Compendio de Biologia Molecular y Celular

Compendio de Biología Celular y Molecular # Año 2009

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BBiioollooggííaa MMoolleeccuullaarr && CCeelluullaarr

Casco, V. H.; Izaguirre M. F. & Húmpola P.

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2

ÍNDICE DE TEMAS PÁGINA

CAPÍTULO PRIMERO

EL ORIGEN Y EVOLUCIÓN DE LAS CÉLULAS ‐ NIVELES DE ORGANIZACIÓN ‐ PRINCIPIOS

DE ECOLOGÍA

4

CAPÍTULO SEGUNDO

QUÍMICA DE LA CÉLULA 24

CAPÍTULO TERCERO

LA SUPERFICIE CELULAR 50

CAPÍTULO CUARTO

EL CITOSOL, EL CITOESQUELETO Y EL MOVIMIENTO CELULAR 75

CAPÍTULO QUINTO

RETÍCULO ENDOSPLASMÁTICO, APARATO DE GOLGI Y LISOSOMAS 91

CAPÍTULO SEXTO

MITOCONDRIAS, CLOROPLASTOS Y PEROXISOMAS 105

CAPÍTULO SÉPTIMO

EL NÚCLEO CELULAR 130

CAPÍTULO OCTAVO

LA ORGANIZACIÓN DE LOS GENOMAS CELULARES 149

CAPÍTULO NOVENO

LA REPLICACIÓN EN EUCARIOTAS 160

CAPÍTULO DÉCIMO

LA TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS 168


3

CAPÍTULO UNDÉCIMO

TRADUCCIÓN Y SÍNTESIS DE PROTEÍNAS 192

CAPÍTULO DUODÉCIMO

EL CICLO CELULAR 232

BIBLIOGRAFÍA 255


4

CAPÍTULO PRIMERO:

El Origen y Evolución de las Células


5

EL ORIGEN Y LA EVOLUCIÓN DE LAS CÉLULAS

Las células vivas pueden, de acuerdo a si poseen o no núcleo, dividirse en dos clases

principales: células procariotas o eucariotas.

CARACTERÍSTICAS Procariotas Eucariotas

NÚCLEO Ausente Presente

Diámetro de las células típicas ~ 1μm 10‐100 μm

Citoesqueleto Ausente Presente

Organelas Citoplasmáticas Ausentes Presentes

Contenido de ADN (pares de bases) 0,5X106 a 5X106 1,5X107 a 5X109

Cromosomas ADN circular

(un cromosoma)

ADN linear (varios pares de cromosomas)

A pesar de las diferencias, las bases moleculares que gobiernan ambos tipos celulares

son comunes.

Las Primeras Células

La vida habría emergido hace aproximadamente 3,8x109 de años, unos 7,5X108 de años

después de formarse la Tierra. Al momento de originarse la vida, se piensa que la

atmósfera contenía principalmente CO2 y N2 (muy poco o nada de O2). También habría

contenido pequeñas cantidades de H2 y H2S.

En la década del 20´ del siglo pasado se comenzó a especular que con estos

componentes, en presencia de luz solar y/o descargas eléctricas podrían formarse

espontáneamente moléculas orgánicas.

La formación espontánea de moléculas orgánicas, fue demostrada experimentalmente

por Stanley Miller en la década del 50`.

La condición crítica que debieron cumplir las moléculas que precedieron y permitieron la

organización prebiótica fue la capacidad de replicarse a si mismas. Las moléculas

actuales con capacidad de llevar información y por tanto candidatas a cumplir con esa

función son: los ácidos nucleicos y las proteínas.


6

De estos dos grupos de moléculas sólo los ácidos nucleicos (ARN) poseen la capacidad de

dirigir su propia replicación.

Un paso crítico en la comprensión de la evolución molecular fue el descubrimiento de

Altman & Cech, quienes fueron los primeros en determinar que el ARN es capaz de

catalizar una serie de reacciones incluyendo la polimerización de los nucleótidos.

El ARN es único en cuanto a su capacidad de servir como molde y para catalizar su

propia replicación. Estas características hicieron pensar que el ARN fue el sistema

genético inicial, época de la evolución prebiótica que se ha dado en llamar: EL MUNDO DEL

ARN. La interacción ordenada entre ARN y aminoácidos habría llevado a la evolución del

código genético.

Posteriormente, el ADN habría reemplazado al ARN como material genético. Las

primeras células presumiblemente se habrían originado por el encapsulamiento de

algunas moléculas de ARN autoreplicantes en una bicapa fosfolipídica. Como se verá

más adelante los fosfolípidos son componente básicos de las membranas plasmáticas de

nuestros días.

EVOLUCIÓN DEL METABOLISMO

Debido a que las células se habrían originado en un mar de moléculas orgánicas ellas

habrían sido capaces de obtener energía y alimentos del ambiente circundante. El

problema que se plantea es que ésta es una situación limitante en sí misma, por lo que

debió producirse una evolución hacia mecanismos propios para generar energía y

sintetizar las moléculas necesarias para su replicación.

La generación y utilización controlada de la energía metabólica es central para todas las

actividades celulares.

Las principales vías del metabolismo energético están altamente conservadas en las

células de nuestros días. Todas las células usan adenosina‐5´ trifosfato como fuente

energética principal para realizar la síntesis de los constituyentes celulares y realizar

otras actividades que requieren energía (por ej. contracción muscular, etc.)


7

Los mecanismos usados por las células para la generación de ATP se piensa que

evolucionaron en tres etapas:

- Evolución de la glucólisis

- Fotosíntesis

- Metabolismo oxidativo

El desarrollo de estas vías metabólicas, cambiaron la atmósfera terrestre, que

inicialmente era anaerobia, y alteraron el curso de la evolución posterior.

En la atmósfera anaerobia inicial de la Tierra las primeras reacciones energéticas

incluyeron la descomposición de las moléculas orgánicas en ausencia de Oxígeno. Estas

reacciones se cree habrían sido similares a la glucólisis de nuestros días:

C6H12O6 → C3H6O3 + 2ATP

Glucosa Ác. Láctico Energía

Además de usar ATP, todas las células del presente llevan adelante el proceso de

glucólisis, esto reafirma el concepto que estas reacciones se habrían originado muy

tempranamente en la evolución.

El desarrollo de la fotosíntesis se cree que fue el siguiente paso evolutivo mayor, este

proceso permite a las células utilizar la energía solar e independizarse de la utilización de

las moléculas orgánicas preformadas. Las primeras bacterias fotosintéticas,

probablemente usaron H2S para convertir CO2 en moléculas orgánicas preformadas –un

patrón aún utilizado por algunas bacterias del presente–.

El uso de H2O como donante de electrones e hidrógeno para la conversión de CO2 en

compuestos orgánicos evolucionó posteriormente y habría tenido una importancia clave

en el cambio de la atmósfera terrestre. El uso de H2O en las reacciones fotosintéticas

implicó la producción de O2 libre

La liberación de O2 como consecuencia de la fotosíntesis habría cambiado la atmósfera

terrestre y se cree que llevó a las células a evolucionar hacia el desarrollo del


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metabolismo oxidativo.

Alternativamente, el metabolismo oxidativo pudo evolucionar antes que la fotosíntesis,

y con el incremento del O2 atmosférico se dio una selección ventajosa sobre aquellos

organismos que eran capaces de usarlo en sus reacciones de producción de energía.

Con pocas excepciones las células de nuestros días usan las reacciones oxidativas como

su principal fuente de energía.

PROCARIOTAS DE NUESTROS DÍAS

Achaea

(arquibacterias)

Eubacteria

(cianoficeas y bacterias)

La mayoría de las bacterias son esféricas, en forma de bastón o espiraladas, con un

diámetro de 1 a 10 μm.

El contenido de ADN oscila entre 0,5 X106 a

5X106 pares de bases

Los procariotas más grandes y complejos

serian las cianobacterias, bactérias de las

que habría evolucionado la

fotosíntesis.

La estructura de las células

procariotas es ilustrada por

Escherichia coli (E. coli) un

habitante común del tracto

digestivo.


9

E. coli posee forma de bastón un diámetro de 1 μm y una longitud de 2 μm.

Posee una pared celular compuesta de polisacáridos y péptidos e interiormente se

encuentra la membrana plasmática

Mientras que la pared celular es porosa, la membrana plasmática es la que confiere la

separación funcional entre el interior y el exterior.

El ADN de E. coli es una molécula circular, sin separación con el citoplasma. El citoplasma

contiene aproximadamente 30.000 ribosomas que le confieren su apariencia granular.

CÉLULAS EUCARIOTAS

Todas las células eucariotas, como las procariotas están rodeadas por una membrana

plasmática y contienen ribosomas.

Las células eucariotas contienen un núcleo, una variedad de organelas y un

citoesqueleto. La organela más prominente es el núcleo, con un diámetro aproximado

de 5 μm

El núcleo contiene la información genética de las células organizadas en forma linear

El núcleo es el sitio de replicación del ADN y de la síntesis de ARN (transcripción).

La traducción del ARN en proteínas se produce en los ribosomas, en el citoplasma

Las organelas compartimentalizan el citoplasma de las células, en estos compartimentos

se localizan las diferentes actividades metabólicas.

Las células eucariotas generalmente son de mayor tamaño que las procariotas –con un

volumen celular al menos 1.000 veces mayor–. La compartimentalización de las células

eucariotas constituye el mecanismo para conseguir la mayor eficiencia de estos tipos

celulares.

Las mitocondrias y los cloroplastos juegan un rol crítico en el metabolismo de

energético. Las mitocondrias se encuentran en casi todas las células eucariotas, son los

sitios en los que produce el metabolismo oxidativo, responsables de la producción de


10

ATP derivado de la descomposición de las moléculas orgánicas

Los cloroplastos son los sitios en los que se realiza la fotosíntesis se encuentran tanto en

las plantas como en las algas verdes.

Los lisosomas y los peroxisomas constituyen compartimentos metabólicos

especializados en la digestión de macromoléculas y de varias reacciones oxidativas

respectivamente.

Adicionalmente, las células vegetales poseen una gran vacuola en la que se realizan una

gran variedad de funciones, incluyendo digestión de macromoléculas, y almacenamiento

de productos de desecho y nutrientes

Debido al tamaño y complejidad de las células eucariotas, el transporte de las proteínas

a sus destinos correctos dentro de las células es una tarea formidable, dos organelas

citoplasmáticas: el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi se han consagrado

específicamente al transporte y clasificación de proteínas destinadas a la secreción,

incorporación a la membrana e incorporación a los lisosomas. El retículo endoplasmático

es una extensa red de membranas intercelulares que se extienden desde la membrana

nuclear a través del citoplasma

El RE no sólo interviene en el procesamiento y transporte de proteínas, sino que

también lo hace en la síntesis de lípidos

Desde el RE, las proteínas se transportan dentro de pequeñas vesículas al aparato de

Golgi donde son posteriormente procesadas y clasificadas a sus destinos definitivos

Además de su función en el transporte, el aparato de Golgi funciona como un lugar de

síntesis de lípidos y en las células vegetales es sitio de síntesis de algunos polisacáridos

de la pared celular

Las células eucariotas poseen otro nivel de organización interna: el citoesqueleto, una

red de filamentos proteicos que se extienden a través del citoplasma. El citoesqueleto

constituye el andamiaje de las células, determinando la forma y la organización general

del citoplasma. El citoesqueleto es el responsable de los movimientos de las células (por


11

ej. la contracción del músculo cardíaco) y del transporte y posición de las organelas y

otras estructuras incluyendo el movimiento de los cromosomas durante el proceso de

división celular.

Las células eucariotas habrían evolucionado aproximadamente 2700 millones de años

atrás, 1.000 a 1.500 millones de años después que hicieron su aparición las células

procariotas. Los estudios del ADN de las arquibacterias (Archaea) y las eubacterias

indican que constituyen dos grupos tan distanciado como lo están las células eucariotas

de las procariotas

Por lo antes dicho, se cree que debió ocurrir un evento muy temprano en la evolución, a

partir del cual se habría producido la divergencia de tres líneas evolutivas que habrían

descendido de un ancestro común originando: arquibacterias, eubacterias y células

eucariotas.

De gran interés es el hecho que algunos genes de las arquibacterias guardan mayores

similitudes con las células eucariotas que con las eubacterias, indicando que éstos

grupos comparten un ancestro común y están más relacionados entre si que con las

eubacterias.

Un paso crítico en la evolución de las células eucariotas habría sido la adquisición de

organelas subcelulares delimitadas por membrana las que permitieron el desarrollo de

la complejidad de estas células.

Se cree que las organelas se adquirieron como resultado de una asociación de tipo

simbiótica entre los ancestros de las células eucariotas y las procariotas.

Esta hipótesis, denominada endosimbiótica está soportada por los estudios de

mitocondrias y cloroplastos, organelas que se cree evolucionaron de bacterias

adaptadas a la vida en el interior de grandes células en una asociación simbiótica.

Mitocondrias y cloroplastos poseen tamaños similares a las bacterias, se reproducen por

división binaria, y un hecho fundamental, ambas organelas poseen su propio ADN que

codifica algunos, aunque no todos, sus componentes. El ADN de mitocondrias y

cloroplastos se replica cada vez que la organela se divide, los genes que codifica este


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ADN se transcriben dentro de las organelas y se traducen también en los ribosomas del

interior de mitocondrias y cloroplastos. Así, mitocondrias y cloroplastos contienen su

propio sistema genético, que es diferente del genoma de las células.

Los ribosomas y los ARNs ribosomales de estas organelas, son mas parecidos al de las

bacterias que al de las células eucariotas.

Actualmente se acepta el origen endosimbionte de estas organelas, se cree que las

mitocondrias habrían evolucionado a partir de bacterias aeróbicas y los cloroplastos a

partir de bacterias fotosintéticas como las actuales cianobacterias.

La adquisición de bacterias aeróbicas, pudo haber permitido que una célula anaerobia

desarrollase el metabolismo oxidativo.

La adquisición de una bacteria fotosintética pudo proveer la independencia nutricional,

conseguida a partir de la capacidad de realizar fotosíntesis.

De esta forma, la endosimbiosis habría sido altamente beneficiosa para ambos

“parteners” y habría sido seleccionada por la naturaleza durante la evolución

Aparentemente, muchos de los genes de estas bacterias simbioticas se habrían

incorporado al genoma nuclear de la célula hospedadora y sólo unos pocos

componentes de mitocondrias y cloroplastos son aún codificados por sus propios genes.

EL DESARROLLO DE LOS ORGANISMOS MULTICELULARES

Muchos eucariotas son organismos unicelulares, que como las bacterias, consisten de

células simples capaces de autoreplicarse. Los eucariotas más simples son las levaduras.

Las levaduras son más complejas que las bacterias pero de tamaño menor y más simples

que las células vegetales o animales. La levadura más estudiada es: Sacharomyces

cerevisiae o levadura de cerveza. Posee un diámetro de 6 μm y contiene 12 x 106 pares

de bases de ADN.

Otros eucariotas unicelulares son más complejos y poseen tantos pares de bases de ADN

como los humanos (por ejemplo la Euglena, posee 3000.000.000 de pares de bases)

Las amebas por ejemplo, son otros organismos unicelulares muy complejos. Amoeba


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proteous es una célula eucariótica muy compleja, su volumen es 100.000 veces mayor

que el de E. coli, y su longitud excede 1 mm. Poseen una movilidad muy importante.

Los organismos multicelulares habrían evolucionado hace aproximadamente 1.700

millones de años. Algunas eucariotas unicelulares habrían formado agregados

multicelulares, que representan organismos de transición evolutiva de organismos

formados por células simples a organismos multicelulares. Por ejemplo el alga Volvox es

una asociación multicelular colonial que se cree constituye una forma similar a los

antecesores de los vegetales de nuestros días.

El incremento en la especialización celular habría llevado a los organismos multicelulares

del presente. La especialización celular y la división del trabajo habrían llevado a la

diversidad de tipos celulares observada en plantas, hongos y animales de nuestros días,

incluyendo a los seres humanos.

Las plantas están compuestas por pocos tipos celulares, en comparación con los

animales, pero cada tipo vegetal está especializado para realizar la tarea requerida por el

organismo completo.

Las células vegetales están especializadas en 3 tipos de sistemas tisulares: tejido

parenquimático, (que posee dos tipos celulares especializados: colénquima y

esclerénquima), tejido dérmico y tejido vascular (xilema y floema).

Las células animales, son considerablemente mas diversas que las vegetales, el cuerpo

humano, por ejemplo, está formado por más de 200 tipos celulares diferentes, los que

se consideran componen 5 tipos tisulares diferentes:

• Tejido Conectivo

• Tejido Epitelial

• Tejido Sanguíneo

• Tejido Nervioso

• Tejido Muscular


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LOS NIVELES DE ORGANIZACIÓN ‐

Princios de Ecología ‐ Fuente: Biología de Curtis & Barnes (Sexta Edición)

Los Átomos

Todas las moléculas orgánicas como los carbohidratos, lípidos,

proteínas y nucleótidos contienen carbono, hidrógeno y oxígeno.

Además, las proteínas contienen nitrógeno y azufre, y los

nucleótidos, así como algunos lípidos, contienen nitrógeno y

fósforo. El agua, una molécula inorgánica, contiene hidrógeno y

oxígeno.

En la Tierra, existen unos 92 elementos. Los elementos son sustancias que no pueden

ser desintegradas en otras sustancias por medios químicos ordinarios. La partícula más

pequeña de un elemento es el átomo.

Desde hace largo tiempo, los científicos tratan de entender cómo es un átomo. Se han

propuesto diversos modelos que intentan dilucidar cuál es la estructura del átomo.

Los átomos de cada elemento diferente tienen en sus núcleos un número característico

de partículas cargadas positivamente, llamadas protones. Por ejemplo, un átomo de

hidrógeno, el más liviano de los elementos, tiene un protón en su núcleo; el número de

protones en el núcleo de un átomo cualquiera recibe el nombre de número atómico. Por

lo tanto, el número atómico del hidrógeno es 1 y el del carbono es 6.

Fuera del núcleo de un átomo hay partículas cargadas negativamente, los electrones,

que son atraídos por la carga positiva de los protones. El número de electrones en un

átomo iguala al número de protones en su núcleo. Los electrones determinan las

propiedades químicas de los átomos y las reacciones químicas implican cambios en el

número y el estado energético de estos electrones.

Los átomos también contienen neutrones, que son partículas sin carga de

aproximadamente el mismo peso que los protones. Estos también se encuentran en el

núcleo del átomo, donde parecen tener un efecto estabilizador. El peso atómico de un


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elemento es aproximadamente igual a la suma del número de protones y el número de

neutrones del núcleo de sus átomos.

El peso atómico del carbono es, por convención, igual a 12, mientras que el del

hidrógeno, que no contiene neutrones, es ligeramente mayor que 1. Los electrones son

tan livianos, en comparación con los protones y neutrones, que su peso habitualmente

no se considera. Cuando nos pesamos, sólo aproximadamente 30 gramos del peso total

está integrado por electrones.

Las Moléculas

Las moléculas forman las células. Pueden ser orgánicas ‐que

contienen carbono‐ o inorgánicas, como el H2O o el O2. Una sola

célula bacteriana contiene aproximadamente cinco mil clases

diferentes de moléculas y una célula vegetal o animal tiene

aproximadamente el doble. Estas miles de moléculas, sin embargo,

están compuestas de relativamente pocos elementos (CHNOPS). De modo similar,

relativamente pocos tipos de moléculas desempeñan los principales papeles en los

sistemas vivos.

En los organismos se encuentran cuatro tipos diferentes de moléculas orgánicas en gran

cantidad. Estos cuatro tipos son los carbohidratos (compuestos de azúcares), lípidos

(moléculas no polares, muchas de las cuales contienen ácidos grasos), proteínas

(compuestas de aminoácidos) y nucleótidos (moléculas complejas que desempeñan

papeles centrales en los intercambios energéticos y que también pueden combinarse

para formar moléculas muy grandes, conocidas como ácidos nucleicos).

Se ha dicho que sólo se necesita ser capaz de reconocer aproximadamente 30 moléculas

para tener un conocimiento que permita trabajar con la bioquímica de las células. Dos

de esas moléculas son los azúcares glucosa y ribosa; otra, un lípido; otras veinte, los

aminoácidos biológicamente importantes; y cinco las bases nitrogenadas, moléculas que

contienen nitrógeno y son constituyentes claves de los nucleótidos.

Las Macromoléculas


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Las macromoléculas son moléculas constituidas por varias

moléculas que pueden ser o no similares entre sí. Los

polisacáridos, por ejemplo, están constituidos por monosacáridos

unidos en cadenas largas. Algunos de ellos son formas de

almacenamiento del azúcar, mientras que otros como la celulosa

son un importante material estructural de las plantas.

Los lípidos son moléculas orgánicas hidrofóbicas que, al igual que los carbohidratos,

desempeñan papeles importantes en el almacenamiento de energía y como

componentes estructurales. Los compuestos de este grupo incluyen las grasas y los

aceites, los fosfolípidos, los glucolípidos, las ceras, y el colesterol y otros esteroides. Las

grasas son los principales lípidos almacenadores de energía. Los fosfolípidos son los

principales componentes estructurales de las membranas celulares.

Las proteínas son moléculas muy grandes compuestas de cadenas largas de

aminoácidos, conocidas como cadenas polipeptídicas. En las proteínas, los aminoácidos

se organizan en polipéptidos y las cadenas polipeptídicas se ordenan en un nuevo nivel

de organización: la estructura terciaria o cuaternaria de la molécula de proteína

completa. Solamente en este nivel de organización emergen las propiedades complejas

de las proteínas y sólo entonces la molécula puede asumir su función.

Los nucleótidos son moléculas complejas formadas por un grupo fosfato, un azúcar de

cinco carbonos y una base nitrogenada. Son los bloques estructurales de los ácidos

desoxirribonucleico (DNA) y ribonucleico (RNA), que transmiten y traducen la

información genética.

Los Complejos de Macromoléculas

Los complejos macromoleculares forman, dentro de las células,

estructuras complejas, como las membranas y las organelas en las

células eucariotas.


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Las técnicas microscópicas modernas han confirmado que las células eucarióticas

contienen, en verdad, una multitud de estructuras. No son, por supuesto, órganos como

los que se encuentran en los

organismos multicelulares, pero en

cierta forma son comparables:

están especializados en forma y

función de manera que son capaces

de desempeñar actividades

particulares requeridas por la

economía celular. Así como los

órganos de los animales

multicelulares trabajan juntos en

sistemas de órganos, las organelas

de las células están comprometidas

en varias funciones cooperativas e

interdependientes.

Si bien los procariotas no tienen

organelas rodeadas por

membranas, sí tienen estructuras macromoleculares complejas que constituyen la

membrana celular, los ribosomas y otras

estructuras.

Todos los seres vivos de la sabana y de todos los

biomas de la Tierra están formados por estas

estructuras macromoleculares complejas.

Modelo de la membrana plasmática de una célula animal. En el esquema se indican los distintos componentes de las membranas biológicas: carbohidratos, colesterol, proteínas integrales y periféricas.


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Los virus son complejos macromoleculares. No es posible ubicar a los virus en alguno de

los reinos de organismos vivos ya

que están están formados por

una región central de ácido

nucleico, DNA o RNA, rodeado

por una cubierta proteínica o

cápside y, en algunos casos, por

una envoltura lipoproteica.

Además, se reproducen

solamente dentro de las células

vivas, apoderándose de las

enzimas y la maquinaria

biosintética de sus hospedadores. Sin esta maquinaria, serían tan inertes como cualquier

otra macromolécula, o sea, sin vida según la mayoría de los criterios.

Fotomicrografía electrónica y diagrama de un bacteriófago Tpar, mostrando sus muchos

componen‐tes estructurales diferentes. El ADN del virus codifica todas las proteínas

necesarias. La cabeza de la cápside, las estructuras más importantes de la cola y las

fibras de la cola se ensamblan por separado. Después de que el ADN ha sido insertado

en la cabeza de la cápside, el ensamble de la cola preformada se une a ella. La adición de

las fibras de la cola completa la partícula viral.

Las Células

Las células son las unidades estructurales y funcionales de todo

ser vivo. Todos los organismos están conformados por células. El

cuerpo de todo organismo multicelular complejo está constituido

por una variedad de células diferentes especializadas. Aunque

estas células se asemejan en gran medida a los organismos

unicelulares en sus requisitos, difieren de éstos en que actúan en conjunto y en forma

coordinada y se diferencian y funcionan como parte de un todo organizado. Los

organismos unicelulares de la sabana, por ejemplo, están representados, entre otros,

por los parásitos de los sistemas digestivos de los vertebrados y por los organismos


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descomponedores.

Estos organismos unicelulares pueden ser procariotas o eucariotas.

En las plantas hay células que presentan algunas diferencias con las células de los

animales.

Los Tejidos

Los tejidos están formados por células individuales que trabajan en forma cooperativa.

En un animal, como cualquiera de los que viven en la

sabana, por

ejemplo, los

diferentes

tejidos que

constituyen

el organismo

son el tejido

epitelial, el

conectivo, el

nervioso y el muscular.

Tipos de tejido conectivo Tipo de tejido Localización Características Propiamente dicho Conectivo laxo Debajo de epitelios

que revisten las cavidades internas. Relacionado con epitelios de las glándulas y los vasos sanguíneos.

Fibras delgadas poco ordenadas, sustancia fundamental abundante. Fibroblastos y adipocitos abundantes Permite la migración de células en tránsito. En él ocurren reacciones inflamatorias de la respuesta immune. Permite la difusión de oxígeno y de nutrientes.

Conectivo denso irregular

En la capa inferior (dermis) de la piel.

Las fibras de colágeno no tienen una orientación definida. y se encuentran en elevada proporción. Sustancia fundamental y fibroblastos escasos. Provee resistencia a desgarros.

Conectivo denso regular

En los ligamentos, tendones y aponeurosis.

Fibras de colágeno formando haces en un patrón definido que le otorga alta resistencia al esfuerzo.

Una porción del tejido sanguíneo, en la que se observan particularmente glóbulos rojos.


20

Especializado Adiposo (blanco y pardo)

Por debajo de la piel (hipodermis) formando una capa aislante.

Contiene adipocitos (almacenadores de lípidos) en íntima relación con un rico lecho vascular. Almacenamiento de energía, aislación y protección de órganos vitales.

Óseo (compacto y esponjoso)

En huesos, resistente y muy liviano (el esqueleto humano constituye sólo aproximadamente el l8% de nuestro peso).

Matriz extracelular mineralizada (fosfato de calcio en forma de cristales de hidroxiapatita). Almacena calcio y fosfato que se pueden movilizar desde la matriz ósea y pasar a la sangre cuando se necesitan, regulando la homeostasis de los niveles de calcio. Sustancia fundamental con proteínas (colágeno y otras) y proteoglucanos. El colágeno y los componentes de la sustancia fundamental también están mineralizados.

Cartilaginoso Restringido a las articulaciones, anillos traqueales y estructuras de sostén del oído externo y la punta de la nariz (excepto en los animales de esqueleto cartilaginoso), también en los discos que actúan como amortiguadores entre las vértebras. En el feto forma los primeros huesos.

Células (condrocitos) secretan una matriz extracelular muy especializada, sólida y firme, pero elástica con fibras de colágeno que la refuerzan y sustancia fundamental. Los condrocitos (solos o en pequeños grupos) se encuentran en pequeñas cavidades de la matriz (lagunas). Generalmente es avascular y no inervado. Actúa como soporte de pesos en las articulaciones. Es clave para el crecimiento de los huesos. Algunos cartílagos son elásticos.

Hemopoyético En la médula ósea roja dentro de los espacios de los huesos largos: en los huesos jóvenes en la cavidad medular y en los espacios del hueso esponjoso.

Formación de glóbulos rojos, granulocitos, monocitos y plaquetas.

Linfoide En timo, ganglios linfáticos, médula ósea, amígdalas y bazo.

Formación de linfocitos y células de sostén de los órganos linfoides que forman redes laxas. Los linfocitos reaccionan en presencia de sustancias antigénicas.

Sanguíneo Dentro del corazón y los vasos sanguíneos del sistema circulatorio.

Matriz extracelular líquida con presencia de glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas. Transporte de nutrimentos, oxígeno, deshechos y otras sustancias.


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Los Órganos

Los órganos están formados por tejidos que cooperan y actúan en

coordinación. El estómago es un órgano que constituye el sistema

digestivo de cualquiera de los vertebrados de la sabana, por

ejemplo. La estructura del órgano más grande del cuerpo de un

vertebrado es la piel.

En las plantas, las hojas, los tallos y las raíces son ejemplos de órganos que constituyen

el cuerpo completo del organismo.

Los Sistemas de Órganos

Los sistemas de órganos están

constituidos por órganos que

trabajan en forma conjunta e

integrada. En la mayoría de los

animales, esta integración

y control la realizan el

sistema nervioso y el

endocrino. En los

animales de la sabana, por

ejemplo, como en

cualquier otro animal

incluido el ser humano, los sistemas de órganos son el

digestivo, respiratorio, excretor, circulatorio, inmune y

reproductor.

Los sistemas de órganos permiten que el organismo

multicelular tome y elimine sustancias desde y hacia el medio. En el curso de la

evolución, aquellos organismos multicelulares que presentaban estas estructuras se

vieron beneficiados y pudieron conquistar nuevos ambientes.

Un sistema de órganos, el sistema circulatorio de las aves y los mamíferos. Está


22

constituido por el corazón y los vasos sanguíneos.

Los Individuos

Existen individuos unicelulares ‐como los protistas y procariotas‐ y

multicelulares. Algunos organismos se encuentran en un nivel

intermedio entre una colonia de células y un organismo

multicelular auténtico; tal es el caso de las esponjas. Otros

organismos alcanzan el nivel de tejidos, como los cnidarios, y otros

se ubican en el nivel de órganos, como las plantas vasculares. Muchos animales

pertenecen al nivel de sistemas de órganos, entre ellos las jirafas y las acacias que

habitan en la sabana africana.

Los individuos como las jirafas o las acacias, por ejemplo, pueden ser estudiados de

diversas maneras. O bien como unidades constituyentes de las poblaciones en los

estudios ecológicos o bien como una unidad estructural y fisiológica.

Otros individuos que componen la sabana y muchos otros ecosistemas, pero que no

podemos ver, son los organismos unicelulares como las bacterias descomponedoras.

Las Poblaciones

La población es una unidad primaria de estudio ecológico; es un

grupo de organismos de la misma especie, interfértiles, que

conviven en el mismo lugar y al mismo tiempo. Entre las nuevas

propiedades que aparecen en el nivel de organización de

población están los patrones de crecimiento y mortalidad de la

población, la estructura etaria, la densidad y la distribución espacial.

En toda población hay otras dos propiedades interrelacionadas: su densidad y su patrón

de distribución espacial. La densidad es el número de individuos por unidad de área o de

volumen, mientras que el patrón de distribución espacial describe la ubicación espacial

de los organismos. Una compleja gama de factores ambientales, tanto bióticos como

abióticos, desempeñan un papel en la regulación del tamaño de la población.


23

Las Comunidades

La comunidad es un conjunto de organismos distintos que habitan

un ambiente común y que se encuentran en interacción recíproca.

Esa interacción regula el número de individuos de cada población

y el número y tipo de especies existentes en la comunidad y son

las fuerzas principales de la selección natural.

Se reconocen tres tipos principales de interacción específica en las comunidades: la

competencia, la predación y la simbiosis.

Cuanto más semejantes sean los organismos en cuanto a sus requisitos y estilos de vida,

más probable es que la competencia entre ellos sea intensa. Como resultado de la

competencia, la aptitud total de los individuos que interactúan puede verse reducida.

La simbiosis es una asociación íntima y a largo plazo entre organismos de especies

diferentes.

La evidencia actual indica que las comunidades son dinámicas, y cambian

continuamente a medida que cambian las condiciones.

Los Ecosistemas

El ecosistema, la unidad de organización biológica, está constituido

por todos los organismos que componen esa unidad –componente

biótico‐ y el ambiente en el que viven ‐componente abiótico‐. Estos

componentes interactúan de diversas maneras.

En el ecosistema de la sabana africana, por ejemplo, se pueden encontrar los tres niveles

tróficos habitualmente presentes en los ecosistemas: los productores, en este caso,

acacias y gramíneas; los consumidores primarios, jirafas, y los consumidores

secundarios, leones; y los descomponedores que degradan la materia orgánica hasta sus

componentes primarios inorgánicos.

La fuente última de energía que ingresa en un ecosistema es el Sol. Los productores

convierten una pequeña proporción ‐aproximadamente 1 a 3%‐ de energía solar en


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energía química. Los consumidores primarios (herbívoros) comen a los productores

primarios. Un carnívoro que come a un herbívoro es un consumidor secundario, y así

sucesivamente. En promedio, aproximadamente el 10% de la energía transferida en

cada nivel trófico es almacenada en tejido corporal; del 90% restante, parte se usa en el

metabolismo del organismo y parte no se asimila. Esta energía no asimilada es utilizada

por los detritívoros y, finalmente, por los descomponedores.

Los Biomas

Las comunidades vegetales y su vida animal asociada que

constituyen un bioma son discontinuas, pero una comunidad

puede asemejarse mucho a otra que se encuentre en el lado

opuesto del planeta. Sometidas a fuerzas evolutivas semejantes,

las formas de vida resultantes también se asemejan. Un bioma es

una clase o una categoría, no

un lugar. Cuando hablamos del

bioma de la sabana, por

ejemplo, no estamos hablando

de una zona geográfica

determinada, sino de todas las

sabanas del planeta. Como

ocurre con la mayoría de las

abstracciones, se omiten

detalles importantes. Por

ejemplo, los límites no son tan definidos como los muestran los mapas, ni tampoco es

fácil clasificar con criterios semejantes a todas las áreas del mundo. Sin embargo, el

concepto de bioma enfatiza una verdad importante: donde el clima es el mismo, los

organismos también son muy similares, aunque no estén genéticamente relacionados y

se encuentren muy distantes por su historia evolutiva. Los organismos de un mismo

bioma, pero de áreas geográficamente separadas, proporcionan muchos ejemplos de

evolución convergente.

Biomas del mundo. La infor‐mación de estos mapas y las refe‐rencias que los


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acompañan fue‐ron suministradas por A.W. Küchler, de la Universidad de Kansas, EEUU,

una de las principales autoridades en el tema de la distribución de biomas. Dada la

cobertura global de los mapas, la escala es relativamente pequeña y el contenido es

general. Los distintos biomas no siempre son uniformes y todos incluyen considerables

variaciones de vegetación. Los límites entre los biomas pueden ser marcados, pero

frecuentemente son difusos y están formados por zonas anchas de transición entre un

tipo de vegetación y otra.

Las sabanas son praderas tropicales con manchones de árboles dispersos. La transición

del bosque abierto con un suelo tapizado de gramíneas a la sabana es gradual y está

determinada por la duración y severidad de la estación seca y, frecuentemente, por el

fuego y por el pastoreo y ramoneo de los animales.

En la sabana, la competencia crítica es por el agua, en la cual las gramíneas resultan

favorecidas. Estas plantas son muy aptas para prosperar en suelos finos, arenosos, con

lluvias estacionales ya que sus raíces forman una densa red capaz de extraer la máxima

cantidad de agua durante el período de lluvias. Durante las estaciones secas, las partes

aéreas de las matas mueren, pero las raíces profundas son capaces de sobrevivir hasta

muchos meses de sequía. El equilibrio entre las plantas leñosas y las gramíneas es

delicado. Si disminuyen las lluvias, los árboles mueren. Si aumentan las lluvias, aumenta

la cantidad de árboles, sombrean a las gramíneas, y éstas, a su vez, tienden a

desaparecer. Si hay un pastoreo excesivo de gramíneas (lo que habitualmente ocurre

cuando se introduce ganado para propósitos pecuarios), queda un excedente de agua en

el suelo que incrementa el número de plantas leñosas y la pradera habitualmente

desaparece.

Las sabanas mejor conocidas son las de África, habitadas por el grupo de grandes

herbívoros más abundante y diverso del mundo, que incluye a las gacelas, el impala, el

antílope alce o elan, el búfalo, la jirafa, la cebra y el ñú. Otro ejemplo es la ancha banda

transicional que rodea a la región de las pampas, donde la estepa graminosa se va

poblando de bosquecillos y de ejemplares aislados de Prosopis y otras leguminosas

leñosas con forma de parasol. El paisaje vegetal recuerda a la sabana africana pero los

herbívoros, mucho menos abundantes, son medianos o pequeños: cérvidos, guanacos,


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ñandúes, diversos armadillos, vizcachas; entre los carnívoros: zorros, zorrinos, pumas y

diversas aves carroñeras.

La Biosfera

La biosfera es la parte de la Tierra en la que habitan los

organismos vivos. Es una película delgada sobre la superficie del

planeta, de irregular grosor y densidad. La biosfera está afectada

por la posición y movimientos de la Tierra en relación con el Sol y

por los movimientos del aire y del agua sobre la superficie de la

Tierra. Estos factores provocan grandes diferencias de temperatura y precipitaciones de

un lugar a otro y de una estación a otra. También hay diferencias en las superficies de los

continentes, tanto en composición como en altitud. Estas diferencias se reflejan en

diferencias en los tipos vegetales y animales que se encuentran en las distintas partes de

la biosfera.

La biosfera se extiende aproximadamente entre 8 y 10 km por encima del nivel del mar y

unos pocos metros por debajo del nivel del suelo, hasta donde pueden penetrar las

raíces y encontrarse los microorganismos.

Según la llamada hipótesis Gaia, la vida se puede interpretar como un único sistema

autorregulado que mantiene la temperatura, la composición de la superficie de la Tierra

y de la atmósfera a través de mecanismos de retroalimentación. La aparición de la vida

permitió el desarrollo y la evolución de condiciones adecuadas para sí misma sobre la

Tierra. Es un fenómeno automantenible a escala planetaria, es decir, tanto en el tiempo

como en el espacio. Una vez establecida firmemente en un planeta, se extiende por toda

su superficie y solamente desaparecerá cuando el planeta sufra un cambio cósmico

trascendental o cuando se acabe la fuente original de energía.

*El origen de la vida Fuente: Revista Ciencia Hoy. Vol. 3 - Nº 17 Marzo/Abril 1992 Marcelo Hermes-Lima Intistuto de Química, Universidad de San Pablo, Brasil En algún momento del pasado remoto, en algún ambiente acuático de la Tierra primitiva, la materia inanimada cobró vida. Tras las huellas que les permitan explicar este acontecimiento, científicos de todo el mundo se preguntan cuál habrá sido el "


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polímero primordial" que generó a los seres vivos. ¿Habrá sido un antepasado de las proteínas? ¿Lo sería de los ácidos ribonucleicos (ARN) o, tal vez, de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN)? Las investigaciones más recientes descartan estas tres posibilidades y apuntan hacia otra completamente nueva.

La cuestión del origen de la vida ha constituido desde hace mucho tiempo un desafío para la imaginación, pero puesto que no disponemos de una "máquina del tiempo" como la utilizada por el personaje de la novela de H. G. Wells, los intentos de reconstruir la génesis de la vida en el ambiente de la Tierra primitiva tienen mucho de temerario. Esto es así sobre todo porque no existen fósiles de los primeros seres vivos que colonizaron nuestro planeta. Los microfósiles más antiguos tienen tres mil seiscientos millones de años (3,6 eones). Sin embargo, los científicos han obtenido pruebas geológicas indirectas según las cuales la capacidad de fijar anhídrido carbónico, que es expresión de la existencia de seres vivos capaces de realizar fotosíntesis (es decir, de aprovechar la energía de la radiación solar para formar los compuestos necesarios para su supervivencia), apareció hace 3,8 eones.

La formación de la Tierra tuvo lugar hace 4,6 eones, pero su superficie se habría tornado menos inhóspita para la acumulación de compuestos orgánicos hace entre 4,2 y 4 eones. De manera tal que la vida, en su forma más primitiva, podría haber necesitado para surgir incluso menos de 0,4 eones, un tiempo muy breve en términos del calendario geológico. En ese exiguo espacio de tiempo, que nos lleva hasta los 3,8 eones antes mencionados, habría tenido lugar una serie encadenada de eventos bioquímicos capaces de conducir hasta la generación de aquellos primeros organismos con capacidad fotosintética.

La primera hipótesis consistente acerca de los procesos químicos que habrían dado origen a la vida fue la formulada por el bioquímico ruso Alexander I. Oparin. La traducción al inglés de su libro sobre el tema apareció en 1938 con el título de The Origin of Life y causó gran impacto. En esta obra se revisaban y ampliaban hipótesis que Oparin originalmente había publicado en una revista rusa poco conocida, la Proiskhjozdenic Zhizny. Este científico proponía que, después de la formación de la atmósfera primitiva de la Tierra, se había producido una serie de eventos químicos que aumentaron la complejidad de las moléculas existentes, determinando que moléculas primitivas se transformaran en estructuras coloidales llamadas "coacervados" de los que habría surgido una nueva organización de la materia: la vida. (Los coloides son suspensiones de partículas cuyo diámetro puede variar desde una milésima hasta diez millonésimas de milímetro. La asociación de estas partículas entre sí y con parte del solvente forma minúsculas gotas llamadas coacervados.) Según Oparin, este largo proceso de generación espontánea de la vida podría (y debería) ser reproducido en el laboratorio.

Esta hipótesis chocaba, sin embargo, con un obstáculo difícil de superar. En efecto, si bien era probable que se hubieran formado estructuras coloidales análogas a los coacervados, las cuales podrían haber estado constituidas por la asociación de macromoléculas, tal vez de estructura proteica y con capacidad de acelerar determinadas reacciones químicas sin sufrir por ello cambios permanentes (capacidad catalítica), resultaba muy difícil de explicar cómo habrían desarrollado esas estructuras un código genético. Por ello, la hipótesis de los coacervados fue paulatinamente abandonada, aunque la filosofía de Oparin sobre la evolución química todavía sirve de base para todos los estudios sobre el origen de la vida.


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El polímero primordial

En 1951, una nueva hipótesis sobre el origen de la vida fue propuesta, con escaso eco en la comunidad científica, por el físico inglés John Bernal. Según esta teoría, una entidad molecular podría definirse como viva si poseyera dos propiedades: capacidad de acumular información genética y capacidad de producir copias de su propia estructura. El metabolismo de este primer ser vivo —el "polímero primordial"— consistiría únicamente en esa capacidad de generar, autocatalíticamente, copias de sí mismo. (Un polímero, es una molécula formada por la unión de muchas moléculas más pequeñas, llamadas monómeros). Los errores producidos durante la autoduplicación podrían dar lugar a variedades con mayor resistencia a la destrucción o con mayor capacidad de reproducción y la selección natural —a nivel molecular— favorecería a estas variedades por su capacidad de adaptarse mejor al ambiente. Asi, la hipótesis de Bernal predecía la aparición de vida en forma de "polímeros autorreplicables", que habrían surgido antes de la aparición de microorganismos separados del medio externo por una membrana. ¿Cuáles podrían ser estos polímeros? Los candidatos naturales eran las proteínas (cadenas de moléculas pequeñas, los aminoácidos, ordenados en una secuencia determinada) o los ácidos nucleicos, el ARN y el ADN (véase "ADN, una molécula maravillosa" en Ciencia Hoy, vol. 2, n° 8, págs. 26‐35 y la figura 1).

Sin embargo, es difícil asignarle a cualquiera de ellos la función de polímero primordial. Las proteínas actúan como excelentes catalizadores, pero son incapaces de acumular información genética, ya que una proteína no puede guardar la información necesaria para la síntesis de otra. Por su parte los ácidos nucleicos (ARN y ADN) almacenan información genética, pero necesitan para duplicarse de enzimas, vale decir de proteínas con actividad catalítica. Entonces, ¿cuál de estos polímeros habría surgido primero en el planeta, los ácidos nucleicos o las proteínas? Hasta el comienzo de la década del '80 este problema (del tipo "el huevo y la gallina") no parecía tener solución. En los últimos años, sin embargo, una serie de evidencias parecieron indicar que el polímero primordial autorreplicable po Debe señalarse que el grupo del biofísico Sidney Fox, de Florida, EE.UU., cree aún ahora que las proteínas (o ciertas estructuras parecidas a ellas a las que llaman "polímeros proteinoides") podrían haber sido los polímeros primordiales. Sin embargo, este grupo ha intentado en vano probar su hipótesis estudiando, desde mediados de la década del '50, los mecanismos de polimerización de aminoácidos a altas temperaturas en medios similares al ambiente volcánico de la Tierra primitiva. Fox ha observado que, en estas condiciones, mezclas que contienen igual número de moléculas de cada uno de más de 15 aminoácidos diferentes generan una gran cantidad de polímeros proteinoides en los que se observa el predominio de algunos tipos de aminoácidos sobre el resto, índice de que la polimerización no se produce totalmente al azar. Estos experimentos, si bien fueron importantes porque los proteinoides así obtenidos tenían capacidad catalítica, han sido insuficientes hasta ahora: a pesar de que la polimerización térmica no ocurre totalmente al azar, el principio de orden que esto implica es insuficiente para conferir a los proteinoides mecanismos eficientes de acumulación y transmisión de la información genética. Por lo tanto, ya que no pueden reproducirse eficazmente, las proteínas no tienen ninguna posibilidad de constituirse en los polímeros primordiales.dría ser un ácido nucleico, más específicamente un ácido ribonucleico (ARN) y no una proteína.


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Fig.1. Esquema de la estructura química del ARN. El hexaedro, que representa al azúcar ribosa, contiene oxígeno en el vértice que ocupa la posición superior en el dibujo. Cada uno de los otros vértices contiene un átomo de carbono que no está representado. Los carbonos que constituyen la ribosa se numeran de 1 a 5 siguiendo la dirección de las agujas del reloj a partir del vértice que se encuentra a la derecha del oxígeno y terminando en el carbono que se une al vértice ubicado a la izquierda del oxígeno. La ribosa se une a una base (éstas pueden ser las bases pirimidínicas uracilo y citosina o las purínicas adenina y guanina) formando un ribonucleósido. Éste une el fosfato al carbono que ocupa la posición 5 en la ribosa para formar un ribonucleótido. Los ribonucleótidos se asocian entre si (se polimerizan) porque el fosfato de uno de ellos se une al carbono que ocupa la posición 3 en la ribosa de otro ribonucleótido. Los distintos ARN difieren entre sí por el número de ribonucleótidos que los forman y por el orden (secuencia) de sus bases. En el ADN la ribosa resulta reemplazada por desoxirribosa y la base pirimidínica uracilo por timina).

En lo que se refiere al ADN, los problemas son diferentes. Como el ARN, el ADN también requiere de proteinas para autoduplicarse, de modo que en el ambiente primitivo de la Tierra, los hipotéticos ADN primordiales no podrían haber servido de molde para ser copiados sin el auxilio de enzimas. Además, los desoxirribonucleótidos (las unidades que al unirse entre sí constituyen el ADN) son producidos por los seres vivos actuales a partir de los ribonucleótidos (las unidades que al unirse entre sí constituyen el ARN), lo que indica que el ADN debe haber aparecido mucho más recientemente que el ARN en el curso de la historia evolutiva de la Tierra. Por otra parte, el ADN es más resistente que el ARN a la descomposición por hidrólisis (en el caso del ADN la hidrólisis es la separación de los desoxirribonucleótidos que lo constituyen por incorporación de agua) y esto haría más difícil el reciclaje de monómeros (desoxirribonucleótidos) a partir de los polímeros descartados por la selección natural. Los hechos enunciados sugieren que resulta poco probable que haya ocurrido una colonización del ambiente acuático primordial de la Tierra a través de moléculas autorreplicables de ADN.

Una vez que se hubo excluido a las proteínas y al ADN, se pasó a explorar la posibilidad de que el polímero primordial fuera el ARN. Los trabajos que iniciaron en los años '70 los grupos liderados por los científicos estadounidenses Thomas Cech y Sidney Altman, quienes fueron laureados por ello con el Premio Nobel en 1989, ampliaron las fronteras de la química del ARN y modificaron profundamente los conocimientos científicos acerca del origen de la vida. Cech y sus colegas verificaron, en la Universidad de Colorado, que determinadas secuencias del ARN de ciertas bacterias eran capaces de


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acelerar la velocidad de algunas reacciones. En otras palabras, descubrieron que el ARN podía comportarse como una enzima. Cech llegó a bautizar a su ARN con el nombre de "ribozima", es decir una enzima constituida por ácido ribonucleico.

En 1981, Cech publicó en la revista Cell la demostración de que determinada secuencia de ribonucleótidos de una forma de ARN ribosomal llamado 26S podía ser separada, en el protozoario Tetrahymena termophila, del resto de la molécula. Este tipo de proceso es conocido por los científicos como splicing del ARN. Los autores utilizaron ARN ribosomal purificado y observaron que el splicing ocurría tanto en presencia de un extracto del núcleo del protozoario, que contiene las enzimas responsables de la catálisis del splicing, como en ausencia de ese extracto y por lo tanto de estas enzimas (véase la revista Cell, volumen 27, 1981, págs. 487‐499).

El mundo de los ARN

Recientemente el equipo de J. Doudna y J. Szostak observó que entre las reacciones catalizadas por el ARN figuraba su propia duplicación. De modo que el ARN sería capaz de copiarse a sí mismo utilizando sólo componentes pertenecientes a su propia estructura. Como un polímero con capacidad de reproducción puede ser ubicado en el límite entre los organismos vivos y la materia inanimada, muchos investigadores llegaron a pensar que la vida en la Tierra se había iniciado a partir de ARN o de estructuras muy semejantes a él.

Por su parte, el equipo de Sidney Altman realizó otro descubrimiento importante en la Universidad de Yale. Comprobó que una enzima de la bacteria Escherichia coli, la ARNasa P, que participa en el procesamiento del ARN, está constituida por dos componentes: uno proteico y otro formado por ARN. El grupo de Altman verificó que ambos componentes debían estar presentes para que la ARNasa P expresara su actividad catalítica. Este descubrimiento fue publicado en 1978 en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. Desde entonces la ARNasa P fue conocida por los científicos como una "enzima fósil" porque, como los organismos primordiales, asocia capacidad catalítica con capacidad de trasmitir información genética.

A su vez, en el Instituto Salk de San Diego, California, el grupo del bioquímico Leslie Orgel comprobó que determinados tipos de ARN (los polirribonucleótidos, constituidos por una sucesión de ribonucleótidos idénticos) son capaces de servir de molde para la oligomerización (síntesis de cadenas cortas constituidas por ribonucleótidos) en ausencia de enzimas de ribonucleótidos activados. Por ejemplo, estos investigadores demostraron que el polirribonucleótido policitosina puede servir de molde para la polimerización de la riboguanosina activada.

Un argumento adicional a favor del ARN es que todos los componentes que participan de la síntesis química del ARN ya han sido obtenidos en el laboratorio en condiciones que simulan el ambiente primitivo de la Tierra, mientras que a pesar de los esfuerzos realizados, no ha sido aún posible sintetizar en las mismas condiciones a la desoxirribosa, el azúcar componente estructural del ADN.

Frente a estos hallazgos parecía haberse resuelto el problema de "el huevo o la gallina" que perturbaba a los científicos. Si los ARN presentaran la adecuada actividad catalítica, o sea si pudieran funcionar como enzimas, ellos serían los polímeros capaces de desempeñar la función de enzimas primitivas y de duplicarse en ausencia de enzimas proteicas. La conclusión lógica era, entonces, que el ARN había aparecido en la Tierra antes que las proteínas. Las evidencias a favor del ARN resultaban


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tan contundentes que llevaron en 1986 a Walter Gilbert, de la Universidad de Harvard, a especular sobre la existencia de una fase evolutiva en la que los ambientes acuáticos de nuestro planeta habrían estado poblados por moléculas de ARN con las más variadas secuencias: era el "mundo de los ARN".

Según este modelo, los ARN serían capaces de autorreplicación y podrían poseer mecanismos de autoeliminación y autoinserción de secuencias. Sería así posible la aparición de una inmensa variedad de ellos, tanto por mecanismos de recombinación (véase la figura 2) como por errores en su duplicación. En el "mundo de los ARN" estos polímeros desempeñarían al mismo tiempo el papel de fenotipo y de genotipo (véase Nature, vol. 319, 1989, pág. 618). (El fenotipo es la expresión física de la información guardada en el mensaje genético o genotipo.)

Gilbert propuso también que, en una etapa ulterior de la evolución, los ARN habrían comenzado a sintetizar proteínas a partir de aminoácidos activados (como los aminoacil‐adenilatos utilizados por los organismos contemporáneos para la síntesis de proteínas) y que con el transcurrir del tiempo esas proteínas habrían adquirido una mayor capacidad catalítica que la del ARN. En una etapa ulterior la función de almacenar la información genética habría sido transferida del ARN al ADN mediante un proceso aún no esclarecido.

El modelo del "mundo de los ARN" parecía perfecto hasta que, a fines de los años '80, los científicos volvieron a tener dudas en relación con la hipótesis de que el ARN habría sido la primera estructura autorreplicable del planeta. La crítica fue formalizada principalmente por Robert Shapiro de la

Fig. 2: Ejemplo de un proceso primitivo de combinación de tres diferentes moléculas de ARN. C representa a la citosina y U al uracilo; ambos son basees constituyentes de los ribonucleótidos. En una primera etapa se produciría la autoeliminación de las regiones que se presentan en rojo. En una segunda etapa, las nuevas moléculas de ARN así formadas (cada una de ellas constituida por seis ribonucleótidos) podrían asociarse entre sí para formar otras 33 moléculas con diferentes secuencias de bases. El número 33 resulta de excluir del total de 36 (6x6) secuencias posibles aquellaas tres que simplemente regenerarían las secuencias originales (ARN 1,2 y 3).


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Universidad de Nueva York y por Gerald F. Joyce del Research Institute de la Scripps Clinic (en La Jolla, California). Todo comenzó cuando estos científicos decidieron formular la siguiente pregunta: ¿puede el ARN, con todos sus componentes, ser sintetizado en las condiciones primitivas a una velocidad mayor que la de su destrucción por la radiación ultravioleta, por hidrólisis o por su reacción con otras moléculas del ambiente? La respuesta fue que ello no era posible (cf. Origins of Life, vol. 18, 1988, págs. 71‐95, y Nature, vol. 338,1989, págs. 217‐224).

Ante esta actitud crítica, los científicos comenzaron a analizar las dificultades que presentaba el camino de la síntesis primitiva del ARN (véase "La síntesis primitiva del ARN"). El rendimiento final de una síntesis de ARN que hubiera partido de gases y de fosfato sería increíblemente bajo, de modo que, aunque la síntesis fuera posible en el ambiente de la Tierra primitiva, ese proceso de evolución química daría lugar a cantidades muy pequeñas de ARN. Aparte del muy bajo rendimiento quedaría otro serio obstáculo para la aparición del "mundo de los ARN": en las condiciones primitivas ocurriría una fuerte inhibición de la duplicación debido a la presencia de mezclas que contendrían los dos isómeros ópticos de los ribonucleótidos activados. (Los isómeros son moléculas que siempre presentan una misma composición atómica y un mismo peso molecular, pero que tienen diferentes configuraciones geométricas. En el caso de los isómeros ópticos, esta diferencia geométrica les confiere la propiedad de producir una distinta rotación del plano de polarización de un haz de luz polarizada que los atraviese, de ahí la denominación de "ópticos". Sólo uno de los dos isómeros ópticos de los ribonucleótidos está presente en el ARN.)

De ese modo, volviendo al ejemplo del experimento de Leslie Orgel, la formación de policitosina utilizando como molde a la poliadenosina sería fuertemente inhibida por la presencia de una mezcla formada por la misma cantidad de los isómeros ópticos de la riboguanosina activada. Como en los ambientes primitivos deben de haber existido mezclas de este tipo, puede inferirse que el ARN habría tenido grandes dificultades para reproducirse.

Los falsos ARN

Dificultades como las mencionadas están llevando a los investigadores a buscar otro polímero primordial autorreplicable. Este podria ser, tal vez, muy semejante al ARN pues se piensa que habrían existido sustancias de comportamiento semejante, o sea "análogos del ARN". Existen muchas sustancias de este tipo; en la figura 3 se representan algunos análogos de ribonucleósidos en los que

Fig. 3. Comparación de un ribonucleósido "verdadero" a) con análogos "primitivos". En éstos, el azúcar ribosa es reemplazado por otros compuestos: el glicerol (b), la acroleína (c) y el eritrol (d).


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otros compuestos ocupan el lugar del azúcar ribosa.

La atención se concentró en un determinado tipo de análogos del ARN que podrían existir en los ambientes acuáticos de la Tierra primitiva: los aciclonucleósidos derivados del glicerol. (El prefijo " aciclo" indica que el compuesto que reemplaza a la ribosa carece de la estructura cíclica cerrada en anillo de la ribosa, como se observa en la figura 1). Estos compuestos podrían haber sido formados en dos etapas: primero por la condensación del glicerol con formaldehído y la generación de hemiacetales y luego por la reacción de estos hemiacetales con bases nitrogenadas. En el ambiente primitivo, la incorporación de fosfato a partir de polifosfatos podría haber generado análogos de los ribonucleótidos.

Un aspecto que hace atractiva esta hipótesis lo constituye el hecho de que la estabilidad del glicerol es muy superior a la de la ribosa, lo que puede haber permitido su acumulación en los ambientes acuáticos de la Tierra primitiva en cantidad suficiente como para formar los aciclonucleósidos. Una ventaja adicional es que estos compuestos no tienen isómeros ópticos "indeseables". Los aciclonucleótidos pueden polimerizarse (generando análogos del ARN) y formar los moldes necesarios para la autorreplicación de estos polímeros. Procesos similares pueden haber ocurrido con otros tipos de análogos del ARN.

Por esa razón, el problema que hoy preocupa a los investigadores es determinar cómo se pasó del "mundo de los análogos del ARN'' al "mundo de los ARN". Quizá, los primeros análogos del ARN estaban compuestos de diferentes variedades de análogos y podrían contener, incluso, algunos "auténticos" ribonucleótidos. La selección natural en el "mundo de los análogos del ARN" debe haber favorecido aquellos polímeros que presentaban una mejor relación entre capacidad de autoduplicación y resistencia a la destrucción.

En un plazo corto en términos de la evolución (no más de 0,4 eones) se habrían ido seleccionando progresivamente aquellos polímeros con mayor cantidad de "auténticos" ribonucleótidos. De ese modo, poco a poco, habría aparecido el "mundo de los ARN". En el curso de este proceso, los análogos del ARN habrían iniciado la síntesis de las primeras proteínas por mecanismos muy primitivos. Las primeras proteínas podrían haber desempeñado una función importante en la selección positiva de los ARN.

A partir de esta etapa se entra en un campo altamente especulativo, que carece prácticamente de sustento experimental. Hay por lo tanto mucho que trabajar para reconstruir el largo camino que la evolución ha seguido desde los primeros análogos del ARN hasta los organismos más complejos que contienen ADN como molécula que guarda y transmite la información genética.

La edición de texto de este artículo, originariamente escrito en portugués, fue realizada por los equipos técnicos de la revista Ciencia Hoy. Traducción al castellano y revisión técnica: Patricio J. Garrahan.

LECTURAS SUGERIDAS

• FERRIS, J. P. y USHER, D.A., 1988, "Origins of life", en Biochemistry, G. Zubay/Macmillan Publishing Company, New York, págs. 1120‐1151.

• HERMES‐LIMA, M, 1990, "Natural selection in the RNA‐like world", Naturwissenschaften, vol.


34

77, págs. 226‐27.

• HERMES‐LIMA, M., TESSIS, A.C. y VIEYRA, A., 1990, "Adsorption of 5'‐Adenosine monophosphate onto precipitated calcium phosphate: effects of inorganic polyphosphates and carbonyl phosphate", Origins of Life and Evolution of the Biosphere. vol. 20. págs. 27‐41.


35

CAPÍTULO SEGUNDO:

La Química de las Células


36

LA QUÍMICA DE LAS CÉLULAS

Introducción

Las células son estructuras increíblemente diversas y complejas, capaces no sólo de

replicarse a si mismas –una de las características esenciales de la vida– sino también de

realizar una amplia gama de tareas especializadas en los organismos multicelulares.

Las células además obedecen las mismas leyes químicas y físicas que determinan el

comportamiento de los sistemas no vivos. Consecuentemente, la biología celular

moderna, apunta a comprender los procesos celulares en términos de reacciones físicas

y químicas.

Consideraremos en esta unidad los principios biológicos fundamentales que gobiernan la

vida de las células. No es nuestra intención realizar una discusión completa de la

bioquímica de las células ni de todas las cartas de las reacciones metabólicas que

ocurren dentro de las células. Enfocaremos aquí cinco tópicos mayores: los tipos de

moléculas dentro de las células, el rol central de las proteínas como catalizadores

biológicos, la generación y utilización de energía metabólica, la biosíntesis de los

mayores constituyentes celulares y la estructura de la membranas biológicas.

La Composición Molecular de las Células

Las células están compuestas de agua, iones inorgánicos y moléculas que contienen

carbono (moléculas orgánicas). El agua es la molécula más abundante de las células,

contabiliza hasta el 70% o más de la masa celular total. En consecuencia, las

interacciones entre el agua y los otros constituyentes celulares son de importancia

central en la química biológica. La propiedad crítica del agua es la de ser una molécula

polar, en la que el átomo de Oxígeno posee una ligera densidad de carga negativa,

mientras que los átomos de Hidrógeno poseen una ligera densidad de cargas positivas.

Debido a su naturaleza polar las moléculas de agua pueden formar puentes hidrógeno

entre si o con otras moléculas polares, así como interactuar con iones cargados positiva

o negativamente. Como resultado de estas interacciones, los iones y las moléculas

polares son solubles en agua (hidrofílicos). En contraste, las moléculas no polares, son

pobremente solubles en ambientes acuosos (hidrofóbicos). En consecuencia, las


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moléculas no–polares tienden a minimizar sus contactos con agua asociándose entre

ellas.

Los iones inorgánicos de las células incluyendo: Sodio (Na+), Potasio (K+), Magnesio

(Mg2+), Calcio (Ca2+), Fosfato (HPO42–), Cloruros (Cl–) y Bicarbonato (HCO3

–) constituyen

1% o menos de la masa de las células. Sin embargo, estos iones están involucrados en

numerosos aspectos del metabolismo celular y poseen roles críticos en la función

celular.

Las moléculas orgánicas son constituyentes críticos de las células. La mayoría de estos

componentes orgánicos pertenecen a una de cuatro clases de moléculas: carbohidratos,

proteínas, lípidos o ácidos nucleicos. Las proteínas, los ácidos nucleicos y la mayoría de

los carbohidratos (polisacáridos), son polímeros de cientos o miles de precursores de

bajo peso molecular: aminoácidos, nucleótidos y azúcares simples respectivamente.

Tales moléculas constituyen del 80 al 90% del peso seco de la mayoría de las células. Los

lípidos son los otros constituyentes mayores de las células. La masa remanente de las

células está compuesta de una variedad de moléculas orgánicas pequeñas, incluyendo

los precursores macromoleculares. La base química de las células puede ser así

comprendida en términos de estructuras y funciones de las cuatro mayores clases de

moléculas orgánicas.

CARBOHIDRATOS

Los carbohidratos incluyen azúcares simples así como también polisacáridos. Estos

azúcares simples, tales como la glucosa, son los mayores nutrientes de las células. Su

descomposición provee tanto la fuente de energía de las células como el material de

partida para la síntesis de otros constituyentes celulares. Los polisacáridos son formas

de almacenamiento de azúcares y componentes estructurales de las células. Además, los

polisacáridos y polímeros de azúcares más cortos actúan como marcadores para una

variedad de procesos de reconocimiento celular, incluyendo la adhesión de las células a

sus vecinos y el transporte de proteínas a sus destinos intracelulares apropiados.

Los monosacáridos, los carbohidratos más sencillos, son aldehídos o cetonas que tienen

dos o más grupos hidroxilo; la fórmula empírica de muchos es (CH2O)n, literalmente un


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"hidrato de carbono". Los monosacáridos más pequeños (n= 3), son la dihidroxiacetona

y el D‐ y L‐gliceraldehído (Fig. 2‐1).

Fig. 2-1 Representación de Dihidroxicetona, D-Gliceraldehído y L- Gliceraldehido respectivamente (Modificado de Biochemistry de Berg).

Estas moléculas también reciben el nombre de TRIOSAS. La dihidroxiacetona es una

cetosa porque contiene un grupo ceto, mientras que el gliceraldehído es una aldosa

porque contiene un grupo aldehído. Los D‐ y L‐Gliceraldehídos, desde el punto de vista

de su isomería, se denominan enantiómeros, o imágenes especulares uno del otro.

Los monosacáridos y otros azúcares a menudo son representados por las denominadas

proyecciones de Fischer (Fig. 2‐2). Las proyecciones de Fischer son útiles para

representar las estructuras de los carbohidratos, ya que proporcionan vistas claras y

sencillas de la estereoquímica en cada centro del átomo de carbono.

Fig. 2-2: proyecciones de Fischer de D- y L-Gliceraldehído y de Dihidroxicetona. (Modificado de Biochemistry de Berg).

Los monosacáridos sencillos con cuatro, cinco, seis, y siete átomos de carbono se llaman

tetrosas, pentosas, hexosas, y heptosas, respectivamente. Con respecto a estos

monosacáridos, los símbolos D y L designan la configuración absoluta del carbono

asimétrico más alejado del grupo carbonilo (aldehído o cetona). En la Fig. 2‐3 se


39

presentan las D‐aldosas más comunes: D‐Ribosa, una aldosa de cinco átomos de

carbono; la D‐Glucosa, D‐manosa, y D‐galactosa aldosas de seis átomos de carbono. Si

observamos las fórmulas de la D‐ glucosa y D‐manosa, observamos que difieren sólo en

la configuración del C2.

Fig 2‐3.

Serie de las D‐aldosas más importantes (Modificado de Biochemistry de Berg).

Los azúcares que difieren en la configuración de un solo centro asimétrico se llaman

epimeros. Así, D‐la glucosa y D‐manosa son epímeros en el C2 y la D‐glucosa y D‐

galactosa son epímeros en el C4.

Como ya dijimos anteriormente, la dihidroxiacetona es la cetosa más sencilla. La relación

estereoquímica entre las D‐cetosas que contienen seis átomos de carbono, muestra que

las mismas tienen un centro asimétrico menos que las aldosas con el mismo número de

átomos de carbono. La D‐Fructosa es la CETOHEXOSA más ABUNDANTE (CETO= de grupo

funcional ceto, y HEXOSA= de seis átomos de carbonos).

Estructuras de pentosas y hexosas cíclicas derivadas del anillo de pirano y furano.

D‐Gliceraldehído

D‐Eritrosa D‐Treosa

D‐Ribosa D‐Arabionosa D‐Xilosa D‐Lixosa

D-Alosa D-Altrosa D-Glucosa D-Manosa D-Gulosa D-Idosa D-Galactosa D-Talosa


40

Las formas predominantes en solución de la ribosa, glucosa, fructosa, y de muchos otros

azúcares no son precisamente como cadenas abiertas. Las formas de cadena abierta de

estos azúcares, en solución se ciclan formando anillos. Esto se fundamenta en general,

en que un aldehído (considerando una aldosa) puede reaccionar con un grupo alcohol

para formar un hemiacetal. (Fig. 2.4)

Para una aldohexosa, tal como la glucosa, el C1 aldehídico en la cadena abierta,

reacciona con el grupo hidroxilo del C‐5 para formar un hemiacetal intramolecular. El

resultado es la formación de un hemiacetal cíclico, es decir, un anillo de seis átomos,

llamado piranosa, a causa de su similitud al anillo de pirano (Fig. 2‐5). De modo

semejante, una cetona puede reaccionar con un alcohol para formar un hemicetal. (Fig.

2‐6).

Fig. 2‐5 (Modificado de Biochemistry de Berg) Fig. 2‐6 (Modificado de Biochemistry de Berg)

El grupo ceto del C‐2 de un cetohexosa de cadena abierta, tal como la fructosa, puede

formar un hemicetal intramolecular, cuando reacciona con el grupo de hidroxilo del C‐6

para formar un anillo de seis átomos, o también con el grupo hidroxilo del C‐5 para

formar un anillo de cinco átomos (Fig. 2‐7). El anillo de cinco átomos se denomina

furanosa a causa de su similtud al anillo de furano.

Aldehído Alcohol Hemiacetal

Fig. 2‐4. Formación de un Hemiacetal(Modificado de Biochemistry de Berg).

D‐Glucosa

α D‐Glucopiranosa

β D‐Glucopiranosa

Cetona Alcohol Hemicetal


41

D‐Ribosa

2 Deoxi D‐Ribosa

Fig 2‐8 (Modificado de

Biochemistry de Berg)

Fig. 2‐7 (Modificado de Biochemistry de Berg).

Las descripciones de la glucopiranosas y fructofuranosas mostradas en las figs. 2‐6 y 2‐7

son las proyecciones de Haworth. Como en las proyecciones de Fischer, las proyecciones

de Haworth permiten realizar una descripción fácil de la

estereoquímica de los azúcares.

Al generarse un hemiacetal cíclico, se crea un nuevo centro

asimétrico. Así, en el anillo se pueden formar dos estructuras

denominados anómeros. Para el caso de la glucosa, estás reciben el

nombre de α‐glucopiranosa y β‐glucopiranosa (ver la fig. 2‐6). El

carbono anomérico es el C‐1. El anómero α es el que presenta el

grupo hidroxilo del hemiacetal, por debajo del plano del anillo y el β

por encima del plano.

La misma nomenclatura se aplica a la forma del anillo

furanósico de la fructosa (ver la fig. 2‐7). La fructosa forma

tanto los anillos de piranosa como de furanosa. La forma piranosica predomina en la

fructosa libre en solución, y la forma de furanosica predomina en muchos derivados de

la fructosa (Fig. 2‐8)

Identificación de azúcares

La glucosa, entre otros, reacciona con agentes oxidantes tales como ion cúprico (Cu2 +)

en medio alcalino, debido a que la forma abierta de la cadena tiene un grupo libre

aldehído libre que se comporta como un reductor. (Fig. 2‐9)

Las soluciones de sales de cobre en medio alcalino (conocidas como solución de Fehling),

proporcionan una prueba sencilla para azúcares, tal como la glucosa y otros hidratos de

carbono con propiedades reductoras. Los azúcares que reaccionan se llaman azúcares

D‐Fructosa α D‐Fructofuranosa


42

reductores.

Fig. 2‐9 (Modificado de Biochemistry de Berg)

DISACÁRIDOS

Debido a que los azúcares contienen muchos grupos hidroxilos, los enlaces glicosídicos

pueden unir un monosacárido con otro. Los oligosacáridos se construyen por la unión de

dos o más monosacáridos por enlaces O‐glicosídicos (Fig. 2‐10).


Un disacárido consiste en dos azúcares unidos por un enlace O‐glicosídico. Los tres

disacáridos más abundantes son la sacarosa, lactosa, y la maltosa. En la sacarosa, se

encuentran unidos los átomos de carbono anoméricos de una unidad de glucosa y una

unidad de fructosa, siendo la configuración de esta unión glicosídica � para la glucosa y �

para la fructosa.

La lactosa, el disacacárido de leche, consiste en una galactosa unida a una glucosa por

una unión ��‐1, 4‐glucosídica.

En la maltosa, dos residuos de D‐glucosa están unidos por enlaces glicosídicos entre C1

Unión


43

anomérico alfa, y el hidroxilo del C4 del azúcar adyacente. Tal unión se llama enlace α‐1,

4 glicosídico. (Fig. 2‐11)


POLISACÁRIDOS

Los grandes polímeros de oligosacáridos, formados por la unión de múltiples

monosacáridos, son llamados polisacáridos. Los polisacáridos juegan papeles esenciales

en el almacenamiento de energía y mantenimiento de la integridad estructural de un

organismo. Si el monosacárido presente en la estructura es el mismo, estos polímeros se

llaman homopolimeros.

Almidón y glucógeno

Tanto el almidón, que pertenece a las células vegetales, como el glucógeno, de las

células animales, son polisacáridos de almacenamiento que se acumulan formando

gránulos. Estos polisacáridos están altamente hidratados ya que tienen cientos o miles

de grupos hidroxilos expuestos al medio acuoso. Ambos son polímeros de glucosa en

distintas estructuras.

LACTOSA

SACAROSA

MALTOSA


44

El almidón está compuesto por 2 tipos de polímeros de glucosa:

1. Amilosa (gluc (alfa 1→ 4) gluc)n polímero lineal (PM 500.000)

2. Amilopectína (glucosa (alfa 1→4) gluc), cada 24‐30 residuos glucosa (alfa1→6) gluc

(PM 1.000.000). (Fig. 2‐12)


El glucógeno es un polímero ramificado de glucosa como la amilopectina del almidón,

salvo que las ramificaciones ocurren cada 8‐12 residuos en la cadena lineal por lo que es

un polímero más compacto que el almidón.

En las células animales, el glucógeno se encuentra en forma de gránulos en ciertas

células como las hepáticas y musculares. Cada molécula de glucógeno tiene un peso de

varios millones y tiene asociado a la molécula las enzimas de síntesis y degradación del

polímero.

La glucosa es almacenada al interior de la célula vegetal y animal como un polímero de

alto peso molecular, y no como glucosa libre, ya que de esta forma contribuye poco a

generar diferencia osmolar entre el interior de la célula y el medio externo (la

osmolaridad está dada por el número de moléculas en solución y su diferencia con el

medio externo). La forma del depósito en la célula vegetal es como almidón, y como

glucógeno en la célula animal.

Celulosa y quitina.

Enlace α 1,6 glucosídico


45

Tanto la celulosa como la quitina son homo polisacáridos estructurales. La celulosa es un

polímero de D‐glucosa unidas por enlace glicosídico β 1‐4 y la quitina un polímero de N‐

acetilglucosamina con el mismo enlace.

El enlace glicosídico β1‐4 genera polímeros lineales más rígidos que los de la amilosa que

son α 1‐4 y permite que varios polímeros lineales interactúen entre ellos formando

fibras que son más resistentes.

La celulosa forma la parte leñosa y resistente de muchos vegetales, la quitina compone

el caparazón de muchos artrópodos.

Los animales pueden degradar amilosa, amilopectina y glucógeno, ya que tienen las

enzimas que hidrolizan el enlace α 1‐4, pero no pueden degradar celulosa o quitina

(excepto los rumiantes) porque no tienen enzimas para el enlace β 1‐4.

GLICOSAMINOGLICANOS

Una clase diferente de polisacáridos está presente en la superficie de la célula animal y

en la matriz de extracelular. Los glicosaminoglicanos y proteoglicanos son

heteropolisacáridos que conforman la matriz extracelular que existe entre las células de

los tejidos animales.

Los glicosaminoglicanos son polímeros lineales compuestos por la repetición de un

disacárido. El disacárido es N‐acetilglucosamina o N‐acetilgalactosamina. Los grupos

hidroxilos de la N‐acetilglucosamina o galactosamina están muchas veces esterificados

con un grupo fosfato, los cuales, sumado a los grupos carboxilo del ácido urónico le dan

carga negativa al glicosaminoglicano.

El sulfato de condroitin, sulfato de queratan, la heparina, sulfato de heparan, sulfato de

dermatan, y el hialuronato; son los glicosaminoglicanos más importantes.

Los glicosaminoglicanos se encuentran conectados generalmente a proteínas para

formar proteoglicanos. En los proteoglicanos, el carbohidrato compone el 95% del peso

de la biomolecula. La función de los proteoglicanos es la de actuar como componentes

estructurales del tejido conectivo y mediar la adhesión celular a la matriz extracelular,

entre otros. Los proteoglicanos están compuestos por una molécula central larga de


46

ácido hialurónico a la que se unen de forma no covalente, pequeñas proteínas (20.000),

y de forma covalente otros glicosaminoglicanos como el sulfato de condroitín, sulfato de

queratán, sulfato de heparán y sulfato de dermatán.

Los proteoglicanos pueden llegar a ser moléculas inmensas que se entremezclan con las

fibras de colágeno y elastina para formar la matriz extracelular. Se unen a ciertas

proteínas de membrana, y estas se unen a su vez a proteínas integrales de membrana

llamadas integrinas. De esta forma se anclan los proteoglicanos de la matriz extracelular

a la célula.

Glicoproteínas

Los diferentes grupos de carbohidratos se conectan covalentemente a muchas proteínas

diferentes para formar glicoproteínas. Los carbohidratos aquí ocupan un porcentaje más

pequeño del peso de la glicoproteina. Muchas glicoproteinas son componentes de las

membranas de celulares, donde juegan una variedad de papeles en procesos tales como

la adhesión celular.

Los oligosacáridos unidos a proteínas son generalmente heterooligosacáridos, en los que

se combinan diferentes monosacáridos con diferentes tipos de uniones (1‐3, 1‐4. 1‐2, 1‐

6, 2‐3).

Puede haber varias cadenas de oligosacáridos unidos a una misma proteína. Las cadenas

pueden ser cortas o largas, y lineales o ramificadas.

Los oligosacáridos se unen a la proteína a través de un enlace O‐glicosídico cuando el

azúcar terminal se une al hidroxilo (OH) de una serina o treonina, o a un enlace N‐

glicosídico cuando el azúcar se une a una asparagina. La enorme cantidad de azúcares

que existen, le dan una variabilidad muy grande a las glicoproteínas.

El proceso de glicosilación de una proteína se verá en detalles en el capítulo de sistemas

de endomembranas.

FUENTES DE CARBOHIDRATOS

Además de ser obtenida a partir de los alimentos o generados por fotosíntesis, la

glucosa puede ser sintetizada a partir de otras moléculas orgánicas. En las células


47

animales, la síntesis de glucosa (gluconeogénesis) usualmente comienza con el lactato

(producido por glucólisis anaerobia), aminoácidos, (derivados de la descomposición de

las proteínas), o glicerol (derivado de la descomposición de los lípidos). Los vegetales

(pero no los animales) son capaces de sintetizar glucosa a partir de ácidos grasos –un

proceso particularmente importante durante la germinación de las semillas donde la

energía almacenada en forma de semillas debe ser convertida a carbohidratos para

sostener el crecimiento de las plantas–. Tanto en células vegetales como en las

animales, los azúcares simples son polimerizados y almacenados como polisacáridos.

La gluconeogénesis involucra la conversión de piruvato a glucosa –esencialmente la

inversa de la glucólisis– Sin embargo, la conversión de glucosa a piruvato es una vía

productora de energía, que genera dos moléculas de ATP y NADH. Aunque algunas

reacciones de glucólisis son realmente reversibles, otras proceden sólo en la dirección

de la descomposición de la glucosa, ya que están asociadas con una gran disminución de

la energía libre. Estas reacciones energéticamente favorables de la glucólisis son

salteadas durante la gluconeogénesis por otras reacciones (catalizadas por diferentes

enzimas) que están acopladas al consumo de ATP y NADH en orden de conducirlas en

dirección de la síntesis de glucosa. En general, la generación de una molécula de glucosa

a partir de dos moléculas de piruvato requiere cuatro moléculas de ATP, dos de GTP y

dos de NADH. Este proceso es considerablemente más costoso que la simple reversión

de la glucólisis (que requiere dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH),

ilustrando la energía adicional requerida para conducir una vía en la dirección

biosintética.

Tanto en células vegetales como animales, la glucosa es almacenada en forma de

polisacáridos (almidón y glucógeno respectivamente). La síntesis de polisacáridos

requiere el aporte de energía. Como se indicó anteriormente la reacción de unión de dos

azúcares por un puente glucosídico es esencialmente una reacción de deshidratación, en

la que se elimina agua (Figura 2.3). Sin embargo, tal reacción es energéticamente

desfavorable y por lo tanto incapaz de proceder en la dirección de formación. En

consecuencia, la formación de una unión glucosídica debe estar acoplada a una reacción

proveedora de energía, que está acompañada por el uso de azúcares nucleotídicos como


48

intermediarios en la síntesis de polisacáridos (Figura). La glucosa es primero fosforilada

en una reacción conducida por ATP a glucosa‐6‐fosfato, que luego es convertida a

glucosa‐1‐fosfato. La glucosa‐1‐fosfato, reacciona con UTP (uridina trifosfato)

produciendo glucosa–UDP + pirofosfato, que luego es hidrolizado a fosfato con la

liberación de la energía libre adicional. La glucosa–UDP es un intermediario activado que

luego dona su residuo de glucosa a una cadena naciente de polisacárido en una reacción

energéticamente favorable.

Así, la energía en forma de ATP y UTP conduce la síntesis de polisacáridos a partir de

azúcares simple.

LÍPIDOS

Los lípidos cumplen tres roles críticos en las células. Primero, proveen una importante

forma de almacenamiento de la energía, segundo, y de gran importancia en biología

celular, los lípidos son componentes principales de las membranas celulares y tercero,

los lípidos juegan un importante rol en el señalamiento celular, tanto como hormonas

esteroides (por ej. estrógenos y testosterona) o como moléculas mensajeras que envían

señales desde la superficie celular a blancos específicos en el interior de las células.

Los lípidos más simples son los ácidos grasos (Fig. 2‐13) que consisten de largas cadenas

hidrocarbonadas, muy frecuentemente constituidas por 16–18 átomos de carbono con

un grupo carboxilo en uno de sus extremos (COO–). Los ácidos grasos insaturados

contienen una o más dobles ligaduras entre átomos de carbono; en los ácidos grasos

saturados todos los átomos de carbono están unidos al máximo número de átomos de

H. Las largas cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos contienen sólo uniones C–H

no polares, que son incapaces de interactuar con agua. La naturaleza hidrofóbica de

estas cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos son las responsables del

comportamiento de muchos de los lípidos complejos, particularmente en relación con la

formación de las membranas biológicas.

Los ácidos grasos son almacenados en forma de triacilgliceroles (Fig. 2‐14) o grasas, los

que consisten de tres ácidos grasos ligados a una molécula de glicerol. Los

triacilgliceroles, son insolubles en agua y se acumulan como gotas de grasa en el


49

citoplasma. Cuando son necesarios, pueden ser degradados para usarlas en reacciones

productoras de energía. Es de destacar que los lípidos son una forma de

almacenamiento de energía más eficiente, produciendo más del doble de energía por

peso de material degradado. Los lípidos, permiten asimismo, almacenar la energía en

menos de la mitad del peso corporal que se requeriría para almacenar la misma

cantidad de energía en forma de carbohidratos –una consideración particularmente

importante para animales en función de su movilidad–.

Fig. 2‐14 (Modificado de “Molecular Biology of the Cell” Albert)

Los Fosfolípidos (fig. 2‐

15), son los principales componentes de la membrana celular, consisten de dos ácidos

grasos unidos a una cabeza polar. En los fosfolípidos, los dos ácidos grasos están unidos

a átomos de carbón del glicerol, como en los triacilgliceroles. Sin embargo, el tercer

carbono del glicerol, está unido a un grupo fosfato, el cual a su vez puede estar unido a

una molécula polar como la colina, la serina, el inositol o la etanolamina (Fig. 2‐16). La

esfingomielina, el único fosfolípido no acilglicerólico de la membrana celular, contiene

dos cadenas hidrocarbonadas unidas a cabezas polares formadas por serina en lugar de

glicerol. Así, todos los fosfolípidos tienen colas hidrofóbicas, consistentes de dos cadenas

hidrocarbonadas y cabezas hidrofílicas, consistentes de grupos fosfato y sus anclajes

polares. En consecuencia, los fosfolípidos son moléculas anfipáticas, parte solubles en

agua y parte insolubles en agua. Esta propiedad de los fosfolípidos es la base de la

formación de las membranas biológicas, como se discutirá más adelante.


50


Fig. 2‐16 Fosfolípidos de la membrana plasmática y un fosfolípido de las mitocondrias

Además de los fosfolípidos, la mayoría de las membranas celulares poseen

glucolípidos y colesterol. Los glucolípidos (Fig. 2‐17) consisten de dos cadenas

hidrocarbonadas unidas a cabezas formadas por grupos polares que contienen

carbohidratos. Así, son similares a los fosfolípidos en su organización general como

moléculas anfipáticas. En contraste, el colesterol (Fig. 2‐18) consiste de cuatro anillos

hidrocarbonados en lugar de cadenas hidrocarbonadas lineares. Los anillos

hidrocarbonados son fuertemente hidrofóbicos, pero el grupo hidroxilo (OH) anclado a

un extremo del colesterol es débilmente hidrofílico, lo que le confiere al colesterol

características anfipáticas.

Fig. 2‐13 (Modificado de “Molecular Biology

of the Cell” Albert)


51

Fig. 2‐17 (Modificado de “Molecular Biology of the Cell”, Albert)


Además de sus roles como componentes de las membranas celulares los lípidos actúan

como moléculas de señalamiento, tanto dentro como entre las células. Las hormonas


52

esteroides son derivados del colesterol. Estas hormonas son un grupo diverso de

mensajeros químicos, que se caracterizan por poseer cuatro anillos hidrocarbonados a

los que se unen diferentes grupos funcionales. Los derivados de los fosfolípidos también

actúan como moléculas mensajeras dentro de las células, transmitiendo señales desde

los receptores de la superficie hacia blancos intracelulares.

Los lípidos son moléculas muy importantes en el almacenamiento de la energía y un

constituyente principal en las membranas celulares. Ellos son sintetizados a partir de la

acetil–CoA, la que está formada por la descomposición de los carbohidratos a partir de

una serie de reacciones que recuerdan a la inversa de la oxidación de los ácidos grasos.

Sin embargo, como ocurre en la síntesis de carbohidratos, las reacciones que conducen a

la síntesis de ácidos grasos difieren de la involucrada en su degradación en que deben

estar acopladas al aporte de energía en forma de ATP y poder reductor en forma de

NADPH. Los ácidos grasos se sintetizan por la adición de unidades de dos carbonos

derivados de la acetil–CoA a una cadena creciente. La adición de cada una de estas

unidades de dos carbonos requiere el aporte de una molécula de ATP y dos moléculas de

NADPH.

Los principales productos de la biosíntesis de ácidos grasos, que ocurre en el citosol de

las células eucarióticas, es el ácido graso de 16 átomos de carbono palmitato. Los

principales constituyentes de las membranas celulares (fosfolípidos, esfingomielina, y

glucolípidos) se sintetizan luego a partir de ácidos grasos libres en el RE y el aparato de

Golgi.

LÍPIDOS DE MEMBRANA

ESTE TEMA SE DESCRIBIRÁ ESPECÍFICAMENTE EN EL CAPÍTULO 3

Ácidos Nucleicos

Los ácidos nucleicos son las principales moléculas portadoras de la información de las

células. El ácido desoxirribonucleico (ADN) posee un rol crítico como material genético,

que en las células eucariotas, está localizado en el núcleo. Los diferentes tipos de ácido

ribonucleico (ARN) participan en numerosas actividades celulares. El ácido ribonucleico


53

mensajero (ARNm) lleva la información desde el ADN a los ribosomas, donde actúa

como patrón para la síntesis de proteínas. Los otros dos tipos de ARN, el de

transferencia (ARNt) y el ribosomal (ARNr) están involucrados en la síntesis de

proteínas. Hay aún otros tipos de ARNs involucrados en el procesamiento y el transporte

de proteínas. Además de actuar como molécula portadora de la información genética, el

ARN es capaz de catalizar numerosas reacciones químicas. En las células de nuestros

días, estas reacciones incluyen tanto la síntesis de proteínas como el procesamiento de

ARN.

El ADN y el ARN son polímeros de nucleótidos que consisten de bases púricas y

pirimídicas (Fig. 2‐19) unidas a azúcares fosforilados. El ADN contiene dos purinas

(adenina y guanina) y dos pirimidinas (citosina y timidina). Adenina, gunanina y citocina

también están presentes en el ARN pero la timina esta reemplazada por uracilo. Las

bases están ligadas a azúcares (2’‐desoxirribosa en el ADN, o ribosa en el ARN) formando

nucleósidos (Fig. 1‐20). Los nucleótidos adicionalmente contienen uno o más grupos

fosfato, unidos al carbono 5’ del azúcar del nucleósido. (Fig. 2‐21)

Fig. 2‐19 (Modificada de Biochemistry de Berg)

Pirimidinas

Adenina Guanina

Citocina Uracilo Timina

Purinas


54

La polimerización de los nucleótidos para formar ácidos nucleicos involucra la formación

de puentes fosfodiéster entre el grupo fosfato 5’ de un nucleótido y el grupo hidroxilo 3’

del otro. (Fig. 2‐22).

Los oligonucleótidos son polímeros pequeños que

contienen sólo unos pocos nucleótidos, los

polinucleótidos grandes que constituyen los ARN y ADN

celulares pueden contener miles a millones de

nucleótidos respectivamente. Es de importancia notar

que una cadena polinucleotídica posee un sentido de

dirección, con un extremo de la cadena finalizando en

un grupo fosfato 5’ y el otro finalizando en un grupo

hidroxilo 3’. Los polinucleótidos siempre son

sintetizados en la dirección 5’→3’, en el que los

nucleótidos libres son agregados al extremo hidroxilo 3’

de una cadena creciente. Por convención la secuencia

de bases en el ADN o en el ARN siempre se escribe en la

Pentosa

Ribosa

2’ deoxiribosa (DNA)


Fosfato

Azucar

Base


Enlace fosfodiéster

Fig. 2‐22 (Modificado de “Molecular Biology of the


55

dirección 5’→3’.

La información en el ADN y el ARN es transmitida por el orden de las bases en la cadena

polinucleotídica. El ADN es una molécula de doble hebra consistente de dos cadenas

polinucleotídicas orientadas en direcciones opuestas. Las bases están orientadas hacia el

interior de la molécula, y las dos cadenas están unidas por puentes hidrógeno entre

pares de bases complementarias –adenina apareada con timina y guanina apareada con

citocina– La consecuencia importante de este apareamiento complementario es que

una hebra de ADN (o ARN) puede actuar como patrón para dirigir la síntesis de una

hebra complementaria. Los ácidos nucleicos son así únicos en su capacidad de dirigir su

propia replicación, permitiéndoles a ellos funcionar como moléculas fundamentales

portadoras de la información de las células. La información portada por el ADN y el ARN

dirige la síntesis de proteínas específicas, las que controlan la mayoría de las actividades

celulares.

Los nucleótidos no sólo son importantes como los bloques con los que se construyen los

ácidos nucleicos, sino que también juegan un importante rol en otros procesos celulares.

Quizás el ejemplo más prominente es el adenosina 5’ trifosfato (ATP) que es la principal

forma de energía química de las células. Otros nucleótidos actúan como carriers de

energía como de grupos reactivos en una amplia variedad de reacciones metabólicas.

Además, algunos nucleótidos, (por ejemplo el AMP cíclico) son importantes moléculas

de señalamiento dentro de las células.

Base Nucleósido Nucléotidos

ADN

Adenina (A) Desoxiadenosina dAMP dADP dATP Guanina (G) Desoxiguanosina dGMP dGDP dGTP Citosina (C) Desoxicitidina dCMP dCDP dCTP Timina (T) Desoxitimidina dTMP dTDP dTTP

ARN

Adenina (A) Adenosina AMP ADP ATP Guanina (G) Guanosina GMP GDP GTP Citosina (C) Histidina CMP CDP CTP Uracilo (U) Uridina UMP UDP UTP


56

Ribozimas

Por convención los ARN con actividad catalítica se denominaron ribozimas. Estas

moléculas de ARN poseen capacidad intrínseca para realizar la ruptura y formación de

enlaces covalentes en reacciones que son teóricamente reversibles. En estas reacciones

no intervienen proteínas, aunque son reacciones químicas dependientes de Magnesio.

En forma genérica se puede decir que las ribozimas son ARN autocatalíticos o con

capacidad de catálisis. Podemos considerar al menos cuatro clases distintas de ribozimas

o de ARNs catalíticos:

a) LOS INTRONES AUTOCATALÍTICOS DEL GRUPO I, que constituyeron los primeros ARN con

actividad de ribozima descriptos; poseen una longitud aproximada de 413

nucleótidos, están presentes en el ARNt, el ARNr y algunos genes que codifican

para proteínas, han sido detectados en hongos, ADN mitocondrial,

Tetrahymena, ADN de cloroplastos, bacteriófagos y eubacterias; su

conservación evolutiva estructural fue definida por medio de comparaciones

filogenéticas y características específicas que han sido confirmadas por

mutaciones y mapeo estructural in vivo e in vitro lo que ha permitido definir que

los intrones catalíticos del grupo I se encuentran constituidos por 9 dominios

estructurales denominados P1–P9, los cuales contienen sitios de procesamiento

5’ y 3’; cuentan asimismo con una secuencia guía interna (IGS) la que se

encuentra localizada adelante del sitio de procesamiento 5’ y entre las

secuencias del sitio de procesamiento exónico. El sitio de procesamiento 5’ es

definido por el apareamiento de bases entre P1 y la IGS, en tanto que la región

de procesamiento 3’ se define por el apareamiento de bases entre el dominio P9

y la IGS, la cual involucra los dos nucleótidos que preceden la G terminal del

intrón. Su mecanismo de acción para el procesamiento de intrones y exones

involucra al ARN intrónico que se une al nucléotido guanosina, autocatalizándose

a través de dos reacciones de transesterificación; en la primera el grupo hidroxilo

3’ terminal ataca al fósforo del sitio de procesamiento 3’, autoliberándose la

región intrónica; este grupo I de Intrones autocatalíticos ha sido clasificado en

cuatro grandes subgrupos que van del IA al ID. Fig. (a) (Cech, 1990).


57

b) LOS INTRONES AUTOCATALÍTICOS DEL GRUPO II: han sido encontrados en algunos tipos

de hongos, mitocondrias de vegetales y en cloroplastos. Los Intrones catalíticos

del grupo II son particularmente interesantes debido a su posible relación

evolutiva con los Intrones del pre‐ARNm, lo cuál ha sido inicialmente sugerido

por la descripción de similitudes en los mecanismos de corte, eliminación de

intrones y unión de regiones exónicas en el procesamiento del pre‐ARNm; el

mecanismo de acción de los Intrones autocatolíticos del grupo II ocurre de la

siguiente manera: en primer lugar, ocurre que la unión intrón‐exón 5’ es

procesada y la unión 2’ 5’ se establece con el residuo A de la región de

procesamiento 3’ y el primer nucleótido, generalmente una G de la región de

procesamiento 5’; así la unión 3’ intrón – exón es procesada permitiendo el

enlace de los dos exones y liberando al intrón en forma de lazo. La definición de

la estructura secundaria ha permitido conocer que los Intrones autocatalíticos

del grupo II poseen seis dominos autocatalíticos denotados del 1 al 6, entre los

que se ubican dos tipos importantes de regiones, una conocida como sitios de

enlace al exón (EBS) y otra denominada sitio de enlace al intrón (IBS); la

interacción y ataque nucleofílico entre estas dos regiones es muy similar a lo

descripto para el

procesamiento del

pre‐ARNm, en el que

participan ARN

pequeños de

localizacion nuclear

(U1, U2, U5, U2/U4

ARNpn). Figs. (b)

(Jacquier 1990; Michel

& cols., 1989).

c) Los dominios de ARN

autocatalíticos de

cabeza de martillo,

presentan forma de Y


58

e incluyen en su conformación dos tallos (1 y 2), formando los brazos de la Y,

además de un tercer tallo que constituye la base. La región catalítica de la

ribozima contiene dos dominios estructurales, la secuencia consenso CUGA

(nucleótidos en la posición C3‐A6) y una repetición de secuencias GA; esta

aparente simplicidad estructural parece permitir su funcionamiento como

enzima; la ribozima tipo cabeza de martillo corta enlaces tipo fosfodiéster,

originando fosfatos cíclicos 2’ y 3’ y una región hidroxílica 5’en una reacción que

es dependiente de Mg2+ (fig. c) Este tipo de ribozimas incluye fundamentalmente

cuatro tipos: [1] la clásica en cabeza de martillo, de aproximadamente 40

nucleótidos de longitud, detectada en viroides de plantas y ARNs satélites, y

recientemente en bastantes generadas sintéticamente. [2] la de tipo horquilla

de aproximadamente 55 nucleótidos de longitud, encontrada en ARN satélite de

vegetales así como también en múltiples de ellas generadas sintéticamente; la

[3] la delta de 85 nucleótidos de longitud que fue detectada como un elemento

de ARN en la hepatitis delta y la [4] Neurospora que representa un dominio de

localización mitocondrial.

d) El último grupo de ribozimas descriptas y clasificadas hasta el momento

corresponde al ARN de la ARNasa P involucrada en el procesamiento de

precursores del ARNt.

RIBOZIMAS: RESABIOS DEL MUNDO PRIMITIVO

Silvia Billi

Jefe deTrabajos Prácticos- Depto. de Química Biológica FCEyN - UBA

El estudio de catalizadores biológicos se intensificó a mediados de 1800 cuando Louis Pasteur llamó fermentos a los agentes presentes en las levaduras que convertían azúcar en alcohol. En 1926 se purificó la primera enzima, la "ureasa", a partir de plantas, encontrando que estaba compuesta por material proteico. Los cientos de enzimas purificadas y analizadas desde entonces resultaron ser de naturaleza proteica, por lo que se concluyó que todas las enzimas eran proteínas.

Este dogma pareció cambiar cuando en 1982, en el laboratorio de Thomas Cech, (1) estudiando el procesamiento de ARN en el protozoo ciliado Tetrahymena thermophila observó que el corte y empalme (splice) de un intrón del pre-ARNr era autocatalítico. ¡El RNA se escindía por sí mismo sin ayuda de un catalizador proteico! Paralelamente, en el laboratorio de Sidney Altman (2) se investigaban las propiedades de la enzima ribonucleasa


59

P, que se encuentra en todos los organismos. Los sustratos de esta enzima son una serie de moléculas precursoras de ARNt inactivo que son transformadas en ARNt funcional. La ribonucleasa P consta de una subunidad proteica y un ARN de 377 nucléotidos enlazados en una sola cadena. Al separar los componentes, la subunidad ARN fue capaz de catalizar la hidrólisis de ARNt precursor en ausencia completa de la parte proteica. Como la caracteristica prominente de estas moléculas de ARN era clivar otras cadenas de ARN se les llamó ribozimas. En 1989 Cech y Altman recibieron el premio Nobel por el descubrimiento de estos catalizadores biológicos no proteicos. El descubrimiento de las ribozimas fortaleció la teoría del "mundo de ARN" que intenta develar el misterio del origen de la vida. La hipótesis del "mundo de ARN" propone que la evolución basada en la replicación del ARN precedió a la aparición de la síntesis proteica (3, 4, 5, 6). En algún momento de la evolución de la vida la continuidad genética habría sido asegurada por la replicación del ARN, sin involucrar como catalizadores a las proteínas codificadas genéticamente, siendo el apareamiento de bases descubierto por Watson y Crick la clave para la replicación (3). Las evidencias(5, 6) que sustentan esta teoría están basadas en las múltiples funciones que pueden cumplir el ARN o los ribonucleótidos: 1) el ARN es capaz de almacenar información genética, 2) puede servir de molde para la síntesis de cadenas complementarias de polinucleótidos, 3) puede actuar como catalizador, 4) los nucléotidos del ARN actúan como coenzimas en muchas reacciones biológicas, 5) los deoxirribonucleótidos precursores del ADN son sintetizados a partir de ribonucléotidos, 6) la presencia de pequeñas ribonucleoproteínas ayudan en la expresión genética y en el mantenimiento del genoma, 7) las moléculas de ARN guia participan en la edición del ARN, y 8) numerosos virus llevan como único materal genético ARN de cadena simple o doble.

Durante la evolución, a medida que el metabolismo celular se fue sofisticando el requerimiento de biocatalizadores con distinta especificidad hizo que las proteínas, con mayor versatilidad que el ARN (20 aminoácidos en comparación con cuatro bases) asumieran el rol de biocatalizadores, mientras que el ADN presumiblemente adquirió la función de guardar y transmitir la información genética, dada su mayor estabilidad. Los descendientes de la era dominada por el ARN habitan hoy en el mundo en forma de ribozimas presentes en organismos que van desde las bacterias al hombre.

Las ribozimas aumentan sustancialmente la velocidad de reacción (3,4,5,6). Así las constantes cinéticas son comparables a las de enzimas proteicas. Pueden usar cofactores como imidazol y presentar regulación alostérica. Su estructura molecular a semejanza de los catalizadores proteicos presenta pliegues dando origen a estructuras tridimensionales que forman sitios activos como hendiduras profundas, protegidas, e inaccesibles a solventes. Mediante esta estructura terciaria se facilita la catálisis orientando los sustratos al sitio catalítico.

Fig. 1 Ribozima grupo I intrón Diagrama de cintas de la estructura terciaria. El sitio catalítico


60

está formado por dos dominios P4-P6 y P3-P9. Ref (3)

El 2'-OH del ARN (Fig 2) actúa como nucleófilo catalítico tanto para el autoprocesamiento de intrones como para el procesamiento catalizado por "spliceosomes". Actúa tambien como ligando de metales, de hecho, algunas ribozimas se comportan como metaloenzimas (7).

Fig.2 Reacción catalizada por la ribozima hammer-head (ver más abajo) y otras ribozimas pequeñas.

Ribozimas naturales

Las ribozimas que están presentes en la naturaleza son de distinto tipo, se conocen: Grupo I intrón (3,4,5,6): Remueven intrones mediante dos transesterificaciones produciendo uniones 3'-5'y un 3'-OH. El mecanismo de acción involucra el sitio de unión al nucleótido, ataque nucleofílico (3'-OH de una guanosina exógena) y catálisis mediada por metales (Fig 3). Se encontraron en los núcleos de protozoos, mitocondrias de hongos, cloroplastos de algas, bacterias y sus fagos.

Grupo II intrón (3,4,5): Producen el autoclivaje de intrones vía dos transesterificaciones, produciendo una unión inicial 2'-5' y un 3'-OH. El mecanismo involucra ataque nucleofílico por un 2' OH de una adenosina especial dentro del intron que produce un cambio en la estructura del ARN (formación de un lazo). Se cree que los iones Mg++ están dentro del intrón partipando de la catálisis. Esta clase se encontró en bacterias y genes de organelas de levaduras de células eucariotas.

Fig 3 Reacciones catalizadas por las ribozimas: grupo I intrón (NOH: 3'-OH de una guanosina), grupo II intrón (NOH: 2'-OH de una adenosina dentro del intrón) y RNasaP


61

(NOH: H2O).

Ribonucleasa (Rnasa) P (3, 4, 5): Cataliza la hidrólisis sitio-específica de precursores de ARN incluyendo ARNt, ARN-5S y la partícula de reconocimiento de ARN (SRP). Estos sustratos comparten probablemente características estructurales que permiten el reconocimiento epecífico por RnasaP posicionando los fosfatos reactivos en el sitio de unión para el ataque nucleofílico por una molécula de agua. Actúa como una endoribonucleasa hidrolítica que cliva el extremo 5' del ARN para producir 5'-fosfato y 3'-OH. RnasaP es un complejo ARN-proteína cuya actividad catalítica en bacterias reside en el componente ARN, en humanos no es activa sin el componente proteico. Es un verdadero catalizador en el sentido que cada ribozima cataliza el clivaje de múltiples sustratos. Tiene 300 a 400 nucleótidos de largo, forma dos dominios uno de los cuales tiene el sitio de reconocimiento del sustrato y el otro el sitio activo.

Cabeza de martillo (hammerhead) (3, 4, 8): Es la ribozima más pequeña, consiste en un ARN de 40 nucleótidos que se autocliva, contiene un motivo altamente conservado que ha sido encontrado en varios viroides y virus satélites de ARN que se autoreplican a través de un mecanismo de círculo rodante ("rolling-circle"). Su estructura involucra tres ramas cortas I, II, y III, tiene una conformación en `Y', las ramas estan conectadas en una secuencia altamente conservada, donde se encuentran los nucleótidos esenciales para la catálisis. La rama I contiene el residuo citosina 17 que contiene la unión que se cliva. Cataliza el clivaje sitio específico de sus propias uniones fosfodiester por un ataque nucleofílico del 2'-OH al fosfato a ser escindido. Se cree que hay iones divalentes que participan en el mantenimiento de la estructura.

Fig.4 Estructura de la ribozima cabeza de martillo. En azul se indica un ADN inhibidor de la ribozima. El sitio catalítico está en color rojo. La rama I y III en verde y la II en púrpura. Ref (8)

Virus de hepatitis delta (HDV) y Horquilla (Hairpin): Catalizan la misma reacción que la ribozima tipo cabeza de martillo y son los responsables de clivar intermediarios generados durante la replicación de HDV y de virus satélites de ARN de las plantas.

"Spliceosome" (U2+U6) (3,4,5,6,7): El núcleo de las células eucariotas contiene numerosas copias de varios ARN de 60 a 250 nucleótidos de longitud denominados ARN nucleares pequeños (snRNA), los cuales forman complejos con proteínas (ribonucleoproteínas: RNP). Los snRNP U1....U6 son miembros de una subfamilia de snRNA rica en uracilo que intervienen en el procesamiento del pre-ARNm. Los snRNP U1, U2, U5 y U4-U6 se ensamblan en los sitios de corte y empalme formando un gran complejo o "spliceosome". Los U2 y U6 producen el corte de sustratos de ARN via transesterificación. Se ensamblan con pre-ARNm y escinden los intrones (no es autoclivaje). El producto de la reacción es un fosfo-triester a diferencia de los obtenidos con otros "spliceosomes".

Ribozimas sintéticas


62

Los científicos han sintetizado ribozimas in vitro, (6, 8, 9) parten de secuencias de ARN seleccionadas al azar (más de 1015), luego separan a las moléculas en base a su habilidad para realizar funciones bioquímicas (unión a ligandos, catálisis), el material seleccionado es amplificado y el ciclo de selección y amplificación es repetido hasta que las secuencias activas dominan el conjunto. Por último se pueden introducir mutaciones para ampliar la diversidad de secuencias, incorporando de esta manera las características más relevantes de la evolución. Mediante esta técnica lograron sintetizar catalizadores de ARN más eficientes que pueden intervenir en otro tipo de reacciones, tal como formar nucléotidos a partir de un azúcar y una base, o sintetizar uniones amida. Se diseñan ribozimas para cortar determinados ARN con fines terapéuticos (6), remedando la estructura y la actividad catalítica de las ribozimas naturales conocidas. Se ha pensado que la función que cumplen estas ribozimas puede ser aplicada para varios problemas médicos, como el cáncer y el sida, teniendo en cuenta que si la molécula de ARN es clivada antes de llegar al ribosoma, la codificación que encierra esa cadena nunca se expresará completamente.

Bibliografía 1- Kruger, K., Grabowski, P.J., Zaug, A.J. Sands, J., Gottschling, D.E., Cech, T.R. (1982) Cell 31,147-157.

2- Guerrier-Takada, C., Gardiner, K., Mardh, T. Altman, S. (1983) Cell 35, 849-857.

3- The RNA World. Gesteland, R. F, Cech, T y Atkins J.F. Ed Cold Spring Harbor Laboratory Press.

4- Doudna, J.A. Cech, T.R. (2002), Nature 418, 222-228.

5- http://walden.mvp.net/~sklib/ribozyme.html Ribozymes: Structure, function and application.

6- http://www.aibs.org/biosciencelibrary/vol48/feb.98.html Landweber L.F., Simon P.J., Wagner, T.A. (1998) Bioscience 48, 94.

7- http://www.chembio.uoguelph.ca/educmat/chm730/k730.htm Chem*730. Proteins and Nucleic acids. Ribosomes and Ribozymes folding and function of RNA.

8- http://attila.stevens-tech.edu/chembio/rsamuel/index.html. The structure and function of the Hammer Head ribozyme.

9- http://web.mit.edu/newsoffice/tt/1995/Sep13/40700.html Nicholson E.K. Scientists produce ribozymes in study molecules evolution.

10-Bartel, D.P., Szostk J.W. (1993) Science 261, 1411-1418.

PROTEÍNAS

Mientras que los ácidos nucleicos portan la información genética de las células, la

principal responsabilidad de las proteínas es ejecutar las tareas dirigidas por esa

información. Las proteínas son las más diversas de todas las macromoléculas, y cada

célula contiene varios miles de proteínas diferentes que realizan una amplia variedad de

funciones. Los roles de las proteínas incluyen: ser componentes

estructurales de células y tejidos, actuando en el transporte y

almacenamiento de moléculas pequeñas, (por ej. transporte de O2

por la hemoglobina), transmitir la información entre las células


63

(por ej. hormonas proteicas) y conferir la defensa contra infecciones (por ej.,

anticuerpos). Sin embargo, la función más importante de las proteínas es su capacidad

de actuar como enzimas, que como se discute más adelante, catalizan la mayor parte de

las reacciones químicas que se desarrollan en los sistemas biológicos. Así las proteínas

desarrollan la mayoría de las actividades de las células.

Las proteínas son polímeros de 20 aminoácidos diferentes. Cada aminoácido consiste de

un carbono, (llamado carbono α‐) unido a un grupo carboxilo (COO–), un grupo amino

(NH3+), un hidrógeno (H) y una cadena lateral distintiva.

Las propiedades químicas de las diferentes cadenas laterales de los aminoácidos

determinan los roles de cada uno de ellos en la estructura de las proteínas.

Los aminoácidos pueden ser agrupados en cuatro amplias categorías de acuerdo a las

propiedades de las cadenas laterales. Diez aminoácidos tienen cadenas laterales no

polares que no interactúan con el agua. La glicina es el aminoácido más simple con un

átomo de Hidrógeno como cadena lateral. Alanina, Valina, Leucina, e Isoleucina, tienen

cadenas laterales de hasta cuatro átomos de carbono, las cadenas laterales de estos

aminoácidos son hidrofóbicas por lo que tienden a localizarse en el interior de las

proteínas, donde no entran en contacto con el agua. De igual manera, la Prolina tiene

una cadena lateral hidrocarbonada, pero es única en el hecho que su cadena lateral está

unida al nitrógeno de los grupos amino y al carbono α–, formando una estructura

cíclica. La cadena lateral de dos aminoácidos: Cisteína y Metionina, contiene átomos de

azufre. La metionina es muy hidrofóbica, pero la cisteína por poseer un grupo sulfidrilo

(SH) lo es menos. Como se discutirá mas adelante, el grupo sulfidrilo de la cisteína juega

un rol muy importante en la estructura de las proteínas, por la posibilidad de establecer

puentes disulfuro entre las cadenas laterales de dos residuos cisteína diferentes.

Finalmente, dos aminoácidos no polares la Fenilalanina y el Triptofano tienen cadenas

laterales con anillos aromáticos muy hidrofóbicos.

Cinco aminoácidos tienen cadenas laterales polares no cargadas. Estas incluyen serina,

treonina y tirosina, que poseen grupos hidroxilo sobre su cadena lateral, así como

asparagina y glutamina, que tiene grupos amida polares (O=C–NH2). Debido a que las


64

cadenas laterales de estos aminoácidos pueden formar puentes hidrógeno con el agua,

estos aminoácidos son hidrofílicos y tienden a estar localizados en el exterior de las

proteínas.

Los aminoácidos lisina, arginina, e histidina poseen cadenas laterales con grupos básicos

que en la célula se encuentran cargados positivamente. En consecuencia, ellos son muy

hidrofílicos y se encuentran en contacto con agua sobre la superficie de las proteínas. La

histidina, a pH fisiológico, puede estar tanto sin cargar como positivamente cargada

jugando un rol activo en las reacciones enzimáticas que involucran un intercambio de

iones hidrógeno.

Finalmente, dos aminoácidos: el ácido aspártico y el ácido glutámico poseen cadenas

laterales ácidas que terminan en grupos carboxilo. Estos aminoácidos frecuentemente se

denominan aspartato y glutamato. Como ocurre con los aminoácidos básicos los

aminoácidos ácidos son muy hidrofílicos y usualmente están localizados en la superficie

de las proteínas.

Aminoácidos no polares

Código de tres letras

Cadena lateral

Alanina Ala -CH3

Valina Val

Leucina Leu

Isoleucina Ile

Metionina Met


65

Prolina Pro

Fenilalanina Phe

Triptófano Trp

Glicina Gly

Cisteína Cys

Aminoácidos polares


Cadena lateral

Serina Ser

Treonina Thr -CHOH-CH3

Asparagina Asn -CH2-CO-NH2

Glutamina Gln CH2-CH2-CO-NH2

Tirosina Tyr

Aminoácidos Básicos


Cadena lateral

Lisina Lys -CH2-CH2-CH2-CH2 -+NH3


66

Arginina Arg

Histidina His

Aminoácidos Ácidos


Cadena lateral

Ácido aspártico Asp -CH2-COO-

Ácido

glutámico Glu -CH2-CH2-COO-

Los aminoácidos se unen por medio de uniones peptídicas (Fig. 2‐23) entre el grupo

amino α‐ de un aminoácido y el grupo carboxilo α‐ del segundo. Los polipéptidos son

cadenas lineales de aminoácidos, usualmente de cientos a miles de aminoácidos de

longitud.


67

Cada cadena polipeptídica tiene dos extremos distintos uno es un grupo amino α‐

(extremo amino o extremo N) y el otro un grupo carboxilo α‐ (extremo carboxilo o

extremo C). Los polipéptidos son sintetizados desde el extremo amino al extremo

carboxilo y la secuencia de aminoácidos se escribe (por convención) en el mismo orden.

En 1953, Frederick Sanger fue el primero en determinar la secuencia completa de

aminoácidos en una proteína, la hormona insulina. Se encontró que la insulina consiste

de dos cadenas polipeptídicas, unidas por puentes disulfuro entre los residuos de

cisteína. Más aún los experimentos de Sanger determinaron que cada proteína consiste

de una secuencia específica de aminoácidos. Las proteínas de las que se conoce la

secuencia de aminoácidos completa son, al presente, unas 100.000. Cada una de ellas

consiste en una secuencia de aminoácidos única, determinada por el orden de los

nucleótidos en un gen.

La secuencia de aminoácidos de una proteína es sólo el primer elemento de su

estructura. Una vez que se han extendido las cadenas de aminoácidos las proteínas

adoptan diferentes conformaciones tridimensionales que son críticas para su función.

Esto fue demostrado por primera vez por C. Anfinsen quien destruyó dicha estructura,

usando por ejemplo calor, por ruptura de las uniones no covalentes en un proceso

conocido como desnaturalización. Luego de incubación bajo condiciones medias, tales

proteínas desnaturalizadas a menudo retornan a sus conformaciones nativas, indicando

que estas conformaciones estaban determinadas por la secuencia de aminoácidos.

La estructura tridimensional de las proteínas es frecuentemente determinada por

cristalografía de rayos X. Esta técnica permite estudiar el arreglo de los átomos dentro

de la molécula. Un haz de rayos X se dirige sobre la proteína cristalizada y el patrón de

los rayos X que pasa a través del cristal es detectado sobre un film de rayos X.

Enlace peptídico

Fig: 2‐23 (Modificado de Biochemistry de Berg)


68

La estructura de las proteínas es usualmente descripta en cuatro niveles. La estructura

primaria de una proteína es la secuencia de aminoácidos en su cadena polipeptídica. La

estructura secundaria es el arreglo regular de los aminoácidos dentro de las diferentes

regiones de las proteínas. Linus Pauling y Robert Corey propusieron en 1951 dos

estructuras muy comunes: hélices‐α y hojas‐β. Ambas estructuras secundarias son

mantenidas por medio de puentes H entre grupos C=O y NH. Una hélice alfa se forma

cuando una región de una cadena polipeptídica se enrolla alrededor de si misma, con los

grupos C=O de un péptido formando una unión puente H con el grupo NH de una unión

peptídica, cuatro residuos más abajo en la cadena polipeptídica lineal. En contraste las

hojas‐β se forman cuando dos partes se ordenan lado a lado por medio de puentes H.

Tales hojas‐β pueden formarse entre varias hebras de polipéptidos, los que pueden

estar orientados tanto en forma paralela como antiparalela una con otra.

La estructura terciaria, es el plegamiento de la cadena polipeptídica como consecuencia

de las interacciones de las cadenas laterales de los aminoácidos ubicados en diferentes

regiones de la secuencia primaria. En la mayoría de las proteínas, las combinaciones de

hélices‐α y hojas‐β, conectadas por lazos de cadenas polipeptídicas, se pliegan en

estructuras globulares compactas denominadas dominios que constituyen las unidades

básicas de las estructuras terciarias. Las proteínas pequeñas tales como las

ribonucleasas o la mioglobina poseen sólo un dominio, las proteínas más grandes

pueden contener varios dominios diferentes, que frecuentemente están asociados con

funciones diferentes.

Una determinante crítica de la estructura terciaria es la localización de aminoácidos

hidrofóbicos en el interior de las proteínas y de los aminoácidos hidrofílicos en la

superficie, donde interaccionan con el agua. En el interior de las proteínas plegadas, en

general, se ubican los aminoácidos hidrofóbicos, en arreglos de hélices alfa y hojas beta.

Estas estructuras secundarias se encuentran en el centro hidrofóbico de las proteínas

debido a que los puentes hidrógeno neutralizan el carácter polar de los grupos C=O y NH

del esqueleto de los polipéptidos. Las regiones de lazo que conectan los elementos de la

estructura secundaria se encuentran en la superficie de las proteínas plegadas donde los

componentes polares de las uniones peptídicas forman puentes hidrógeno con el agua o


69

con las cadenas laterales de aminoácidos hidrofílicos. Las interacciones entre las cadenas

laterales de los aminoácidos polares (puentes H y puentes iónicos) sobre la superficie de

las proteínas son también importantes determinantes de la estructura terciaria de las

proteínas. Además, los puentes disulfuro covalentes entre residuos de cisteína

estabilizan las estructuras plegadas de muchas proteínas de la superficie celular o de

proteínas de secreción.

El cuarto nivel de la estructura proteica, la estructura cuaternaria, consiste en la

interacción de diferentes cadenas polipeptídicas, en proteínas compuestas por más de

un polipéptido. Por ejemplo la hemoglobina, está compuesta de cuatro cadenas

polipeptídicas que se mantienen juntas por los mismos tipos de interacciones que

mantienen la estructura terciaria.

Las distintas características químicas de los 20 aminoácidos diferentes llevan a una

considerable variación en la conformación tridimensional de las proteínas plegadas. En

consecuencia, las proteínas constituyen un grupo de macromoléculas extremadamente

complejo y diverso, que concuerda con la amplia variedad de tareas que ellas realizan en

la biología celular.

PROTEÍNAS DE MEMBRANA

ESTE TEMA SE DESCRIBIRÁ ESPECÍFICAMENTE EN EL CÁPITULO 3

Enzimas: Conceptos Básicos y Cinética

Las enzimas, sistemas catalizadores biológicos, son dispositivos moleculares que

determinan los patrones de transformaciones químicas. También son los responsables

de mediar la transformación de una forma de energía en otra. Las características más

importantes de las enzimas son su poder catalítico y su especificidad. La catálisis tiene

lugar en un sitio particular del enzima, denominado sitio activo. La mayor parte de las

enzimas conocidas son proteínas. Sin embargo, las proteínas no tienen el monopolio de

la catálisis; el descubrimiento de la actividad catalítica activa de las moléculas de ARN

provee la evidencia que el ARN tiene una actividad biocatalítica temprana.


70

Las proteínas, como una clase de macromoléculas son catalizadores altamente efectivos

para una enorme diversidad de reacciones químicas debido a su capacidad para unirse

específicamente a un muy amplio rango de moléculas. Utilizando un amplio rango de

fuerzas intermoleculares las enzimas mantienen substratos unidos en una óptima

orientación, el preludio que produce la ruptura de uniones químicas. Ellos catalizan

reacciones estabilizando estados de transición, las especies de más alta energía en un

patrón de reacción. Estabilizando selectivamente un estado de transición, una enzima

determina cual de varias potencialmente posibles reacciones tienen lugar realmente.

Las Enzimas son Poderosos Catalizadores altamente específicos

Las Enzimas aceleran las reacciones en factores que pueden llegar hasta un millón o más

veces. En efecto la mayoría de las reacciones en sistemas biológicos no tendrían lugar a

tasas perceptibles en ausencia de las enzimas. Aún una reacción tan simple como la

hidratación de dióxido de carbono es catalizada por una enzima ‐denominada, anhidrasa

carbónica. La transferencia de CO2 desde los tejidos a la sangre y luego al aire alveolar

sería prácticamente nula en ausencia de esta enzima. En efecto, la anhidrasa carbónica

es una de las enzimas más rápidas conocidas. Cada molécula de esta enzima puede

hidratar 106 moléculas de CO2 por segundo. Esta reacción catalizada es 107 veces más

rápida que la no catalizada. Las enzimas son altamente específicas tanto en las

reacciones que catalizan, como en la elección de los reactantes, que se denominan

substratos. Una enzima usualmente cataliza una reacción química o un conjunto de

reacciones estrechamente relacionadas. Reacciones laterales que lleven a la formación

de productos de desecho son raras en las reacciones enzimáticas en contraste con las no

catalizadas.

Consideremos ahora las enzimas proteolíticas como ejemplo. In vivo, estas enzimas

catalizan la proteólisis, esto es la hidrólisis de una unión peptídica.


71

La mayoría de las enzimas también catalizan una reacción diferente pero relacionada in

vitro denominada la hidrólisis de una unión tipo éster. Tales reacciones son más

fácilmente monitoreables que la proteólisis y son utilizadas en las investigaciones de

estas enzimas.

Las enzimas proteolíticas difieren marcadamente en su gradiente de la especificidad por

el substrato. Por ejemplo, la subtilisina, que se encuentra en ciertas bacterias es muy

indiscriminada: puede clivar cualquier unión peptídica con muy poca identidad de las

cadenas laterales adyacentes. Por otro lado, la tripsina, una enzima digestiva, es muy

específica y cataliza el clivaje de las uniones peptídicas sólo en el lado carboxílico de los

residuos lisina y arginina (Figura). La trombina, una enzima que participa en la

coagulación de la sangre, cataliza la hidrólisis de las uniones Arg‐Gly en secuencias

particulares solamente, es aún más específica que la tripsina.

La ADN polimerasa I, es una enzima que agrega nucleótidos a una hebra de ADN que

está siendo sintetizada en la secuencia determinada por la secuencia de nucleótidos de

otra hebra de ADN que sirve como patrón. La ADN polimerasa I es remarcablemente

precisa portando las instrucciones dadas por el ADN patrón. Estas enzimas insertan los

nucleótidos en una nueva hebra de ADN erróneamente menos de una en un millón de

veces.

LA ESPECIFICIDAD DE UNA ENZIMA SE DEBE A LA PRECISA INTERACCIÓN DEL SUBSTRATO CON LA ENZIMA. ESTA PRECISIÓN ES EL RESULTADO DE LA INTRINCADA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE LA PROTEÍNA ENZIMÁTICA.

Muchas Enzimas Requieren Cofactores para su Actividad

La actividad catalítica de muchas enzimas depende de la presencia de pequeñas

moléculas denominadas cofactores, aunque el preciso rol varía con los cofactores y las

enzimas. Tal enzima sin su cofactor es referida como una apoenzima, la enzima


72

completa, catalíticamente activa se denomina holoenzima.

Apoenzima + cofactor = holoenzima

Los cofactores pueden ser subdivididos en dos grandes grupos: metales y moléculas

orgánicas pequeñas (Tabla 1). La enzima anhidrasa carbónica, por ejemplo, requiere Zn2+

para su actividad. Glicógeno fosforilasa, que moviliza glicógeno para obtener energía,

requiere la pequeña molécula orgánica piridoxal fosfato (PLP).

Los cofactores que son pequeñas moléculas orgánicas, se denominan coenzimas. A

menudo derivados de vitaminas, las coenzimas pueden estar tanto firme como

relajadamente unidos a la enzima. Si la unión es firme, se denominan grupos prostéticos.

Las coenzimas asociadas más relajadamente son más semejantes a co‐substratos debido

a que ellos se unen a y son liberados de la enzima como los substratos y los productos. El

uso de la misma coenzima por una variedad de enzimas y su fuente de vitaminas

mantienen las coenzimas separadas de su substrato normal. Las enzimas que usan la

misma coenzima usan usualmente mecanismos similares.

Tabla 1. Cofactores Enzimáticos

Cofactor Enzima

Coenzima

Tiamina pirofosfato Piruvato deshidrogenasa

Flavina adenina nucleotido Monoamina oxidasa

Nicotinamida adenina dinucleótido

Lactato deshidrogenasa

Piridoxal fosfato Glicogeno fosforilasa

Coenzima A (CoA) Acetil CoA carboxilasa

Biotina Piruvato carboxilasa

5 ‐Desoxiadenosil cobalamina Metilmalonil mutase

Tetrahidrofolato

Thimidilato sintetasa

Metal

Zn2+ Anhidrasa Carbonica

Zn2+ Carboxipeptidasa

Mg2+ EcoRV


73

Mg2+ Hexocinasa

Ni2+ Ureasa

Mo Nitrato reductasa

Se Glutation peroxidasa

Mn2+ Superoxido dismutasa

K+

Propionil CoA carboxilasa

Las enzimas pueden transformar energía de una forma a otra

En muchas reacciones bioquímicas, la energía de los reactantes es convertida con alta

eficiencia en una forma diferente. Por ejemplo en la fotosíntesis, la energía lumínica es

convertida en energía química a través de un gradiente iónico. En las mitocondrias la

energía química contenidas en moléculas pequeñas derivadas del alimento es convertida

primero en energía libre de un gradiente iónico y luego en una diferente forma de

energía, la energía libre de la adenosina trifosfato. Las enzimas pueden luego usar la

energía de los enlaces del ATP de muchas formas. Por ejemplo, la miosina convierte la

energía de ATP en energía mecánica de contracción muscular. Las bombas en las

membranas de células y organelas pueden pensarse como enzimas que en lugar de

alterar químicamente los substratos los moviliza creando gradientes eléctricos o

químicos usando la energía del ATP para transportar iones o moléculas (Figura 2). Los

mecanismos moleculares de estas enzimas transductoras de energía están siendo

desentrañados.

Las enzimas son clasificadas en base a los tipos de reacciones que catalizan

Muchas enzimas tienen nombres comunes que proveen poca información acerca de las

reacciones que ellas catalizan. Por ejemplo, una enzima proteolítica secretada por el

páncreas se denomina tripsina, sin embargo, la mayoría de las enzimas se denominan de

acuerdo a sus substratos y la reacción que catalizan, con el agregado del subfijo “asa”.

Así, una ATPasa es una enzima que hidroliza ATP mientras que la ATP‐sintetasa es una

enzima que sintetiza ATP.

Para darle alguna consistencia a la clasificación de las enzimas, en 1964 la Unión


74

Internacional de Bioquímica estableció una Comisión de Enzimas para desarrollar una

nomenclatura para las enzimas. Las reacciones fueron subdivididas en seis grupos

mayores numerados del 1 al 6 (tabla 3). Estos grupos fueron subdivididos hasta que un

número de cuatro dígitos precedidos por las letras EC (por Comisión de Enzimas) que

permiten identificar todas las enzimas.

Considérese como ejemplo la nucleosido monofosfato (NMP) quinasa una enzima que

cataliza la siguiente reacción:

La NMP quinasa transfiere un grupo fosforilo del grupo ATP a NMP para formar un

nucleosido difosfato (NDP) y ADP. Consecuentemente, es una transferasa, o un miembro

del grupo 2. Muchos grupos además del grupo fosforilo, tales como azúcares y unidades

de carbono puede ser transferido. Las transferasas que cambian un grupo fosforilo son

designadas como 2.7. Varios grupos funcionales pueden aceptar el grupo fosforilo. Si un

fosfato es el aceptor, la transferasa es designada como 2.7.4. El número final designa

más precisamente al aceptor. El NMP quinasa, un nucleosido monofosfato es el aceptor,

y la designación de la enzima es EC 2.7.4.4. A pesar que los nombres comunes son

usados rutinariamente, el número de clasificación es usado cuando la identidad precisa

de la enzima puede ser ambigua.

La energía libre es una función termodinámica útil para comprender a las enzimas

Para comprender completamente cómo trabajan las enzimas es necesario considerar las

dos propiedades termodinámicas de la reacción. (1) la diferencia en la energía libre (DG)

entre los productos y los reactivos y (2) la energía requerida para iniciar la conversión de

reactivos en productos. Los primeros determinan si la reacción será espontánea,

mientras que la última determina la tasa a la que se producirá la reacción. Las enzimas

afectan sólo la última de estas. Primero entonces consideraremos la termodinámica de

las reacciones y luego las tasas de las reacciones.

Los cambios en la energía libre proveen información acerca de la espontaneidad de la reacción pero no de su tasa


75

El cambio en la energía libre de una reacción (∆G) nos habla de si esta puede o no ocurrir

espontáneamente.

1. Una reacción puede ocurrir espontáneamente sólo si el ∆G es negativo. Tal reacción

decimos que es exergónica.

2. Un sistema esta en equilibrio y no tiene lugar un cambio neto si ∆G es cero.

3. Una reacción no puede ocurrir espontáneamente si la ∆G es positiva. Si esto ocurre la

reacción requiere un aporte de energía libre para que tenga lugar dicha reacción. Estas

reacciones se denominan endergónicas.

Deben asimismo enfatizarse dos puntos adicionales. El ∆G de una reacción sólo depende

de la energía libre de los productos (el estado final) menos la energía libre de los

reactivos (el estadio inicial). La ∆G de una reacción es independiente del patrón (o

mecanismo molecular) de la transformación. El mecanismo de una reacción no tiene

efecto sobre la ∆G. Por ejemplo, la ∆G para la oxidación de glucosa a CO2 y H2O es la

misma si ocurre por combustión in vitro o por una serie de pasos catalizados por

enzimas‐en una célula. La ∆G no provee información acerca de la tasa de una reacción.

Una ∆G negativa indica que una reacción puede ocurrir espontáneamente, pero no

significa que va a proceder a una tasa perceptible. Como será discutido prontamente, la

tasa de una reacción depende de la energía libre de activación (∆Go), que no está

relacionada a la ∆G de la reacción.

Los cambios de la energía libre estándar están relacionados a la constante de equilibrio

Como para toda reacción, debemos ser capaces de determinar la ∆G para una reacción

catalizada por una enzima para conocer si la reacción es espontánea o requiere un

aporte de energía. Para determinar este importante parámetro termodinámico, debe

tenerse en cuenta tanto la naturaleza de los reactivos como de los productos así como

sus concentraciones.

Considérese la reacción:


76

La ∆G de esta reacción esta dada por:

En la cual ∆G° son los cambios en la energía libre estándar, R es la constante de los

gases, T es la temperatura absoluta, y [A], [B], [C], y [D] son las concentraciones molares

(más precisamente, las actividades) de los reactivos. ∆G° son los cambios de la energía

libre para esta reacción bajo condiciones estándar que es, cuando cada uno de los

reactivos A, B, C y D están presentes a una concentración de 1,0 M (para un gas, el

estado estándar es usualmente 1 atmósfera). Así, la ∆G de una reacción depende de la

naturaleza de los reactivos (expresado en el termino ∆G° de la ecuación 1) y sobre sus

concentraciones (expresados en el término logarítmico de la ecuación 1).

Unidades de energía

Una caloría (cal) es equivalente a la cantidad de calor

requerido para incrementar la temperatura de 1 gramo

de agua de 14.5°C a 15.5°C.

Una kilocaloría (kcal) es igual a 1000 cal.

Un joule (J) es la cantidad de energía necesaria para

aplicar una fuerza de 1‐newton a una distancia de 1

metro.

A kilojoule (kJ) es igual a 1000 J.

1 kcal = 4.184 kJ

Para simplificar los cálculos de energía libre se ha adoptado la convención para las

reaciones bioquímicas. El estado estándar está definido como si el pH fuese 7.

Consecuentemente cuando el H es un reactivo si actividad tiene el valor 1

(correspondiéndose a un pH 7) en la ecuación 1 y 4. La actividad del agua también es

considerada en esa ecuación 1. El cambio de energía libre a pH 7 denotado por el

símbolo ∆G°’ será usado en este capítulo. La kilocaloría y los kilojoules (kJ) serán usados


77

como unidades de energía. Una kilocaloría es equivalente a 4,184 kilojoules.

La relación entre la energía libre estándar y la constante de equilibrio de una reacción

pueden ser derivados. Esta ecuación es importante debido a que exhibe la energética de

la reacción entre productos y reactantes en términos de su concentración. En

condiciones de equilibrio, ∆G = 0. Luego la ecuación 1 pasa a:

Y así:

La constante de equilibrio en condiciones estándar, K’eq, se define como:

Substituyendo la ecuación 4 en ecuación 3 da:

que puede ser reagrupada dando:

Substituyendo R = 1.987 × 10‐3 kcal mol‐1 deg‐1 y T = 298o K (correspondiente a 25°C) da:

Donde: ∆G°’ es aquí expresado en kilocalorías por mol debido a la elección de las

unidades para R en la ecuación 7. Así, la energía libre estándar y la constante de

equilibrio de una reacción están relacionadas por una expresión simple. Por ejemplo una


78

constante de equilibrio de 10 veces un cambio de energía libre estándar de ‐1.36 kcal

mol‐1 (‐5.69 kJ mol‐1) a 25°C. Nótese que por cada 10 veces el cambio en la constante de

equilibrio en la constante de equilibrio, el ∆Go’ cambia 1.36 kcal mol‐1 (5.69 kJ mol‐1).

Como ejemplo, calculemos ∆G°’ y la ∆G para la isomerización de la dihidroxiacetona

fosfato (DHAP) a gliceraldehído 3‐fosfato (GAP). Esta reacción tiene lugar en la glucólisis.

Al equilibrio, la relación de GAP a DHAP es 0.0475 a 25°C (298 K) y pH 7. Por lo tanto, K’eq

= 0.0475. Los cambios de energía libre estándar para esta reacción es luego calculado

desde la ecuación 6:

Bajo estas condiciones la reacción es endergónica, La DHAP no podrá ser

espontáneamente convertida a GAP.

Calculemos ahora DG para esta reacción cuando la concentración inicial de DHAP es

2x10‐4 M y la concentración inicial de GAP es 3x10‐6 M. Substituyendo estos valores en la

ecuación 1 da:


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Estos valores negativos para el ∆G indican que la isomerización de DHAP a GAP es

exergónica y puede ocurrir espontáneamente cuando estas especies están presentes a

las concentraciones anteriores. Note ∆G para estas reacciones son negativas.

Las enzimas alteran sólo la tasa de reacción y no el equilibrio de la reacción

Debido que las enzimas son soberbios catalizadores uno podría estar tentado a

adscribirle poderes que ellas no tienen. Una enzima no puede alterar las leyes de la

termodinámica y consecuentemente no pueden alterar el equilibrio químico de una

reacción química. Esta inestabilidad significa que una enzima acelera tanto las

reacciones directas como las reversas precisamente debido a los mismos factores.

Considerando la interconversión de A a B. Supóngase que en ausencia de la enzima la

constante de la tasa directa (kF) es 10‐4 s‐1 y; mientras que la tasa reversa es (kR) es de10

‐6

s‐1. La constante de equilibrio K viene dada por la relación de estas tasas constantes:

La concentración de equilibrio de B es 100 veces la de A, tanto la enzima esté presente o

no. Sin embargo puede tomar un tiempo considerable para llegar a este equilibrio sin la

enzima. Las enzimas aceleran el alcance del estado de equilibrio pero no cambian su

posición. La posición de equilibrio sólo es una función de la diferencia de la energía

libre entre reactivos y productos.

Las enzimas aceleran las reacciones facilitando la formación del estado de transición.

La energía libre entre los reactivos y productos accounts por el equilibrio de la reacción,

pero las enzimas aceleran cuan rápidamente este equilibrio es alcanzado. ¿Cómo se

puede explicar el aumento de la tasa en términos termodinámicos? Para hacerlo


80

nosotros tenemos que considerar no el punto final de la reacción, sino la vía entre los

puntos finales.

Una reacción química del substrato S a producto P pasa a través de un estado de transición S# que tiene una más alta energía libre que la que tienen tanto S o P. El símbolo denota una propiedad termodinámica del estado de transición. El estado de transición es el que más raramente ocupan las especies en la reacción pues es uno que posee la más alta energía libre. La diferencia en la energía libre entre el estado de transición y el substrato se llama la energía libre de activación de Gibbs o simplemente la energía de activación simbolizado por ∆G (Figura 8.3).

Figura 3. Las enzimas Disminuyen la Energía de Activación. Las enzimas aceleran las reacciones por disminución ∆G‡, de la energía libre de la activación.

Debe notarse que la energía de activación o ∆G‡ no entra en el cálculo final de la ∆G de la reacción pues el aporte de energía requerido para llegar al estado de transición retorna cuando el estado de transición forma el producto. La barrera de la energía de activación sugieren inmediatamente como las enzimas aumentan la tasa de la reacción sin alterar ∆G de la reacción: la función de las enzimas disminuyen la energía de activación, o en otras palabras, las enzimas facilitan la formación del estado de transición.

Una forma de comprender como trabajan las enzimas para realizar esta facilitación es asumir que el estado de transición (S‡) y el substrato (S) están en equilibrio.

en la cual K‡ es la constante equilibrio por la formación de S‡ y υ es la tasa de formación del producto S#

La tasa de la reacción es proporcional a la concentración de S‡


81

Debido a que sólo S‡ puede ser convertido en producto. La concentración de S‡ está luego relacionada a la diferencia de la energía libre entre S‡ y S, debido a que estas dos especies químicas que se asume están en equilibrio; la mayor diferencia entre estos dos estados el menor la cantidad de S.

Debido a que la reacción es proporcional a la concentración de S, y la concentración de S‡ depende de ∆G’, la tasa de reacción V depende de ∆G’.

Específicamente:

En esta ecuación k es la constante de Bolzmann’s y h es la constante de Planck. El valor de kT/h a 25oC es 6,2x1012 s‐1. Suponemos que la energía libre de activación es de 6,82 kcal/mol‐1 (28,53kJ mol‐1) la relación [S‡][S] es luego 10‐5]. Si asumimos simplemente por obra divina que [S] = 1M, luego la tasa de la reacción V es 6,3 x 107 s‐1. Si ∆G‡ fue disminuido a 1.36 kcal mol‐1 (5.69 kJ mol‐1), la relación [S‡]/[S] es luego 10‐4 y la tasa de reacción debería ser 6.2 × 108 s‐1 como muestra en la tabla 8.4 una disminución de 0.36 kcal mol‐1 en ∆G‡ produce una V diez veces mayor. Una relativamente pequeña disminución en ∆G‡ (20% en esta reacción particular) resulta en un mucho mayor incremento en V:

"Pienso que las enzimas son moléculas que,

estructuralmente complementan a los complejos de

activación que catalizan, esto es, a la configuración que

intermediaria entre las substancias reactantes y los

productos de la reacción catalizados por estos procesos. La

atracción de las moléculas enzimáticas por el complejo

activado podría así llevar a disminuir en su energía y de esta

forma, a una disminución en la energía de activación de la

reacción y a un incremento en la tasa de la reacción".

Linus Pauling

Nature 161(1948):707

Así, puede observarse que la clave de cómo las enzimas operan: las enzimas aceleran las reacciones por disminución del ∆G‡. La combinación del substrato y la enzima crea un nuevo patrón de reacción cuyo estado de transición es menor que la de la reacción en ausencia de la enzima. La disminución de la energía de activación significa que más moléculas tienen la energía para llegar al estado de transición. La disminución de la


82

barrera de activación es análoga a la disminución de la altura en una barra de salto, así mas atletas serán capaces de pasarla. La esencia de la catálisis es su ligazon al estado de transición.

La formación de un complejo Enzima‐Substrato es el primer paso en la catálisis enzimática

Mucho del poder catalítico de las enzimas proviene de su capacidad para mantener substratos juntos y en orientaciones favorables para promover la formación de estados de transición en complejos enzima substrato (ES). Los substratos están unidos a regiones específicas de la enzima denominadas el sitio activo. La principal característica que le da la especificidad catalítica a las enzimas, depende en parte de la especificidad de su unión al substrato.

¿Cual es la evidencia para la existencia de un complejo enzima – substrato?

1. La primera clave fue la observación que, a una concentración constante de la enzima, la tasa de la reacción se incrementa conforme lo hace la concentración del substrato hasta que se alcanza una velocidad máxima (Figura 8.4). En contraste, las reacciones no catalizadas no muestran este efecto de saturación. El hecho que una reacción catalizada tiene una velocidad máxima sugiriendo la formación de una cantidad discreta del complejo ES. A una tasa suficientemente alta concentración del substrato, todos los sitios catalíticos están completos y así la tasa de reacción no puede incrementar. Aunque indirecta, esta es la evidencia más general de la existencia de complejos ES.

Figura 8.4. ‐Velocidad de la Reacción Versus Concentración del Substrato en una Reacción Catalizada por Enzimas. Una reacción catalizada por enzimas llega a una velocidad máxima.

2. La cristalografía de rayos X ha provisto de imágenes de alta resolución de substratos y análogos de substratos unidos al sitio activo de muchas enzimas. Los estudios de rayos X, llevados a cabo a bajas temperaturas (para disminuir la reacción) proveen imágenes que revelan visiones de complejos enzima‐substrato y su posterior reacción. Una nueva técnica, la cristalografía de resolución temporal se realiza co‐cristalizando un análogo de substrato fotolábil con la enzima. El análogo del substrato puede ser convertido a un


83

substrato luz, y la imagen del complejo enzima – substrato se obtienen en una fracción de segundo por el barrido del cristal con un sincrotrón de rayos X policromáticos.

Figura 8. 5. Estructura de un Complejo Enzima‐Substrato. (Izquierda) la enzima

citocromo P‐450 es ilustrada uniendo a su substrato camphor. (Derecha) En el sitio

activo, el substrato esta rodeado por residuos de la enzima. Note también la presencia

de un cofactor heme.

3. La espectroscopía característica de muchas enzimas y substratos cambia en la formación de un complejo ES. Estos cambios son particularmente críticos si la enzima contiene un grupo prostético coloreado. La triptofano ‐ sintetasa una enzima bacteriana que contiene un grupo prostético piridoxal fosfato (PLP). La adición subsecuente de indol, el segundo substrato, reduce esta fluorescencia a un nivel aún menor que aquella de la enzima sola. Así la espectroscopía de fluorescencia a un nivel menor que el de la enzima sola, provee una bella ilustración. Ésta enzima cataliza la síntesis de L‐triptofano a partir de la L‐serina y derivados de indol. Otra técnica espectroscópica, tal como la resonancia magnética nuclear y la resonancia electrónica de espín también son altamente informativas acerca de esta interacción de ES.


84

Figura 8.6. Cambios en la espectroscopía característica con la formación de un complejo enzima‐substrato. La intensidad de la fluorescencia del grupo piridoxal fosfato al sitio activo de la triptofano sintetasa cambia con la adición de los substratos serina e indol.

Los sitios activos de las enzimas tienen algunas características comunes

El sitio activo de una enzima es la región que une los substratos (o el cofactor, si es que existe alguno). También contiene los residuos que participan directamente en la formación y la ruptura de las uniones. Estos residuos se denominan los grupos catalíticos. En esencia, la interacción de la enzima y el substrato al sitio activo promueve la formación del estado de transición. Los sitios activos son la región de la enzima que directamente disminuye la ∆G# de la reacción, resultando en el aumento característico de la tasa de acción enzimática. Aunque la enzima difiere ampliamente en estructura, especificidad y modo de catálisis, pueden puntualizarse varias generalizaciones concernientes a sus sitios activos.

1. El sitio activo es una hendidura tridimensional formada por grupos que provienen de diferentes partes de la secuencia de la proteína. En efecto los residuos alejados en la secuencia pueden interactuar más fuertemente que los residuos adyacentes en la secuencia de aminoácidos. En la lisozima, una enzima que degrada las paredes celulares de algunas bacterias, los grupos importantes en el sitio activo son 35, 52, 62, 63, 101, y 108 en la secuencia de 129 amino ácidos (Figura 8.7)


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Figura 8.7. Los sitios activos pueden incluir residuos distantes. (A) diagrama de cintas de la enzima lisozima con varios componentes del sitio activo se muestran en color. (B) Representación esquemática de la estructura primaria de la lisozima mostrando que el sitio activo está conformado por residuos que provienen de diferentes partes de la cadena polipeptídica.

2. El sitio activo ocupa sólo una pequeña parte del volumen total de una enzima. La mayoría de los residuos de aminoácidos en una enzima no están en contacto con el substrato. Esto aumenta la cuestión de ¿por qué las enzimas son moléculas tan grandes? Prácticamente todas las enzimas poseen más de 100 residuos de aminoácidos lo que les da una masa superior a 10 kd y un diámetro de más de 25 Å. Los aminoácidos “extra” actúan como andamios creando el sitio activo tridimensional que están alejados en la estructura primaria. Los aminoácidos cercanos en la estructura primaria a menudo están estéricamente impedidos para adoptar las relaciones estructurales necesarias para formar los sitios activos. En muchas proteínas los aminoácidos remanentes también contribuyen a los sitios regulatorios, los sitios de interacción con otras proteínas, o canales para llevar a los substratos al sitio activo.

3. Los sitios activos son hendiduras, surcos o pliegues. En todas las enzimas de estructura conocida, las moléculas de substratos se unen a un surco o pliegue. El agua usualmente no puede ingresar salvo que sea parte de los reactivos. El carácter no polar de la mayoría de los surcos aumenta la afinidad de la unión del substrato así como la catálisis. No obstante, los pliegues pueden también contener residuos polares adquiriendo propiedades especiales esenciales para la unión al substrato o a la catálisis. En las posiciones internas de estos residuos polares, hay excepciones biológicamente cruciales a la regla general que los residuos polares están expuestos al agua.

4. Los substratos se unen a las enzimas por múltiples atracciones débiles. Los complejos ES usualmente tienen constantes de equilibrio cuyo rango va de 10‐2 a 10‐8 M, correspondiendo a la energía libre de la interacción que van desde cerca de ‐3 a ‐12 kcal mol‐1 (desde ‐13 a‐50 kJ mol‐1) Las interacciones no covalentes en los complejos ES son mucho mas débiles que las interacciones covalentes que tienen energías entre 50 y ‐110


86

kcal mol‐1 (entre ‐210 y ‐460 kJ mol‐1). Las uniones electrostáticas, las uniones puente hidrógeno, las fuerzas de van de Waals y las interacciones hidrofóbicas median las interacciones reversibles de biomoléculas. Las fuerzas de van der Waals se tornan significativas en la unión sólo cuando numerosos átomos de los substratos simultáneamente quedan próximos a muchos átomos de las enzimas. De allí que las enzimas y los substratos tienen formas complementarias. El carácter direccional de uniones hidrógeno entre las enzimas y substrato a menudo a fuerzan un alto grado de especificidad, como se observa en la enzima degradante de ARN: ribonucleasa (Figura 8.8).

Figura 8.8. Puentes hidrógeno entre una enzima y un substrato. La enzyma ribonucleasa forma puentes hidrógeno con la uridina del substrato. [F. M. Richards, H. W. Wyckoff, and N. Allewel. In The Neurosciences: Second Study Program, F. O. Schmidt, Ed. (Rockefeller University Press, 1970), p. 970.].

5. La especificidad de la unión depende del preciso arreglo de átomos en un sitio activo. Debido a que la enzima y el substrato interactúan por medio de fuerzas de corto rango, que requieren de contactos cercanos, un substrato debe coincidir en cuanto a forma para unirse en el sitio d. La analogía de Emil Fischer de la llave y la cerradura expresada en 1890 ha probado ser altamente estimulante y fructífera. Sin embargo, ahora se sabe que la forma del sitio activo puede ser marcadamente modificando por la unión al substrato, como ha sido postulado por Daniel E. Koshand Jr. En 1958. El sitio activo de algunas enzimas asumen que una forma que es complementaria a la del estado de transición solo después que el substrato está unido. Este proceso se denomina de encaje

inducido.

El modelo de Michaelis ‐ Menten da cuenta de las propiedades cinéticas de de muchas enzimas


87

La función primaria de una enzima es aumentar la tasa de las reacciones así que ellas son compatibles con las necesidades del organismo. Para comprender cómo funcionan las enzimas se necesita una descripción cinética de su actividad. Para la mayoría de las enzimas la tasa de catálisis Vo es definida como el número de moles de producto formado por segundo, éste varía con la concentración de substrato [S] en la forma que se muestra en al figura 8.11. La tasa de catálisis aumenta linealmente con la concentración del substrato. Para poder interpretar este gráfico es necesario comprender como es generada. Considerando una enzima que cataliza el S a P por el siguiente patrón:

Figura 8.11. Cinética de Michaelis‐Menten. Una gráfica de la velocidad de la reacción (V0) como funcción de la concentración del substrato [S] de una enzima que se rige por la cinética de Michaelis‐Menten mostrando que la máxima velocidad (Vmax) se aproxima asimtóticamente. La constante de Michaelis (KM) es la concentración del substrato produciendo una velocidad de Vmax/2.

La cantidad de producto formado viene determinada como función del tiempo de una serie de concentraciones del substrato (Figura 8.12) Como es dable esperar en cada caso la cantidad de producto formado incrementa con el tiempo, aunque eventualmente un tiempo is reached cundo no hay cambios netos en la concentración de S o P. La enzima aún convierte activamente substrato en productos y viceversa pero la reacción de equilibrio ha sido attained. La figura 8.13ª ilustra los cambios en la concentración observados en todas las reacciones participante con el tiempo hasta que se llega al equilibrio.


88

Figura 8.13. Cambios en la concentración de la reacción participantes de una reacción catalizada por una enzima con el tiempo. Cambios de concentración bajo (A) condiciones de equilibrio, y (B) condiciones de preequilibrio.

Las cinéticas enzimáticas son mas fácilmente aproximadas si podemos ignorar la reacción reversa. Definiendo V0 como la tasa de incremento en el producto con el tiempo cuando [P] es bajo; esto es, a tiempos cercanos a cero (V0) (Figura 8.13B). Así por el gráfico de la figura 8.11, V0 es determinado para cada concentración del substrato por medición de la tasa de la formación del producto a tiempos tempranos antes de que se acumule P (ver Figura 8.12).

Comenzando con el examen de la actividad cinética con la gráfica mostrada en la gráfica 8.11.A una concentración fijada de las enzimas, V0 es casi linealmente proporcional a [S] es pequeña pero parece independizarse de [S] cuando [S] es grande. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Mentem propusieron un modelo simple para dar cuenta de la cinética. La característica crítica de en su tratamiento es que en un complejo ES específico es un intermediario necesario de la catálisis. El modelo propuesto más simple que da cuenta de las propiedades cinéticas de muchas enzimas es:

Una enzima E combinada con el substrato S para formar un complejo ES, con una tasa constante k1. El complejo ES tiene dos posibles salidas. Puede disociarse en E y S con una tasa constante k‐1, o puede proceder a formar un producto P, con una tasa constante k2. Nuevamente, se puede asumir que casi ningún producto revierte al substrato inicial, una condición que mantiene el estado inicial de una reacción antes de que la concentración del producto sea apreciable.

Si se requiere una expresión que relacione la tasa de catálisis a la concentración del substrato y la enzima y la tasa de los pasos individuales. El punto de partida inicial es que la tasa catalítica es igual al producto de la concentración del complejo ES y k2

Ahora nosotros necesitamos expresar [ES] en términos de cantidades conocidos. Las tasas de formación y destrucción de los complejos de ES vienen dados por:


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To simplify matters, we will work under the steady‐state assumption. In a steady state, the concentrations of intermediates, in this case [ES], stay the same even if the concentrations of starting materials and products are changing. This occurs when the rates of formation and breakdown of the ES complex are equal. Setting the right‐hand sides of equations 11 and 12 equal gives

En materia de simplificación, se puede trabajar bajo la asunción del estado de equilibrio, las concentraciones de intermediarios, en este caso [ES], stay the same aún si la concentración de los materiales de partida y los productos son cambiantes. Esto ocurre cuando la tasa de formación y la ruptura del complejo de ES son iguales.

Reemplazádose los términos de las ecuaciones 11 y 12:

Por rearreglo de la ecuación 13, se obtiene:

Ecuación 14 puede ser simplificado definiendo una nueva constante, KM, llamado la constante de Michaelis:

Note que la KM tiene las unidades de concentración. La KM es una importante característica de interacciones enzima‐substrato es independiente de las concentraciones de substrato y enzimas.

Insertando la ecuación 15 en la ecuación 14 y resolviendo por [ES] produce

Examinemos ahora el numerador de la ecuación 16. La concentrción del substrato [S] no combinado es prácticamente cercanamente igual a la concentración total del substrato. La concentración de la enzima no combinada [E] es igual a la concentración total de la enzima [E]T menos la concentración del complejo ES

Substituyendo esta expresión por [E] en la ecuación 16 da:


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Resolviendo la ecuación 18 por [ES] da

o

Substituyendo esta expresión por [ES] en la ecuación 10, obtenemos

La maxima tasa, Vmax, se obtiene cuando los sitios catalíticos en la enzima se satura con los substratos esto es, cuando [ES] = [E]T. así,

Substituyendo la ecuación 22 en la ecuación 21 produciendo la ecuación de Michaelis‐Menten:

Esta ecuación da cuenta de los datos cinéticos dados en la Figura 8.11. A muy baja concentración de substrato, cuando [S] es mucho menor que KM, V0 = (Vmax/KM)[S]; esto es la tasa es directamente proporcional a la concentración de substrato. A altas concentraciones de substrato cuando [S] es mucho mayor que KM, V0 = Vmax; esto es la tasa es máxima, independiente de la concentración de substrato.


91

CAPÍTULO TERCERO:

La Superficie Celular


92

LA SUPERFICIE CELULAR

LA MEMBRANA PLASMÁTICA O PLASMALEMA (DEL GRIEGO PLASMA = FORMA, LEMMA = CÁSCARA, LÁMINA)

ES UNA DELGADA CAPA DE 6‐10 nm DE ESPESOR (POR DEBAJO DEL LÍMITE DE RESOLUCIÓN DEL MICROSCOPIO

OPTICO), SE OBSERVA MEDIANTE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA COMO UNA ESTRUCTURA TRILAMINAR CON UN

CENTRO CLARO Y POR ENCIMA Y DEBAJO DOS CAPAS DENSAS.

ES EL ELEMENTO QUE CONTROLA LAS RELACIONES DE LA CÉLULA CON SU MEDIO, ES UNA ESTRUCTURA

NETAMENTE DINÁMICA Y DE ELEVADA COMPLEJIDAD. ESCENCIALMENTE, LA MEMBRANA PLASMÁTICA SE

COMPONE DE UNA CAPA BIMOLECULAR DE FOSFOLÍPIDOS CON PROTEÍNAS; LA PORCIÓN FOSFOLIPÍDICA,

IMPERMEABLE A LAS MOLÉCULAS HIDROSOLUBLES, A LA VEZ ES SOLVENTE PARA LAS PROTEÍNAS DE LA

MEMBRANA.

Jonhatan Singer en 1972 planteó el “modelo de mosaico fluído” en el cual los

fosfolípidos forman una doble capa mientras que las proteínas integrales están insertas

en la capa fluída y aunque tiene estabilidad, su fluidez le permite a los lípidos y proteínas

desplazarse en el plano estructural.

La organización es asimétrica, lo cual significa que los componentes a ambos lados de la

membrana se distribuyen de manera dispar, esto es más evidente en el caso de los

oligosacáridos que se encuentran solo en la superficie extracelular de la membrana o

hacia el interior de compartimentos de cisternas, vacuolas o vesículas.

La MP tiene como funciones: • Determinar la composición diferencial entre el citosol y el medio extracelular • Permitir la comunicación entre las células • Relacionar las matrices extracelulares • Transporte de nutrientes hacia el interior • Transporte de detritus hacia el exterior • Impedir la pérdida de los metabolitos necesarios • Mantener la composición iónica, el pH (7,2) y la presión osmótica adecuados del citosol

LÍPIDOS DE LA MEMBRANA

Los bloques fundamentales con los que se construyen todas las membranas celulares

son los fosfolípidos. Estos son moléculas anfipáticas que consisten de dos ácidos grasos

hidrofóbicos unidos a una cabeza hidrofílica que contiene un grupo fosfato. Debido a


93

que sus colas de ácidos grasos son pobremente solubles en agua, los fosfolípidos, en

soluciones acuosas, forman bicapas espontáneamente orientando las cabezas hacia

ambos lados en contacto con el agua y las colas hidrofóbicas hacia el interior de la

membrana (Fig.3.1). Tales bicapas fosfolipídicas, forman barreras estables entre dos

compartimentos acuosos, y representan la estructura básica de todas las membranas

biológicas.

Fig. 3.1. Modificado de Biochemistry de Berg

TABLA 3.1 COMPOSICIÓN DE LOS LÍPIDOS DE LA MEMBRANA CELULAR (% DE MOLES)

MEMBRANA PLASMÁTICA

RER

MEMBRANA MITOCONDRIAL

EXTERNA LÍPIDOS E. COLI ERITROCITOS

Fosfatidilcolina Fosfatidiserina

Fosfatidiletanolamina Esfingomielina Glucolípidos Colesterol

O 0 80 0 0 0

17 6

16 17 2

45

55 3

16 3 0 6

50 2 23 5 0

>5 Los lípidos constituyen aproximadamente el 50% de la masa de la mayoría de las

membranas celulares aunque esta proporción varía dependiendo del tipo de membrana.

Por ejemplo la membrana

plasmática contiene

aproximadamente 50%

lípidos y 50% de proteínas.

La membrana interna de las

mitocondrias contiene una

inusualmente alta

proporción de proteínas

(~75%), reflejando el

complejo proteico que Fig. 3.2. Modificado de Biología Celular y Molecular de Lodish


94

participa del transporte de electrones y la fosforilación oxidativa. La composición de los

lípidos de las diferentes membranas celulares también varía (Tabla 3.1).

Una propiedad importante de las bicapas lipídicas es que se comportan como fluidos

bidimensionales en los que las moléculas individualmente (tanto lípidos como proteínas)

pueden rotar y moverse en sentido lateral. Tal fluidez es una propiedad crítica de las

membranas y esta determinada tanto por la temperatura como por la composición de

los lípidos. Por ejemplo, las interacciones entre los ácidos grasos cortos son más débiles

que las que se dan entre las cadenas mas largas, así las membranas que contienen

ácidos grasos cortos, son menos rígidas y permanecen fluidas a bajas temperaturas. Los

lípidos contienen ácidos grasos insaturados, incrementan la fluidez, debido a la

presencia de dobles ligaduras que introducen “bucles” en las cadenas de ácidos grasos,

haciendo más difícil su empaquetamiento. Los fosfolípidos (ff) son moléculas

anfipáticas (Fig. 3.2): los fosfolípidos están constituidos por dos cadenas de grupos acilo

derivadas de ácidos grasos, unidos (por lo general por un enlace éster) a pequeños

grupos muy hidrófilos. En consecuencia, los fosfolípidos no se agrupan entre sí en gotas,

sino que se orientan en láminas que exponen sus extremos hidrófilos al ambiente

acuoso. Las moléculas en las cuales un extremo (“la cabeza”) interactúa con el agua y el

otro extremo (“la cola”) es hidrófoba se denominan anfipáticas (“tolerante a ambos”).

En los fosfoglicéridos, una de las clases principales de fosfolípidos, las cadenas laterales

de ácidos grasos (AG) están esterificadas con dos de los tres grupos hidroxilo de glicerol,

y el tercer grupo hidroxilo está esterificado con un fosfato. Este último grupo también

está esterificado por un grupo hidroxilo de otro compuesto hidrófilo, como la colina en

la fosfatidilcolina. En otros fosfoglicéridos, el fosfato está unido a aminoalcoholes u

aminoácidos, como la etanolamina y serina, o derivados de azúcares, como el inositol,

en lugar de la colina. La viscosidad de la bicapa será mayor cuanto más largas sean las

cadenas de A.G (generalmente de 16 a 22º C). Los dobles enlaces en las cadenas

aumentan la fluidez de la bicapa. Ambas cadenas laterales de AG del fosfoglicérido

pueden se saturadas o insaturadas, por lo general, una cadena es saturada y la otra no.

La esfingomielina es un fosfolípido que se encuentra sobre todo en membranas

plasmáticas y carece de la columna vertebral de glicerol, y en lugar de ésta tiene una


95

columna de esfingosina.

Debido a su naturaleza anfipática, en un medio acuoso, tienden a agruparse adoptando

tres formas diferentes: micelas, liposomas y láminas bicapa simétricas de dos moléculas

de espesor similares a la membrana plasmática (Fig. 3.3). Es posible que la lección más

importante recabada del estudio de membranas de bicapas de fosfolípidos puros sea la

tendencia espontánea a unirse para formar estructuras cerradas que separan dos

compartimentos acuosos. Si una bicapa fosfolipídica formara una lámina, con extremos

en los cuales el interior hidrófobo estuviera en contacto con el H2O, esa lámina sería

inestable, por lo tanto, una estructura

esférica sin extremos es el estado más

estable de una bicapa fosfolipídica.

Cada capa fosfolipídica de esta

estructura laminar se denomina

hojuela. Las cadenas laterales

hidrocarbonadas de cada hojuela

reducen al mínimo el contacto con

agua, al distribuirse en un estrecho

alineamiento, en el centro de la bicapa,

para formar un núcleo hidrófobo de 3

nm de espesor el estrecho

agrupamiento de estas cadenas laterales de hidrocarburo se estabiliza mediante

interacciones de van der Waals entre ellas. Enlaces iónicos y de hidrógeno estabilizan las

uniones entre sí y con agua de los grupos polares de la cabeza del fosfolípidos. A pH

neutro los grupos polares de la cabeza de algunos fosfolípidos no tienen carga eléctrica

neta, mientras que los grupos de la cabeza de otros tienen una carga negativa neta. Sin

embargo todos los se pueden agrupar para formar la estructura bicapa característica.

Varios tipos de evidencias indican que la bicapa fosfolipídica es la unidad estructural

básica de casi todas las biomembranas.

Todas las membranas celulares son estructuras cerradas que rodean toda la célula o los

compartimentos separados. Por lo tanto, las membranas celulares tienen una cara

Fig. 3.3Modificado de Biología Celular y


96

interna o fase citosólica (orientada hacia el interior del compartimento) y una cara

externa o fase extracelular (orientada hacia el medio). Dado que la mayoría de las

organelas está rodeada por una membrana de bicapa única, el citosol es la parte del

citoplasma exterior a las organelas. En consecuencia, la cara exoplasmática está

orientada hacia su interior. Algunas organelas como el núcleo, las mitocondrias y los

cloroplastos, están rodeadas por dos membranas; en estos casos, las superficies

exoplasmáticas están orientadas hacia la luz o el espacio entre las dos membranas. En la

Membrana Plasmática los fosfolípidos cargados se encuentran del lado citosólico y son

muy importantes para los procesos de endo y exocitosis.

Colesterol: debido a su estructura compuesta de anillos hidrocarbonados, el colesterol

juega un rol diferente en la determinación de la fluidez de la membrana. Las moléculas

de colesterol se insertan en la bicapa con sus grupos polares hidroxílicos próximos a las

cabezas polares de los fosfolípidos. El anillo hidrocarbonado rígido interactúa con las

regiones de las cadenas de ácidos grasos. Esta interacción disminuye la movilidad de las

porciones externas de las cadenas de los ácidos grasos, tornando esta parte de la

membrana más rígida. La inserción de colesterol, por otra parte interfiere con las

interacciones entre ácidos grasos, manteniendo así la fluidez a bajas temperaturas. La

Membrana Plasmática de las células eucariotas tiene tanto colesterol como fosfolípidos

y se intercalan entre sí. En la mayor parte de las procariotas el colesterol está ausente y

se relaciona con el 5% de colesterol presente en las mitocondrias.

El colesterol es anfipático, posee una cabeza polar (el OH del C3), dirigida hacia la

superficie acuosa y el resto de la molécula es hidrofóbica y permanece en el interior de

la bicapa e interacciona con la parte inicial de los ácidos grasos de los fosfolípidos y los

inmoviliza parcialmente, estos efectos causan:

• Aumento en la permeabilidad de la membrana

• Disminución de la fluidez y flexibilidad a la T corporal de 37ºC

• Ante eventuales descensos de oT, el colesterol previene la transición de fase de

cristal líquido a gel que ocurriría si la bicapa fuera sólo de fosfolípidos, es decir,


97

Fig. 3.4 Modificado de Biología Celular y Molecular de Lodish

mantiene la fluidez cuando baja la oT.

El colesterol constituye entre el 30 y el 50% de los lípidos de la Membrana Plasmática en

células eucariotas vegetales y constituye ciertos esteroides exclusivos de las plantas.

Procariotas Eucariota animal Eucariota vegetal

COLESTEROL Ausente* salvo excepciones

Presente en alto % Presente hasta un 30‐50%

PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA

Si bien todas las biomembranas tienen la misma estructura de bicapa fosfolipídica y

ciertas

funciones

comunes, cada

tipo de

membrana

celular

también posee

ciertas

actividades distintivas determinadas, sobre todo, por el exclusivo grupo de proteínas

relacionadas con esa membrana (Fig. 3.4).Las proteínas son los otros componentes

importantes de las membranas celulares, constituyendo entre el 25 al 75% de la masa de

las proteínas. El modelo de membrana actualmente vigente es el propuesto por

Jonhatan Singer & Garth Nicolson en 1972, visualiza la membrana como un mosaico

fluido en el que las proteínas están insertadas en una bicapa lipídica. Mientras que los

fosfolípidos proveen la organización estructural básica, las proteínas de membrana están

encargadas de desarrollar las diferentes funciones de las membranas de las células. Los

dominios proteicos sobre la superficie de la membrana extracelular suelen intervenir en

las señales o interacciones intercelulares. Los dominios dentro de la membrana, en

particular los que forman canales y poros, desplazan moléculas a través de la

membrana. Los dominios ubicados a lo largo de la cara citosólica de la membrana tienen

un amplio espectro de funciones, desde el anclaje de proteínas citoesqueléticas a la

membrana hasta desencadenar vías de señal intracelulares. Estas proteínas son divididas


98

en dos clases generales, basadas en la naturaleza de su asociación con la membrana: las

proteínas integrales de membrana, que están embebidas directamente dentro de la

bicapa lipídica y las proteínas periféricas de membrana, que no están insertadas sino

asociadas indirectamente con las membranas, generalmente mediante interacciones

con proteínas integrales de membrana.

Proteínas integrales o intrínsecas: muchas proteínas integrales de membrana

(denominadas proteínas de transmembrana), atraviesan la bicapa lipídica, exponiendo

porciones a ambos lados de la membrana. Las porciones de estas proteínas que

atraviesan la membrana, usualmente son regiones α–helicoidales de 20 a 25

aminoácidos no–polares. Las cadenas laterales hidrofóbicas de estos aács interactúan

con las cadenas de los ácidos grasos de los lípidos de membrana, y la formación de una

hélice α neutraliza el carácter polar de las uniones peptídicas. Como ocurre con los

fosfolípidos, las proteínas de transmembrana son moléculas anfipáticas, con sus

porciones hidrofílicas expuestas a los ambientes acuosos, lo cual significa que los

aminoácidos hidrofóbicos quedan expuestos hacia la superficie por lo que deben quedar

en el interior de la bicapa y sólo las partes hidrofílicas asoman al medio acuoso (por lo

tanto son anfipáticas), además, se pueden establecer enlaces iónicos con las cabezas

polares de los fosfolípidos y ésto brinda más estabilidad.

Algunas proteínas de transmembrana atraviesan las membranas una vez; otras lo hacen

múltiples veces. La mayoría de las proteínas de transmembrana de las membranas

plasmáticas de las células eucariotas se han modificado por la adición de carbohidratos,

que están expuestos sobre la superficie de la célula y pueden participar en las

interacciones célula–célula.

Las proteínas pueden estar también ancladas en las membranas por lípidos que son

retenidos por uniones covalentes a la cadena polipeptídica. Diferentes modificaciones

de lípidos anclan proteínas a la fase citosólica y extracelular de la membrana plasmática.

Las proteínas pueden ser ancladas a la fase citosólica de la MP por la adición de ácidos

grasos de 14 carbonos (ácido mirístico) a su extremo amino o por la adición de un ácido

graso de 16 carbonos (ácido palmítico) o grupos prenilo de 15‐ a 20‐ átomos de carbono

en las cadenas laterales de los residuos de cisteína. Alternativamente, las proteínas se


99

anclan a la fase extracelular de la membrana plasmática por la adición de glucolípidos a

su extremo carboxilo.

Para poder extraer las proteínas transmembrana se requieren detergentes o solventes

orgánicos que destruyen la integridad de la membrana.

En ciertos casos, las proteínas integrales no son transmembrana, sino que están

ancladas a una de las caras de la membrana mediante enlaces covalentes con los ácidos

grasos del lado citosólico o extracelular, es decir, que en este caso la cadena

polipeptídica no ingresa en la bicapa, este tipo de anclaje es a través de una cadena

hidrocarbonada fijada por enlace covalente. Algunas proteínas de superficie celular

están ancladas a la cara extracelular por medio de un complejo fosfolipídico glucosilado

unido al extremo C‐terminal, varias enzimas como la fosfatasa alcalina y la fosfolipasa C

pertenecen a esta clase de moléculas.

Algunas proteínas del citosol están ancladas a la cara citosólica de las membranas

mediante una cadena hidrocarbonada, fijada por enlace covalente a una cisteína

cercana al C terminal. En otro grupo de proteínas citosólicas ancladas mediante lípidos,

un grupo acilo graso se une a través de un enlace amida al resto de glicina N‐terminal,

en estas proteínas, el anclaje N terminal es necesario para retenerlas sobre la membrana

y puede desempeñar un papel importante en una función asociada a la membrana, por

ejemplo, v‐Src, una forma mutante de una tirosinaquinasa celular, es oncogénica y sólo

puede transformar las células cuando retiene un N‐terminal miristilado.

Las hélices α hidrofóbicas de las proteínas transmembrana están incluídas en la bicapa:

Las proteínas integrales que contienen dominios hélices α que atraviesan la membrana,

se incluyen en la membrana mediante interacciones hidrofóbicas con el interior lipídico

de la bicapa y probablemente también por interacciones iónicas con los grupos de las

cabezas polares de los fosfolípidos. Las cadenas laterales hidrofóbicas forman

interacciones van der Waals con las cadenas acilos grasos y resguardan los grupos

carbonilos (C=O) e imino (N‐H) del enlace peptídico.

Muchas proteínas integrales contienen múltiples hélices‐α transmembrana: en la

actualidad se sabe que muchas proteínas transmembrana contienen dos o más hélices‐


100

α que atraviesan la membrana. Por ejemplo el centro de reacción fotosintético

bacteriano (PRC) comprende cuatro subunidades y varios grupos prostéticos, entre ellos

cuatro moléculas de clorofila. En esta compleja proteína, tres de las cuatro subunidades

atraviesan la membrana; dos de estas subunidades (L y M) contienen cada una cinco (5)

hélices α que atraviesan la membrana.

Una familia de proteínas de membrana importante y numerosa se define por la

presencia de siete (7) hélices α que atraviesan la membrana, son ejemplos de esto la

bacteriorrodopsina (proteína que se encuentra en bacterias fotosintetizadoras), las

opsinas (proteínas de la retina del ojo que absorben la luz), los receptores de varias

hormonas sobre la superficie celular y los receptores para las moléculas aromatizantes.

Las hebras β múltiples de las porinas forman “barriles” que se extienden de una

superficie a otra de la membrana: las porinas son una clase de proteínas transmembrana

que proporcionan canales para el pasaje de disacáridos, fosfatos y moléculas similares.

Las secuencias de aminoácidos de las porinas son en su mayor parte polares y no

contienen segmentos hidrófobos típicos de las proteínas integrales con dominios

helicoidales‐α. Las porinas son trímeros de subunidades idénticas, en cada subunidad,

dieciséis (16) hebras β‐ forman una estructura con forma de barril, con un poro en el

centro. En un monómero de porina, los grupos laterales orientados hacia fuera de cada

una de las hebras β son hidrófobas, por lo que pueden interactuar con los grupos acilos

grasos de los lípidos de membrana o con otros monómeros de porina. Entre los grupos

laterales orientados hacia el interior de un monómero de porina predominan los

hidrófilos y revisten el poro.

Proteínas periféricas o extrínsecas: son las que no interactúan con el núcleo hidrofóbico

de la bicapa y se asocian con la membrana de manera indirecta mediante enlaces

débiles a las otras proteínas o de manera directa a las cabezas polares de los

fosfolípidos, del lado citosólico o del lado extracelular. Entre las proteínas periféricas

localizadas sobre la cara citosólica de la bicapa se encuentran las del citoesqueleto:

espectrina y actina de los eritrocitos y la enzima proteinasa‐C. Un grupo importante de

proteínas periféricas son enzimas hidrosolubles, que se asocian con los grupos polares

de los fosfolípidos de la membrana. Un grupo bien definido de estas enzimas son las


101

fosfolipasas, que hidrolizan distintos enlaces en los grupos de las cabezas de los

fosfolípidos, estas enzimas tienen un importante papel en la degradación de las

membranas celulares dañadas o envejecidas.

Para el aislamiento de proteínas periféricas se pueden utilizar tratamientos suaves con

soluciones salinas, pH elevado o agentes quelantes de cationes bivalentes.

PROTEÍNAS INTRÍNSECAS EXTRÍNSECAS Tipo transmembranosa SI /NO NO

Asociación a la MP Mediante enlaces fuertes Mediante enlaces débiles Método de extracción Fuerte Suave

GLÚCIDOS DE LA MEMBRANA

Son oligosacáridos o monosacáridos unidos covalentemente a lípidos, como

constituyentes de glucolípidos o proteínas, como glucoproteínas. Los

glucosaminoglucanos (GAGs) usualmente se encuentran unidos a proteínas. Los hidratos

de carbono así ligados aumentan el carácter hidrófilo de los lípidos y las proteínas, y

contribuyen a estabilizar las conformaciones de muchas proteínas de membrana. Los

glúcidos se encuentran casi exclusivamente del lado extracelular.

Por lo general, los espacios dentro y fuera de los compartimentos cerrados formados por

las membranas celulares tienen distintas composiciones. Esta asimetría es un aspecto

esencial de la estructura y la función de las membranas biológicas y se refleja en la

asimetría de todas las proteínas integrales de membrana. Así, cualquier tipo de proteína

integral de membrana tiene una orientación específica exclusiva respecto de las caras

citosólicas y exoplasmáticas de una membrana celular, y todas las moléculas de una

proteína integral comparten esta orientación. La asimetría de una proteína de

membrana, establecida durante su biosíntesis e inserción en una membrana, se

mantiene durante toda la vida de la proteína.

Las glucoproteínas y glucolípidos son especialmente abundantes en las membranas de

las células eucariotas, pero no se encuentran en la membrana mitocondrial interna, las

laminillas de los cloroplastos y varias otras membranas intracelulares. Casi siempre hay

hidratos de carbono adosados a la cara exoplasmática de la membrana. Los glucolípidos


102

siempre se encuentran del lado extracelular, al igual que las glucoproteínas, las cadenas

hidrocarbonadas polares se orientan hacia el exterior, hacia el medio externo y hacia

fuera de la célula.

La mayoría de los fosfolípidos y también el colesterol, por lo general se encuentran en

ambas hojuelas de la membrana, si bien a menudo son mas abundantes en una u otra.

Se puede determinar la abundancia relativa de un fosfolípidos particular, en las dos

caras de la membrana plasmática sobre la base de su susceptibilidad a ser hidrolizado

por las fosfolipasas específicas (enzimas que hidrolizan los enlaces fosfoéster). Los

fosfolípidos de la cara citosólica son resistentes a la hidrólisis por fosfolipasas.

FLUIDEZ DE MEMBRANA: hace referencia a que tanto los lípidos como las proteínas

pueden tener una considerable libertad de movimiento lateral dentro de la membrana.

Los fosfolípidos pueden girar sobre su eje, balancearse y flexionar sus cadenas de AG,

pero no pueden realizar movimiento de inversión o traslación (flip‐flop), es decir, no

migran o alternan de una cara de la membrana a la otra. Desde el punto de vista

energético estos movimientos son muy desfavorables, porque la cabeza polar de un

fosfolípido debe ser transportada por el interior hidrófobo de la membrana. En las

membranas naturales y artificiales, una molécula lipídica típica puede intercambiar su

lugar con las moléculas vecinas unas 107 veces por segundo, y se difunde varios

micrómetros por segundo a 37ºC. A esta velocidad, un lípido podría difundirse por toda

la longitud de una célula bacteriana típica ( ≈ 1μm) en sólo 1 segundo, y la longitud de

una célula animal en unos 20 segundos.

Distintos experimentos han demostrado que muchas proteínas integrales de membrana,

al igual que los fosfolípidos, flotan con cierta libertad dentro del plano de la membrana

natural. Estos experimentos sugieren que muchas proteínas integrales se difunden con

libertad en un mar de lípidos en el espacio bidimensional de la membrana. De acuerdo

con este concepto, conocido como modelo de mosaico fluido, la membrana se

interpreta como un mosaico bidimensional de moléculas de fosfolípido y proteína con

movilidad lateral.

Nunca se observó que las proteínas atraviesen la membrana en un movimiento

alternado de ida y vuelta (flip‐flop), en el que debería intervenir un pasaje transitorio de


103

restos de aminoácidos y azúcares hidrófilos a través del interior hidrófobo de la

membrana, lo que sería desfavorable desde el punto de vista energético.

GLICOCALIZ o GLUCOCALIX

Se denomina de esta manera al revestimiento externo de la mayoría de las células

eucariotas, y cuya importancia varía conforme la función del tipo celular.

Tiene aproximadamente un espesor de 10 – 20 nm y contiene las cadenas laterales de

los oligosacáridos de las glicoproteínas y de los glicolípidos que se ven en la superficie

externa de la membrana plasmática. Se renueva constantemente. Cumple entre otras,

una función antigénica, y en ciertas células, como algunas endoteliales, contribuye a

formar un filtro; también proporciona un microambiente, por su carga eléctrica, pH y

concentración iónica especial. Tiene funciones específicas en el metabolismo,

reconocimiento celular, asociación celular y como sitio de receptores para hormonas. La

potencial diversidad estructural desde el punto de vista químico de los carbohidratos, les

permite asociarse entre sí en varios sitios y hacen que sean importantes transportadores

de información, también pueden combinarse en forma selectiva y reversible con las

lectinas, proteínas que frecuentemente aparecen en la superficie de las células, las

cuales tienen la habilidad de distinguir no sólo monosacáridos sino también

oligosacáridos diferentes. Pero debe también remarcarse que si bien los carbohidratos

del glicocáliz son muy importantes en los reconocimientos o interacciones celulares, hay

también otros modos de reconocimiento o interacción entre las células, que dependen o

se basan en un lenguaje de péptidos. Algunas formas de adherencia, por ejemplo

involucran proteínas de superficie llamadas integrinas y péptidos complementarios; y es

justamente la existencia de más de un sistema para las actividades de adhesión lo que

otorga mayor flexibilidad al repertorio de interacciones de una célula dada.


104

EL TRANSPORTE DE MOLÉCULAS

La membrana plasmática es selectivamente permeable al pasaje de moléculas pequeñas.

La presencia de proteínas

específicas para el transporte

media el pasaje selectivo de

molé‐culas pequeñas a través de

la membrana, permi‐tiendo a la

célula controlar la com‐posición

de su cito‐plasma (Fig. 3.5).

Fig 3.5 Tipos de transporte de

membrana (modificado de Albert,

2002)


105

Fig. 3.6. Cinéticas de la difusión simple y de la difusión mediada por proteínas transportadoras

DIFUSIÓN SIMPLE

Es un mecanismo sencillo, en el que una molécula simplemente se disuelve en la bicapa

de fosfolípidos, difunde y luego se disuelve en la solución acuosa del otro lado de la

membrana.

Ninguna proteína de la membrana está implicada, y la dirección del transporte es

determinada simplemente por las concentraciones relativas de la molécula dentro y

fuera de la célula. Es un proceso no selectivo. Los gases (tales como O2 y CO2), moléculas

hidrofóbicas (como el benceno), y moléculas polares pequeñas sin carga neta (tales

como H2O y etanol) son capaces de difundir.

DIFUSIÓN FACILITADA

Implica el movimiento de moléculas en la dirección determinada por sus

concentraciones relativas y/o por el potencial eléctrico, para el caso de moléculas

cargadas. No se proporciona ninguna fuente externa de la energía y presentan cinética

de saturación.

Difiere de la difusión pasiva en que las moléculas transportadas no se disuelven en la

bicapa de fosfolípidos. Su pasaje es mediado por proteínas que permiten cruzar la


106

membrana sin interactuar con su interior hidrofóbico.

Por este mecanismo se transportan: los carbohidratos, los aminoácidos, nucleótidos, y

los iones.

En la difusión facilitada intervienen dos clases de proteínas: las proteínas

transportadoras y las proteínas canal.

Las proteínas transportadoras ligan moléculas específicas para ser transportadas en un

lado de la membrana. Experimentan cambios conformacionales para funcionar.El

transportador de la glucosa fue identificado inicialmente como una proteína de 55 kd en

glóbulos rojos humanos. Tiene 12 segmentos de transmembrana hélice‐α Los cambios

conformacionales del transportador de la glucosa son reversibles. Tal flujo inverso (de

adentro hacia afuera) ocurre en células del hígado, en donde la glucosa se sintetiza y es

liberada en la circulación.

Las proteínas canal simplemente forman poros abiertos en la membrana, permitiendo

que, moléculas pequeñas, del tamaño y carga apropiadas pasen libremente.

Permiten también, el pasaje de moléculas entre células conectadas. Tipos de proteínas

canal son las porinas, acuoporinas y las proteínas de los canales iónicos y están

presentes en las membranas de todas células.

Propiedades del transporte a través de canales iónicos

• Rápido.

• Selectivo: restringen el pasaje a iones del tamaño y carga apropiados. Así, las

proteínas canal específicas permiten el pasaje de Na+, K+, Ca2+ y Cl‐ a través de la

membrana

• La apertura de los canales responde a estímulos específicos

El flujo de iones por canales de membrana, es dependiente de la disminución de la

concentración del ion, y debido a que los iones son sustancias cargadas, su transporte

tiene como resultado el establecimiento de una disminución en el potencial eléctrico a


107

través de la membrana. El flujo de iones a través de una membrana es manejado por

ambos componentes: concentración y voltaje electroquímico.

Existe un potencial de equilibrio separadamente para cada ion.

Cuando los impulsos nerviosos viajan por los axones, la membrana se despolariza. Estos

cambios resultan de la apertura y cierre secuenciales y rápidos de los canales de Na+ y K+

(al entrar Na+ se produce la despolarización y caída del potencial).

Al lograr el equilibrio, los canales de sodio Na+ se desactivan y los canales de K+ se abren,

con el consecuente aumento en la permeabilidad de la membrana al K+. Aumenta el

flujo rápidamente fuera de la célula llevando a una disminución rápida en el potencial de

membrana. Luego los canales se desactivan y regresa el potencial de membrana a su

nivel de reposo. La despolarización permite que los potenciales de acción viajen por toda

la longitud de axones de las células nerviosas como señales eléctricas, teniendo como

resultado la transmisión rápida de impulsos de nerviosos sobre distancias más largas,

mediadas por la liberación de los neurotransmisores.

Los canales de Na+, K+, y Ca2+ pertenecen a una familia grande de proteínas relacionadas:

proteínas de transmembranas.

Distribución de iones en distintos tipos celulares

Célula Ion Razón concentraciones (ext/int)

Potencial de equilibrio (mV)

Potencial de Membrana (mV)

Músculo Na+ 12 +67 –90 K+ 0,0026-98 –98 Cl– 30 –90 Ca+2 15.000 +123

Axón Na+ 9 +57 –60 K+ 0,029 –83 Cl– 14 –67 Ca+2 10.000 +118

Transporte activo


108

Se produce en contra de un gradiente de concentración. En el transporte activo, la

energía proporcionada por otra reacción acoplada (hidrólisis de ATP) es utilizada para

manejar el transporte en contra de este gradiente.

La bomba de Na+/K+ proporcionan un ejemplo importante de transporte activo

manejado directamente por hidrólisis de ATP.

La concentración de Na+ es aproximadamente diez vez más alta en el exterior que en el

interior de la célula, mientras que la concentración de K+ es más alta dentro que fuera.

Estas diferencias son mantenidas por la ATPasa de Na+/ K+ que utiliza la energía derivada

de la hidrólisis de ATP.

Mecanismo de la bomba

- Cambios conformacionales: los iones Na+ se unen a sitios de alta afinidad dentro

de la célula lo que estimula la hidrólisis de ATP y fosforilación de la bomba. Luego

se produce la exposición del Na+ al exterior de la célula. Al mismo tiempo, los

sitios de alta afinidad para el K+ se exponen en la superficie de la célula y se

estimula la hidrólisis del grupo fosfato del ATP.Esto induce un segundo cambio

conformacional, exponiendo el K+ al interior de la célula.

La bomba tiene tres sitios obligatorios para el Na+ y dos para K+.

Función de la bomba de Na+/K+:

- Propagación de señales eléctricas en el nervio y el músculo.

- Manejar el transporte activo de una gran variedad de moléculas.

- Mantener el volumen osmótico de la célula (el citoplasma contiene una

concentración alta de moléculas orgánicas. En la ausencia de un contrapeso, esto

manejaría el flujo interno de agua por ósmosis, dando como resultado el estallido

de la célula.

El transporte activo de Ca2+ a través de la membrana es manejado por una bomba de

Ca2+, estructural y funcionalmente relacionada con la bomba de Na+/K+ (la concentración

de Ca2+ dentro de la célula es mucho menor que fuera). Esto concentración intracelular


109

baja hace que la célula sea sensible a pequeños aumentos en sus niveles. Tales

aumentos juegan un papel importante en la contracción del músculo.

Fig. 3.7. La bomba de sodio / potasio

Fig. 3.8. Un modelo del ciclo de bombeo de la bomba de Na+ / K+

Otras bombas:

- Bomba de H+: responsable del transporte activo de H+ fuera de la célula.

- Aquellas presentes en las membranas de bacterias, levaduras, y células vegetales y

animales ( células gástricas, lisosoma y endosomas, síntesis de ATP en las

mitocondrias y cloroplastos)


110

Fig. 3.9. Tres formas de transporte activo

El Transporte activo acoplado (cotransporte)

La disminución de Na+ establecido por la bomba Na+/ K+ proporciona una fuente de la

energía que se utiliza frecuentemente para accionar el transporte activo de azúcares,

aminoácidos, y de los iones en células de mamíferos. Las células epiteliales del intestino

proporcionan un buen ejemplo del transporte activo manejado por la disminución del

Na+.

Esta forma de transporte puede ser como cotransporte: transporte de dos moléculas en

la misma dirección (sinporte) (Na+/glucosa) y por contratransporte (antiporte): dos

moléculas se transportan en direcciones opuestas (contratransporte Na+/Ca2+, Na+/H+).

Fig. 3.10. Tipos de transporte mediado por proteínas transportadoras (carriers).


111

Fig. 3.11. Modelo de cómo el gradiente de electroquímico de Na+ media el transporte de Glucosa

ENDOCITOSIS

Las células eucariotas son capaces de tomar macromoléculas y partículas del medio

circundante por un proceso llamado endocitosis. En la endocitosis, la materia

internalizada es rodeada por un área de la membrana dentro de la célula para formar

vesículas que contienen la materia ingerida.

FAGOCITOSIS

Durante fagocitosis, las células incorporan partículas grandes tales como bacterias,

restos celulares, o células aún intactas. La incorporación de la partícula a receptores en

la superficie de la célula fagocítica, provoca la extensión de seudópodos. Se rodea la

partícula y se fusiona para formar una vesícula denominada fagosoma. Este luego se

fusiona con los lisosomas, formando el fagolisosoma, en donde la materia ingerida es


112

destruida por acción de enzimas hidrolíticas ácidas.

Función de la fagocitosis

- En las amebas, se utiliza para capturar las partículas de alimento, tal como

bacterias u otros protozoos.

- En animales pluricelulares, proporciona una defensa contra la invasión de

microorganismos y para eliminar células dañadas del cuerpo (leucocitos

granulocitos neutrófilos y macrófagos).

ENDOCITOSIS MEDIADAS POR RECEPTORES

La pinocitosis es común entre células eucariotas. La forma característica de este proceso

es la endocitosis mediada por receptores, que proporciona un mecanismo para la

recepción selectiva de macromoléculas específicas

Las macromoléculas, para ser interiorizadas, primero se unen a la célula por receptores

específicos de superficie. Estos receptores se concentran en regiones especializadas de

la membrana. Luego se forman vesículas que contienen los receptores y su ligando

unido, se fusionan en un endosoma inmaduro y se transporta hacia el lisosoma para ser

reciclado.

La captación mediada por receptores del colesterol en las células de mamíferos ha

proporcionado un modelo clave para entender este proceso a nivel molecular.


113

Fig. 3.13. Endocitosis de LDL mediada por receptores

La endocitosis mediada por receptores tiene como resultado la incorporación no

selectiva de líquidos extracelulares y su contenido, además de la interiorización de

macromoléculas específicas. El endosoma inmaduro sirve como un compartimiento que

clasifica las moléculas que serán recicladas a la membrana o bien transportadas al

lisosoma para la degradación. Una característica importante del endosoma inmaduro es

que mantienen un pH interno ácido (acerca de 6.0 a 6.2) como resultado de la acción de

una bomba de H+. Este pH ácido lleva a la disociación de muchos ligandos unidos a sus

receptores dentro del compartimiento temprano del endosoma. Un ejemplo clásico es

proporcionado por LDL, que se disocia de su receptor dentro de los endosomas

inmaduros. El receptor entonces es vuelto a la membrana vía vesículas de transporte y

las LDL se transportan al lisosoma, donde su degradación libera el colesterol. Los

ligandos destinados para la degradación, se transportan del endosoma inmaduro al

maduro, el cual es más ácido (pH acerca de 5.5 a 6.0) y madura en el lisosoma. Dentro

de los lisosomas, se produce la degradación por la acción de hidrolasas ácidas.


114

PARED CELULAR EN VEGETALES

La pared celular de las células vegetales es una matriz extracelular elaborada que

encierra cada célula vegetal. Las paredes celulares de dos células vecinas se cementan

unas con otras formando una estructura más gruesa, fuerte y rígida que la matriz

extracelular de las células animales. La evolución de la relativamente rígida pared

celular, que puede llegar a varios micrómetros de espesor, tuvo como consecuencia la

pérdida de la capacidad de desplazarse y reptar y las células vegetales, habrían adoptado

un estilo de vida sedentario, que persistió hasta las plantas de la actualidad.


115

La composición de las paredes celulares depende del tipo celular

Todas las paredes celulares vegetales tienen su origen en la división celular conforme se

forma a partir de la placa en la citocinesis para crear una pared de separación entre las

dos células hijas. Las nuevas células normalmente se forman en regiones especiales

denominadas meristemos y normalmente son más pequeñas que las células adultas.

Para poder crecer, las paredes celulares, denominadas pared primaria son delgadas y

extensibles, aunque resistentes. Una vez que el crecimiento cesa, la pared no necesita

ser extensible: algunas veces la pared primaria es retenida sin mayores modificaciones,

pero más comúnmente se produce una rígida pared secundaria por depósito de nuevas

láminas dentro de las más viejas. Éstas pueden tener tener tanto una composición

similar a la de la pared primaria o ser marcadamente diferente. El polímero adicional

más comúnmente encontrado en la pared secundaria es la lignina, una red compleja de

componentes fenólicos encontrados en la pared celular de los vasos del xilema y las

fibras celulares de los tejidos leñosos. La pared celular de las plantas constituye una

especie de esqueleto que soporta la estructura de las plantas como un todo, y también

posee un rol de transporte ayudando al movimiento de fluidos a través de la planta.

Cuando las células vegetales se especializan generalmente adoptan formas específicas y

producen paredes celulares especializadas de acuerdo a las cuales, las mismas pueden

ser reconocidas y clasificadas.


116

Aunque las paredes celulares de los vegetales superiores varían tanto en composición

cuanto en su organización, todos ellas están construídas, como en las matrices

extracelulares de las células animales usando un principio estructural común a todas las

fibras compuestas incluyendo fibras de vidrio, y concreto reforzado. Un componente

provee de la fuerza tensil, mientras que el otro en el cual el primero esta embebido,

provee resistencia a la compresión. Mientras que el principio es el mismo en células

animales y vegetales la química es diferente, A diferencia de las metrices de las células

animales, que son ricas en proteínas y otros polímeros que contienen nitrógeno, las

células vegetales prácticamente poseen polímeros que carecen de nitrógeno, incluyendo

celulosa y lignina. Los árboles hacen grandes inviersiones en lignina y celulosa que

comprende la mayor parte de su biomasa. Para un organismo sedentario que depende

de CO2 y H2O y luz solar, estos dos biopolímeros representan materiales estructurales

baratos basados en carbono, estrategia que ayuda a conservar el escaso nitrógeno fijado

en el suelo que generalmente limita el crecimiento de las plantas.

En la pared celular de plantas superiores las fibras tensiles están conformadas de

celulosa, la molécula orgánica más abundante sobre la tierra, fuertemente ligada en una

red de glicanos entrecruzados. En la pared celular primaria, la matriz en la cual la

celulosa está embebida, está compuesta de pectina, una red altamente hidratada de

polisacáridos ricos en ácido galactourónico. La pared secundaria contiene componentes

adicionales, tales como lignina, la cual es dura y ocupa los intersticios entre los otros


117

componentes, rigidizando la pared. Todas estas moléculas se mantienen unidas por una

combinación de uniones covalentes y no covalentes para formar una una estructura

altamente compleja, cuya composición, espesor y arquitectura depende del tipo celular.

Primero nos enfocaremos en la pared celular primaria y la arquitectura molecular que

subraya su combinación remarcable de fortaleza, resilencia y plasticidad, como la

observada en las porciones de crecimiento de una planta.

La fuerza tensil de la pared celular permite a las células de las plantas desarrollar presión

de turgor

El ambiente acuoso extracelular de una célula vegetal, consiste en el fluido contenido en

la pared que rodea a las células. A pesar que el fluido en las paredes de las células

vegetales, contiene más solutos que los del agua del medio externo (por ejemplo el

suelo), este es aún hipotónico en comparación con el interior celular. Este desbalance

osmótico provoca una presión hidrostática muy alta denominada presión de turgor, que

causa un empuje sobre la pared celular. La presión de turgor se incrementa cuando el

punto donde la célula está en equilibrio osmótico, sin influjo neto de agua debido al

desbalance salino. Esta presión es vital para las plantas debido a que es la principal

fuerza que conduce el

crecimiento de los tejidos vivos de

las plantas.

La pared celular primaria está

construida de microfibrillas de

celulosa entretejida con una red

de polisacáridos pécticos.

La molécula de celulosa provee

de las fuerzas tensiles a la pared

celular primaria. Cada molécula

consiste de una cadena linear de al menos 500 residuos de glucosa, que están

covalentemente ligados unos a otros, formando ristras estabilizadas por puentes

hidrógeno dentro de la cadena. Adicionalemente, los puentes hidrógeno entre las

moléculas de celulosa causan adhesiones mutuas entre las moléculas de celulosa


118

adyacentes y provocando fuertes adhesiones en un arreglo paralelo que forma un haz de

aproximadamente 40 cadenas de celulosa, todas las cuales tienen la misma polaridad.

Estos altamente ordenados agregados cristalinos de muchos micrómetros de longitud,

se denominan microfibrillas de celulosa, y tienen una fuerza tensil comparable al acero.

Los conjuntos de microfibrillas están arreglados en láminas o lamelae, con cada una de

estas microfibrillas de cerca de 20‐40 nm de sus vecinos y se conectan por moléculas de

glicano entrecruzantes que están unidas por puentes de hidrógeno a la superficie de las

microfibrillas. La pared celular primaria consiste de varias de tales lamelas arregladas en

una red semejante a las de madera terciada.

Los glicanos de entrecruzamiento, son un grupo heterogéneo de polisacáridos

ramificados que se unen estrechamente a cada microfibrilla de celulosa y que ayudan a

las microfibrillas entrecruzadas en una red compleja. Su función es análoga a la de las

fibrillas asociadas al cólágeno de las células animales. Hay muchas clases de glicanos de

entrecruzamiento pero todos ellos tienen un largo esqueleto lineal compuesto de un

típo de azúcar (xilosa, glucosa o manosa) de las cuales protruyen cortas cadenas

laterales de otros azúcares, este es el esqueleto de moléculas de azúcar que forman

puentes hidrógeno con la superficie de microfibrillas de celulosa, entrecruzándolas en el

proceso. Ambos, el esqueleto y la las cadenas laterales de azúcares varian de acuerdo a

las especies vegetales y a su estado de desarrollo.

Coextensiva con esta red de microfibrilas de celulosa, y glicanos de entrecruzamiento,

hay otra red de polisacáridos de entrecruzamiento basado en pectinas. Las pectinas son

un grupo heterogéneo de polisacáridos ramificados que contienen muchos residuos de

ácido galactourónico cargados negativamente. Debido a sus cargas negativas, las

pectinas están altamente hidratadas y asociadas con una nube de cationes que

recuerdan a los glicosaminoglicanos de las células animales. Cuando se agrega Ca2+ a una

solución de pectina estas se entrecruzan entre ellas generando un gel semirígido (la

pectina suele agregarse a los jugos para formar gelatinas). Ciertas pectinas son

particularmente abundantes en la laminilla media la región especializada que promueve

la adhesión de células vecinas; se cree que el Ca2+ coopera en el mantenimiento de los

entrecruzamientos de los componentes de la pared celular. Aunque los enlaces


119

covalentes tambien juegan un rol importante en este proceso, poco se conoce acerca de

su naturaleza. La separación regulada de las células en la lámina media subraya tal

proceso en el ripenning de los tomates o en la abscisión de las hojas durante el otoño.

Además de las dos redes basadas en polisacáridos que están presentes en todas las

paredes primarias de las células vegetales, las proteínas pueden contribuir con cerca del

5% del peso seco de la pared, Muchas delas proteínas son enzimas responsables del

recambio y remodelación de la pared, particularmente durante el desarrollo. Otra clase

de proteínas de la pared tienen altos niveles de hidroxiprolina como el colágeno. Se cree

que estas proteínas también provocan el reforzamiento de la pared y se producen en

grandes cantidades como respuesta al ataque de agentes patógenos. De la

secuenciación del genoma de Arabidopsis se ha determinado que al menos 700 genes

son responsables de la síntesis, el ensamble y la remodelación de la pared celular de

vegetales. Algunos polímeros encontrados en la pared celular primaria o secundaria son

listados en la tabla:

Polímero Composición FuncionesCelulosa Polímeros lineales de glucosa Las fibrillas le confiren fuerza

tensil a las paredes. Glicanos de entrecruzamiento Xiloglucano, glucourono‐

arabinoxilano, mannanosEntrecruzamiento de fibrillas de celulosa en una red robusta.

Pectina Homogalacturonatos y ramnogalacturanos

Formas negativamente cargadas, red hidrofílica que da fuerzas de compresión a la pared primaria, adhesión célula ‐ célula.

Lignina Cumaril, coniferil y sinapsil alcoholes entrecruzados

Polímeros impermeables que refuerzan las paredes celulares de las plantas.

Proteínas y glicoproteínas Enzimas, proteínas ricas en hidroxiprolinas

Responsables del recambio y remodelación y ayuda a defender contra patógenos.

Los microtúbulos orientan el depósito de la pared celular

Para que una célula crezca o cambie su forma la pared celular tiene que stretch o

deformarse debido a su estructura cristalina, sin embargo, las microfibrillas de celulosa

individuales son incapaces de stretch. Así el stretching o deformación de la pared celular

debe involucrar tanto el desplazamiento de una sobre otra, la separación de

microfibrillas adyacentes o ambas.

La forma final del crecimiento de las células de las plantas y aún la forma final de las


120

plantas está determinada por la expansión de las células. La expansión ocurre en

respuesta a la presión de turgor en un arreglo de las microfibrillas de celulosa en la

pared. Las células asimismo anticipan su morfología futura controlando la orientación de

miofibrillas que depositan en la pared A diferencia de otras macromoléculas de la matriz

que se producen en el retículo endoplasmático y el aparato de Golgi y son secretadas, la

celulosa como el hialuronano es spun out de la superficie de la célula por una enzima

unida a la membrana plasmática (la celulosa sintetasa) que usa como substrato el

conjugado de glucosa‐UDP suministrado por el citosol. Conforme son sintetizados, las

cadenas de celulosa naciente se ensamblan espontáneamente en microfibrillas que

forman una lámina o lamella, en la cual todas las microfibrillas tienen casi el mismo

alineamiento. Cada nueva lamella se forma internamente a las previas, produciéndose

así un arreglo concéntrico con las lamellas más viejas en la periferia. Las microfibrillas

formadas más recientemente en células que se están elongando, se disponen

perpendicularmente al eje de elongación de la célula. Aunque la orientación de las

microfibrillas en las lamellae que se depositaron previamente pueda ser diferente, es la

dirección de la última lamellae la que tiene la influencia dominante en la dirección de la

expansión celular.

Una clave importante del mecanismo que dicta esta orientación proviene de la

observación de los microtúbulos en las células de las plantas. Estos están arreglados en

el citoplasma cortical con la misma orientación que las microfibrillas que se depositan en

la pared celular en esta región, Estos microtúbulos forman un arreglo cortical cercano a

la fase citosólica de la membrana plasmática que se mantiene adherido por proteíans

pobremente caracterizadas. La orientación concordancia de los microtúbulos dispuestos

corticalmente (justo por debajo de la membrana plasmática), y las fibras de celulosa

(justo por encima de la membrana) se observa en muchas tipos y formas de células

vegetales y se presenta tanto durante el depósito de la pared primaria como de la

secundaria sugiriendo una relación causal.

Si todo el sistema de microtúbulos corticales es desensamblado, tratando los tejidos

vegetales con una droga despolimerizante, las consecuencias no son tan graves como

podría esperarse. El tratamiento no provoca efectos sobre el depósito de nuevas fibrillas

en la orientación preexistente. Sin embargo, se bloquean todos los cambios en el patrón


121

de distribución de las miofibrillas que podría ocurrir posteriormente durante el

desarrollo entre lamellae sucesivas. Así parece ser que la orientación de las microfibrillas

puede ser propagada en ausencia de microtúbulos, pero todo cambio en el patrón

requiere que se encuentren presentes microtúbulos intactos para determinar la nueva

orientación.

Estas observaciones son consistentes con el siguiente modelo. Los complejos que

sintetizan celulosa se encuentran embebidos en la membrana plasmática y liberan las

largas moléculas de celulosa. Conforme se produce la síntesis y autoensamble de

moléculas de celulosa, el extremo distal de cada microfibrilla forma entrecruzamientos

indirectos con la lámina de material de la pared conforme se va integrando en la textura

de la pared. Con el crecimiento, el extremo proximal de cada microfibrilla, los complejos

sintetizantes necesitan moverse a través de la membrana en la dirección de la síntesis.

Ya que las microfibrillas de la celulosa creciente son staff. Cada lámina de microfibrillas

debería tender a depositarse por fuera de la membrana en la misma orientación que la

lámina que se deposito previamente, con el complejo celulosa sintetasa siguiendo a lo

largo de la senda preexistente de microfibrillas orientadas fuera de la célula. Sin

embargo, los microtúbulos dentro de la célula pueden cambiar la dirección

predeterminada en la que se mueven los complejos sintetasa: ellos pueden crear

boundaries en la membrana plasmática actuando como los bancos de canal

restringiendo los movimientos de los complejos sintetasas. En esta visión, la síntesis

ocurre independientemente de los microtúbulos pero estos restringen espacialmente a

la disposición de los microtúbulos que se encuentran presentes para definir los dominios

dentro de los que los complejos enzimáticos pueden moverse.

Adhesión Celular en vegetales y plasmodesmata

La adhesión entre las células vegetales es mediada por su pared celular más que por las

proteínas de transmembrana presentes en las células animales. En particular la región

especializada rica en pectina de la célula, denominanda laminilla media, acúa como

pegamento entre células adyacentes. Debido a la rigidez de la pared celular vegetal, la

asociación estable entre las células vegetales no requieren la formación de ligamientos

citoesqueléticos tales como los provistos por desmosomas y uniones adherentes de


122

células animales. Sin embargo, células vegetales adyacentes se comunican entre ellas

mediante conexiones citoplasmáticas denominadas plasmodesmata (singular

plasmodesmo) que funcionan en forma equivalente a las gap junctions de las células

animales.

A pesar de sus similitudes en la función los plasmodesmata no estan estructuralmente

relacionados con las gap junctions de las células animales.En cada plasmodesmata, la

membrana plasmática de cada célula es contínua con la de su vecina, creando un canal

abierto entre los dos citosoles. Una extensión del retículo endoplasmático liso pasa a

través del poro dejando un anillo de citoplasma alrededor por donde pasan iones y

pequeñas moléculas entre las células. Adicionalmente los plasmodesmata pueden

expandirse en respuesta a estímulos apropiados permitiendo el pasaje de moléculas

entre células adyacentes. Los plasmodesmata pueden así jugar un rol clave en el

desarrollo de los plantas controlando el tráfico de moléculas regulatorias tales como

factores de transcripción o moléculas de ARNs entre las células.


123

Capítulo Cuarto:

El Citosol, el Citoesqueleto

y el Movimiento celular


124

MATRIZ CITOPLASMÁTICA (CITOSOL)

Esta fase de las células eucariotas contiene esencialmente una composición semejante a

la de las células procariotas. Básicamente la matríz contiene una alta proporcion de

agua, proteínas solubles, enzimas, moléculas de ARN, a menudo formando estructuras

complejas con proteínas, etc.

Las células eucariotas poseen un medio interno que rellena todos los espacios no

ocupados por los compartimientos subcelulares y el citoesqueleto. Este citosol, es

especialmente notable en las células poco diferenciadas ya que estas poseen un

desarrollo relativamente escaso de endomembranas.

Las propiedades coloidales de las células, así como las transformaciones de sol a gel, o

las modificaciones de viscosidad, dependen entre otros factores, de la matriz

citoplasmática amorfa.

Es en el citosol en donde se producen la mayor parte de las funciones citoplasmáticas,

En esta fase se encuentran numerosas macromoléculas, enzimas, ribosomas, el

citoesqueleto y un número variable de cuerpos de inclusión que son estructuras

transitorias que carecen de envolturas de membrana (depósitos de glucógeno, gotas

lipídicas, critales, pigmentos, etc.). Cuando se realiza el fraccionamiento celular y una vez

que se han separado las fraciones nuclear, mitocondrial y microsómica, se obtiene la

fracción sobrenadante soluble o citosol.

La matriz citoplasmática o citosol contiene agua iones, metabolitos de bajo peso

molecular y macromoléculas. De estas, alrededor del 20% son las proteínas totales que

posee la célula aunque pueden llegar a constituir una proporcion aún mayor. Las

enzimas de la glucólisis anaerobia, las responsables de la síntesis y degradación del

glucógeno, la maquinaria necesaria para la síntesis de proteínas, las chaperonas, etc.

Adicionalemente se encuentran en esta fase las moléculas de ARN mensajero, los ARN

solubles, y las enzimas relacionadas con estos procesos.

Inclusiones transitorias:

Suspendidos en el seno del citosol existe un número variable de componentes


125

citoplasmáticos que representan acúmulos de nutrientes o subproductos relativamente

inertes del metabolismo celular. Salvo contadas excepciones, no poseen membranas de

recubrimiento. Su concentración en las células depende de la edad de las células, del

tipo celular y su actividad fisiológica.

Partículas Glucógeno:

Cuando la disponibilidad de glucosa es elevada, la glucógeno‐sintetasa elabora grandes

polímeros ramificados que constituyen las moléculas de glucógeno, que es la forma de

depósito intracelular de glucosa transitoriamente inmovilizada.

Estas moléculas forman estructuras electro‐opacas que pueden visualizarse a nivel

ultraestructural usando MET. Estas partículas pueden tener varios niveles de

organización. Los glucosomas o partículas β son estructuras esferoidales de unos 30 nm,

formadas por un centro del polisacárido rodeado por una capa de enzimas que

intervienen en su formación y degradación. Los glucosomas pueden mantenerse como

estructuras independientes o formar acúmulos (partículas α‐ o rosetas).

Los hepatocitos y las células musculares son tipos celulares que contienen grandes

cantidades de glucógeno almacenado en algunas fases de su vida. Cuando el contenido

es especialmente alto se lo puede visualizar al MO mediante la técnica de PAS. Cuando

la célula requiere glucosa, las enzimas de la glucogenólisis (glucógeno fosforilasas)

localizadas en la superficie de los glucosomas pueden degradar el polímero y liberar

glucosa 1‐fosfato hacia el citosol, mas tarde esta es convertida al isómero glucosa 6‐

fosfato que puede iniciar la via catabólica de la glucólisis.

Los hepatocitos constituyen un tipo celular único dado que no almacenan glucógeno

para su consumo sino para exportar glucosa a la sangre a fin de mantener un nivel

relativamente constante de azucar (glucemia) aún después de varias horas de ayuno.

Dado que la membrana no puede transportar la glucosa 6‐fosfato a través de las

permeasas, los hepatocitos poseen un sistema desfosforilante constituido por la glucosa

6‐fosfatasa que en el retículo endoplasmático liso genera glucosa libre la que es luego

transportada al exterior.


126

Inclusiones Lipídicas:

Los acúmulos más comunes son las inclusiones de triglicéridos. Estas formaciones

carecen de membrana y poseen tamaños muy diversos. Algunas son visibles solo con el

ME, mientras que otras alcanzan decenas de micrómetros como las gotas

citoplasmáticas de los adipocitos que son las células especializadas en la acumulación de

lípidos como reserva concentrada de nutrientes para todo el organismo. Otros tipos

como las musculares pueden almacenar pequeñas gotas lipídicas como reserva

energética para su propia utilización. En el hígado, que es el principal órgano involucrado

en el metabolismo lipídico, es común la presencia de estas inclusiones de tamaño

submicroscópico en el citoplasma de los hepatocitos Ciertas glándulas, como las

sebáceas, acumulan triglicéridos como material de secreción. Pese a que las células

utilizan ampliamente el colesterol para la síntesis de sus membranas no existen

depósitos visibles de este esterol. Una excepcion son las glándulas endócrinas que

sintetizan y secretan hormonas esteroides donde las gotitas lipídicas forman ésteres de

colesterol que son los precursores hormonales que se movilizan y desaparecen

rápidamente cuando las células son estimuladas.

Inclusiones cristalinas

Los cristales fueron descriptos como constituyentes normales de algunos tipos de células

por los primeros microscopistas ópticos como por ejemplo las células de Sertoli y las de

Leydig del testículo humano. Estos cristales están suspendidos en el citosol, pero existen

estructuras cristalinas en otros compartimientos celulares como el núcleo, las

mitocondrias, etc. Aunque la mayoría de las inclusiones cristalinas son proteínas de

función y estructura desconocidas, en algunos casos la composición no es proteica,

ejemplo de ello son los cristales intranucleares de hepatocitos caninos que están

compuestos de uratos, lo mismo que en las células de la cornea humana de individuos

que sufren de gota.

En otros casos la composición proteica de los cristales es bien conocida, por ejemplo, el

complejo de apoferritina y hierro (ferritina), que es la forma intracitosólica de depósito

del hierro, la cual cuando se acumula en grandes proporciones puede cristalizar de


127

manera característica.

En otros casos, la presencia de cristales constituye una adaptación funcional importante

como en el tapetum lucidum de animales de hábitos nocturnos. Estos cristales

regularmente espaciados, actúan reforzando la sensibilidad de la visión nocturna.

Pigmentos

Muchas células poseen granulaciones citoplasmáticas de color pardo, descriptas por los

citólogos clásicos como inclusiones de lipofusina o lipocromo . Estas inclusiones no se

presentan en células de vida corta o en organismos juveniles, pero conforme los

individuos envejecen su cantidad se incrementa paulatinamente. Ejemplo de ello se da

en las células que como las neuronas y los cardiocitos se encuentran terminalmente

diferenciados y que han perdido su capacidad de dividirse.

Estos pigmentos se tiñen positivamente con la tinción de PAS1 y débilmente con los

colorantes para lipidos. Actualmente se sabe que estos pigmentos representan los

estadios finales de la desintegración en vacuolas autofágicas que con el correr de los

años se acumulan en forma de residuos no digeribles, metabólicamente inertes que

permanecen sin desdoblarese por las enzimas lisosómicas.

Otro pigmento que puede observarse en las células es la melanina. Es un pigmento

derivado del aminoácido tirosina que se sintetiza en células especializadas llamadas

melanocitos.

EL CITOESQUELETO Y EL MOVIMIENTO CÉLULAR

El citoesqueleto, se compone de una red de filamentos proteicos que se extienden a

través del citoplasma de todas las células eucariotas. Aunque las estructuras del

1 Periodic acid‐Schiff (PAS) es un método de tinción usado en histología y patología. Este método se usa principalmente para identificar glucógeno en los tejidos. La reacción del ácido periódico oxida los residuos de glucosa, creando aldehídos que reaccionan con el reactivo de Schiff y desarrolla un color púrpura‐magenta. También puede utilizarse como técnica de contratinción. La tinción de PAS es principalmente usada para teñir estructuras que contienen una alta proporción de carbohidratos (glicógeno, glicoproteínas, proteoglicanos), típicamente se encuentran en tejidos conectivos, en mucus y en la lámina basal.


128

citoesqueleto se han considerado exclusivas de eucariotas, recientemente se ha

demostrado que algunos procariotas como los bacilos poseen proteínas que funcionan

de forma semejante a los mictofilamentos (proteínas de la familia MreB), a los

microtúbulos (la proteína FtsZ) y a los filamentos intermedios (por ejempo la

denominada crescentina). Aunque las proteínas baterianas no se parecen a las

homólogas eucarióticas en lo que a composición de aminoácidos se refiere, cuando se

ensamblan los polímeros, su estructura general es muy similar. El citoesqueleto

proporciona un armazón estructural para la célula, sirve de andamio para determinar la

forma de la célula y la organización general del citoplasma. Además de jugar un papel

estructural, el citoesqueleto es responsable de los movimientos de la célula. Estos

incluyen no sólo los movimientos de la célula como un todo, sino también el transporte

interno de organelas y otras estructuras (tales como los cromosomas durante la anafase

de la división celular). Es una estructura dinámica que se reorganiza continuamente. El

citoesqueleto se compone de tres tipos principales de filamentos proteicos: filamentos

de actina, filamentos intermedios y microtúbulos, los cuales se mantienen unidos a

organelas intracelulares y a la membrana plasmática por una variedad de proteínas

accesorias.

La estructura y la organización de los Filamentos de actina

La proteína mas abundante del citoesqueleto de la

mayoría de las células es la actina, la cual polimeriza

para formar filamentos, fibras flexibles de

aproximadamente 7 nm de diámetro y hasta varios

micrómetros de longitud. Dentro de la célula, los

filamentos de actina (llamados también microfilamentos) están organizados en

estructuras muy ordenadas. Forman haces o redes tridimensionales con propiedades de

geles. El ensamble y desensamble de filamentos de actina, su organización en haces y

redes, y su asociación con otras estructuras celulares, están regulados por una variedad

de proteínas de unión a actina. Los filamentos de actina son especialmente abundantes

por debajo de la membrana plasmática, donde forman una red que proporciona apoyo

mecánico, determina la forma de la célula, y permite el movimiento de la superficie de la


129

célula, determinando la migración y absorción de partículas.

Ensamble y desensamble de filamentos de actina

La actina fue originalmente aislada de células musculares, en donde constituye

aproximadamente 20% de las proteínas totales. Aunque inicialmente se pensó que se

encontraba implicada sólo en la contracción de músculo, ahora se sabe que es una

proteína extremadamente abundante (típicamente 5 a 10% del contenido proteico total)

en toda clase de células eucariotas.

Las estructuras tridimensionales de los monómeros y filamentos de actina fue

determinada en 1990 por Kenneth Holmes, Wolfgang Kabsch y col. Los monómeros son

proteínas globulares de 375 aminoácidos. Cada monómero de actina (actina globular

[G]) tiene sitios obligatorios que median las interacciones de cabeza y cola con otros dos

monómeros de actina, para polimerizarse formando filamentos (actina filamentosa [F]).

Debido a que todos los monómeros de actina se orientan en la misma dirección, los

filamentos de actina tienen una polaridad definida (terminales positivas y negativas).

El primer paso en la polimerización de la actina, es la formación de un agregado

pequeño compuesto por tres monómeros de actina. Los filamentos de actina entonces

crecen por la adición

reversible de monomeros en

ambos extremos, pero una

terminal (positiva) se alarga

cinco a diez veces más que la

terminal negativa. Los

monómeros de actina

también ligan ATP, que es

hidrolizado a ADP. Aunque el ATP no se requiere para la polimerización, los monómeros

de actina que fijan el ATP, polimerizan más rápido que los que ligan ADP.

Debido a que la polimerización de la actina es un proceso reversible, los filamentos

pueden despolimerizarse por disociación en subunidades de actina. Así, existe un

equilibrio aparente entre los monómeros de actina y los filamentos, que es dependiente

de la concentración de monómeros libres. La velocidad con la que los monómeros de


130

actina se incorporan a los filamentos es proporcional a su concentración, por lo tanto,

hay una concentración crítica de monómeros de actina, en donde la velocidad de

polimerización en filamentos es igual a la velocidad de disociación.

Cabe mencionar, que varias drogas se unen a la actina afectando su polimerización. Por

ejemplo, las citocalasinas se unen a las terminales positivas de los filamentos de actina y

bloquean su alargamiento. Esto tiene como resultado cambios en la forma de la célula

así como la inhibición de algunos tipos de movimientos.

Dentro de la célula, el ensamble y desensamble de filamentos de actina es regulado por

proteínas de unión a actina. La proteína clave responsable del desmontaje de

filamentos de actina dentro de la célula es la cofilina, que se une a los filamentos de

actina y aumenta la velocidad de disociación de monómeros de actina en la terminal

negativa. Además, puede cortar filamentos de actina, engendrando más terminales y

aumentando el desensamble del filamento.

Figura 4‐1. Curva de polimerización. Se puede apreciar que el polímero que se esta formando crece mas rápidamente en el extremo (+). La concentración crítica (Cc) es aquella por debajo de la cual no hay polimerización. Tr = treadmilling, se refiere al rango de concentración en el polímero se polimeriza en el extremo (+) y se despolimeriza en el (‐).

Otra proteína de unión a actina, la profilina, ésta, puede invertir este efecto y estimula la


131

constitución de monómeros de actina en filamentos.

Organización de los filamentos de actina

Los filamentos de actina se disponen en dos tipos de estructuras generales, llamadas

haces y redes de actina. En los haces, los filamentos de actina se eslabonan en series

empaquetadas y paralelas. En las redes, los filamentos de actina están débilmente

eslabonados en series para formar mallas tridimensionales con propiedades de geles. La

formación de estas estructuras se encuentra gobernada por una variedad de proteínas.

Las proteínas que disponen los filamentos de actina en haces son generalmente

proteínas rígidas que fuerzan los filamentos para alinearlos cerca el uno con el otro. Por

contraste, las proteínas que organizan filamentos de actina en redes tienden a ser las

proteínas grandes y flexibles, que pueden eslabonar filamentos perpendiculares.

Hay dos tipos estructural y funcionalmente definidos de haces de actina. El primer tipo

de haces, contiene filamentos de actina alineados en forma paralela como proyecciones

que se apoyan sobre la membrana plasmática, denominadas microvellosidades En estos

haces, todos los filamentos tienen la misma polaridad, con las terminales positivas

adyacentes a la membrana plasmática. Un ejemplo de una proteína que está implicada

en la formación de estas estructuras es la fimbrina, que fue primero aislada de las

microvellosidades intestinales y posteriormente se encontró en proyecciones de

superficie de una gran variedad de células.

El segundo tipo haces de actina se compone de filamentos más espaciados, y cumple

funciones en la contracción, tal como la actina del anillo contráctil que divide las células

en la mitosis.

Los filamentos de actina organizados en redes están adheridos a proteínas grandes, tal

como la filamina. La filamina forma las conexiones entre filamentos de actina, creando

una malla tridimensional débil. Tales redes de filamentos de actina subyacentes a la

membrana plasmática, sirven de sostén a la superficie celular.

Asociación de los filamentos de actina con la membrana plasmática

Los filamentos de actina se concentran en la periferia de la célula, donde forman una red

tridimensional por debajo de la membrana plasmática. Esta red de filamentos de actina


132

y proteínas asociadas a ésta, determinan la forma de la célula y está implicada en una

variedad de actividades en la superficie celular.

La proteína que proporciona la base estructural para el citoesqueleto en los eritrocitos

es la espectrina, que está en relación con la filamina. La espectrina de los eritrocitos es

un tetrámero compuesto de dos pares de cadenas polipeptídicas, llamadas α y β, con

pesos moleculares de 240 y 220 kd, respectivamente. La cadena β tiene un solo dominio

obligatorio de actina en su extremo amino terminal. Las cadenas α y β se asocian para

formar dímeros y luego tetrámeros con dos dominios obligatorios de unión a actina

separados aproximadamente a una distancia de 200 nm. Las terminales del tetrámero

de espectrina se asocian con filamentos cortos de actina, dando como resultado la red

de actina y espectrina, que forma el citoesqueleto submembranoso de los glóbulos

rojos.

Otros tipos celulares contienen uniones entre el citoesqueleto y la membrana

plasmática que son semejantes a los observados en glóbulos rojos.

ACTINA, MIOSINA, Y EL MOVIMIENTO CELULAR

Los filamentos de actina, generalmente están asociados a miosina. La proteína miosina

es el prototipo de un motor molecular—una proteína que convierte la energía química

en mecánica. El ejemplo más llamativo de esta interacción entre la actina y la miosina lo

constituye la contracción muscular.

Existen tres tipos de células musculares: músculo esquelético, cardiaco y liso. En el

músculo esquelético y cardiaco, los elementos contráctiles del citoesqueleto están

presentes en series sumamente organizadas.

El músculo esquelético está constituido por haces de fibras, formadas por células

grandes (aproximadamente 50 μm de diámetro) fusionadas. La mayor parte del

citoplasma se compone de miofibrillas (haces cilíndricos de dos tipos de filamentos:

filamentos gruesos de miosina y filamentos de actina). Cada miofibrilla se organiza como

una cadena de unidades contráctiles denominadas sarcómeros (Fig. 4‐2). Los sarcómeros

miden aproximadamente 2,3 μm longitud y se compone de varias regiones claras,

discernible por microscopía electrónica. Las


133

terminales de cada sarcómero son definidas por el disco Z. Dentro de cada sarcómero,

las bandas oscuras (A) se alternan con bandas claras (I). Estas bandas corresponden a la

presencia o la ausencia de filamentos de miosina. Las bandas I contienen sólo actina,

mientras que la A contiene filamentos gruesos de miosina y actina intercalados. La zona

H contiene sólo miosina, y los filamentos de actina se conectan en sus terminales

positivas al disco Z, que incluye la proteína α‐actinina. Los filamentos de miosina se

anclan en la línea M en el centro del sarcómero. Durante la contracción del músculo, el

sarcómero se acorta, acercando los discos Z. No hay cambios en el ancho de la banda A,

pero la I y la zona H casi desaparecen completamente. Así, la contracción del músculo

resulta de una interacción entre los filamentos de actina y miosina.

Fig. 4‐2: esquema de un sarcómero y sus componentes

La miosina tipo II es una proteína de 500 kd, compuesta de dos cadenas pesadas

idénticas (cerca de 200 kd cada una) y dos pares de cadenas livianas (cerca de 20 kd cada

una). Cada cadena pesada se compone de una región globular (cabeza) y una cola

organizada en una α‐hélice.

Los filamentos gruesos del músculo se componen de más de cien moléculas de miosina,

asociadas por interacciones entre las colas. La actividad motriz de la miosina consiste en

mover sus cabezas sobre el filamento de actina, en la dirección de la terminal positiva.

Este movimiento desliza los filamentos de actina de ambos lados del sarcómero hacia la

línea M, acortando el sarcómero, teniendo como resultado la contracción de músculo.

Las cabezas de miosina unen e hidrolizan ATP, que proporciona la energía para conducir


134

el movimiento. La hidrólisis de ATP conduce los ciclos repetitivos de la interacción entre

cabezas de miosina y actina. Durante cada ciclo, se producen cambios conformacionales

en la miosina, dando como resultado el movimiento de sus cabezas sobre los filamentos

de actina.

La contracción de músculo esquelético es provocada por impulsos nerviosos, que

estimulan la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplásmico—una red especializada de

membranas internas, semejante al retículo endoplasmático. El aumento en el Ca2+

señala la contracción por acción de dos proteínas accesorias: tropomiosina y troponina

(Fig 4‐3). La tropomiosina es una proteína fibrosa que se liga longitudinalmente por la

ranura de filamentos de actina. En el músculo estriado, cada molécula de tropomiosina

se liga a la troponina, que es un complejo de tres polipéptidos: troponina C, troponina I

y troponina T. Cuando la concentración de Ca2+ es baja, el complejo de troponinas se

bloquea y el músculo no se contrae. En concentraciones altas de Ca2+ se activa la

troponina C cambia la posición, rompe la inhibición y permite que la contracción.

Fig 4‐3 Distribución y relaciones de la troponina y tropomiosina musculares

Ensambles contráctiles de Actina y Miosina en células no musculares

Los filamentos de actina en células contráctiles no musculares, se asocian también con

tropomiosina, que facilita su interacción con miosina II. En células no musculares, y en el

músculo liso, la contracción está regulada principalmente por fosforilación de la cadena

liviana de la miosina.

Existe un grupo denominado, miosinas no convencionales, que no forman filamentos y

por lo tanto no están implicadas en la contracción. Intervienen en una variedad de

movimientos celulares, tal como el transporte de vesículas de membrana y organelas, y

en movimientos a través de seudópodos en las amebas. La miosina I presenta una

cabeza globular que actúa como un motor molecular. Es más pequeña que la miosina II y


135

fijan los haces de actina a la membrana plasmática en la microvellosidades. Además de

miosinas I y II, existen por lo menos doce clases más de miosinas no convencionales.

Filamentos intermedios

Los filamentos intermedios son polímeros de más de 50 tipos de proteínas que se

expresan en varios tipos de células. No están involucrados en los movimientos, pero

proveen del soporte mecánico para células y tejidos.

ENSAMBLE DE LOS FILAMENTOS INTERMEDIOS

Los filamentos intermedios están formados por dímeros de dos cadenas polipeptídicas

enrollados uno sobre el otro. Los dímeros luego se asocian para formar tetrámeros que

se ensamblan en protofilamentos. Los filamentos intermedios están formados por

enrollamiento de unos sobre otros formando estructuras que semejan a sogas.

ORGANIZACIÓN INTRACELULAR DE LOS

FILAMENTOS INTERMEDIOS

Los filamentos intermedios son de

longitud variable y posiblemente

se extienden hasta el citoplasma

de la célula para interaccionar con

otras estructuras, como los

llamados desmosomas en las

membranas, dándoles rigidez y

ayudando a su función de

mantener a las células unidas entre sí (Fig. 4‐4). Generalmente se piensa que tienen una

función mecánica dentro de las células, puesto que existen siempre en forma

polimerizada. La presencia de clases específicas de filamentos intermedios, en diferentes

tipos celulares, ha

permitido tipificar a una

célula e identificar de

dónde proviene, lo cual

ha resultado muy útil en


136

los casos de cánceres en que el origen de las células en una metástasis puede

determinarse por el tipo de proteínas que constituyen a los filamentos intermedios que

contiene, y así localizar el punto de origen de la metástasis.

Figura 4‐4. Micrografía por inmunofluoresencia de células en cultivo que han sido

decoradas con un anticuerpo contra filamentos intermedios (en este caso vimetina). La

intrincada red de estos filamentos se extiende por toda la célula hasta su periferia.

Los filamentos intermedios también juegan roles especializados en células musculares y

nerviosas.

Hay también proteínas asociadas a filamentos intermedios; dos bien conocidas son la

filagrina y la sinemina. Sin embargo, su función específica es poco clara todavía, ya que

los filamentos intermedios son muy estables. En algunas enfermedades, como la de

Alzheímer, se ha demostrado que las proteínas de los filamentos intermedios están

alteradas. La fosforilación de las proteínas que forman a los filamentos intermedios está

relacionada con algunas de sus funciones, es reversible y se observa cuando las células

cambian de forma o se reestructura un componente celular, como sucede con la

envoltura nuclear. No se conocen drogas que los despolimericen, aunque en células

tratadas con colchicina estos filamentos se colapsan sobre el núcleo sin desensamblarse,

por lo que se ha postulado que la organización de los microtúbulos controla la

organización de los filamentos intermedios y entonces la colchicina, al desensamblar los

microtúbulos, produce un colapso de la red de filamentos intermedios. Este proceso es

reversible y tanto los filamentos como los microtúbulos se reorganizan al quitarse la

colchicina. Sin embargo, no se han hallado los cofactores que participan en la

reorganización de filamentos intermedios.

FUNCIONES DE QUERATINAS Y NEUROFILAMENTOS: ENFERMEDADES DE LA PIEL Y DEL SISTEMA NERVIOSO: la

importancia de los filamentos intermedios en conferir fuerza mecánica a células en

tejidos ha sido demostrado por la introducción de genes mutantes de queratina en

ratones mutantes. Mutaciones similares del gen de queratina son responsables de

algunas enfermedades humanas de la piel, y anormalidades en los neurofilamentos han

sido implicadas en el desarrollo de enfermedades de las motoneuronas (como se


137

mencionó anteriormente).

Nuevos Roles de los filamentos intermedios: Un nuevo estudio identifica a la lámina-B de los filamentos intermedios como un componente estructural clave de la matriz del huso en mitosis.

La segregación de los cromosomas durante la mitosis es coordinada por el huso mitótico. Este proceso requiere la actividad conjunta de microtúbulos, proteínas de unión a microtúbulos y cromosomas. Aún cuando se ha sugerido que un andamiaje estructural— denominado la matriz del huso— une factores de ensamble del huso (FEHs) y soporta el armado del huso. Hasta el presente, la naturaleza de este andamiaje ha permanecido elusiva. Recientemente, Yixian Zheng y sus colegas reportaron en Science que la lamina-B (proteína de los filamentos intermedios) es necesaria para el ensamble del huso, proponiendo un rol estructural para ésta, en la matriz del huso.

Es ampliamente sabido que la lámina tiene funciones regulatorias y estructurales en el núcleo interfásico, pero estudios previos indicaban que una fracción de lamina-B podría también asociarse con el huso mitótico pudiendo asimismo tener un rol en mitosis. Zheng y sus colegas mostraron, usando técnicas de inmuno-fluorescencia, que la lámina-B se asocia con el huso mitótico en extractos de ovocitos de Xenopus laevis y en células HeLa. Se mostró que la depleción de lámina-B usando técnicas de ARN de interferencia en células HeLa, lleva a un incremento en defectos asociados con el ensamble y la función de esta estructura, lo que indica que la lámina-B podría actuar en el ensamble del huso mitótico. Para eliminar la posibilidad que los defectos en el huso fuesen el resultado indirecto de la perturbación de su función en la interfase, los autores desarrollaron experimentos en la fase M de extractos de ovocitos de X. laevis y obtuvieron resultados similares.

A continuación, los autores mostraron proteínas de la lámina-B ensamblados en una red semejante a la matriz durante la mitosis, demostrando que este proceso depende de la presencia de GTP-unido a las formas pequeñas de la GTPasa Ran. El huso fue ensamblado en extractos de ovocitos de X. laevis en presencia o ausencia de Ran-GTP, y los microtúbulos del huso fueron a continuación despolimerizados con nocodazol. Esto reveló una matriz fibrilar de lámina-B-específica, que sólo se forma en presencia de Ran-GTP. Una posible explicación del requerimiento de Ran-GTP es que las proteínas de importación nuclear importinas α y β interfieren con el ensamble de la matriz de lámina-B, y que el Ran-GTP desplaza a las importinas α y β de las proteínas tales como la lámina-B que son requeridos para el ensamble de la matríz.

Análisis de doble-inmunofluorescencia de la matriz de lámina-B mostraron la presencia tanto de lámina-B y SAFs (poli (ADP-ribosa), NuMA, Eg5, XMAP215 y TPX2) en la misma matriz. A pesar de que la depleción de lámina-B inhibe la formación de estructuras de la matriz que contienen SAFs, la depleción tanto de Eg5 o XMAP215 aún permite la formación de matrices de lámina-B que contienen otras SAFs. Estos descubrimientos indican que se requiere lámina-B para el ensamble de una matriz asociada al huso.

Zheng y colaboradores fueron capaces de aislar la matriz de lámina-B a partir de extractos de ovocitos de fase M tratados con nocodazol, y asimismo fueron capaces de detectar la presencia de lámina-B y varias SAFs. Cuando incubaron con tubulina pura, aislaron matrices que causan la nucleación de los microtúbulos, que ataron a las matrices. En contraste, no se produjo ensamble de microtúbulos en ausencia de matrices. Un hecho muy importante lo constituye el que las matrices en las que no había XMAP215 fueron incapaces de promover el ensamble de microtúbulos. Esto implica que las matrices de lámina-B matrices pueden promover el ensamble por SAFs ligadoras.

Finalmente, los autores mostraron que los mutantes de lámina-B que eran incapaces para formar láminas nucleares interfásicas adecuadas rompen los ensambles del huso. Asimismo, la localización de SAFs sobre las estructuras de los microtúbulos en las matrices que contienen mutantes de lámina-B son anormales. De este modo, el adecuado ensamble de la matriz de la lámina-B es esencial para la organización y localización de SAFs sobre el huso durante la mitosis.

Este trabajo indica que las láminas podría tener un rol nuclear estructural no sólo en la interfase, pero también en mitosis e ilumina importantes visiones sobre la elusiva matriz del huso.

REFERENCIA

1. Tsai, M.-Y. et al. A mitotic lamin B matrix induced by RanGTP required for spindle assembly. Science 311, 1887–1893 (2006) | Article | PubMed |

Microtúbulos

La unidad básica de los microtúbulos es el dímero, formado por tubulinas α y β en

iguales proporciones. El ensamble de estos dímeros para formar un microtúbulo

requiere de la hidrólisis de GTP, un nucleótido trifosfato que contiene la base guanina en


138

lugar de adenina, como en el ATP, y que se encuentra asociado a cada dímero. La

energía provista por la hidrólisis del GTP favorece la polimerización en el extremo del

túbulo, que aumenta de tamaño. El otro extremo, al no crecer, se empieza a

despolimerizar. Por esta razón los microtúbulos son muy inestables y pueden

polimerizarse y despolimerizarse con gran rapidez. Los dímeros, al polimerizar, forman

filamentos alargados (Fig. 4‐5) que posteriormente se asocian en grupos de 13 y dejan

una luz central que le da a la estructura el carácter de túbulo en el citoplasma. Los

microtúbulos, de aproximadamente 25 nm, se forman de manera espontánea partiendo

de centros de nucleación llamados organizadores de microtúbulos (MTOC), en donde se

concentran las subunidades de tubulina. En base a estas estructuras, se organizan los

microtúbulos que irradian hacia el citoplasma (Fig. 4‐6). Los centros organizadores de

microtúbulos forman los ásteres en la mitosis y también los cuerpos basales de los cilios

y flagelos en muchas células.

Figura 4‐5. Microfotografía de microtúbulos

polimerizados in vitro. La tubulina se obtuvo de

cerebro de rata y se hizo polimerizar en

presencia de GTP.

Algunos dímeros de tubulina se modifican una

vez ensamblados en un microtúbulo, para

participar en funciones definidas. Así vemos

cómo algunas tubulinas se acetilan y otras pierden el aminoácido tirosina. También, al

asociarse a algunas proteínas los microtúbulos, se estabilizan.

Figura 4‐6. Centros organizadores de microtúbulos

(MTOC). Los microtúbulos se observan por

microscopía de inmunofluoresencia dentro de las

células, ya que se decoraron con un anticuerpo

contra la tubulina. La región más brillante

alrededor de los núcleos corresponde al MTOC, de

donde irradian los microtúbulos a todo el citoplasma.

Los Centrosomas y la Organización de los Microtúbulos


139

El centrosoma es un orgánulo enigmático y su fama en este sentido ha ido aumentando

durante los últimos 100 años.

Ubicado en el centro de la célula y foco de los microtúbulos, se le considera como el

principal “centro organizador de microtúbulos”. Se observa como una estructura clave

en la progresión del ciclo celular y en su control. Recientes evidencias indican que los

centrosomas no son esenciales en la formación del huso mitótico, pero sí serían de gran

importancia para el inicio de la fase S del ciclo celular y para la terminación de la

citocinesis. Se han identificado, además, las moléculas que regulan la duplicación del

centrosoma y sigue en expansión la lista de actividades sujetas a esta estructura, sus

funciones, algunas aún por determinar que prometen interesantes descubrimientos

futuros.

Está compuesto por los centriolos, situados en su centro y que suelen aparecer en

número de 2, formando el llamado diplosoma. Cerca de ellos puede haber unos pocos

cuerpos densos de pequeño tamaño, denominados satélites centriolares. Los centriolos

están rodeados por un material amorfo y electrónicamente denso que es el llamado

material pericentriolar.

Sus componentes mayoritarios son un conjunto de tubulinas. En el centrosoma existen

varios tipos de tubulinas: α, β, γ y las recientemente descubiertas δ y ε (en humanos).

Tubulinas ‐α y ‐β

Se encuentran formando los 9 tripletes de microtúbulos que constituyen cada uno de los

centríolos. Están organizadas en dímeros con una tubulina α y una β cada uno. La

asociación de estos dímeros es lo que da lugar a la formación de un filamento lineal o

protofilamento y 13 protofilamentos componen un microtúbulo.

Tubulina‐γ

Se encuentra formando complejos en forma anular, en el material pericentriolar. Es la

encargada de la nucleación de los microtúbulos, pero no se incorpora a los mismos.

Tubulinas ‐δ y ‐ε:

Son dos tipos de tubulinas humanas identificadas recientemente y que también están


140

asociadas con el centrosoma. La tubulina δ es homóloga de la tubulina‐δ‐Oni‐3 de

Chlamydomonas. La tubulina‐ε ha sido recientemente descubierta. La localización de

estas dos tubulinas en el centrosoma es independiente de los microtúbulos, y también

los patrones de localización son distintos algo similar ocurre con la tubulina‐γ.

La tubulina‐δ se encuentra en asociación con los centriolos mientras que la tubulina‐ε

está localizada en el material pericentriolar.

La tubulina‐ε muestra un patrón de localización específico del ciclo celular, asociándose

sólo con el centrosoma más viejo en un par recién duplicado y después asociándose a

ambos centrosomas. Así, la tubulina‐ε permite distinguir el centrosoma viejo del nuevo a

nivel del material pericentriolar, indicando que habría un proceso de maduración

centrosomal, marcado mediante el reclutamiento de tubulina‐ε.

Los microtúbulos nucleados por el centrosoma son polarizados, con un extremo de

crecimiento rápido o extremo (+), y otro de crecimiento lento o: (–). Este extremo (–) es

el que se relaciona con el centrosoma, y el (+) es el más alejado, y a partir del que

alargan los microtúbulos.

La geometría de estos microtúbulos es regular, cada uno consta de 13 protofilamentos

que están organizados en una estructura tubular. Como contraste, microtúbulos

creciendo “in vitro” con altas concentraciones de tubulina poseen un número variable de

protofilamentos. Esto indica que requieren de una especie de plantilla para nuclearse

correctamente.

Esta plantilla para la nucleación de microtúbulos en el centrosoma es un complejo

proteico con forma de anillo que contiene tubulina‐γ, una proteína similar a las tubulinas

α‐ y β‐ pero que se encuentra principalmente en los centrosomas y no se incorpora a los

microtúbulos.

La reorganización de los microtúbulos DURANTE LA MITOSIS ocurre al comienzo de la misma

para formar el huso mitótico, que es el responsable de la separación de los cromosomas.

El posicionamiento del huso mitótico dentro de las células es importante para varios

procesos fundamentales, incluyendo la segregación correcta de los cromosomas, la

distribución asimétrica de los determinantes del destino celular durante el desarrollo, las


141

divisiones celulares normal y asimétrica así como la definición del plano de citocinesis.

Los centrosomas y los microtúbulos astrales asociados parecen ser importantes para el

posicionamiento del huso en mamíferos y células de levaduras. Una característica

común de estos sistemas es la interacción de las moléculas de los extremos (+) de los

microtúbulos astrales asociados al centrosoma, con la dineína citoplasmática localizada

en la corteza celular. Fuerzas generadas fuera del huso central por la dineína,

contribuyen, al menos en parte, a la fuerza conductora para el posicionamiento del

huso.

En células de mamíferos que carecen de centrosomas, se producen microtúbulos no

astrales y los husos no llegan a estar bien posicionados, causando los consecuentes

problemas durante la citocinesis.

ESTABILIZACIÓN DE LOS MICROTÚBULOS Y POLARIDAD CELULAR: la estabilización selectiva de los

microtúbulos por las proteínas asociadas a estos (MAPs) pueden determinar la forma y

polaridad de las células, tales como la extensión de los axones y las dendritas de las

células nerviosas.

Entre las proteínas que estabilizan a los microtúbulos se encuentran las llamadas MAPs,

que son de peso molecular elevado y que están formadas por aproximadamente 2.000 a

3.000 aminoácidos, y las llamadas TAU, con 400 a 600 aminoácidos. Ambas se asocian a

los microtúbulos y contienen dos dominios, uno que une a varios dímeros y ayuda a

polimerizarlos y otro que permite que los microtúbulos se unan a otras proteínas.

La polimerización de los microtúbulos puede inhibirse por temperatura, presión, falta de

cationes como Ca2+ y Mg2+ y por drogas, como la colchicina que, al interaccionar con los

dímeros de tubulina, impide que éstos se integren al microtúbulo que esta créciendo en

un extremo, causando la despolimerización del otro extremo. Ya que un microtúbulo

está en un equilibrio dinámico entre dímeros y polímeros, cualquier factor que

interrumpa este equilibrio interferirá con su funcionamiento. Es por esto que la

colchicina es un inhibidor de la mitosis, del transporte axonal y de otras funciones que

requieren la participación de microtúbulos. La droga llamada taxol actúa en forma

contraria a la colchicina, esto es, estabiliza al polímero de modo que los microtúbulos no

pueden despolimerizarse, con la corsecuente inhibición del equilibrio dinámico y de los


142

procesos ya mencionados, en los que participan los microtúbulos.

Motores microtubulares y movimientos

IDENTIFICACIÓN DE LOS MOTORES MICROTUBULARES PROTEICOS: dos familias de proteínas motoras

son las responsables de los movimientos a lo largo de los microtúbulos: las quinesinas y

las dineínas. Las quinesinas y la mayoría de las moléculas relacionadas se mueven hacia

el extremos plus (+) de los microtúbulos, mientras que las dineínas y algunas de la

familia de las quinesinas se mueven hacia el extremo minus (–).

SEPARACIÓN DE LOS CROMOSOMAS MITÓTICOS: durante la anafase mitótica, los cromosomas

hijos se separan y mueven a los polos opuestos del huso mitótico y las proteínas

motores participan del proceso.

EL TRANSPORTE DE LA ORGANELA Y LA ORGANIZACIÓN INTRACELULAR: los movimientos a lo largo de

los microtúbulos transportan vesículas de membrana y organelas a través del

citoplasma, así como posicionan las organelas citoplasmáticas dentro de las células.

CILIAS Y FLAGELOS: estas estructuras son extensiones de la membrana plasmática. Sus

movimientos resultan de deslizamiento de los microtúbulos, conducidos por la acción de

las dineínas motoras. La estructura microtubular más organizada es tal vez el axonema

de cilios y flagelos, en el cual nueve pares exteriores de microtúbulos se arreglan

alrededor de un par central, todos ellos conectados entre sí por un gran número de

proteínas diversas que ayudan a que este axonema lleve a cabo el movimiento de

deslizamiento que resulta en el movimiento batiente de los cilios y de látigo o tirabuzón

de algunos flagelos (Fig. 4‐7). En el caso de cilios y flagelos los microtúbulos son muy

estables y no se despolimerizan con facilidad. Cada par exterior tiene asociada una

proteína con actividad de ATPasa, que se conoce como dinaina, y que al hidrolizar el

ATP genera la energía necesaria para permitir el deslizamiento de los túbulos y, por

consiguiente, de los flagelos o cilios.


143

Figura 4‐7. A) Videomicrografía del protozoario parásito Giardia con sus dos flagelos en movimiento.

B) Representación esquemática del axonema de túbulos arreglados en nueve pares exteriores y un par

central. El movimiento de los microtubulos causa la flexión de los flagelos y esto permite a la célula

desplazarse en su medio ambiente.

¿EXISTE UN CITOSQUELETO EN PROCARIOTAS?

RAMÓN MUÑOZ‐CHÁPULI

La transición de procariotas a eucariotas ha sido uno de los hitos más importante en la evolución de los seres vivos. En la comprensión de cómo se produjo dicha transición han sido importantísimas las aportaciones conceptuales de Lynn Margulis, y en especial su audaz propuesta, hoy generalmente aceptada, de que mitocondrias y cloroplastos derivan de procariotas endosimbióticos que se asociaron a otros procariotas. La formación de un compartimento nuclear diferenciado del citoplasma y el desarrollo de un citosqueleto son otras dos marcas características de los eucariotas. Hoy vamos a tratar del citosqueleto y su origen. Como es sabido, los filamentos de actina, junto con toda una serie de proteínas que modulan su funcionalidad, forman un entramado que no sólo es fundamental para dar forma y soporte mecánico a la célula, sino para procesos tales como la migración celular, la fagocitosis, la división celular, el movimiento de proteínas motoras que la utilizan como guía, etc. La actina es muy abundante,


144

alcanzando el 5% de la proteína total en una célula animal típica. Otros elementos del citosqueleto son los filamentos intermedios, de diferentes tipos según la clase de célula, y los microtúbulos de tubulina. El origen del citosqueleto se relaciona, como ya hemos dicho, con la transición procariota/eucariota, del mismo modo que el núcleo celular o las mitocondrias. La cuestión es cómo se produjo dicho origen. Esta cuestión ha recibido una sorprendente respuesta gracias a dos trabajos publicados en los últimos meses en una competencia que emula a la de las famosas regatas en el Támesis. Por un lado, el grupo de Jeffery Errington, en la Universidad de Oxford, ha descubierto que filamentos muy similares a los de actina, formados por las proteínas MreB y Mbl, controlan la forma de las bacterias [Jones et al., Cell 104:913-922 (2001)]. Por otro, el equipo de Jan Löwe en Cambridge ha demostrado que la proteína MreB polimeriza en filamentos estructuralmente muy similares a los de la F-actina [van den Ent et al., Nature 413:39-44 (2001)]. Vamos a intentar explicar el alcance de estos dos sorprendentes descubrimientos, que se unen a la constatación, hecha hace algunos años, de que las bacterias tienen una proteína similar a la tubulina, denominada FtsZ, que forma filamentos implicados en la división celular.

El estudio de estos grupos se ha centrado básicamente en dos proteínas que ya se conocían en bacterias, denominadas MreB y Mbl. Ambas presentan similaridades superficiales con las proteínas pertenecientes a la superfamilia de la actina, aunque esto, en principio, no quería decir nada. A esta superfamilia pertenecen también enzimas como la hexosaquinasa (que fosforila azúcares) o chaperonas como la DnaK/Hsp70 (por heat shock protein). Estas proteínas no tienen nada que ver con el citosqueleto. Lo que hizo el grupo de Oxford fue generar anticuerpos policlonales contra las dos proteínas, MreB y Mbl e intentar localizarlas por inmunofluorescencia al microscopio confocal en la bacteria Bacillus subtilis, que normalmente tiene forma de bastoncillo, es decir, alargada. Para su sorpresa observaron que las proteínas parecían disponerse en una estructura en forma de hélice dextrógira que recorría la bacteria inmediatamente por debajo de la membrana plasmática, en un plano transversal al eje mayor. Dicha estructura daba entre una vuelta y una vuelta y cuarto a la periferia celular. Por otro lado el número de bandas fluorescentes parecía pasar de una a dos o incluso más en los momentos previos a la división celular, sugiriendo algún proceso, acoplado al ciclo celular, de replicación o síntesis de la estructura. Por otro lado, procedieron a generar cepas mutantes inducibles de Bacillus subtilis que dejaban de expresar mreB cuando se retiraba un componente del medio de cultivo. Las bacterias morían al cabo de un tiempo, pero resultó interesante que antes de morir sufrieran espectaculares cambios en su forma. Se inflaban y redondeaban, perdiendo su aspecto alargado. La disrupción del gen mreB, por tanto, resultaba en una pérdida de control del diámetro celular. En cuanto a la proteína Mbl, también aparecía en forma de estructuras filamentosas y helicoidales dextrógiras, pero situadas a lo largo de la bacteria, en lugar de transversalmente a ella. Esto le da a la estructura una forma de 8.

Los autores calcularon el número de moléculas de MreB y Mbl por bacteria, y obtuvieron una cifra de 8000 y 12000-14000, respectivamente. Esta cantidad es más que suficiente para justificar una estructura microscópica del tamaño observado. Quizá uno de los resultados más llamativos obtenidos por estos investigadores fue el obtenido mediante la búsqueda de genes similares a mreB en distintas bacterias. Después de un exhaustivo recorrido por las bases de datos, pudieron establecer dos grupos de procariotas, según tuvieran o no genes similares a mreB. En el primer apartado se agrupaban bacterias alargadas como Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Haemophilus influenzae y la arquea Methanobacterium thermoautotrophicum. También tienen genes mreB bacterias filamentosas como Streptomyces coelicolor y helicoidales como Treponema pallidum o Helicobacter pylori. En cambio, bacterias esféricas (cocos) como Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Synechocystis sp o las arqueas Pyrococcus horikoshii y Methanococcus janaschii, no tienen genes parecidos a mreB.

Varias consecuencias se pueden extraer de esta observación. Por otro lado parece que la presencia o ausencia de MreB está perfectamente correlacionada con la morfología de la bacteria. A menos que exista esta proteína, la bacteria adopta una forma esférica. Por otro lado, los genes que controlan la forma bacteriana mediante la síntesis de estas estructuras helicoidales, se distribuyen por los dos grandes grupos de procariotas, Eubacterias y Arqueas. Hubiera sido un hallazgo de gran interés filogenético que uno de los dos grupos compartiera con los Eucariotas un carácter derivado como son las proteínas citosqueléticas, pero no es así. Dichas proteínas debieron estar ya presentes en los antepasados comunes de los tres grandes grupos de seres vivos, Eubacterias,


145

Arqueas y Eucariotas.

La comparación de la secuencia de MreB con la de la actina de los eucariotas revela un porcentaje total de homología muy bajo, pero con interesantes coincidencias en zonas especialmente importantes. Dichas zonas parecen estar bien conservadas, y probablemente son claves para la función de la proteína, ya que mutaciones puntuales, con sustitución de un sólo aminoácido, la convierten en no funcional. Por otra parte el alineamiento de las secuencias requiere muy pocos "gaps" o espacios, lo que indica no sólo un tamaño similar de ambas proteínas, lo que ya se sabía, sino además un espaciamiento similar de las zonas conservadas.

Los autores del artículo de Cell concluyen que MreB y Mbl forman estructuras filamentosas, probablemente por ensamblaje de los monómeros proteicos en polímeros. Dichas estructuras se dispondrían según el modelo representado en la figura, lo que explicaría que MreB y Mbl controlen, respectivamente, la anchura y la longitud de la célula.

La polimerización de MreB es exactamente lo que han demostrado los autores del segundo artículo. El grupo de Cambridge ha purificado la proteína MreB de la bacteria Thermotoga maritima y la ha sometido a ensayos de polimerización in vitro. Así han demostrado que MreB forma polímeros sólo si se encuentra en presencia de ATP o GTP. Es importante recordar que la polimerización de la actina también es dependiente de la hidrólisis de ATP. Los polímeros de MreB, observados al microscopio electrónico, recuerdan a los filamentos de actina, con una diferencia importante. Los protofilamentos de actina, formados por un alineamiento de monómeros, suelen asociarse por pares

girando uno alrededor del otro, en forma de doble hélice. Los protofilamentos de MreB también están asociados por pares, pero dispuestos paralelamente. La distancia entre monómeros en los protofilamentos es de 51Å, ligeramente inferior a los 55 Å de la actina. Los autores del artículo de Nature lograron cristalizar MreB y determinar su estructura atómica mediante difracción de rayos X. La estructura tridimensional resultó ser casi idéntica a la de la actina, con dos dominios divididos cada uno en dos subdominios. Es decir, que a pesar de las grandes diferencias en estructura primaria, en la secuencia de aminoácidos, de las que hablábamos antes, las regiones conservadas parecen determinar una estructura terciaria muy similar en MreB y en actina.

Conocida la estructura tridimensional de MreB, es posible calcular que las 8000 moléculas de MreB bastan para ensamblar un polímero de 41 micrómetros de longitud. Dado que los filamentos observados por Jones y cols., miden alrededor de 3 mm, deberían estar formados por una decena de protofilamentos, probablemente suficiente para garantizar rigidez mecánica y mantener la forma de la bacteria.

A partir de ahora se abren interesantes interrogantes. Por ejemplo, ¿existe un mecanismo regulador de la polimerización y despolimerización en MreB y Mbl, igual al existente en actina? Este mecanismo es fundamental para la motilidad de las células eucariotas, y quizá su precursor estuviera ya presente en procariotas. Por otro lado, puesto que en procariotas se han descubierto ya precursores de los filamentos de actina y de los microtúbulos, ¿que sucederá con los filamentos intermedios? ¿Serán los únicos elementos citosqueléticos realmente eucariotas?

Ramón Muñoz-Chápuli es Catedrático de Biología Animal en la UMA

Encuentros en la Biología 73:5-7 (2001)

FILAMENTOS DE ACTINA EN PLANTAS

Los estudios de genómica de plantas han revelado la existencia de isovariantes proteicas

dentro de la familia de genes de la actina; dentro de Arabidopsis thaliana, una dicotiledónea

empleada como organismo modelo, existen al menos 10 tipos de actinas, 9 de alfa tubulinas,


146

seis de beta tubulinas, seis de profilinas y docenas de miosinas. Tal diversidad se explica de

acuerdo a la necesidad evolutiva de poseer variantes ligeramente diferentes en su pauta de

expresión temporal y espacial; no obstante, la mayoría

de ellas se expresan conjuntamente en los tejidos

analizados. El entramado de redes de actina se

distribuye por todo el citoplasma de las células

cultivadas in vitro, con un refuerzo en torno al núcleo

que se conecta, mediante radios, a la corteza celular;

dicho entramado es altamente dinámico, con un polimerizado y despolimerizado continuo.

Estructura de la villina, una proteína accesoria del citoesqueleto de actina.

Si bien las células vegetales poseen generalmente una pared que define su morfología e

impide su movimiento, sus microfilamentos generan las fuerzas necesarias para varias

actividades celulares, por ejemplo, las corrientes citoplasmáticas generadas por los

microfilamentos y las miosinas. Además, la actina interviene en el movimiento de orgánulos y

morfogénesis celular, procesos que incluyen la división celular, la elongación y la

diferenciación.

En cuanto a las proteínas asociadas al citoesqueleto de actina presentes en plantas cabe

mencionar: villina, una proteína perteneciente a la familia de la gelsolina/severina, capaz de

cortar microfilamentos y unir monómeros de actina en presencia de catión calcio; fimbrina, un

elemento capaz de reconocer y unir monómeros de actina y que interviene en la formación

de entramados (mediante una regulación diferente a la propia de células animales y

levaduras) ; forminas, proteínas capaces de actuar como agente nucleante de la

polimerización a actina F; miosina, típico motor moleculares propio de eucariotas que, en

Arabidopsis thaliana, está codificado por 17 genes clasificados en dos clases distintas;

CHUP1, capaz de unir actina e implicado en la distribución espacial de los cloroplastos en la

célula; KAM1/MUR3, una proteína que define la morfología del complejo de Golgi así como la

composición en xiloglucanos de la pared celular; NtWLIM1, proteína que faculta la aparición

de estructuras aovilladas de actina; y ERD10, que participa en la asociación entre orgánulos

delimitados por membranas y los microfilamentos y que parece desempeñar un papel

especialmente relevante en presencia de estrés.


147

CAPÍTULO QUINTO:

El Retículo Endosplasmático, el Aparato de Golgi y Lisosomas


148

EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO EL APARATO DE GOLGI Y LOS LISOSOMAS

Además de la presencia del núcleo, las células eucariotas se distinguen de las procariotas

por la posesión, dentro de sus citoplasmas, de organelas rodeadas de membrana. Estas

organelas proveen compartimentos discretos en los cuales tienen lugar las actividades

celulares específicas. La subdivisión del citoplasma les permite a las células eucariotas

funcionar eficientemente a pesar de su relativamente gran tamaño (aproximadamente

1.000 veces el de una bacteria).

Debido a la compleja organización interna de las células eucariotas la clasificación y el

direccionamiento de las proteínas a sus destinos apropiados no son tareas sencillas. El

primer paso en la clasificación de las proteínas tiene lugar mientras se está produciendo

el transporte. Muchas proteínas destinadas al retículo endoplasmático, al aparato de

Golgi, a los lisosomas, a la membrana plasmática y a la secreción desde la célula, son

sintetizadas sobre los ribosomas que están unidos a la membrana del retículo. Conforme

se produce la traducción, la cadena polipeptídica es transportada al interior del retículo

endoplasmático, donde se produce el procesamiento y el plegamiento. Desde el retículo

endoplasmático las proteínas son transportadas en vesículas al aparato de Golgi, donde

son nuevamente procesadas y clasificadas para los lisosomas, la membrana plasmática,

o la secreción desde la célula. El RE, el aparato de Golgi y los lisosomas se distinguen del

resto de las otras organelas citoplasmáticas por su papel común en el procesamiento de

proteínas y por la conexión establecida por el transporte vesicular.

EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO (RE)

El RE es una red de túbulos y cisternas rodeados de membrana que se extiende desde la

membrana nuclear a través del citoplasma. El RE está rodeado completamente por una

membrana continua y es la organela más grande de la mayoría de las células eucariotas.

Su membrana puede contabilizar cerca de la mitad de todas las membranas celulares y

el espacio encerrado por el RE, (la luz o espacio cisternal) puede representar cerca del

10% del volumen celular total.

Existen dos tipos de RE que realizan funciones diferentes dentro de las células. El RE

rugoso está cubierto de ribosomas sobre su superficie externa, y actúa en el

procesamiento de proteínas. El RE liso no está asociado a ribosomas y esta involucrado


149

fundamentalmente en el metabolismo de lípidos (Fig. 5.1).

Fig. 5.1 Modificado de: “The Cell a Molecular Approach”. G. Cooper

EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO Y LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS

El rol del RE en el procesamiento y clasificación de proteínas fue demostrado por G.

Palade y sus colaboradores en la década del 60´. Estos investigadores estudiaron las

células acinares pancreáticas las que secretan proteínas digestivas al intestino delgado.

Usaron aminoácidos radioactivos para marcar las proteínas de neosíntesis. La

determinación de las proteínas radiomarcadas dentro de la célula fue determinada por

autoradiografía.

Después de una breve exposición de las células pancreáticas a los aminoácidos

radioactivos, las proteínas neosintetizadas se detectaron en el RE rugoso. El cual fue

identificado como el sitio de síntesis de las proteínas destinadas a la secreción. Si las

células se incuban luego con aminoácidos no radioactivos (un proceso conocido como

chase) las proteínas eran detectadas en el aparato de Golgi. Después de un largo período

de corte del suministro de aminoácidos marcados, las proteínas marcadas viajan desde

el Golgi hacia la superficie celular a través de vesículas secretorias que se funden a la MP

y liberan su contenido en la superficie de la célula.

Estos experimentos definieron una vía para las proteínas de secreción, el patrón

secretor:

RE rugoso → Golgi → vesículas secretoras → exterior celular

Estudios posteriores permitieron determinar que este patrón no esta restringido a

proteínas destinadas a la secreción de proteínas fuera de las células. Las proteínas de la

Retículo endoplasmático rugoso

Retículo endoplasmático liso


150

membrana plasmática y las proteínas lisosomales también viajan desde el RER al Golgi y

desde allí a sus destinos finales. Aún otras proteínas viajan a través de los pasos iniciales

del patrón secretor, pero luego son retenidas y funcionan en el RE o en el Golgi. La

entrada de las proteínas al RER constituye un punto de ramificación para el tráfico de

proteínas dentro de las células eucariotas.

En las células de mamíferos la mayoría de las proteínas son transferidas al interior del RE

mientras están siendo traducidas por los ribosomas unidos a la membrana. En contraste,

las proteínas destinadas al citosol o las que deberán ser incorporadas al núcleo, las

mitocondrias, los cloroplastos o los peroxisomas son sintetizadas en los ribosomas libres

y liberadas en el citosol cuando la traducción se ha completado.

DIRECCIONAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS AL RE

Las proteínas son translocalizadas hacia el RER durante su síntesis sobre los ribosomas

unidos a membrana (translocalización cotraduccional), o después que su traducción ha

sido completada en los ribosomas libres (translocalización postraducional). En las

células de mamíferos la mayoría de las proteínas entran al RE cotraduccionalmente,

mientras que las levaduras usan ambos patrones.

El primer paso en el patrón cotraduccional es la unión del ribosoma a la membrana del

RER. Los ribosomas son direccionados por la secuencia de aminoácidos de la cadena de

polipéptidos que se está sintetizando.

La secuencia señal está formada por una corta ristra de aminoácidos hidrofóbicos

precedido por residuos básicos como la arginina. La secuencia señal se cliva por una

proteasa microsomal conforme el péptido es transferido al lumen del RE.

Los experimentos para estudiar el proceso se realizaron in vitro utilizando microsomas.

Aún no se conoce con exactitud el mecanismo por el que las proteínas son direccionadas

al RER durante la traducción (patrón cotraduccional)

Conforme la secuencia señal emerge del ribosoma, la cadena es reconocida por una

partícula de reconocimiento de la señal (PRS) que consiste de seis polipéptidos y un ARN

citoplasmático pequeño (ARN‐7SL). La PRS se une a la secuencia señal y al sitio “A”


151

(aminoacil) del ribosoma, inhibiendo todo el proceso de traducción y direccionando el

complejo PRS–ribosoma–cadena polipeptídica creciente al RE donde se une al receptor

de la PRS. La unión al receptor libera la PRS del sitio aminoacil del ribosoma y del

péptido señal.

El ribosoma se une, riboforinas mediante, a un complejo de translocalización proteica y

la secuencia señal es insertada en un canal de membrana. En mamíferos este canal está

formado 3 proteínas de transmembrana llamadas Sec61 (emparentadas con las

proteínas de la membrana plasmática de bacterias SecA, responsables de procesos de

secreción en procariotas).

Unas pocas proteínas en levaduras y en células de mamíferos son direccionadas al RER

una vez que su traducción se ha completado.

Estas proteínas son sintetizadas en ribosomas libres y su incorporación al RER después

que se ha completado su traducción (postraduccional) no requiere de las PRS.

Su secuencia señal es reconocida por proteínas de reconocimiento diferentes (el

complejo Sec62/63) asociado evolutivamente con el complejo Sec61 en la membrana.

En este último caso, se requieren un conjunto de chaperonas citoplasmáticas que

mantienen la cadena sin plegar y otra chaperona en la luz del RE: BiP se necesita para

realizar la translocalización postraduccional.

INSERCIÓN DE PROTEÍNAS EN LA MEMBRANA DEL RE

Las proteínas que son destinadas al sistema de membranas de la célula son inicialmente

insertadas en la membrana del RE en lugar de ser liberadas en el lumen del RE.

Desde la membrana del RE siguen el mismo camino que las proteínas del patrón

secretor:

RE → Golgi → Membrana Plasmática /o → Lisosomas

Las proteínas integrales de membrana son incluidas en la membrana por sus regiones

hidrofóbicas atravesando la bicapa de fosfolípidos.

Las porciones de transmembrana están constituidas por 20–25 aminoácidos


152

hidrofóbicos formando hélices‐α.

Las proteínas pueden atravesar la membrana una o más veces (uni‐ o multipaso).

Algunas proteínas se ubican con su extremo COO– hacia el lumen del RE y otras con el

extremo NH3+.

El lumen del RE es topológicamente equivalente al exterior de la célula.

El modo más directo de inserción hacia la membrana resulta en la síntesis de proteínas

de transmembrana con su extremo COO– hacia el citosol.

Estas proteínas poseen una secuencia N–terminal normal, que es clivada por peptidasas

señal durante la translocalización a través de la membrana del RE por el canal Sec61.

Luego son anclados a la membrana por una hélice‐α hidrofóbica en medio de la

proteína.

Esta secuencia se denomina de stop o parada de la transferencia que cierra el canal

Sec61, bloqueando toda transferencia de la cadena a través de la membrana con lo que

la porción COO– restante es sintetizada en el citosol. El dominio transmembrana luego

sale del canal y se ubica en la bicapa lipídica.

La inserción de estas proteínas en la membrana requiere de 2 elementos: una secuencia

señal amino terminal clivable que inicia la translocalización a través de la membrana y

una secuencia de transmembrana stop o de parada de la transferencia que ancla la

proteína a la membrana.

Hay también proteínas que no son clivadas por peptidasas señal, que son ancladas por

secuencias señal internas.

Estas secuencias son reconocidas por la PRS y transportadas a la membrana del RE como

se discutió antes.

PROCESAMIENTO Y PLEGAMIENTO EN EL RE

El RE es el sitio de plegamiento de las proteínas, del ensamble de múltiples subunidades,

de la formación de puentes disulfuro, de la adición de gucolípidos a algunas proteínas

de membrana y de los estadios iniciales del proceso de glicosilación.


153

Las proteínas atraviesan las membranas del RE como polipéptidos no plegados mientras

están siendo traducidos.

Los polipéptidos se pliegan en sus conformaciones tridimensionales dentro del RE

asistidos por las chaperonas intraluminales.

Uno de los miembros de la familia de las chaperonas mejor conocida, la Hsp70 es la BiP.

Las proteínas correctamente plegadas se separan de la BiP y son transportadas al

aparato de Golgi mientras que las que han fallado en el proceso de plegamiento

permanecen unidas al BiP y luego son degradadas dentro del RE.

La formación de puentes disulfuro entre las cadenas laterales de residuos del

aminoácido cisteína, es un aspecto importante del plegamiento de proteínas dentro del

RE y es facilitado por la enzima disulfuro‐isomerasa de proteínas, localizada en la luz del

RE.

Las proteínas también son glicosiladas sobre residuos específicos de Asp (N‐glicosilación)

mientras el proceso de traducción está sucediendo

Algunas proteínas son ancladas a la membrana por glucolípidos en lugar de hacerlo a

través de regiones hidrofóbicas de la cadena.

Los glucolípidos de anclaje se denominan glucosidil‐fosfatidil‐inositol (GPI) y son

ensamblados también en la membrana del RE.

EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO LISO Y LA SÍNTESIS DE LÍPIDOS

Además de su rol en el procesamiento de proteínas de secreción y de membrana, el REL

es el principal sitio de síntesis de los lípidos de membrana.

En función de su extremada hidrofobia los lípidos de membrana deben ser sintetizados

en asociación con los de la membrana celular. Posteriormente son trasladados por el RE

a sus destinos finales tanto en vesículas como por proteínas transportadoras.

Las membranas de las células eucariotas están compuestas por 3 tipos de lípidos

• Fosfolípidos (fosfoglicéridos y esfingofosfátidos)

• Glucolípidos


154

• Colesterol

La mayoría de los fosfolípidos, que son los componentes estructurales básicos de las

membranas biológicas, son derivados del glicerol.

Estos son sintetizados en la hojuela citosólica de la membrana del REL, como

precursores.

Los ácidos grasos son primero transferidos desde la coenzima A, que actúa como

transportadora, al glicerol‐3‐fosfato por una enzima unida a la membrana y el fosfolípido

resultante, el ácido fosfatídico es insertado en la membrana.

Las enzimas localizadas en la fase citosólica del RE catalizan, luego la adición de distintos

grupos polares, resultando en la formación de fosfatidil‐colina, fosfatidil‐serina,

fosfatidil‐etanolamina y fosfatidil‐inositol.

Los fosfolípidos siempre se sintetizan en la cara externa (citosólico) del RE, para pasar a

la cara luminal requieren la acción de una enzima llamada flipasa que cataliza el pasaje a

través de la porción polar a través de la capa hidrofóbica.

Además de fosfolípidos el REL es el sitio de síntesis de otros dos lípidos de membrana: el

colesterol y la ceramida.

La ceramida luego puede convertirse, en el aparato de Golgi, en glucolípidos

(galactósidos o cerebrósidos) o esfingomielina (el único fosfolípido no derivado de

glicerol).

El REL es abundante en tipos celulares particularmente activos en el metabolismo de

lípidos. Por ejemplo las hormonas esteroides son sintetizadas en el REL a partir del

colesterol. Además el RE Liso es particularmente abundante en el hígado que contiene

enzimas que metabolizan varios compuestos liposolubles. Estas enzimas son

destoxificantes.

EXPORTACIÓN DE PROTEÍNAS Y LÍPIDOS DESDE EL RE

Tanto las proteínas como los lípidos que viajan por el patrón secretor viajan en vesículas

que brotan de la membrana de una organela y se fusionan luego con la membrana de la


155

siguiente:

RREE →→ CCoommppaarrttiimmiieennttoo IInntteerrmmeeddiioo →→ AAppaarraattoo ddee GGoollggii →→ CCoommppaarrttiimmiieennttooss ddeell GGoollggii →→

→→MMeemmbbrraannaa PPllaassmmááttiiccaa //oo →→ LLiissoossoommaass

La orientación topológica es mantenida en toda la vía.

Las secuencias KDEL (Lis – Asp – Glu – Leu) en el extremo C‐terminal son las secuencias

que permiten la retención de proteínas que son necesarias para su uso en el RE (como

por ejemplo las BiP, la proteína disulfuro isomerasa, etc.)

La secuencia KKXX (lis – Lis – X – X) también promueve la retención de proteínas en el

RE.

Actualmente se piensa que las otras proteínas que deben seguir la vía secretoria

también poseen señales específicas aún no dilucidadas completamente.

EL APARATO DE GOLGI O COMPLEJO DE GOLGI

El aparato de Golgi funciona como una fábrica en la que las proteínas recibidas del RE

son procesadas a sus eventuales destinos: lisosomas, membrana plasmática o

secretadas al exterior de la célula.

La síntesis de glucolípidos y esfingomielina se completa en el Aparato de Golgi.

En plantas, los polisacáridos complejos de la pared celular, también son sintetizados en

el Golgi.

ORGANIZACIÓN DEL GOLGI

Está formado por una serie de sacos aplanados rodeados de membrana (cisternas) y

vesículas asociadas (Fig. 5.2).

Una característica distintiva del aparato de Golgi es su diferente polaridad estructural y

funcional.


156

Las proteínas provenientes del RE entran por su cara cis que posee forma convexa hacia

el núcleo y que está asociada estrechamente al elemento transicional (CIERG) con el RE.

Fig 5.2 Modificado de “The Cell a Molecular Approach”. G. Cooper (2000)

Las proteínas son transportadas por el Golgi y salen por la cara cóncava trans.

Conforme pasan a través del Golgi, las proteínas son clasificadas y modificadas

ordenadamente para ser transportadas a sus destinos dentro de la célula

El procesamiento y la clasificación tienen lugar en diferentes lugares del Golgi.

Se distinguen cuatro regiones funcionales:

• La red cis del aparato de Golgi: sitio de entrada desde el CIERG (ERGIC)

• El apilamiento medial del Golgi

Golgi Cis

Cara Medial Golgi

Cara Trans del Golgi

Apilamiento Trans Golgi

Secreción

Compartimiento intermedio RER-

Golgi


157

• El apilamiento trans del Golgi

• La red trans del Golgi (trans Golgi network)

Las proteínas, los lípidos y los polisacáridos modificados pasan a la red trans que actúa

como centro de clasificación y distribución, dirigiendo el tráfico molecular a los

lisosomas, la membrana plasmática o el exterior celular.

CLASIFICACIÓN Y EXPORTACIÓN DE PROTEÍNAS DESDE EL APARATO DE GOLGI

Las proteínas, así como los lípidos y los polisacáridos son transportados desde el aparato

de Golgi a sus destinos finales a través del patrón secretor.

Esto implica la clasificación en diferentes tipos de vesículas desde la fase trans del Golgi.

Algunas proteínas son transportadas desde el Golgi, a la membrana plasmática por un

patrón secretor constitutivo, que permite la incorporación de nuevos lípidos y proteínas

a la membrana plasmática, así como la secreción continua de proteínas desde la célula.

Otras proteínas son transportadas por un patrón de secreción regulada o son dirigidas a

otros destinos intracelulares como los lisosomas en las células animales o las vacuolas en

levaduras

Las proteínas que poseen una función dentro del aparato de Golgi deben ser retenidas

en esta organela.

En contraste con el RE todas las proteínas retenidas en el Golgi están asociadas a la

membrana y no se las encuetra en el lumen en forma soluble.

Las secuencias de retención de estas proteínas están localizadas en sus dominios de

transmembrana.

La clasificación de proteínas en el patrón secretor regulado parece involucrar el

reconocimiento de parches de señalización compartido por múltiples proteínas que

entran en este patrón.

Las células epiteliales poseen una complicación adicional en el transporte de las

proteínas a la membrana plasmática ya que estas células poseen dos regiones

separadas, el domino apical y el dominio basolateral que contienen proteínas


158

relacionadas con sus funciones particulares.

El patrón constitutivo debe transportar desde la red trans del Golgi, a estos distintos

dominios de la membrana plasmática. Esto lo realizan por el empaquetamiento selectivo

de proteínas en al menos dos tipos de vesículas secretoras constitutivas que dejan la red

trans del Golgi direccionadas hacia las caras apical o basolateral de las células.

LAS CADENAS DE OLIGOSACÁRIDOS SON PROCESADOS EN EL APARATO DE GOLGI

En el retículo endoplasmático se produce un único tipo de oligosacárido N‐ligado a una

gran variedad de proteínas. Estas son luego modificadas en el Aparato de Golgi. Las dos

clases de oligosacáridos N‐ligados son los oligosacáridos ricos en manosa y los

oligosacáridos complejos. Los primeros sólo tienen dos residuos de N‐acetilglucosamina,

que se agregan originalmente en el RE y los residuos manosa presentes en el dolicol

(cadena de lípido que transporta esta secuencia en el RE).

Los oligosacáridos complejos por el contrario poseen más de dos residuos de N‐

acetilglucosamina que son agregados en el AG. También poseen residuos de galactosa,

ácido siálico, y en algunos casos de fucosa.

El ácido siálico es de especial importancia pues es el único que posee carga neta

negativa.

Los oligsacárdos complejos poseen una región denominada core, y una región terminal.

La región core deriva de la región N‐ligada original que contiene los dos residuos de N‐

acetilglucosamina y tres residuos de manosa. La región terminal contiene un número

variable de trímeros de N‐acetilglucosamina – galactosa – ácido síalico (o ácido N‐acetil

neuramínico). Frecuentemente la región terminal está truncada conteniendo sólo N‐

acetilglucosamina y galactosa o aún sólo N‐acetilglucosamina.

Todos los azúcares agregados en la región terminal son agregados en el AG en su fase

trans por una serie de glucosiltransferasas que actuán en una secuencia rígidamente

determinada. Los substratos son azúcares activados por ligamiento a nucleótido

(comúnmente UDP o CDP). La galactosidil transferasa es usualmente usada como

marcador de las vesículas derivadas del Golgi.


159

El procesamiento que genera oligosacáridos sigue un patrón áltamente ordenado.

FIGURA 5‐3 REPRODUCIR ESQUEMA DEL ALBERT.

El que un oligosacárido permanezca como rico en manosa o sea procesado para

transformarse en un polisacárido complejo depende en gran parte de la proteína a la

que está unido. Si el oligosacárido es estéricamente accesible al procesamiento de la

enzima en el AG, entonces es convertido a un oligosacárido complejo, si es inaccesible

permanece como oligosacárido rico en manosa.

Una pregunta que cabe hacerse es ¿Cúal es el propósito biológico de la glicosilasión N‐

ligada? A diferencia de la síntesis de ADN, ARN o proteínas la síntesis de oligsacáridos

requiere una enzima diferente en cada paso, cada producto de reacción es reconcido

por como el substrato de la enzima subsiguiente de la serie. Dado el complicado patrón,

que ha evolucionado para su síntesis, parecería que los oligosacáridos o los glucolípidos

poseerían una importante función pero en su mayoría estas no se conocen.

La N‐glicosilación parece ser excusiva de las células eucariotas y no se conoce en

bacterias.

LOS PROTEOGLICANOS SON ENSAMBLADOS EN EL APARATO DE GOLGI

En el tránsito del RE al aparato de Golgi no sólo se produce el N‐ligamiento sino que

muchas proteínas son modificadas de otra forma.

Algunas proteínas poseen azúcares agregados sobre los residuos treonina o serina a

través de sus cadenas laterales. Estas proteínas se denominan O‐ligadas y para la adición

de los oligosacáridos requieren también de enzimas glicosiltransferasas específicas que

usan azúcres unidos a nucleótidos para agregar un residuo por vez en el lúmen del AG.

Usualmente primero también se agrega N‐acetilglucosamina, seguido de un número

variable de azúcares hasta aproximadamente un número de 10.

Las proteínas más altamente glicosiladas son algunos cores proteoglicanos, que son

modificados en el AG. Esto implica la polimerización de más de una cadena de

glicosaminoglicanos (largas cadenas de unidades repetidas de disacáridos no

ramificados) unidos a los residuos serina de las proteínas a los que primero se les agrega


160

xilosa en lugar de N‐acetilglucosamina. Muchos proteoglicanos se segregan hacia la

matriz extracelular, mientras que otros permanecen anclados a la MP como proteínas

integrales de esta. Adicionalemente, el mucus que es secretado para formar una

cubierta protectora de los epitelios consiste en una mezcla de proteoglicanos y

glicoproteínas.

Los azúcares incorporados en los glicosaminoglicanos son fuertemente sufatados

inmediatamente después que son procesados en el AG. El donante del sulfato es la 3’‐

fosfoadenosina‐5’‐fosfosulfato (PAPs) que es transportada desde el citosol hacia el

lumen del AG.

Otra modificación que se produce en el AG es el agregado de sulfatos a partir de la PAPs

en los residuos tirosina de algunas proteínas. Estas tirosinas sulfatadas se encuentran en

los dominios extracelulares de la MP.

LAS PROTEÍNAS A MENUDO SON PROCESADAS PROTEOLÍTICAMENTE DURANTE LA FORMACIÓN DE VESÍCULAS

SECRETORAS.

Muchas hormonas polipeptídicas y neuropéptidos son sintetizados como precursores

inactivos a partir de los cuales se liberan las moléculas activas por proteólisis.

Este clivage se cree que comienza en la red trans del Golgi y continúa en las vesículas

que lo forman. El procesamiento inicial se realiza por las proteasas unidas a la

membrana que cortan cerca de pares de aminoácidos básicos (Lys‐Lys; Lys‐Arg; Arg‐Lys;

Arg‐Arg) y las reacciones de escisión producen luego el producto final secretado.

En el caso más simple, un polipéptido posee una pro‐pieza amino terminal que es clivada

en el RER. Algunos son algo más que moléculas que contienen péptidos señales, estos se

encuentran como poliproteínas conteniendo múltiples copias de la misma secuencia de

aminoácidos. Finalmente, una variedad de moléculas peptídicas de señalamiento como

parte de una poliproteína que actúa como precursor para múltiples productos finales

que son individualmente clivados de la cadena principal. En este caso, la misma

poliproteína puede ser procesada de varias formas para producir diferentes péptidos en

diferentes tipos celulares, incrementando la diversidad del señalamiento químico entre


161

las células.

¿Por qué este tipo de procesamiento proteolítico demorado se observa para tanta

cantidad de polipéptidos?

Agunos de los péptidos producidos por esta vía, tales como las encefalinas

(neuropéptidos de 5 aminoácidos) son muy cortos para que sus formas maduras sean

eficientemente sintetizadas por los ribosomas, mientras que péptidos más largos,

podrían carecer de las señales necesarias para ser empaquetadas en vesículas. Más aún,

la demora en la producción de una proteína activa hasta que llega a una vesícula

secretoria, tiene la ventaja que previene su actividad en el interior de la célula que la

sintetiza.

LAS CISTERNAS DEL GOLGI ESTÁN ORGANIZADAS COMO UNA SERIE SECUENCIAL DE COMPARTIMIENTOS DE

PROCESAMIENTO

El patrón de procesamiento está altamente organizado en pilas del Golgi. Cada cisterna,

es un compartimiento distinto con su propio conjunto de enzimas de procesamiento, de

tal forma que cada apilamiento forma una unidad de procesamiento multiestado. Las

proteínas son modificadas en estados sucesivos conforme ellas se mueven de un

compartimiento a otro a través del apilamiento.

Las proteínas exportadas del RE ingresan al primer compartimiento del Golgi (el

compartimiento cis del Golgi), luego se mueve al siguiente (el compartimiento medial)

consistente en la cisternas centrales del apilamiento y finalmente se movilizan hacia el

compartimiento trans (consistente de la última cisterna) donde se completa la

glicosilación de las proteínas. Desde el compartimiento trans, las proteínas se movilizan

hacia la red trans del Golgi que es el compartimiento tubular en el que son segregados

en diferentes vesiculas secretoras.

Las diferencias funcionales entre las subdivisiones cis, medial y trans fueron primero

descubiertas por la localización de las enzimas.


162

LISOSOMAS

Son organelas rodeadas de membrana que contienen un arreglo de enzimas capaces de

romper todo tipo de polímeros biológicos (Fig. 5.4).

Pueden consederarse como el “sistema digestivo” de las células animales. Toman tanto

los componentes obsoletos del exterior celular como los del interior mismo.

Se visualizan como vacuolas esféricas densas, pero exhiben considerables variaciones en

forma y tamaño.

Vesículas de secreción

Fosforilación de Oligosacáridos Lisosomales

Remoción de manosa / adición de GlcNAc

Adición de Gal / NANA

Clasificación

Lis

Apilaminto trans

Apilamiento medial

Red trans del Golgi

Apilamiento cis

CIERG

MP


163

Los lisosomas representan organelas morfológicamente diversas, definidas por la

función común de degradar material intracelular.

Fig 5.4 Modificado de “The Cell A Molecular Approach” de Cooper

Hidrolasas ácidas lisosomales

Los lisosomas contienen aproximadamente 50 tipos diferentes de enzimas degradativas

que pueden hidrolizar proteínas, ARN, ADN, polisacáridos y lípidos.

Las mutaciones en los genes que codifican estas enzimas son la causa de más de 30

enfermedades hereditarias humanas. Por ejemplo la patología de Gaucher, es una

enfermedad resultante de una mutación que afecta al gen que codifica una enzima que

hidroliza polisacáridos.

Todas las enzimas lisosomales son hidrolasas ácidas que poseen actividad a ~ pH 5 (Fig

5.5). Este pH previene la digestión de las moléculas orgánicas fuera de los lisosomas ya

que el pH del citosol es aproximadamente 7,2.

Fagolisosomas

Autofagosomas

Retículo Endoplasmatico

Lisosoma

Mitocondria


164

Aún si se rompe la membrana Lisosomal, las hidrolasas ácidas permanecen inactivas

Para mantener el pH ácido en su interior, los lisosomas deben bombear continuamente

protones H+. Esto se realiza mediante una bomba protónica en la membrana lisosomal.

Este bombeo requiere energía a través de la hidrólisis de ATP

Endocitosis y Formación de Lisosomas

Una de las principales funciones de los lisosomas es la digestión de los materiales

capturados del exterior de las células por endocitosis.

Fig 5.5 Modificado de: “The Cell a Molecular Approach”. G. Cooper (2000)

Fagocitosis y Autofagia

Además de la degradación de las moléculas capturadas por endocitosis, los lisosomas

digieren material derivado de otras dos rutas: fagocitosis y autofagia.

En el proceso de fagocitosis se degradan partículas por células especializadas como los

macrófagos.

Los lisosomas también son responsables del intercambio gradual de los componentes

Citosol

Hidrolasas Ácidas

Lisosoma


165

celulares propios.

La autofagia es responsable del recambio gradual de las organelas citoplasmáticas.


166

CAPÍTULO SEXTO:

Bioenergética

Mitocondrias Cloroplastos y Peroxisomas


167

BBIIOOEENNEERRGGÉÉTTIICCAA

La energía puede definirse simplemente como la capacidad para realizar trabajo, lo cual

incluye sintetizar moléculas, mover objetos, y generar calor y luz. Hay dos tipos de

energía: energía cinética y energía potencial. Ambas a su vez pueden presentarse de

muchas formas distintas. La energía cinética o de movimiento incluye la luz (movimiento

de fotones), el calor (movimiento de moléculas), la electricidad (movimiento de

partículas con carga eléctrica). La energía potencial o energía almacenada, incluye la

energía química almacenada en una batería y la de posición almacenada en un

clavadista que está a punto de lanzarse. En las condiciones apropiadas, la energía

cinética se puede transformar en potencial y viceversa.

Para comprender el flujo de energía necesitamos conocer dos cosas: (l) la cantidad de

energía disponible y (2) la utilidad de la energía; ambos temas son descriptos por las

leyes de la termodinámica.

Las leyes de la termodinámica definen las propiedades básicas y el comportamiento de

la energía. La primera ley de la termodinámica establece que si no hay aporte de energía

la cantidad total de energía se mantiene constante. Los procesos ordinarios no pueden

ni crear ni destruir energía, pero si pueden cambiarla de una forma en otra (por ejemplo

energía química en energía térmica). Por esto la primera ley de la termodinámica se

denomina también: ley de la conservación de la energía.

La segunda ley de la termodinámica establece la tendencia universal de los sistemas al

desorden: en el universo o en un sistema aislado (una colección de materia que se aisla

completamente del universo) el grado de desorden solo puede incrementarse. La

cantidad de desorden que usamos para medir este desorden se denomina la entropía de

un sistema: cuanto más grande es la entropía mayor es el desorden.

Las células vivas –para sobrevivir, crecer, y conformar organismos complejos– generan

orden y así aparecen como contradiciendo al segundo principio de la termodinámica. Sin

embargo, como la célula no es un sistema aislado ya que toma energía del ambiente en

forma de alimentos, fotones de luz o como ocurre en algunas bacterias quimiotrofas de

moléculas inorgánicas, y usan esta energía para generar orden dentro de ellas mismas.

En el curso de las reacciones químicas que generan orden, parte de la energía es dispada


168

al ambiente en forma de calor. Este calor desordena el ambiente circundante, de tal

forma que la entropía total – sumando la célula más su ambiente– incrementa como lo

demanda la 2da ley de la termodinámica.

MMIITTOOCCOONNDDRRIIAASS CCLLOORROOPPLLAASSTTOOSS YY PPEERROOXXIISSOOMMAASS

Además de estar involucradas en el transporte y clasificación de proteínas, las organelas

citoplasmáticas proporcionan compartimientos en los cuales tienen lugar una variedad

de actividades metabólicas. La generación de energía metabólica es una de las

actividades principales de las células y son dos las organelas que están específicamente

dedicadas al metabolismo energético y a la producción de ATP. Las mitocondrias son

responsables de la generación de la mayor parte de la energía derivada de la

degradación de carbohidratos y lípidos. Los cloroplastos, por otro lado, usan la energía

capturada de la luz solar para generar tanto ATP como poder reductor para sintetizar

carbohidratos a partir de CO2 y H2O. Una tercera organela, los peroxisomas, contienen

las enzimas involucradas en varias vías metabólicas que incluyen la degradación de

ácidos grasos y el metabolismo de un subproducto de la fotosíntesis.

Las mitocondrias, los cloroplastos y los peroxisomas difieren de las otras organelas no

sólo en sus funciones sino en los mecanismos de ensamble. En lugar de ser sintetizadas

en los ribosomas unidos a membrana, y translocalizadas al RE, las proteínas destinadas a

mitocondrias, cloroplastos y peroxisomas, son sintetizadas sobre ribosomas libres e

importados al interior de las organelas blanco como cadenas polipeptídicas completas.

Las mitocondrias y los cloroplastos contienen su propio genoma, el cual incluye algunos

genes que son transcriptos y traducidos dentro de la organela.

MITOCONDRIAS

Estas organelas juegan un rol crítico en la generación de la energía metabólica en las

células eucariotas (Fig 6.1). Tal como se revisó antes, son las responsables de la

generación de la mayor parte de la energía útil derivada de la degradación de los

carbohidratos y los ácidos grasos, que son convertidos a ATP por el proceso de

fosforilación oxidativa. La mayoría de las proteínas mitocondriales son traducidas en los

ribosomas citosólicos libres e importados hacia la organela por señales de

direccionamiento específicas.


169

Las mitocondrias poseen su propio ADN que codifica ARNts, ARNrs y algunas proteínas

mitocondriales. El ensamble de las mitocondrias involucra proteínas codificadas por su

propio genoma y traducidas dentro de la organela, así como también proteínas

codificadas por el genoma nuclear, e importadas del citosol.

Fig 6.1 Modificado de: “The Cell a Molecular Approach” de G. Cooper (2000)

ORGANIZACIÓN Y FUNCIÓN DE LAS MITOCONDRIAS

Las mitocondrias están rodeadas de un doble sistema de membrana, consistente en una

membrana interna y una externa separadas por un espacio intermembrana. La

membrana interna presenta numerosos pliegues, (crestas) que se extienden al interior

(matriz) de la organela. Cada uno de estos componentes juega un rol funcional diferente

con la matriz y la membrana interna representando los principales compartimientos de

trabajo de las mitocondrias. La matriz contiene el sistema genético de las mitocondrias

así como las enzimas responsables de las reacciones centrales del metabolismo

oxidativo. La degradación oxidativa de la glucosa y de los ácidos grasos son las

principales fuentes de energía metabólica en las células animales. Los estadios iniciales

en el metabolismo de la glucosa (glucólisis) ocurren en el citosol, donde la glucosa es

convertida a piruvato. El piruvato es luego transportado hacia la mitocondria, donde se

produce su oxidación completa formando CO2 y el grueso de la energía utilizable (ATP).

Matriz

Crestas

Espaciointermembrana

MembranaMitochondrial Int.

MembranaMitocondrial Ext.


170

Esto involucra la oxidación inicial de piruvato a acetil‐CoA, que luego es degradada a CO2

vía el ciclo del ácido cítrico. La oxidación de ácidos grasos, también produce acetil‐CoA

que es metabolizado en forma similar en el ciclo del ácido cítrico en las mitocondrias. Las

enzimas del ciclo del ácido cítrico (localizadas en la matriz de las mitocondrias) son

claves en la degradación tanto de los carbohidratos como de los ácidos grasos. La

oxidación de acetil–CoA a CO2 está acoplada a la reducción de NAD+ y FAD a NADH y

FADH2 respectivamente. La mayor parte de la energía derivada del metabolismo

oxidativo es luego producida por el proceso de fosforilación oxidativa el cuál tiene lugar

en la membrana mitocondrial interna. Los electrones de alta energía provenientes del

NADH y FADH2 son transferidos a través de una serie de transportadores en la

membrana a oxígeno molecular. La energía derivada de estas reacciones de

transferencia es convertida a energía potencial almacenada en un gradiente de

protones a través de la membrana que es luego utilizada para conducir la síntesis de

ATP. La membrana mitocondrial interna representa el principal sitio de generación de

ATP y este rol crítico se refleja en su estructura. Primero, su área superficial está

substancialmente incrementada por su plegamiento en crestas. Además, la membrana

mitocondrial interna contiene un inusualmente alto porcentaje de proteínas (superior al

70%) involucradas en el proceso de fosforilación oxidativa, en el transporte de

metabolitos (por ej., piruvato, ácidos grasos) entre el citosol y las mitocondrias. Por otro

lado, la membrana interna es impermeable a la mayoría de los iones y moléculas

pequeñas –una propiedad crítica para mantener el gradiente de protones que conduce a

la fosforilación oxidativa. En contraste con la membrana interna, la externa es

libremente permeable a las moléculas pequeñas. Esto se debe a que esta contiene

proteínas llamadas porinas que forman canales que permiten la libre difusión de

moléculas menores a 6.000 daltons. La composición del espacio intermembrana en

cuanto a iones y moléculas pequeñas, es similar al citosol. La membrana mitocondrial

interna es la verdadera barrera funcional al pasaje de pequeñas moléculas entre el

citosol y la matriz y mantiene el gradiente protónico que conduce la fosforilación

oxidativa.

El Sistema Genético de las Mitocondrias

Las mitocondrias contienen su propio sistema genético, que está separado y es diferente


171

del genoma de la célula. Se piensa que las mitocondrias habrían evolucionado de

bacterias libres, capaces de metabolizar el oxígeno (aerobias). Estas bacterias,

escapando a la digestión, se habrían desarrollado en simbiosis, viviendo en el interior de

células más grandes, presumiblemente anaerobias (endosimbiosis). Así, en esta

asociación mutual, las mitocondrias habrían obtenido proteccion y nutricion de la célula

“predadora” en retorno a la generación de energía que le proveyeron a la célula

hospedadora. Esta hipótesis ha sido recientemente sostenida por los resultados de

análisis de secuencia de ADN que revelan fuertes similitudes entre los genomas de

mitocondrias y de bacterias como Rickettsia prowazekii. Las Rickettsia son parásitos

intracelulares que, como las mitocondrias, sólo son capaces de reproducirse dentro de

células eucariotas. Consistente con sus tipos de vida simbiótica, las secuencias de ADN

de mitocondrias y Rickettsia sugieren que comparten ancestros comunes, de los cuales

habría evolucionado el sistema genético de las mitocondrias de nuestros días. Los

genomas mitocondriales usualmente son moléculas circulares de ADN, similares a los de

las bacterias, las cuales están presentes en múltiples copias por organela. Los genomas

varían considerablemente en tamaño entre las distintas especies. Los de las

mitocondrias humanas y de otros animales poseen sólo 16 Kb, pero, genomas

mitocondriales substancialmente mayores, se encuentran en levaduras

(aproximadamente 80 kb) o en plantas (más de 200kb). Sin embargo estos genomas

mitocondriales grandes, están compuestos predominantemente de secuencias no

codificantes y no parecen contener más información genética significativa. Por ejemplo,

el genoma mitocondrial de secuencia más larga, es el de Arabidopsis thaliana. Sin

embargo, el ADN mitocondrial de Arabidopsis de alrededor de 367 Kb codifica sólo 32

proteínas, aproximadamente dos veces el número codificado por el ADN mitocondrial

humano. El mayor número de genes mitocondriales ha sido encontrado en el protozoo

Reclinomonas americana el cual es de 69 kb y contiene 97 genes. El genoma

mitocondrial de Reclinomonas recuerda más estrechamente al genoma de las bacterias

de las cuales las mitocondrias habrían evolucionado, que al genoma de las mitocondrias

actuales las que sólo codifican un pequeño número de proteínas que son componentes

esenciales del sistema de fosforilación oxidativa. El genoma mitocondrial codifica

también todos los ARNs ribosomales y la mayoría de los ARN de transferencia necesarios


172

para la traducción de estas secuencias codificantes de proteínas dentro de las

mitocondrias. Otras proteínas mitocondriales son codificadas por los genes del núcleo,

los cuales se piensa que han sido transferidos al núcleo desde el genoma mitocondrial

ancestral.

El genoma mitocondrial humano codifica 13 proteínas involucradas en el transporte de

electrones y la fosforilación oxidativa. También codifica los ARNrs 16S y 12S y 22 tipos de

ARNts requeridos para la traducción de las proteínas requeridas por la organela. Los

ribosomas mitocondriales de animales y levaduras sólo contienen dos tipos de ARNrs, en

contraste con los tres componentes de los ribosomas de las bacterias (23S, 16S y 5S). El

ADN mitocondrial de vegetales también codifica un tercer ARNr de 5S. Las mitocondrias

de plantas y protozoos también difieren en el hecho de utilizar tanto ARNts codificados

por el genoma nuclear, como por el de la organela, mientras que las mitocondrias

animales sólo usan ARNts codificados por el genoma mitocondrial.

El pequeño número de ARNts codificados por el genoma mitocondrial resalta una

característica del sistema genético mitocondrial –el uso de un código genético

ligeramente diferente, del usado por las células procariotas y eucariotas.

Tabla 1. Diferencias entre el código genético universal y el código genético de mitocondrias.

Codón Código Universal Código mitocondrial humano

UGA AGA AGG AUA

Stop Arg Arg Ile

Trp Stop Stop Met

En plantas y levaduras hay otros codones que varían en relación al código universal.

Muchos ARNts tanto en células procariotas como eucariotas son capaces de reconocer

más de un codón en el ARNm en función del “wobble” que permite algún error de

apareamiento entre el ARNt y la tercera posición de ciertos codones complementarios.

Sin embargo, se requieren al menos 30 ARNts diferentes para traducir el código

universal de acuerdo a las reglas wobble. Aún el ADN mitocondrial humano codifica sólo

22 ARNts, y estos son los únicos ARNts usados para la traducción de los ARNm

mitocondriales. Esto se realiza por una forma de “wobble” extrema en la que los

nucleótidos que contenienen U en el anticodón del ARNt, pueden aparearse con


173

cualquiera de las cuatro bases en la posición del ARNm permitiendo que cuatro codones

sean reconocidos por un único ARNt. Adicionalmente, algunos codones especifican

diferentes aminoácidos en mitocondrias que en el código universal (tabla 1).

Como el ADN nuclear, el mitocondrial puede ser alterado por mutaciones, las cuales son

frecuentemente letales para la organela. Ya que casi todas las mitocondrias de los

óvulos fecundados provienen de los ovocitos, más que del esperma, las mutaciones del

ADN mitocondrial son transmitidas a la siguiente generación por vía materna. Tales

mutaciones se han asociado con numerosas enfermedades. Por ejemplo la neuropatía

óptica de Leber, una enfermedad que lleva la ceguera puede ser causada por

mutaciones en los genes mitocondriales que codifican componentes de la cadena de

electrones. Adicionalmente la acumulación de mutaciones mitocondriales durante la

vida de los individuos ha sido sugerida como uno de los contribuyentes al proceso de

envejecimiento.

Importación y Ensamble de Proteínas en las Mitocondrias

En contraste a los componentes del ARN, (ARNrs y ARNts), la mayoría de los genomas

mitocondriales no codifican las proteínas requeridas para la replicación, transcripción y

traducción mitocondrial. En su lugar, los genes que codifican las proteínas requeridas

para la replicación y expresión están en el genoma nuclear de la célula. Adicionalmente,

el núcleo contiene la mayoría de las proteínas mitocondriales requeridas para la

fosforilación oxidativa y todas las mitocondrias involucradas en el metabolismo

mitocondrial (por ejemplo las enzimas del ciclo del ácido cítrico). Las proteínas

codificadas por estos genes (más del 95% de las proteínas mitocondriales) son

sintetizadas en ribosomas citosólicos libres e importados hacia las mitocondrias

conforme completan cadenas polipeptídicas. Debido a la doble membrana de las

mitocondrias, la importación de las proteínas es considerablemente más complepleja

que la transferencia de un polipéptido a través de una bicapa fosfolipídica simple como

ocurre en el RER. Las proteínas que son direccionadas hacia la matriz deben cruzar las

membranas mitocondriales interna y externa, mientras que otras proteínas deben ser

clasificadas a distintos compartimientos dentro de la organela (por ejemplo, el espacio

intermembrana).


174

La importación de proteínas cuyo destino es la matriz mitocondrial es el aspecto mejor

comprendido de la clasificación de proteínas mitocondriales. La mayoría de las proteínas

son direccionadas hacia la mitocondria por secuencias amino‐terminales de 20 a 35

aminoácidos llamadas presecuencias, que son removidas por clivaje proteolítico

después de ser importadas hacia la organela. Las presecuencias de las proteínas

mitocondriales contienen múltiples residuos de aminoácidos básicos cargados

positivamente que usualmente se presentan como una hélice alfa anfipática. El primer

paso en la importación de las proteínas es la unión de estas presecuencias a un receptor

sobre la superficie de la mitocondria. Las cadenas polipeptídicas son luego insertadas

hacia un complejo proteico que dirige la translocalización a través de la membrana

externa (la translocasa de la membrana externa o complejo TOM, del inglés “Translocase

Outer Membrane complex”). Las proteínas son luego transferidas a un segundo

complejo en la membrana interna, (la translocasa de la membrana interna o complejo

TIM: del inglés Translocase Inner Membrane complex). La continuidad de la

translocalización de las proteínas requiere que se establezca el gradiente de potencial

electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna, lo que como veremos, se

produce durante el transporte de electrones. Como se verá en la siguiente sección, la

transferencia de electrones de alta energía desde el NADH y FADH2 al oxígeno molecular

está acoplada a la transferencia de protones desde la matriz al espacio intermembrana.

Como los protones son partículas cargadas, esta transferencia establece un potencial

eléctrico a través de la membrana interna, quedando la matriz con carga negativa.

Debido a que los protones son partículas cargadas, esta transferencia establece un

potencial eléctrico a través de la membrana interna, el cuál conduce la translocalización

de las presecuencias positivamente cargadas.

Para ser translocalizadas a través de la membrana, las proteínas deben permanecer, al

menos parcialmente, sin plegarse. Consecuentemente, la importación de proteínas hacia

las mitocondrias requiere la presencia de chaperonas moleculares además de las

proteínas de la membrana involucradas en la translocalización. En el lado citosólico, los

miembros de la familia de las chaperonas Hsp70 mantienen a las proteínas en estado

parcialmente desplegado de tal manera que pueden ser insertadas en la membrana


175

mitocondrial. Conforme cruzan la membrana, el polipéptido sin plegarse se une a otro

miembro de la familia de las chaperonas Hsp70 que se asocia con el complejo Tim y

actúa como motor que conduce la importación de proteínas. El polipéptido es luego

transferido a una chaperona de la familia de las Hsp60 (una chaperonina) dentro de la

cuál tiene lugar el plegamiento de las proteínas. Ya que estas interacciones de las

cadenas polipeptídicas con las chaperonas moleculares requieren ATP, la importación de

proteínas requiere de ATP tanto del lado interno como externo de la membrana;

además del potencial eléctrico a través de la membrana interna.

Como se indicó antes, algunas proteínas mitocondriales son direccionadas a las

membranas mitocondriales externa, interna, o al espacio intermembrana en lugar de la

matriz por lo que requieren de un mecanismo adicional para direccionar estas proteínas

al compartimiento submitocondrial correcto. Estas proteínas son direccionadas a sus

destinos por una segunda señal de direccionamiento. Las proteínas cuyos destinos son

las membranas mitocondriales parecen estar mediadas por secuencias de parada de la

transferencia que detienen la translocalización de la cadena polipeptídica a través de los

complejos Tim o Tom, conduciendo su inserción hacia la membrana externa o interna

respectivamente. Las proteínas pueden ser direccionadas al espacio intermembrana por

varios mecanismos diferentes. Algunas proteínas son transferidas a través de la

membrana externa a través del complejo Tom pero son luego liberadas dentro del

espacio intermembrana en lugar de ser transferidas al complejo Tim. Otras proteínas

son transferidas al complejo Tim pero luego son liberadas hacia el espacio

intermembrana como resultado del clivaje de secuencias de parada hidrofóbicas. Aún

puede ocurrir que otras proteínas puedan ser completamente importadas hacia la

matriz mitocondrial y luego retro‐exportadas a través de la membrana interna hacia el

espacio intermembrana.

No sólo las proteínas sino los fosfolípidos de las membranas mitocondriales son

importadas del citosol. En células animales, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilcolina

son sintetizadas en el REL y transportadas a las mitocondrias por proteínas

transportadoras de fosfolípidos que extraen moléculas de fosfolípidos simples de la

membrana del RE. Los lípidos pueden ser luego transportados a través del ambiente


176

acuoso del citosol, encerradas en sitio de unión hidrofóbico de la proteína, y liberados

cuando el complejo arriba a una nueva membrana como la de las mitocondrias,

directamente en alguna de las hojuelas de la bicapa fosfolipídica. Las mitocondrias luego

sintetizan fosfatidilserina, a partir de la fosfatidiletanolamina, además de catalizar la

síntesis de un fosfolípido inusual, la cardiolipina que contiene cuatro cadenas de ácidos

grasos.

El mecanismo de la Fosforilación Oxidativa

La mayor parte de la energía utilizable, obtenida de la degradación de los hidratos de

carbono, es derivada de la fosforilación oxidativa que tiene lugar dentro de las

mitocondrias. Por ejemplo, la degradación de la glucosa por glucólisis y el ciclo del ácido

cítrico producen un total de 4 (cuatro) moléculas de ATP, 10 (diez) moléculas de NADH y

2 (dos) moléculas de FADH2. Los electrones del NADH y FADH2 son luego transferidos a

oxígeno molecular acoplados a la formación de 32 a 34 moléculas de ATP por

fosforilación oxidativa. El transporte de electrones y la fosforilación oxidativa son

actividades críticas de una serie de complejos proteicos en la membrana mitocondrial

interna, que finalmente actúan como las principales fuentes de energía.

Cadena transportadora de electrones

Durante la fosforilación oxidativa los electrones derivados del NADH y del FADH2

combinados con O2, y la energía liberada de estas reacciones de oxidación–reducción es

usada para conducir la síntesis de ATP a partir de ADP. La transferencia de electrones

desde NADH a O2 es una reacción productora de mucha energía, con un ∆G°´= –52.5

kcal / mol por cada par de electrones transferidos. Para ser cosechada como energía

utilizable, esta energía debe ser producida gradualmente, por el pasaje de electrones a

través de una serie de transportadores, la cual constituye la cadena transportadora de

electrones. Estos transportadores están organizados en cuatro complejos en la

membrana mitocondrial interna. Un quinto complejo de proteínas actúa acoplando las

reacciones productoras de energía del transporte de electrones a síntesis de ATP.

Los electrones del NADH entran a la cadena transportadora de electrones en el complejo

I el cuál consiste en aproximadamente 40 cadenas polipeptídicas. Estos electrones son


177

inicialmente transferidos desde NADH al flavin mononucleótido y luego, a través de un

transportador que contiene sulfuro de hierro a la coenzima Q –un proceso productor de

energía con un ∆G°´= –16.6 kcal/mol. La coenzima Q (también llamada ubiquinona) es

una pequeña molécula liposoluble que transporta electrones desde el complejo I a

través de la membrana al complejo III, que consiste en alrededor de 10 polipéptidos. En

el complejo III, los electrones son transferidos desde el citocromo b al citocromo c, –una

reacción con un rendimiento energético con un ∆G°´= –10,0 kcal/mol. El citocromo c,

una proteína periférica de membrana unida a la cara externa de la membrana interna,

luego transporta los electrones al complejo IV (citocromo oxidasa), donde son

finalmente transferidos al O2 (∆G°´= –25,8 kcal/mol).

Un complejo de proteínas diferente, (el complejo II), que consiste de cuatro polipéptidos

recibe los electrones del intermediario del ciclo del ácido cítrico, succinato. Estos

electrones son transferidos del FADH2 (en lugar del NADH), y luego a la coenzima Q.

Desde la coenzima Q, los electrones son transferidos al complejo III y luego al complejo

IV como ya se ha descripto. En contraste con la transferencia electrones desde el NADH

a la coenzima Q del complejo I, la transferencia de electrones desde FADH2 a la

coenzima Q no está asociada con una disminución significativa en la energía libre, esta

disminución es importante sólo entre los complejos III y IV.

La energía libre derivada desde el pasaje de electrones a través de los complejos I, III y IV

es cosechada por estar acoplada a la síntesis de ATP.

Un hecho importante, es que el mecanismo por el cuál la energía derivada de estas

reacciones de transporte de electrones está acoplada a la síntesis de ATP es

fundamentalmente diferente de la síntesis de ATP durante la glucólisis o el ciclo del

ácido cítrico. En el último caso, un fosfato de alta energía es transferido directamente.

Acoplamiento quimiosmótico

El mecanismo de acoplamiento del transporte de e– a la generación de ATP: el

acoplamiento quimiosmótico es un ejemplo de la ajustada relación entre estructura y

función en biología celular.


178

La hipótesis del acoplamiento quimiosmótico fue propuesta por P. Mitchell en 1.961

quién sugirió que el ATP se genera por el uso de la energía almacenada en forma de

gradiente protónico a través de las membranas biológicas, más que por transferencia

química de grupos de alta energía.

Esta hipótesis no fue compartida en su momento y debió transcurrir una década para ser

aceptada por la comunidad científica en general.

El transporte de e– a través de los complejos I, III y IV está acoplado al transporte de

protones desde la matriz de la mitocondrias al espacio intermembrana. Así, las

reacciones productoras de energía del transporte de electrones están acopladas a la

transferencia de protones desde la matriz al espacio intermembrana. Los complejos I y

IV parecen actuar como bomba de protones que transportan protones a través de la

membrana como resultado de cambios conformacionales inducidos por el transporte de

electrones. En el complejo III los protones son transferidos a través de la membrana por

la acción de la coenzima Q que transporta electrones desde la matriz hacia el espacio

intermembrana en el complejo III. Los complejos I y III transfieren cada uno 4 protones a

través de la membrana por cada par de electrones. En el complejo IV, se bombean dos

protones por cada par de electrones bombeados a través de la membrana y otro par de

protones combinando con O2 y para formar H2O dentro de la matriz. Así, el equivalente

de cuatro protones por par de electrones es transportado fuera de la matriz

mitocondrial en cada uno de estos 3 complejos. Esta transferencia de protones desde la

matriz hacia el espacio intermembrana juega un rol crítico en la conversión de la energía

derivada de las reacciones de oxidación–reducción a la energía potencial del transporte

de electrones almacenada en un gradiente de protones.

Debido a que los protones son partículas cargadas, la energía potencial almacenada en

el gradiente protónico es tanto de naturaleza química como eléctrica, corresponde a la

diferencia de voltaje a través de la membrana mitocondrial interna, dentro de la matriz

de la mitocondria es negativa y el espacio intermembrana es positivo.

La correspondiente energía libre (ΔG) está dada por la ecuación:


179

ΔG = –F. ΔVn

Donde:

F: constante de Faraday y

ΔV: potencial de membrana

La energía libre adicional correspondiente a la diferencia en la [H+] está dada por la

ecuación.

ΔG = RT. ln [H+]i / [H+]0xx

Donde: [H+]i concentración dentro de las mitocondrias [H+]0: fuera de las mitocondrias.

En células metabólicamente activas, los protones son bombeados fuera de la matriz, de

tal manera que el gradiente de protones es cerca de una unidad de pH o una

concentración diez veces menor. El pH de la matriz mitocondrial es cercano a 8 (básico)

comparado con el pH neutral (~7) del espacio intermembrana y del citosol.

Este gradiente genera un potencial eléctrico de cerca de 0,14V a través de la membrana

con la matriz negativa. Tanto el gradiente de pH como el potencial eléctrico conducen

los protones de regreso a la matriz, desde el citosol, combinándose para formar un

gradiente electroquímico a través de la membrana mitocondrial interna,

correspondiendo a un ΔG ~ –5 kcal / mol por cada protón. Debido a que la bicapa

fosfolipídica es impermeable a los iones, los protones son capaces de atravesar la

membrana sólo a través de un canal proteico. Esta restricción permite cosechar la

energía del gradiente electroquímico y convertirla en ATP como resultado de la acción

del complejo V o ATP sintetasa. Ésta está organizada en 2 componentes

estructuralmente diferentes: F0 y F1 ligados por un tallo delgado. La porción F0 atraviesa

la membrana interna y provee el canal a través del cual fluyen los protones. En

particular, el flujo de electrones a través de F0 conduce la rotación de F1, el que como un

motor rotativo, conduce la síntesis de ATP.

Parece que el flujo de cuatro protones que regresan a través de F0 son necesarios para

conducir la síntesis de una molécula de ATP por F1, consistente con la transferencia de al


180

complejo I, III y IV cada una contribuyendo con suficiente energía libre al gradiente de

protones para conducir la síntesis de una molécula de ATP. La oxidación de una molécula

de NADH lleva así a la síntesis de tres moléculas de ATP, mientras que la oxidación de

FADH2, que ingresa a la cadena transportadora de electrones al complejo II, produciendo

sólo dos moléculas de ATP.

Cloroplastos y otros Plástidos

Los cloroplastos, las organelas responsables de la fotosíntesis, son en muchos aspectos

similares a las mitocondrias. Ambas organelas tienen como función la generación de

energía metabólica, habrían evolucionado por endosimbiosis, contienen su propio

sistema genético y se replican por división. Sin embargo, los cloroplastos son mayores y

más complejos que las mitocondrias, y realizan varias tareas críticas además de generar

ATP. Los cloroplastos son los responsables de la conversión fotosintética de CO2 a

carbohidratos. Adicionalmente, los cloroplastos sintetizan aminoácidos, ácidos grasos y

los componentes lipídicos de su propia membrana. La reducción de nitrito (NO2–) a

amonio (NH3+), un paso esencial en la incorporación de nitrógeno en los componentes

orgánicos, ocurre en los cloroplastos. Los cloroplastos son sólo un tipo de varias

organelas relacionadas (Plástidos) que juegan una variedad de papeles en las células

vegetales.

La Estructura y Función de los Cloroplastos

Los cloroplastos vegetales son organelas grandes (5 a 10 μm de longitud) que como las

mitocondrias están limitadas por una doble membrana llamada la cubierta cloroplástica.

Además de las membranas interna y externa de la cubierta, los cloroplastos poseen un

tercer sistema de membranas internas llamado la membrana tilacoides. Esta última,

forma una red de discos aplanados denominados tilacoides que frecuentemente se

arreglan formando pilas que se llaman grana. Debido a esta estructura de membrana

triple, la estructura interna de los cloroplastos es más compleja que la de las de

mitocondrias. En particular sus tres membranas dividen al cloroplasto en tres

compartimientos internos: (1) el espacio intermembranoso entre las dos membranas de

la cubierta del cloroplasto, (2) el estroma, el cual está por dentro de la cubierta y por

fuera de la membrana tilacoides; (3) el lumen del tilacoides.


181

A pesar de la mayor complejidad estructural, la membrana del cloroplasto tiene claras

similitudes funcionales con la de las mitocondrias –como es de esperar dado el rol de

ambas organelas, en la generación quimioosmótica de ATP. La membrana externa de la

cubierta del cloroplasto contiene porinas y es libremente permeable a pequeñas

moléculas. En contraste, la membrana interna es impermeable a iones y metabolitos

que pueden penetrar al cloroplasto sólo por medio de transportadores específicos de

membrana. Estas propiedades de las membranas interna y externa de la cubierta del

cloroplasto son similares a las membranas interna y externa de las mitocondrias. El

estroma del cloroplasto es también equivalente a la matriz mitocondrial, contiene el

sistema genético de los cloroplastos y una variedad de enzimas metabólicas, incluyendo

las responsables de la conversión de CO2 a carbohidratos durante la fotosíntesis.

La mayor diferencia entre cloroplastos y mitocondrias en términos de estructura y

función, es la membrana tilacoides. Esta membrana es de importancia central en

cloroplastos donde actúa como la membrana mitocondrial interna en el transporte de

electrones y en la generación quimiosmótica de ATP. La membrana interna de los

cloroplastos que no está plegada formando crestas como en las mitocondrias, no actúa

en la fotosíntesis. El sistema de transporte de electrones de los cloroplastos está

localizado en la membrana tilacoidal, y los electrones son bombeados a través de esta

membrana desde el estroma al lumen del tilacoides. El gradiente electroquímico

resultante conduce la síntesis de ATP conforme los protones cruzan hacia el estroma. En

función de este rol en la generación de energía metabólica, la membrana tilacoides de

los cloroplastos es equivalente a la membrana interna de las mitocondrias.

El Genoma de los Cloroplastos

Como las mitocondrias, los cloroplastos poseen su propio sistema genético, reflejando

sus orígenes evolutivos a partir de bacterias fotosintéticas. El genoma de los cloroplastos

es similar al de las mitocondrias en que consiste de moléculas circulares de ADN,

presentes en múltiples copias por organela. Sin embargo, los genomas de los

cloroplastos son mas grandes y más complejos que los de las mitocondrias, con un rango

que va desde los 120 a 160 kb y conteniendo aproximadamente 120 genes.

Tabla 6.2: Genes codificados por el ADN del Cloroplasto


182

Función N° de genes Genes para el aparato genético ARNrs (23S; 16S; 5S; 4,5S) ARNts Proteínas ribosomales Subunidades de la ARN polimerasa Genes para la Fotosíntesis Fotosistema I Fotosistema II Complejo Citocromo bf ATP sintetasa Ribulosa bifosfato carboxilasa

4

30 21 4 5

12 4 6 1

Los análisis de secuencia indican que los genomas de los cloroplastos contienen cerca de 30 genes además de los listados aquí. Algunos de estos genes codifican proteínas involucradas en la respiración pero la mayoría aún deben ser identificadas

Los genomas de los cloroplastos de varias plantas, han sido completamente

secuenciados llevando a la identificación de muchos de los genes contenidos en el ADN

de la organela. Estos genes de los cloroplastos codifican tanto ARNs como proteínas

involucrados en la expresión génica como así también una variedad de proteínas que

actúan en la fotosíntesis. Tanto los ARNs ribosomales como los de transferencia usados

en la traducción de los ARNms de los cloroplastos son codificados por el genoma de la

organela. Estos incluyen cuatro ARNrs: 23S, 16S, 5S y 4,5S y 30 especies de ARNts. En

contraste con el menor número de ARNts codificado por el genoma mitocondrial, los

ARNts de los cloroplastos son suficientes para traducir todos los codones del ARNm de

acuerdo al código genético universal. Además de estos ARNs componentes del sistema

de traducción, el genoma de los cloroplastos codifica aproximadamente 20 proteínas de

los ribosomas de los cloroplastos, las que representan aproximadamente 1/3 de las

proteínas de los ribosomas de los cloroplastos. Algunas de las subunidades de las ARN

polimerasas son también codificadas por los cloroplastos, aunque se necesitan algunas

subunidades de la ARN polimerasa y otros factores que son codificados por el genoma

nuclear.

El genoma de los cloroplastos también codifica aproximadamente 30 proteínas que

están involucradas en el proceso de la fotosíntesis incluyendo componentes de los

fotosistemas I y II, del complejo de citocromos bf y de la ATP sintetasa. Además, una de

las subunidades de la ribulosa carboxilasa bifosfato (rubisco) es codificada por el ADN

de los cloroplastos. Esta enzima es crítica ya que cataliza la adición de CO2 a la ribulosa


183

1,5‐bifosfato durante el ciclo de Calvin. No sólo es el principal componente del estroma

mitocondrial sino que se cree que es la proteína más abundante sobre la tierra.

Importación y Clasificación de las Proteínas de los Cloroplastos

Aunque los cloroplastos codifican una mayor proporción de sus propias proteínas que

las mitocondrias, cerca del 90% de las proteínas de los cloroplastos son codificadas por

los genes nucleares. Como ocurre con las mitocondrias, estas proteínas son sintetizas en

los ribosomas citosólicos y luego son importadas hacia los cloroplastos conforme se

completan las cadenas polipeptídicas. Estas deben ser luego clasificadas hacia sus

localizaciones apropiadas dentro de los cloroplastos –una tarea aún más compleja que

en las mitocondrias ya que los cloroplastos poseen tres sistemas de membrana que los

dividen en tres compartimientos internos diferentes.

La importación de proteínas hacia los cloroplastos generalmente recuerda la

importación de las proteínas mitocondriales. Las proteínas son direccionadas para ser

importadas hacia los cloroplastos por secuencias N‐terminales de 30 a 100 aminoácidos

denominados péptidos de tránsito, los cuales direccionan la translocalización de las

proteínas a través de las dos membranas de las cubiertas de los cloroplastos y luego son

removidos por clivaje proteolítico. Los péptidos de tránsito son reconocidos por los

complejos de translocalización de la membrana cloroplástica externa (el complejo Toc),

y las proteínas son transportadas a través de este complejo cruzando la membrana.

Estas son transferidas a los complejos de translocalización de la membrana interna (el

complejo Tic) y transportadas a través de la membrana interna hacia el estroma. Como

ocurre con las mitocondrias, se requieren chaperonas moleculares tanto sobre el lado

estromal como sobre el citosólico de la cubierta para la importación de las proteínas, las

que requieren energía en forma de ATP. En contraste con las pre‐secuencias de la

importación mitocondrial, los péptidos de tránsito no están cargados positivamente y el

transporte de las cadenas polipeptídicas no requiere un potencial eléctrico a través de la

membrana.

Las proteínas que van a ser direccionadas hacia el lumen del tilacoide, son

transportadas hacia sus destinos en dos pasos. Primero son importadas hacia el estroma

como se ha descripto y luego son direccionadas por una segunda secuencia señal


184

hidrofóbica, que es expuesta luego del clivaje del péptido de tránsito. La secuencia señal

hidrofóbica dirige la translocalización de los polipéptidos a través de los tilacoides y

luego es removida por un segundo clivaje proteolítico dentro del lumen. La vía de

clasificación de las proteínas a los otros cuatro destinos –las membranas externa e

interna, la membrana mitocondrial y el espacio intermembrana– no están claramente

establecidos. Como en las mitocondrias, las proteínas parecen ser insertadas

directamente hacia la membrana externa de la cubierta del cloroplasto. En contraste, las

proteínas destinadas tanto a la membrana tilacoidal como a la membrana interna de los

cloroplastos son inicialmente direccionadas importándolas hacia el estroma por

péptidos de tránsito N‐terminales. A continuación del clivaje de los péptidos de tránsito,

estas proteínas son direccionadas para su inserción en la membrana apropiada por otras

secuencias, que aún no han sido bien caracterizadas. Finalmente ni las secuencias que

direccionan las proteínas al espacio intermembrana, ni las vías por las que viajan a

aquellos destinos han sido identificados.

Otros Plástidos

Los cloroplastos son sólo uno, aunque el más importante miembro de una gran familia

de organelas vegetales llamadas plástidos. Todos los plástidos contienen el mismo

genoma que los cloroplastos, aunque difieren en estructura y función. Los cloroplastos,

están especializados en la fotosíntesis y son los únicos que poseen un sistema de

membranas tilacoides. Otros plástidos que están involucrados en diferentes aspectos del

metabolismo de vegetales están rodeados por las dos membranas de la cubierta

plastidial pero carecen de la membrana tilacoidal y de otros componentes del aparato

fotosintético.

Los diferentes tipos de plástidos son clasificados frecuentemente de acuerdo al tipo de

pigmento que contienen. Los cromoplastos contienen carotenoides que son

responsables de los colores amarillos, rojos, anaranjados de algunas flores y frutas,

aunque su función en el metabolismo celular no es clara. Los leucoplastos son plástidos

no pigmentados, que almacenan una gran variedad de fuentes de energía en tejidos

vegetales no fotosintéticos. Los amiloplastos y los elaioplastos son ejemplos de

leucoplastos que almacenan almidón y lípidos respectivamente.


185

Todos los plástidos incluyendo los cloroplastos se desarrollan a partir de los proplástidos

(0,5 a 1 μm de diámetro), organelas indiferenciadas presentes en las células que se

dividen activamente de raíces y meristemos. Los proplástidos se diferencian en los

diferentes tipos de plástidos maduros de acuerdo a las necesidades de las células

diferenciadas. Adicionalmente, los plástidos maduros son capaces de cambiar de un tipo

a otro. Los cromoplastos se desarrollan a partir de los cloroplastos, durante la

maduración de flores y frutos (por ej., tomates). Durante este proceso, la clorofila y los

tilacoides se degradan mientras se sintetizan nuevos tipos de carotenoides.

Una característica interesante de los plástidos es que su desarrollo es controlado por

señales ambientales y por un programa intrínseco de diferenciación celular. En las

células fotosintéticas de las hojas, por ejemplo, los proplástidos se desarrollan en

cloroplastos. Durante este proceso, la membrana tilacoidal está formada por vesículas

que brotan de la membrana interna de la cubierta del cloroplasto y varios de los

componentes del aparato fotosintético son sintetizados y ensamblados. Sin embargo,

los cloroplastos se diferencian sólo en presencia de luz. Si las plantas se mantienen en la

oscuridad, el desarrollo de los proplastidios en las hojas es arrestado en un estado

intermedio (llamado etioplastos), en el cual se forma un arreglo semicristalino de

membranas tubulares internas en el que no se ha sintetizado la clorofila. Si las plantas

que crecen en la oscuridad son luego expuestas a la luz los etioplastos continúan su

desarrollo a cloroplastos. Es notable que este control dual del desarrollo de los plástidos

involucra tanto la expresión coordinada de los genes dentro de los plástidos como los

del genoma nuclear. El mecanismo responsable de tal expresión génica es desconocido,

y su dilucidación representa un problema desafiante en la biología molecular de

vegetales.

Fotosíntesis

Durante la fotosíntesis, la energía proveniente de la luz solar es colectada para conducir

la síntesis de glucosa a partir de CO2 y H2O. Por convertir la energía solar en una forma

utilizable de energía química, la fotosíntesis es la fuente final de energía metabólica para

todos los sistemas biológicos. La fotosíntesis tiene lugar en dos estados diferentes. En las

reacciones de luz, la energía de la luz solar conduce a la síntesis de ATP y NADPH,


186

acoplada a la formación de O2 a partir de H2O. En las reacciones de oscuridad, llamadas

así por no requerir luz, el ATP y el NADPH producidos durante las reacciones de luz

llevan adelante la síntesis de glucosa. En las células eucariotas, tanto las reacciones de la

fase lumínica como las reacciones oscuras de la fotosíntesis ocurren dentro de los

cloroplastos –las reacciones lumínicas en la membrana del tilacoide, y las reacciones

oscuras dentro del estroma. Ver la reacción oscura más abajo.

El Flujo de Electrones a Través de los Fotosistemas I y II

La luz solar es absorbida por los pigmentos fotosintéticos, el más abundante de los

cuales es la clorofila. La absorción de la luz excita un electrón, llevándolo a un estado

mayor de energía, convirtiendo así la energía solar en energía química potencial. Los

pigmentos fotosintéticos, están organizados en fotocentros en la membrana del

tilacoide, cada uno de los cuales contiene cientos de moléculas de pigmentos. Las

numerosas moléculas de pigmentos de cada fotocentro actúan como una antena que

absorbe luz y transfiere la energía a una molécula de clorofila que actúa como un centro

de reacción. La clorofila del centro de reacción luego transfiere su electrón de alta

energía a una molécula aceptora en una cadena transportadora de electrones. Los

electrones de alta energía son luego transferidos a través de una serie de

transportadores de membrana acoplados a la síntesis de ATP y NADPH.

El centro de reacción fotosintética mejor caracterizado es el de la bacteria

Rhodopseudomonas viridis, la estructura de los cuales fue determinada en 1985 por

Deisenhofer J., Michel H., Hubert R., y sus colegas. El centro de reacción consiste de tres

polipéptidos de transmembrana, unidos a un citocromo tipo c sobre el lado exterior de

la membrana.

La energía de la luz solar es capturada por un par de moléculas de clorofila conocidas

como el par especial. Los electrones son luego transferidos desde el par especial a otro

par de clorofilas y desde aquí a otros grupos prostéticos (feofitinas y quinonas). Desde

aquí los electrones son transferidos al complejo del citocromo bc en el cuál el transporte

de electrones se acopla a la generación de un gradiente de protones. Los electrones son

luego transferidos al centro de reacción citocromo y de allí finalmente retornados al par

especial de la clorofila. El centro de reacción convierte así la energía de la luz solar a


187

electrones de alta energía, la energía potencial de los cuales es convertida a un

gradiente protónico por el complejo citocromo bc.

Las proteínas involucradas en la reacciones de luz de la fotosíntesis en plantas están

organizadas en cinco complejos en la membrana del tilacoides. Dos de estos complejos

son fotosistemas (fotosistemas I y II), en los cuales la luz es absorbida y transferida a los

centros de reacción de la clorofila. Los electrones de alta energía son transferidos a

través de una serie de transportadores en ambos fotosistemas y en un tercer complejo

proteico, el complejo del citocromo bf. Como ocurre en las mitocondrias, esta

transferencia de electrones está acoplada a la transferencia de protones en el lumen de

los tilacoides, estableciendo de este modo un gradiente de protones a través de la

membrana tilacoides. La energía almacenada en este gradiente de protones es luego

cosechada por un cuarto complejo de proteínas en la membrana del tilacoides, la ATP

sintetasa, que (como ocurre con la enzima mitocondrial) acopla el flujo inverso de

protones a través de la membrana, a la síntesis de ATP.

Una diferencia importante entre el transporte de electrones en cloroplastos y la que

ocurre en las mitocondrias es que la energía derivada de la luz solar durante la

fotosíntesis no sólo se convierte en ATP sino que también se usa para generar NADPH

requerido para la subsiguiente conversión de CO2 a carbohidratos. Esto se realiza por el

uso de dos fotosistemas en las reacciones lumínicas de la fotosíntesis, uno para generar

ATP y otra para generar NADPH. Los electrones son transferidos secuencialmente entre

los dos fotosistemas, con el fotosistema I actuando como generador de NADPH y el

fotosistema II actuando como generador de ATP.

La vía del flujo de electrones comienza en el fotosistema II, el cuál es homólogo del

centro de reacción fotosintética de R. viridis descripto anteriormente. Sin embargo en el

fotosistema II la energía derivada de la absorción de fotones es usada para dividir las

moléculas de agua a oxígeno molecular y protones. Esta reacción tiene lugar dentro del

lumen del tilacoide, de tal forma que la liberación de protones del agua establece un

gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide. Los electrones de alta

energía derivados de este proceso son transferidos a través de una serie de

transportadores a la plastoquinona, un transportador liposoluble similar a la coenzima Q


188

(ubiquinona) de las mitocondrias. La plastoquinona transporta electrones del

fotosistema II al complejo citocromo bf, dentro del cual los electrones son transferidos a

la plastocianina y los protones adicionales son bombeados hacia el lumen del tilacoide.

El transporte de electrones a través del fotosistema II está acoplado al establecimiento

del gradiente de protones, el cuál conduce la síntesis quimiosmótica del ATP.

Desde el fotosistema II los electrones son transportados por la plastocianina (una

proteína periférica de membrana) al fotosistema I, donde la absorción de fotones

adicionales genera nuevamente electrones de alta energía. El fotosistema I, sin

embargo, no actúa como una bomba de protones, en su lugar, usa los electrones de alta

energía para reducir NADP+ a NADPH. El centro de reacción de la clorofila del

fotosistema I transfiere sus electrones excitados a través de una serie de

transportadores desde la ferrodoxina, una pequeña proteína sobre el lado del estroma

de la membrana del tilacoide. La enzima NADP reductasa luego transfiere los electrones

desde la ferrodoxina al NADP+, generando NADPH. El pasaje de electrones a través de los

fotosistemas I y II genera tanto ATP como NADPH, los cuales son usados por las enzimas

del ciclo de Calvin en el estroma del cloroplasto para convertir el CO2 a carbohidratos.

El Flujo Cíclico de Electrones

Una segunda vía del transporte de electrones llamada el flujo cíclico de electrones,

produce ATP sin la síntesis de NADPH, subministrando de esta forma ATP adicional para

otros procesos metabólicos. En el flujo cíclico de electrones la energía lumínica

colectada por el fotosistema I es usada para la síntesis de ATP más que para la síntesis

de NADPH. En lugar de ser transferidos al NADP+, los electrones de alta energía son

transferidos desde el fotosistema I, al complejo citocromo bf. La transferencia de

electrones a través del complejo citocromo bf es luego acoplada, como en el fotosistema

II, al establecimiento de un gradiente de protones a través de la membrana del tilacoide.

Luego la plastocianina retorna estos electrones al fotosistema I en un estado menor de

energía, completando un ciclo de transporte de electrones en el cuál la energía lumínica

colectada en el fotosistema I es usada para bombear protones al complejo citocromo bf.

La transferencia de electrones desde el fotosistema I puede así generar tanto ATP como

NADPH, dependiendo de las necesidades metabólicas de las células.


189

Síntesis de ATP

La ATP sintetasa de la membrana del tilacoide es similar a la enzima mitocondrial. Sin

embargo, la energía almacenada en el gradiente de protones a través de la membrana

del tilacoide, en contraste con la membrana mitocondrial interna, es casi enteramente

de naturaleza química. Esto se debe a que la membrana del tilacoide aunque es

impermeable a los protones difiere de la membrana mitocondrial interna en que es

permeable a otros iones, particularmente al Mg2+ y al Cl–. El libre pasaje de estos iones

neutraliza el voltaje del gradiente protónico, por lo que la energía derivada de la

fotosíntesis es conservada principalmente como la diferencia en la concentración de

protones (pH) a través de la membrana tilacoidal. Sin embargo, debido a que el lumen

del tilacoide es un compartimiento cerrado, esta diferencia en la concentración de

protones puede ser muy grande, correspondiendo a una diferencia de más de tres

unidades de pH entre el estroma y el lumen tilacoidal. En función de la magnitud de este

diferencial de pH, la energía libre total almacenada a través de la membrana tilacoidal es

similar a la almacenada a través de la membrana mitocondrial interna.

Por cada par de electrones transportados, dos protones son transferidos a través de la

membrana tilacoidal al fotosistema II y de dos a cuatro protones al complejo citocromo

bf. En función que se necesitan cuatro protones para conducir la síntesis de una

molécula de ATP, el pasaje de cada par de electrones a través de los fotosistemas I y II

por el flujo no cíclico de electrones produce entre 1 y 1.5 moléculas de ATP. El flujo

cíclico de electrones tiene un menor rendimiento, correspondiendo entre 0,5 y 1

molécula de ATP por cada par de electrones.

En las reacciones de oscuridad, el NADPH y el ATP producidos en la reacción lumínica

conducen la síntesis de carbohidratos a partir de CO2 y H2O. Se agrega una molécula de

CO2 en cada ciclo de reacción –conocido como el ciclo de Calvin– que conduce a la

formación de carbohidratos (Figura). En general el ciclo de Calvin consume 18 moléculas

de ATP y 12 moléculas de NADPH por cada molécula de glucosa sintetizada. Se necesitan

dos electrones para convertir cada molécula de NADP+ en NADPH, por lo que deben

pasar 24 electrones a través de la cadena transportadora de electrones para generar el

suficiente NADPH como para sintetizar una molécula de glucosa. Estos electrones se


190

obtienen por la conversión de 12 moléculas de H2O a seis moléculas de O2, consistente

con la formación de 6 moléculas de O2 por cada molécula de glucosa. Sin embargo, no

está claro si el pasaje de los mismos 24 electrones a través de la cadena de electrones es

suficiente para generar los 18 ATPs que son requeridos para el ciclo de Calvin. Algunas

de estas moléculas de ATP pueden ser generadas por cadenas de electrones alternativas

que usan la energía derivada de la luz solar para sintetizar ATP sin la síntesis de NADPH.

Peroxisomas

Los peroxisomas son organelas pequeñas encerradas por membrana que contienen

enzimas involucradas en una variedad de reacciones metabólicas incluyendo varios

aspectos del metabolismo energético. A pesar que los peroxisomas son

morfológicamente similares a los lisosomas, son ensamblados como las mitocondrias o

los cloroplastos, a partir de proteínas que son sintetizadas sobre ribosomas libres y

luego son incorporadas a los peroxisomas como cadenas polipeptídicas completas. A

pesar que los peroxisomas no contienen su propio genoma, son similares a las

mitocondrias y los cloroplastos en que se replican por división

Función de los Peroxisomas

Los peroxisomas contienen al menos 50 enzimas diferentes, que están involucradas en

una variedad de vías bioquímicas en diferentes tipos de células. Los peroxisomas fueron

originalmente definidos como organelas que realizan reacciones de oxidación llevando a

la producción de peróxido de hidrógeno. Debido a que el peróxido es peligroso para las

células también contienen la enzima catalasa, que descompone peróxido de hidrógeno a

agua o lo usa para oxidar otros componentes orgánicos. Una gran variedad de substratos

son degradados por tales reacciones en peroxisomas, incluyendo: ácido úrico,

aminoácidos y ácidos grasos. La oxidación de ácidos grasos es un ejemplo

particularmente importante ya que provee una de las principales fuentes de energía. En

células animales, los ácidos grasos son oxidados tanto en peroxisomas como en

mitocondrias, pero en levaduras y en vegetales los ácidos grasos su oxidación esta

restringida a los peroxisomas.


191

Fig 6.2 Modificada de “The Cell a Molecular Approach” de Cooper (2000).

Además de constituir un compartimiento para las reacciones de oxidación, los

peroxisomas están implicados en la biosíntesis de lípidos. En las células animales el

colesterol y el dolicol son sintetizados en los peroxisomas, así como en el RE. En el

hígado, los peroxisomas también están involucrados en la síntesis de los ácidos biliares,

los cuales se derivan del colesterol. Adicionalmente los peroxisomas contienen las

enzimas requeridas para la síntesis de plasmalógenos una familia de fosfolípidos en los

cuales una de las cadenas hidrocarbonadas está unida a glicerol por una unión éter más

que por una unión éster. Los plasmalógenos son importantes componentes de

membrana en algunos tejidos particularmente en corazón y cerebro, aunque están

ausentes en otros.

Los peroxisomas juegan dos roles particularmente importantes en plantas. Primero, los

peroxisomas en las semillas son responsables de la conversión de los ácidos grasos

almacenados a carbohidratos, los cuales son críticos en la provisión de energía y materia

prima para el crecimiento de las plantas germinantes. Esto ocurre vía una serie de

reacciones denominadas el ciclo del glioxilato, que es una variante del ciclo del ácido

cítrico. Los peroxisomas en los cuales esto tiene lugar algunas veces se denominan

glioxisomas.

Los peroxisomas en las hojas están involucrados en la fotorespiración, que actúa

metabolizando un producto lateral formado durante la fotosíntesis. El CO2 es convertido

Peroxisomas


192

a carbohidratos durante la fotosíntesis vía una serie de reacciones denominadas el ciclo

de Calvin. El primer paso es la adición de CO2 al azúcar de 5 carbonos ribulosa 1,5

bifosfato produciendo dos moléculas de 3‐fosfoglicerato (tres carbonos cada una). Sin

embargo, la enzima involucrada, la ribulosa bifosfato carboxilasa o rubisco) algunas

veces cataliza la adición de O2 en lugar de CO2 produciendo una molécula de 3‐

fosfoglicolato de dos carbonos). Esta es una reacción lateral, y el fosfoglicolato no es un

metabolito útil. Esta molécula es primero convertida a glicolato y luego transferida a

peroxisomas, donde se oxida y se convierte a glicina. La glicina es luego transferida a las

mitocondrias donde dos moléculas de glicina son convertidas a una molécula de serina,

con pérdida de una molécula de CO2 y NH3. La serina es luego convertida a glicerato. La

serina es retornada a los peroxisomas, donde se convierte a glicerato. Finalmente, el

glicerato es luego retornado a los cloroplastos, reentrando al ciclo de Calvin. La

fotorespiración no parece ser beneficiosa para los vegetales ya que es esencialmente la

inversa de la fotosíntesis –consume O2 y libera CO2 sin ninguna ganancia de ATP–. Sin

embargo la ocasional utilización de O2 en lugar de CO2 parece ser una propiedad

inherente de rubisco, así que la fotorespiración es un acompañamiento de la

fotosíntesis. Así, los peroxisomas juegan un papel importante permitiendo que la mayor

parte del carbono en el glicolato sea recuperado y utilizado.


193

CAPÍTULO SÉPTIMO:

El Núcleo Celular


194

EEll NNúúcclleeoo

La presencia de núcleo es la principal característica que separa a las células eucariotas

de las procariotas.

Las bacterias y arquibacterias en general, carecen de esta estructura. El arribo a escena

del núcleo pudo haber acelerado la generación de la diversidad de la vida multicelular

observada en nuestros días, por lo que esta organela ha fascinado a los científicos que

intentan probar la evolución de los organismos modernos.

El origen del núcleo también está intimamente ligado con nuestros propios orígenes. En

relación con el origen del núcleo se reconocen tres teorías líderes en este sentido2. Una

de ellas sostiene que la organela es el resultado de la fusión microbiana. Otra sustenta

que el núcleo residual, oculto en algunas bacterias actuales, fue una innovación crucial

más antigua de lo que comúnmente se piensa. La teoría más radical sostiene que los

virus habrían jugado un rol clave en el desarrollo de las células eucariotas.

Se ha propuesto que en los días tempranos de la evolución celular, las archaeas

productoras de metano, habrían vivido dentro de bacterias que dependían de la

fermentación para su mantenimiento en una relación denominada el modelo sintrófico.

La relación habría funcionado para las arqueas pues la fermentación proveía la fuente de

H2 que ellas requerían. Las bacterias por ortro lado se habrían beneficiado pues la

fermentación requiere que el contenido de H2 permanezca bajo.

Se ha hipotetizado que las cambiantes condiciones ambientales sobre la tierra

finalmente promovieron un cambio en la simbiosis. Las arqueas habrían perdido

gradualmente su apetito por el H2, cesando su producción de metano y en lugar de eso

se hicieron más dependientes de la bacteria hospedadora como fuente de nutrientes. La

membrana de la arquea que antes cumplía un rol crítico para la metanogénesis se habría

tornado superflua en estas condiciones. Al mismo tiempo, la membrana bacteriana

externa se habría invaginado y rodeado el compartimiento celular, eventualmente

rodeando el ADN arqueal pero excluyendo a los ribosomas. El cambio habría sido

2 Elizabeth Pennisi. The Birth of the nucleus. Science (2004) 305: 766‐768.


195

beneficioso para las bacterias debido a que la separación de los ribosomas de los

cromosomas microbianos habría ayudado a asegurar una más precisa transmisión del

mensaje del ADN. Esta disposición persistió y finalmente habría evolucionado en el

nucleo eucariótico. El remanente del citoplasma arqueal se habría tornado núcleo.

Quienes sostienen esta teoría sobre el origen del núcleo, sugieren que las modernas

archaea metanogénicas poseen características que recuerdan a las células eucariotas

serían las posibles descendientes de las antiguas arqueas metanogénicas. Estas arqueas

comparten con los eucariotas el hecho de tener genes similares involucrados con la

estructura del ADN y del ARN. Por ejemplo comparten genes para la codificación de las

histonas, que son las proteínas que ayudan a estabilizar los cromosomas. En contraste

las bacterias carecen de histonas en sus cromosomas.

Otro microbio moderno, el Myxobacterium recuerda a los antiguos hospedadores

bacterianos en los que habría evolucionado el núcleo. Como las células eucariotas,

myxobacteria se comunica con otras células, se mueve y puede formar complejos

multicelulares. Myxobacterium tiene estructuras complejas que son muy semejantes y

reminiscentes de células eucariotas. Esta bacteria tiene moléculas de señalamiento

celular tales como quinasas y proteínas G, comunes con los eucariotas.

Quienes sostienen esta teoría asumen que bacterias y arqueas habrían aparecido más

tempranamente que eucariotas en el árbol de la vida,

pero otros autores sostienen que lo contrario

también podría ser verdad.

Por ejemplo, John Fuerst de la Universidad de

Queensland, Australia, está convencido que células

similares a eucariotas aparecieron antes que las

bacterias y las arqueas, o que emergieron en el

tiempo en el que estas procariotas se separaron para

formar un nuevo reino. Fuerst puntualiza sus teorías

en un inusual grupo de bacterias que él ha estudiado durante la última década. Este

notable microbio tiene un núcleo o algo similar a esta estructura y podría ser semejante


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Micrografía electronica de una sección de Gemmata obscuri‐globus. La membrana que rodea al núcleo esta marcada con la M: el citoplasma que rodea el cuerpo nuclear está marcado con (C) y posee una diferente textura que el

citoplasma (G). Bar = 0.5μm.

a las células tempranas que pudieron evolucionar en las eucariotas modernas.

Estas bacterias que se encuentran en el suelo y en el agua dulce se denominan

Planctomycetes. Estos organismos poseen paredes celulares que no son mucho más

rígidas que las de otras bacterias. En 1984 los investigadores habían sugerido que

algunos planctomycetes poseían membranas internas. En el 2001, Fuerst y sus

colaboradores, usando sofisticadas técnicas de microscopía electrónica confirmaron la

existencia de estas membranas, revelando que estas poseían estructura doble como las

del núcleo eucariota.

Estas observaciones tiraron abajo el dogma “de que

las células procariotas carecen de membranas

internas”, argumenta Philip Bell un biólogo de

levaduras de la universidad de Macquarie en Sydney,

Australia.

Usando sofisticadas técnicas de microscopía electrónica, Fuerst y sus colegas han ahora

verificado que existen compartimientos discretos rodeados de membrana dentro de dos

planctomycetes, Gemmata obscuriglobus y Pirellula marina. Uno de los

compartimientos, ubicado en la periferia parece contener muy poco en su interior. El

segundo ubicado en el centro del microbio contiene una densa colección de material

genético –ADN, ARN y proteínas procesantes de ADN y ARN. El citoplasma se encuentra

lleno de proteínas, ribosomas y ARN.


197

Al menos uno de los planctomicetos estudiados posee una doble membrana de

alrededor de su ADN en lugar de la más típica membrana simple. La membrana no es

contínua sino que consiste en dobles membranas

plegadas mantenidas juntas. Las interrupciones entre las

membranas podrían indicar cómo se originaron los

complejos de poro nucleares, puntualiza Fuerst. Explicar

estas estructuras siempre fue un punto controversial para

la evolución nuclear. Sin complejos de poro, el núcleo no

puede funcionar. Pero nada similar a este complejo ha

sido observado en las bacterias hasta la fecha. En el año

2004 Fuerst mostró dramáticas micrografías de

estructuras similares a cráteres en las membranas internas de los planctomicetes, estas

depresiones recuerdan a los poros nucleares, indica Fuerst. Aunque son difíciles de

comparar los genes que codifican las proteínas de los complejos de poro, ese es el actual

objetivo de Fuerst quien tiene pruebas que los genomas planctomicetes tienen

versiones primitivas de los genes eucariotas para algunas proteínas claves del complejo

de poro.

Si se combinan todas estas evidencias el panorama parece convincente. Gemmata es un

modelo válido para explicar un orígen no simbiótico del núcleo. Pero Fuerst dice que

este no es el único ejemplo, ellos han descubierto recientemente un filum de bacterias

habitantes de esponjas que también parece tener núcleo y sostiene que aún podrían ser

descubiertas otras especies. Bacterias con membranas internas y poros nucleares,

características estas, propias de las células eucariotas, sugieren que el núcleo podría

haber aparecido mucho antes de lo que tradicionalmente se creía. Si el escenario de

Fuerst es correcto, entonces el núcleo precede a los eucariotas.

En efecto, este compartimiento puede llevar al último ancestro universal comumun

(LUCA del inglés: Last Universal Common Ancestor), un organismo putativo a partir del

cual habrían emergido eucariotas, bacterias y archaeas. Si este fuese el caso, ciertas

características del núcleo fueron retenidas en eucariotas pero se habrían perdido en la

mayoría de las bacterias y archaeas. Ciertamente, si esta aseveración fuese cierta, las


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células eucariotas actuales poseerían características ahora observadas en cada uno de

los tres grupos.

Una tercera opción para el orígen del núcleo gira alrededor de los virus. Los virus

predatan la divergencia de los tres dominios de la vida, sostiene David Prangishvili un

virólogo de la universidad de Resenverg, Alemania. El argumenta que los virus ya eran

muy comunes en la sopa primordial y solo posteriormente se tornaron dependientes de

las células para sobrevivir. Cuando apartecieron las células los virus jugaron un papel en

la evolución de los sistemas [eucariotas] complejos.

Los virus poseen la capacidad de residir permanentemente en una célula, infectándola

pero no matando a la hospedadora. Así, ellos y sus genes pueden mantenerse e

influenciar la evolución celular. Hay diversas propuestas de cómo los virus pudieron

influenciar la evolución del núcleo. Los datos disponibles son provocativos pero

circunstanciales y controvertidos. El hecho que los virus persistan en la célula en lugar de

matarla, permite que éstas adquieran un conjunto nuevo de genes en un solo evento,

sostiene Luis Villarreal de la Universidad de California, Irving. Mientras se encuentran

residiendo por millones de años los nuevos genes virales, podrían reemplazar genes de

bacterias o archaeas, por ejemplo los que codifican a las proteínas que procesan ADN.

Estos genes extra podrían haber jugado nuevos roles en las células.

Villarreal apunta que hay extraordinarias similitudes entre el núcleo y los virus. Ambos

son paquetes de ADN cubiertos por proteínas y a menudo por membrana. En las algas

rojas por ejemplo, un núcleo puede moverse de una célula a otra como si fuese un virus

infeccioso. En general el núcleo celular y los virus carecen de mecanismos para la

producción de proteínas y lípidos dentro de sus límites. Ambos contienen ADN en forma

de cromosomas lineales mientras que en la mayoría de

las bacterias los cromosomas son circulares. Ambos

desensamblan la membrana durante su división. Ambos

transcriben ADN pero no taducen el ARNm dentro de sus

límites. Algunos virus pox forman una cubierta alrededor

de su ADN usando el RE de la célula hospedadora. Las

células eucarióticas usan este mismo material para


199

construir su núcleo.

Los largos y complejos ADNs virales entre los que se incluyen a los virus pox como el

virus de la fiebre de cabras africanas, parece compartir estrechamente el putativo

ancestro viral del núcleo. La hebra de ADN en estos virus tiene telómeros primitivos,

secuencias de ADN protectoras encontradas en los extremos de los cromosomas

eucarióticos. Bell especula que virus viviendo en arqueas establecieron el comienzo del

núcleo. Finalmente el ADN viral y el ADN arqueal se habrían fusionado dentro del virus y

el nuevo genoma habría portado el material genético para ambos. Al final argumenta

Bell, la arquitectura genética única de los eucariotas, sería el resultado de la

superposición de la arquitectura viral sobre la arquitectura genética arqueal. Si esto

fuese así, remarca Bell, seríamos descendientes de los virus.

Funciones del Núcleo

El núcleo, como alojamiento del genoma celular actúa como depósito de la información

genética y como centro de control celular.

En el núcleo tienen lugar:

• la replicación del ADN,

• la transcripción, el procesamiento de los distintos tipos de ARN y su transporte

hacia el citoplasma.

Al separar el genoma del citoplasma, la cubierta nuclear permite regular la expresión

genética por mecanismos que son únicos de eucariotas. El ARNm de los procariotas es

traducido mientras su transcripción está aún en proceso, el ARNm eucariótico sufre

procesamiento postranscripcional (por ej. el splicing o empalme), antes de ser

transportado desde el núcleo al citoplasma.

La limitación del acceso de proteínas al material genético de eucariotas, también

constituye un mecanismo de control de la expresión génica a nivel transcripcional. Por

ejemplo la expresión de algunos genes puede ser controlada por el transporte de

algunos factores de transcripción desde el citoplasma al núcleo, una forma de regulación

transcripcional de la que carecen los procariotas.


200

La separación del genoma del sitio de traducción del ARNm juega así un rol central en la

expresión genética de los eucariotas.

LA CUBIERTA NUCLEAR Y EL TRÁFICO ENTRE EL NÚCLEO Y EL CITOPLASMA

La cubierta nuclear separa el contenido nuclear del citoplasma y provee el marco

estructural del núcleo. Así, el núcleo se mantiene como un compartimento bioquímico

distinto. Los únicos canales entre el núcleo y el citoplasma son los complejos de poro

nuclear.

El tráfico selectivo de proteínas y ARNs a través de los complejos de poro no sólo

establece la composición interna del núcleo, sino que juega además un rol crítico en la

regulación de la expresión genética en eucariotas.

ESTRUCTURA DE LA CUBIERTA NUCLEAR

La estructura de la cubierta nuclear es compleja, posee un sistema doble de membranas,

una lámina nuclear subyacente y los complejos de poro nuclear. El núcleo está rodeado

por un sistema de dos membranas concéntricas, llamadas la membrana nuclear interna

(MNI) y la membrana nuclear externa (MNE).

La membrana nuclear externa posee continuidad con el RE por lo que el espacio entre

las membranas nucleares interna y externa tienen continuidad con el lumen del RE.

Adicionalmente, la membrana nuclear externa es funcionalmente similar al retículo

endoplasmático y tiene ribosomas unidos a la superficie citoplasmática. En contraste, la

MNI posee proteínas que son exclusivas del núcleo.

La función crítica de las membranas nucleares es actuar como barreras que separan el

contenido nuclear del citoplasmático. Como ocurre con otras membranas celulares, las

MN son bicapas fosfolipídicas, permeables sólo a pequeñas moléculas no polares. Otras

moléculas son incapaces de difundir a través de la bicapa lipídica. El poro nuclear es una

estructura compleja responsable del tráfico selectivo entre el núcleo y el citoplasma.

Por debajo de la MNI se encuentra la lámina nuclear, un entramado que provee de

soporte estructural al núcleo. La lámina nuclear está compuesta de una o más proteínas

relacionadas llamadas láminas. La mayoría de las células de mamíferos contienen cuatro

tipos diferentes de láminas: A, B1, B2 y C. Todas las laminas son proteínas fibrosas de 60


201

– 80Kd, relacionadas con las proteínas de los filamentos intermedios del citoesqueleto.

Como otras proteínas de los filamentos intermedios, las láminas se asocian unas con

otras para formar filamentos. El primer estado de esta asociación es la interacción de

dos láminas para formar un dímero en el cual las regiones de helices alfa de dos cadenas

polipeptídicas están enrolladas una alrededor de la otra formando una estructura

denominada coiled coil. Estos dímeros luego se asocian unos con otros para formar

filamentos que conforman la lámina nuclear.

La asociación de láminas con la MNI está facilitada por la adición postraduccional de

lípidos –en particular la prenilación C–terminal de los residuos cisteína. Las láminas se

unen además a proteínas de la MNI, lo que permite que las láminas se organicen en una

malla entramada y median su anclaje a la membrana.

Además de proveer soporte al núcleo, se cree que la lámina nuclear sirve como sitio de

anclaje de la cromatina. La cromatina dentro del núcleo está organizada formando

grandes lazos de ADN, algunos de los cuales aparecen unidos a la cubierta nuclear. Las

laminas uniendo la cromatina podrían ayudar a mediar esta interacción.

El Complejo de Poro Nuclear

Son los únicos canales a través de los que son capaces de pasar pequeñas moléculas

polares, iones y macromoléculas (ARN y proteínas).

El complejo de poro nuclear es una estructura extremadamente grande, con un

diámetro de aproximadamente 120 nm y una masa estimada de 125.000 kd

(aproximadamente 30 veces el tamaño de un ribosoma).

En vertebrados el complejo de poro esta formado por entre 50 y 100 tipos diferentes de

proteínas.

Dependiendo de su tamaño, las moléculas pueden atravesar a través del poro por dos

mecanismos diferentes. Las moléculas pequeñas y algunas proteínas con masas

moleculares menores que 50 kd pasan libremente a través de la cubierta nuclear en

ambas direcciones: del citoplasma al núcleo y del núcleo al citoplasma. Estas moléculas

difunden pasivamente a través de un canal acuoso de 9 nm de diámetro. La mayoría de

las proteínas y los ARNs, sin embargo son incapaces de atravesar estos canales abiertos.


202

Por esto, estas macromoléculas atraviesan estos complejos

por un proceso activo, en el que proteínas y ARNs apropiados

son reconocidos y transportados selectivamente en una sola

dirección. El tráfico de estas macromoléculas ocurre a través

de canales regulados en el complejo de poro nuclear que en

presencia de señales adecuadas puede abrirse más de 25 nm

de diámetro.

La visualización de los complejos de poro nuclear

por microscopía electrónica reveló que poseen una

estructura de simetría ortogonal organizada

alrededor de un canal central. Los estudios

estructurales detallados, incluyendo análisis de

imágenes basados en computadoras han llevado al

desarrollo de modelos tridimensionales del

complejo de poro nuclear. Estos estudios indican

que el poro nuclear consiste de un ensamble de

ocho radios arreglados alrededor de un canal

central. Los radios están conectados a anillos tanto

en la superficie nuclear como en la citoplasmática. El ensamble de anillos – radios está

anclado dentro de la cubierta nuclear en los sitios de fusión de las membranas

nucleares interna y externa. Las proteínas filamentosas se extienden desde los anillos en

la fase nuclear, formando una estructura similar a una canasta, denominada jaula

nuclear y en la citoplasmática, se desprenden hacia el citosol perinuclear. Los canales

centrales tienen aproximadamente 40 nm de diámetro, que es suficientemente ancho

para que pasen las partículas más grandes capaces de atravesar la cubierta nuclear. En el

interior del canal existe una estructura llamada el transportador central, a través del

que se cree ocurre el transporte activo de macromoléculas por un mecanismo no

completamente dilucidado.

Transporte selectivo de proteínas desde y hacia el núcleo

La base del transporte selectivo a través de la cubierta nuclear es mejor comprendida

Imagen de TEM de un corte de la membrana nuclear. c: citoplasma; n: núcleo. Flechas: poros nucleares, cabezas de flecha: poros nucleoplamáticos


203

para proteínas que son importadas desde el citoplasma hacia el núcleo. Tales proteínas

son responsables de todos los aspectos de la estructura y función del genoma. Incluyen

histonas, ADN polimerasas, ARN polimerasas, factores de transcripción, factores de

empalme, y muchos otros. Estas proteínas son dirigidas hacia el núcleo por secuencias

de aminoácidos específicas llamadas señales de localización nuclear (SLN), que

direccionan su transporte hacia el complejo de poro nuclear. La primera señal de

localización nuclear en ser mapeada en detalle fue caracterizada por Allan Smith y sus

colegas en 1984. Estos investigadores estudiaron el antígeno T del virus 40 de los simios

(SV40), una proteína codificada por el virus que inicia la replicación viral en células

infectadas. Como podía esperarse, de una proteína promotora de los procesos de

replicación, para ejercer su función debe localizarse en el núcleo. La señal responsable

para su localización nuclear fue primero identificada por el descubrimiento que la

mutación de un residuo de lisina simple –que evita la importación nuclear– resulta en la

acumulación del antígeno T en el citoplasma. Estudios posteriores definieron la SLN del

antígeno T como una secuencia de siete aminoácidos: Pro~Lys~Lys~Lys~Arg~Lys~Val. No

sólo se demostró que esta secuencia es necesaria, sino que su adición a otras proteínas

citoplasmáticas dirige su transporte y acumulación en el núcleo. Las señales de

localización nuclear, han sido identificadas en muchas proteínas. La mayoría de estas

secuencias, de manera similar a lo que ocurre con el antígeno T, son cortas tiras ricas en

residuos de aminoácidos básicos (como lisina, arginina) En muchos casos, sin embargo,

los aminoácidos que forman la señal de localización nuclear están próximos entre si,

pero no adyacentes unos con otros. Por ejemplo, la señal de localización nuclear de la

nucleoplasmina (una proteína involucrada en el ensamble de los cromosomas consiste

de dos partes: un par Lys~Arg seguida de cuatro residuos de lisina localizados diez

aminoácidos corriente abajo. Tanto las secuencias Lys~Arg como Lys~Lys~Lys~Lys son

necesarias para el direccionamiento nuclear pero los 10 aminoácidos intermedios entre

estas secuencias pueden ser mutados sin afectar la localización nuclear. Debido a que

estas secuencias de localización nuclear están compuestas por dos elementos separados

se refieren como bipartitas. Además algunas proteínas, tales como las ribosomales,

contienen distintas señales de localización nuclear que no están relacionadas con las

señales ricas en aminoácidos básicos de la nucleoplasmina o el antígeno T.


204

La importación de proteínas a través del complejo de poro nuclear puede ser dividida en

dos pasos distinguidos por su requerimiento de energía. En el primer paso, que no

requiere energía, las proteínas que contienen señales de localización nuclear se unen al

complejo de poro nuclear sin pasar a través de él. En este paso inicial, las señales de

localización nuclear se reconocen por una proteína citosólica receptora, y el complejo se

une al poro nuclear, el receptor prototipo se denomina importina, consiste de dos

subunidades. Una subunidad (importina‐α), se une a la señal de localización nuclear rica

en aminoácidos básicos. La segunda subunidad, (importina‐β) se une a los filamentos

citoplasmáticos del complejo de poro nuclear. Otros tipos de señales de localización

nuclear, tales como las de las proteínas ribosomales son reconocidas por distintos tipos

de moléculas receptoras que están relacionadas con la importina β y funcionan como

ésta durante el transporte de sus proteínas target hacia el núcleo. El segundo paso en la

importación nuclear, es un proceso dependiente de energía, a partir de la hidrólisis de

GTP. Un jugador clave en este proceso de translocalización son las pequeñas proteínas

unidas al GTP denominadas Ran, relacionadas con las proteínas Ras. La conformación y

actividad de estas proteínas está regulada por la unión e hidrólisis de GTP, como ocurre

con el Ras u otros factores de traducción involucrados en la síntesis de proteínas. Las

enzimas que estimulan la unión de GTP a Ran están localizadas en el lado nuclear de la

cubierta nuclear mientras que las enzimas que estimulan la hidrólisis de GTP están

localizadas en el lado citoplasmático. En consecuencia hay un gradiente de Ran/GTP a

través de la cubierta nuclear, con una mayor concentración GTP–Ran en el lado nuclear y

mayor concentración GDP–Ran en el citoplasma. Se cree que este gradiente determina

la direccionalidad del transporte.

La hidrólisis de GTP por Ran parece proveer la energía de la mayor parte, si no toda la

energía necesaria para la importación nuclear.

El complejo importinas α / β y su molécula target asociada están en presencia de una

alta concentración de GDP–Ran en el lado citoplasmático.

El complejo: {importinas‐α /‐β + la proteína target} son importados hacia el interior del

núcleo, donde hay una mayor concentración de GTP–Ran.


205

Como consecuencia, los complejos GTP–Ran se unen a la subunidad‐β de la importina

desplazando la subunidad‐α y la proteína target, que son liberados dentro del núcleo.

El complejo: {GTP–Ran + la subunidad‐β} es exportado al citosol, donde el GTP es

hidrolizado a GDP, liberando a la importina‐β.

Muchas enzimas target permanecen en el núcleo pero otras son reenviadas al

citoplasma, algunas actuando como transportadoras de otras moléculas como los ARNs,

otras coordinan funciones nucleares o citoplasmáticas (por ejemplo regulación de

algunos factores de transcripción)

Las proteínas son direccionadas para la exportación desde el núcleo por secuencias

específicas de aminoácidos denominadas señales de exportación nuclear (SEN)

Como en el caso de las señales de localización nuclear, las SEN son reconocidas por

receptores de exportación nuclear llamados exportinas, que están molecularmente

relacionadas con la subunidad‐β de las importinas

Como ocurre con la importina‐β, las exportinas se unen a Ran, el cual es necesario para

la importación y la exportación de las proteínas.

Sin embargo, un aspecto notable es que, los complejos Ran–GTP promuevan la

formación de complejos estables entre las exportinas y su proteína target, mientras que,

promueven la disociación entre importinas y su target.

Este efecto de la unión Ran–GTP sobre las exportinas dirige los movimientos de

proteínas que contienen señales de exportación del núcleo al citoplasma.

Regulación de la Importación de Proteínas Nucleares

Los factores de transcripción son funcionales sólo en el núcleo, de tal forma que su

importación hacia el núcleo es clave para controlar la expresión génica

La importación hacia el núcleo de los factores de transcripción y las proteína quinasas

juegan un rol muy importante en el control del comportamiento de la célula en

respuesta a los cambios en el ambiente circundante.

Un mecanismo de regulación es aquel en el que los factores de transcripción (u otras


206

proteínas) se asocian con otras moléculas que enmascaran su señal de localización

nuclear;

Un buen ejemplo lo provee NFκB que activa la transcripción de la cadena K liviana de las

inmunoglobulinas en los linfocitos T.

Transporte de ARNs

Los ARNs son exportados desde el núcleo hacia el citoplasma.

Ya que las proteínas son sintetizadas en el citoplasma, la expresión y transporte de los

ARNms, ARNts y ARNrs es un paso crítico en las células eucariotas.

La exportación de ARNs a través del núcleo es un proceso dependiente de energía que

requiere del complejo: proteína Ran–GTP.

Los ARNs son transportados formando complejos con proteínas.

Estas proteínas son reconocidas como exportinas y transportan desde el núcleo al

citoplasma como se describió anteriormente.

Los pre‐ARNms y ARNms están asociados con un conjunto de al menos 20 proteínas

(formando ribonucleoproteínas nucleares heterogéneas o RNPnhs)

Al menos 2 de estas 20 proteínas poseen señales de exportación nuclear

Los ARNrs son ensamblados con proteínas ribosomales en el núcleo y las subunidades

intactas son transportadas luego al citoplasma.

Su exportación al citoplasma parece estar mediada por señales de exportación nuclear

en las proteínas ribosomales.

Aún no se han identificado las proteínas específicas que median el transporte de los

ARNt.

En contraste con los ARNms, ARNt y ARNrs que actúan en el citoplasma, los ARNs

nucleares pequeños (snARNs) que desempeñan su función en el núcleo como

componentes de la maquinaria de procesamiento del ARN son transportados desde el


207

núcleo al citoplasma, donde se asocian con proteínas para formar snRNPs y retornan al

núcleo

Las proteínas que se unen al cap 5’ de los snARNs parecen involucradas en la

exportación de estos al citoplasma.

Las secuencias presentes en las snRNPs son las responsables de transportar estas

moléculas nuevamente al núcleo desde el citoplasma.

Organización Interna del Núcleo

El núcleo no es un empaquetamiento de cromatina, ARNs y proteínas nucleares

El núcleo posee una estructura interna que organiza el material genético y localiza

algunas funciones nucleares en sitios discretos

El sitio más obvio es el nucleolo que es el lugar en el que se transcribe el ARNr y en

donde se ensamblan los ribosomas

Cromosomas y Estructura de la Cromatina altamente ordenada

La cromatina se torna altamente condensada durante la mitosis formando los

cromosomas metafásicos compactos.

Durante la interfase:

• Heterocromatina transcripcionalmente inactiva:

Constitutiva (satélites de los centrómeros)

Facultativa

• Eucromatina

El fenómeno de inactivación del cromosoma X. Ejemplo, del rol de la heterocromatina

en la expresión de los genes.

El cromosoma X posee miles de genes que no están en el cromosoma “Y” más pequeño.

A pesar de esa diferencia machos y hembras poseen la misma cantidad de proteínas

codificadas por el cromosoma X. Uno de los cromosomas X en las hembras es inactivado


208

conviertiéndolo en heterocromatina.

Aún no se comprende totalmente cómo se produce esta inactivación.

Aparentemente existe un ARN regulatorio que cubre el cromosoma X inactivo e induce

su conversión a heterocromatínico.

Aunque la cromatina interfásica parece

uniformemente distribuida, los cromosomas están

ordenados en forma ordenada y dividida en dominios

discretos y funcionales.

En 1.885 C. Rabl propuso que en núcleo interfásico

cada cromosoma ocupa un territorio distinto con

centrómeros y telómeros anclados en los extremos

opuestos de la cubierta nuclear.

En 1.984 D. Mathog et al., confirmaron las hipótesis de Rabl.

Los cromosomas individuales también ocupan distintos territorios dentro del núcleo.

Los genes que son activamente transcriptos aparecen localizados en la periferia de los

territorios adyacentes a los canales que separan los cromosomas.

Se piensa que los ARNs recién transcriptos son liberados en estos canales entre los

cromosomas donde tiene lugar el procesamiento del ARN.

Como en los cromosomas metafásicos, la cromatina interfásica parece estar organizada

en dominios con forma de lazos de 50 a 100 Kb de ADN. Un buen ejemplo de esta

organización es la de los cromosomas altamente transcribientes de los oocitos de

anfibios en la regiones de ADN en activa transcripción pueden ser visualizadas como

lazos extendidos de cromatina descondensada. Estos dominios de cromatina parecen

representar unidades funcionales discretas, que regulan independientemente la

expresión génica.

Los efectos de la organización de los cromosomas sobre la expresión de los genes han

sido demostrados por varios experimentos que muestran que la posición de un gen en el

Territorios Cromosómicos


209

ADN cromosómico afecta el nivel al que este gen es expresado. Por ejemplo, la actividad

transcripcional de genes introducidos en ratones transgénicos depende de los sitios de

integración en el genoma del ratón. El efecto de la posición cromosómica sobre la

expresión génica es aliviado por secuencias conocidas como locus control regions, que

resultan en un alto nivel de expresión de los genes introducidos, sin que incida su sitio

de integración. En contraste con los amplificadores transcripcionales, las regiones de

control de locus estimulan sólo genes transfectados que se integran en el ADN

cromosómico, sin afectar la expresión de los plásmidos en ensayos transitorios.

Adicionalmente, más que afectar promotores individuales, las regiones control de locus

parecen activar grandes dominios cromosómicos, presumiblemente por introducción de

alteraciones de amplio rango en la estructura de la cromatina.

La separación entre los dominios cromosómicos se mantiene por secuencias de unión o

elementos aislantes que impiden que la estructura de la cromatina de un dominio se

disperse entre sus vecinos. Además los aislantes actúan como barrera para prevenir la

amplificación de promotores o cis‐acting localizados en dominios adyacentes. Como las

regiones de control de locus, los elementos de aislamiento, funcionan sólo en el

contexto del ADN cromosómico, sugiriendo que ellos regulan la estructura de la

cromatina de orden superior. Aunque el mecanismo de acción de las regiones de control

de locus y los aislantes no ha sido dilucidado, su función claramente indica la

importancia de la organización de orden superior de la cromatina en el control de la

expresión génica eucariótica.

Dominios Funcionales dentro del Núcleo

Se ha postulado que actividades como la replicación del ADN y el procesamiento del

pre–ARNm podrían estar localizadas en sitios discretos o dominios del núcleo eucariota.

En una célula diploide de mamíferos en cada instante de tiempo dado hay

aproximadamente 4.000 orígenes de replicación activos, cada uno de estos sitios

agrupados de replicación del ADN deben contener aproximadamente 40 horquillas de

replicación.

Los genes que se encuentran en activo proceso de transcripción, parecen estar


210

distribuidos en todo el núcleo, pero los componentes de la maquinaria de empalme

(splicing) están concentrados en dominios estructurales subnucleares discretos.

Los componentes de empalme están concentrados en 20–50 estructuras discretas

llamadas “pecas nucleares” en las que se piensa se acumulan los componentes de

empalme que son reclutados desde las pecas a los genes en activa transcripción donde

ocurre el procesamiento del pre–ARN.

Otras estructuras son los cuerpos enrollados y los cuerpos PML. Los primeros son ricos

en ribonucleoproteínas nucleares pequeñas (small nuclear ribonuclearproteins) (snRNP)

y se cree que son los sitios de ensamblaje de las snARNs. La función de los cuerpos PML

aún no ha podido determinarse.

Algunos investigadores sostienen que la matriz nuclear es un componente central de la

organización nuclear pero aún no ha sido caracterizada.

El Nucleolo

Es la estructura más prominente del núcleo. Es el sitio de transcripción, procesamiento y

ensamble del ARNr.

Las células requieren de gran cantidad de ribosomas para cubrir sus necesidades de

síntesis de proteínas. Las células de mamíferos, por ej., poseen entre 5 y 10 millones de

ribosomas que deben sintetizarse cada vez que la célula se divide.

Genes del ARNr y la organización de nucleolo

Es una región no delimitada por membrana, organizada alrededor de las regiones que

contienen los genes para los ARNrs 5.8S, 18S y 28S.

Los ribosomas eucarióticos poseen 4 tipos de ARNs designados como: 5S, 5,8S, 18S y 28S

Los ARNs 5,8S, 18S y 28S son transcriptos como una unidad simple por la ARN

polimerasa I produciendo un precursor de ARNr de 45S.

El pre – ARNr 45S es procesado a ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐18S (subunidad pequeña 40S)

y a ‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐‐28S y 5,8S (subunidad grande 60S)

La transcripción del ARNr 5S se realiza fuera del nucleolo y es catalizada por la ARN


211

polimerasa III, este ARNr se incorpora a la subunidad 60S.

Estructura Tipo de pre–ARN y polimerasa

Tipo de ARN Subunidad a la que se incorpora.

Nucleolo Pre – ARNr 45S ARN polimerasa I

18S Subunidad 40S

28S Subunidad 60S

5,8S “ Extranucleolo Pre – ARNr 5S

ARN polimerasa III

5S “

Para cubrir

con las

necesidades

del gran

número de

ARNr todas

las células

contienen

múltiples

copias de los

genes de los

ARNrs

Por ejemplo en humanos, cada célula contiene 200 copias del gen que codifica los ARNrs

5,8; 18S y 28S y aproximadamente 2.000 copias del gen que codifica el ARNr 5S.

En humanos, los genes para ARNrs 5,8; 18S y 28S están agrupados en un arreglo en

tandem sobre 5 cromosomas diferentes (13, 14, 15, 21 y 22); el gen para el ARNr 5S está

presente en un arreglo en tándem simple en el cromosoma 1.

Los nucleolos consisten morfológicamente de tres regiones distinguibles:

• el centro fibrilar (CF)


212

• el componente fibrilar denso (CFD)

• el componente granular (CG)

Estos serían diferentes estados de maduración del ARNr:

CF: sitio de transcripción de los ARNrs

CFD: comienzo de procesamiento de los ARNrs

CG: final del procesamiento y sitio de ensamble con las proteínas ribosomales para

formar las subunidades pre–ribosomales listas para ser exportadas al citoplasma.

El tamaño del nucleolo depende de la actividad metabólica de la célula.

Ensambles de los Ribosomas

Implica el ensamble de los ARNs ribosomales nucleolares con las proteínas y con el ARNr

5S.

Los genes que codifican las proteínas ribosomales son transcriptos fuera del nucleolo

por la ARN polimerasa II, produciendo ARNms que son traducidos en los ribosomas

citoplasmáticos. Luego las proteínas son trasladadas desde el citoplasma al nucleolo

donde se ensamblan con los ARNrs formando partículas preribosomales.

Aunque los genes para el ARNr 5S son transcriptos fuera del nucleolo, por la ARN

polimerasa III, este se ensambla en el nucleolo.

El Núcleo durante la Mitosis

Una característica única del núcleo es que se desensambla y ensambla cada vez que la

célula se divide.

Al comienzo de la mitosis los cromosomas se condensan, el nucleolo desaparece y se

rompe la cubierta nuclear con lo que el contenido nuclear se vierte en el citoplasma.

Al final se produce el fenómeno inverso

El proceso está controlado por la fosforilación y desfosforilación reversible de las

proteínas nucleares que resultan de la acción de la proteína quinasa Cdc2 que es un


213

regulador crítico de la mitosis

Disolución de la cubierta nuclear

Marca el final de la profase pero no ocurre en todas las células eucariotas por lo que no

puede ser considerada una característica universal.

La ruptura de la cubierta nuclear es paralela a una ruptura del RE, e involucra a los tres

componentes:

• La membrana nuclear se fragmenta formando vesículas

• El complejo de poro nuclear se desensambla

• La lámina nuclear se despolimeriza

El mejor comprendido de los procesos es la despolimerización de la lámina nuclear.

Conforme se disuelve la lámina nuclear, la membrana nuclear se fragmenta formando

vesículas.

Las láminas tipo B permanecen asociadas con las vesículas de la membrana nuclear.

Las láminas tipo A y C se disocian de la membrana nuclear y se liberan como dímeros

libres en el citosol.

Esta diferencia se origina en el hecho que las láminas tipo B son permanentemente

modificadas por la adición de grupos prenilo mientras que los grupos prenilo de las

lamininas A y C son removidos luego que las láminas se incorporan a la lámina.

Condensación de los Cromosomas

La cromatina se condensa aproximadamente 1.000 veces para formar cromosomas de

células mitóticas.

Esta condensación es necesaria para permitir el movimiento de los cromosomas en el

huso mitótico.

Los cromosomas metafásicos condensados se organizan formando grandes lazos de ADN

que comprenden aproximadamente 100 Kbs de ADN que están anclados a un andamiaje


214

Nucleosoma

proteico

A pesar de la importancia el mecanismo de condensación cromosómica no está

completamente comprendido.

La unidad básica de la estructura de la cromatina es el

nucleosoma que consiste en 146 pares de bases de ADN

enrolladas alrededor de un centro histónico conteniendo 2

moléculas de cada una de las siguientes histonas: H2A, H2B,

H3 y H4

Una molécula de histona H1 está unida al ADN conforme

este ingresa en cada partícula del core nucleosomal.

La histona H1 es substrato de la proteína quinasa Cdc2 y es fosforilada durante la

mitosis.

Sin embargo, esta fosforilación se ha demostrado que no es requerida para la

condensación de los cromosomas.

En contraste, se ha encontrado que la fosforilación de la H3 es necesaria para que se

produzca la condensación aunque aún no se conoce exactamente el mecanismo.

Los estudios recientes, han identificado un complejo de proteínas denominadas

condensinas que juegan un rol destacado en la condensación de los cromosomas. Las

condensinas son fosforiladas por las proteínas quinasas Cdc2.


215

CAPÍTULO OCTAVO:

La Organización de los Genomas Celulares


216

LLAA OORRGGAANNIIZZAACCIIÓÓNN DDEE LLOOSS GGEENNOOMMAASS CCEELLUULLAARREESS

Como material genético, el ADN, constituye una especie de anteproyecto que dirige

todas las actividades celulares y especifica el plan de desarrollo de los organismos

multicelulares.

La complejidad y el tamaño de los genomas eucarióticos son mayores que la de los

procariotas. Este mayor tamaño de los genomas eucarióticos no debería sorprendernos

ya que sería de esperar que organismos más complejos posean más genes. Sin embargo,

el tamaño del genoma de muchos eucariotas no parece estar relacionado con la

complejidad genética. Por ejemplo, los genomas de las salamandras y de las lilas

contienen más de 10 veces la cantidad de ADN que el genoma humano.

Esta aparente paradoja fue resuelta por el descubrimiento que el genoma de la mayoría

de los eucariotas posee no sólo genes funcionales sino también gran cantidad de

secuencias de ADN que no codifican proteínas. Así, la diferencia entre el genoma

humano y el de la salamandra refleja que esta última posee mayor cantidad de ADN no

codificante que el humano. La presencia de grandes cantidades de secuencias no

codificantes es una propiedad general de los genomas de los eucariotas complejos.

Se ha establecido que el genoma humano contiene alrededor de 30.000 genes, sólo 7,5

veces más que el de E. coli. Mucha de la complejidad de los genomas eucariotas es el

resultado de la abundancia de varios tipos diferentes de secuencias no codificantes que

constituyen la mayoría del ADN de las células eucariotas superiores.

FAMILIAS DE GENES Y PSEUDOGENES

Otro factor que contribuye al mayor tamaño de los genomas eucariotas es que algunos

genes se repiten muchas veces, mientras que la mayoría de los genes procariotas están

representados una vez en el genoma. Así, muchos genes eucariotas están presentes en

múltiples copias, denominadas familias de genes. En algunos casos se requieren

múltiples copias para producir ARNs o proteínas en grandes cantidades, tales como los

ARNs ribosomales o las histonas. En otros casos, diferentes miembros de estas familias

son transcriptos en diferentes tejidos o en diferentes momentos del desarrollo. Por

ejemplo, las subunidades α– y β– de la hemoglobina son ambas codificadas por una

familia de genes en el genoma humano, siendo expresados diferentes miembros de esta


217

familia en los diferentes estadios del desarrollo (ver figura). Los miembros de muchas

familias de genes (por ejemplo, los genes de la globina) están agrupados dentro de una

región del ADN, mientras que otras familias se encuentran dispersas en diferentes

cromosomas.

Se piensa que las familias de genes se originan por duplicación de un gen ancestral

original, con diferentes miembros de la familia divergiendo luego como consecuencia de

mutaciones durante la evolución. Tal divergencia, pudo llevar a la evolución de proteínas

relacionadas, que están optimizadas para funcionar en diferentes tejidos o en

diferentes estadios del desarrollo. Por ejemplo, las globinas fetales tienen mayor

afinidad por el oxígeno que las adultas, una diferencia que le permite al feto obtener

oxígeno de la circulación fetal.

Sin embargo, como puede esperarse, no todas las mutaciones aumentan la función

génica. Algunas copias de genes han resultado en la pérdida de la capacidad de producir

un gen funcional. Por ejemplo, las familias de las globinas α– y β– humanas contienen

cada una genes que han sido inactivados por mutaciones. Tales copias de genes no

funcionales, denominadas pseudogenes, representan relictos evolutivos que

incrementan significativamente el tamaño de los genomas eucarióticos sin conferirle,

aparentemente, una contribución genética funcional.

SECUENCIAS REPETITIVAS DE ADN

Una porción importante del ADN de los genomas eucariotas consiste de secuencias de

ADN altamente repetitivas no codificantes. Estas secuencias, algunas veces presentes en

cientos de miles de copias por genoma, fueron primero demostradas por Roy Britten y

David Kohne durante sus estudios de la tasa de reasociación de fragmentos de ADN

celular desnaturalizados. Las hebras desnaturalizadas de ADN hibridan una con otra

(reasociación), restableciendo la estructura de Watson & Crik de las moléculas de ADN.

Ya que la reasociación del ADN es una reacción bimolecular (dos hebras separadas de

ADN desnaturalizadas deben contactar una con otra para hibridar), la tasa de

reasociación depende de la concentración de las hebras de ADN. Cuando los fragmentos

de ADN de E. coli se desnaturalizan y se permite su hibridación, la reasociación se

produce a la misma tasa, como es de esperar si cada secuencia se encontrase


218

representada una vez en cada genoma. Sin embargo, la reasociación de los fragmentos

de ADN extraídos de células de mamíferos, mostraron un patrón muy diferente.

Aproximadamente el 60% de los fragmentos de ADN se reasociaron a la tasa esperada

para secuencias representadas una vez por genoma, mientras que el porcentaje restante

lo hizo mas rápidamente que lo esperado. La interpretación de estos resultados, fue que

algunas secuencias están presentes en múltiples copias y éstas se reasociaron más

rápidamente que aquellas que están representadas una vez por genoma. En particular,

estos experimentos demostraron que el 40% del ADN de los mamíferos consiste de

secuencias altamente repetitivas, algunas de las cuales están repetidas 105 a 106 veces.

Análisis más profundos permitieron identificar varios tipos de secuencias altamente

repetitivas. La clase denominada ADN de secuencia simple, contiene arreglos en tándem

de miles de copias de secuencia simple, de 5 a 200 nucleótidos. Por ejemplo, un tipo de

secuencia simple de ADN en Drosophila consiste de repeticiones en tándem de las

unidades de siete nucleótidos ACAAACT. Debido a su composición de bases diferentes

del resto del ADN genómico muchas secuencias de bases simples pueden ser separadas

del resto del genoma por centrifugación en gradientes de densidad de CsCl. La densidad

del ADN está determinada por su composición de bases siendo las secuencias ricas en

timina–adenina menos densas que las secuencias ricas en C–G. Por lo tanto, una

secuencia simple rica en A – T se ubica en una banda de menor densidad que el grueso

del ADN genómico de Drosophila. Ya que estas secuencias repetitivas de ADN forman

bandas como “satélites” separadas de la banda de ADN principal, a menudo se las

refiere como ADN satélite. Estas secuencias están repetidas millones de veces por

genoma constituyendo entre el 10 y el 20% del ADN de la mayoría de las células

eucariotas superiores. Los ADNs de secuencia simple no son transcribibles y no llevan

información genética funcional. Sin embargo, pueden jugar importantes roles en la

estructura de los cromosomas.

Otras secuencias de ADN repetitivas están esparcidas por el genoma, en lugar de estar

agrupadas como repeticiones en tándem. Estas secuencias se clasifican SINEs (short

interspersed elements) o LINEs (long intersperted elements). Los principales SINEs de los

genomas de mamíferos son las secuencias Alu, llamadas así porque usualmente

contienen un sitio simple para la endonucleasa de restricción AluI. Las secuencias Alu


219

tienen aproximadamente 300 bases de longitud, y cerca de un millón de tales secuencias

están dispersas a través del genoma, contabilizando cerca del 10% del total del ADN

celular. Aunque las secuencias Alu se transcriben en ARN, no codifican proteínas y su

función es desconocida. Los principales LINEs humanos, (que pertenecen a la familia LINE

1 o L1) son alrededor de 6000 pares de bases de longitud, repetidos aproximadamente

50.000 veces en el genoma. Las secuencias L1 son transcriptas y al menos algunas de

ellas codifican proteínas, pero tal como ocurre con las secuencias Alu aún no se les ha

encontrado una función en la fisiología celular. Tanto las secuencias Alu como las L1 son

ejemplos de elementos transportables, capaces de moverse a diferentes sitios en el

ADN genómico. Algunas de estas secuencias podrían ayudar a regular la expresión

génica, pero la mayoría de las secuencias Alu y L1 no parecen tener una contribución útil

a las células. Sin embargo, se considera que estas secuencias pudieron jugar un rol

evolutivo importante contribuyendo a la generación de diversidad genética.

EL NÚMERO DE GENES EN LAS CÉLULAS EUCARIOTAS

Este punto ha quedado desactualizado, se propone ver los artículos: “What If There Are

only 30,000 Human Genes”, by Jean Michael Claverie. Science vol., 291 pp. 1255‐1257

(2001) & “The Sequence of the Human Genome”, by Venter J. C. et al., vol., 291 pp.

1304‐1351 (2001).

Habiendo discutido varios tipos de ADNs no codificantes que contribuyen a la

complejidad de los genomas de eucariotas superiores, es interesante considerar el

número total de genes de los genomas eucariotas.

CCRROOMMOOSSOOMMAASS YY CCRROOMMAATTIINNAA

No sólo los cromosomas de la mayoría de los eucariotas son más complejos que los de

los procariotas, sino que el ADN de las células eucariotas está organizado de forma

diferente que el de las procariotas. Los genomas de las células procariotas están

contenidos en cromosomas simples, que usualmente son moléculas circulares de ADN.

En contraste, el genoma de los eucariotas está compuesto de múltiples cromosomas,

cada uno de los cuales contiene una molécula lineal de ADN. A pesar de que el número

y tamaño de los cromosomas varía considerablemente entre diferentes especies, su

estructura básica es la misma en todas las células eucariotas. El ADN de las células


220

eucariotas está firmemente unido a pequeñas proteínas básicas denominadas histonas

las que permiten el empaquetamiento del ADN en una forma ordenada en el núcleo

celular. Esta tarea es esencial dado el contenido de ADN de la mayoría de los eucariotas.

Por ejemplo, la longitud total del ADN de una célula completamente extendido es de 2

m, pero este ADN puede acomodarse en un núcleo de sólo 5 a 10 μm de diámetro. A

pesar de que el empaquetamiento del ADN es un problema también para las bacterias,

el mecanismo por el que el ADN procariota está empaquetado es diferente y aún no

comprendido completamente.

CROMATINA

Los complejos formados entre el ADN eucariótico y las proteínas se denomina

cromatina. Estos contienen aproximadamente dos veces la cantidad de proteínas en

relación al ADN. Las principales proteínas presentes en la cromatina son las histonas –

pequeñas proteínas básicas que contienen una alta proporción de aminoácidos básicos

(arginina y lisina) que facilitan su unión a la molécula de ADN, negativamente cargada–.

Hay cinco tipos principales de histonas denominadas HH11,, HH22AA,, HH22BB,, HH33 YY HH44, los que son

muy similares entre las diferentes especies de eucariotas. Estas histonas son proteínas

extremadamente abundantes en las células eucariotas, siendo su masa

aproximadamente igual a la del ADN de la célula. La cromatina contiene además una

masa aproximadamente igual a la de histonas de una amplia variedad de proteínas

cromosómicas no–histónicas. Hay más de un

millar de diferentes tipos de estas proteínas,

las que están involucradas en un rango de

actividades incluyendo la replicación del ADN y

la expresión de los genes. Las histonas no se

encuentran en las eubacterias (como E. coli)

pero el ADN de estas bacterias está asociado a

proteínas que probablemente funcionen en

forma similar a las histonas. Las arquibacterias (Archaea), sin embargo, poseen histonas

que empaquetan su ADN en estructuras similares a la cromatina eucariótica.

ARN10%

ADN

PROTEÍNA2 x ADN

MASA DECROMATINA

HMG

HISTONAS


221

La base estructural de la unidad de la cromatina, el nucleosoma, fue descripto en 1974

por Roger Kornberg. Este investigador fue

llevado a la propuesta del modelo

nucleosomal por dos serie de

experimentos llevados a cabo con

nucleasa microccocal, (una enzima que

degrada ADN) que se observó producía

fragmentos de aproximadamente 200 pb

de longitud. En contraste una digestión de

ADN desnudo producía una “chorreada” continua de fragmentos aleatorios de ADN.

Estos resultados sugirieron que las

proteínas unidas al ADN protegían al ADN

de la digestión de nucleasas, de tal forma

que el ADN podía ser atacado en sitios

separados por distancias de

aproximadamente 200 pb. Consistente

con esta noción el MET reveló que las

fibras de cromatina poseen una estructura

en forma de rosario, cuyas cuentas están

espaciadas cada 200 pb. Estas estructuras repetitivas (~ cada 200 pb) se denominaron

nucleosomas.

Niveles de Empaquetamiento de la Cromatina

1° nivel ~ 6

2° nivel ~ 40

En mitosis ~ 10.000

3 ° nivel ~ 1.000

El ADN se Enrolla en una Serie de Nucleosomas

• La nucleasa microcócica digiere la cromatina• La jerarquía microcócica se genera cuando

sólo ~2% del ADN del núcleo es soluble en ácido

• Se establecen series multiméricas

605pb 205pb405pb

> del 90% del ADN ~ 200 ± 5 pbSeparación en Gel de Agarosa

La Fibra de 10 nm en estado desplegado


222

Una digestión de la cromatina más extensiva

con nucleasa microccocal produce partículas

(partículas centrales de nucleosomas) que se

corresponden con las cuentas visibles por ME. El

análisis detallado de estas partículas ha

mostrado que contienen 146 pb de ADN que

envuelven 1,65 veces alrededor de un centro

histónico cada uno de los cuales consiste de dos moléculas de cada una de las: H2A,

H2B, H3 y H4 (el corazón histónico). Una molécula de la quinta histona H1, está unida al

ADN, a la entrada de cada partícula de los corazones de nucleosomales. Esta forma una

subunidad de cromatina conocida como cromatosoma, que consiste de 166 pares de

bases de ADN envolviendo al corazón histónico mantenidos en su lugar por la H1

(histona linker).

El empaquetamiento del ADN con las histonas produce una fibra cromatínica de 10 nm

de diámetro que está compuesta de cromatosomas separados por segmentos linkers de

aproximadamente 80 pb de longitud en promedio. Por ME, esta fibra posee una

apariencia de rosario que sugiere el modelo nucleosomal. Este empaquetamiento del

ADN produce un acortamiento de aproximadamente seis veces. La cromatina puede

espiralarse a su vez en fibras de 30 nm, cuya estructura aún debe dilucidarse. La

interacción de las moléculas de H1 parece jugar un rol importante en este segundo

estado de condensación cromatínica.

La extensión de la condensación de la

cromatina varía durante el ciclo de vida de las

células.

En las células interfásicas, la mayoría de la

cromatina (eucromatina), está relativamente

descondensada y distribuida a través del

núcleo. Durante este período del ciclo celular, los genes son transcriptos y el ADN se

replica en preparación de la división celular. Durante este período del ciclo celular, los

genes son transcriptos y el ADN es replicado. La mayoría de la eucromatina en el núcleo

1°, 2° y 3° NIVEL DE ORGANIZACIÓN

La Fibra de 30 nm


223

interfásico parece estar en la forma de fibras de 30 nm, organizada en grandes lazos que

contienen aproximadamente 50 a 100 kb de ADN. Aproximadamente el 10% de la

eucromatina, que contiene genes que se transcriben activamente, está en un estado

más descondensado (la conformación de 10 nm) permitiendo la transcripción. La

estructura de la cromatina está íntimamente ligada al control de la expresión de los

genes en eucariotas.

En contraste con la eucromatina, un 10% de la cromatina interfásica denominada

heterocromatina, constituye un estado altamente condensado que recuerda a la

cromatina de las células en división. La heterocromatina es transcripcionalmente

inactiva y contienen secuencias de ADN

altamente repetidas, como las que se

presentan en telómeros y centrómeros.

Conforme la célula entra en mitosis, sus

cromosomas se tornan altamente

condensados de tal manera que pueden ser

distribuidos en las células hijas. Los lazos de

30 nm de las fibras cromatínicas, se pliegan

sobre si mismos para formar los cromosomas metafásicos de las células mitóticas, en los

que el ADN se ha condensado cerca de 10.000 veces. Esta cromatina condensada no

puede usarse para la síntesis de ARN, por lo que la transcripción cesa durante la mitosis.

Las micrografias electrónicas indican que el ADN en los cromosomas metafásicos están

organizados en grandes lazos (o loops) anclados a un andamiaje proteíco, pero aún

persiste mucho desconocimiento acerca de la estructura detallada de esta cromatina

altamente condensada y del mecanismo de condensación cromatínica.

Los cromosomas metafásicos están tan altamente condensados que su estructura puede

ser estudiada usando el microscopio óptico. Varias técnicas de tinción producen

patrones de bandas alternantes claras y oscuras que resultan de la unión preferencial de

colorantes fluorescentes por secuencias ricas en A = T versus CΞG. Estas bandas son

específicas de cada cromosoma y parecen representar distintas regiones cromosómicas.

Los genes pueden ser localizados en bandas cromosómicas específicas por hibridación in

Modelo de la Estructura de losCromosomas


224

situ, indicando que el proceso de empaquetamiento es altamente ordenado y

reproducible.

CCEENNTTRRÓÓMMEERROOSS

El centrómero es una región especializada del cromosoma que juega un rol crítico

asegurando la correcta distribución de los cromosomas duplicados en las células hijas. El

ADN celular es replicado durante la interfase resultando en la formación de dos copias

de cada cromosoma previo al comienzo de la mitosis. Conforme las células entran en

mitosis, la condensación de la cromatina, lleva a la formación de cromosomas

metafásicos que consisten de dos cromátidas hijas idénticas. Estas cromátidas se

mantienen unidas por los centrómeros, los que se observan como una región

cromosomal constreñida. Conforme transcurre la mitosis, los microtúbulos del huso se

unen al centrómero y las dos cromátidas hijas se separan y mueven hacia los polos

opuestos del huso. Al final de la mitosis se forma nuevamente la membrana nuclear y los

cromosomas se descondensan, resultando en la formación de los núcleos hijos que

contienen cada uno una copia de cada cromosoma parental. Así los centrómeros actúan

como los sitios de asociación de las cromátidas hijas y como los sitios de anclaje de los

cromosomas al huso mitótico. Los centrómeros consisten de secuencias específicas de

ADN a los que se unen varias proteínas centroméricas formando una estructura

especializada llamada el cinetocoro La unión de los microtúbulos a las proteínas del

cinetocoro median el anclaje de los cromosomas al huso. Las proteínas asociadas con el

cinetocoro actúan como motores moleculares que conducen los movimientos de los

cromosomas a lo largo de las fibras del huso, segregando los cromosomas a los núcleos

hijos.

Las secuencias de ADN centromérico han sido bien definidas en levaduras, donde su

función pudo ser ensayada con el seguimiento de los plásmidos durante la mitosis. Los

plásmidos que contienen centrómeros funcionales se segregan como los cromosomas y

son distribuidos en forma equitativa a las células hijas durante la mitosis. En ausencia de

un centrómero funcional, sin embargo, los plásmidos no se separan correctamente, y

muchas células hijas fallan en heredar el ADN de los plásmidos. Ensayos de este tipo han

permitido determinar las secuencias requeridas para la función centromérica. Tales


225

experimentos mostraron, que las secuencias centroméricas de los Saccharomyses

cereviceae contienen aproximadamente 125 pb consistentes de tres elementos: dos

cortos de 8 y 25 pares de bases separados por ADN muy rico en secuencias AT de 78–86

pb. Esta estructura centromérica corta de S. cereviceae no parece reflejar la estructura

de los eucariotas en general. Estudios recientes han permitido definir el centrómero de

fisión de la levadura Schizosaccharomyses pombe por medio de un método similar. S.

pombe, es muy diferente de S. cereviceae en muchos aspectos. Los centrómeros de esta

especie, comprenden 40 a 100 kb de ADN. Consisten de cuerpo central de 4 a 7 kb de

ADN de copia simple flanqueado por secuencias repetitivas. Ambos tipos de secuencia

se requieren para la función de los centrómeros.

Los estudios de los cromosomas de Drosophila han provisto la primera caracterización

de los cromosomas de eucariotas superiores. Estos centrómeros están comprendidos

por 420 pb. Muchos de los cuales (más del 85%) consiste de dos ADNs satélites

altamente repetitivos con las secuencias AATAT y AAGAG. El remanente del centrómero

consiste de elementos transponibles que se encuentran también en otros sitios del

genoma de Drosophila, además de una región no repetitiva de ADN rico en AT. La

supresión de las secuencias satélite, los elementos transponibles, así como los

elementos no–repetitivos reducen la actividad de los centrómeros en los ensayos

funcionales. Ambas regiones parecen contribuir a la formación y la función de los

centrómeros.

Los centrómeros de humanos y otros mamíferos, aún no han sido definidos por estudios

funcionales, pero han sido identificados por la unión de proteínas asociadas a

centrómeros. Los centrómeros de mamíferos se caracterizan por extensas regiones de

heterocromatina que consiste de secuencias de ADN satélite altamente repetitivas. En

humanos y otros primates la secuencia centromérica primaria es el ADN satélite‐α, que

es una secuencia de 171 pares de bases arregladas en repeticiones en tándem que

comprenden millones de pares de bases. El ADN satélite‐α parece jugar un rol en la

estructura y función centromérica, ya que se ha encontrado que se une a las proteínas

asociadas al centrómero. Sin embargo, su función y los potenciales roles de otras

secuencias en la centrómeros de mamíferos deben ser establecidos. Consistente con su

gran tamaño, los centrómeros de los mamíferos forman grandes cinetocoros, que unen


226

30 a 40 microtúbulos, mientras que sólo microtúbulos simples son unidos en S.

cereviceae.

TTEELLÓÓMMEERROOSS

La secuencia de los extremos de los cromosomas eucarióticos se denominan telómeros.

Estos juegan un rol muy importante en la replicación y mantenimiento de los

cromosomas. Los telómeros fueron reconocidos como estructuras distintivas ya que los

cromosomas rotos eran altamente inestables en las células eucariotas, implicando que

se requieren secuencias específicas en los extremos cromosómicos normales. Esto fue

subsecuentemente demostrado en experimentos en los que los telómeros del protozoo

Tetrahymena fueron agregados a los extremos de moléculas lineales del ADN de

plásmidos de levaduras. La adición de estas secuencias de ADN telomérico les permite a

estos plásmidos replicarse como moléculas similares a cromosomas lineales en

levaduras, demostrando directamente que los telómeros son necesarios para la

replicación de moléculas lineares de ADN.

Las secuencias lineales de ADN de varios eucariotas son similares, consistiendo de

repeticiones de ADN de secuencia simple que contienen grupos de residuos de G sobre

una hebra (Tabla 1).

TTAABBLLAA 11:: AADDNNSS TTEELLOOMMÉÉRRIICCOOSS ORGANISMOS REPETICIÓN DE SECUENCIAS TELOMÉRICAS LLEEVVAADDUURRAASS Saccharomyses cereviceae Schizosaccharomyces pombe

G1‐3AT G2‐5TTAC

PPRROOTTOOZZOOOOSS Tetrahymena Dictyostelium

GGGGTT G1‐8ª

VVEEGGEETTAALLEESS Arabidopsis AGGGTTT MMAAMMÍÍFFEERROOSS Homo sapiens sapiens AGGGTT

Por ejemplo, la secuencia de repeticiones de telómeros en humanos y otros mamíferos

es AGGGTT, y las repeticiones en Tetrahymena es GGGGTT, Estas secuencias se repiten

cientos a miles de veces comprendiendo varias quilobases y finalizan con una saliente de

ADN de hebra simple. Los resultados más recientes sugieren que las secuencias


227

teloméricas repetidas de ADN forman lazos en los extremos de los cromosomas,

protegiéndolos de su degradación (Figura).

Los telómeros juegan un rol crítico en la replicación de los extremos de las moléculas

lineales de ADN. La ADN polimerasa es capaz de extender una cadena de ADN creciente

pero no puede iniciar la cadena en el extremo de una molécula de ADN lineal. En

consecuencia, los extremos de los cromosomas lineales no pueden ser replicados por la

acción normal de la ADN polimerasa. Este problema ha sido solucionado por la evolución

de un mecanismo especial que involucra la actividad de la transcriptasa reversa para

replicar las secuencias de ADN teloméricas. El mantenimiento de telómeros parece ser

un factor importante en la determinación de vida y la capacidad reproductiva de las

células. Así, los estudios de los telómeros y las telomerasas prometen la provisión de

nuevos conocimientos en envejecimiento y cáncer.


228

CAPÍTULO NOVENO:

Replicación Celular en Eucariotas


229

REPLICACIÓN DEL ADN EN EUCARIOTAS

La replicación es un proceso semiconservativo en el que cada hebra parental actúa como

molde para la síntesis de una nueva hebra hija complementaria. La enzima central

involucrada es la ADN polimerasa, que cataliza la incorporación de

desoxirribonucleótidos trifosfato–5’ (dNTPs) para la formación de la cadena creciente de

ADN. Sin embargo, el proceso es mucho más complejo que una simple reacción

enzimática, ya que se requieren otras proteínas y mecanismos de corrección para

asegurar la adecuada replicación con la baja frecuencia de errores necesarios para la

reproducción celular. Es por ello, que son necesarias proteínas adicionales y secuencias

específicas de ADN para iniciar la replicación y para la copia de los extremos de los

cromosomas eucarióticos.

ADN POLIMERASAS

Estas enzimas fueron descubiertas por A. Kornberg en 1956. La primera ADN polimerasa

purificada en E. coli, se denominó ADN polimerasa I. Posteriormente se aislaron dos

ADN polimerasas (denominadas II y III). Las polimerasas I y III son las realmente

necesarias para la replicación de las E. coli.

Las células eucariotas poseen 5 ADNs polimerasas, a saber: “α”, “β”, “δ”, “ε” y “γ”. La

ADN polimerasa γ se encuentra en las mitocondrias y es responsable de la replicación

del ADN mitocondrial. Las otras cuatro están localizadas en el núcleo. Las polimerasas α,

δ y ε son las más activas en las células en división y la polimerasa β es más activa en

células que no se están dividiendo, sugiriendo una función en la reparación del ADN

dañado.

En las eucariotas las polimerasas α y δ parecen ser suficientes para la replicación tanto

in vitro, como in vivo en levaduras mientras que el rol de la polimerasa ε aún debe ser

determinado.

Propiedades fundamentales de las ADNs polimerasas:

• Las ADN polimerasas sólo sintetizan ADN en la dirección 5’→3’ agregando los


230

dNTP al grupo hidroxilo 3’ de una cadena creciente de ADN.

• Las ADN polimerasas sólo pueden agregar un nuevo desoxirribonucleótido a una

nueva hebra, cuyo último nucleótido está unido por un puente hidrógeno al

nucleótido complementario de la hebra molde. No pueden iniciar la síntesis de

novo catalizando la polimerización de dNTPs libres. En este sentido las ADN

polimerasas son diferentes a las ARN polimerasas.

LA HORQUILLA DE REPLICACIÓN

J. Cairns fue el primero en analizar el proceso de replicación en experimentos con E. coli,

usando timidina radiomarcada. Las moléculas de ADN poseen dos horquillas de

replicación, y por cada horquilla de hebra parental separada, se sintetizan dos nuevas

hebras de ADN. Esto representaba un problema, ya que las dos hebras corren en sentido

antiparalelo y la ADN polimerasa sólo cataliza la polimerización de dNTPs en la dirección

5’ a 3’. Este enigma fue resuelto por experimentos que muestran que sólo una hebra de

ADN se sintetiza en forma continua mientras que la otra lo hace como piezas

discontinuas pequeñas que se sintetizan en dirección opuesta al movimiento de la

horquilla de replicación. Estas pequeñas hebras de ADN sintetizadas (denominadas

Fragmentos de Okazaki) se unen por la acción de la ADN ligasa, formando una nueva

hebra de ADN intacta. La hebra que se sintetiza continuamente se denomina la hebra

líder o conductora ya que su elongación en la dirección del movimiento de la horquilla

de replicación, expone el molde usado para la síntesis de los fragmentos de Okazaki (la

hebra rezagada). Pese a que el descubrimiento de la síntesis discontinua de la hebra

rezagada permitió postular un mecanismo para la elongación de las dos hebras de ADN

en la horquilla de replicación, permaneció obscura otra cuestión: ya que la ADN

polimerasa requiere de un cebador y no puede iniciarse la síntesis de novo, ¿cómo se

inicia la síntesis de los fragmentos de Okazaki? La respuesta es que los fragmentos

cortos de ARN actúan como primers para la replicación de ADN. En contraste a la síntesis

de ADN, la síntesis de ARN puede iniciar la síntesis de novo, y una enzima llamada

primasa sintetiza fragmentos cortos de ARN (de tres a diez nucleótidos de longitud)

complementarios a la hebra molde rezagada en la horquilla de replicación. Así, los

fragmentos de Okazaki son sintetizados vía la extensión de estos primers de ARN por la


231

ADN polimerasa. Una consecuencia importante es que estos ARNs contienen uniones

ADN ‐ ARN lo que provee una evidencia crítica para el rol de los primers ARN en la

replicación del ADN.

Para formar la hebra de ADN rezagada continua, los primers deben ser removidos de los

fragmentos de Okazaki y se reemplazan con ADN.

En E. coli los primers de ARN se remueven con la acción combinada de la ARNasa H, una

enzima que degrada el ARN de los híbridos ADN‐ARN y la polimerasa I que posee

actividad de exonucleasa que puede hidrolizar ADN (o ARN) tanto en la dirección 3’ a 5’

como 5’ a 3’. En eucariotas el rol de la polimerasa I es realizado por otras exonucleasas,

removiendo primers y las interrupciones entre los fragmentos de Okazaki se llenan por

la acción de la polimerasa‐δ. Como en procariotas, los fragmentos de ADN se unen

mediante la ADN ligasa.

En las células eucariotas se requieren dos polimerasas para realizar la tarea de la

polimerasa III de procariotas. La polimerasa‐α se encuentra formando un complejo con

la primasa y ambas parecen actuar conjuntamente para sintetizar los cortos fragmentos

de ARN‐ADN durante la síntesis de la hebra rezagada. La polimerasa δ luego puede

sintetizar ambas hebras actuando en la extensión de los primers inicialmente

sintetizados por el complejo primasa‐polimerasa‐α. Adicionalmente la polimerasa δ

puede tomar el lugar de la polimerasa I en el llenado de las interrupciones entre los

fragmentos de Okazaki luego de la remoción de los primers de ARN.

Además de las polimerasas y la primasa, otras enzimas actúan en la horquilla de

replicación. Una clase de proteínas se une a la ADN polimerasa provocando su unión al

ADN patrón de tal manera que continúe la síntesis de una nueva hebra de ADN. Tanto la

ADN polimerasa III de E. coli como la ADN polimerasa δ de eucariotas están asociadas a

dos tipos de proteínas accesorias [sliding–clamp proteins {proteínas abrazaderas de

deslizamiento} & clamp loading proteins {proteínas abrazaderas de montaje}] que

acoplan la polimerasa sobre el primer y mantienen su asociación estable con el molde.

Otras proteínas provocan el desenrollamiento el ADN y estabilizan las regiones de hebra

simple. Las helicasas son enzimas que catalizan el desenrollamiento de la doble hebra


232

del ADN parental acoplado a la hidrólisis del ATP, adelantándose a la horquilla de

replicación

Las proteínas de unión a ADN de hebra simple, [FACTOR DE REPLICACIÓN A (RFA) de

eucariotas] estabilizan luego la hebra desenrollada manteniéndolo en forma extendida

para ser replicado por las ADN polimerasas.

Conforme se produce el desenrollamiento del ADN parental, el ADN por delante de la

horquilla de replicación es forzado a rotar. Esta rotación podría causar que las moléculas

de ADN circular se retuerzan sobre sí mismos, bloqueando su replicación. Este problema

es solucionado por las topoisomerasas, enzimas que catalizan la ruptura y la reunión

reversible de la hebra de ADN. Hay dos tipos de topoisomerasas: las topoisomerasas tipo

I rompen sólo una hebra de ADN, las topoisomerasas tipo II introducen rupturas

simultáneas en ambas hebras. Las rupturas introducidas por las topoisomerasas I y II

actúan como pivote que permiten a las dos hebras de ADN molde rotar libremente una

alrededor de la otra sin que se produzca retorcimiento del ADN por delante de la

horquilla. Aunque los cromosomas eucariotas están compuestos por ADN lineal, su

replicación también requiere topoisomerasas, de otra forma los cromosomas tendrían

que rotar continuamente durante su síntesis.

Las enzimas involucradas en la replicación de ADN actúan en forma coordinada para

sintetizar ambas hebras de ADN (líder y rezagada) simultáneamente en la horquilla de

replicación. Esta tarea es realizada por la formación de dímeros de ADN polimerasa

(polimerasa III en E. coli o polimerasa δ en eucariotas), cada una de ellas con sus

respectivas proteínas accesorias. Una molécula de polimerasa actúa en la síntesis de la

hebra líder mientras la otra lo hace sobre la hebra rezagada. Se cree que la hebra

rezagada molde forma un lazo en la horquilla de replicación de tal manera que la

subunidad de la síntesis sobre esta hebra se mueve en la misma dirección que la otra

subunidad, que está sintetizando la hebra líder.

El Origen y la Iniciación del Proceso de Replicación:

La replicación tanto del ADN procariota como el eucariota comienzan en una secuencia

única llamada origen de replicación, que actúa como sitio de unión específico para las


233

proteínas que inician el proceso. El primer origen definido fue el de E. coli, en el que el

análisis genético indicó que la replicación siempre comienza en un sitio del cromosoma

bacteriano. El origen de E. coli consiste de 245 pares de bases de la secuencia de ADN,

elementos que actúan como sitios de unión de las proteínas que inician su replicación. El

paso clave, es la unión de una proteína, a secuencias específicas de ADN dentro del

origen. La proteína iniciadora comienza a desenrollar el origen del ADN y recluta a las

otras proteínas involucradas en la síntesis de ADN. La helicasa y las proteínas de unión a

ADN de hebra simple actúan luego continuando el desenrollamiento y exponiendo el

molde de ADN, y la primasa inicia la síntesis de la hebra líder.

Aunque en las bacterias es suficiente un origen de replicación, en los genomas

eucariotas es necesario que se produzcan múltiples sitios de replicación. Los orígenes de

replicación en las células de mamíferos están espaciados cada 50 a 300 kb así el genoma

humano tiene cerca de 30.000 orígenes de replicación.

Los orígenes de replicación mejor estudiados son los de las levaduras. Las secuencias se

denominan ARSs (del inglés: autonomously replicating sequences), Los elementos ARSs

funcionales comprenden cerca de 100 pares de bases, incluyendo un centro de 11 pares

de bases común a diferentes ARSs. Esta secuencia centro es esencial para la función de

los ARS y se encontró que es el sitio de unión de un complejo proteínico llamado ORC

(del inglés: origin replication complex) que es requerido para la iniciación de la

replicación del ADN. El complejo ORC parece reclutar a otras proteínas (incluyendo la

ADN helicasa) en el origen e iniciando el proceso de replicación.

Telómeros y Telomerasas: Replicación en el extremo de los cromosomas

Ya que la ADN polimerasa sólo extiende primers en la dirección 5’ a 3’, estas enzimas son

incapaces de extender los extremos 5’ de las moléculas lineales de ADN. En

consecuencia, se requieren mecanismos especiales para replicar las secuencias

terminales de los cromosomas lineales de las células eucariotas. Estas secuencias

(telómeros) son repeticiones en tándem de moléculas de ADN simple. Ellas son

replicadas por la acción de una enzima única denominada telomerasa, que es capaz de

mantener los telómeros catalizando su síntesis en la ausencia de un ADN molde.

La telomerasa es una transcriptasa reversa, un tipo de ADN polimerasa descubierta


234

originalmente en retrovirus que sintetizan ADN a partir de un molde de ARN. Un hecho

importante es que la telomerasa porta su propio ARN molde, que es complementario a

las secuencias teloméricas repetitivas como parte de los complejos enzimáticos. El uso

de estos ARN como molde, permite a la telomerasa generar múltiples copias de las

secuencias repetitivas manteniendo así telómeros en ausencia de un molde de ADN

convencional para dirigir su síntesis.

El mecanismo de acción de la telomerasa fue dilucidado en 1985 por Carol Greider y

Elizabeth Blackburn estudiando el protozoo Tetrahymena. La telomerasa de

Tetrahymena está formando un complejo con un primer de ARN de 159 nucleótidos de

extensión que incluye la secuencia 3’–AACCCCAAC–5’ Esta secuencia es complementaria

a la secuencia telomérica repetitiva de Tetrahymena (5’ –CCGGGG– 3’) y actúa como

molde del ADN telomérico. El uso de este ARN como molde permite a la telomerasa

extender el extremo 3’ del ADN cromosómico por una unidad de repetición más allá de

su longitud original. La hebra complementaria puede ser luego sintetizada por el

complejo polimerasa α – primasa usando el cebado (priming) convencional con ARN. La

remoción de los primers ARN lleva a una saliente de los extremos 3’ del ADN

cromosómico el que puede formar lazos en los extremos de los cromosomas eucariotas.

La telomerasa ha sido identificada en una gran variedad de eucariotas, y los genes que

codifican el ARN de la telomerasa han sido clonados en Tetrahyemena, levaduras,

ratones y humanos. En cada caso, la ARN telomerasa contiene secuencias

complementarias con las secuencias repetitivas de estos organismos. Sin embargo, la

introducción de genes de ARNs telomerasas mutantes en levaduras ha mostrado resultar

en alteraciones correspondientes de las secuencias de las repeticiones teloméricas.

Demostrando directamente la función de la telomerasa en el mantenimiento de los

extremos de los cromosomas eucarióticos.


235

CAPÍTULO DÉCIMO:

Transcripción en Células Eucariotas


236

TRANSCRIPCIÓN EN CÉLULAS EUCARIOTAS

A diferencia de los procariontes, los organismos eucariontes poseen núcleo, por lo que

los procesos biológicos que tienen lugar en la célula van a estar compartimentalizados.

Por ejemplo, la replicación y reparación del ADN tendrán lugar en el núcleo, lugar donde

este ácido nucleico está protegido. La transcripción, por tanto, también tendrá lugar en

el núcleo celular. Sin embargo, la síntesis de proteínas tiene lugar en el citoplasma. Por

otra parte, las células eucariotas sufren el proceso de diferenciación mediante el cual

cada tejido u órgano estará formado por células especializadas. Por todo lo anterior, es

de esperar que haya grandes diferencias entre la síntesis de los ARN procariotas y los

eucariotas, como sucede en realidad.

CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS POLIMERASAS EUCARIOTAS

A diferencia de los organismos procariotas que sintetizan los tres tipos de moléculas de

ARN mediante una sola enzima, la ARN polimerasa ADN dependiente, los eucariontes

poseen tres tipos de polimerasas, también ADN dependientes para transcribir los tres

tipos de genes de clase I, II y III. Las polimerasas eucariotas se conocen como ARN

polimerasa I, II y III y recibieron estos nombres debido a su orden de elución. Las tres se

pueden diferenciar entre sí por su reacción ante la α‐amanitina (Tabla 1). La α‐

amanitina es un octapéptido bicíclico que actúa como un inhibidor diferencial de la

transcripción, muy útil para diferenciar entre las tres polimerasas.

TABLA 1: CARACTERÍSTICAS DE LAS POLIMERASAS EUCARIOTAS

Enzima Localización Actividad

Polimerásica Sensibilidadα‐amanitina

ARN‐PI Nucleolo 50‐70% Ninguna

ARN‐PII Nucleoplasma 20‐40% Alta

ARN‐PIII Nucleoplasma ~10% Específica de especie

Una característica de las tres enzimas es que su producto, en cada caso, necesita ser

procesado o modificado para tornarse funcional, por lo que la ARN‐PI sintetizará pre‐

ARN ribosomales, la ARN‐PII producirá los ARNhn (ARN heterogeneos nucleares) que

después de varios procesos de modificación postranscripcional darán los ARN

mensajeros que servirán de molde en la síntesis de proteínas. Esta enzima es también la


237

encargada de sintetizar los ARNnpq (ARN nucleares pequeños) U1, U2, U4 y U5. Estos

ARNs, unidos a proteínas, formarán las ribonucleoproteínas (RNP) que tomarán parte

activa en el proceso de modificación postranscripcional conocido como splicing o

empalme.

TODAS LAS ARN POLIMERASAS EUCARIOTAS SON GRANDES PROTEÍNAS EN FORMA DE

AGREGADOS DE 500 KDA O MÁS. GENERALMENTE TIENEN DE 8 A 14 SUBUNIDADES. LA ENZIMA

PURA PUEDE LLEVAR A CABO LA TRANSCRIPCIÓN DEL ARN EN DEPENDENCIA DEL MOLDE, PERO

NO PUEDE INICIARLA DE FORMA SELECTIVA EN LOS PROMOTORES. NINGUNA DE LAS ENZIMAS

EUCARIOTAS SE HA PODIDO RECONSTRUIR A PARTIR DE SUS SUBUNIDADES PURAS, LO CUAL POR

SUPUESTO HACE PENSAR SI TODAS LAS SUBUNIDADES SON ESENCIALES.

EL ÚNICO CASO EN EL CUAL TODAS LAS SUBUNIDADES SE HAN DEFINIDO A NIVEL DE LA

CARACTERIZACIÓN DE SUS GENES ES EN EL CASO DE S. CEREVISIAE, EN LA CUAL SE NECESITAN DE

10 A 11 SUBUNIDADES PARA LLEVAR A CABO LA TRANSCRIPCIÓN. LAS TRES SUBUNIDADES

MAYORES DE LA ENZIMA ARN POLIMERASA II DE S. CEREVISIAE TIENEN HOMOLOGÍA CON LAS

SUBUNIDADES DE LA ARN POLIMERASA BACTERIANA. LAS DOS MAYORES PROBABLEMENTE

CONTENGAN EL SITIO CATALÍTICO. TRES DE LAS SUBUNIDADES RESTANTES SON COMUNES A

TODAS LAS ARN POLIMERASAS, O SEA, SON TAMBIÉN COMPONENTES DE LAS ARN POLIMERASAS

I Y III. LAS ACTIVIDADES DE LA ARN POLIMERASA DE LAS MITOCONDRIAS Y LOS CLOROPLASTOS

SON MENORES Y SE ASEMEJAN A LA ARN POLIMERASA BACTERIANA MÁS QUE A CUALQUIERA DE

LAS ENZIMAS NUCLEARES.

Una característica diferencial de las polimerasas eucariotas es que para transcribir el

ADN no se fijan directamente, sino que lo hacen mediante factores proteicos

adicionales. Las proteínas necesarias para la iniciación de la transcripción pero que no

forman parte de la ARN polimerasa como tal, se definen como factores de transcripción.

Muchos factores de transcripción actúan reconociendo sitios activos en cis que se

clasifican como parte de los promotores o como amplificadores (enhancers). Sin

embargo, la unión al ADN no es el único medio de acción de un factor de transcripción.

Un factor puede tanto reconocer a otro factor, como a la ARN polimerasa, o puede estar

incorporado en un complejo de iniciación solamente en presencia de otras proteínas. La

última prueba para ser miembro del aparato de transcripción es funcional: la proteína


238

tendrá que ser absolutamente necesaria para que ocurra la transcripción en un

promotor o grupo de promotores específicos. Por lo tanto, in vivo, la polimerasa

eucariota reconoce un complejo formado por ADN y proteínas y son las interacciones

proteína‐proteína las que priman en las reacciones donde ellas intervienen. Aunque

existen excepciones, en general, múltiples polimerasas transcriben simultáneamente el

mismo gen y su velocidad de síntesis es de aproximadamente un ARN cada 10 segundos.

ALGUNAS CARACTERÍSTICAS DE LA TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIONTES

Una diferencia significativa en la transcripción de los ARNm eucariotas y procariotas es

que la iniciación en un promotor eucariota, implica una gran cantidad de factores que se

unen a una gran variedad de elementos que actúan en cis. El promotor se define como la

región que contiene todos estos sitios de unión, es decir, que puede llevar a cabo la

transcripción con una eficiencia normal y con un control adecuado. Así, la característica

más importante que define al promotor del ARNm eucariota es la localización de sitios

de unión para los factores de transcripción. La propia ARN polimerasa se une alrededor

del punto de inicio pero no hace contacto directo con la región anterior al punto de

iniciación es decir, con el promotor. Por el contrario, los promotores bacterianos se

definen en gran medida, en términos del sitio de unión de la ARN polimerasa en la

vecindad inmediata del punto de inicio. Otras secuencias cercanas regulan al promotor,

pero generalmente se consideran diferentes de éste.

El proceso de transcripción es similar en eucariontes y procariontes; ambos tienen

etapas comunes y cada una de éstas ocurre según reacciones análogas. Sin embargo,

estos procesos se diferencian también en el sitio de síntesis de cada molécula de ARN

como ya hemos visto. También se diferencian, como se ha dicho, en que los ARN

eucariotas deben ser modificados postranscripcionalmente para ser funcionales. El

grado de complejidad de la maquinaria de transcripción también difiere, siendo más

compleja en los eucariontes. Estas diferencias se deben al mayor tamaño del genoma

eucariota y a su organización en una estructura ordenada conocida con el nombre de

cromatina.

La transcripción no es compatible con la estructura empaquetada de la cromatina en los

cromosomas metafásicos. El proceso sólo ocurre cuando la cromatina está en su


239

conformación de "cuentas de collar" (10 nm). El cromosoma debe estar extendido como

en la interfase para que los genes puedan transcribirse. La función esencial de los

cromosomas es servir de matriz para la síntesis de ARN pues es la única forma en que la

información almacenada en el ADN puede ser útil para la célula.

En células de mamíferos sólo el 1% del ADN será ARN‐funcional. Esta selectividad se da

en dos niveles ya que sólo una parte del ADN se transcribe para formar ARNs nucleares y

porque sólo una pequeña proporción de las secuencias de los ARNs nucleares sobrevive

las etapas de maduración del ARN que preceden el tránsito del ARN al citoplasma.

TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES DE CLASE I

CARACTERÍSTICAS DE LA ARN‐POLIMERASA I

Los genes que codifican los ARNr de las dos subunidades grandes y el de la subunidad

pequeña del ribosoma (ARNs: 18S, 5,8S y 25‐28S) se transcriben como un único

precursor policistrónico en ese mismo orden. Estos genes son muy numerosos, variando

entre 10 a 50.000 por célula y no contienen nucleosomas. En la mayoría de los

eucariontes, los genes de ARNr se encuentran formando agrupaciones de 100 a 500

repeticiones. Las unidades que se repiten están separadas entre sí por secuencias

espaciadoras intergénicas que pueden tener desde 2 hasta más de 30 kb. Estos genes

son transcriptos por la ARN‐PI en el nucleolo. En el nucleolo también se encuentran

topoisomerasas, una serie de proteínas específicas, ARN 5S, snRNPs y los ARNr en curso

de maduración. La maduración y la transcripción son simultáneas. Una célula eucariota

tiene ~40.000 moléculas de ARN‐PI, las que parecen exageradas para transcribir 100

genes, pero el precursor del ARNr es grande (6.000 a 15.000 nucleótidos) y ~50 ARN‐PI

pueden transcribir simultáneamente el gen de los ARNr. La transcripción de los genes

ribosomales dura alrededor de tres minutos.

Promotor de la ARN‐PI

El promotor de la ARN polimerasa I se ha caracterizado en células humanas en las cuales

está formado por una secuencia bipartita en la región anterior al punto de inicio. El

promotor central o core rodea el punto de inicio extendiéndose desde ‐45 hasta +20, y

es suficiente para iniciar la transcripción. Sin embargo, su eficiencia se aumenta mucho


240

gracias al elemento de control anterior (UCE: Upstream Control Element).

TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES DE CLASE III

CARACTERÍSTICAS DE LA RNA POLIMERASA III

La ARN‐PIII es una molécula compleja que presenta alrededor de 15 subunidades y una

masa total de 650 kDa. Es la polimerasa encargada de transcribir ARN pequeños no

codificantes, ARNts y el ARNr 5S. Lleva a cabo alrededor del 10% de la transcripción de

los genes eucariotas. Al igual que las otras dos polimerasas eucariotas, la ARN‐PIII

también requiere de factores de transcripción. Los ARN transcriptos por la ARN‐PIII

tienen la particularidad de que no están modificados en el extremo 5' y su base terminal

es casi siempre una purina, en el ARN 5S casi siempre una G.

Promotor de la ARN‐PIII

La ARN polimerasa III reconoce dos clases generales de promotores que son reconocidos

de diferentes maneras por diferentes grupos de factores. Los promotores de los genes

del ARNr 5S y los de los ARNt son internos, están ubicados después del punto de inicio

(downstream). Los promotores de los genes del ARNnpq (small nuclear RNA) están

situados por delante del punto de inicio (upstream) en la manera más convencional de

otros promotores. En ambos casos, los elementos individuales necesarios para que

funcione el promotor consisten exclusivamente en secuencias que son reconocidas por

factores de transcripción, que a su vez, dirigen la unión de la ARN polimerasa.

Hay dos tipos de promotores internos. Cada uno contiene una estructura bipartita en la

cual dos elementos conformados por secuencias cortas están separados por una

secuencia variable. El tipo 1 tiene una secuencia llamada caja A separada de otra

llamada caja C, y el tipo 2 una caja A separada de una caja B. La distancia entre las cajas

A y B en un promotor de tipo 2 puede variar mucho pero las cajas generalmente no se

pueden acercar mucho una a la otra sin eliminar su función.

La región anterior al punto de inicio tiene un rol más importante en la tercera clase de

promotor de la ARN polimerasa III. Hay tres elementos anteriores que también se

encuentran en los promotores de los genes que codifican a los ARNnpq que se

transcriben por la ARN‐ polimerasa II. Los genes de algunos ARNnpqs se transcriben por


241

la RNA polimerasa II, mientras que otros se transcriben por la ARN polimerasa III. Los

elementos anteriores funcionan de manera similar en los promotores de estas dos

polimerasas. Un elemento TATA confiere especificidad según el tipo de polimerasa.

TRANSCRIPCIÓN DE LOS GENES DE CLASE II

LA ARN POLIMERASA II

La ARN polimerasa II tiene ~10 subunidades con una masa de ~500 kDa. La ARN

polimerasa II no puede iniciar la transcripción por sí sola y depende completamente de

factores auxiliares de la transcripción. La enzima, conjuntamente con estos factores

constituye el aparato básico de transcripción, requerido para transcribir cualquier

promotor.

La subunidad mayor de la ARN‐PII posee una estructura única que no se encuentra en

ninguna otra polimerasa; se trata de un dominio poco común en el extremo carboxílico

de la subunidad mayor. Esta estructura se llama CTD (carboxy terminal domain) y está

constituida por repeticiones en tándem de la secuencia consenso heptapeptídica tyr‐ser‐

pro‐treo‐ser‐pro‐ser. La estructura es fosforilable pero no se conoce el porqué, ni su

función. Existen evidencias que indican que cada ciclo de transcripción está asociado con

la fosforilación reversible de CTD. No obstante, se ha diseñado un modelo general en el

cual las interacciones de la ARN‐PII con el promotor están mediadas, al menos en parte,

por la interacción de CTD con los componentes del complejo de preiniciación. La

estructura CTD es indispensable para la viabilidad celular.

El promotor y los factores proteicos de la ARN‐polimerasa II

El primer punto para considerar la organización del promotor es definir un promotor

"genérico" que será la secuencia más corta en la cual la ARN‐polimerasa II puede iniciar

la transcripción y caracterizar las subunidades de la enzima y los factores de

transcripción que se necesitan para reconocerlo. Un promotor genérico puede, en

principio, expresarse en cualquier célula: no depende de secuencias cuyo uso esté bajo

control específico del tejido. Las proteínas accesorias que requiere la ARN polimerasa II

para iniciar en este promotor, definen los factores generales de transcripción implicados

en la mecánica de unión al ADN y la iniciación de la transcripción.


242

El número de factores que pueden actuar conjuntamente con la ARN polimerasa II es

muy grande. Se han dividido en tres grupos:

Los factores generales se requieren para el inicio de la síntesis del ARN en todos

los promotores. Ellos se unen con la ARN polimerasa para formar un complejo que

rodea el punto de inicio, y determinan el sitio de iniciación. Los factores generales,

conjuntamente con la ARN polimerasa, constituyen el aparato básico de

transcripción.

Los factores anteriores (upstream) son proteínas de unión al ADN que

reconocen elementos consenso, cortos y específicos que se encuentran antes del

punto de inicio. La actividad de estos factores no es regulada; son omnipresentes, es

decir siempre están presentes en todas las células. También actúan sobre cualquier

promotor que contenga los sitios adecuados de unión al ADN. Estos factores

aumentan la eficiencia de la iniciación, y se necesitan para que un promotor

funcione en un nivel adecuado. El grupo exacto de factores necesarios para la total

expresión del gen es característico de cualquier promotor específico.

Los factores inducibles funcionan de la misma manera general que los factores

anteriores, pero tienen un papel regulador. Se sintetizan o activan en momentos o

en tejidos específicos, y son por tanto, responsables del control de los patrones de

transcripción en tiempo y espacio. Las secuencias a las cuales se unen se llaman

elementos respuesta.

Los factores generales se describen como TFIIX, donde la X es una letra que identifica el

factor individual. Un promotor genérico funciona sólo a muy baja eficiencia; se necesitan

factores anteriores adicionales para alcanzar un adecuado nivel de funcionamiento. Los

factores anteriores y los inducibles no se describen sistemáticamente, sino que tienen

nombres casuales que reflejan sus historias de identificación.

La mayoría de los promotores tienen una secuencia llamada la caja TATA, localizada

generalmente ~25 pb antes del punto de inicio. Constituye el único elemento del

promotor antes del punto de inicio que posee una localización relativamente fija

respecto al punto de iniciación de la transcripción. La secuencia consenso de 8 pb

consiste enteramente de pares de bases A•T (en dos posiciones la orientación es


243

variable), y sólo en unos pocos casos conocidos es un par G•C. La caja TATA tiende a

estar rodeada de secuencias ricas en G•C, las que se cree pueden ser un factor que

influya en su función. Posee un alto grado de homología con la secuencia –10 de los

promotores bacterianos. De hecho, podría pasar por uno de ellos excepto porque la

localización es en la posición –25 en lugar de ser en –10.

Las sustituciones de una sola base en la caja TATA actúan disminuyendo fuertemente la

actividad del promotor (mutaciones bajas). Algunas mutaciones invierten la orientación

de un par A•T, de manera que la composición de bases solamente no es suficiente para

su funcionamiento. Por tanto, la caja TATA es un elemento cuyo comportamiento es

análogo al concepto de promotor bacteriano: una secuencia corta, bien definida,

colocada justo antes del punto de inicio, que es necesaria para la transcripción. Los

pocos promotores que no contienen el elemento TATA se llaman promotores carentes

de caja TATA.

Mecanismo de ensamblaje del complejo de iniciación de la ARN polimerasa II

El primer paso en la formación del complejo de preiniciación en un promotor que

contenga una caja TATA es la unión del factor TFIID a una región que se extiende en la

dirección 5' (upstream) de la secuencia TATA. TFIID contiene dos tipos de componentes:

la proteína de unión a TATA (TBP) (TATA‐binding protein) que es una pequeña proteína

de ~30 kDa y ~11 TAFs (TBP‐associated factors), factores asociados a TBP con una masa

total típica de ~800 kDa. TFIID es el único responsable del reconocimiento de un

promotor por la ARN polimerasa II.

TBP es el primer factor que hace contacto con un promotor de clase II y a veces se

considera como un "factor de compromiso" ya que en efecto, determina que un

promotor se transcriba. Debido a que la caja TATA está situada a una distancia fija del

sitio de inicio, su reconocimiento es importante para "situar" a las ARN polimerasas. El

factor TBP es requerido para iniciar la transcripción por parte de cualquiera de las tres

ARN polimerasas eucariotas. En cada caso, la TBP constituye una subunidad de algún

factor de transcripción que se une al ADN en la vecindad del sitio de inicio. TBP se une

directamente a la caja TATA cuando ésta está presente, y en los promotores carentes de

caja TATA se ubica cerca del sitio de inicio por otros medios.


244

La iniciación requiere que los factores de transcripción actúen en un orden definido,

pero no exclusivo para formar un complejo al cual se ha de unir la ARN polimerasa. Se

puede conocer la serie de eventos que tiene lugar, por el aumento del tamaño del

complejo proteico asociado al ADN. A medida que cada factor TFII se une al complejo, se

cubre un tramo más del ADN. La ARN polimerasa se incorpora en una etapa más tardía.

El resto de los factores de transcripción involucrados en el complejo de iniciación tiene

cada uno su rol determinado. Después de la unión de TFIID, los factores generales de

transcripción de la ARN‐PII se encargan de ensamblar el aparato básico de transcripción

en el promotor y casi todos se liberarán cuando la ARN‐PII comience la elongación.

El proceso general de la iniciación es similar al catalizado por la ARN polimerasa

bacteriana. La unión de la ARN polimerasa genera un complejo cerrado que se convierte

posteriormente en complejo abierto cuando las cadenas de ADN se han separado. En la

reacción bacteriana, la formación del complejo abierto completa el cambio estructural

necesario del ADN. Una diferencia en la reacción eucariota es que se necesita más

desenrollamiento del molde después de esta etapa.

Los promotores de la ARN polimerasa II tienen elementos de secuencias cortas

El promotor de la ARN polimerasa II tiene dos tipos de regiones. El propio sitio de

iniciación se identifica por el Inr y/o la caja TATA cercana. Conjuntamente con los

factores generales de transcripción, la ARN‐polimerasa II forma un complejo de

iniciación que rodea el punto de inicio, tal y como se ha descrito. La eficiencia y la

especificidad con las cuales se reconoce el promotor dependen, sin embargo, de

secuencias cortas, situadas más lejos en dirección 5' (upstream), que son reconocidas

por factores anteriores o factores inducibles. Estas secuencias y los factores que las

reconocen pueden ser comunes, y encontrarse en una amplia variedad de promotores, o

pueden ser específicas y muy particulares para realizar la transcripción en un tiempo o

lugar restringido. Usualmente estas secuencias están ubicadas ~100 pb antes del punto

de inicio, pero a veces están mucho más distantes. Los factores de unión a estos sitios

pueden influir en la formación del complejo de iniciación en cualquiera de sus diversas

etapas. La mayoría de las mutaciones en estas secuencias no afectan la habilidad del

promotor para iniciar la transcripción.


245

Una de las secuencias anteriores es la caja CAAT. Nombrada por su secuencia consenso,

fue uno de los primeros elementos comunes en describirse. Casi siempre está localizada

cerca de ‐80, pero puede funcionar a distancias que varían considerablemente del punto

de inicio. Funciona en ambas direcciones. Su susceptibilidad a las mutaciones sugiere

que la caja CAAT juega un fuerte papel en la determinación de la eficiencia del

promotor. No parece jugar un rol directo en la especificidad del promotor, pero su

inclusión aumenta la fortaleza de éste. La caja GC contiene la secuencia GGGCGG y

también es variable en cuanto a su posición respecto al sitio de inicio. A menudo existen

múltiples copias en el promotor, y pueden ubicarse en cualquier orientación. Es también

un componente relativamente común del promotor.

Una gran variedad de elementos puede contribuir a la función del promotor, pero

ninguno es esencial para todos los promotores. Los elementos anteriores son

reconocidos por factores de transcripción que interactúan con el complejo básico de

transcripción con el fin de determinar la eficiencia con la cual se va a utilizar ese

promotor. Los elementos encontrados en cualquier promotor difieren en número,

localización y orientación. Ningún elemento es común a todos los promotores. Uno de

los enigmas de la organización de los promotores es que el promotor comunica

información direccional (la transcripción procede solamente en la dirección 3'), pero las

cajas GC y CAAT pueden funcionar en cualquier orientación (aunque sus secuencias son

asimétricas).

Se asume que los factores que están más o menos omnipresentes en todos los

promotores están disponibles a cualquier promotor que tenga una copia del elemento

que reconocen. Esta posibilidad común diferencia los factores anteriores de los

inducibles. Los elementos en la categoría upstream incluyen la caja CAAT, la caja GC y el

octámero. Todos los promotores probablemente necesiten uno o más de estos

elementos para poder funcionar eficientemente.

Hasta aquí se ha considerado al promotor como una región aislada, responsable de la

unión de la ARN polimerasa. Pero los promotores eucariotas no necesariamente

funcionan por sí solos. Al menos en algunos casos, la actividad de un promotor aumenta

enormemente por la presencia de un amplificador o enhancer, que consiste en otro


246

grupo de elementos pero localizado a una distancia variable de los que hasta ahora

hemos contemplado que estarían formando parte del propio promotor. Los

amplificadores y los factores inducibles se estudiarán con detalle en la regulación de la

expresión génica en eucariontes.

TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN EN EUCARIOTAS

La unidad de transcripción eucariota generalmente contiene un solo gen, y la

terminación tiene lugar más allá del final de la región codificadora. Aún cuando

quisiéramos definir el mecanismo de terminación, éste carece de la importancia

reguladora que se aplica a los sistemas procariotas. Las ARN polimerasas I y III terminan

en secuencias discretas en reacciones definidas, pero el modo de terminación por la

ARN‐polimerasa II aún no se ha clarificado totalmentente. El proceso de generación del

extremo 3' de un ARNm no es un evento de terminación como tal, sino que es el

resultado de una reacción de corte en el transcripto primario.

MODIFICACIONES POSTRANSCRIPCIONALES

Los ARN eucariotas son sintetizados en forma de precursores que tendrán que sufrir un

proceso de modificación para poder ser funcionales. Los ARNm procariotas no necesitan

modificarse después de ser sintetizados y constituyen secuencias lineales respecto al

gen a partir del cual se sintetizaron. Es decir, son completamente complementarios. En

cuanto a los ARNr y ARNt procariotas, las modificaciones que sufren son sencillas pues

tienen que ver con los cortes que sufrirá el precursor largo en el cual están incluidas

ambas especies. Sin embargo, los ARNm, los ARNr y ARNt eucariotas, que son

sintetizados en el núcleo y nucleolo de la célula y posteriormente utilizados en el

citoplasma, deben sufrir procesos de modificación mucho más complejos, no sólo para

ser funcionales sino para poder pasar a través de los pequeños poros nucleares al

citoplasma.

MODIFICACIONES DEL ARNM

MODIFICACIÓN EN EL EXTREMO 5' O CAP 5'

El extremo 5' del ARNm se modifica en el núcleo eucariota (pero no en las mitocondrias

ni en los cloroplastos). Las reacciones de modificación son probablemente comunes en


247

todos los eucariontes. La transcripción comienza con un nucleósido trifosfato (casi

siempre una purina, A o G). El primer nucleótido retiene su grupo 5' trifosfato y forma el

enlace fosfodiéster habitual desde su posición 3' a la posición 5' del siguiente nucleótido.

Cuando el ARNm maduro es sometido a tratamiento in vitro con enzimas que deben

degradarlo en nucleótidos individuales, el extremo 5' no produce el nucleósido trifosfato

esperado. En su lugar, contiene dos nucleótidos conectados por un enlace 5'‐5' trifosfato

y también contiene grupos metilo. La base terminal es siempre una guanina que será

añadida al ARN original después de la transcripción.

La adición de la G en el extremo 5' está catalizada por una enzima de localización

nuclear, la guanidil transferasa. La reacción ocurre imediatamente al comienzo de la

transcripción y no es posible detectar más que trazas del extremo 5' trifosfato original

en el ARN nuclear. La reacción total se puede representar como una condensación entre

GTP y el trifosfato 5' terminal original del ARNm.

El nuevo residuo G añadido al extremo del ARN está ubicado en orientación contraria

respecto a todos los otros nucleótidos. Esta estructura se llama cap o capuchón. Es el

sustrato de varios eventos de metilación. Los tipos diferentes tipos de caps se distinguen

por la cantidad de metilaciones que ocurren:

La primera metilación ocurre en todos los eucariontes y consiste en la adición de un

grupo metilo en la posición 7 de una guanina terminal. Un cap que posee este único

grupo metilo se conoce como cap 0. Hasta aquí llega la reacción en los eucariontes

unicelulares. La enzima responsable de esta modificación se llama guanina‐7‐

metiltransferasa.

El siguiente paso es la adición de otro grupo metilo, a la posición 2'–O de la

penúltima base (que verdaderamente era la primera base original del transcripto

antes de las modificaciones). Esta reacción está catalizada por otra enzima (2'‐O‐

metil‐transferasa). Un cap con dos grupos metilo se llama cap 1. Este es el tipo

predominante de cap en todos los eucariontes excepto los organismos unicelulares.

En una pequeña minoría de los casos en eucariontes superiores, se añade otro grupo

metilo a la segunda base. Esto sólo ocurre cuando esa posición está ocupada por una

adenina; la reacción implica la adición de un grupo metilo en la posición N6. La


248

enzima responsable actúa solamente en un sustrato de adenosina que ya tiene un

grupo metilo en la posición 2'‐O.

En algunas especies, se añade un grupo metilo a la tercera base del ARNm que ya

tiene su cap. El sustrato de esta reacción es el ARNm cap 1 que ya tiene dos grupos

metilo. La modificación de la tercera base es siempre una metilación en 2'‐O de la

ribosa. Este cap se denomina cap‐2 y generalmente representa menos del 10‐15%

del total de ARNms con caps.

En una población de ARNms eucariotas, todas las moléculas tienen cap. Las

proporciones de los diferentes tipos de cap son características de un organismo

específico. No se sabe si la estructura de un ARNm específico es invariable o puede tener

más de un tipo de cap. Además de la metilación y solamente en eucariontes superiores,

ocurre una baja frecuencia de metilación interna en el ARNm. Esto se lleva a cabo

mediante la generación de residuos N6 metiladenina con una frecuencia de alrededor de

una modificación por cada 1000 bases. Hay 1‐2 metiladeninas en un ARNm típico de

eucariontes superiores, aunque su presencia no es obligatoria, ya que algunos ARNms

no presentan ninguna.

Modificación del extremo 3' o cola Poli (A)

La mayoría de los ARNms eucariotas tienen una secuencia de ácido poliadenílico en el

extremo 3'. Este tramo terminal de residuos A se describe a menudo como cola de Poli

(A) y el ARNm con estas características se llama poli(A)+. La secuencia poli(A) no está

codificada en el ADN, sino que se añade al ARNm en el núcleo después de la

transcripción. La adición de poli(A) está catalizada por la enzima poli(A) polimerasa, la

cual añade ~200 residuos de A al extremo 3'‐OH libre del ARNm. La cola poli(A) tanto del

ARN nuclear como del ARNm está asociada a una proteína, la proteína de unión a

poli(A) (PABP: poly(A)‐binding protein). Formas similares de esta proteína se pueden

encontrar en muchos eucariontes. Un monómero de PABP de ~70 kDa se une cada 10‐20

bases de la cola poli(A). Por tanto una característica común en muchos o la mayoría de

los eucariontes es que el extremo 3' del ARNm consiste en una hilera de poli(A) unida a

una proteína de gran masa.

¿Cuál es el papel de poli(A)? A pesar de muchas sugerencias en referencia a que ésta le


249

confiere estabilidad al ARNm, no ha sido posible demostrar en forma contundente una

correlación sistemática entre la presencia o longitud de poli(A) y la supervivencia del

ARNm, aunque la escisión de la cola poli(A) precede la degradación de algunos ARNms.

La estabilidad del ARNm puede estar conectada con poli(A), aunque queda por definir su

relación.

La presencia de poli(A) tiene una consecuencia práctica importante. La región poli(A) del

ARNm puede aparearse con el oligonucleótido (U) o el oligonucleótido (dT); y esta

reacción puede utilizarse para aislar poli(A)+ mRNA. La técnica más conveniente es

inmovilizar el oligonucleótido (U o dT) en un soporte sólido. Entonces, cuando se aplica a

la columna una población de RNA, sólo se retienen los mRNA poli(A)+. Se puede eluir

tratando la columna con una solución que rompa los enlaces para liberar el ARN.

La única desventaja de este procedimiento es que aísla todos los ARN que contienen

poli(A). Si se utiliza el ARN de toda una célula se retendrá, por ejemplo, tanto el ARN

poli(A)+ nuclear como citoplasmático.

Casi todos los ARNms celulares poseen poli(A)+. Una excepción significativa serían los

ARNms que codifican a las histonas (un componente estructural fundamental del

material cromosómico). Estos ARNms carecen de toda o casi toda la fracción poli(A)+. La

importancia de la ausencia de poli(A) en los ARNms de histonas no está clara, y no existe

ningún aspecto específico de su función para el cual ésto aparezca como necesario.

MECANISMO DE GENERACIÓN DEL EXTREMO 3’ DEL ARNM

Los extremos 3’ de los ARNms se generan por corte seguido de poliadenilación. La ARN

polimerasa transcribe hasta después del sitio correspondiente al extremo 3’ y algunas

secuencias en el ARN son reconocidas como blanco para el corte endonucleolítico. Una

característica común de todos los ARNms de eucariontes superiores (pero no de las

levaduras), es la presencia de la secuencia AAUAAA en la región comprendida entre 11 y

30 nucleótidos antes del sitio de adición de poli(A)+. La secuencia está muy conservada y

sólo ocasionalmente difiere en tan solo una base. La deleción o mutación del hexámero

AAUAAA impide la formación del extremo 3’ poliadenilado. La señal es necesaria tanto

para el corte como para la poliadenilación.

La generación de la estructura 3’ terminal requiere de una endonucleasa para cortar el


250

ARN, una poli(A) polimerasa (PAP) para sintetizar la cola poli(A), y un componente de

especificidad (CPSF) que reconoce la secuencia AAUAAA y dirige otras actividades. La

reacción de poliadenilación tiene dos etapas:

1. Se añade una secuencia corta de oligo(A) de ~10 residuos al extremo 3’. Esta

reacción es totalmente dependiente de la secuencia AAUAAA, y la poli(A) polimerasa

la lleva a cabo bajo la dirección del factor de especificidad.

2. La cola oligo(A) se extiende hasta formar un residuo de ~200 adeninas. Esta reacción

requiere otro factor de estimulación que reconoce la cola oligo(A) y dirige a la poli(A)

polimerasa específicamente para que extienda el extremo 3’ de una secuencia de

poli(A). La longitud de la cola poliadenilada está controlada por la PABP (polyA‐

binding protein) la que, de alguna forma, limita la acción de la poli(A) polimerasa

para que añada ~200 residuos de adenina. El límite pudiera ser la acumulación de

una masa crítica de PABP en la cadena poliadenilada. PABP sigue siendo después, un

componente del ARNm y su rol exacto en el metabolismo no se conoce.

EL EMPALME (SPLICING) NUCLEAR

Los genes interrumpidos se encuentran en todos los tipos de organismo, de manera que

la facilidad de reconstituir secuencias codificadoras intactas es un requerimiento común.

Los genes interrumpidos representan una proporción menor de los genes de los

eucariontes inferiores mientras que la gran mayoría de los genes en genomas de

eucariontes superiores están interrumpidos. Los genes varían ampliamente de acuerdo

con el número y longitud de los intrones, pero un gen típico de un mamífero tiene 7‐8

exones distribuidos en ~16 pb?. Los exones son relativamente cortos (~100 – 200 pb) y

los intrones son relativamente largos (~1 kb).

La discrepancia entre la organización interrumpida del gen y la organización

ininterrumpida de su ARNm requiere de un cambio en el ARN entre la transcripción y la

traducción. El transcrito primario tiene la misma organización del gen, y a veces se le

llama pre‐ARNm. La separación de los intrones del pre‐ARNm produce un mensajero

típico de ~2.2 kb. El proceso mediante el cual se separan los intrones se llama empalme

(splicing) del ARN. Una de las primeras claves referentes a la naturaleza de la

discrepancia en tamaño entre los genes nucleares y sus productos en los eucariontes


251

superiores se halló en las propiedades del ARN nuclear. Su tamaño promedio es mucho

mayor que el del ARNm, es muy inestable y tiene una complejidad de secuencia mucho

mayor. A partir de su gran tamaño se le llamó ARN nuclear heterogéneo (hnRNA:

heterogenous nuclear RNA). La población de ARNnh, caracterizada en estos primeros

experimentos, incluye la población de los pre‐ARNm. Los ARNnh se encuentran

asociados a proteínas formando partículas llamadas ribonucleoproteínas.

El empalme ocurre en el núcleo, junto con las otras modificaciones que sufre el ARN

recién sintetizado. El transcrito obtiene su cap en el extremo 5', pierde sus intrones y se

poliadenila en el extremo 3'. Entonces el ARN se transporta a través de los poros

nucleares hacia el citoplasma donde estará disponible para ser traducido.

Se han podido identificar varios tipos de sistemas de emaplme:

Los intrones se separan de los ARNs nucleares en los eucariontes superiores por un

sistema que reconoce solamente secuencias consenso cortas conservadas en los límites

exón‐intrón y dentro de los intrones. Esta reacción necesita un gran aparato de

empalme, que toma la forma de un conjunto de proteínas y de ribonucleoproteínas que

funciona como un gran complejo de partículas (el empalmosoma).

La escisión de algunos intrones es una propiedad autónoma del propio ARN. Existen

dos grupos de intrones con esta capacidad en diversas localizaciones. Cada uno forma un

tipo característico de estructura secundaria. Las secuencias de un grupo se relacionan

con las de los intrones nucleares. La facilidad del ARN para demostrar actividades

enzimáticas también se demuestra en la auto‐escisión de los ARNs viroides y en la

actividad catalítica de la ARNasa‐P.

La separación de los intrones en los precursores de los ARNt nucleares en levaduras

implica actividades enzimáticas cuya actividad con el sustrato se parece al de las enzimas

procesadoras del ARNt ya que una característica crítica es la conformación del precursor

ARNt.

En el empalme se emplean dos tipos fundamentales de mecanismo. Todos los exones

excepto los de los pre‐ARNts nucleares se empalman mediante reacciones de

transesterificación, aunque el componente catalítico y otros involucrados son distintos

en cada caso. Los intrones del pre‐ARNt nuclear se separan por corte y ligazón. Muchos


252

de los intrones con capacidad autónoma de empalmar son móviles, es decir, tiene la

facilidad de insertar copias en nuevas localizaciones. Por lo que es probable que hayan

sido originados mediante inserción en genes ya existentes. Aún es un enigma si los

intrones de los genes nucleares de los eucariontes superiores se originaron por inserción

o si fueron parte de la construcción original del gen. Parece inevitable que los intrones

de los genes del pre‐ARNt nuclear se hayan originado por inserción en genes ya

existentes.

LOS SITIOS DE EMPALME

Para comprender los eventos moleculares implicados en el splicing nuclear de intrones,

hay que considerar la naturaleza de los sitios de empalme, los dos límites exón‐intrón

que incluyen los sitios de rompimiento y reunión. Cuando se compara la secuencia

nucleotídica del ARNm con la del gen estructural se pueden determinar las uniones

entre exones e intrones. No hay otra homología o complementariedad entre los dos

extremos de un intrón. Sin embargo las uniones tienen secuencias consenso bien

conservadas, aunque bastante cortas. Es posible asignar un extremo específico a cada

intrón según la conservación de las uniones exón‐intrón. Se pueden alinear todos para

conformar la siguiente secuencia consenso:

Sitio 5' Sitio 3'

Exón A64G73G100T100A62A68G84T63...............12PyNC65A100G100N Exón

Intrón

En este y en otros casos, se escribe solamente la secuencia de la cadena de DNA que es

idéntica a la del producto RNA. Los subíndices indican el porcentaje en que ocurre la

base especificada (o el tipo de base) en cada posición consenso. Se observa una gran

conservación solamente inmediatamente dentro del intrón en las supuestas uniones.

Esto identifica la secuencia de un intrón genérico como GT... ...AG.

Debido a que el intrón así definido comienza con el dinucleótido GT y termina con el

dinucleótido AG, las uniones se describen a menudo como que cumplen la regla GT‐AG.

(Las verdaderas secuencias en el ARN son por supuesto GU‐AG). Ver fig. 10.1. Nótese

que los dos sitios tienen diferentes secuencias y así definen los extremos del intrón de


253

forma direccional. Se nombran de izquierda a derecha a lo largo del intrón, es decir,

como los sitios de empalme izquierdo (ó 5') y el derecho (ó 3'). A veces se llaman sitios

donador y aceptor. Las secuencias consenso se han determinado como sitios de

reconocimiento en el empalme mediante mutaciones puntuales que evitan que tenga

lugar el empalme tanto in vivo como in vitro.

La regla GT‐AG describe los sitios de splicing de los genes nucleares de muchos

eucariontes (tal vez todos). Esto implica que hay un mecanismo común de splicing del

ARN. Los segmentos consenso no se aplican a los intrones de las mitocondrias ni de los

cloroplastos ni tampoco a los genes ARNt de las levaduras. Los ARNms típicos de

mamíferos tienen muchos intrones. El problema básico del splicing nuclear resulta de la

propia simplicidad de los sitios de splicing. ¿Qué asegura que los pares correctos de

sitios se reconozcan juntos? Los pares GU‐AG correspondientes deben conectarse a

través de grandes distancias (algunos intrones tienen >10 kb de largo), evitando la

conexión de pares incorrectos. Nos podemos imaginar dos tipos de principios que

pudieran ser responsables del apareamiento correcto de los sitios 5' y 3':

• Podría ser una propiedad intrínseca del ARN la capacidad de conectar los sitios en los

extremos de un intrón específico. Esto requeriría comparar y capturar las secuencias

o estructuras específicas.

• El empalme podría seguir reglas que garanticen que un sitio 5' siempre se conecte

con el próximo sitio 3' en el ARN.

Ni los sitios de emplame ni las regiones circundantes tienen complementariedad de

secuencia, lo que excluye modelos de apareamiento entre extremos de los intrones. Se

han hecho experimentos que concluyen que:

• Los sitios de splicing son genéricos: no son específicos de precursores individuales de

ARN, y los precursores individuales no confieren la información específica (tal como

una estructura secundaria) que se necesita para el splicing.

• El aparato de splicing no es específico de tejido; un ARN generalmente puede ser

modificado adecuadamente por cualquier célula, se haya o no sintetizado en esa

célula.


254

He aquí una paradoja. Probablemente todos los sitios de empalme 5' y 3' le resultan

iguales al aparato de empalme. En principio cualquier sitio 5' puede reaccionar con

cualquier sitio de empalme 3'. Pero en circunstancias normales el empalme ocurre

solamente entre los sitios 5' y 3' del mismo intrón. ¿Que reglas aseguran que el

reconocimiento de los sitios de empalme esté restringido de manera que solamente los

sitios 5' y 3' del mismo intrón sufran empalme?

¿Se eliminan los intrones de un ARN específico en un orden específico? Utilizando

Northern blotting se pueden identificar los ARNs nucleares que representan a los

intermediarios de los cuales se han eliminado algunos intrones. En un blot de los

precursores del ARNm ovomucoide hay una serie de bandas discretas que sugieren que

el empame ocurre a través de vías definidas. (Si los siete intrones de dicho ARN fueran

eliminados en un orden completamente aleatorio, habría más de 300 precursores con

diferentes combinaciones de intrones, y no veríamos bandas discretas).

Parece que no hay una vía obligatoria, ya que se pueden encontrar intermediarios en los

cuales se han eliminado diferentes combinaciones de intrones. Sin embargo, hay

evidencias que indican una vía o vías preferenciales.

Se puede concluir de forma general que la conformación del ARN influye sobre la

accesibilidad de los sitios de splicing. A medida que se eliminan intrones específicos, la

conformación cambia, y nuevos pares de sitios de splicing se vuelven disponibles. Pero la

facilidad que tiene el precursor de eliminar sus intrones en más de un orden sugiere que

en cada etapa estarán disponibles conformaciones alternas. Lo que sí está claro es que la

reacción no procede secuencialmente a lo largo del precursor. Pero la forma en que se

reconocen correctamente los pares de sitios de empalme aún está por dilucidarse.


255

FIG 10.1. EMPALME DE ARNHN EN EUCARIOTAS

MECANISMO DE EMPALME (SPLICING)

El mecanismo de empalme se ha caracterizado in vitro utilizando sistemas en los cuales

los intrones se pueden eliminar de los precursores de ARN. Los extractos nucleares

pueden modificar los precursores de ARN puros, lo que demuestra que la acción del

splicing no está ligada al proceso de la transcripción. El empalme es también

independiente de otras modificaciones del ARN, y puede ocurrirle a ARNs que no tienen

ni cap 5' ni están poliadenilados. La reacción de empalme se describe en términos de las

especies individuales de ARN que pueden identificarse, pero debemos recordar que in

vivo, las especies que contienen exones no se liberan como moléculas libres sino que

permanecen sujetas al aparato de empalme.

En la primera etapa, se realiza un corte en el sitio 5' de empalme, separando el exón

izquierdo de la molécula intrón‐exón a la derecha. El exón izquierdo toma la forma de

una molécula lineal. La molécula intrón‐exón a la derecha forma una estructura llamada

lariat, en el cual, el extremo 5' terminal generado al final del intrón se enlaza mediante

un enlace 5'‐2' a una base que está dentro del intrón. La base blanco es una A situada en

una secuencia llamada sitio de ramificación. En una segunda etapa, el corte realizado en


256

el sitio 3' de empalme, libera el intrón en forma de lariat, mientras que el exón derecho

se liga la exón izquierdo. Las reacciones de corte y ligamiento se muestran por separado

en las figuras con propósitos ilustrativos, pero realmente ocurren como una sola

transferencia coordinada. Después se "desramifica" el lariat para dar un intrón lineal

escindido que se degrada rápidamente.

Las secuencias necesarias para el empalme son secuencias consenso cortas en los sitios

de empalme 5' y 3' y en el sitio de ramificación. Se sabe que la mayor parte de la

secuencia de un intrón puede delecionarse sin impedir el empalme, lo que indica que no

se necesita una conformación específica en el intrón (o exón). El sitio de ramificación

ofrece los medios mediante los cuales se identifica el sitio 3' de empalme. En levaduras,

este sitio está altamente conservado, y tiene la secuencia consenso UACUAAC. El sitio de

ramificación en los eucariontes superiores no está bien conservado, pero tiene

preferencia por purinas y pirimidinas en cada posición y retiene la A blanco.

El sitio de ramificación está ubicado de 18 a 40 nucleótidos antes del sitio 3' de

empalme. Las mutaciones o deleciones del sitio de ramificación en levaduras impiden el

empalme. En eucariontes superiores, algunas restricciones en su secuencia traen como

resultado la posibilidad de utilizar secuencias similares en la vecindad cuando se

deleciona la rama auténtica. La proximidad al sitio 3' de empalme parece ser muy

importante, ya que el sitio críptico está siempre cercano al auténtico. Cuando se utiliza

una secuencia de ramificación críptica como la anterior, el empalme transcurre

normalmente, y los exones producen los mismos productos que el tipo nativo. El papel

del sitio de ramificación es, por tanto, identificar el sitio 3' de empalme más cercano

como blanco para conectarlo al sitio 5'.

El enlace que forma el lariat va desde la posición 5' de la G invariable que estaba en el

extremo 5' del intrón hasta la posición 2' de la A invariable en el sitio de ramificación.

Esta corresponde al tercer residuo A en la caja UACUAAC de la levadura. Las reacciones

químicas son de transesterificación: de hecho un enlace se transfiere desde un lugar a

otro. El primer paso es un ataque nucleofílico del 2'‐OH de la A del sitio de ramificación

sobre el sitio 5' de splicing. En un segundo paso, el 3'‐OH libre del exón que fuera

liberado en la primera reacción ataca ahora el enlace en el sitio 3' de splicing. El curso


257

real de la reacción probablemente implique ácidos y bases generales. Así, en la primera

reacción, una base general quita un protón del extremo 2'‐OH, y un ácido general dona

un protón al oxígeno 3' libre del exón liberado. En la segunda reacción tienen lugar

reacciones similares. Nótese que el número de enlaces fosfodiéster está conservado.

Originalmente había dos enlaces 5'‐3' en los sitios de empalme exón‐intrón; uno ha sido

sustituido por el enlace 5'‐3' entre los exones, y el otro ha sido sustituido por el enlace

5'‐2' que forma el lariat.

LAS RIBONUCLEOPROTEÍNAS Y LA FORMACIÓN DEL EMPALMOSOMA

Los sitios de empalme 5' y 3' y la secuencia de ramificación son reconocidos por

componentes del aparato de empalme que se ensamblan para formar un gran complejo.

Este complejo acerca las secuencias consenso antes de que tenga lugar la reacción,

explicando porqué una deficiencia en cualquiera de los sitios puede evitar que se inicie

la reacción. El complejo se ensambla secuencialmente, y los complejos de diferentes

tamaños en vías de fraccionamiento pueden reconocer varios intermediarios. El

empalme ocurre solamente cuando todos los componentes se han ensamblado. La

reacción implica la liberación de algunos componentes y la reorganización de otros.

El aparato de empalme contiene proteínas y ARNs. Los ARNs tienen la forma de

pequeñas moléculas que existen como partículas de ribonucleoproteínas. Tanto el

núcleo como el citoplasma de las células eucariotas contienen muchas especies discretas

de ARNs pequeños. Ellos varían en tamaño desde 100 a 300 bases en los eucariontes

superiores, y se extienden en longitud hasta ~1000 bases en la levadura. Varían

considerablemente en abundancia. Las especies más abundantes han sido detectadas

bioquímicamente en cantidades de 105‐106 moléculas por célula. Otras, presentes en

concentraciones demasiado bajas para poderlas detectar directamente, se han

identificado mediante pruebas funcionales para procesar reacciones en las cuales ellas

participan.

Las especies restringidas al núcleo se llaman ARNs nucleares pequeños (snRNA: small

nuclear RNAs). En su estado natural, existen como partículas ribonucleoproteicas

(snRNPs). Los snRNPs implicados en el empalme, junto con algunas proteínas

adicionales, forman un gran complejo de partículas, llamado el empalmosoma. Aislados


258

in vitro de los sistemas de empalme, forman partículas de ribonucleoproteínas de 50‐

60S. El empalmosoma puede formarse en etapas, a medida que los snRNPs se unen,

pasando por varias etapas de "complejos pre‐empalme". El empalmosoma es muy

grande, equivalente en tamaño a una subunidad ribosomal.

MADURACIÓN DEL ARNR EUCARIOTA

La maduración del ARNr eucariota se puede seguir en detalle debido a la velocidad

relativamente lenta a la cual madura el transcripto primario a través de etapas

intermedias para dar las moléculas de ARNr maduro. Las especies intermedias

principales del proceso se pueden aislar de varias células, en las cuales se ha podido

caracterizar su vía en los mamíferos. El transcripto primario de mamíferos es un pre‐ARN

45S (Fig. 10.2) que contiene las secuencias de los ARNrs 18S, 5,8S y 28S, pero que tiene

casi el doble de la longitud combinada de ambos. Contiene ~110 grupos metilo, los que

fueron añadidos durante la transcripción o inmediatamente después. Casi todos ellos

están unidos a los residuos ribosa, en una gran variedad de secuencias

oligonucleotídicas. Los grupos metilo se conservan durante el procesamiento del

precursor, encontrandose presentes en los distintos ARNrs maduros. Hay ~39 grupos

metilos originales en el ARNr 18S maduro; a los que posteriormente le serán añadidos

otros 4 en el citoplasma. Hay ~74 grupos metilo (todos originales) en el ARNr 28S. Esto

sugiere que la metilación se utiliza para señalar las regiones del transcrito primario que

van a madurar en el ARNr.

Se ha encontrado más de una vía de maduración, tal y como se puede deducir de los

tamaños de las moléculas intermedias de ARN. Pero todas las vías se pueden conciliar

suponiendo que un pequeño número de sitios de corte puede ser utilizado en diversos

órdenes. Se conocen dos vías en mamíferos. En cada caso, hay sitios de corte en el

extremo 5' del gen 18S, dentro del espaciador entre los genes 18S y 5.8S, y en el

espaciador entre las secuencias 5.8S y 28S. (La secuencia 5.8S se convierte en un ARN

pequeño que se asocia con el ARNr 28S por apareamiento de bases).

La diferencia entre ambas vías es exclusivamente el orden en que se utilizan los sitios de

corte. No se sabe si estos cortes realmente generan los extremos maduros o si los cortes

liberan los precursores individuales que después serán cortados. Lo que sí se sabe es que


259

el preARN‐45S se asocia con proteínas inmediatamente después de su síntesis. En este

proceso interviene la RNP U3, pero en eucariontes inferiores el proceso es

autocatalítico. No se conocen enzimas participantes.

FIG. 10.2. PROCESAMIENTO DE ARNR EN EUCARIOTAS.

EL EMPALME (SPLICING) DIFERENCIAL

Algunos genes son capaces de codificar más de una proteína, dependiendo de cómo el

producto primario de transcripción es procesado a ARNm maduro. Algunos precursores del

ARNm que contienen un gran número de exones pueden sufrir un proceso de empalme

diferencial que da como resultado distintas moléculas de ARNm, codificando proteínas

diferentes. Este fenómeno se conoce como empalme diferencial. Así por ejemplo, el gen

de la tropomiosina I en Drosophila codifica para dos proteínas musculares relacionadas,

una que se expresa durante el desarrollo embrionario y otra que se encuentra en el

músculo torácico de las moscas adultas. Estas proteínas difieren en al menos 27

aminoácidos, y el hecho de que se sintetice una u otra proteína depende de que se elimine

o no el tercer exón durante el proceso de empalme. Otros productos primarios de

transcripción que pueden sufrir empalme diferencial para generar proteínas distintas son,

por ejemplo, los de los genes de la fibronectina, la troponina y la cadena ligera de la

miosina en la rata. Todavía no se conoce la razón por la cual ciertos intrones pueden

perderse o no durante el procesamiento de los precursores del mRNA.

Aguna Bibliografía adicional (Pedir Lic. E. V. Paravani)


260

• Los genes sin intrones en las secuencias transcribibles producen menores niveles de

mRNA nuclear y citoplasmático y exportación y traducción reducida (Cullen, 2003).

• Los genes que contienen intrones en el extremo 5´ producen mayores niveles de RNA

maduro que los que poseen intrones en el extremo 3´ (Rose, 1997, 2000, 2002, 2004;

Kim, 2004; Hu, 2005).

• La presencia del intrón o el proceso de splicing no influyen en sí mismos en la

regulación pos‐transcripcional. El mecanismo de enhancer parece depender de los

factores proteicos involucrados (Simpson, 1996).

• La acción enhancer de los intrones depende del tipo de promotor, secuencia y

posición de los intrones, secuencia de los exones y tipo y estado fisiológico de las

células (Simpson, 1996).

• El mecanismo de splicing o la acción enhancer del intrón pueden ser influenciados

por estrés (anaeróbico o por presencia de metales pesados) (Simpson, 1996).


261

CAPÍTULO UNDÉCIMO:

Traducción y Síntesis de Proteínas


262

Traducción

En el capítulo anterior, se estudió el proceso de transcripción observándose que el

producto final de algunos genes es una molécula de ARN en si misma como ocurre con el

ARNt y el ARNr de los ribosomas.

Sin embargo, la mayoría de los genes de las células producen moléculas de ARN que actúan

como intermediarias de la síntesis de proteínas.

Una vez que se produce la molécula de ARNm la conversión de la información de ARN en

proteínas es equivalente a un proceso de traducción.

Como existen sólo cuatro tipos de nucleótidos en el ARNm y veinte tipos diferentes de

aminoácidos proteicos, es fácil comprender que esta

traducción no puede realizarse con una correspondencia

uno a uno, entre un nucleótido en el ARN y un aminoácido

en las proteínas. La secuencia de nucleótidos de un gene a

través del ARNm, es traducida en la secuencia de

aminoácidos por una regla conocida como código genético.

Este código fue descifrado a principios de la década del ‘60.

La secuencia de nucleótidos en el ARNm es leída consecutivamente en grupos de tres. El

ARN es un polímero de cuatro diferentes nucleótidos, 4x4x4 (43)=64 posibles

combinaciones de tres nucleótidos los tripletes AAA, AUA, AUG,…. etc. Sin embargo, existen

sólo 20 aminoácidos proteicos. Debido a esto, originalmente se pensó que podría ocurrir

que, algunos de los tripletes de los nucleótidos no se usen, o bien que algunos de los

nucleótidos sean especificados para más de un triplete. La segunda posibilidad es en efecto

la correcta, como lo demuestra el código genético completamente descifrado en la figura

XX. Cada grupo de tres nucleótidos se denomina codón y cada uno de ellos, puede

especificar tanto un aminoácido como una señal de parada del proceso de traducción.

Este código es usado universalmente en todos los organismos vivos del presente, aunque


263

se han encontrado pequeñas diferencias en el código en el ADN de las mitocondrias. Estas

últimas tienen su propio sistema de transcripción y síntesis de proteínas que operan

independientemente del resto de la célula.

En principio, una secuencia de ARN puede ser traducida en alguno, de tres diferentes

marcos de lectura, dependiendo de donde comienza el proceso de decodificación. Ver

figura XX. Sin embargo, solo uno de los tres posibles marcos de lectura en un ARNm codifica

la proteína requerida. Se vio posteriormente cómo una señal de puntuación al comienzo de

cada conjunto de cada de mensaje de ARN al correcto marco de lectura al comienzo de la

síntesis de proteínas.

Los codones en una molécula de ARNm no reconocen

directamentea los aminoácidos que ellos especifican. La traducción

del ARNm en proteína depende de una molécula adaptadora que

puede reconocer y unir tanto al codón como a un aminoácido. Estos

adaptadores se conocen como ARNs de transferencia (ARNt), los

que poseen aproximadamente 80 nucleótidos de longitud.

Como se vio anteriormente, la molécula de ARNt se pliega en

una estructura tridimensional precisamente definida. Cuatro

segmentos cortos del ARNt plegados son de doble hélice

produciendo una molécula que semeja una hoja de trébol

cuando esta se esquematiza. Por ejemplo, una secuencia 5’‐

GCUC‐3’ en una parte de una cadena polinucleotídica puede

formar una fuerte asociación 5’‐GAGC‐3’ en otra región de la

misma molécula. La hoja de trébol sufre un plegamiento para formar una estructura de L

invertida compacta que se mantiene unida por puentes

hidrógeno entre diferentes regiones

de la molécula.

Dos regiones de nucleótidos no

apareados situados en los dos

extremos de la L invertida son

cruciales para la función del ARNt en la síntesis de las proteínas.


264

Una de estas regiones forma el anticodón: un conjunto de tres nucleótidos consecutivos

que se aparean con el codón complementario de la molécula de ARNm. La otra es una

región de hebra simple de ARN ubicada en el extremo 3’ de la molécula de ARNt donde se

ancla el aminoácido que corresponde al codón.

Se ha indicado previamente que el código genético es redundante, esto es, que varios

codones pueden especificar un aminoácido. Esta redundancia podría implicar tanto que

existe más de un ARNt para muchos de los aminoácidos cuanto que, algunas moléculas de

ARNt pueden aparearse con más de un codón. En efecto, ocurren ambas cosas. Algunos

aminoácidos poseen más de un ARNt y algunos ARNts requieren apareamiento

complementario de sólo las primeras dos posiciones del codón pudiendo tolerar un

apareamiento inestable (o wobble) no regido por las reglas de complementareidad antes

mencionadas, en la tercera posición (ver figura XX). Este apareamiento de bases tipo

wobble explica porqué muchos de los codones alternativos de un aminoácido difieren sólo

en su tercer nucleótido (ver figura XX) En bacterias el apareamiento de bases tipo wobble

permite que los 20 aminoácidos puedan ser adaptados a los 61 codones con sólo 31 tipos

diferentes de moléculas ARNt. El número exacto de diferentes tipos de ARNts, sin embargo,

difiere en las especies. Por ejemplo, en humanos hay 497 genes ARNt, pero entre ellos, sólo

están representados 48 anticodones diferentes.

Los ARNts son modificados covalentemente antes de salir del núcleo

Hemos visto que la mayoría de los ARNs son covalentemente alterados antes de que se les

permita salir del núcleo y los ARNts no son una excepción. Los ARNts eucaróticos son

típicamente sintetizados como moléculas más largas como ARNts precursores y estos son

luego procesados para producir el ARNt maduro. Adicionalmente, algunos precursores de

ARNts (tanto bacterianos como eucariotas) contienen intrones que deben ser empalmados.

Esta reacción de empalme es químicamente distinta a la del pre‐ARNm, ya que más que

generar un lazo intermediario el empalme ocurre a través de un proceso de “corte y

pegue” catalizado por proteínas. Tanto el proceso de seccionamiento como el de empalme

requieren el ARNt precursor para ser plegados correctamente en su configuración de hoja

de trébol. Debido a que los ARNt precursores mal plegados no serán procesados

propiamente, las reacciones del seccionamiento y empalme se cree que constituyen un


265

paso de control de calidad en la generación de ARNts.

Todos los ARNts están sujetos a una variedad de

modificaciones químicas –cerca de uno cada 10

nucleótidos en cada molécula de ARNt madura es

una versión alterada de un ribonucleótido estándar

G, U, C, A. Se conocen 50 tipos diferentes de

modificaciones de ARNt; algunas de estas son

mostradas en la figura XX. Algunos de los nucleótidos modificados ‐el más notable la

inopina producida por la deaminación de guanosina‐ afecta la conformación y el

apareamiento de bases del anticodón y facilita el reconocimiento del codón del ARNm

apropiado por la molécula de ARNt. Otros afectan la adecuación con la que el ARNt se ancla

al aminoácido.

Enzimas específicas acoplan cada aminoácido a la molécula de ARNt apropiada

Se ha visto que, para leer el código genético en

el ADN, las células fabrican una serie de ARNts

diferentes. Ahora consideraremos cómo cada

molécula de ARNt se une a uno de los 20

aminoácidos apropiado. El reconocimiento y

unión del aminoácido correcto, depende de

enzimas denominadas aminoacil‐ARNt

sintetasas que son las responsables de acoplar

covalentemente cada aminoácido, a su apropiado conjunto de ARNt. Para la mayoría de las

células hay diferentes sintetasas para cada aminoácido (esto es, al menos 20 sintetasas en

total); una ancla glicina, a todos los ARNts que reconocen los codones de glicina, otra

anclan alanina a todos los ARNts que reconocen los codones de alanina, etc. Muchas

bacterias sin embargo, tienen menos de 20 sintetasas y la misma enzima sintetasa puede

acoplar más de un aminoácido a los ARNts apropiados. En estos casos, una única sintetasa

coloca el aminoácido apropiado sobre dos tipos diferentes de ARNts, de los cuales, sólo uno

posee un anticodón que se corresponde con el aminoácido específico. Posteriormente, una

segunda enzima modifica químicamente cada aminoácido incorrectamente unido de tal


266

modo que el que aminoácido modificado, corresponde al anticodón exhibido por su ARNt

ligado covalentemente.

La reacción catalizada por la sintetasa que une a los aminoácidos al extremo 3’ del ARNt es

una de las muchas reacciones celulares acopladas a la liberación de energía por hidrólisis de

ATP, produciendo una unión de alta energía entre el ARNt y los aminoácidos. La energía de

esta unión es usada en un estadio ulterior durante la síntesis de proteínas para ligar

covalentemente los aminoácidos en las cadenas polipeptídicas crecientes.

Pese a que las moléculas de ARNt actúan como adaptadores finales en la conversión de

secuencias nucleotídicas, en secuencias de aminoácidos, las enzimas aminoacil‐ARNt

sintetasas, son adaptadores de igual importancia en el proceso de decodificación. Esto fue

establecido con un ingenioso experimento en el cual un aminoácido (cisteína) fue

químicamente convertido en un aminoácido diferente (alanina) después que ya había sido

unido a su ARNt específico. Cuando este híbrido fue usado para la síntesis de proteínas en

un sistema libre de células, el aminoácido erróneo fue insertado en cada punto en que se

usó dicho ARNt. Las células tienen varios mecanismos de control que evitan este tipo de

errores, el experimento demuestra que el código genético es traducido por dos conjuntos

de adaptadores que actúan secuencialmente. Cada uno de ellos se corresponde con la

superficie molecular de la otra, con gran especificidad y es su acción combinada que asocia

cada secuencia de tres nucleótidos en la molécula de ARNm ‐esto es, cada codón‐ con su

aminoácido particular.

La edición por la ARN sintetasa asegura la adecuación del mecanismo

La acción conjunta de varios mecanismos aseguran que la ARNt sintetasa ligue el

aminoácido correcto a cada ARNt. La sintetasa debe primero seleccionar el aminoácido

correcto. Este proceso se efectúa por un mecanismo de dos pasos. Primero selecciona el

aminoácido correcto, que es el que tiene la más alta afinidad por el bolsillo del sitio activo

de su sintetasa y por esto es favorecido sobre los otros 19 restantes. En particular,

aminoácidos mayores que el correcto, son efectivamente excluidos del sitio activo. Sin

embargo, es muy difícil realizar la discriminación entre dos aminoácidos similares, tales

como la isoleucina y la valina, (que difieren sólo en un grupo metilo), en un mecanismo de

reconocimiento de un único paso. Un segundo paso de discriminación ocurre después que


267

el aminoácido ha sido covalentemente ligado a la sintetasa, forzando al aminoácido a pasar

a un segundo bolsillo en la sintetasa, la dimensión precisa de éste, excluye el aminoácido

incorrecto pero permite el acceso del aminoácido específico. Una vez que un aminoácido

ingresa a este bolsillo de edición, es hidrolizado del AMP (o del ARNt mismo si el aminoácil‐

ARNt ya ha sido establecido) y liberado de la enzima. Esta edición hidrolítica, que es

análoga a la edición por la ADN polimerasa, aumenta la adecuada carga del ARNt a

aproximadamente un error en 40.000 acoplamientos.

La ARNt sintetasa debe también reconocer el conjunto correcto de ARNts y la

complementariedad química y estructural entre la sintetasa y el ARNt permiten sensar

varias características del ARNt. La mayoría de las ARNt‐sintetasas reconocen directamente

la concordancia entre el anticodón del ARNt; estas sintetasas contienen tres bolsillos de

unión de nucleótidos adyacentes, cada uno de los cuales es complementario en forma y

carga al nucleótido en el anticodón. Para otras sintetasas es la secuencia de nucleótidos del

tallo aceptor la que resulta determinante para el reconocimiento. Sin embargo, en la

mayoría de los casos los nucleótidos son leídos en varias posiciones por la sintetasa.

Los aminoácidos son agregados al extremo carboxilo de la cadena polipeptídica creciente

La reacción fundamental de la síntesis de proteínas es la formación de una unión peptídica

entre el grupo carboxilo al final de una cadena polipeptídica creciente y un grupo amino

libre de un aminoácido que se incorpora. Consecuentemente, una proteína es sintetizada

desde su extremo N‐terminal a su extremo C‐terminal. A través del proceso global, el

extremo creciente de una cadena polipeptídica permanece activado por su anclaje

covalente a una molécula de ARNt (una molécula de peptidil‐ARNt). Este ligamiento

covalente de alta energía se rompe durante cada adición pero es inmediatamente

reemplazado por el ligamiento idéntico en el último aminoácido que se agrega. De esta

forma, cada aminoácido agregado posee la energía de activación para la adición del

siguiente aminoácido, más que la energía para su propia adición, esto constituye de un tipo

de polimerización “head growth” como se describe en la figura XX.

El mensaje del ARN es decodificado en los ribosomas

La síntesis de proteínas es guiada por la información que poseen las moléculas de ARNm.

Para mantener el correcto marco de lectura y para asegurar la exactitud del proceso


268

(aproximadamente 1 error cada 10.000 aminoácidos), la síntesis de proteínas se realiza en

los ribosomas, una compleja máquina catalítica constituída por mas de 50 proteínas (las

proteínas ribosomales) y varias moléculas de ARN ribosomales (ARNrs). Una célula

eucariota típica, contiene millones de ribosomas en su citoplasma. Como se vio

previamente las subunidades de los ribosomas son ensambladas en el nucléolo por la

asociación de ARNrs recién transcriptos y modificados con proteínas ribosomales, las que

se han transportado hacia el núcleo desde el citoplasma. Las dos subunidades ribosomales

luego son exportadas al citoplasma donde se realiza la síntesis de proteínas.

Los ribosomas de las células eucariotas y procariotas son muy similares en el diseño y

función. Ambos están compuestos de una unidad mayor y una unidad menor que se

ajustan mutuamente para formar un ribosoma completo con una masa de varios millones

de daltons. La subunidad menor provee del marco de trabajo en el cual el ARNt puede ser

adecuadamente alineado con los codones del ARNm, mientras que la subunidad mayor

cataliza la formación de la unión peptídica que une los aminoácidos en la cadena

polipeptídica.

Cuando no se estan sintetizando activamente las proteínas, las dos subunidades del

ribosoma se mantienen separadas. Las subunidades se mantienen unidas sobre una

molécula de ARNm, usualmente cerca de su extremo 5’, para iniciar la síntesis de una

proteína. El ARNm es luego traccionado a través del ribosoma; conforme sus codones

encuentran los sitios activos, la secuencia de nucleótidos del ARNm es traducida en una

secuencia de aminoácidos usando el ARNt como molécula adaptadora para el agregado de

cada uno de los aminoácidos en la secuencia correcta al extremo de la cadena polipeptídica

creciente. Cuando se encuentra un codón de parada, el ribosoma libera la proteína

finalizada, sus dos subunidades se separan nuevamente, Estas subunidades pueden luego

ser usadas para comenzar la síntesis de otras proteínas sobre otra molécula de ARNm.

Los ribosomas operan con una remarcable eficiencia: un ribosoma de una célula eucariota

agrega aproximadamente dos aminoácidos por segundo en una cadena polipeptídica;

mientras que los ribosomas de las células procarióticas agregan cerca de 20 aminoácidos

por segundo.

Los ribosomas contienen cuatro sitios de unión para las moléculas de ARN: uno de estos


269

sitios está destinado a la unión del ARNm y los tres restantes (denominados sitio A; sitio P;

y el sitio E) son para los ARNts. Una molécula de ARNt calza estrechamente en los sitios A o

P, sólo si su anticodón se aparea con las bases complementarias del codón (admitiendo el

wobble) sobre el ARNm que está unido al ribosoma. Los sitios A y P están suficientemente

cerca de modo tal que permiten que dos moléculas de ARNt sean forzadas a aparearse con

codones adyacentes de moléculas de ARNm. Esta característica de los ribosomas mantiene

el marco de lectura correcto sobre la molécula de ARNm.

Una vez que se inicia la síntesis de las proteínas, cada nuevo aminoácido se agrega a la

cadena que se está elongando en un ciclo de reacciones que consiste de tres pasos

principales. Esta descripción del proceso de elongación de la cadena, comienza en un punto

en el cual algunos aminoácidos siempre han sido ligados y existe una molécula de ARNt en

el sitio P sobre el ribosoma, unido covalentemente al extremo del polipéptido creciente. En

el paso (1), un ARNt portando el siguiente aminoácido en la cadena se une al sitio A‐

ribosomal formando pares de bases con el codón en el ARNm allí posicionado, de esta

manera, los sitios P‐ y A‐ contienen ARNts adyacentes unidos. En el paso (2) el extremo

carboxilo de la cadena polipeptídica se libera del ARNt del sitio P (por ruptura de la unión

de alta energía entre el ARNt y su aminoácido) y unido al grupo amino libre del aminoácido

ligado al ARNt en el sitio A‐, formando una nueva unión peptídica. Esta reacción central de

la síntesis de proteínas es catalizada por la actividad catalítica de una peptidil transferasa

contenida en la subuinidad ribosomal mayor. Esta reacción va acompañada por varios

cambios conformacionales en el ribosoma, el cual cambia los dos ARNts hacia los sitios E‐ y

P‐ de la subunidad mayor. En el paso 3 otra serie de cambios conformacionales mueven el

ARNm exactamente 3 nucleótidos a través de los ribosomas y reubican a los ribosomas

para que estén preparados para recibir el siguiente aminoacilo‐ARNt. El paso 1 es luego

repetido con un nuevo aminoacilo‐ARNt ingresante y así sucesivamente.

Este ciclo de tres pasos es repetido cada vez que un aminoácido se agrega a la cadena

polipeptídica, y la cadena crece por la adición de aminoácidos a su extremo carboxilo hasta

que se encuentra un codón de terminación.

Los factores de elongación conducen el proceso de traducción

El ciclo básico de elongación mostrado en la figura XX tiene una característica adicional que


270

hace al proceso de traducción, especialmente eficiente y preciso. Dos factores de

elongación (EF‐Tu y EF‐G) ingresan y salen del ribosoma durante cada ciclo, cada uno

hidroliza GTP a GDP, sufriendo cambios conformacionales en el proceso. Bajo ciertas

condiciones, los ribosomas pueden realizar síntesis de proteínas sin la ayuda de los

factores de elongación y la hidrólisis de GTP pero esta síntesis es lenta y poco eficiente e

imprecisa. El proceso es acelerado enormemente por el acoplamiento de cambios

conformacionales en los factores de elongación y de los ribosomas. Aunque estos cambios

conformacionales de los ribosomas no son comprendidos en detalle algunos de estos

cambios involucran rearreglos similares a aquellos que ocurren el empalmosoma. Los ciclos

de asociación de los factores de elongación, hidrólisis de GTP y la disociación que asegura

que los cambios conformacionales ocurran en la dirección “forward” y la traducción

procede así eficientemente.

Adicionalmente, para ayudar el movimiento de traducción forward, se cree que EF‐Tu

incrementa la precisión de la traducción monitoreando la interacción inicial entre el ARNt

cargado y un codón. El ARNt cargado ingresa al ribosoma unido al EF‐Tu‐GTP. A pesar que la

unión de factor de elongación permite el apareamiento y unión del codón y el anticodón,

previene que el aminoácido se incorpore a la cadena polipeptídica creciente. El

reconocimiento del codón inicial, sin embargo, dispara el factor de elongación hidrolizando

su GTP (a GDP+Pi), como resultado de esto, el factor se disocia del ribosoma sin el ARNt,

permitiendo que la síntesis continúe. El factor de elongación introduce una corta demora

entre el apareamiento de las bases codón ‐ anticodón y la elongación de la cadena

polipeptídica; esta demora permite la eliminación de ARNts incorrectamente unidos antes

de que se produzca la elongación de la cadena polipeptídica. La primera demora se debe al

tiempo requerido por la hidrólisis del GTP. La tasa de la hidrólisis de GTP por el EF‐Tu es

más rápida cuando el apareamiento codón‐anticodón es correcto, que cuando éste es un

apareamiento incorrecto, consecuentemente una molécula de ARNt incorrectamente

unida posee una ventana de oportunidades para disociarse de los ribosomas más larga. En

otras palabras, la hidrólisis de GTP capta selectivamente la unión de ARNt correcta. Una

segunda demora ocurre entre la disociación de EF‐Tu y el acomodamiento completo de la

ARNt en el sitio A de los ribosomas. Aunque este intervalo se cree que es el mismo para los

ARNts incorrecta‐ o correctamente unidos, dado que los primeros forman un menor


271

número uniones puente hidrógeno codón‐anticodón que los correctamente apareados, son

más fáciles de disociarse durante este período. Estas dos demoras introducidas por el

factor de elongación provocan que la mayoría de las moléculas de ARNt incorrectamente

unidas (así como también un número significativo de moléculas correctamente unidas)

dejen los ribosomas sin ser usados para la síntesis de proteínas. Así, este mecanismo de dos

pasos es responsable del 99,99% de la precisión de los ribosomas en la traducción de

proteínas.

Recientes descubrimientos indican que el EF‐Tu podría tener un rol adicional en el

incremento de la precisión de la traducción. Ya hemos discutido previamente el rol clave de

las aminoacil sintetasas en el preciso encaje de los aminoácidos al ARNt. Como la forma

unida de GTP a EF‐Tu acompaña a las aminoacil‐ARNts a los ribosomas, aparentemente

realiza un doble chequeo para la adecuada correspondencia entre los aminoácidos y el

ARNt, rechazando a aquellos que están mal apareados. El cómo se realiza esto, no está

completamente comprendido pero se cree que debe involucrar a todo la energía de unión

entre el EF‐Tu y el aminoacil‐ARNt. De acuerdo a esta idea, la correcta coincidencia tiene

una afinidad estrechamente definida por EF‐Tu y un coincidencia incorrecta tanto puede

ser muy débil o muy fuerte. Así el EF‐Tu parece discriminar crudamente entre muchas

diferentes combinaciones de aminoácidos‐ARNt, permitiendo selectivamente que solo las

correctas ingresen al ribosoma.

El ribosoma es una ribozima

El ribosoma es una estructura muy grande y compleja compuesta de dos tercios ARN y un

tercio de proteínas. La determinación de la estructura tridimensional de sus subunidades

menor y mayor en el año 2000, confirmó la evidencia temprana que el ARNr ‐y no las

proteínas‐ es el responsables de toda la estructura de los ribosomas, su capacidad para

posicionar a los ARNts sobre el ARNm y su capacidad catalítica en la formación de las

uniones peptídicas covalentes. Así, los ARNs ribosomales son estructuras tridimensionales,

altamente compactas, precisamente plegadas que forman el corazón de los ribosomas y

asimismo determinan su forma.

En marcado contraste con la posición central del ARNr, las proteínas ribosomales

generalmente están localizadas sobre la superficie y completan las interrupciones y los


272

pliegues de los ARNs plegados, Algunas de estas proteínas contienen dominios globulares

sobre la superficie de los ribosomas que envían sus extensiones a las regiones de cadenas

polipeptídicas que penetran cortas distancias en orificios en el core de ARN. El principal rol

de las proteínas ribosomales parece ser la estabilización del core de ARN permitiendo los

cambios en la conformación del ARNr, necesarios para que el ARN catalice la síntesis de

proteínas.

No sólo los tres sitios de unión para los ARNts (los sitios A, P y E) sobre los ribosomas se

forman principalmente por los ARNs ribosomales, sino que los sitios catalíticos para la

formación de uniones peptídicas son claramente provistos por el ARN 23S de procariotas o

28S de eucariotas, con el aminoácido más cercano, localizado 1,8 nm más allá. Este sitio

catalítico peptidil‐transferasa basado en ARN, es similar en muchos aspectos al encontrado

en algunas proteínas; este es un bolsillo altamente estructurado que orienta precisamente

los dos reactivos (la cadena peptídica creciente y el aminoacil‐ARNt) y provee un grupo

funcional como para actuar en la catálisis de ácido ‐ base. En este caso, aparentemente

actúa un anillo de la base nitrogenada adenina, en lugar de una cadena lateral

aminoacídica, como la de la histidina. La capacidad de una molécula de ARN para actuar

como un catalizador fue inicialmente sorprendente pues se creía que el ARN carecía de los

grupos dadores o aceptores de electrones apropiados. Aunque el pK de los anillos de

nitrógeno de la adenina es usualmente alrededor de 3,5, la estructura tridimensional y la

distribución de cargas del sitio activo del ARN 23S fuerza el pK de ésta aparentemente

crítica adenina, creando así la actividad enzimática.

Las moléculas de ARN que poseen actividad catalítica son conocidas como ribozimas. La

capacidad de las moléculas de ARN para actuar como catalizadores de una amplia variedad

de reacciones diferentes, podría significar que esta molécula fue clave en la evolución

temprana de las células vivas. Actualmente se cree que existen buenas razones para pensar

que el ARN, más que las proteínas, actuó como catalizador primitivo para las células

vivientes. Esto podría explicar el por qué el mecanismo de síntesis de proteínas pudo

evolucionar en los sistemas biológicos a partir casi exclusivamente de los ribosomas.

Las secuencias nucleotídicas en el ARNm señalizan dónde comienza la síntesis de

proteínas


273

La iniciación y terminación del proceso de traducción ocurre a pesar de las variaciones en el

ciclo de elongación descripto previamente. El sitio en el cual la síntesis de proteínas

comienza sobre la hebra de ARNm es especialmente crucial, ya que en el conjunto de

marcos de lectura para la longitud total del mensaje, un error de un nucleótido puede

causar que cada codón subsiguiente en el mensaje sea mal leído, de tal forma que la

proteína no sea funcional o exhiba una secuencia de aminoácidos distorsionada.

El paso de iniciación es también de gran importancia ya que para la mayoría de los genes es

el último paso en el cual la célula puede decidir si el ARNm será o no traducido y la proteína

sintetizada; la tasa de iniciación determina así la tasa a la cual la proteína se sintetiza.

La traducción de un ARNm comienza con el codón AUG, y se requiere un ARNt especial

para iniciar la traducción. Este ARNt iniciador siempre lleva el aminoácido metionina (en

bacterias, se usa una forma modificada de la metionina: la formilmetionina) de tal manera

que toda nueva proteína tiene a la metionina como el primer aminoácido en su extremo N‐

terminal, que es el que sintetiza primero. Esta metionina, usualmente se remueve más

tarde por una proteasa específica. El ARNt iniciador tiene una secuencia nucleotídica (que

está acoplada a la metionina) es primero cargado a la subunidad pequeña con una proteína

adicional denominada factor de iniciación eucariótico o eIFs. De todos los aminoacil ARNt

presentes en la célula, sólo el iniciador cargado con metionina es capaz de unirse

fuertemente a la subunidad menor de los ribosomas sin que se encuentre todo el ribosoma

completo. A continuación, la subunidad menor de los ribosomas unida al extremo de una

molécula de ARNm que es reconocida por su capuchón 5’ y sus dos factores de iniciación

unidos eIF4E (que está directamente unido al capuchón) y el eIF4G. La subunidad menor de

los ribosomas luego se mueve de 5’ a 3’ a lo largo del ARNm, buscando el primer AUG. Este

movimiento es facilitado por factores de iniciación adicionales que actúan como helicasas

ATP‐dependientes, permitiendo que la subunidad menor barra a lo largo de la estructura

secundaria del ARN. En el 90% de los ARNms, la traducción comienza con el primer AUG

encontrado por la subunidad pequeña. En este punto, los factores de iniciación se disocian

de la subunidad menor de los ribosomas para que se complete el ensamble de los

ribosomas. El ARNt iniciador está ahora unido en el sitio P de los ribosomas dejando libre el

sitio A. La síntesis de proteínas está así lista para comenzar con la adición de la siguiente


274

molécula aminoacil‐ARNt.

Los nucleótidos que rodean inmediatamente el sitio de inicio en el ARNm de eucariotas

influencian la eficiencia del reconocimiento de AUG durante el proceso de barrido anterior.

Si este sitio de reconocimiento es muy diferente de la secuencia consenso la subunidad

ribosomal de barrido puede ignorar el primer codón AUG en el ARNm y salta al segundo o

tercer codón AUG. Las células usualmente usan este fenómeno conocido como “barrido de

goteo” para producir dos o más proteínas, difiriendo en su N‐terminal, a partir de la misma

molécula de ARNm. Esto le permite a algunos genes producir la misma proteína con o sin

una secuencia señal en su extremo N‐terminal, de tal manera que la proteína puede ser

dirigida a dos compartimientos diferentes en la célula.

El mecanismo para seleccionar un codón de inicio en bacterias es diferente. Los ARNms

bacterianos no poseen capuchón 5’ que le indique a los ribosomas donde comienza el sitio

de comienzo de la traducción. En lugar de eso, cada ARNm bacteriano posee un sitio de

unión a los ribosomas conocido como secuencia de Shine‐Dalgano, está localizada unos

pocos nucleótidos corriente arriba del sitio AUG que es el punto donde comienza la

traducción. Esta secuencia de nucleótidos, con el consenso 5’‐AGGAGGU‐3’, posee bases

complementarias con la molécula 16S del ARNr de la subunidad ribosómica pequeña y

posiciona al codón de iniciación AUG en el ribosoma. Un conjunto de factores de iniciación

de la traducción orquestan esta interacción, así como también el subsiguiente ensamble de

la subunidad ribosómica grande para completar el ribosoma.

A diferencia de los ribosomas eucarióticos, un ribosoma bacteriano puede asimismo

ensamblarse directamente sobre un codón de iniciación ubicado en el interior de una

molécula de ARNm, tan larga como el sitio de unión precede por varios nucleótidos. Como

resultado, el ARNm bacteriano es a menudo polisistrónico esto es, codifica varias proteínas

diferentes, cada una de las cuales se traduce de la misma molécula de ARNm. En contraste

el ARNm eucariótico, generalmente sólo codifica una proteína.

El codón de parada marca el final de la traducción

El final de una proteína es señalado por la presencia de uno de tres codones (UAA, UAG, o

UGA) llamados también codones de parada o stop. Estos no son reconocidos por ningún

ARNt y no especifican un aminoácido pero señalizan a los ribosomas para que finalice la


275

traducción. Las proteínas conocidas como factores liberadores se unen a los ribosomas con

el codón stop posicionado en el sitio A y esta unión fuerza a la peptidiltransferasa en el

ribosoma a catalizar la adición de una molécula de agua al peptidil ARNt, en lugar de un

aminoácido. Esta reacción libera el extremo carboxilo de la cadena polipeptídica creciente

de su anclaje a una molécula de ARNt y en función de que este anclaje normalmente porta

la cadena polipeptídica creciente, es inmediatamente liberada hacia el citoplasma. El

ribosoma libera luego al ARNm y las subunidades se separan, hasta encontrar otra

molécula de ARNm para comenzar un nuevo ciclo de síntesis de proteína.

Los factores de liberación proveen un dramático ejemplo del mimetismo molecular, donde

un tipo de molécula recuerda la forma de una molécula no relacionada. En este caso la

estructura tridimensional de los factores de liberación (constituidos totalmente por

proteínas) recuerda en cuanto a forma y distribución de cargas a una molécula de ARNt.

Este mimetismo de carga y forma, permite a los factores de liberación entrar en el sitio A

de los ribosomas y provocan la finalización de la traducción.

Durante la traducción, el polipéptido naciente se mueve a través de un largo túnel acuoso

(~10 nm x 1,5 nm) en la subunidad grande de los ribosomas. La pared de este túnel,

principalmente ARNr 23S, esta compuesta de pequeños parches hidrofóbicos embebidos

en una mas extensa superficie hidrofílica. Esta estructura debido a que no es

complementaria a ninguna estructura peptídica, provee una cobertura tipo “Teflón” a

través de la cual, una cadena polipeptídica puede deslizarse fácilmente. La dimensión del

túnel sugiere que las proteínas nacientes son fundamentalmente no estructuradas cuando

pasan por los ribosomas, aunque algunas hélices α pueden formarse antes de dejar al túnel

del ribosoma.

Las proteínas son sintetizadas sobre polirribosomas

La síntesis de la mayoría de las proteínas se produce entre aproximadamente 20 segundos

varios minutos. Pero aún durante este corto período de tiempo tienen lugar múltiples

iniciaciones sobre cada molécula de ARNm iniciada. Conforme se ha traducido suficiente

ARNm sobre el ribosoma precedente y la secuencia nucleotídica emerge de éste, el

extremo 5’ es capturado por un nuevo ribosoma. Las moléculas de ARNm que estan siendo

traducidas se encuentran a menudo formando polirribosomas (también conocidas como


276

polisomas). Estos son grandes ensambles citoplasmáticos constituídos por vatrios

ribosomas espaciados cada ~80 nucleótidos a lo largo de una molécula simple de ARNm.

Estas múltiples iniciaciones significan que pueden fabricarse muchas más moléculas de

proteínas en un tiempo dado, que si cada uno debiese completarse antes de que comience

la síntesis de la próxima molécula.

Tanto bacterias como eucariotas utilizan polisomas y ambos emplean estrategias

adicionales para acelerar la tasa de síntesis de proteínas. Debido a que el ARNm bacteriano

no requiere procesamiento y es accesible a los ribosomas mientras está siendo sintetizado,

los ribosomas pueden anclarse al extremo libre de la molécula de ARNm y comenzar a

traducirse aún antes de que la transcripción se haya completado. En eucariotas los

extremos 3’ y 5’ del ARNm se encuentran interactuando, por lo tanto, tan rápidamente

como se disocia el ribosoma, sus dos subunidades están en óptimas condiciones para

reiniciar la traducción en la misma molécula de ARNm.

Mecanismos de control de calidad operan en muchos estadios de la traducción

La traducción por los ribosomas es un compromiso entre precisión y velocidad. Se ha

observado que la precisión de la traducción (un error por cada 104 aminoácidos unidos)

requiere una demora de tiempo cada vez que se agrega un nuevo aminoácido a la cadena

polipeptídica, produciendo una overall velocidad de traducción de 20 aminoácidos

incorporados por segundo en bacterias. Bacterias mutantes con una alteración específica

en su subunidad ribosómica menor traducen el ARNm en proteínas con una precisión

considerablemente mas alta que esto, sin embargo, la velocidad es tan lenta que las

bacterias son raramente capaces de sobrevivir.

Se ha observado que la precisión de la síntesis de las proteínas requiere del gasto de

energía libre; esto es de esperarse ya que siempre debe pagarse un por cada incremento en

el orden de las células. En la mayoría de las células, la síntesis de proteínas consume más

energía que ningún otro proceso biosintético. Se rompen al menos cuatro uniones fosfato

de alta energía, por cada nuevo enlace peptídico formado: dos son consumidos en la carga

de una molécula de ARNt con un aminoácido, y dos más conducen los pasos en el ciclo de

reacciones que ocurren sobre el ribosoma durante la síntesis misma. Adicionalmente, cada

vez que un aminoácido equivocado se inserta en la cadena, se consume energía extra y lo


277

mismo ocurre cada vez que un ARNt erróneo ingresa al ribosoma, disparando la hidrólisis

de GTP y es rechazado. Para ser efectivo, este mecanismo de lectura de prueba debe

también remover una fracción apreciable de interacciones correctas; por esta razón, son

aún más costosos en energía que lo que teóricamente podría calcularse.

Otros mecanismos de control de calidad, aseguran que una molécula de ARNm eucariótico

esté completo antes que los ribosomas comiencen a traducirla. Los ARNm rotos o

incompletamente procesados podrían ser dañinos para la célula o podrían producirse. En

eucariotas se ha visto que la producción de ARNm no sólo involucra la transcripción sino

también una serie de elaborados pasos de procesamiento que se llevan a cabo en el núcleo,

y sólo cuando el ARNm está completo, es transportado al citosol para ser traducido. Una

molécula de ARNm que estaba intacta en el núcleo puede romperse en el citosol. Para

evitar la traducción de las moléculas de ARNm tanto el capuchón 5’ y la cola 3’ poli‐A son

reconocidos por el aparato de iniciación de la traducción, antes de que la traducción

comience.

Las bacterias solucionan este problema de ARNm incompletos en una vía enteramente

diferentes. No solo no existen señales en el extremo 3’ de los ARNm bacterianos, sino

también, la traducción a menudo comienza antes de que la síntesis de los transcriptos ha

sido completada. Cundo el ribosoma bacteriano traduce el extremo de un ARN incompleto,

un ARN especial, denominado ARNtm ingresa al sitio A del ribosoma y es traducido;

agregando un marcador especial de 11 aminoácidos en el extremo carboxilo de la proteína

truncada que señaliza a proteasas para que la degraden.

Existen variaciones menores en códigos genéticos estándar

Como se discutió antes, el código genético se aplica a las tres ramificaciones más

importantes de la vida, proveyendo de una evidencia importante para el origen común de

toda la vida sobre la tierra. Aunque raras, existen excepciones para este código. Por

ejemplo, Candida albicans, el mas persistente patógeno fúngico de los humanos traduce el

codón CUG como serina mientras que todos los otros organismos lo traducen como

leucina. Las mitocondrias (que tienen su propio genoma y codifican mucho de su aparato

transcripcional) también muestran varias desviaciones del código estándar. Por ejemplo, en

las mitocondrias AUA es traducida como metionina mientras que en el citosol de la célula


278

es traducido como isoleucina.

El tipo de desviación en el código genético discutido antes es del tipo “hardwired”. Un tipo

diferente de variación algunas veces denominada “recodificación traduccional” ocurre en

muchas células. En este caso, otra información de secuencias nucleotídicas presentes en un

ARNm pueden cambiar el significado del código genético en un sitio particular del ANm. El

código genético estándar permite a las células fabricar las proteínas usando sólo 20

aminoácidos. Sin embargo, bacterias, arqueas y eucariotas disponen de un vigésimo primer

aminoácido que puede ser incorporado directamente en una cadena polipeptídica

creciente a través del proceso llamado recodificación traduccional. La Selenocisteína que es

un aminoácido esencial para varias enzimas, contiene un átomo de selenio en lugar del

azufre de la cisteína. La selenocisteína se produce a partir de una serina anclada a una

molécula particular de ARNt que se aparea con el codón UGA, un codón que normalmente

se usa como stop de la traducción. Los ARNms para las proteínas en las que la

selenocisteína debe ser insertada en el codón UGA poseen una secuencia nucleotídica

adicional en las cercanías del ARNm que causan este evento de recodificación, (ver Fig. 6‐77

Albert).

Otra forma de recodificación es el cambio de marco traduccional (translational

frameshifting). Este tipo de recodificación es comúnmente usado por retrovirus, un gran

grupo de virus eucarióticos, en los cuales se permite que más de una proteína se sintetice a

partir de una molécula de ARNm. Estos virus fabrican tanto las proteínas de la cápside

(proteínas Gag) y las transcriptasa reversa y la integrasa (proteínas Pol). Tales virus

necesitan más copias de las proteínas Gag que de las Pol, y realizan este ajuste cuantitativo

codificando los genes pol justo antes que los genes gag pero en un marco de lectura

diferente. Un codón stop al final de la secuencia codificante de los genes gag pueden ser

salteados por un cambio de marco traduccional intencional que ocurre corriente arriba de

él. Este cambio del marco de lectura ocurre en un codón particular en el ARNm y requiere

de una secuencia señal de recodificación que parece ser una característica estructural de la

secuencia de ARN corriente debajo de este sitio.

Muchos inhibidores de la síntesis de proteínas procarióticas son usados como antibióticos

Muchos de los antibióticos más efectivos usados en medicina son componentes fabricados


279

por los hongos que actúan como inhibidores de la síntesis de proteínas. Algunas de estas

drogas explotan las diferencias estructurales y funcionales que existen entre los ribosomas

bacterianos y los eucarioticos, interfiriendo diferencialmente con la función de los

ribosomas bacterianos. Así, algunos de estos componentes pueden ser tomados en altas

dosis sin causar toxicidad en humanos. Debido a que diferentes antibióticos se unen a

diferentes regiones de los ribosomas bacterianos, ellos inhiben diferentes pasos del

proceso de síntesis. Algunos de los más comunes son usados tambien en estudios de

biología celular. Algunos inhiben la síntesis de proteínas en eucariotas y por lo tanto no

pueden usarse como antibióticos.

El cloranfenicol, por ejemplo, inhibe la síntesis de proteínas sólo en los ribosomas

mitocondriales, (y en cloroplastos en plantas) reflejando el probable origen procariotico de

estas organelas. La cicloheximida en contraste, afecta solo los ribosomas citosólicos. La

puromicina es especialmente interesante ya que es un análogo estructural de una molécula

de ARNt ligada a un aminoácido y es otro ejemplo de mimetismo molecular. El ribosoma

engañado por la molécula y la incorpora covalentemente al extremo carboxilo de la cadena

polipeptídica creciente, cuasando la prematura finalización y liberación del polipéptido. La

puromicina inhibe tanto la síntesis de proteínas de eucariotas como de procariotas.

Las proteínas comienzan a plegarse aun cuando están siendo sintetizadas

El proceso de expresión génica no termina cuando el código genético se ha usado para

sintetizar una secuencia de aminoácidos. Para ser útil este polipéptido debe plegarse en su

conformación tridimensional única, unir todo pequeño cofactor requerido para su

actividad, ser apropiadamente modificado por proteínas cinasas, u otras enzimas

modificadoras de proteínas, y ensamblarse correctamente con las otras subunidades

proteicas con las cuales ellas funcionan.

La información necesaria para los pasos de maduración proteica listados antes es

finalmente contenida en la secuencia de aminoácidos ligados que el ribosoma produce

cuando el traduce una molécula de ARNm en una cadena polipeptídica. Cuando una

proteína se pliega en una estructura compacta, la mayoría de los residuos hidrofóbicos se

encierran en el core interior. Adicionalmente, gran número de interacciones no covalentes

se producen entre varias partes de la molécula. Es la suma de todos estos arreglos


280

energéticamente favorables lo que determina el patrón del plegamiento final de la cadena

polipeptídica ‐como la conformación de la menor energía libre.

A través de muchos millones de años de tiempo evolutivo, la secuencia de aminoácidos de

cada proteína ha sido seleccionada no sólo por la conformación que adopta sino también

por su capacidad para plegarse rápidamente conforme la cadena polipeptídica sale del

ribosoma, comenzando por su extremo N‐terminal. Los experimentos han demostrado que

una vez que un domino proteico en una proteína multidomino emerge de los ribosomas,

ellos forman una estructura compacta que contiene la mayoría de las estructura secundaria

final (hélices α y hojas β) dentro de unos pocos segundos, alineándose en la forma correcta

en forma gruesa. Para muchos dominios proteícos, esta estructura inusualmente abierta y

flexible, que se denomina molten globule, es el punto inicial por el que ocurre un

relativamente lento proceso en el que se producen muchos ajustes de las cadenas laterales

hasta que se forma la estructura correcta. Sin embargo, ya que a los ribosomas demoran

varios minutos en sintetizar una proteína de tamaño promedio, una gran parte del proceso

de plegamiento se completa en el tiempo que el ribosoma libera el extremo carboxilo

terminal de una proteína.

Las chaperonas ayudan a guiar el plegamiento de muchas proteínas

El plegamiento de muchas proteínas se realiza más eficientemente por una clase especial

de proteínas llamadas chaperonas moleculares. Estas últimas son muy útiles para las

células pues hay una variedad de diferentes patrones que pueden tomarse para convertir

una estructura de molten globule de una proteína en su forma funcional. Para muchas

proteínas algunos de los intermediarios formados a lo largo de esta vía podrían agregarse y

quedar fuera de la vía de muerte sin la intervención de una chaperona que reforma el

proceso de plegamiento.

Las chaperonas moleculares fueron primero identificadas en bacterias cuando mutantes de

E. coli fallaron en permitir que el bacteriófago lambda se replique en ellos.

Estas células mutantes producen versiones levemente alteradas de la maquinaria de

chaperonas y como resultado de esto, son defectuosas en pasos específicos del ensamble

de las proteínas virales. Las chaperonas moleculares se incluyen en el grupo de las

proteínas de choque térmico (heat shock proteins: hsp) debido a que ellas son sintetizados


281

en grandes cantidades cuando las células son sometidos brevemente a altas temperaturas

(por ejemplo, a 42º C para células que normalmente viven a 37º C). Esto refleja la

operación de un sistema de feedback en respuesta a cualquier mal plegamiento de

proteínas (como las que se producen a altas temperaturas) aumentando la síntesis de

proteínas chaperonas que ayudan a estas proteínas a replegarse.

Las células eucariotas tienen al menos dos familias principales de chaperonas moleculares

conocidas como las proteínas hsp60 y la hsp70. Diferentes miembros de las familias

funcionan en diferentes organelas. Por ejemplo, en las mitocondrias contienen sus propias

moléculas hsp60 y hsp70 que son distintas a las que funcionan en el citosol y una hsp70

especial (denominada BIP) que ayuda a plegar a las proteínas en el retículo

endoplasmático.

Las proteínas semejantes a la hsp60 y hsp70 trabajan con su propio conjunto de proteínas

asociadas cuando cooperan en el plegamiento de otras proteínas. Estas comparten afinidad

por los segmentos hidrofóbicos sobre proteínas incompletamente formadas e hidrolizan

ATP, a menudo la unión y liberación de su proteína con cada ciclo de hidrólisis de ATP. En

otro sentido, los dos tipos de proteínas hsp funcionan en forma diferente. La maquinaria

hsp70 actúa tempranamente en la vida de muchas proteínas, uniendo una tira de cerca de

siete aminoácidos hidrofóbicos antes que las proteínas dejen los ribosomas. En contraste,

las proteínas hsp60 forman una estructura con forma de barril que actúa posteriormente

en la vida de las proteínas, después que la proteína ha sido completamente sintetizada.

Este tipo de chaperonas forma una “cámara de aislamiento” en la cual las proteínas mal

plegadas son direccionadas, previniendo su agregación y proveyéndole un ambiente

favorable en el cual intentar replegarlo.

Las regiones hidrofóbicas proveen señales críticas para el control de calidad de las

proteínas

Si se agregan aminoácidos radioactivos a células por períodos de tiempo breves, las

proteínas recién sintetizadas pueden ser seguidas conforme maduran en su forma

funcional final. Este tipo de experimentos permiten mostrar que las proteínas hsp70 actúan

primero cuando la proteína aún está siendo sintetizada en el ribosoma, y que las proteínas

semejantes a la hsp60 están llamadas a jugar un rol posteriormente en el plegamiento de


282

las proteínas. Sin embargo, los mismos experimentos revelan que solo un subconjunto de

proteínas recientemente sintetizadas estan involucradas: quizas 20% de todas las proteínas

con la hsp70 y 10% con las hsp60. ¿Como son seleccionadas estas proteínas para este

replegamiento catalizado por ATP?

Antes de responder esta pregunta, es necesario hacer una pausa para considerar los

hechos post‐traduccionales de las proteínas más ampliamente. Una proteína que tiene

segmentos de aminoácidos hidrofóbicos sobre la superficie es anormal: ha fallado en su

correcto plegamiento después de dejar los ribosomas, sufre un accidente permaneciendo

sin plegar o falla en encontrar una subunidad partner en una proteína compleja. Una

proteína así no sólo es no utilizable, sino que puede ser dañina. Muchas proteínas con una

región hidrofóbica expuesta pueden formar grandes agregados que precipitan. En raros

casos estos agregados forman o causan enfermedades severas en humanos. Sin embargo,

en la mayoría de las células existen mecanismos de control que previenen tales desastres.

Con lo discutido en el párrafo anterior no debe sorprenderse que en las células hayan

evolucionado mecanismos elaborados que reconocen y remueven los segmentos

hidrofóbicos en las proteínas. Dos de estos mecanismos dependen de las chaperonas

uniéndose a los segmentos hidrofóbicos y dándole a las proteínas una segunda

oportunidad de plegamiento. Al mismo tiempo, al cubrir los segmentos hidrofóbicos estas

chaperonas previenen transitoriamente la agregación de las proteínas. Las proteínas que se

pliegan correctamente muy rápidamente no muestran tales parches hidrofóbicos y son

salteadas por las chaperonas.

Cuando el intento de replegar correctamente una proteína falla, entra en juego un tercer

mecanismo para destruir completamente la proteína mediante proteólisis. El patrón

proteolítico comienza con el reconocimiento de un parche hidrofóbico sobre la superficie

de las proteínas y finaliza con la liberación de la proteína entera a una máquina de

destrucción proteica conocida como proteosoma. Este mecanismo depende de un sistema

de fabricacion de proteínas conocido como el proteosoma que también lleva adelante otras

funciones destruyendo proteínas normales seleccionadas.

El proteasoma degrada una fracción substancial de proteínas recien sintetizadas en la

célula


283

Las células remueven rápidamente las fallas de su sistema de traducción. Los experimentos

recintes sugieren que un tercio de los polipéptidos recién sintetizados son seleccionados

para su degradación como resultado del proceso de control de calidad proteica. El aparato

de descarte final en eucariotas es el proteasoma, una proteasa ATP dependiente que

constituye cerca del 1% de las proteínas celulares. Presentes en muchas copias dispersas a

través del citosol y el núcleo, el proteosoma también apunta a las proteínas del RE: aquellas

proteínas que fallan en plegarse o ensamblarse correctamente después de ingresar al RE

son detectadas por un sistema de supervivencia del RE que los retranslocaliza hacia el

citosol para su degradación.

Cada proteosoma consiste de un cilindro hueco central (el core 20S proteosoma) formado

por múltiples subunidades proteicas que se ensamblan como una pila cilíndrica de cuatro

anillos heptaméricos. Algunas de estas subunidades son distintas proteasas cuyos sitios

activos están dispuestos hacia la cámara interna del cilindro. Cada extremo del cilindro está

normalmente asociado con un gran complejo (el cap 19S) que contiene aproximadamente

20 polipéptidos diferentes. La subunidad cap incluye al menos seis proteínas que hidrolizan

ATP; localizados cerca del borde del cilindro estas ATPasas se unen a las proteínas no

plegadas para digerirlas, moviéndolas al interior de la cámara para proceder a su

proteólisis. Una propiedad crucial del proteosoma, y una razón para la complejidad de su

diseño es la procesividad de su mecanismo: en contraste con una simple proteasa que cliva

una cadena polipeptídica substrato, el proteosoma mantiene el substrato completo unido,

hasta que es completamente convertido en péptidos cortos.

El cap 19S actúa como una compuerta regulada a la entrada de la cámara proteolítica,

siendo también responsable de la unión de una proteína blanco al proteosoma. Con pocas

excepciones, el proteosoma actúa sobre proteínas que han sido específicamente marcadas

para la destrucción por anclaje covalente de múltiples copias de una pequeña proteína

denominada ubiquitina. Ésta molécula existe tanto en las células libres como ligadas

covalentemente a una amplia variedad de proteínas intracelulares. Para la mayoría de estas

proteínas, este señalamiento con la ubiquitina resulta en su destrucción por el proteosoma.

Un elaborado sistema Ubiquitina‐conjugado marca a las proteínas para su destrucción

La ubiquitina es preparada para su conjugación a otras proteínas por la enzima ATP


284

dependiente activadora de ubiquitina (E1), la que crea una ubiquitina activada que es

transferida a un conjunto de enzimas conjugadas a ubiquitina (E2). La enzima E2 actúa en

conjunto con una proteína accesoria (E3) En el complejo E2‐E3 llamado ligasa ubiquitina, el

componente E3 une a señales de degradación específica en substratos proteicos, ayudando

a la E2 para formar una cadena de multiubiquitina ligada a una lisina del substrato proteico.

En esta cadena, el residuo C‐terminal de cada ubiquitina es ligado a una lisina específica de

la molécula de ubiquitina precedente, produciendo una serie lineal ubiquitina‐ubiquitina

conjugada. Esta cadena multiubiquitina sobre una proteína target es reconocida por un

receptor específico en el proteosoma.

Hay alrededor de 30 enzimas E2 estructuralmente similares pero diferentes en mamíferos y

cientos de diferentes proteínas E3 que forman complejos con enzimas E2 específicas. El

sistema ubiquitina proteosoma consiste así de muchos patrones proteolíticos diferentes,

pero organizados de forma similar, que tienen en común la enzima E1 al top y el

proteosoma en el extremo final, difiriendo por la composición de sus ligasas E2‐E3

ubiquitina y factores asociados. Distintas ubiquitina ligasas reconocen diferentes señales de

degradación, y asimismo, marcan para la degradación a distintos subconjuntos de proteínas

intracelulares que comparten estas señales.

Proteínas mal plegadas o desnaturalizadas, así como proteínas conteniendo grupos

oxidados u otros aminoácidos anormales son reconocidos y destruidos debido a que las

proteínas anormales tienden a presentar sobre su superficie secuencias de aminoácidos o

motivos conformacionales que son reconocidos por señales de degradación por un

conjunto de moléculas E3 en el sistema proteosoma‐ubiquitina; estas secuencias deben,

por supuesto, estar encriptadas y ser inaccesibles en la contraparte normal de estas

proteínas. Sin embargo, un patrón proteolítico que reconoce y destruye proteínas

anormales debe ser capaz de distinguir entre proteínas completadas que tienen

conformaciones “erroneas” y los muchos polipéptidos crecientes sobre los ribosomas, (así

como los polipéptidos liberados de los ribosomas) que aún no han completado su

conformación plegada normal. Esto no es un problema trivial del sistema ubiquitina

proteosoma pude destruir algunas proteínas nacientes no por ser anormales sino porque

exponen transitoriamente señales de degradación que son encriptadas en su estado


285

maduro (plegado).

Muchas proteínas son controladas por destrucción regulada

Una función de los mecanismos proteolíticos, como se ha descripto, es reconocer y eliminar

proteínas anormales o mal plegadas. Otra función de estos patrones proteolíticos es

conferir vidas medias cortas a proteínas específicas normales cuya concentración debe

cambiar rápidamente cuando se alteran los estados de una célula. Algunas de estas

proteínas de corta vida, son rápidamente degradadas todo el tiempo, mientras muchas

otras son condicionalmente de corta vida, esto es, ellas son metabólicamente estables bajo

ciertas condiciones, pero se tornan inestables con cambios en el estado celular. Por

ejemplo, las ciclinas mitóticas son de larga vida a través del ciclo celular hasta su súbita

degradación al final de la mitosis.

Se conocen una variedad de mecanismos, (figura 6‐88 A), por ejemplo, la actividad de una

ubiquitina‐ligasa es activada tanto por la fosforilación de la E3 o por una transición

alostérica en una proteína E3 causada por su unión a moléculas específicas. Por ejemplo, el

complejo promotor de anafase (APC) es una ligasa ubiquitina multisubunidad que es

activada por la adición de una subunidad cell‐cycle‐timed en la mitosis. La APC activada

luego, causa la degradación de ciclinas mitóticas y otros varios reguladores de la transición

metafase‐anafase.

Alternativamente, en respuesta tanto a señales intracelulares o a señales del ambiente, una

señal de degradación puede ser creada en una proteína causando su rápida ubiquitinación

y destrucción por el proteosoma. Una vía común para crear tal señal es fosforilar un sitio

específico sobre una proteína que desenmascara una señal que comúnmente está

escondida. Otra vía para desenmascarar una señal es por la disociación de una subunidad

proteica. Finalmente, poderosas señales de degradación pueden ser creadas por un simple

clivaje de una unión peptídica, creando un nuevo extremo amino que es reconocido por

una E3 específica como un residuo N‐terminal “desestabilizado” (figura 6‐88B).

El tipo de señal de degradación N‐terminal se origina en la regla N‐terminal, la que

relaciona la vida media de una proteína in vivo a la identidad de su residuo N‐terminal.

Existen 12 residuos desestabilizantes en la regla del extremo N‐ de la levadura S. cerevisiae

(Arg, Lys, His, Phe, Leu, Trp Tyr, Glu, Asn, Ile, Asp y Gln). Los residuos desestabilizantes N‐


286

terminales son reconocidos por una ubiquitina ligasa especial que está conservada desde

levaduras a humanos.

Como se vio todas las proteínas son inicialmente sintetizadas compartiendo el residuo

metionina (o formilmetionina en bacterias), que es un residuo estabilizante en la regla N‐

terminal. Proteasas especiales llamadas metionina aminopeptidasas, a menudo remueven

el residuo N‐terminal, pero esto sólo se produce si el segundo aminoácido es también un

residuo estabilizante en la regla N‐terminal de las levaduras. Asimismo, inicialmente no

estaba claro cómo operaba la regla N‐terminal in vivo. Sin embargo, recientemente se ha

descubierto que una subunidad de la cohesina, un complejo proteico que mantiene a las

cromátides hermanas juntas, es clivada por una proteasa sitio‐específica en la transición

metafase ‐ anafase. Este clivaje regulado por el ciclo celular, permite la separación de las

cromátidas hermanas y lleva a la finalización de la mitosis. El fragmento C‐terminal de la

subunidad clivada comparte una arginina N‐terminal, un residuo destabilizante en la regla

N‐terminal. Las células mutantes que carecen del patrón de la regla N‐terminal, exhiben

una frecuencia incrementada de daños cromosómicos presumiblemente debido a que las

fallas en la degradación de estos fragmentos de la subunidad de la cohesina interfieren con

la formación de nuevos complejos cromátidas asociadas con cohesinas en el siguiente ciclo

celular.

Las proteínas anormalmente plegadas pueden agregarse causando patologías humanas

destructivas

Cuando todos los controles de calidad de las proteínas celulares fallan, tienden a formarse

grandes agregados proteicos en las células afectadas (ver figuras 6‐85). Algunos de estos

agregados, al adsorber macromoléculas críticas sobre ellas, pueden dañar severamente y

aún causar muerte celular. Los agregados proteicos liberados desde las células muertas,

tienden a acumularse en la matriz extracelular que rodea a las células en los tejidos, en los

casos extremos causa daños de los tejidos. Debido a que el cerebro está compuesto de una

altamente organizada colección de células nerviosas, este es un tejido altamente

vulnerable. No debe sorprender que los agregados proteicos causen primariamente

enfermedades neurodegenerativas. Entre estas se destacan las enfermedades de

Huntington y Alzheimer esta última causante de la demencia relacionada con la edad en


287

más de 20 millones de personas en el mundo.

Para que un tipo proteico particular de agregado sobreviva, crezca y dañe un organismo,

este debe ser altamente resistente a la proteólisis tanto dentro, como fuera de la célula.

Muchos de los agregados de proteínas que causan problemas forman fibrillas construidas

desde una serie de cadenas polipeptídicas que forman apilamientos de láminas de hojas β.

Estos filamentos β entrecruzados tienden a ser resistentes a la proteólisis. Esta resistencia

explica porque estas estructuras son observadas en muchos de los desórdenes

neurológicos causados por agregados proteicos que producen depósitos anormalmente

teñidos conocidos como amiloideos.

Una variedad particular de estas enfermedades han alcanzado especial notoriedad. Estas

son las enfermedades prion. A diferencia de las enfermedades de Huntington o Alzheimer,

las enfermedades prion, pueden transmitirse de un organismo a otro, por ingestión de un

organismo con prion por otro. Un conjunto de enfermedades ‐llamadas scrapie en cabras,

enfermedad de Creutzfeldt‐Jacob en humanos y encelofatía espongiforme bovina en vacas‐

son causadas por un agregado mal plegado de proteínas llamado PrP (por proteína prion).

La PrP normalmente se localiza sobre la superficie externa de la membrana plasmática,

muy prominentemente en neuronas. Su función normal no se conoce. Sin embargo, PrP

tiene la propiedad de convertirse en una muy especial conformación anormal. Esta

conformación, no solo forma filamentos β entrecruzados, resistentes a proteasas, sino que

es “infecciosa”, debido a que convierte a las formas normales en las patológicas. Esta

propiedad crea un lazo de retroalimentación positiva que propaga la forma anormal

denominada PrP*, que puede propagarse rápidamente de célula en célula en el cerebro,

causando la muerte de animales y humanos. Puede ser dañino comer animales con tejidos

conteniendo PrP*, como se ha visto con la propagación de la enfermedad de la vaca loca de

vacas a humanos en Gran Bretaña.

Afortunadamente en ausencia de PrP* es extraordinariamente difícil convertir PrP a su

forma anormal. Aunque muy pocas proteínas tienen la capacidad de plegarse

erróneamente en una conformación “infecciosa”, una transformación similar ha sido

descubierta que causa una misteriosa “herencia por proteínas” observadas en células de

levaduras.


288

Hay muchos pasos intermedios entre el ADN a proteínas

Se ha observado en este apunte que se requieren muchos tipos diferentes de reacciones

químicas para que se produzca el correcto plegamiento de una proteína en una célula

desde la información contenida en un gen. La eficiencia del plegamiento de las proteínas

depende de la eficiencia con que se realiza cada uno de estos pasos. Cada uno de estos

pasos puede ser regulado por las células, pero es en la iniciación de la transcripción es el

más común para una célula en la regulación de la expresión de cada uno de los genes. Esto

tiene sentido ya que la regulación más eficiente para la expresión de un gen es bloqueando

le primer paso ‐la transcripción de su secuencia de ADN en una molécula de ARN.

REGULACIÓN DE LA TRADUCCIÓN

Aunque la transcripción es el nivel primario de control de la expresión génica, tanto las

células eucariotas como las procariotas poseen mecanismos de control durante la

traducción del ARNm. Uno de los mecanismos de control traduccional es la unión de

proteínas represoras que bloquean la traducción del ARNm.

Uno de los ejemplos mejor conocido en las células eucarióticas es la regulación de la

síntesis de ferritina, una proteína que se almacena en el interior de la célula.

La traducción de la ferritina esta regulada por la presencia de hierro. Cuanto más

abundante es la provisión de hierro, más ferritina se produce.

La proteína represora regula el proceso, ya que en ausencia de hierro se une a una

secuencia del ARNm denominada IRE (iron response elements) en la porción no

traducible del extremo 5’ del ARNm de la ferritina.

En presencia de hierro, el represor no se une a la región IRE del ARNm y la traducción se

efectúa normalmente.

Es interesante notar que la regulación de la traducción del ARNm para ferritina es similar

a la regulación del ARNm del receptor de la transferrina.

En ese caso la estabilidad del mRNA del receptor de transferrina es regulada por la unión

a la región IRE de la región no traducible de la porción 3`.


289

La misma proteína une a diferentes regiones IRE de los ARNm de ferritina y del receptor

de transferrina.

Sin embargo, las consecuencias de la unión a los diferentes IRE son muy distintas. La

unión a la región 3’ del ARNm del receptor protege el ARNm de su degradación más que

inhibir su traducción.

Estos diferentes efectos, presumiblemente devienen de las distintas regiones en las que

está localizado el IRE. Para funcionar como un sitio de represión, el IRE debe estar

localizado dentro de los 70 nucleótidos del cap del ARNm de la ferritina, sugiriendo que

la unión de la proteína al IRE bloquea la traducción por interferencia del reconocimiento

y la unión del cap por la subunidad S40 del ribosoma. Mientras que al ARNm del

receptor de la transferrina la unión de la proteína lo protege de la degradación por

ARNasas.

Otro mecanismo de regulación traduccional en eucariotas que resulta de un efecto

global sobre toda la actividad traduccional, involucra la modulación de la actividad de

factores de iniciación, particularmente el eIF‐2.

El eIF‐3 (formando un complejo con GTP) se une al iniciador metionilo del ARNt, para

llevarlo hasta el ribosoma. La subsecuente liberación de eIF‐2 va acompañada de

hidrólisis del GTP, dejando al eIF‐2 como un complejo GDP inactivo. Para participar en

otro ciclo de iniciación, el complejo eIF‐2 / GTP debe ser regenerado por el intercambio

de unión GDP por GTP. Este intercambio es mediado por otro factor eIF‐2B.

La regulación de eIF‐2 provee de un punto de control crítico en células eucariotas. En

particular, eIF‐2 puede ser fosforilado por proteína‐quinasas regulatorias. Esta

fosforilación bloquea el intercambio de GDP unido a GTP, inhibiendo así la iniciación de

la traducción. Esta fosforilación ocurre por ejemplo en los reticulocitos encargados de la

síntesis de hemoglobina.

La traducción de ARNm para globina está controlada por la disponibilidad grupos heme,

el ARNm es traducido, sólo si hay adecuado heme disponible. En ausencia de heme una

proteína – quinasa que fosforila a eIF‐2 se activa y así toda la traducción se inhibe.


290

Un mecanismo similar de ha encontrado en otros tipos celulares, particularmente en

células infectadas por virus, en las que la síntesis de la proteína viral es inhibida por el

interferon.

Otros estudios han implicado al eIF‐4E, que se une a la región 5’ cap de los ARNms como

una regulación traduccional de proteínas. Por ejemplo la hormona insulina, estimula la

síntesis de proteínas en adipocitos y células musculares. Este efecto de la insulina estaría

mediado, al menos en parte, por la fosforilación de proteínas asociadas con el IF4‐E, lo

que resultaría en la tasa de iniciación traduccional.

La regulación traduccional es particularmente importante durante el desarrollo

embrionario temprano. Como se ha discutido previamente, una variedad de ARNms se

almacenan en los oocitos en forma no traducible, el proceso de traducción se activa

luego de la fertilización o aún más tardíamente. Este mecanismo de regulación

traduccional está controlado por la poliadenilación del ARNms de los oocitos.

Muchos ARNms no traducidos son almacenados en los oocitos con colas de poli‐A de

aproximadamente 20 nucleótidos. Estos ARNms son recuperados por traducción en las

etapas adecuadas del desarrollo, por alargamiento de sus colas poli‐A a varios cientos de

nucleótidos. Además, la traducción de algunos ARNms durante el desarrollo parece ser

regulada por proteínas represoras que se unen a secuencias específicas en sus regiones

3’ no traducibles. Estas proteínas regulatorias pueden también dirigir ARNms a regiones

específicas del huevo o del embrión, permitiendo la síntesis localizada de la proteína

codificada durante el desarrollo embrionario.

Plegamiento y procesamiento de proteínas

El proceso de traducción, completa el flujo de información genética dentro de la célula.

La secuencia de ADN se ha convertido ahora en una cadena polipeptídica de

aminoácidos. Sin embargo, la síntesis de un polipéptido no es equivalente a la

producción de una proteína funcional. Para ser utilizables, los polipéptidos deben

además plegarse adoptando distintas conformaciones tridimensionales y en muchos

casos cadenas polipetídicas múltiples deben ensamblarse en un complejo funcional.

Además, muchas proteínas sufren modificaciones más profundas, incluyendo el clivaje y


291

la adición covalente de carbohidratos o lípidos, que son críticos para la correcta función

y localización de las proteínas dentro de la célula.

CHAPERONAS Y PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS

Las conformaciones tridimensionales de las proteínas resultan de interacciones entre las

cadenas laterales de sus aminoácidos. El clásico principio de plegamiento proteico es

que toda la información requerida para adoptar la correcta información tridimensional

está dada por la secuencia de sus aminoácidos. Esto fue inicialmente establecido por los

experimentos de Anfinsen quien demostró que la RNAsa desnaturalizada puede

replegarse in vitro a su conformación activa.

El plegamiento proteico parece ser así un proceso de autoensamble que no requiere

factores celulares adicionales. Estudios más recientes, sin embargo, han demostrado

que esto no es una descripción adecuada del plegamiento proteico dentro de la célula,

mediado por las actividades de otras proteínas.

Las proteínas que facilitan el plegamiento de otras proteínas son llamadas chaperonas

moleculares.

El término chaperonas fue originalmente usado por Laskey para describir una proteína

(nucleoplasmina) que se requiere para el ensamble de histonas y DNA. Las

nucleoplasminas se unen a las histonas y median el ensamble en nucleosomas, pero las

nucleoplasminas no son incorporadas a la estructura final del nucleosoma. Las

chaperonas actúan así como catalizadores que facilitan el ensamble sin formar parte del

complejo ensamblado. Estudios subsecuentes han extendido el concepto incluyendo a

las proteínas que median una variedad de otros procesos de ensamble.

Es importante notar que las chaperonas no llevan información adicional requerida para

el plegamiento de los polipéptidos en su correctas conformación espacial.

Las chaperonas catalizan el plegamiento de las proteínas asistiendo su propio ensamble.

Las chaperonas parecen funcionar uniéndose y estabilizando el polipéptido no plegado o

parcialmente plegado.

En ausencia de chaperonas, estos polipéptidos no plegados o incompletamente plegados


292

son inestables en el interior de la célula frecuentemente plegándose incorrectamente o

agregándose en complejos insolubles.

Un buen ejemplo es provisto por las chaperonas que se unen a la cadena naciente

cuando aún está siendo sintetizada, previniendo el plegamiento incorrecto o

agregándose en complejos insolubles.

Un buen ejemplo es provisto por las chaperonas que se unen a la cadena polipeptídica

naciente cuando aún está siendo sintetizado, previniendo el plegamiento incorrecto o la

agregación de la porción amino–terminal antes que la cadena esté finalizada.

Presumiblemente, esta interacción es particularmente importante para proteínas en las

que el extremo carboxilo (el último en ser sintetizado) es requerido para el correcto

plegado del extremo amino. En tal caso, la unión a las chaperonas estabiliza la porción

amino terminal en una conformación no plegada hasta que el resto de la cadena

polipetídica es sintetizada y completada y pueden plegarse correctamente. Las

chaperonas también estabilizan las cadenas polipeptídicas no plegadas durante su

transporte hacia las organelas subcelulares – por ejemplo, durante su transferencia de

proteínas hacia las mitocondrias desde el citosol.

Las proteínas son transportadas a través de la membrana mitocondrial en

conformaciones parcialmente no plegadas que están estabilizadas por las chaperonas en

el citosol. Las chaperonas dentro de las mitocondrias luego facilitan la transferencia de la

cadena poliptídica a través de la membrana y su subsecuente plegamiento dentro de las

organelas. Además, las chaperonas están involucradas en el ensamble de las proteínas

que consisten de múltiples cadenas polipeptídicas en el ensamble de las estructuras

macromoleculares (por ejemplo la nucloplasmina) y en la regulación de la degradación

de proteínas.

Muchas de las proteínas ahora conocidas como chaperonas moleculares, fueron

inicialmente identificadas heat shock proteins, un grupo de proteínas expresadas en las

células que están sujetas a temperaturas elevadas u otras formas de estrés ambiental.

Las heat shock proteins (abreviadas como Hsp) están altamente conservadas tanto en

células procariotas como eucariotas, se cree que estabilizan y facilitan el repliegue de


293

proteínas que han sido parcialmente desnaturalizados como resultado de la exposición a

temperaturas elevadas. Sin embargo, muchos miembros de la familia de las Hsp que son

expresadas y tienen funciones esenciales bajo condiciones de crecimiento normales.

Estas proteínas sirven como chaperonas moleculares que se necesitan para los

plegamientos polipetídicos y se transportan bajo condiciones normales así como

también en células sujetas al estrés ambiental. Las proteínas de choque térmico Hsp70 y

Hsp60 conforman una familia particularmente importante en los patrones e

plegamiento proteico tanto en células eucariotas como procariotas. Las proteínas de

ambas familias funcionan uniéndose a regiones no plegadas durante la traducción así

como también durante el transporte de los polipéptidos hacia una variedad de

compartimentos subcelulares como mitocondrias y el retículo endoplasmático. Estas

proteínas unen a cortos segmentos (de 6 a 7 aác.) de polipéptidos no plegados,

previniendo la agregación.

La familia de las Hsp60 (también llamadas chaperoninas) facilitan el plegamiento de

proteínas en su conformación nativa. Cada chaperonina consiste de 14 subunidades de

aproximadamente 60 da cada una de las cuales están arregladas en dos anillos que

forman una doble “rosca”. Los polipéptidos no plegados son aislados del citosol

encapsulados en el interior del cilindro. En este ambiente, proteico aislado el

plegamiento se produce mientras la agregación de segmentos de las cadenas

polipeptídicas es prevenida por su unión a las chaperoninas. La unión de los polipéptidos

no plegados a las chaperoninas es una reacción reversible que está acoplada a la

hidrólisis del ATP como fuente de energía. La hidrólisis del ATP conduce así a múltiples

rondas de liberación y reunión de regiones no plegadas a las chaperoninas, permitiendo

a los polipéptidos plegarse gradualmente en la conformación correcta.

En algunos casos, miembros de las familias Hsp60 y 70 se ha encontrado que actúan

conjuntamente en forma secuencial durante el transporte de proteínas hacia las

mitocondrias y durante el plegamiento de síntesis recién sintetizadas en E. coli. Primero

una chaperona Hsp70 estabiliza cadenas polipeptídicas nacientes hasta que se completa

la síntesis de la proteína. La cadena polipeptídica no plegada se transfiere luego a una

chaperonina Hsp60, en la que tiene lugar el plegamiento proteico, produciendo una


294

correctamente plegada con su conformación tridimensional funcional. Los miembros de

las familias Hsp70 y 60 se encuentran en el citosol y las organelas subcelulares

mitocondrias) de células eucariotas así como también en bacterias. La acción secuencial

de Hsp70 y 60 parecen representar un patrón general de plegamiento proteico. Una

alternativa involucra la acción secuencial de Hsp70 y Hsp90 aunque aún no se

comprende bien el rol de ésta última.

ENZIMAS Y PLEGAMIENTO PROTEICO

Además de las chaperonas que facilitan el plegamiento proteico y estabilizan los

intermediarios parcialmente plegados, las células poseen al menos dos tipos de enzimas

que catalizan el plegamiento proteico por ruptura de las uniones covalentes y su

remodelación.

La formación de puentes disulfuro entre residuos cisteína es importante en la

estabilización de estructuras plegadas de muchas proteínas.

La protein disulfide isomerase cataliza la ruptura y remodelación de estos puentes. Para

proteínas que contienen múltiples residuos cisteína, la PDI juega un rol clave

promoviendo intercambios entre disulfuros apareados, permitiendo a las proteínas

alcanzar el patrón de puentes disulfuro que es compatible con su conformación

establemente plegada.

Los puentes disulfuro están generalmente restringidos a proteínas secreción y a algunas

proteínas de membrana debido a que el citosol contiene agentes reductores que

mantiene los residuos de cisteína en su forma reducida, previniendo así la formación de

puentes disulfuro S–S. En las células eucariotas los puentes disulfuro se forman el

retículo endoplasmático en el que se mantiene el ambiente oxidante. Consistente con el

rol de los puentes disulfuro en la estabilización de las proteínas de secreción en

diferentes tipos celulares.

La segunda enzima que juega un rol en el plegamiento de proteínas cataliza la

isomerización de puentes peptídicas que involucra residuos Prolina.

La Prolina es un aminoácido inusual en el que el equilibrio entre la conformación


295

peptídica trans o cis de la unión peptídica que precede los residuos de Prolina está

levemente en favor de la forma trans. La isomerización entre las configuraciones cis y

trans de las uniones peptídicas prolil, que podría de otra forma constituir el paso

limitante en el plegamiento proteico es catalizado por la enzima peptidil prolil

isomerasa. Esta enzima está ampliamente distribuida tanto en células procariotas como

eucariotas y puede catalizar el replegamiento de al menos algunas proteínas. Sin

embargo, su substrato fisiológicamente importante y su rol dentro de las células no ha

sido aún determinado.

CLIVAJE PROTEICO

El clivaje de las cadenas polipeptídicas (proteólisis) es un paso importante en la

maduración de muchas proteínas. Un ejemplo simple es la remoción del iniciador

metionina de la región amino de muchos polipeptídicos que ocurre rápidamente

después que la porción amino terminal de muchos polipéptidos crecientes emergen del

ribosoma. Los grupos químicos adicionales tales como los grupos acetilo o las cadenas

de ácidos grasos, son agregados luego a los residuos amino terminales.

Las modificaciones proteolíticas de la región amino terminal puede jugar un rol

importante en la translocación de muchas proteínas a través de las membranas,

incluyendo proteínas de secreción tanto en bacterias como en eucariotas, así como

proteínas destinadas a la membrana plasmática, a lisosomas, mitocondrias y

cloroplastos de células eucariotas. Estas proteínas son dirigidas hacia su objetivo por

secuencias amino terminales. Que son removidos por clivaje proteolítico cuando la

proteína atraviesa la membrana. Por ejemplo, las secuencias señal amino terminales,

usualmente de aproximadamente 20 aác. (usualmente hidrofóbicos) se dirige hacia la

membrana plasmática como proteínas secretorias en bacterias o hacia el RE en

eucariotas, mientras la traducción progresa.

La secuencia señal se inserta en la membrana conforme emerge de los ribosomas. El

resto de la cadena polipeptídica pasa a través del canal de la membrana mientras se

produce la traducción. La secuencia señal es luego clivada por proteasas específicas de la

membrana (peptidasas señal) y la proteína madura es liberada. En células eucariotas la

translocación de cadenas polipeptídicas crecientes hacia el RE es el primer paso en las


296

proteínas para secreción, para la incorporación a membrana o en lisosomas. En otras

instancias importantes de clivaje proteolítico se forman enzimas activas u hormonas

activas (por ejemplo insulina, ANF, etc.)

Es interesante notar que las proteínas se muchos virus animales se derivan del clivaje de

grandes precursores. Un ejemplo particularmente importante lo constituye el HIV.

En la replicación del HIV una proteasa codificada por el virus cliva polipéptidos

precursores que forman las proteínas virales. Debido a su rol clave en la replicación viral

la proteasa HIV (ademas de su rol como transcriptasa reversa) es un blanco importante

en el desarrollo de drogas a usar en el tratamiento del AIDS. Por ejemplo, los

inhibidoeres de proteasas están entre los agentes más efectivos disponibles para el

tratamiento de esta enfermedad.

GLICOSILACIÓN

Muchas proteínas, particularmente en las células eucariotas, son modificadas por la

adición de carbohidratos, un proceso llamado glicosilación. Las proteínas glicosiladas

usualmente son secretadas o localizadas en la superficie celular, aunque algunas

proteínas de la membrana nuclear y del citosol están glicosiladas.

Las porciones de H de C. de las glicoproteínas juegan importantes roles en el

plegamiento de las proteínas en el RE, en el targeting de proteínas para la liberació de

éstas al compartimento intracelular apropiado y como sitios de reconocimiento en las

interacciones célula – célula.

Las glicoproteínas son clasificadas como N‐ligadas u O‐ligadas, dependiendo del sitio del

ligamiento de la cadena lateral de carbohidratos. En las glicoproteínas O‐ligadas, el

átomo de oxígeno lateral de serina o treonina son el sitio de unión de los carbohidratos.

Los azúcares, que se unen directamente a estas posiciones son usualmente: N‐

acetilglucosamina o N‐acetilgalactosamina respectivamente.

Muchas glicoproteínas en células en células eucariotas se destinan tanto para la

secreción como para la incorporación en la membrana plasmática. Estas proteínas

usualmente son transferidas al RE antes que la traducción se haya completado (con el


297

clivaje de una secuencia señal) mientras su traducción se encuentra en progreso. La

glicosilación también se inicia en el RE antes que la traducción se haya completado. El

primer paso es la transferencia de un oligosacárido común consistiendo de 14 residuos

de azúcares: 2 N‐acetilglucosamina, 3 glucosas y 9 manosas, a un residuo asparagina. El

oligosacárido es ensamblado dentro del retículo endoplasmático en un transportador

lipídico (dolicol phosphate). Esto es luego transferido como una unidad intacta a una

asparagina aceptora (Asp) dentro de la secuencia Asp_X_Thr, donde X es todo

aminoácido distinto de Prolina. En el procesamiento siguiente el oligosacárido N‐ligado

es luego modificado en el aparato de Golgi, al que son transferidos las glicoproteínas

desde el RE. Estas modificaciones incluyen tanto la remoción y adición de residuos

carbohidrato conforme las glicoproteínas son transportadas al Golgi. Los oligosacáridos

N‐ligados de diferentes glicoproteínas son procesadas con distinto alcance, dependiendo

tanto de las enzimas presentes en diferentes células y a la accesibilidad de los

oligosacáridos a las enzimas que catalizan su modificación. Las glicoproteínas con

oligosacáridos no tienen nuevos azúcares agregados a ellos en el Golgi. Los

oligosacáridos relativamente simples de estas glicoproteínas se denominan

oligosacáridos ricos en manosa, debido a la alta proporción de éste azúcar, similar al

oligosacárido común originalmente en el RE. En contraste, las glicoproteínas con

oligosacáridos accesibles son procesados mas extensivamente, resultando en la

formación de una variedad de oligosacáridos complejos.

Los oligosacáridos O‐ligados son también procesados dentro del aparato de Golgi. En

contraste, los oligosacáridos O‐ligados son formados por la adición de un azúcar por vez

y usualmente consiste de sólo unos pocos residuos. Muchas proteínas citoplamáticas y

nucleares, incluyendo una variedad de factores de transcripción, también son

modificados por la adición de residuos simples de N‐acetilglucosamina O‐ligados,

catalizados por un sistema enzimático diferente. Sin embargo, el rol de los carbohidratos

en la función de estas glicoproteínas citoplasmáticas y nucleares no son aún

comprendidas.

ANCLAJE DE LÍPIDOS

Algunas proteínas en células eucariotas son modificadas por el anclaje de lípidos a la


298

cadena polipeptídica. Tales modificaciones, frecuentemente permiten anclar las

proteínas a la membrana plasmática con la que los lípidos hidrofóbicos son capaces de

interactuar. En las células eucarioticas existen tres tipos diferentes de adiciones lipídicas:

N‐miristoilación, prenilación y palmitoilación. Estas proteínas están asociadas con la fase

citosólica de la MP. Un cuarto tipo de modificación, la adición de glicolípidos, juega un

rol importante en el anclaje de algunas proteínas de la superficie celular a la fase

extracelular de las membranas plasmáticas.

En algunas proteínas un ácido graso es anclado a la porción amino de la cadena

polipeptídica creciente durante la traducción. En este proceso, llamado N‐miristoilación,

el ác. mirístico (un ácido graso de 14 carbonos) es anclado a un residuo glicina N‐

terminal (Fig.). La glicina es usualmente el segundo aminoácido incorporado en una

cadena polipeptídica; el iniciador metionina es removido por proteólisis antes de la

adición del ácido graso. Muchas proteínas que son modificadas por N‐miristoilación

están asociadas con la fase interna de la membrana plasmática, y el rol del ácido graso

en esta asociación ha sido claramente demostrada por análisis de proteínas mutantes en

el cual la glicina N‐terminal es cambiada por una alanina. Esta substitución previene la

miristoilación y bloquea la función de las proteínas mutantes inhibiendo su asociación

con la membrana.

Los lípidos pueden también ser anclados a las cadenas laterales de los residuos cisteína,

treonina, y serina. Un ejemplo importante de este tipo de modificación es la

prenilación, en la que tipos específicos de lípidos (grupos prenilo) son anclados a los

átomos de azufre de la cadena lateral de los residuos de cisteína localizados cerca de la

porción c‐terminal de la cadena polipeptídica. Muchas proteínas asociadas a la

membrana plasmática involucradas en el control del crecimiento y diferenciación celular

son modificadas de esta forma, incluyendo la proteína del oncogene Ras que es la

responsable del crecimiento incontrolable de muchos tipos de cáncer. La prenilación de

estas proteínas ocurre en tres pasos, Primero el grupo prenilo es agregado a una cisteína

localizada tres aminoácidos del extremo carboxilo terminal de la cadena polipeptídica.

Los grupos prenilo agregados en esta reacción son tanto farnesilo (de 15 Carbonos) o

geranilgeranilo de 20 átomos de carbono. Los aminoácidos que le siguen a la cisteína son


299

luego removidos quedando la cisteína en la porción carboxilo terminal. Finalmente un

grupo metilo es agregado en el grupo carboxilo del residuo cisteína C‐terminal.

El significado biológico de la prenilación está indicado por el hecho que la mutación de la

cisteína crítica, bloquea la asociación a la membrana y la función de la proteína Ras.

Debido a que la farnestilación es una modificación relativamente rara de las proteínas

celulares, se ha estimulado la posibilidad que inhibiendo la enzima clave (farnesil

transferasa) podría proveer de una herramienta valiosa en el desarrollo de drogas para

el tratamiento de cánceres que involucren a las proteínas Ras.

En un tercer tipo de modificación es la palotoilación, en la que el ácido palmítico (de 16

carbonos es agregado a los sulfuros de las cadenas laterales de los residuos de cisteína

internos. Similar a los dos procesos descriptos anteriormente, la palmitoilación tiene una

rol importante en la asociación de algunas proteínas con la fase citosólica de la

membrana plasmática.

Finalmente, los lípidos unidos a oligosacáridos (glucolípidos) son agregados a los grupos

carboxilo terminales de algunas proteínas, donde sirven como anclaje para fijar las

proteínas a la fase externa de la membrana plasmática. Debido a que los glucolípidos en

general contienen fosfatidil–inositol usualmente se los denomina glucosil–fosfatidil–

inositol o ancladores GPI, (Fig. X). Las porciones de oligosacáridos de los ancladores GPI

son ligadas a los grupos carboxilo terminales de las cadenas polipeptídicas. La cabeza del

grupo inositol del fosfatidil–inositol esta ligado al oligosacárido, así el carbohidrato sirve

como un puente entre la proteína y el ácido graso del fosfolípido. Los ancladores GPI son

sintetizados y agregados a las proteínas como unidades pre–ensambladas dentro del RE.

Su adición va acompañada pos el clivaje de un péptido de aproximadamente 20 aác. De

la región carboxilo terminal de la cadena polipeptídica. La proteína modificada es luego

transportada hasta la superficie de la célula, donde los ácidos grasos de los ancladores

GPI actúan mediando su anclaje a la membrana plasmática.

REGULACIÓN DE LA FUNCIÓN DE LAS PROTEÍNAS

Una función crítica de las proteínas es su actividad como enzimas, la que catalizan casi

todas las reacciones biológicas. LA regulación de la actividad enzimática juega un rol


300

clave en el gobierno del comportamiento celular. Esto se realiza en parte a nivel de la

expresión génica que determina la cantidad de toda enzima sintetizada por la célula.

Otro nivel de control se obtiene por regulación de la función de las proteínas que

permite a la célula regular no sólo la cantidad sino también la actividad de sus

constituyentes proteicos. La regulación de las actividades de algunas de las proteínas

involucradas en la transcripción y traducción ha sido previamente discutida, se

discutirán a continuación los tres mecanismos generales por los que se controla la

actividad de las proteínas celulares.

Regulación por pequeñas moléculas

La mayoría de las enzimas son controladas por cambios en su conformación, que a la

postre alteran su actividad catalítica. En muchos casos tales cambios conformacionales

resultan de la unión de pequeñas moléculas tales como aác. o nucleótidos, que regulan

la actividad enzimática. Este tipo de regulación comúnmente es responsable del control

de las vías metabólicas por inhibición del feedback. Por ejemplo, los productos finales de

muchas vías biosintéticas, (por ej., aminoácidos) inhiben las enzimas que catalizan el

primer paso en su síntesis, asegurando así, un suministro adecuado del producto

mientras se previene la síntesis de las cantidades excedentarias. (Fig. X).

La inhibición del feedback es un ejemplo de regulación alostérica en el que una molécula

se une a un sitio enzimático diferente del sitio catalítico (allo = otro; “steric” = sitio). La

unión de una molécula reguladora tal altera la conformación de la proteína cambiando

asimismo la forma del sitio catalítico, afectando su actividad (Fig. X). Uno de las enzimas

alostéricas mejor estudiadas es la aspartato transcarbamilasa, que cataliza el primer

paso de la síntesis de los nucleótidos pirimidínicos y es regulada por inhibición feedback

por citidina trifosfato (CTP). La aspartato transcarbamilasa consiste de 12 cadenas

polipeptídicas diferentes: seis subunidades catalíticas y seis regulatorias. La unión de

CTP a la sub–unidad reguladora induce un re–arreglo mayor de las posiciones de las

subunidades, inhibiendo asimismo la actividad enzimática (Fig. ).

Muchos factores de transcripción son también regulados por la unión de pequeñas

moléculas. Por ejemplo, la unión de lactosa o un metabolito al represor E. coli lac induce


301

cambios conformacionales que previenen la unión al DNA. En células eucariotas, las

hormonas esteroides controlan la expresión génica de forma similar por unión a

proteínas transcripcionales regulatorias.

La regulación de los factores de traducción como EF‐Tu por unión de GTP ilustra otro

mecanismo común por el que se controla la actividad de las proteínas intracelulares. En

este caso, las formas unidas a GTP son inactivas. Muchas proteínas celulares son

reguladas en forma similar por unión de GTP o GDP. Estas proteínas incluyen la proteína

del oncogen Ras, que ha sido muy estudiado por su rol en el control de la proliferación

celular y en el cáncer humano. El análisis cristalográfico de rayos X de estas proteínas es

particularmente interesante ya que revela sutiles diferencias conformacionales entre las

formas inactivas unidas a GDP y las activas unidas a GTP (Fig. ). Estas pequeñas

diferencias en la conformación proteica determinan si Ras (en la forma activa unida a

GTP) puede interactuar con su molécula target, actuando en el señalamiento de la

división celular. La importancia de esas sutiles diferencias en la conformación proteica es

dramáticamente ilustrada por el hecho que la mutación en el gen ras contribuye al

desarrollo de cerca de 15% de los cánceres humanos. Tales mutaciones alteran la

estructura de las proteínas Ras de tal forma que ellas traban la conformación GTP‐unida

y la señal de la división celular, conduciendo al crecimiento descontrolado de las células

cancerosas. En contraste, las proteínas Ras normales alternan entre la las

conformaciones unidas a GDP y GTP, de forma tal que sólo son activas por hormonas y

factores de crecimiento que normalmente controlan la proliferación celular en

organismos multicelulares.

Fosforilación de proteínas

Los ejemplos discutidos en la sección precedente involucran asociaciones no covalentes

de proteínas con pequeñas moléculas activadoras o inhibidoras. Ya que no forman

uniones covalentes, la unión de estas moléculas reguladoras a las proteínas es

reversible, permitiendo a la célula para responder rápidamente a cambios ambientales.

La actividad de muchas proteínas, sin embargo, está también regulada por

modificaciones covalentes. Un ejemplo de este tipo de regulación es la activación de

algunas enzimas por clivaje proteolítico de los precursores inactivos. Como se notó


302

previamente, las enzimas digestivas y las proteínas de coagulación sanguínea son

reguladas por este mecanismo. Aunque la proteólisis es irreversible, sin embargo,

provee de un medio de control la actividad enzimática más que las proteínas el

encendido y apagado en respuesta de cambios en el ambiente. En contraste, otras

modificaciones covalentes –particularmente la fosforilación– son reversibles y funcionan

como lo hace la regulación alostérica. Tanto para activar como revertir una amplia

variedad de proteínas celulares en respuesta a señales ambientales.

La fosforilación de proteínas es catalizada por proteína – quinasas, la mayoría de las

cuales transfieren grupos fosfato del ATP a los grupos hidroxilo de las cadenas laterales

de los residuos serina, treonina y tirosina (Fig. ). La mayoría de las proteína – quinasas

fosforilan tanto residuos serina y treonina o tirosina. Se llaman proteína serina/treonina

quinasas o proteína tirosina quinasas, respectivamente. La fosforilación de las proteínas

es revertida por las fosfatasas de proteínas, que catalizan la hidrólisis de los residuos de

aminoácidos fosforilados. Similar a las proteínas cinasas, la mayoría de las proteína‐

fosfatasas son específicas tanto para serina como para treonina o para tirosina, aunque

algunas fosfatasas de proteínas reconocen los tres fosfo‐aminoácidos.

La acción combinada de las proteínas cinasas y las fosfatasas proteínas actúan mediando

la fosforilación reversible de la mayoría de las proteínas celulares. Frecuentemente, las

proteínas quinasas funcionan como componentes de las vías de traducción de señales

en las cuales una quinasa activa a una segunda quinasa, que a su vez actúa sobre otra

quinasa. La acción secuencial de una serie de proteína quinasas puede transmitir una

señal recibida en la superficie celular para actuar sobre proteínas dentro de la célula,

resultando en cambios en el comportamiento celular n respuesta a los estímulos

ambientales.

El prototipo de las acciones de las proteínas cinasas proviene de los estudios del

metabolismo del glucógeno de Ed Fisher y Ed Krebs en 1955. En las células musculares

las hormona epinefrina (adrenalina) señala la ruptura del glucógeno a glucosa –1‐

fosfato, proveyendo de energía para el incremento de la actividad muscular. Esta

reacción es catalizada por la enzima glicógeno – fosforilasa, que es regulada por una

proteína quinasa (figura ). La epinefrina se une a un receptor de la superficie celular que


303

dispara la conversión de ATP en AMPc que se une y activa una proteína quinasa llamada

proteína quinasa dependiente de AMPc. Esta quinasa fosforila y activa una segunda

proteína quinasa llamada fosforilasa quinasa. Esta a su vez activa la glucógeno

fosforilasa, llevando a la producción de glucógeno. La fosforilación activante de ambas

fosforilasa quinasa y glucógeno fosforilasa puede ser revertida por fosfatasas

específicas, removiéndose así el estímulo inicial (epinefrina) e inhibiendo la ruptura del

glucógeno.

El patrón de señalamiento que conduce a la activación de la glicógeno fosforilasa es

iniciado por la unión de pequeñas moléculas a la superficie celular a la superficie celular

–la epinefrina uniendo a su receptor y el AMPc une a la proteína dependiente de AMPc–.

La señal es luego transmitida a su target intracelular por la acción secuencial de

proteínas quinasas. Un patrón de señalamiento similar en el que las proteínas quinasas y

las fosfatasas juegan un rol central, están involucradas en la regulación de casi todos los

comportamientos de las células eucarióticas. Aberraciones en este patrón,

frecuentemente involucran a anormalidades de proteína quinasas son también

responsables de muchas enfermedades asociadas con la regulación impropia del

crecimiento y diferenciación celular, particularmente el desarrollo del cáncer.

Interacciones Proteína ‐ Proteína

Muchas proteínas consisten de múltiples subunidades, cada una de las cuales es una

cadena polipeptídica independiente. En algunas proteínas las subunidades son idénticas,

otras proteínas están compuestas por dos o más polipéptidos diferentes. En ambos

casos las interacciones entre las cadenas polipeptídicas son importantes en la

regulación de la actividad proteica. La importancia de estas interacciones es evidente en

muchas enzimas alostéricas, tales como la aspartato transcarbamilasa, en la que el

binding de una molécula reguladora altera la conformación de la proteína cambiando las

interacciones entre subunidades.

Muchas otras enzimas son similarmente reguladas por la interacción proteína –

proteína. Un buen ejemplo la proteína quinasa dependiente del AMPc que está

compuesta por dos subunidades regulatorias y dos subunidades catalíticas. En este

estado, la enzima es inactiva; la subunidad reguladora inhibe la actividad enzimática de


304

la subunidad catalítica. La enzima es activada por AMPc, que se une a la subunidad

reguladora e induce cambios conformacionales y conducen a la disociación del

complejo; las subunidades catalíticas libres son enzimáticamente, proteínas quinasas

activas. El AMPc actúa así como un regulador alostérico alterando las interacciones de

proteína – proteína.

Las proteínas reguladoras transcripcionales constituyen otro ejemplo importante de las

interacciones proteína – proteína. Muchos factores de transcripción de eucariotas

funcionan como activadores o represores vía interacciones proteicas con componentes

de la maquinaria general de transcripción. Las interacciones proteína – proteína que

pueden ser ellas mismas reguladas por la unión de pequeñas moléculas y la

fosforilación, juegan roles críticos en el control diferentes aspectos del comportamiento

celular.


305

CAPÍTULO DUODÉCIMO:

El Ciclo Celular


306

Ciclo Celular

La progresión de las células a través del ciclo de división es regulada por señales internas

que coordinan y monitorean varios procesos que tienen lugar durante diferentes fases

del ciclo celular.

Un ejemplo de la regulación del ciclo por señales extracelulares lo provee el efecto de

los factores de crecimiento en la proliferación de las células animales.

Además, diferentes procesos celulares como el crecimiento, la replicación del ADN y la

mitosis deben ser coordinados durante la progresión del ciclo celular.

Esto ocurre por una serie de puntos de control que regulan el progreso a través de varias

fases del ciclo celular.

En muchos tipos celulares un punto regulatorio del ciclo celular ocurre al final del G1 y

controla la progresión desde G1 a S. Este punto regulatorio fue primero definido por

estudios en Saccaromyces cerevisiae) donde se lo denominó: START. Una vez que las

células han pasado el punto START, están conminadas a entrar en la fase S y sufrir un

ciclo de división celular. Sin embargo, el pasaje a través del punto START es un evento

altamente regulado en el ciclo celular de levaduras, controlado por señales externas

como la disponibilidad de nutrientes, así como por el tamaño celular por ejemplo si las

levaduras son sometidas a una privación de nutrientes, arrestan su ciclo celular en el

punto START y entran en un estado de quiescencia. Así, el punto START representa un

punto de decisión en el que la célula determina si hay suficientes nutrientes disponibles

para soportar la progresión a través del ciclo de división.

Los factores polipeptídicos que señalizan el acoplamiento de las levaduras también

arrestan el ciclo en el punto START. Permitiendo que las células haploides se fusionen

con otras en lugar de entrar en la fase S.

Además de actuar como un punto de monitoreo de señales extracelulares, START es el

punto en el cual el crecimiento celular es coordinado con la replicación del ADN y la

división celular.


307

La importancia de esta regulación es particularmente evidente, en levaduras gemantes

en las que se producen células hijas de tamaños muy diferentes, una célula madre de

gran tamaño y una célula hija pequeña. Para mantener un tamaño constante, la célula

hija debe crecer más que la célula madre antes de dividirse ella misma. Así, el tamaño

celular debe ser monitoreado para coordinar la dimensión celular así como el

crecimiento, con otros eventos del ciclo celular.

Esta regulación se lleva a cabo por un mecanismo de control que requiere que cada una

de las células alcance un tamaño mínimo antes de pasar el punto START. En

consecuencia, la célula hija más pequeña consume más tiempo en G1 y debe crecer más

que la célula madre.

La proliferación de la mayoría de las células animales es regulada de un modo similar en

la fase G1 del ciclo celular. En particular, un punto de decisión en la fase G1 tardía

denominado punto de restricción en las células animales, funciona análogamente al

punto START de las levaduras. Sin embargo, en contraste con las levaduras, el pasaje de

las células animales a través del ciclo es regulado por factores de crecimiento

extracelulares que señalizan la proliferación celular más que por la disponibilidad de

nutrientes. En presencia de factores de crecimiento adecuados, las células pasan el

punto de restricción y entran en la fase S y el resto del ciclo. Si no hay factores de

crecimiento en G1 la progresión a través del ciclo se detiene en el punto de restricción,

llamado G0 en el que pueden permanecer por largos períodos de tiempo sin proliferar.

Las células en G0 son metabólicamente activas, aunque su crecimiento cesa y poseen

una tasa reducida de síntesis de proteínas.

Por ejemplo los fibroblastos de la piel se encuentran en estado G0 hasta que son

estimulados a dividirse cuando son requeridos para reparar el daño producido por una

herida. La proliferación de estas células es disparada por factores de crecimiento

derivados de las plaquetas (PDGF), los que se liberan de las plaquetas sanguíneas

durante la coagulación y señalizan la proliferación celular de fibroblastos en la vecindad

del tejido injuriado.

A pesar de que la mayoría de las células son reguladas en G1, algunos ciclos celulares son


308

regulados en G2. Este es el caso de Schizosaccaromyces pombe que en contraste con S.

cerevisiae, su ciclo celular es regulado principalmente en G2 controlando la transición de

G2 a M, que es el principal punto en el que el se chequea el tamaño celular y la

disponibilidad de nutrientes.

En las células animales, el principal ejemplo en el que se realiza el control del ciclo

celular en el punto G2 es el de los oocitos de vertebrados. Estos permanecen en G2 por

largos períodos de tiempo (varias décadas en humanos) hasta que su progresión a la

fase M es disparada por la estimulación hormonal.

Puntos de Chequeo del Ciclo Celular

Además de los controles que regulan la progresión en respuesta al tamaño celular y a las

señales extracelulares, como los nutrientes y los factores de crecimiento, los eventos

que tienen lugar durante los diferentes estadios deben ser coordinados unos con otros

de tal forma que ocurran en el orden apropiado. Por ejemplo resulta crítico que las

células no comiencen la mitosis hasta que la replicación del genoma no se haya

completado. Si esto ocurriese, podría darse una división celular catastrófica, en la cuál

las células hijas fallan en heredar copias de completas del material genético. En la

mayoría de las células, esta coordinación entre diferentes fases de del ciclo celular

depende de un sistema de chequeo y controles de feedback que previenen la entrada de

la célula en la siguiente fase del ciclo celular, si los eventos de la fase precedente no se

han completado.

Varios puntos de chequeo aseguran que los cromosomas dañados o no replicados pasen

a las células hijas. Uno de los puntos de chequeo mas definidos ocurre en G2 y previene

la iniciación de mitosis hasta que la replicación del ADN se completa. Este punto de

chequeo en G2 realiza el sensado del ADN no replicado, el cual genera una señal que

lleva al arresto del ciclo celular. La operación del punto de chequeo en G2 previene la

iniciación de la fase M, por lo que las células permanecen en este estadio hasta que el

genoma se replica completamente. Sólo luego se remueve la inhibición, permitiendo a la

célula iniciar la mitosis y distribuir los cromosomas completamente replicados a las

células hijas.


309

La progresión a través del ciclo celular es también arrestada en el punto de chequeo en

G2, en respuesta al daño celular, como el que por ejemplo ocurre por la irradiación. Este

arresto permite a las células que el ADN sea reparado. Los estudios de levaduras

mutantes han mostrado que el punto de chequeo en G2 es inducido tanto por daño del

ADN como por ADN no replicado, por lo que se deduce que las señales del arresto del

ciclo celular ocurren por vías similares.

El daño del ADN no sólo arresta el ciclo celular en G2, sino que también ralentiza la

progresión a través de la fase S arrestando a las células en la fase G1. Este arresto puede

permitir la reparación antes del ingreso a la fase S donde el ADN dañado podría ser

replicado. En las células de mamíferos, el arresto en el punto de chequeo G1 es mediado

por la acción de una proteína conocida como p53 que es rápidamente inducida en

respuesta al ADN dañado. Un hecho altamente sugestivo es que el gen que codifica p53

se encuentra frecuentemente mutado en los cánceres humanos. La pérdida de la

función de p53 como resultado de esta mutación impide el arresto en G1 en respuesta al

daño del ADN, por lo que el ADN dañado es replicado y pasa a las células hijas en lugar

de ser reparado. Este ADN dañado heredado, resulta en un aumento de la frecuencia de

mutaciones y la inestabilidad del genoma celular, que posteriormente contribuye al

desarrollo del cáncer. Las mutaciones en el gen p53 son una de las alteraciones más

comunes en cánceres humanos, ilustrando la importancia de la regulación del ciclo

celular en la vida de los organismos multicelulares. Otro punto importante del chequeo

que mantiene la integridad del genoma ocurre hacia el final de la mitosis. Este chequeo

monitorea el alineamiento de los cromosomas en el huso mitótico, asegurando que se

hayan distribuido en las células hijas. Por ejemplo, la falla del alineamiento de uno o más

cromosomas causa el arresto de la mitosis en metafase. Como resultado de este punto

de chequeo, los cromosomas no se separan hasta que un complemento de cromosomas

completo no se organiza para su distribución en cada célula hija.

Acoplamiento de la Fase S a la fase M

El punto de chequeo en G2 previene la iniciación de la mitosis, previo a que se complete

la fase S, asegurando que el ADN incompletamente replicado no se distribuya en las

células hijas. Igualmente importante es que se asegure que el genoma sólo se replique


310

una sola vez por cada ciclo celular. Así, una vez que el ADN se ha replicado deben existir

mecanismos de control que impidan que una célula en G2 reingrese en la fase S y

bloquee la iniciación de otra rueda de replicación hasta que se haya producido la

mitosis.

La dilucidación inicial de este mecanismo proviene de los estudios de fusión de células

de Potu Rao & Robert Johnson en 1971. Estos investigadores aislaron células en distintas

fases del ciclo y luego fusionaron estas células formando híbridos.

Cuando se fusionaron células en G1 células en fase S el núcleo de las células en G1

comenzó a sintetizar ADN. Así se dedujo que el citoplasma de la célula en fase S debía

contener algún/os factor/es que promovían la síntesis de ADN en el núcleo G1.

Fusionando las células en G2 con células en fase S, el núcleo G2 es incapaz de iniciar la

síntesis de ADN aún en presencia de un citoplasma de una célula en fase S.

El mecanismo molecular que restringe la replicación del ADN celular en la fase G2

involucra la actividad de una familia de proteínas llamadas MCM se unen a la hebra de

ADN en conjunción las proteínas del complejo de origen de replicación (ORC). Las

proteínas MCM actúan como factores de licenciamiento que permiten que se inicie la

replicación. Su unión a ADN es regulada durante el ciclo celular de tal manera que las

proteínas MCM sólo son capaces de unirse a los orígenes de replicación en la fase G1

permitiendo a las células que el ADN se replique al iniciarse en la fase S. Una vez que se

produce la iniciación, las proteínas MCM son desplazadas del origen de replicación

nuevamente hasta que la célula pase a través de la mitosis y entre a la fase G1 otra vez

en el siguiente ciclo celular.

Uno de los desarrollos más excitantes de la década ha sido la dilucidación de los

mecanismos moleculares que controlan la progresión del ciclo celular en eucariotas.

Estos progresos en el conocimiento se han basado en la convergencia de resultados

obtenidos en organismos tan diversos como levaduras, erizos de mar, ranas y

mamíferos. Estos estudios han revelado que el ciclo celular de todos los eucariotas está

controlado por un conjunto de proteínas quinasas muy conservadas que son las

responsables de disparar las principales transiciones del ciclo celular.


311

MPF un Dímero de Cdc2 y Ciclinas

Tres experimentos diferentes contribuyeron a la identificación de las moléculas claves

de la regulación del ciclo celular.

1° Estudios sobre oocitos de rana:

Estos oocitos están arrestados en la fase G2 de la meiosis, la estimulación hormonal

dispara el ingreso de éstos a la fase M.

En 1971, Y. Masui & C. Markert y D. Smith & R. Eckert encontraron que los oocitos

arrestados en G2 podían ingresar en M si se les inyectaba citoplasma de oocitos

hormonalmente estimulados. Así, se concluyó que la presencia de un factor

citoplasmático presente en los oocitos hormonalmente estimulados era el responsable

de la transición de G2 a M en los oocitos no expuestos. Este factor se denominó factor

promotor de la maduración (MPF). Estudios posteriores demostraron que este factor no

está restringido a los oocitos sino que también se encuentra en las células somáticas. Se

concluyó el MPF es un factor general que actúa en la promoción de la transición de las

células de G2 a M.

2° estudios sobre la regulación del ciclo celular en el análisis genético de levaduras:

En la década del 70´, L. Hartwell y colaboradores, trabajando sobre la levadura gemante,

S. cerevisiae identificaron mutantes sensibles a la temperatura deficientes en la

progresión a través del ciclo celular. Estos mutantes (denominados cdc por cell division

cicle mutants) se caracterizan por sufrir arresto del crecimiento celular en puntos

específicos del ciclo. Por ejemplo, el mutante cdc28 provoca el arresto del ciclo celular

en el punto START indicando que la proteína Cdc28 es requerida para pasar este punto

crítico en G1.

Una colección de mutantes del ciclo celular fue aislada en la levadura de fisión

Schizosaccaromyces pombe por P. Nurse y colaboradores. Estos mutantes, incluyen a

cdc2 que arresta el ciclo celular en G2 y G1. Debe recordarse que la transición de G2 a M

es el principal punto de regulación del ciclo celular de S. pombe.


312

Estudios posteriores demostraron que cdc28 y cdc2 son genes funcionalmente

homólogos, requeridos para el pasaje a través de START (de G1 a S) y para la entrada a la

mitosis (G2 a M) en ambas especies. Para evitar confusiones de nomenclatura se

denominará a la proteína codificada por ambos genes Cdc2.

Los estudios de clonado molecular permitieron determinar que cdc2 codifica una

proteína quinasa, constituyendo la primera indicación que la fosforilación de las

proteínas actúa en la regulación del ciclo celular.

Posteriormente, se descubrió un gen relacionado a cdc2 en humanos lo que constituyó

una dramática demostración de la conservación de la actividad de esta proteína en la

regulación del ciclo celular de los eucariotas.

3° estudios en embriones de erizo de mar:

Estudios convergentes en la identificación del MPF y de genética de levaduras

emergieron de los estudios de la síntesis de proteínas en embriones de erizo de mar.

Luego de la fertilización estos embriones sufren una serie de divisiones celulares rápidas.

Una serie de estudios, utilizando inhibidores de la síntesis de proteínas revelaron que la

entrada en la fase M de las células embrionarias requiere nueva síntesis de proteínas.

En 1983, T. Hunt y colaboradores identificaron dos proteínas que exhiben un patrón

periódico de acumulación y degradación en embriones de erizo y almejas de mar. Estos

autores determinaron que las proteínas se acumulan en interfase y luego se degradan

rápidamente hacia el final de la mitosis.

Hunt llamó a estas proteínas ciclinas A y B sugiriendo que podrían influir en la inducción

de la mitosis.

El sustento directo a esta hipótesis fue provisto por Ruderman et al. (1988) cuando

demostraron que la inyección de Ciclina A en oocitos de rana era suficiente para

disparar la transición de G2 a M.

Estas aproximaciones independientes convergieron en 1988, con los experimentos de J.

Maller y colaboradores quienes purificaron el MPF de huevos de rana. La caracterización


313

molecular del MPF en varios laboratorios mostró que este regulador filogenéticamente

conservado del ciclo celular, está compuesto por dos subunidades claves: la proteína

quinasa: Cdc2 y la Ciclina B. La Ciclina B es una subunidad reguladora requerida para la

actividad catalítica de la proteína quinasa Cdc2, lo que resultó consistente con la noción

de que, la actividad de la MPF, es controlada por la acumulación y degradación de la

ciclina B durante la progresión del ciclo celular.

Una variedad de estudios han confirmado este rol de ciclina B así como la regulación de

MPF por fosforilación y desfosforilación del Cdc2. En las células de mamíferos, la síntesis

de ciclina B comienza en la fase S. Luego la ciclina B se acumula y forma complejos con

Cdc2 a través de la fase S y G2. Conforme estos complejos se forman, Cdc2 es fosforilada

en dos posiciones regulatorias críticas. Una de estas fosforilaciones ocurre en treonina

161 y es requerida para la actividad de proteína quinasa de Cdc2. La segunda es una

fosforilación de la tyr‐15 y la thr‐14 en vertebrados. La fosforilación de tyr‐15 es

catalizada por una proteína quinasa llamada Wee‐1, inhibiendo la actividad de Cdc2 y

llevando a la acumulación del complejo Cdc2/ciclina B inactivo a través de la fase S y G2.

La transición de G2 a M se produce por la activación del complejo Cdc2 /ciclina B como

resultado de la desfosforilación de los residuos Tyr‐15 y Thr‐14 por una proteína

fosfatasa denominada Cdc25.

Una vez activada la proteína quinasa Cdc2 fosforila una variedad de proteínas blanco

que inician la fase M. Además la actividad de la Cdc2 dispara la proteólisis de la ciclina B,

que ocurre como resultado de la proteólisis mediada por ubiquitina. Esta destrucción

proteolítica de la ciclina B inactiva luego la Cdc2 y lleva a la célula a la salida de la

mitosis, sufrir citocinesis y retornar a la interfase.

Familia de las Ciclinas y las Quinasas Dependientes de Ciclinas (CdKs)

Luego del descubrimiento de la ciclina B y de la Cdc2 y con la dilucidación del rol que

éstas cumplen, las investigaciones demostraron que ellas son parte de una gran familia

de moléculas de proteínas relacionadas, cuyos diferentes miembros controlan la

progresión a través de distintas fases del ciclo.

Como se vio antes, la Cdc2 controla el pasaje a través del punto START así como también


314

la entrada en mitosis de las levaduras. La Cdc2 también controla el pasaje de G2 a M en

asociación con otro tipo de ciclinas mitóticas del tipo B (Clb1, Clb2, Clb3 y Clb4). El pasaje

a través del punto START sin embargo, es controlado por una clase diferente de ciclinas

denominadas ciclinas G1 o Clns. Luego las Cdc2 se asocian con distintos tipos de ciclina

tipo B (Clb5 y Clb6), las que se requieren para la progresión a través de la fase S, Estas

asociaciones de Cdc2 con distintos tipos de ciclinas B y G1 inducen a las Cdc2 a fosforilar

distintas proteínas substrato como las requeridas para la progresión a través de las fases

específicas del ciclo celular.

El ciclo celular de eucariotas superiores es controlado no sólo por múltiples ciclinas sino

también por múltiples proteínas quinasas relacionadas a las Cdc2. Estas proteínas

quinasas son conocidas Cdks (Cyclin dependent kinases). Como la Cdc2 fue el primer

miembro conocido se la denomina: Cdk1.

Estas múltiples Cdks se asocian con ciclinas específicas conduciendo la progresión a

través de distintos estadios del ciclo celular. Por ejemplo la progresión de G1 a S es

regulado principalmente por Cdk2 y Cdk4 (y en algunas células Cdk6) en asociación con

las ciclinas D y E. Los complejos de Cdk4 y Cdk6 con las ciclinas tipo D (D1, D2, D3) juegan

un papel crítico en la progresión a través del punto de restricción en G1. La ciclina E se

expresa más tarde en G1 y los complejos Cdk2 / ciclina E son requeridos para la

transición de G1 a S y la iniciación de la síntesis de ADN. Los complejos de Cdk2 con

ciclina A funcionan a través de la fase S. Como se ha discutido, la transición de G2 a M es

luego conducida por complejos de Cdc2 con ciclina B.

La actividad de las Cdks durante la progresión del ciclo celular es regulada por al menos

4 mecanismos moleculares. Como se ha discutido para la Cdc2, el primer nivel de

regulación involucra la asociación de Cdks con sus ciclinas parteners. Así, la información

de complejos específicos Cdks / ciclinas, es controlada por la síntesis y degradación de

ciclinas.

Segundo, la activación de los complejos de Cdk / ciclina, requieren de la fosforilación de

un residuo treonina (thr) de la Cdk, situado aproximadamente en la posición 160. Esta

fosforilación activante de Cdk es catalizada por una enzima denominada CAK (Cdk‐


315

activating kinase) los cuales pueden ellos mismos estar compuestos de un Cdk (Cdk7)

formando complejos con la ciclina H. Estos complejos están asociados con el factor de

transcripción TFIIH, el que es requerido para la iniciación de la ARN polimerasa II. Esto

hace pensar que este miembro de la familia de la Cdk podría participar en la

transcripción así como en la regulación del ciclo celular.

En contraste con la fosforilación activada por CAK, el tercer mecanismo de regulación de

la Cdk involucra la fosforilación inhibitoria catalizada por la proteína Wee1 de los

residuos tirosina cercanos al extremo N‐terminal de la Cdk. En particular, tanto la Cdc2

como la Cdk2 son inhibidos en vertebrados por la fosforilación de la tirosina 15 y la

treonina 14 adyacente. Estas Cdks son luego activadas por desfosforilación de estos

residuos por miembros de las proteínas fosfatasas de la familia de las Cdc25. Además de

la regulación por fosforilación, las Cdks pueden ser controladas por la unión de proteínas

inhibitorias denominadas Cdks inhibitors o CKIs a los complejos Cdk / ciclinas. En los

mamíferos hay dos familias de CKIs las responsables de regular los distintos miembros

de Cdk / ciclinas. Los miembros de la familia de Cip/Kip regulan todos estados de

progresión a través de las fases G1 y S inhibiendo los complejos Cdk2, Cdk4 y Cdk6 con

las ciclinas A, D y E. En contraste los miembros de la familia Ink4 CKIs son específicos

para los complejos Cdk4 y Cdk6 con las Ciclinas D, por lo que el Ink4 CKIs sólo regula la

progresión a través del punto de restricción en G1. En levaduras diferentes CKIs regulan

distintos estados en la progresión del ciclo celular por inhibición específica de los

complejos de Cdk /ciclinas. El efecto combinado de estos múltiples modos de regulación

Cdk es responsable por el control de la progresión del ciclo celular tanto en respuesta a

los controles de chequeo como a una gran variedad de estímulos extracelulares que

regulan la proliferación celular.

Los eventos de la Fase M

La fase M es el período de cambios más dramáticos del ciclo celular, involucrando una

reorganización de virtualmente todos los componentes celulares. Durante la mitosis los

cromosomas se condensan, la cubierta nuclear desaparece, el citoesqueleto se

reorganiza para formar el huso mitótico y los cromosomas se mueven hacia polos

opuestos. La segregación de los cromosomas es luego seguida de la división del


316

citoplasma: citocinesis. Al final de la mitosis el proceso es revertido: los cromosomas se

descondensan y la cubierta nuclear se reforma alrededor de los cromosomas “hijos”. El

proceso es controlado por la fosforilación y desfosforilación reversible de proteínas

nucleares resultantes de la acción de la proteína quinasa Cdc2 que es un regulador clave

de la mitosis en todas las células eucariotas.

Disolución de la membrana nuclear

En la mayoría de las células el desensamble de la membrana nuclear marca el comienzo

de la mitosis. Sin embargo, esto no es una característica universal ya que algunos

organismos eucariotas unicelulares, como por ejemplo las levaduras, sufren la llamada

mitosis cerrada en la que la cubierta nuclear permanece intacta. En este caso los

cromosomas migran a los polos opuestos del núcleo que luego se divide en dos. Las

células de los eucariotas superiores, sin embargo, usualmente sufren mitosis abiertas las

que se caracterizan por la ruptura de la cubierta nuclear. Los cromosomas hijos migran

luego a los polos opuestos del huso mitótico y el nuevo núcleo se rearma alrededor de

ellos.

El desensamble de la cubierta nuclear, es paralelo a un proceso similar al que le ocurre al

RE, involucra cambios en los tres componentes: las membranas nucleares se fragmentan

formando vesículas, los complejos de poro se disocian y la lámina nuclear se

despolimeriza. La lámina nuclear compuesta de proteínas filamentosas denominadas

láminas, la que es catalizada por la proteína quinasa Cdc2 (y otras proteínas quinasas).

En paralelo con la disolución de la lámina nuclear la membrana nuclear se fragmenta

formando vesículas. Las láminas tipo B (1 y 2) permanecen asociadas a las vesículas, pero

las tipo A y C se liberan como dímeros al citosol. Esta diferencia se debe a que las

láminas tipo B se encuentran modificadas por la adición de lípidos (grupos prenilo),

mientras que los grupos prenilo C‐terminales de las láminas A y C son removidos por

proteólisis luego de su incorporación a la lámina.

En la mitosis también son fosforiladas varias proteínas integrales de membrana lo cual

es un proceso clave para la formación de vesículas así como para la disociación de la


317

membrana nuclear, los cromosomas y la lámina nuclear.

• Condensación de los cromosomas

El otro cambio importante en la estructura del núcleo mitótico es la condensación de los

cromosomas. La cromatina interfásica ya está empaquetada formando los nucleosomas

los que a su vez forman las fibras de 30 nm, deben empaquetarse unas 1.000 veces para

formar los cromosomas mitóticos compactos.

El mecanismo de la condensación cromosómica no está aún comprendido. Aunque se ha

visto que la histona H1 es substrato de la Cdc2 y está fosforilada en la mayor parte de las

células mitóticas. Sin embargo, experimentos recientes han mostrado que la

fosforilación de la H1 no es un requisito para la condensación de los cromosomas

mitóticos. En contraste se ha visto que la fosforilación de la H3 es requerida para la

condensación cromosómica en la mitosis.

Estudios recientes han identificado complejos proteicos llamados condensinas que

juegan un rol importante en la condensación de los cromosomas. Las condensinas son

requeridas para la condensación de los cromosomas en extractos de las células mitóticas

y parecen actuar envolviendo ADN alrededor de ellas. Las condensinas son activadas y

fosforiladas por la proteína quinasa Cdc2 proveyendo una unión directa entre la

activación de la Cdc2 y la condensación de los cromosomas mitóticos.

Estadios de la mitosis

La mitosis cumple la función de distribuir los cromosomas duplicados de modo tal que

cada nueva célula obtenga una dotación completa de cromosomas. La capacidad de la

célula para llevar a cabo esta distribución depende del estado condensado de los

cromosomas durante la mitosis y del ensamble de microtúbulos del denominado huso.

En los estadios tempranos de la mitosis, cada uno de los cromosomas consiste en dos

copias idénticas, llamadas cromátides, que se mantienen juntas por sus centrómeros.

Simultáneamente se organiza el huso, cuya formación se inicia a partir de los

centrosomas.

Tanto en las células animales como en las vegetales, el entramado del huso está


318

formado por fibras que se extienden desde los polos al ecuador de la célula. Otras fibras

están unidas a las cromátides al nivel de los cinetocoros, estructuras proteicas asociadas

con los centrómeros. La profase finaliza con la desintegración de la envoltura nuclear y

la desaparición de los nucléolos.

Durante la metafase, los pares de cromátides, dirigidos por las fibras del huso, se

mueven hacia el centro de la célula. Al final de la metafase se disponen en el plano

ecuatorial. Durante la anafase se separan las cromátides hermanas, y cada cromátide –

ahora un cromosoma independiente– se mueve a un polo opuesto.

Durante la telofase se forma una envoltura nuclear alrededor de cada grupo de

cromosomas. El huso comienza a desintegrarse, los cromosomas se desenrollan y una

vez más se extienden y aparecen difusos.

MPF y el progreso de la Metafase

La mitosis involucra cambios dramáticos que llevan a una reorganización de la célula.

Estos eventos son iniciados por el complejo formado por Cdc2 /ciclina B (MPF). Parece

ser que la MPF no sólo actúa como regulador maestro de la fase M, fosforilando y

activando otras proteínas quinasas corriente abajo sino que actúa directamente

fosforilando y activando a algunas de las proteínas estructurales involucradas en esta

reorganización celular.

La condensación de la cromatina interfásica es un evento clave en mitosis ya que resulta

crítico para permitir a los cromosomas moverse a lo largo del huso mitótico sin

romperse ni enredarse. Durante esta etapa la cromatina no se transcribe. A pesar de la

importancia del evento, no conocemos completamente ni la estructura ni el mecanismo

molecular involucrado en la condensación metafásica de los cromosomas.

La Cdc2 fosforila la proteína GM130 (Golgi Matrix 130) impidiendo la coalescencia de

vesículas y la formación del aparato de Golgi. También la Cdc2 fosforila a las proteínas

asociadas a microtúbulos aumentando su inestabilidad. También fosforila una serie de

MAPK o a quinasas activadas por la MPF.

Proteólisis e inactivación del MPF: anafase y telofase

Una vez que la célula ha realizado el chequeo del alineamiento de los cromosomas en la


319

metafase, la célula procede a iniciar la anafase y a completar la mitosis. La progresión de

metafase a anafase resulta de la proteólisis mediada por ubiquitina, de las proteínas

regulatorias claves. Esta está disparada por la activación de una ligasa de ubiquitina

denominada complejo promotor de la anafase. La activación del complejo promotor de

la anafase es inducido por el propio MPF al comienzo de la mitosis por lo que ésta es la

responsable de disparar su propia destrucción. El complejo promotor de la anafase, sin

embargo, permanece inhibido hasta que la célula pasa el chequeo de la metafase,

después del cual la activación del sistema de degradación de la ubiquitina lleva a la

transición de la metafase a la anafase. El comienzo de la anafase resulta de la

degradación de una proteína denominada Scc1, un componente de un complejo de

proteínas denominadas cohesinas que mantienen la conexión entre las cromátidas

hermanas mientras estas están alineadas en la placa metafásica. La degradación de la

Scc1 no es catalizada directamente por el complejo activador de la anafase, sino que

éste degrada una proteína regulatoria denominada Pds1. La degradación de ésa, activa

otra proteína llamada Esp1 la que lleva a la proteólisis de la cohesina Scc1 que conduce

a la separación de las cromátidas hermanas permitiendo que estas se dirijan hacia los

polos opuestos del huso mitótico. La separación de los cromosomas durante la anafase

procede como resultado de varias proteína motoras asociadas al huso mitótico.

La otra proteína clave que resulta ser blanco de la ubiquitinización y degradación es la

ciclina B, la que conduce a la inactivación de la MPF, la que es requerida para que la

célula salga del proceso mitótico. Muchos de los cambios que se producen en esta

transición son la reversa de los que ocurren en la entrada en la mitosis inducida por

MPF. La inactivación de MPF también dispara la citocinesis.

Citocinesis

La culminación de la mitosis es en general acompañada por la citocinesis. La citocinesis

usualmente comienza en la anafase, y es disparada por la inactivación de la MPF

coordinando la división nuclear y citoplasmática de la célula.

La citocinesis es la división del citoplasma y difiere significativamente en las células

vegetales y en las animales. En las células animales, durante la telofase temprana la

membrana comienza a constreñirse alrededor de la circunferencia de la célula, en el


320

plano ecuatorial del huso. La constricción se produce por la contracción de un anillo

compuesto principalmente por filamentos de actina y miosina –el anillo contráctil– que

se encuentra unido a la cara citoplasmática de la membrana celular. El anillo contráctil

actúa en la membrana de la célula materna, a la altura de su línea media,

estrangulándola hasta que se separan las dos células hijas.

En las células vegetales, una serie de vesículas divide al citoplasma en la línea media.

Estas vesículas, son producidas por los complejos de Golgi y contienen polisacáridos. Las

vesículas migran hacia el plano ecuatorial, transportadas por los microtúbulos

remanentes del huso mitótico; finalmente se fusionan y forman una estructura plana

limitada por membrana, la placa celular. A medida que se agregan más vesículas, los

bordes de la placa en crecimiento se fusionan con la membrana de la célula y se forma

una capa de polisacáridos entre las dos células hijas, completándose su separación. Esta

capa se impregna con pectinas y forma finalmente la laminilla media. Cada nueva célula

construye, así, su propia pared celular, depositando celulosa y otros polisacáridos sobre

la superficie externa de su membrana celular.

Cuando se completa la división celular, se han producido dos células hijas, más pequeñas

que la célula materna, pero indistinguibles de ésta en cualquier otro aspecto.

Apoptosis

En la formación de un individuo, la muerte celular o apoptosis es tan importante como la

división celular. La mayoría de las células fabrican las proteínas que forman parte de una

maquinaria para su propia destrucción. Esta maquinaria letal está compuesta por

enzimas capaces de degradar proteínas (proteasas) cuya activación produce, directa o

indirectamente, cambios celulares característicos. Las células que entran en apoptosis se

encogen y se separan de sus vecinas; luego las membranas celulares se ondulan y se

forman burbujas en su superficie; la cromatina se condensa y los cromosomas se

fragmentan; finalmente, las células se dividen en numerosas vesículas, los cuerpos

apoptóticos, que serán engullidas por células vecinas.

Las enzimas involucradas en el proceso de apoptosis permanecen normalmente

inactivas en las células, respondiendo a estrictos mecanismos de control. Los


321

mecanismos de control son los responsables de activar la maquinaria letal en momentos

particulares de la vida de la célula, respondiendo a señales externas o internas.

Cualquier alteración en estos mecanismos de control puede tener consecuencias

nefastas para el organismo, creando estados patológicos producidos tanto por la pérdida

de células normales como por la sobrevida de células que deberían entrar en apoptosis.

Cuando una célula muere por daño o envenenamiento, proceso denominado necrosis,

normalmente se hincha y explota, derramando su contenido en el entorno. Como

consecuencia, se produce una inflamación que recluta leucocitos, y que puede lesionar

el tejido normal que la circunda. La apoptosis, a diferencia de la necrosis, es un tipo de

muerte activa, que requiere gasto de energía por parte de la célula y es un proceso

ordenado en el que no se desarrolla un proceso inflamatorio.

El mecanismo es diferente para las plantas superiores.

EL CONTROL DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR Y EL CÁNCER

La capacidad de proliferar en forma descontrolada está relacionada con la acumulación

de ciertos cambios en la célula. El cáncer es el resultado de una serie de modificaciones

accidentales en el material genético que trae como consecuencia la alteración del

comportamiento normal de la célula. Existen genes que contribuyen a originar un cáncer

los cuales, en sus “versiones normales”, están relacionados con el control del

crecimiento y la sobrevida de la célula. Entre ellos, los protooncogenes estimulan la

proliferación celular y los genes supresores de tumores, la inhiben. La versión alterada

de un protooncogen se denomina oncogen (del griego onkos, “tumor”) y puede ser

responsable, por ejemplo, del aumento desmedido de una proteína estimuladora del

crecimiento. Por otra parte, la versión alterada de un gen supresor puede resultar en la

pérdida de una proteína inhibidora del crecimiento o de una proteína activadora de la

muerte programada.

En ambos casos, la presencia de estos genes alterados conduce a la proliferación

descontrolada de las células que se encuentra en el origen de todo cáncer.

Mientras las células tumorales quedan restringidas a una masa única, se dice que el


322

tumor es benigno. Un tumor benigno puede proseguir su crecimiento sin invadir el tejido

circundante; puede también detener su crecimiento o reducirse. En muchas ocasiones,

es posible removerlo quirúrgicamente y lograr así una cura completa.

Una característica clave de las células cancerosas es que, a diferencia de las células

normales, tienen la capacidad de emigrar, invadir nuevos tejidos y establecer nuevas

colonias. Este proceso se denomina metástasis. Un tumor que adquiere esta capacidad

pasa a ser maligno y causa frecuentemente la muerte.

MMEEIIOOSSIISS YY RREEPPRROODDUUCCCCIIÓÓNN SSEEXXUUAALL

La reproducción sexual requiere, en general, de dos progenitores y siempre involucra

dos hechos: la fecundación y la meiosis. La fecundación es el medio por el cual las

dotaciones genéticas de ambos progenitores se reúnen y forman una nueva identidad

genética, la de la progenie. La meiosis es un tipo especial de división nuclear en el que

se redistribuyen los cromosomas y se producen células que tienen un número haploide

de cromosomas (n). La fecundación restablece el número diploide (2n). En organismos

con reproducción sexual, la haploidía y la diploidía se suceden a lo largo de los ciclos de

vida.

Cada una de las células haploides producidas por meiosis contiene un complejo único de

cromosomas, debido al entrecruzamiento y a la segregación al azar de los cromosomas.

De esta manera, la meiosis es una fuente de variabilidad en la descendencia.

Los acontecimientos que tienen lugar durante la meiosis se asemejan a los de la mitosis,

proceso de reproducción en el cual el material genético –el ADN– se reparte en partes

iguales entre dos nuevas células hijas. Existen importantes diferencias entre los procesos

de mitosis y meiosis. Durante la meiosis, cada núcleo diploide se divide dos veces,

produciendo un total de cuatro núcleos. Sin embargo, los cromosomas se duplican sólo

una vez, antes de la primera división nuclear. Por lo tanto, cada uno de los cuatro

núcleos producidos contiene la mitad del número de cromosomas presentes en el

núcleo original. A diferencia de lo que ocurre en la meiosis, en la mitosis, luego de la

duplicación de los cromosomas, cada núcleo de divide sólo una vez. En consecuencia, el


323

número de cromosomas se mantiene invariable.

Debido al fenómeno del entrecruzamiento y al de segregación al azar de los

cromosomas, durante la meiosis se recombina el material genético de los progenitores,

lo que no ocurre en la mitosis.

La mitosis puede ocurrir en células haploides o diploides, mientras que la meiosis

ocurre solamente en células con un número diploide (o poliploide) de cromosomas.

La meiosis ocurre en diferentes momentos del ciclo vital, según en que especie se

produzca. Aunque la meiosis en los animales produce gametos, en las plantas produce

esporas. Una espora es una célula reproductora haploide que, a diferencia de un

gameto, puede producir un organismo haploide sin haberse fusionado previamente con

otra célula. Sin embargo, con la formación de gametos y esporas por meiosis, se obtiene

el mismo resultado: en algún momento del ciclo vital de un organismo que se reproduce

sexualmente, se reduce la dotación diploide de cromosomas a la dotación haploide.

LAS FASES DE LA MEIOSIS

LA MEIOSIS, UN TIPO ESPECIAL DE DIVISIÓN NUCLEAR

Consiste en dos divisiones nucleares sucesivas, designadas convencionalmente meiosis I

y meiosis II. Durante este proceso de división se redistribuyen los cromosomas y se

producen células que tienen un número haploide de cromosomas (n).

Durante la interfase que precede a la meiosis, los cromosomas se duplican. En la profase

I de la meiosis, los cromosomas homólogos se aparean.

Un homólogo de cada par proviene de un progenitor, y el otro homólogo, del otro

progenitor. Cada homólogo consta de dos cromátides hermanas idénticas, que se

mantienen unidas por el centrómero. Mientras los homólogos están apareados, ocurre

entre ellos el entrecruzamiento (crossing over), dando como resultado el intercambio de

material cromosómico.

Al finalizar la meiosis I, los cromosomas homólogos se separan. Se producen dos

núcleos, cada uno con un número haploide de cromosomas. Cada cromosoma, a su vez,


324

está formado por dos cromátides. Los núcleos pueden pasar por un período de interfase,

pero el material cromosómico no se duplica. En la segunda etapa de la meiosis, la

meiosis II, las cromátides hermanas de cada cromosoma se separan, como si fuese una

mitosis.

CUANDO LOS DOS NÚCLEOS SE DIVIDEN, SE FORMAN CUATRO CÉLULAS HAPLOIDES. A) PAR DE CROMOSOMAS

HOMÓLOGOS ANTES DE LA MEIOSIS. UN MIEMBRO DEL PAR PROVIENE DE UN PROGENITOR Y EL OTRO

MIEMBRO PROVIENE DE OTRO PROGENITOR. CADA CROMOSOMA ESTÁ DUPLICADO Y CONTIENE DOS

CROMÁTIDES HERMANAS. B) DURANTE LA PROFASE I DE LA MEIOSIS, LOS CROMOSOMAS HOMÓLOGOS SE

DISPONEN DE A PARES –SE APAREAN–. CADA PAR HOMÓLOGO ESTÁ FORMADO POR CUATRO CROMÁTIDES

POR LO QUE TAMBIÉN SE CONOCE COMO TÉTRADA (DEL GRIEGO, TETRA QUE SIGNIFICA "CUATRO"). ENTRE

LAS CROMÁTIDES DE LOS DOS CROMOSOMAS HOMÓLOGOS SE PRODUCE EL ENTRECRUZAMIENTO, ES DECIR, EL

INTERCAMBIO DE SEGMENTOS CROMOSÓMICOS. LOS CROMOSOMAS HOMÓLOGOS PERMANECEN ASOCIADOS

EN LOS PUNTOS DE ENTRECRUZAMIENTO –O QUIASMAS– HASTA EL FINAL DE LA PROFASE I. C) LUEGO, LOS

CROMOSOMAS COMIENZAN A SEPARARSE. COMO SE PUEDE VER, LAS CROMÁTIDES HERMANAS DE CADA

HOMÓLOGO YA NO SON COMPLETAMENTE IDÉNTICAS; EL ENTRECRUZAMIENTO DA COMO RESULTADO UNA

RECOMBINACIÓN DEL MATERIAL GENÉTICO DE LOS DOS HOMÓLOGOS. REPRESENTACIÓN DE LAS FASES DE LA

MEIOSIS EN UNA CÉLULA VEGETAL CUYO NÚMERO DIPLOIDE ES 2N = 8 (N = 4).

HAPLOIDÍA Y DIPLOIDÍA

Cada organismo tiene un número de cromosomas característico de su especie. Sin

embargo, en la mayoría de las plantas y animales conocidos, las células sexuales, o

gametos, tienen exactamente la mitad del número de cromosomas que las células

somáticas del organismo. El número de cromosomas de los gametos se conoce como

número haploide, y en las células somáticas, como número diploide. Las células que

tienen más de dos dotaciones cromosómicas se denominan poliploides.

Utilizando una notación abreviada, el número haploide se designa como n y el número

diploide como 2n. Cuando un espermatozoide fecunda a un óvulo, los dos núcleos

haploides se fusionan, n + n=2n, y el número diploide se restablece. La célula diploide

producida por la fusión de dos gametos se conoce como cigoto.

En toda célula diploide, cada cromosoma tiene su pareja. Estos pares de cromosomas se


325

conocen como pares homólogos. Los dos se asemejan en tamaño y forma y también en

el tipo de información hereditaria que contienen. Uno de los cromosomas homólogos

proviene del gameto de uno de los progenitores y su pareja, del gameto del otro

progenitor. Después de la fecundación, ambos homólogos se encuentran presentes en el

cigoto.

En la meiosis, la dotación cromosómica diploide, que contiene los dos homólogos de

cada par, se reduce a una dotación haploide, que contiene solamente un homólogo de

cada par. Así, la meiosis compensa los efectos de la fecundación.

• El proceso de Meiosis

El apareamiento de los cromosomas homólogos después de la replicación del ADN no

sólo es un evento clave que subraya la segregación meiótica sino que también permite la

recombinación entre cromosomas de origen paternal y maternal. El apareamiento

crítico de cromosomas homólogos tiene lugar durante una extendida profase de la

meiosis I que se divide en cinco estadios: leptotene, zigotene, paquitene, diplotene y

diacinesis, en base a la morfología de los cromosomas. La asociación inicial de los

cromosomas homólogos se cree que se produce mediada por apareamiento de bases

entre hebras de ADN complementarias durante el estadio leptotene antes que la

cromatina se torne altamente condensada. La estrecha relación entre los cromosomas

homólogos (sinapsis) comienza durante el estadio zigotene. Durante este estadio, una

estructura proteica, tipo cierre relámpago, denominada complejo sinaptonemal se

forma a lo largo de los cromosomas apareados. Este complejo, compuesto por un

elemento central, los elementos laterales, mantiene los cromosomas homólogos

estrechamente asociados y alineados unos con otros a través del estadio paquitene, que

puede persistir por varios días. La recombinación entre los cromosomas homólogos se

completa durante su asociación en el estadio paquitene, manteniéndose los

cromosomas ligados en los sitios en los que se ha producido el entrecruzamiento

(crossing‐over) en las zonas donde se producen los quiasmata. El complejo

sinaptonemal desaparece en el estadio diplotene y los cromosomas homólogos se

separan a lo largo de su longitud. Sin embargo, ellos permanecen asociados en las

regiones de recombinación o quiasmata, lo que es crítico para su correcto alineamiento


326

en la metafase. En este estadio cada par cromosómico (llamado bivalente) consiste de

cuatro cromátidas unidas en los quiasmata. La diacinesis, el estadio final de la profase I,

representa el estadio de transición a la metafase I durante la cual los cromosomas se

tornan completamente condensados.

En la metafase I los cromosomas se alinean sobre el huso. En contraste con la mitosis,

los cinetocoros de las cromátides hermanas se ubican adyacentes unos con otros y

orientados en la misma dirección, mientras que los cinetocoros de los cromosomas

homólogos apuntan hacia los polos opuestos. Consecuentemente, los microtúbulos de

cada uno de cada mismo polo se unen a las cromátides hermanas, mientras que los

microtúbulos de los polos opuestos se unen a cada cromosoma homólogo. La anafase I

se inicia por disrupción de los quiasmata por los que se unen los cromosomas

homólogos. Los cromosomas homólogos se separan, mientras que las cromátidas

hermanas permanecen unidas por sus centrómeros. Al completarse la meiosis I cada

célula hija ha adquirido un miembro de cada par homólogo consistiendo de dos

cromátidas hijas.

La meiosis II se inicia inmediatamente después de la citocinesis, usualmente antes de

que los cromosomas se hayan descondensado totalmente. En contraste con la meiosis I,

la meiosis II recuerda a una mitosis normal. En la metafase II, los cromosomas se alinean

en el huso mitótico con microtúbulos de los polos opuestos del huso anclados a los

cinetocoros de cromátidas hermanas. La unión de los centrómeros de las cromátidas se

rompe en la anafase II y las cromátidas hermanas se separan hacia los polos opuestos,

luego se produce la citocinesis, dando células hijas haploides.

• Regulación de la Meiosis de los oocitos

Los oocitos de vertebrados han sido modelos particularmente útiles para los estudios del

ciclo celular, en parte por su tamaño y fácil manipulación en el laboratorio. Por ejemplo,

ya hemos visto que el descubrimiento del MPF y su ulterior purificación se realizó en

estos tipos celulares de anfibios. La meiosis de estos oocitos como la de otras especies

es regulada en dos puntos del ciclo celular y los estudios sobre estos oocitos han

ilustrado nuevos mecanismos en el control del ciclo celular.


327

El primer punto de regulación se da en el estadio de diplotene de la primera división

meiótica. Los oocitos pueden permanecer arrestados en este estadio por largos períodos

de tiempo – hasta 50 años en humanos –. Durante éste arresto diploténico, los oocitos

descondensan sus cromosomas y su ADN se transcribe activamente. Esta actividad

transcripcional se refleja en el gran crecimiento de los oocitos durante éste período. Los

oocitos humanos, por ejemplo, son de aproximadamente 100 μm (más de 100 veces el

tamaño de típico de una célula somática). Los oocitos de rana son aún más grandes con

un diámetro de aproximadamente 1 mm. Durante este período de crecimiento, los

oocitos acumulan materiales stock que incluye las proteínas y los ARNs necesarios para

el desarrollo temprano del embrión.

Los oocitos de las distintas especies varían en cuanto al momento en que se reanuda la

meiosis y tiene lugar la fertilización. En algunos animales los oocitos permanecen

arrestados en diplotene hasta que son fertilizados, sólo luego proceden las meiosis I y II

hasta completarse.

Sin embargo, en la mayoría de los vertebrados incluyendo ranas, ratones y humanos, la

respuesta de la meiosis se debe a estímulos hormonales y procede a través de la meiosis

I previo a la fertilización. La división celular que sigue a la meiosis I es asimétrica y

resulta en la producción de un pequeño cuerpo polar y un oocito de gran tamaño. El

oocito luego procede a ingresar en la meiosis II, sin haber reformado el núcleo ni

descondensado sus cromosomas. La mayoría de los vertebrados mantienen sus oocitos

nuevamente arrestados en la metafase II en la que permanecen hasta ser fertilizados.

Como la fase M de las células somáticas, la meiosis de los oocitos es controlada por el

MPF. La regulación del MPF durante la meiosis de los oocitos muestra características

únicas que son las responsables del arresto de los oocitos en metafase II. La estimulación

hormonal de los oocitos arrestados en diplotene dispara inicialmente el reinicio de la

meiosis por activación del MPF, como ocurría en la transición de G2 a M en las células

somáticas. Como en la mitosis el MPF induce la condensación de los cromosomas, la

ruptura de la envoltura nuclear y la formación del huso. La activación del complejo B

activante de la anafase de la meiosis I luego lleva de la metafase a la anafase de la

meiosis I, acompañada por una disminución en la actividad del MPF. Sin embargo, luego


328

de la citocinesis, nuevamente aumenta la actividad de la MPF y permanece en niveles

elevados mientras el oocito es arrestado en metafase II. Un mecanismo regulatorio

único mantiene así la actividad de la MPF durante el arresto en metafase II, previniendo

la transición metafase – anafase II que sucede normalmente durante la proteólisis de la

ciclina B en la fase M de las células somáticas.

El factor responsable del arresto en metafase II fue primero identificado Yoshio Masui &

Clemet Markert en 1971, en la misma serie de experimentos que llevaron al

descubrimiento del MPF. Sin embargo, en este caso el citoplasma de un huevo arrestado

en metafase II se inyectó en una célula embrionaria temprana que se encontraba

sufriendo mitosis. Esta inyección de citofase de oocito metafísico II causó el arresto de

de la célula embrionaria, en metafase, indicando que el arresto metafísico era inducido

por un factor citoplasmático presente en el oocito metafísico II. Debido a que arrestaba

el proceso mitótico se denominó factor citostático (CSF).

Experimentos más recientes, han identificado una proteína quinasa serina–treonina

conocida como Mos, la cual sería un componente esencial del CSF. La Mos es

específicamente sintetizada en los oocitos en el tiempo de finalización de la meiosis I y

luego es requerida tanto para el incremento de la actividad de la MPF durante el arresto

de la metafase II, como durante la meiosis II. La acción de la Mos resulta de la activación

de la quinasa ERK‐MAP que juega un rol central en la activación de la célula. Sin

embargo, el ERK juega un rol diferente: este factor activa otra proteína quinasa llamada

Rsk la que inhibe la acción del complejo promotor de la anafase y arresta la meiosis en la

metafase II. Los oocitos pueden permanecer arrestados en este punto en ciclo celular

meiótico por varios días aguardando la fertilización.

MEIOSIS Y REPRODUCCIÓN SEXUAL

La reproducción sexual requiere, en general, de dos progenitores y siempre involucra

dos hechos: la fecundación y la meiosis. La fecundación es el medio por el cual las

dotaciones genéticas de ambos progenitores se reúnen y forman una nueva identidad

genética, la de la progenie. La meiosis es un tipo especial de división nuclear en el que

se redistribuyen los cromosomas y se producen células que tienen un número haploide


329

de cromosomas (n). La fecundación restablece el número diploide (2n). En organismos

con reproducción sexual, la haploidía y la diploidía se suceden a lo largo de los ciclos de

vida.

Cada una de las células haploides producidas por meiosis contiene un complejo único de

cromosomas, debido al entrecruzamiento y a la segregación al azar de los cromosomas.

De esta manera, la meiosis es una fuente de variabilidad en la descendencia.


proceso de reproducción en el cual el material genético –el ADN– se reparte en partes

iguales entre dos nuevas células hijas. Existen importantes diferencias entre los procesos

de mitosis y meiosis. Durante la meiosis, cada núcleo diploide se divide dos veces,

produciendo un total de cuatro núcleos. Sin embargo, los cromosomas se duplican sólo

una vez, antes de la primera división nuclear. Por lo tanto, cada uno de los cuatro

núcleos producidos contiene la mitad del número de cromosomas presentes en el

núcleo original. A diferencia de lo que ocurre en la meiosis, en la mitosis, luego de la

duplicación de los cromosomas, cada núcleo de divide sólo una vez. En consecuencia, el

número de cromosomas se mantiene invariable.

Debido al fenómeno del entrecruzamiento y al de segregación al azar de los

cromosomas, durante la meiosis se recombina el material genético de los progenitores,

lo que no ocurre en la mitosis.

La mitosis puede ocurrir en células haploides o diploides, mientras que la meiosis

ocurre solamente en células con un número diploide (o poliploide) de cromosomas.

La meiosis ocurre en diferentes momentos del ciclo vital, según en que especie se

produzca. Aunque la meiosis en los animales produce gametos, en las plantas produce

esporas. Una espora es una célula reproductora haploide que, a diferencia de un

gameto, puede producir un organismo haploide sin haberse fusionado previamente con

otra célula. Sin embargo, con la formación de gametos y esporas por meiosis, se obtiene

el mismo resultado: en algún momento del ciclo vital de un organismo que se reproduce

sexualmente, se reduce la dotación diploide de cromosomas a la dotación haploide.


330

DIFERENCIAS ENTRE MITOSIS Y MEIOSIS


pero una comparación de los dos procesos muestra un buen número de diferencias

importantes

LA MEIOSIS OCURRE EN DISTINTOS TIPOS DE CICLOS VITALES

La meiosis, según en qué especie se produzca, ocurre en diferentes momentos del ciclo

vital. En muchos protistas y hongos, tales como el alga Chlamydomonas y el moho

Neurospora, ocurre inmediatamente después de la fusión de las células fecundantes. Las

células, habitualmente son haploides, y la meiosis restablece el número haploide

después de la fecundación.

En las plantas, la fase haploide típicamente alterna con una fase diploide. En los

helechos, por ejemplo, la forma más común y conspicua es el individuo diploide, el

esporofito. Los esporofitos de los helechos producen esporas por meiosis, que

habitualmente se encuentran en la parte inferior de sus frondes (hojas). Estas esporas,

que tienen el número haploide de cromosomas, germinan y forman plantas mucho más

pequeñas, los gametofitos, que típicamente consisten sólo en unas pocas capas de

células, todas ellas haploides. Los pequeños gametofitos haploides producen gametos

por mitosis; los gametos se fusionan y luego desarrollan un nuevo esporofito diploide.

Este proceso, en el cual una fase haploide es seguida por una fase diploide y

nuevamente por otra haploide, se conoce como alternancia de generaciones. La

alternancia de generaciones ocurre en todas las plantas que se reproducen

sexualmente, aunque no siempre en la misma forma.

Los seres humanos tienen el ciclo biológico típico de los animales en el cual los

individuos diploides producen gametos haploides por meiosis, inmediatamente antes de

la fecundación. La fecundación de los gametos masculino y femenino restablece el

número diploide de cromosomas. Prácticamente, todo el ciclo vital transcurre en el

estado diploide.


331

BIBLIOGRAFÍA

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Documents

Compendio de Biologia Molecular y Celular