Comparative Study on the Effect of Cerebralcare Granule and Its

Disassembled Prescriptions on SHRs

Reporter: Qu Zhuo

Advisor: Prof. Gao Wenyuan

2013.10.05

Cerebralcare Granule （养血清脑颗粒） , one of the famous classical recipes in

traditional Chinese medicin, is developed from the "Decoction of Four Drugs". It is able

to ameliorate the detrimental effect on cognition following chronic cerebral

hypoperfusion , improve cerebromeningeal microcirculation, inhibit platelet

aggregation, and release vasospasm. Currently, the recipe is mostly used for treating

headache, including migraine headache, neurogenic headache, etc.

源自经典 现代改良

当归、川芎芍药、熟地黄

延胡索、鸡血藤、夏枯草、决明子、珍珠

母、钩藤、细辛

Primary hypertension ： 95% ， Etiology is not clear

Secondary hypertension ： 5% ， There is a clear and

independent etiology

Hypertension （高血压） is a cardiovascular disease with the most

epidemiological impact in the world and also represents a major risk factor for

developing other diseases as endothelial dysfunction, metabolic syndrome,

diabetes, renal dysfunction, congestive heart failure, coronary artery disease

and stroke.

Worldwide hypertension is estimated to cause 7.1 million premature deaths

and 4.5 % of the disease burden.

Research progress of Cerebralcare Granule

Mechanism of hypertension

1

2

Review

Chemical composition analysis of Cerebralcare Granule

1

2

Experiment

Vasorelaxant effects of Cerebralcare Granule

# 5

具有养血平肝、活血通络的功效；

用于治疗血虚肝亢所致的头痛，眩晕眼花，心烦易怒，

失眠多梦。

养血清脑颗粒能够改善脑组织微循环；缓解血管痉挛，

目前为治疗头痛、脑供血不足、高血压、眩晕、失眠

等疾病的中药特效药。

--Research progress of Cerebralcare Granule

#

平肝药 珍珠母、钩藤

散寒解表药 细辛

补血药当归、白芍、 熟地

清热药 夏枯草、决明子

活血药 川芎、鸡血藤、延胡索

17.58%

27.03%

27.02%

27.02%

1.35%

1. 组方分析

测定阿魏酸和芍药苷的含量较全面地反映和控制养血清脑颗粒的质量 . 养血清脑颗粒中芍药苷和阿魏酸含量分别为 5.13±0.24 ， 0.36±0.011 mg/g.

定量分析

高展 , 等 . 血清脑颗粒质量标准研究 . 广东药学院学报 . 2011,27(5): 484-488.李文博 , 等 . SPE-UPLC 法测定养血清脑颗粒中的芍药苷含量 . 药物分析杂志 . 2011,31(7): 1385-1388.秦昉 , 等 . 液相色谱 - 质谱联用测定养血清脑颗粒中芍药苷的含量 . 中国医院药学杂志 . 2007, 27(10): 1396-1398.

2. 化学成分

2.1 质量标准研究2.1 质量标准研究

# 8

蒽醌类成分LC-MS 指认出其中 8 个蒽醌类特征成分分别为大黄酚 - 四吡喃葡萄糖苷、橙黄决明素、芦荟大黄素、大黄酸、 3-甲基 -2- 羟基 -1 ， 6 ， 7 ， 8- 四甲氧基蒽醌、 3- 甲基 -2 ， 8- 二羟基 -1 ， 6 ， 7- 三甲氧基蒽醌、大黄素、大黄酚 )

酚酸类成分分析 挥发性成分分析

通过超高效液相色谱建立了快速、高效分离分析 4 个酚酸的方法，绿原酸 396.17±42.05 ，咖啡酸 81.67±9.55 ，阿魏酸 251.17±28.25 ，迷迭香酸 582.41±88.14 µg/g 。

用气相色谱（ GC-MS ）法建立指纹图谱，对其中化学成分进行分析鉴定。 10 批养血清脑颗粒得到的共有指纹图谱选定了 10 个共有峰，通过质谱鉴定出 10 个共有峰的化学成分。

郝晓霞 , 等 . HPLC-DAD-MS / MS 用于养血清脑颗粒蒽醌类成分分析 . 中成药 , 2012, 34（ 1 ）： 66-70.陈国辉 , 等 . 超高效液相色谱法测定养血清脑颗粒中 4 个酚酸类成分的含量 . 药物分析杂志， 2013， 33（ 1 ）： 124-127.李文博 , 等 . 养血清脑颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究 . 分析化学研究简报 . 2011,39(3): 387-391.李文博 , 等 . 养血清脑颗粒中挥发性成分的 GC 指纹图谱研究 . 中草药， 2011,42（ 7 ） :1321-1325.

2. 化学成分

2.2 化学成分分析2.2 化学成分分析

# 9

吸收动力学研究

考察了养血清脑颗粒中芍药苷和阿魏酸在体外吸收动力学：线性吸收，符合零级吸收速率；口服养血清脑后延胡索乙素的药动学研究。

以非那西丁作为探针药物 ,

考察养血清脑颗粒对 CYP450

1A2 作用，未发现明显的抑制或诱导作用。对同服其它药物体内代谢过程未产生影响。

对肝微粒体酶活性影响

陈晓鹏 , 等 . 养血清脑颗粒中有效成分的肠外翻吸收研究 . 中国实验方剂学杂志 , 2013, 19(4): 159-162.李昂 , 等 . 养血清脑颗粒对大鼠肝 CYP 1A2 活性的影响 . 2010, 21(43): 4038-4040.陈洁 , 等 . 养血清脑颗粒对丙戊酸在人体内血药浓度和药代动力学的影响 . 中风与神经疾病杂志 , 2012, 29(7): 626-628.

3. 吸收代谢

# 10

4. 降压作用

养血清脑颗粒对高血压的治疗

3.1 自发性高血压 :3.1 自发性高血压 :

3.2 肾性高血压：3.2 肾性高血压：

3.3 缓解左心室心肌肥厚3.3 缓解左心室心肌肥厚

3.4 改变心脑肾基因表达谱 3.4 改变心脑肾基因表达谱

3.5 调节肾素 - 血管紧张素 -醛固酮系统

3.5 调节肾素 - 血管紧张素 -醛固酮系统

# 11

5. 脑循环改善

养血清脑颗粒抑制 右旋糖酐引起小鼠大脑皮质血流量减少，改善脑组织血流量，改善脑组织微循环，缓解脑组织供血不足所致的各种病证。明显改善慢性脑缺血大鼠局部脑血流量，提高学习记忆能力。

6. 脑神经保护

养血清脑颗粒对两侧颈总动脉结扎后再灌注损伤模型，能选择性抑制谷氨酸、 caspase-3 的表达，并且通过谷氨酸盐合成酶选择性抑制兴奋性氨基酸谷氨酸的神经毒性作用，减少神经细胞的死亡，从而发挥神经保护作用。

--Mechanism of hypertension

头痛

眩晕

头痛

眩晕

内在因素：五脏不足，体质阴阳偏盛偏衰，气血虚损；

内在因素：五脏不足，体质阴阳偏盛偏衰，气血虚损；

外在因素：久病过劳，情志不畅，饮食不节，嗜好烟酒

外在因素：久病过劳，情志不畅，饮食不节，嗜好烟酒

人体脏腑阴阳失调、气血逆乱、痰浊内生、瘀血内阻导致络脉损伤

人体脏腑阴阳失调、气血逆乱、痰浊内生、瘀血内阻导致络脉损伤

中医病因分析

遗传遗传吸烟吸烟 酗酒酗酒肥胖肥胖

精神紧张精神紧张

过度摄盐过度摄盐胰岛素抵抗胰岛素抵抗

血管紧张素血管紧张素IIII异常增多异常增多

高血压高血压

1 遗传因素2 环境因素3 血管活性物质3.1 肾素 -血管紧张素系统（ RAAS ）3.2交感神经系统（ SNS ）3.3 氧化氮合酶 /一氧化氮（ NOS/NO ）3.4硫化氢3.4 内皮素3.5胰岛素4 调控离子转运5 血管异常改变

--Mechanism of hypertension

西医病因分析

血管内皮血管内皮

血管平滑肌血管平滑肌

Fabio S. Monteiro, Ana C.L. Silva, Italo R.R. Martins, Ana C.C. Correia, Ionaldo J.L.D. Basílio, Maria F. Agra, Jnanabrata Bhattacharyya, Bagnólia A. Silva .Vasorelaxant action of the total alkaloid fraction obtained from Solanum paludosum Moric. (Solanaceae) involves NO/cGMP/PKG pathway and potassium channels Journal of Ethnopharmacology, 2012,141(3):895-900

Ref.

Hitesh Soni, Praful Patel, Akshyaya C Rath, Mukul Jain, Anita A Mehta. Cardioprotective effect with carbon monoxide releasing molecule-2 (CORM-2) in isolated perfused rat heart: Role of coronary endothelium and underlying mechanism. Vascular Pharmacology, 2010,53(1-2):68-76.

Ref.

Na+

Ca2+

Ca2+

钙通道钙通道

►钙离子（细胞内 Ca2+浓度↑，血管壁紧张性↑，阻力↑）►钠离子（肾潴钠→胞内钠浓度↑，细胞膜对钠的通透性↑，钠泵功能抑制）►钾离子（血管平滑肌上钾离子通道开放， K+ 外流）

血管平滑肌 Ca2+ 动员与 Ca2+ 稳态模式图

Concentration of[Ca2 +]i↑

Concentration of[Ca2 +]i ↓Intracellular Ca2 + release Na+/Ca2+exchange

calcium pump

Extracellular Ca2 + influx

Intracellular stores of Ca2 + release

Extracellular Ca2 + influx

Smooth Muscle

contraction

Smooth muscle relaxation

舒血管因子 抑制剂前列环素 环氧合酶抑制剂：吲哚美辛等

内皮细胞舒张因子

一氧化氮合酶抑制剂： L-N-硝基精氨酸甲酯（ L-NAME ）， N-单甲基精氨酸（ L-NMM

A ），左旋硝基精氨酸甲酯（ L-NAME ）等可溶性鸟甘酸环化酶抑制剂：亚甲蓝

内皮细胞超极化因子 钙敏感的钾通道拮抗剂：四乙胺、四丁胺

KATP非特异性抑制剂：格列苯脲

Kir 抑制剂： BaCl2

[1]卞筱泓，张映桥，许激扬，等 . 黄芩苷对离体大鼠胸主动脉的舒张作用及机制 . 药物生物技术 .2013 ， 20( 2) : 146 -148[2]François Senejoux, Céline Demougeot, Magdalena Cuciureanu, Anca Miron, Rodica Cuciureanu, Alain Berthelot, Corine Girard-Thernier . Vasorelaxant effects and mechanisms of action of Heracleum sphondylium L. (Apiaceae) in rat thoracic aorta. Journal of Ethnopharmacology, 2013,147(2) 2013, 536-539.

药物发挥降压作用的靶点：血管内皮，平滑肌上的受体，离子通道等采用相应的工具药（受体，离子通道的激动剂或拮抗剂）；药物的舒血管作用是否与内皮有关，可用去除内皮细胞的方法进行观察，若去内皮后，药物的舒张血管作用减弱，则说明药物的作用具有内皮依赖性。

KCl诱导血管收缩后，加入 10-6M 的 Ach。内皮去除：舒张率小于10%

KCl诱导血管收缩后，加入 10-6M 的 Ach。内皮去除：舒张率小于10%

缩血管剂：

NE\Phe

缩血管剂：

NE\Phe

环氧合酶抑制剂一氧化氮合酶抑制剂可溶性鸟甘酸环化酶抑制剂

Kca拮抗剂KATP非特异性抑制剂Kir 抑制剂Ca 通道阻滞剂

内皮完整血管环内皮完整血管环

去内皮血管环去内皮血管环

药物对血管的作用

平滑肌细胞增殖平滑肌细胞增殖 血管壁增厚血管壁增厚 血管阻力增高血管阻力增高 血管反应性增强血管反应性增强

细胞增殖是通过细胞周期的运转来实现的 , 细胞周期包括 G0/G1、 S 、 G2、 M 4期 , 存在着两个重要的调点 :G1/S和 G2/M期 , 其中G1/ S调控点是影响细胞周期的关键。

对方中以及芍药苷，阿魏酸为主要成分控制产品质量，并对其中酚酸类成分进行定量，对蒽醌类及挥发性成分进行定性分析，

对方中以及芍药苷，阿魏酸为主要成分控制产品质量，并对其中酚酸类成分进行定量，对蒽醌类及挥发性成分进行定性分析，

总结西医对高血压发病原因的认识及对发病机制的解释；总结体外血管环实验方法。

总结西医对高血压发病原因的认识及对发病机制的解释；总结体外血管环实验方法。

化学成

分

对不同模型高血压具有降压作用；改变心脑肾基因表达谱；调节肾素 -血管紧张素系统；改善认知障碍，改善脑微循环，保护脑组织。

对不同模型高血压具有降压作用；改变心脑肾基因表达谱；调节肾素 -血管紧张素系统；改善认知障碍，改善脑微循环，保护脑组织。

药理活

性

前期研究发现养血清脑颗粒具有降压作用，本实验以大鼠离体胸主动脉环为研究对象，探讨养血清脑颗粒舒血管的作用机制

体外吸收：比较了阿魏酸和芍药苷的体外吸收特性；体内吸收：对全方给药后延胡索乙素药代动力学进行了研究；代谢：未对肝微粒体酶及对同服其它药物体内代谢过程产生影响。

体外吸收：比较了阿魏酸和芍药苷的体外吸收特性；体内吸收：对全方给药后延胡索乙素药代动力学进行了研究；代谢：未对肝微粒体酶及对同服其它药物体内代谢过程产生影响。

吸收代

谢

养血清脑颗粒 高血压

细辛作用评

价

抗高血压1.1

离体血管收缩舒张活性离体血管收缩舒张活性

自发性高血压大鼠降压作用自发性高血压大鼠降压作用

抗老年痴呆症1.2

记忆获得障碍的影响记忆获得障碍的影响

对慢性脑缺血保护作用对慢性脑缺血保护作用

精选处方

全 方 组全 方 组

去细辛组 去细辛组

细辛单味组细辛单味组

补 血 组补 血 组

活 血 组活 血 组

平肝熄风组平肝熄风组

清热泻火组清热泻火组

当

归

川

芎

组方整合研究2

细辛配伍作用研究1

KCl诱导血管收缩后，加入 10-6M 的 Ach。内皮去除：舒张率小于10%

KCl诱导血管收缩后，加入 10-6M 的 Ach。内皮去除：舒张率小于10%

缩血管剂：

NE\Phe

缩血管剂：

NE\Phe

环氧合酶抑制剂一氧化氮合酶抑制剂可溶性鸟甘酸环化酶抑制剂

Kca拮抗剂KATP非特异性抑制剂Kir 抑制剂Ca 通道阻滞剂

内皮完整血管环内皮完整血管环

去内皮血管环去内皮血管环

药物对血管的作用

养血清脑颗粒对 NE预收缩血管的影响

Fig. 1 . Influence of different concentrations of Cerebralcare Granule on the NE pre-contracted of rat thoracic aorta rings (endothelium-intacted E+, endothelium-denuded E-).Symbols and vertical bars represent means and S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s Multiple Comparison Test. *p < 0.05 **p < 0.01 (E+ vs. E-) (n = 5).

Fig. 2. Influence of different concentrations of Cerebralcare Granule on the KCl pre-contracted of rat thoracic aortic rings (endothelium-intact E+, endothelium-denuded E-)Symbols and vertical bars represent means and S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s Multiple Comparison Test. *p < 0.05 **p < 0.01 (E+ vs. E-) (n = 5).

养血清脑颗粒对 KCl预收缩血管的影响

内皮对养血清脑颗粒舒张血管的影响

Fig. 3 Effect of different inhibitors on Cerebralcare Granule-induced vasodilation in endothelium-intact rat thoracic aortic rings . (A) Effect of L-NAME 10-4 M on Cerebralcare Granule-induced vasodilation;(B) Effect of INDO 10-5 M on Cerebralcare Granule-induced vasodilation.Symbols and vertical bars represent means and S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s Multiple Comparison Test. *p < 0.05 **p < 0.01 (Control vs. L-NAME or INDO) (n = 5).

A B

养血清脑颗粒对 K+ 通道的影响A

B

C

Fig. 4. Effect of the pretreatment with different K+ channels blockers on Cerebralcare Granule-induced vasodilation in endothelium-denuded rat rat thoracic aortic rings . (A) a selective K ir channel blockers BaCl2 10-4 M ; (B) a non-selective blocker of KCa channels Tetraethtylamine （ TEA ） 10-3 M; (C) an ATP-sensitive K+ channels (KATP) blocker glibenclamide （ Gli ） 10-5 M . Symbols and vertical bars represent means and S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s Multiple Comparison Test. *p < 0.05 **p < 0.01 (Control vs. BaCl2 /TEA/Gli) (n = 5).

养血清脑颗粒对 Ca2+ 动员的影响

Fig. 5 . A:Inhibitory effect of YXQN on the NE (1×10−6 M) induced contraction in Ca2+-free solution.B:Dose-effect curves of CaCl2 on rat thoracic aorta rings in the absence and in the presence of Cerebralcare Granule（ endothelium-denuded E- ）Symbols and vertical bars represent means and S.E.M. ANOVA followed by Dunnett’s Multiple Comparison Test. Compared with control *p < 0.05 **p < 0.01 (n = 5).

AB

养血清脑颗粒化学成分分析

min0 10 20 30 40 50 60 70 80

Norm.

0

50

100

150

200

250

300

1

2

3

45

67

min0 10 20 30 40 50 60 70 80

Norm.

-400

-200

0

200

400

600

800

1000

1200

VWD1 A, Wavelength=230 nm (QZ\SYG10000.D) VWD1 A, Wavelength=230 nm (QZ\GC100000.D)

8

1.绿原酸； 2.咖啡酸； 3.阿魏酸； 4.芦荟大黄素； 5.大黄酸； 6.大黄素； 7.大黄酚；8.芍药苷

养血清脑颗粒化学成分分析 YXQN-LC-MS: TIC +All MS

2

4

6

7x10Intens.

20 40 60 80 100 Time [min]

YXQN-LC-MS: TIC -All MS

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

7x10Intens.

20 40 60 80 100 Time [min]

YXQN-LC-MS: UV Chromatogram, 228-232 nm

0

500

1000

Intens.[mAU]

10 20 30 40 50 60 70 80 Time [min]YXQN-LC-MS: UV Chromatogram, 252-256 nm

0

100

200

300

400

Intens.[mAU]

10 20 30 40 50 60 70 80 Time [min]

YXQN-LC-MS: UV Chromatogram, 278-282 nm

0

100

200

300

Intens.[mAU]

10 20 30 40 50 60 70 80 Time [min]

YXQN-LC-MS: UV Chromatogram, 319-335 nm

0

50

100

150

Intens.[mAU]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Time [min]

YXQN-LC-MS: UV Chromatogram, 319-335 nm

0

50

100

150

Intens.[mAU]

10 20 30 40 50 60 Time [min]

红链霉素 -6-β- 龙胆二糖苷

决明苷 C

延胡索乙素

大黄酚 -1-O-B- 龙胆二糖苷

养血清脑颗粒化学成分分析

32

养血清脑颗粒主要成分药动学

养血清脑颗粒 14g/kg

i.g.

收集给药前血样，给药后48小时内不同时间点血

样

拟合药时曲线，计算药动学参数

血样前处理甲醇沉淀蛋白

血样前处理乙腈沉淀蛋白

血样前处理乙酸乙酯萃取

血样前处理固相萃取小柱

HPLC-MS analysis

养血清脑颗粒能浓度依赖性地拮抗由 NE 引起内皮完整和去内皮的血管收缩，对内皮完整血管的舒张作用强于去内皮血管。养血清脑颗粒舒张血管具有内皮依赖性非内皮依赖性和浓度依赖性。

分别用内皮细胞舒张因子 eNOS 抑制剂 L-NAME 和前列环素途径中环氧合酶抑制剂 INDO孵育胸主动脉环，发现二者均能使养血清脑颗粒的舒血管作用减弱。

养血清脑颗粒对 Kir 和 KCa 通道无影响，能使得 KATP 通道开放。

不同浓度的养血清脑颗粒使得 CaCl2 量效曲线右移，推测其对血管的舒张作用主要是通过外钙内流而发挥作用的；预先用养血清脑颗粒孵育血管环后，再用 NE刺激血管，血管收缩作用减弱，说明其舒血管作用与肌浆网储存钙释放有关

养血清脑颗粒能显著舒张由 NE 及 KCl 诱导收缩的血管，其舒张血管效应具有内皮依赖性和非内皮依赖性的特点，可能与抑制内皮细胞的前列环素途径、 NO/cGMP信号通路及血管平滑肌细胞上的钙通道和 KATP 通道有关。

结论

小结

小结

采用 HPLC 对养血清脑颗粒化学成分进行分析，结合标准品的保留时间，指认出其中的 4 个化合物，分别为绿原酸、阿魏酸、大黄酸和芍药苷；

采用 LC-MS 对养血清脑颗粒化学成分进行分析，与文献中的质谱碎片信息比对，指认出其中的 4 个化合物，分别为延胡索乙素、红链霉素 -6-β-龙胆二糖苷、决明苷 C 、大黄酚 -1-O-β-龙胆二糖苷。

Spasmolytic activity of Wei-Chang-An pill extract involves calcium channels in rat jejunum . (Journal of Ethnopharmacology. Required Reviews Completed)

文章情况

Oct.

2013

Nov.

10.20-.11.05 Vasorelaxant effects of Cerebralcare GranuleR are mediated by NO/cGMP pathway, potassium channel opening and calcium channel blockade in isolated rat thoracic aorta

10.20-.11.05 Vasorelaxant effects of Cerebralcare GranuleR are mediated by NO/cGMP pathway, potassium channel opening and calcium channel blockade in isolated rat thoracic aorta

10.14-11.14SHR连续给药 7天，周末测血压、心率等；养血清脑颗粒入血成分，脑组织分布及主要成分的药动学研究：给药后收集生物样品。

10.07-10.13养血清脑颗粒化学成分分析把已有数据写成论文的一部分

11.15-11.30SHR连续给药 7天，周末测血压、心率等；细辛配伍对主要成分体内药动学及脑组织分布的影响：给药后收集生物样品。

工作计划