Compendio de Enzimología

7/24/2019 Compendio de Enzimologa

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COMPENDIODEENZIMOLOGA


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ENRIQUEBATTANERARIAS

COMPENDIO DE ENZIMOLOGA


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Manuales Universitarios88

Ediciones Universidad de Salamanca y Enrique Battaner Arias

1. edicin: julio, 2013ISBN: 978-84-9012-295-2 (pdf)

ISBN: 978-84-9012-296-9 (e-Pub)ISBN: 978-84-9012-297-6 (Mobipocket)

Ediciones Universidad de [email protected]

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Ficha catalogrfcaCEP

BATTANER ARIAS, Enrique

Compendio de enzimologa [Recuso electrnico] / Enrique Battaner Arias. 1a. ed. electrnica. Salamanca : Ediciones Universidad de Salamanca, 2013.

320 p. - (Manuales Universitarios ; 88)

1. Bioqumica. 2. Biologa molecular. 3. Biomolculas577.1


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ndice

Introduccin a la Enzimologa ....................................................................................17

Notas histricas ......................................................................................................................18I. Los orgenes ...................................................................................................................18

II. La fermentacin alcohlica ...........................................................................................20

El estudio de la Enzimologa ...................................................................................................22

Bibliografa general .................................................................................................................23

Captulo 1Las reacciones qumicas: criterios de espontaneidad y cintica .................. 27

1.1. En qu circunstancias tiene lugar espontneamente una reaccin? ..................................28

1.1.1. El calor absorbido o desprendido en reacciones qumicas ........................................28

1.1.2. Orden o desorden introducido en un sistema: la entropa........................................29

1.1.3. rabajo til potencial en una transformacin: la Energa Libre ................................30

1.2. La velocidad de las reacciones qumicas ............................................................................33

1.2.1. Velocidad y concentracin: orden de reaccin y molecularidad ................................33

1.2.2. Velocidad y temperatura: concepto de energa de activacin ....................................38

1.2.3. Catlisis ..................................................................................................................411.2.3.1. Los catalizadores no entran en la ecuacin estequiomtrica global ..................41

1.2.3.2. Los catalizadores no alteran la posicin de equilibrio de la reaccin ................42

1.2.3.3. Los catalizadores modifican la energa de activacin .......................................43

1.2.3.4. Catlisis homognea y heterognea .................................................................45

Captulo 2Catlisis enzimtica: trminos, conceptos y caractersticas generales .........47

2.1. Conceptos y trminos ......................................................................................................48

2.1.1. Enzima ...................................................................................................................48

2.1.2. Substrato .................................................................................................................50

2.1.3. Centro activo ..........................................................................................................50

2.1.4. Protmero ...............................................................................................................51

2.1.5. Actividad enzimtica ...............................................................................................51

2.1.6. Actividad especfica, actividad molecular, nmero de recambio ...............................52

2.1.7. Inhibidor ................................................................................................................53

2.1.8. Activador ................................................................................................................53
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2.1.9. Coenzima ...............................................................................................................53

2.1.10. Isoenzima ..............................................................................................................55

2.2. Naturaleza qumica de las enzimas ...................................................................................55

2.3. La especificidad de las enzimas .........................................................................................57

2.3.1. Especificidad sobre estereoismeros .........................................................................57

2.3.2. Proquiralidad ..........................................................................................................58

2.3.3. Especificidad relativa ...............................................................................................60

2.3.4. Especificidad en enzimas multisubstrato ..................................................................60

2.3.5. Especificidad en secuencias de nucletidos ..............................................................61

2.4. Otros aspectos de la catlisis enzimtica ...........................................................................61

2.5. eoras sobre la accin enzimtica ....................................................................................62Captulo 3Clasificacin y nomenclatura de las enzimas. Reacciones enzimticas .......65

3.1. Principios generales de clasificacin y nomenclatura de enzimas ......................................66

3.1.1. Nomenclatura .........................................................................................................66

3.1.2. Clasificacin............................................................................................................67

3.2. Reacciones enzimticas ....................................................................................................68

3.2.1. Grupo 1: Oxidorreductasas .....................................................................................68

3.2.1.1. Clasificacin sistemtica de las oxidorreductasas .............................................68

3.2.1.2. Nomenclatura alternativa (recomendada) para las oxidorreductasas ................69

3.2.1.3. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por oxidorreductasas.....................69

(a) Deshidrogenasas ...............................................................................................69

(b) Oxidasas...........................................................................................................70

(c) Peroxidasas .......................................................................................................70

(d) Oxigenasas (no confundir con Oxidasas) ..........................................................71

(e) Hidroxilasas ......................................................................................................72

(f ) Reductasas ........................................................................................................72

3.2.2. Grupo 2: ransferasas ..............................................................................................73

3.2.2.1. Clasificacin sistemtica de las transferasas .....................................................73

3.2.2.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por transferasas .............................74

(a) Subgrupo 2.1: ransfieren grupos monocarbonados ..........................................74

(b) Subgrupo 2.4: Glicosil transferasas ...................................................................74
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(c) Subgrupo 2.6: transfieren grupos nitrogenados .................................................75

(d) Subgrupo 2.7: Fosfotransferasas o kinasas .........................................................77

3.2.3. Grupo 3: Hidrolasas ................................................................................................77

3.2.3.1. Clasificacin sistemtica de las hidrolasas.......................................................78

(a) Subgrupo 3.1. Hidrolizan enlaces ster .............................................................78

(b) Subgrupo 3.2: Glicsido hidrolasas (glicosidasas) .............................................79

(c) Subgrupo 3.4: Pptido hidrolasas ......................................................................80

- Serin proteinasas ............................................................................................80

- iol proteinasas ..............................................................................................81

- Proteinasas cidas ...........................................................................................81

- Metaloproteinasas ..........................................................................................81(d) Subgrupo 3.6: Acil anhdrido hidrolasas ...........................................................82

3.2.4. Grupo 4: Liasas .......................................................................................................82

(a) Subgrupo 4.1: Liasas C-C .................................................................................83

(b) Subgrupo 4.2: Liasas C-O ................................................................................84

3.2.5. Grupo 5: Isomerasas................................................................................................84

3.2.5.1. Clasificacin sistemtica de las isomerasas.......................................................85

3.2.5.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por isomerasas ..............................85

(a) Subgrupo 5.1: Racemasas y epimerasas .............................................................85

(b) Subgrupo 5.2: Isomerasas cis-trans ...................................................................85

(c) Subgrupo 5.3: Oxidorreductasas intramoleculares ............................................86

(d) Subgrupo 5.4: ransferasas intramoleculares (mutasas) .....................................86

(e) Subgrupo 5.99: Otras isomerasas ......................................................................87

3.2.6. Grupo 6: Ligasas o Sintetasas ..................................................................................873.2.6.1. Clasificacin sistemtica de las ligasas .............................................................88

3.2.6.2. Algunas reacciones enzimticas catalizadas por ligasas .....................................88

(a) Subgrupo 6.1: Ligasas C-O...............................................................................88

(b) Subgrupo 6.3: Ligasas C-N ..............................................................................89

(c) Subgrupo 6.4: Ligasas C-C ...............................................................................89

Captulo 4Coenzimas o cofactores ............................................................................91

4.1. Introduccin ....................................................................................................................92
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4.2. Coenzimas asociadas a procesos redox ..............................................................................93

4.2.1. Coenzimas piridnicas (NAD+, NADP+)..................................................................93

4.2.1.1. Estructura qumica y modo de accin .............................................................94

4.2.1.2. Significacin metablica y fisiolgica..............................................................96

4.2.1.3. Carcter vitamnico ........................................................................................97

4.2.2. Coenzimas flavnicas ...............................................................................................97


4.2.2.2. Flavoprotenas ................................................................................................100


4.2.3. Coenzimas hemnicas ..............................................................................................101

4.2.3.1. Estructura qumica y modo de accin .............................................................1024.2.3.2. Las peroxidasas ...............................................................................................103

4.2.3.3. Los citocromos ...............................................................................................104

4.2.4. Quinonas ................................................................................................................106

4.2.4.1. Ubiquinona o Coenzima Q ............................................................................106

4.2.4.2. Otras quinonas ...............................................................................................107

4.2.5. cido ascrbico (vitamina C) ..................................................................................107

4.2.5.1. Estructura qumica .........................................................................................108

4.2.5.2. Funciones biolgicas.......................................................................................108

4.2.6. Glutatin ................................................................................................................109

4.2.7. Otras coenzimas redox ............................................................................................110

4.3. Coenzimas asociados a otras reacciones (no redox) ...........................................................111

4.3.1. iamina pirofosfato .................................................................................................111

4.3.1.1. Estructura qumica y modo de accin .............................................................1124.3.1.2. Carcter vitamnico ........................................................................................112

4.3.2. Piridoxal fosfato ......................................................................................................112

4.3.2.1. Estructura qumica y modo de accin; metabolismo de aminocidos ..............113

4.3.2.2. Otras reacciones dependientes de piridoxal fosfato .........................................114


4.3.3. Coenzimas folnicas ................................................................................................114

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4.3.3.3. Farmacologa asociada al cido flico ..............................................................117

4.3.4. Coenzimas cobamdicas ..........................................................................................118

4.3.4.1. Estructura qumica.........................................................................................118

4.3.4.2. Modo de accin..............................................................................................120


4.3.5. Biotina ....................................................................................................................121

4.3.5.1. Estructura qumica y modo de accin.............................................................121

4.3.5.2. Avidina ...........................................................................................................123

4.3.6. S-adenosil metionina ...............................................................................................123

4.3.6.1. Estructura qumica .........................................................................................1234.3.6.2. Funcin metablica ........................................................................................123

4.3.7. Pantetenas ..............................................................................................................124

4.3.7.1. Estructura qumica .........................................................................................125

4.3.7.2. Modo de accin..............................................................................................126

4.3.8. Carnitina ................................................................................................................126

4.3.9. 3-Fosfoadenosil 5-fosfosulfato (PAPS) ...................................................................127

4.3.10. Adenosina 5 trifosfato (AP) ................................................................................128

(a) Reacciones de transferencia ligadas al AP ........................................................128

(b) Suministro de energa para otras reacciones ......................................................128

4.3.11. Otros nucletidos que operan como coenzimas .....................................................129

Captulo 5Cintica de las reacciones enzimticas .......................................................131

5.1. Introduccin ....................................................................................................................132

5.1.1. Inters de los estudios cinticos ...............................................................................132

5.1.2. Concepto de velocidad inicial .................................................................................134

5.2. Efecto de la concentracin de enzima ..............................................................................135

5.3. Efecto de la concentracin de substrato ...........................................................................139

5.3.1. Estudio cintico de la interaccin enzima-substrato .................................................141

5.3.2. Mecanismo de Michaelis y Menten .........................................................................143

5.3.3. Concepto de Km

......................................................................................................145

5.3.4. Concepto de Vmax

....................................................................................................147


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5.3.5. Aproximacin de estado estacionario .......................................................................148

5.3.6. Eficiencia cataltica de las enzimas ...........................................................................150

5.3.7. Determinacin experimental de Kmy V

max...............................................................151

5.3.7.1. ransformaciones lineales de la ecuacin de Michaelis-Menten.......................153

5.4. Efecto del pH sobre la velocidad de las reacciones enzimticas .........................................154

5.4.1. Bases moleculares ....................................................................................................154

5.4.2. Significado biolgico del efecto del pH ...................................................................158

5.5. Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas.................................................159

5.5.1. Bases moleculares ....................................................................................................159

5.5.2. Significado biolgico del efecto de la temperatura ...................................................161

Captulo 6Inhibicin enzimtica ............................................................................... 1636.1. Concepto e importancia ..................................................................................................164

6.2. ipos de inhibidores ........................................................................................................166

6.2.1. Inhibidores reversibles .............................................................................................166

6.2.2. Inhibidores irreversibles...........................................................................................167

6.3. Inhibicin competitiva.....................................................................................................168

6.3.1. Cintica de la inhibicin competitiva ......................................................................168

6.3.2. Diagnstico cintico de la inhibicin competitiva ...................................................170

6.3.3. Aspectos estructurales de la inhibicin competitiva .................................................172

6.3.4. Anlogos de estado de transicin .............................................................................175

6.3.5. Anticuerpos catalticos ............................................................................................177

6.3.6. Importancia prctica de la inhibicin competitiva ...................................................178

6.4. Otras formas de inhibicin reversible ...............................................................................179

6.4.1. Inhibicin no competitiva.......................................................................................179

6.4.2. Inhibicin acompetitiva o anticompetitiva ..............................................................181

6.5. Inhibicin irreversible ......................................................................................................182

6.5.1. Generalidades .........................................................................................................182

6.5.2. Reactivos de grupo -SH ..........................................................................................184

6.5.3. Metales pesados.......................................................................................................186

6.5.4. Inhibidores que combinan con cationes esenciales ...................................................186

6.5.5. Reactivos especficos de grupo y marcadores de afinidad..........................................187


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8.3. Alosterismo ......................................................................................................................231

8.3.1. Definicin ...............................................................................................................231

8.3.2. Pruebas experimentales ...........................................................................................234

8.3.3. Alosterismo y cooperatividad..................................................................................235

8.3.3.1. Concepto de cooperatividad ...........................................................................235

8.3.3.2. Implicaciones estructurales de la existencia de cooperatividad .........................236

8.3.3.3. Efectores positivos y negativos y cooperatividad..............................................236

8.3.3.4. Modelo alostrico restringido.........................................................................238

8.3.4. Interpretacin cuantitativa del alosterismo ..............................................................239

8.3.4.1. El modelo de Monod, Wyman y Changeux ....................................................239

8.3.5. La aspartato transcarbamilasa ..................................................................................2428.3.5.1. Comportamiento alostrico de la aspartato transcarbamilasa ..........................242

8.3.5.2. Adecuacin de la aspartato transcarbamilasa al modelo MWC........................242

8.3.6. La hemoglobina ......................................................................................................246

8.3.6.1. Comportamiento alostrico de la hemoglobina ..............................................246

8.3.6.2. Adecuacin de la hemoglobina al modelo MWC ............................................248

Captulo 9Regulacin de la actividad enzimtica, 2. Modificacin covalente de las enzi-mas. Activaciones proteolticas ...................................................................................253

9.1. Introduccin ....................................................................................................................254

9.1.1. Modificacin covalente: su importancia biolgica ...................................................254

9.1.2. Formas de modificacin covalente ...........................................................................256

9.1.3. Concepto de segundo mensajero .............................................................................258

9.1.3.1 Concepto de activacin en cascada ..................................................................260

9.2. Regulacin de la glucgeno fosforilasa .............................................................................2619.2.1. Reaccin catalizada y formas moleculares de la glucgeno fosforilasa .......................261

9.2.2. Cascada de activacin en la glucgeno fosforilasa ....................................................263

9.2.3. Mecanismos moleculares en el sistema de la glucgeno fosforilasa ...........................267

9.2.3.1. Glucgeno fosforilasa .....................................................................................267

9.2.3.2. Fosforilasa kinasa ............................................................................................272

9.2.3.3. Protein kinasa A .............................................................................................273

9.2.3.4. Adenilato ciclasa .............................................................................................275

9.2.3.5. Protenas G ....................................................................................................276


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10.1.2.1. Aumentos de la concentracin enzimtica ....................................................305

10.1.2.2. Disminuciones en la actividad enzimtica .....................................................306

10.1.3. Estudio de las principales enzimas con inters diagnstico.....................................307

10.1.3.1. Aminotransferasas ........................................................................................307

10.1.3.2. Creatinkinasa ...............................................................................................309

10.1.3.3. Fosfatasa alcalina ..........................................................................................310

10.1.3.4. -Glutamil transferasa ..................................................................................311

10.1.3.5. -Amilasa.....................................................................................................311

10.1.3.6. Fosfatasa cida ..............................................................................................312

10.1.3.7. Lactato deshidrogenasa .................................................................................312

10.2. Enzimas en eraputica..................................................................................................31310.2.1. eraputicas sustitutivas ........................................................................................314

10.2.2. Enzimas en Ciruga ...............................................................................................316

10.2.3. rastornos de la circulacin ...................................................................................316

10.2.4. rastornos de la coagulacin sangunea..................................................................316

10.2.5. Enzimas en teraputica antineoplsica ...................................................................317

10.2.6. Otros usos teraputicos de enzimas .......................................................................317


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COMPENDIO DE ENZIMOLOGA Enrique Battaner Arias

17


INRODUCCIN A LA ENZIMOLOGA

Si algo distingue realmente a la Bioqumica del resto de las disciplinas qumicas,es el papel central que en los seres vivos desempean las enzimas. Y si algn elementodistintivo hay en la Bioqumica frente a las ciencias biolgicas es que las enzimas nosbrindan un modelo interpretativo de uso general para todas ellas sin excepcin en trmi-nos de la teora atmico-molecular. El estudio de las biomolculas no es en s mismo msque una serie de captulos de la Qumica Orgnica, por ms que se utilicen tcnicas pococonvencionales desde el punto de vista de esta ciencia. Lo realmente nico en la qumicabiolgica es esa impresionante cantidad de catalizadores especficos encargados cada unode un determinado proceso dentro de los muchos miles de reacciones qumicas posiblesen lo organismos. Cmo son las enzimas? Cmo funcionan? Cmo se forman? Larespuesta a estas preguntas, entendidas en su ms amplio significado, nos brindara laexplicacin a todos los fenmenos que asociamos a la vida: la posibilidad de un metabo-lismo; de su regulacin, y por tanto de su integracin a un nivel fisiolgico; igualmente,de su biosntesis y todos los fenmenos genticos a ella asociados; y por ltimo, de lascomplicadas pautas evolutivas y adaptativas de los organismos vivientes.

No es de extraar, por tanto, que los espectaculares avances de la Bioqumica habi-dos en los ltimos treinta aos hayan tenido lugar normalmente en torno a sistemas ex-perimentales nacidos del estudio convencional de las enzimas. Los mtodos y tcnicasde purificacin y aislamiento de enzimas han marcado las pautas de toda la Bioqumicapreparativa o extractiva; los mtodos que la Enzimologa emplea en la cuantificacinde enzimas forman la base de la Bioqumica Analtica, habiendo transcendido su uso alAnlisis Qumico General; el estudio qumico de los inhibidores ha creado los protoco-los que hoy se siguen en el desarrollo sistemtico de nuevos frmacos.

Y ya en la esfera puramente terica, el estudio de las reacciones enzimticas nos hasuministrado un modelo de aplicacin general a todas las interacciones biolgicas; el deun ligando unindose a un receptor de naturaleza proteica, y desencadenando en l uncambio que es el ltimo responsable molecular del efecto fisiolgico investigado. Por otraparte, el estudio cintico de cadenas de reacciones enzimticas nos va dando una idea,hoy todava aproximada, de las complejidades dinmicas que pueden surgir en el servivo por la accin de las enzimas, y que en un terreno puramente especulativo podemos

relacionar sin demasiada dificultad con cuestiones tan abstractas como el origen objetivo


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del tiempo biolgico o las asimetras (y simetras) espaciales que surgen en la ontogeniade los seres vivos.

En el momento actual quiz es posible que el trmino Enzimologa pueda sonarun tanto pasado de moda, sobre todo en comparacin con otros como Biotecnologao Ingeniera Gentica, y que nos recuerde los viejos laboratorios donde se haca Bio-qumica clsica all por los aos 50 y 60. Por ello trato de reivindicar la importancia dela misma. Si la Biotecnologa no es otra cosa que introducir en gran escala a las enzimasen el proceso productivo y econmico, la Ingeniera Gentica actual no es concebiblesin la ayuda de una serie muy concreta de enzimas; y adems, sus ltimas aspiracionesson enteramente enzimticas: la introduccin de nuevos procesos metablicos all don-

de normalmente no los hay. La Gentica Molecular se ocupa de los planos del edificioviviente; la Enzimologa, del estudio del propio edificio funcionando.

El propsito del autor de este libro es presentar una visin actualizada de las en-zimas, pero a un nivel de estudiante de Grado, y especficamente, en el rea de Cienciasde la Salud. Para el especialista hay numerosas y magnficas monografas, aparte de seriesperidicas e innumerables artculos de investigacin y de divulgacin que tratan conenzimas directa o indirectamente. A tal fin se da una cierta extensin a captulos comola cintica enzimtica, que en los textos consagrados de Bioqumica ocupan un espacio

a nuestro juicio harto reducido, pero sin llegar por ello a extremos monogrficos o espe-cializados. El autor pretende demostrar que la metodologa del estudio de las enzimas,tanto en lo puramente tcnico como en lo ms conceptual y abstracto, es la indicada parael abordaje de la gran mayora de los problemas, puros o aplicados, que nos plantea elestudio de los seres vivientes.

NOTASHISTRICAS

I. Los orgenes

El pensamientoyatroqumicoque floreci a partir de Paracelso, en el s. , es elms remoto antecedente histrico de la Bioqumica y de la Enzimologa. Precisamenteel representante ms genuino de este pensamiento, Van Helmont, a principios del s. sugiri que la digestin de los alimentos implicaba su transformacin a partir defermentos, tomando este trmino de la tecnologa del vino, y en la idea de que ambosprocesos tenan mucho en comn. Este pensamiento discrepaba radicalmente de la tra-

dicin galnica, que vea en la digestin una serie de cocciones. anto en un caso como


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en otro imperaba el razonamiento de analoga, pero hemos de reconocer que van Hel-mont estaba mucho ms cerca de la realidad. Y adems, desde entonces se estableci unafructfera relacin entre los estudios que hoy llamaramos bioqumicos con los procesos

de digestin y de fermentacin, pues ambos fenmenos fueron desde entonces el objetoprincipal de los estudios que han desembocado en la moderna Enzimologa.

Rn de Raumur(1683-1757) emprendi hacia el final de su vida (1752) unaserie de estudios sobre la digestin que representaron un importante avance metodol-gico. Alimentando a aves con tubos metlicos rellenos de distintas materias alimenticias,estudi las transformaciones de estas a lo largo del tubo digestivo y pudo comprobar queexista realmente una transformacin qumica de los alimentos durante la digestin. La-

zzaro Spallanzani(1729-1799) ampli estos estudios dejando fuera de duda el hecho dela transformacin qumica de los alimentos durante el proceso digestivo. Si consideramosque por aquel entonces su contemporneoAntoine de Lavoisier(1743-1794) reduca atrminos qumicos el proceso respiratorio, que Karl Wilhelm Scheele(1742-1786) co-menzaba el estudio de los productos naturales y que unos pocos aos ms tarde (1804)

John Dalton(1766-1844) resucitaba en trminos cientficos el primitivo atomismo deDemcrito, bien podemos sugerir que estaba teniendo lugar una verdadera revolucinqumica al mismo tiempo que la Revolucin Francesa. En cuanto al proceso digestivo, en1836, Schwanny Eberledescribieron un principio en el jugo gstrico capaz de degradar

protenas, al que denominaron pepsina.

Otro campo, el de las reacciones qumicas, se desarrollaba ampliamente por aquelentonces. En lo que a nuestra discusin se refiere, es importante sealar que en 1812Kirchoffdemostr la produccin de azcar a partir de almidn por accin de cidossin que estos quedaran modificados; y en 1814 comprob que el mismo proceso podatener lugar en presencia de un extracto de trigo en lugar de cidos. Unos aos ms tarde(1817-1822), e independientemente, Davy, Dbereimer, Mitscherlichy Tnarddes-cubrieron que la descomposicin del perxido de hidrgeno era acelerada por metales,sin cambios apreciables en estos; Tnard, por su parte, observ el mismo fenmeno enpresencia de fibrina sangunea. En 1833 Payeny Persozobtuvieron a partir de malta unprincipio similar al antes mencionado de Kirchoff, al que dieron el nombre de diastasa;por su parte, Robiqueten 1830 descubri en las almendras amargas un principio albu-minoide que era capaz de descomponer la amigdalina en glucosa, benzaldehdo y CNH(y bautizado posteriormente por LiebigyWhlercomo emulsina). Con todos estosdatos y algunos ms,Jns Jacob Berzelius(1779-1848) elabor su teora de la catlisis,central en toda esta discusin. Por ello le citamos literalmente:


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...Tenemos amplias razones para suponer que en las plantas y en los animales vi-vientes tienen lugar miles de procesos catalticos entre los tejidos y los fluidos, y que deellos resulta la formacin de gran nmero de distintos compuestos, para cuyo origen

a partir de la sangre o de los jugos vegetales no podemos asignar hoy da una causaconocida (1836).

Y aqu entra en escena otro gran protagonista de la historia de la Enzimologa: elestudio de la fermentacin alcohlica.

II. La fermentacin alcohlica

Conocido desde tiempo inmemorial, este proceso empez a recibir atencin cien-tfica a finales del siglo . En 1779 la Academia de Ciencias de Francia estableciun premio consistente en una libra de oro para el trabajo que arrojara luz sobre el hastaentonces misterioso proceso qumico. Aunque este premio fue retirado en 1793, no hayduda que contribuy decisivamente a nuestro actual conocimiento no solo de las fer-mentaciones, sino de la Enzimologa en general.

J. L. Gay-Lussac (1778-1850) reconoci como productos el etanol y el CO2,

aunque sus datos no establecieron la estequiometra del proceso. C. Cagniard-Latour(1777-1859) sugiri la naturaleza celular de la levadura, estimando su dimetro en 6-7m y observando el proceso de gemacin. Igualmente demostr las diferencias entre lalevadura de cerveza y la del vino; desde el punto de vista qumico, comprob el requeri-miento de compuestos nitrogenados en el proceso. Observaciones similares fueron lleva-das a cabo por F. . Ktzing(1807-1893) y por . Schwann(1810-1882).

Justus von Liebig(1803-1873), junto con F. Whler(el autor de la sntesis deurea) consideraban la levadura como una sustancia qumica inestable que al comunicarsu inestabilidad al azcar lo degradaba a alcohol. Esto entraba en contradiccin con elpunto de vista sostenido por Schwann, Ktzing y Cagniard-Latour, es decir, la natura-leza celular de la levadura. Por tanto se plante la cuestin de si las fermentaciones de-pendan de la propia calidad viviente de la clula o bien se trataba de un componenteinanimado de la misma. Liebig defenda esta ltima postura, mientras que Schwannsostena la primera.


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Los experimentos de Louis Pasteur(1822-1895) parecieron dar la razn entera-mente a Schwann. En 1860 escriba lo siguiente:

...El acto qumico de la fermentacin es esencialmente un fenmeno correlativo a unacto vital, que comienza y termina con este. Creo que la fermentacin alcohlica no

puede tener lugar si no viene acompaada de la organizacin, desarrollo y multipli-cacin de las clulas, o bien de la vida continua de las clulas ya formadas.

A consecuencia de este punto de vista, se estableci la distincin entre fermentosorganizados (o formes), de los que la levadura era el ejemplo, y fermentos no orga-nizados (o informes) como la diastasa, pepsina, emulsina, invertasa, etc. (cuya lista ibacreciendo), que podan ser extrados de las clulas. Precisamente para evitar esta com-plicada nomenclatura, Khneintrodujo en 1878 el trmino enzima (literalmente, enla levadura) para denominar los hasta entonces conocidos como fermentos no orga-nizados, indicando as que estaban dentro de la clula, pero que no eran la clula. Elpunto de vista de Pasteur prevaleci momentneamente, a pesar de que algunas voces sealzaron en contra (en particular las de Claude Bernard, Bertheloty raube; citamos aeste ltimo (1878):

...Los fermentos no son, como crea Liebig, sustancias inestables que transmiten amateriales normalmente no reactivos su vibracin qumica, sino que son sustanciasqumicas, relacionadas con las protenas y que como todas las dems sustancias poseenuna estructura qumica definida... La hiptesis propuesta por Schwann y Pasteur deque la fermentacin ha de ser considerada como expresin de la actividad vital de losorganismos inferiores no es satisfactoria... Los fermentos son la causa de los procesosqumicos vitales no solo en los organismos inferiores, sino tambin en los superiores.

En 1897 E. Bchner(1860-1917) dio con la clave final al preparar un extractoacelular de levadura capaz de fermentar azcar, lo que ech por tierra la teora celular dela fermentacin (y todo el vitalismo que implicaba); la totalidad del proceso fermenta-

tivo poda ser llevada a cabo por enzimas individuales en el sentido de los definidos porKhne (es decir, los no organizados).


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Y por fin, Arthur Harden(1865-1940) utiliz el sistema de Bchner medianteuna metodologa que pas a ser clsica en todos los estudios metablicos: calentamiento,dilisis, inhibidores, etc. de forma que unos aos ms tarde Meyerhofpudo enumerar

una a una todas las enzimas y reacciones de la fermentacin alcohlica.

A partir de entonces, el desarrollo histrico de la Enzimologa se confunde consus captulos concretos, y a ellos nos remitimos. Igualmente, el origen de la Bioqumicamoderna podemos cifrarlo en el momento en que qued resuelta la polmica sobre lasfermentaciones; la aparicin de las enzimas en la escena cientfica fue lo suficientementeimportante como para discernir esta ciencia de sus diversas predecesoras, como la Fisio-loga, la Farmacia, la Qumica y la Agronoma. Adems, los estudios de Harden y Young

dotaron a la nueva ciencia de su arma principal: el sistema acelular.

ELESTUDIODELAENZIMOLOGA

A lo largo de esta obra, trataremos de presentar la Enzimologa de acuerdo con lasiguiente sistemtica:

- En primer lugar, se repasan algunas nociones de quimicofsica que son necesarias para

la comprensin, siquiera superficial, de las reacciones qumicas. Los conceptos im-portantes que se abordan son: la energa libre, la velocidad y el orden cintico de lasreacciones y el fenmeno de catlisis tratado de una manera general.

- Pasamos a continuacin a una visin introductoria de la catlisis enzimtica. Paraello definimos los principales trminos propios de la Enzimologa, para seguir conlas principales propiedades de las enzimas: su naturaleza qumica, su especificidad ysu eficiencia cataltica. Se discuten por ltimo las principales teoras sobre la accin

enzimtica.

- En el captulo 3 se describen las reacciones enzimticas, con las normas vigentes declasificacin y nomenclatura. El captulo 4 presenta el estudio de las coenzimas, losreactivos especficos de la qumica biolgica.

- Los dos captulos siguientes se refieren a la cintica de las reacciones enzimticas y asus inhibidores, respectivamente (captulos 5 y 6). Veremos cmo el estudio cintico

nos ayuda a comprender los mecanismos bsicos de reaccin y nos permite en mu-


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chas circunstancias un estudio de los pasos individuales. La inhibicin, que se estudiainicialmente bajo un punto de vista cintico, se termina discutiendo en trminos msestructurales, indicando su importancia prctica, y muy particularmente como para-

digma de la teraputica farmacolgica.

- El siguiente captulo (7) trata de la estructura molecular de las enzimas. Se contempladicho estudio sobre todo en torno al centro activo enzimtico, presentndose los di-versos mtodos de su estudio. Por otra parte, las estructuras primarias de las molculasde enzima nos introducen a la evolucin filogentica y el origen de los enzimas.

- La regulacin de la actividad enzimtica, que se presenta en el siguiente captulo (8),

tiene la enorme importancia de ser el nexo de unin entre el nivel metablico celulary la fisiologa del organismo. Se presentan el fenmeno del alosterismo, otros modelosregulatorios, la regulacin covalente de los enzimas y las cascadas de actividades enzi-mticas (estos dos ltimos aspectos en el captulo 9).

- Se estudian a continuacin (captulo 10) algunos aspectos de la Enzimologa aplicadaa la Medicina, muy especialmente en el diagnstico y en la teraputica.

BIBLIOGRAFAGENERAL

Mencionamos a continuacin algunas referencias bibliogrficas y de Internet quepueden ser de utilidad en el estudio de la Enzimologa.


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Pginas web

http://www.expasy.ch/enzyme/

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/

http://en.wikipedia.org/wiki/Enzymes

http://en.wikipedia.org/wiki/Coenzyme

http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_kinetics

http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme_inhibitor


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CAPULO 1

LAS REACCIONES QUMICAS: CRIERIOS DEESPONANEIDAD Y CINICA


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Los organismos vivientes mantienen de forma constante y simultnea varios milesde reacciones qumicas, cuyo conjunto llamamos metabolismo. Este conjunto de reac-ciones es tan caracterstico de los mismos que, de hecho, un punto de vista perfectamen-

te vlido para la definicin de vida es la capacidad de mantenimiento de un metabolis-mo. Por el momento, no sabemos de ningn proceso nuclear que tenga lugar en los seresvivos, y de ah que la metodologa ms adecuada para el estudio de los seres vivos sea lapropia de la Qumica. En qumica estudiamos las reacciones desde el punto de vista desu velocidad y de su mecanismo. Ambos tipos de estudio son asimismo cruciales, comoveremos, en el particular terreno de la Bioqumica. Pero en este ltimo se da un hecho deimportancia transcendental: la prctica totalidad de las reacciones qumicas que se danen un ser vivo estn catalizadas, es decir, en ellas interviene un agente que no aparece enla estequiometra global de la reaccin, pero que acelera la consecucin del equilibrio. Se

conocen, como es lgico, muchas otras reacciones catalizadas fuera del mundo viviente,pero a lo largo de este y los prximos captulos trataremos de ver por qu la catlisis bio-lgica es tan importante en el contexto de un curso de Bioqumica. Antes de entrar enesta materia especfica, es preciso que consideremos brevemente algunas generalidadessobre las reacciones qumicas, particularmente su posibilidad y su velocidad.

1.1. ENQUCIRCUNSTANCIASTIENELUGARESPONTNEAMENTEUNAREACCIN?

La funcin bsica de toda ciencia natural es la prediccin de fenmenos, y los fe-nmenos qumicos forman parte de nuestra experiencia cotidiana. Por ejemplo, tenemostodos una idea bastante aproximada de qu sustancias pueden entrar en combustin alacercar una llama; sabemos que es mucho ms fcil disolver sal que sacarla de la solucin;y que una vez cuajada la clara de un huevo no podemos restituir esta a su estado original.Es decir, en muchos casos tenemos una concepcin emprica del sentido espontneo enque cursan las reacciones, y evidentemente puede ser de gran utilidad un conjunto dereglas cientficas que nos permitan discernir clara y cuantitativamente la posibilidad o node reacciones qumicas. La respuesta a este problema nos la da la ermodinmica clsica,de forma que hoy da podemos predecir con toda exactitud la posibilidad de cualquierreaccin qumica real o imaginable. Veamos a continuacin dichos criterios.

1.1.1. El calor absorbido o desprendido en reacciones qumicas

Somos conscientes de que en muchas reacciones qumicas hay intercambio decalor. Cuando un sistema se transforma a presin y temperatura constantes, el calor

desprendido o absorbido en el proceso recibe el nombre de entalpa(y se representa por


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H). Como los procesos biolgicos tienen lugar por lo general en estas condiciones, enlo sucesivo utilizaremos calor y entalpa prcticamente como sinnimos. Asimismo, he-mos de sealar una importante convencin respecto a las variaciones de entalpa en una

transformacin: el incremento en entalpa se considera positivo cuando el sistema absor-be calor a partir del entorno; en caso contrario, el incremento se considera negativo. Porejemplo, si se nos dice que una reaccin cursa con un incremento de entalpa de -100 kJ(kilojoules), ello significa que la transformacin desprende esa energa en forma de calordesde el sistema al entorno. El caso contrario (absorcin de calor por el sistema desde elentorno) se representa como variacin positiva de entalpa.

Pues bien: una primera aproximacin emprica a la definicin de un criterio de

espontaneidad en las reacciones qumicas nos dira que en nuestra experiencia son msusuales aquellas reacciones en las que se desprende calor. As, definiramos como es-pontneas las reacciones exotrmicas(reacciones que desprenden calor, con incrementonegativo de entalpa) y como no espontneas las reacciones endotrmicas (esto es, queabsorben calor, con incremento positivo de entalpa).

Es fcil refutar esta hiptesis, pues bastan unas pocas observaciones para compro-bar que existen procesos endotrmicos y que son sin embargo espontneos. Por ejemplo,la entrada en solucin de sales como el cloruro amnico es un proceso perfectamente

espontneo, y sin embargo cursa con absorcin de calor, como podemos comprobar altacto por el enfriamiento del recipiente que contiene la solucin. Por tanto, no es facti-ble un criterio sobre espontaneidad de las reacciones qumicas basado nicamente en laentalpa.

1.1.2. Orden o desorden introducido en un sistema: la entropa

Fijmonos en el ejemplo que refutaba la hiptesis anterior. La disolucin de unasal amnica en agua es un proceso endotrmico y sin embargo, espontneo. El fenme-no de disolucin de la sal implica el paso de un sistema altamente ordenado, cual es elcaso de un slido cristalino, al desorden propio de una solucin, similar al que existe enel estado gaseoso. oda vez que el desorden de un sistema es medido por una magnitudtermodinmica de estado, la entropa, que se representa con el smbolo S, y que el Se-gundo Principio establece el aumento global de la entropaen cualquier transformacinque sufra un sistema aislado, podramos pensar que un criterio vlido para dictaminar laespontaneidad de las reacciones sera el siguiente: son espontneas las transformaciones

de un sistema que cursen con un incremento de entropa (y que por tanto van a favor de
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laflecha del tiempo). Debemos hacer notar que en este caso definimos como positivas lasvariaciones en las que aumenta la entropa del sistema.

ampoco es vlido este segundo criterio. Por ejemplo, la congelacin del agua a0 C y presin atmosfrica es un fenmeno totalmente espontneo y cursa con una im-portante disminucin entrpica, la propia de pasar del relativamente desordenado estadolquido al orden propio de los slidos cristalinos. Igualmente, la desnaturalizacin de unaprotena cursa con un fuerte incremento de entropa en el sistema, ya que la estructuranativa de aquella representa un sistema muy ordenado y, sin embargo, las protenas no sedesnaturalizan espontneamente.

1.1.3. Trabajo til potencial en una transformacin: la Energa Libre

A pesar de las consideraciones anteriores, las transformaciones espontneas cursanpor lo general o con desprendimiento de calor o con incremento de entropa. Existe unatercera magnitud termodinmica de estado, la energa libre de Gibbs, que se representacomo G y que se define por la siguiente ecuacin en procesos isotrmicos a presinconstante:

[1]G = H - S

en la que vemos que entran como variables la entalpa H, la entropa S y latemperatura absoluta . La energa libre de Gibbs representa la cantidad mxima detrabajo til que puede obtenerse en una transformacin a presin constante, y constitu-ye un criterio vlido para predecir la espontaneidad de las reacciones qumicas. As, unincremento negativo en energa libre (es decir, cuando el sistema desprende energa libre

hacia el entorno) significa que la transformacin puede tener lugar espontneamente.Una variacin positiva tiene lugar cuando el sistema absorbe energa, y tales transforma-ciones no pueden tener lugar espontneamente. La magnitud G tiene una gran impor-tancia en todo tipo de clculos qumicos, y por tanto en los biolgicos.

1.1.3.1.Normalmente se dispone de tablas en las que se especifican lasenergas libresstandard de formacinde compuestos. Esta magnitud es el incremento en energa libreque tiene lugar en la reaccin de formacin del compuesto a partir de sus elementos

en estado standard (se toma como cero la energa libre de formacin standard de un
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elemento en su estado ms estable). Estas energas libres de formacin se refieren a esta-dos standard, es decir, concentracin unidad, 298 K (25 C), 1 atm de presin, etc. Apartir de las energas de formacin de los reactivos y productos podemos calcular muy

fcilmente la energa libre standard de una reaccin dada. Esta energa libre standard serepresenta por el smbolo G0.

Ejemplo: Calclese la energa libre standard de la descomposicin del perxido dehidrgeno: 2H

2O

22H

2O + O

2. Esta es una interesante reaccin en el metabolismo

celular, catalizada por enzimas llamados peroxidasas, de las cuales el ejemplo ms repre-sentativo es la catalasa, que cataliza esta misma reaccin. Sabemos que las energas libresde formacin son:

H2O2G0= -103.04 kJ/mol

H2O G0= -227.65 kJ/mol

O2(oxgeno molecular) G0= 0 kJ/mol

Solucin: Al ser la energa libre una funcin termodinmica de estado, su varia-cin depende nicamente de los estados inicial y final de la reaccin, sin importar elcamino seguido. Por tanto, las energas libres se suman o restan de la misma forma queen ecuaciones termoqumicas. A partir de la relacin

G0= G0(productos) - G0(reactivos)

endremos para la ecuacin propuesta:

G0= -227.65 -(-103.04 + 0) = -124.61 kJ/mol

Lo cual nos indica que en condiciones standard, la reaccin cursar espontnea-mente de izquierda a derecha, tal como ha sido enunciada.

En aquellas reacciones en que intervienen cidos, el protn H+ suele ser un

reactivo o un producto; a concentracin unidad, por tanto, las energas libres standard


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de las reacciones en que intervienen cidos disociados total o parcialmente, se refieren apH = 0 (es decir, el pH para el cual [H+] = 1 M. En el medio biolgico el pH siempre escercano a 7 (la neutralidad cido base) y se prefiere, por esa razn, calcular las energas

libres standard de las reacciones a pH 7, es decir, a una concentracin de protones iguala 10-7 M. Las energas libres as calculadas se representan por el smbolo G0'.

1.1.3.2Para unas condiciones dadas, diferentes de las standard, podemos calcular el in-cremento en energa libre de una reaccin concreta AB mediante la relacin

[2]

En la que R es la constante de los gases, la temperatura absoluta, y [A] y [B] lasconcentraciones de reactivo y producto, respectivamente.

1.1.3.3De la relacin anterior podemos obtener otra muy interesante, mediante la cualse calcula la constante de equilibrio de una reaccin a partir de la energa libre standard,

o viceversa. En el equilibrio, G = 0, y por tanto,

[3]G

0= -RT ln(K

eq)

En la que Keq

es la constante de equilibrio de la reaccin, y R y tienen el mismosignificado que en [2]. Esta relacin nos indica que (a) son espontneas aquellas reac-ciones para las que G

0 es negativa, o lo que es lo mismo, tienen una K

eqmayor que la

unidad; y a la inversa, (b) no pueden producirse espontneamente reacciones para lasque G

0 es positiva, o bien, cuya constante de equilibrio es menor que la unidad.

1.1.3.4 Por til que sea la magnitud energa libre standard, debemos tener muy encuenta que una cosa son las condiciones standard de una reaccin y otra muy distinta lascondiciones actuales en que se desarrolla la reaccin que nos interesa. As, por ejemplo,podemos ver que una reaccin metablica cuyo clculo de energa libre standard nosindica que tiene lugar espontneamente en un sentido, puede estar funcionando en el

metabolismo en sentido inverso porque las condiciones en el interior de la clula sonevidentemente distintas, y en particular las concentraciones de reactivos y productos.


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1.1.3.5Por ltimo, veamos la reaccin de combustin aerbica de la glucosa:

[4]C6H12O6+ 6O26CO2+ 6H2O G0 = -2858 kJ/mol

Segn las consideraciones anteriores, esta reaccin cursar espontneamente,puesto que transcurre con un fuerte incremento negativo en energa libre. Sin embargo,todos somos conscientes de que la glucosa en presencia de oxgeno (por ejemplo, dentrode un frasco) es perfectamente estable y no arde espontneamente. Esto no est encontradiccin con todo lo que acabamos de exponer, ya que la energa libre standard nosinforma acerca de la posibilidad de una reaccin, pero no nos da ninguna informacin

acerca de la dimensin tiempo de los fenmenos. Para tener una idea de la velocidad conque transcurre una reaccin, no nos queda hoy por hoy ms remedio que ir al laboratorioy estudiarla experimentalmente. Quiz los progresos en qumica cuntica y las actualesfacilidades de clculo nos permitan algn da hacer predicciones tericas de la velocidad;entre tanto, solo las determinaciones empricas nos valen para algo, como veremos acontinuacin.

1.2. LAVELOCIDADDELASREACCIONESQUMICAS

La velocidad en sentido qumico es la variacin de concentracin por unidad detiempo, o ms propiamente, la variacin instantnea en concentracin. Para una reac-cin cualquiera AB, podemos medir su velocidad bien como (a) velocidad de desapa-ricin del reactivo A, es decir, -d[A]/dt, o bien (b) velocidad de aparicin del productoB, es decir, d[B]/dt.

La velocidad de una reaccin qumica depende de varios factores cuyo efecto po-

demos medir experimentalmente en el laboratorio. De estos factores tienen especial sig-nificacin para nosotros la concentracin de reactivos, la temperatura y la presencia oausencia de catalizadores.

1.2.1. Velocidad y concentracin: orden de reaccin y molecularidad

Hacia 1850Wilhemyestudi la reaccin de inversin de la sacarosa:


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[5]C12H22O11(sacarosa) + H2OC6H12O6(glucosa) + C6H12O6(fructosa)

Olvidndonos por el momento de que el agua es un reactivo en esta reaccin, losresultados que obtuvo eran compatibles con la siguiente ley: La velocidad de la reaccin esdirectamente proporcional a la concentracin de sacarosa. Es decir,

[6]-d[A]/dt = d[B]/dt = d[C]/dt = k[A]

Donde representamos comoAla sacarosa, Bla glucosa y Cla fructosa; krepre-senta la constante de proporcionalidad entre la velocidad y la concentracin. En general,para una reaccin irreversible

[7]aA + bBcC + dD

En dondeAy Bson los reactivos, Cy Dlos productos, y a, b, cy dlos respectivos

coeficientes estequiomtricos, la velocidad v (en ausencia de productos, es decir, en elmomento t = 0de la reaccin) puede en general expresarse como

[8]v = -d[A]/dt = -d[B]/dt = d[C]/dt = d[D]/dt = k[A]x[B]y

es decir, como el producto de las concentraciones de los reactivos elevadas a losexponentes xey(que no son necesariamente iguales a los coeficientes estequiomtricos

ay b).

1.2.1.1.Llamamos orden de reaccin a la suma de los exponentes que aparecen en laecuacin de velocidad. En el caso de la inversin de la sacarosa, el orden es de uno, oreaccin de primer orden; en el caso de la reaccin [7], el orden es de (x+y). En este l-timo caso podemos tambin decir que la reaccin es de orden x respecto a A, de ordenyrespecto a By de orden global (x+y).

Es importante sealar que el orden de reaccin es una magnitud experimental, esdecir, que la obtenemos a partir de mediciones en el laboratorio. En este sentido, debe-


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mos tener presente que son posibles rdenes de reaccin no enteros; por ejemplo, en lareaccin de descomposicin del acetaldehdo

[9]CH3-CHOCH4+ CO

la experimentacin nos dice que tiene un orden de 3/2 con respecto al acetaldeh-do, a pesar de que la observacin de la ecuacin estequiomtrica nos hara pensar en unprimer orden para esta reaccin.

De la misma manera, son posibles rdenes cerode reaccin. Ms adelante tendre-mos ocasin de ver que en las reacciones catalizadas por enzimas, a altas concentracionesde substrato, el orden es prcticamente de cero, es decir, la velocidad es independientede la concentracin del reactivo.

Volvamos a la ecuacin [7]. En ella se deca que la velocidad puede ser igual ak[A]x[B]y, y por tanto el orden de reaccin global igual a (x+y). Es importante insistir enel hecho de que el orden de reaccin no es necesariamente igual a la suma de los coefi-cientes estequiomtricos, ya que el orden de reaccin depende del mecanismo de la mis-

ma, y no de su estequiometra global. Supongamos una reaccin en la que dos molculasde A reaccionen con una de B para dar el producto C:

[10]2A + BC

Para esta reaccin son posibles varios mecanismos. Por ejemplo: en un caso pode-mos suponer que las tres molculas colisionan simultneamente para producir C. En esecaso la reaccin sera de orden 3. Ahora bien, si la reaccin transcurre de manera que enprimer lugar reacciona una molcula de A con una de B para dar un intermediario X yeste posteriormente reacciona con una nueva molcula de A para dar el producto C, elorden ya no sera de 3, sino que estara comprendido entre 2 y 3. Y de esta misma manerapodemos pensar en muchos otros mecanismos para esta reaccin, cada uno de los cualesnos dara un orden distinto. De hecho, rdenes de reaccin de 3 son muy raros en laprctica; y superiores a 3 son realmente excepcionales.

1.2.1.2Por las consideraciones anteriores debemos definir un nuevo concepto en la ci-ntica de reacciones qumicas, la molecularidad. La molecularidad de una reaccin es el


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nmero de molculas que participan en la configuracin del complejo activo (vase msadelante), y por tanto, es un nmero que necesariamente ha de ser entero, a diferenciadel orden de reaccin. Y as como este es una magnitud experimental, la molecularidad

lo es terica, ya que se debe definir para los pasos elementales del mecanismo. En elejemplo [10] vimos que podamos postular varios mecanismos. De los propuestos, en elprimero de ellos habra una sola reaccin de molecularidad 3; en el segundo, haba dosreacciones sucesivas de molecularidad 2 cada una.

1.2.1.3Particularmente importantes en el mundo biolgico son losprocesos de primerorden. Definamos estos procesos como los que obedecen a la relacin

[11]-d[A]/dt = k[A]

esta relacin puede integrarse directamente y conduce a la expresin

[12]At= A0exp(-kt)

en la que Ates la cantidad de A que queda a tiempo t; A

0es la cantidad inicial de

A; k la constante de primer orden, y t el tiempo. Si tomamos logaritmos naturales de estaexpresin llegamos a

[13]ln At= ln A0- kt

lo cual indica que si representamos el logaritmo de A en funcin del tiempo, ob-tendremos una lnea recta de pendiente -k y cuyo corte en ordenadas ser igual al logarit-mo de A

0. Por otra parte, se define en estos procesos otra importante magnitud derivada:

el semiperodoo tiempo en que A queda reducido a A/2. No es difcil deducir de [13] queel semiperodo t

1/2es igual a

[14]t1/2= ln2/k


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Ejemplos:

(a) La desintegracin de un elemento radioactivo es un proceso de primer orden.Por tanto, si conocemos la constante k(que en este caso se llama constante de desinte-gracin) y la actividad total A, podremos conocer la actividad Aten cualquier tiempotpasado o futuro. En este principio se basan los mtodos de datacin radioqumica demuestras biolgicas, midiendo la cantidad de 14C que permanece en una muestra y cal-culando el perodo de tiempo que ha tenido que transcurrir a partir de una proporcinde 14C igual a la de los seres vivientes.

(b) Otro mtodo de datacin de muestras biolgicas consiste en la medicin de la

relacin D-aspartato/L-aspartato. eniendo en cuenta que en un ser viviente todo el ci-do asprtico presente lo est en forma L-, y que el D-aspartato se forma por racemizacindel ismero L- despus de la muerte, siendo este un proceso de primer orden, conocidadicha relacin en la muestra se puede calcular el perodo aproximado de muerte de lamuestra biolgica.

(c) La inactivacin de enzimas por agentes fsicos o qumicos es muy a menudoun proceso de primer orden. As, en algunos procesos patolgicos, como el infarto de

miocardio, la destruccin de las clulas hace que se vierta su contenido a la circulacinsangunea. Entre los componentes celulares vertidos a la sangre se encuentran muchasenzimas; alguna de ellas, como la creatin kinasa, nos sirven para diagnosticar la presenciade un infarto. eniendo en cuenta que a lo largo del tiempo la actividad enzimtica en lasangre va disminuyendo segn un proceso de primer orden, a partir de mediciones seria-das del enzima podemos calcular la cantidad inicial vertida a la sangre, y de esta manerapodemos tener una idea de la extensin y gravedad del infarto.

(d) La inactivacin por calor de algunas enzimas, como la fosfatasa alcalina, sigueun proceso de primer orden. Esta enzima se emplea como indicador de enfermedadesseas o del rbol biliar, entre otras; y las enzimas de distintas procedencias se puedendistinguir por su estabilidad trmica. As, el semiperodo de inactivacin de la fosfatasaalcalina de origen seo a 56 C es de dos minutos, mientras que el de la de procedenciaheptica es de 7 minutos.

(e) La desaparicin de un componente (por ejemplo, un medicamento) de cual-quiera de los compartimentos lquidos del organismo sigue muchas veces una cintica de

primer orden (y a veces tambin de rdenes superiores). eniendo presente este hecho,


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podemos hacer un diseo racional de las pautas teraputicas para que la concentracinde medicamento se mantenga en niveles ptimos.

1.2.1.4La ecuacin [5] representaba la inversin de la sacarosa. En realidad se trata deuna reaccin bimolecular, en la que una molcula de agua ataca al enlace glicosdicoconstituido entre glucosa y fructosa. Sin embargo, las mediciones experimentales nosmuestran que aparentemente es una reaccin de primer orden. Ello es debido a quesiendo uno de los reactivos el agua y teniendo lugar la reaccin en solucin acuosa, elagua aparece a una concentracin muy elevada (55.5 M) y en la prctica constante, yaque es mucho mayor que la de reactivos y productos. Este tipo de procesos (de hecho,

todas las reacciones de hidrlisis en el medio biolgico) se comportan como si fuerande primer orden a pesar de ser bimoleculares. Por ello reciben el nombre de procesos depseudo primer orden.

1.2.2. Velocidad y temperatura: concepto de energa de activacin

En 1889,Arrheniuspropuso que la dependencia de la constante de velocidad ken funcin de la temperatura viene dada por la expresin

[15]k = A exp(-Ea/R)

en la que Res la constante de los gases, la temperatura absoluta,Ael llamadofactor de frecuenciay Eala energa de activacin. omando logaritmos en la expresin [15]llegamos a

[16]ln k = -Ea/R + ln A

En la que vemos que una representacin del logaritmo de la constante de velocidaden funcin del recproco de la temperatura absoluta 1/nos da una recta cuya pendientees -Ea/Ry su corte en ordenadas ln A(figura 1.1) Por tanto, podemos calcular la energade activacin midiendo el valor de la constante de velocidad en funcin del recproco dela temperatura y representando los datos conforme a la ecuacin [16], lo que se conoce

como representacin de Arrhenius.


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Figura 1.1

Podemos dar una interpretacin de esta relacin de la siguiente forma: la tempe-ratura es una medida de la energa cintica media de las molculas de un reactivo. Para

una temperatura concreta , las energas de las molculas se distribuyen conforme auna ley de probabilidad no muy diferente de las que rigen para fenmenos aleatorios;habr un cierto nmero de molculas con energa igual a la media, otras con energassuperiores y otras con energas inferiores. El factor exp(-Ea/R)(factor de Boltzmann)es precisamente la fraccin de molculas con una energa igual o mayor a la requeridapara reaccionar. El factor de frecuencia,A, por su parte, tiene las mismas dimensionesque la constante de velocidad k, y es proporcional a la frecuencia de colisiones entre lasmolculas, de ah su nombre.

La ecuacin de Arrhenius nos indica que las molculas reactivas deben alcanzaruna energa crtica Eaantes de que puedan reaccionar. La figura 1.2, por su parte, nosmuestra grficamente el concepto de energa de activacin como la barrera que debesuperarse para alcanzar el complejo activo, de energa mxima, y a partir de l, caer dellado de los productos. Por otra parte, en esta grfica se ve que el intercambio global deenerga, E no depende del camino que siga la reaccin, sino nicamente de los estadosinicial y final.
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La ecuacin [16] nos demuestra que la constante de velocidad se hace mayor amedida que disminuye la energa de activacin. Como veremos, la accin de los cataliza-dores es precisamente esta: disminuir la energa de activacin gracias a situar los reactivos

en un entorno fsicoqumico ms favorable a su interaccin.

Figura 1.2

Las representaciones de Arrhenius no se utilizan solamente en el campo de laqumicofsica. Una descripcin rigurosa del efecto de la temperatura sobre cualquierfenmeno biolgico debe hacerse en base a este tipo de representaciones. Por ejemplo,el estudio del efecto de la temperatura sobre la funcin cardiovascular en animales poi-quilotermos, como los reptiles, se hace mediante representaciones de Arrhenius. Puedeobservarse que hay variables, como la frecuencia cardaca, que dentro de ciertos lmitessiguen una relacin similar a la ecuacin [1.16].

A veces se emplea el ndice Q10; si aes el valor de una variable a la temperatura ,y ael valor de la misma a la temperatura +10, el Q10es el cociente a/a. Un valor gran-de de este ndice denota una fuerte dependencia de la temperatura. Una regla empricaaproximada para las reacciones qumicas en general es que su Q10es aproximadamentede 2 (pero como toda regla emprica debe utilizarse con suma cautela).


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1.2.3. Catlisis

Las velocidades de reaccin se ven alteradas por la presencia de catalizadores. Eltrmino catlisis fue propuesto por Berzeliusen 1835 para describir la accin de sustan-cias que por su mera presencia inducen reacciones qumicas que no tendran normalmentelugar en su ausencia. Hay una serie de ideas centrales respecto al fenmeno de catlisis:

1.2.3.1. Los catalizadores no entran en la ecuacin estequiomtrica global

Esto quiere decir que, aun cuando participan en la reaccin, los catalizadores no

sufren cambio alguno por efecto de la misma, o si lo sufren, en el transcurso de la reac-cin vuelven a su estado original; de esta forma, en la ecuacin estequiomtrica globalapareceran iguales tanto en el trmino de la derecha como en el de la izquierda, por loque pueden ser eliminados de la misma.

Una reaccin cualquiera AB catalizada por X puede representarse como

[17]

A + X

B + X

con los pertinentes pasos intermedios, si los hubiere; por ejemplo,

[18]A + XAYBXB + X

Por esta razn, las reacciones catalizadas siempre pueden representarse como unproceso cclico (figura 1.3). Este hecho tiene particular importancia en el metabolismo,en el que las vas cclicas (como el ciclo de Krebs, por ejemplo), se comportan cataltica-mente.


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Sea la reaccin reversible

[19]

en la que kdes la constante de velocidad directa y kila inversa. En este caso, Keq =ki/kd; si Keqno se modifica por la accin del catalizador, pero aumenta kd, tiene necesa-riamente que aumentar ki.

1.2.3.3. Los catalizadores modifican la energa de activacin

Segn la teora de las colisiones, para que se produzca una reaccin entre tomoso molculas, estas deben primero colisionar entre s. De esta forma se explica que a unamayor concentracin de reactivo se acelere la reaccin. Ahora bien, no todas las colisio-nes son eficaces; para que lo sean se necesita que las molculas reaccionantes posean unacierta energa cintica y, adems, que las molculas entren en colisin con la orientacin

precisa.

Los catalizadores permiten un nivel energtico ms bajo, bien sea por introdu-cir un nuevo agente en la reaccin que posteriormente se regenera (por ejemplo, en lacatlisis especfica cido-base), o bien por permitir el encuentro de las molculas en laorientacin adecuada (caso de la catlisis heterognea). En todo caso, la accin del cata-lizador se traduce en una disminucin de la energa de activacin, haciendo ms grandeel factor de Boltzmann y, por tanto, aumentando el nmero de molculas con capacidadde reaccionar en unas condiciones dadas (figura 1.4).


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Figura 1.4

Una reaccin ampliamente estudiada y de gran importancia industrial es la sntesisde amonaco por elprocesoHaber, en el que se hace reaccionar nitrgeno e hidrgeno enfase gaseosa para producir amonaco:

[20]N2+ 3H22NH3 G0= -91.83 kJ/mol

A pesar del valor negativo de G0, que nos indica que el equilibrio favorecer la

formacin de amonaco, la reaccin es extraordinariamente lenta, y para que se lleve acabo se necesitan temperaturas de 450 C y presiones que van de 200 a 1000 atmsferas.El amonaco as obtenido se utiliza ampliamente en la fabricacin de fertilizantes, explo-sivos, fibras sintticas, etc., de tal manera que la cantidad total de amonaco producidopor la industria qumica viene a ser de unas 5107m/ao.

Los seres vivos, en concreto las llamadas bacterias fijadoras de nitrgeno, realizanun proceso que globalmente es anlogo al de Haber, fijando el nitrgeno atmosfrico

a compuestos amnicos como los aminocidos, pero en una magnitud global mucho


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Los seres vivientes se caracterizan por llevar a cabo varios miles de reacciones qu-micas diferentes, a cuyo conjunto damos el nombre de metabolismo. Estas reaccionesno tienen lugar aleatoriamente; en lneas generales, los fines que persiguen son los si-

guientes: (a) proveer a la clula de energa en una forma directamente aprovechable; (b)sintetizar los elementos plsticos necesarios en la estructura celular; (c) generar y procesarseales informativas a efectos regulatorios y adaptativos; y (d) propagar y mantener lainformacin gentica propia de la especie. La mera enumeracin de estos fines nos dauna idea de la complejidad de los sistemas bioqumicos, y de las complicadas reagrupa-ciones moleculares que tienen lugar en el metabolismo. odas las reacciones que en unmomento dado tienen lugar en la clula cursan, como es lgico, en el sentido de un in-cremento negativo en energa libre en la forma definida por la ecuacin 1.2 del captuloanterior. Ahora bien, la gran mayora de ellas seran extremadamente lentas para el ritmo

temporal propio de los seres vivientes; por eso todas ellas, o al menos la gran mayora,son reacciones catalizadas, y llamamos enzimas a estos catalizadores. Pero a diferencia deotros catalizadores que emplea la Qumica, las enzimas tienen la particularidad de serespecficas para cada reaccin. No sera rigurosamente exacto, pero tampoco muy aleja-do de la realidad, afirmar que en el metabolismo hay tantas enzimas como reacciones;en otras palabras, cada reaccin tiene su enzima especfica. Uno de los criterios exigidoscuando se propone tericamente una va metablica estriba en el hallazgo de una enzimaespecfica para cada uno de los pasos postulados.

En este captulo vamos a tratar de ofrecer una idea de las caractersticas ms rele-vantes de la catlisis enzimtica, como la naturaleza proteica de las enzimas, su especifici-dad y su eficiencia como catalizadores. Antes de entrar a estos apartados, vamos a definiralgunos trminos comnmente empleados en Enzimologa, y de los que se har ampliouso en el presente estudio.

2.1. CONCEPTOSYTRMINOS

2.1.1. Enzima

Siguiendo la definicin de DixonyWebb, llamamos enzima a una protena do-tada de actividad cataltica debida a su capacidad de activacin especfica. Son varios lospuntos que merecen comentario en esta definicin.

En primer lugar, y ya desde el principio, hacemos alusin al carcter proteico de

las enzimas. Este concepto predomin en la Bioqumica hasta que en la dcada de los 80


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Por ltimo, el adjetivo especfica se refiere a una caracterstica general y propiade todas las enzimas, consistente en su capacidad para catalizar solo una o unas pocasreacciones similares (a diferencia de los catalizadores convencionales) y que se tratar ms

adelante con mayor detenimiento. Su generalidad es motivo suficiente para que entre enla definicin de enzima.

2.1.2. Substrato

Denominamos substrato a la sustancia sobre la que acta la enzima, y a quien serefiere por otra parte la especificidad de la misma. ngase en cuenta que la gran mayorade las enzimas tienen ms de un substrato; las reacciones estrictamente monosubstrato

son la excepcin. Igualmente, el substrato entra a formar parte del complejo ES al inte-raccionar con los grupos activos de la enzima.

2.1.3. Centro activo

Es la regin de la molcula de enzima que fija el substrato y contiene los gruposqumicos que lo transforman. Ntese que el concepto de centro activo indica un ca-rcter heterogneo en la catlisis enzimtica, en el sentido de que el substrato es fijado

a la molcula de enzima en un sitio especfico. Como veremos, la razn molecular dela especificidad radica en la configuracin tridimensional, altamente precisa, del centroactivo. En lneas generales, existe un solo centro activo por molcula de enzima o pro-tmero (vase ms adelante). Conviene pensar en el centro activo como realizando dosfunciones: una, la fijacin especfica del substrato; otra, su transformacin. En muchoscasos estas funciones no son estrictamente disociables; aun as, nuestra idea de la catlisisenzimtica se ve facilitada por esta distincin.

Hoy da disponemos de las estructuras tridimensionales de muchas enzimas. Muya menudo se logra la cocristalizacin de la enzima con su substrato o un anlogo del mis-mo. En la figura 2.2se presenta la estructura de la ribonucleasa pancretica unida a unanlogo de substrato, un oligodesoxinucletido (que se fija a la enzima pero no reaccionapor no disponer de un 2-OH).


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como se dijo, a la inadecuacin de los mtodos cuantitativos para detectar cantidadesmuy pequeas de protena, junto con las impresionantes cifras de actividad molecular dealgunas enzimas. En cuanto a los grupos prostticos detectados en algunos enzimas, hoy

da sabemos que son efectivamente parte del centro activo enzimtico, pero su reactivi-dad y su funcin biolgica, en definitiva, se deben al entorno proteico de la apoenzima(cuando una enzima presenta un grupo prosttico, denominamos holoenzimaa la enzi-ma completa, y apoenzimaa la parte especficamente proteica de la misma).

Repasaremos a continuacin las principales lneas de evidencia que nos llevan aafirmar categricamente la naturaleza proteica de las enzimas.

1. Una de las primeras observaciones a este respecto fue que la actividad enzi-mtica puede ser eliminada de una preparacin mediante tratamiento de la misma conenzimas proteolticas, como pepsina, tripsina o quimotripsina.

2. Anlogamente, la actividad enzimtica desaparece de las muestras biolgicascon aquellos tratamientos capaces de desnaturalizarlas protenas: calor, interfases, sol-ventes orgnicos, reactivos de grupos -SH, urea, guanidina, extremos de pH, etc.

3. Los mismos procedimientos que se emplean en la purificacin y aislamiento deprotenas son los adecuados para la purificacin de enzimas; por ejemplo, precipitacinisoelctrica, precipitacin salina, cromatografa y electroforesis. En estadios avanzados depurificacin, por ejemplo, la electroforesis de protenas llega a presentar una nica bandaa partir de preparaciones enzimticas purificadas.

4. Elpeso molecularde las enzimas, en aquellos casos en que puede ser determina-do, es compatible con una estructura proteica.

5. Un importantsimo avance en la determinacin de la naturaleza qumica de lasenzimas fue la cristalizacin de la ureasa por Sumneren 1926. A falta de otros mtodosms avanzados para definir criterios de pureza, durante mucho tiempo se consider quela obtencin de un compuesto en estado cristalino era la mxima purificacin posible.Una enzima en estado cristalino, y dando todas las reacciones propias de una protena,constituy una importante evidencia a favor de la naturaleza proteica de las enzimas. Hoysabemos que los primeros cristales de Sumner contenan muchas impurezas. No obstante,

su trabajo fue seguido por los estudios de Northropy Kunitzsobre la cristalizacin de


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la enzima aconitasa ataca al grupo -CH2-COOH que procede de oxalacetato, mientrasque no acta sobre el grupo idntico procedente de acetato (vase figura 2.6).

Ogstonha explicado el fenmeno de proquiralidad en el sentido expresado en lafigura 2.7: cuando un carbono C est sustituido por dos grupos x, un grupoyy un grupoz(es decir, cuando su estructura puede representarse como Cx2yz), caben dos formas deinteraccin con el centro activo de la enzima en el caso en que sean necesarios tres de loscuatro grupos para la fijacin. Solo una ser la forma correcta, y de ese modo la enzimareconocer como distintos los dos grupos idnticos.

Figura 2.6


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COMPENDIO DE ENZIMOLOGA Enrique Battan

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