COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA …livros01.livrosgratis.com.br/cp084128.pdf · COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA ... Dentro das células, há estruturas intracelulares

Fernando Pereira de Almeida

COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ SOB CAMPO MAGNÉTICO APLICADO

Dissertação de Mestrado

Orientador: Drª. Carolina Neumann Keim Co-orientador: Dr. Ulysses Garcia Casado Lins

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES

RIO DE JANEIRO MARÇO DE 2009

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COMPORTAMENTO E MOTILIDADE DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ SOB CAMPO MAGNÉTICO

APLICADO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia)

Orientador: Drª. Carolina Neumann Keim Co-orientador: Dr. Ulysses Garcia Casado Lins

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES

RIO DE JANEIRO MARÇO DE 2009

Almeida, Fernando Pereira de Comportamento e motilidade da bactéria magnetotáctica ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado / Fernando Pereira de Almeida – Rio de Janeiro, 2009. v, 106p Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, 2009. Orientador: Carolina Neumann Keim Referências bibliográficas: 130 1. Mobilidade bacteriana 2. Bactérias magnetotácticas 3. ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ I. Carolina Neumann Keim. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Mestrado em Ciências Biológicas. III. Comportamento e motilidade da bactéria magnetotáctica ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ sob campo magnético aplicado.

II



APLICADO

Rio de Janeiro, 31 de Março de 2009.

(Orientadora: Carolina Neumann Keim, doutora, IMPPG). (Examinador: Henrique Gomes de Paiva Lins de Barros, doutor, IMPPG).

(Examinador: Gilberto Weissmuller, doutor, IBCCF).

(Examinador: Daniel Acosta Avalos, doutor, CBPF)

(Revisor: Nathan Bessa Viana, doutor, IF-UFRJ)

III

O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia e Ultraestrutura de Procariotos, Departamento de Microbiologia Geral, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de Ciências da Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da Profª Carolina Neumann Keim e co-orientação do Prof. Ulysses Garcia Casado Lins.

IV

V

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus e a todas as pessoas que de alguma forma

ajudaram no desenvolvimento dessa dissertação. Espero conseguir

lembrar todas elas nesse momento tão importante da minha vida.

Agradeço aos meus pais, “Seu Wilson” e “Dona Judite”, as pessoas

mais importantes na minha vida.

Às minhas tias Neuza e Nenzinha, por toda a ajuda e carinho nos

momentos difíceis pelos quais minha mãe passou nesse último ano.

Aproveito para dedicar essa dissertação aos meus tios José e Heitor, que

faleceram recentemente. É grande a saudade.

À minha orientadora, Profª Carolina Keim, por todo apoio,

incentivo e compreensão ao longo desses últimos anos.

Ao Prof. Nathan Viana, por ter sido o revisor e um co-orientador

“não-oficial” dessa dissertação. Sua ajuda foi imprescindível para a

realização desse trabalho.

Ao Prof. Ulysses Lins, por ter me recebido em seu laboratório e

pela sua colaboração ao longo da dissertação.

Ao Prof. Marcos Farina, pelas importantes contribuições ao longo

de todo o mestrado, e por todo o tempo de convivência e aprendizado

que tive em seu laboratório.

À Professora Darci Esquivel, minha primeira orientadora, e aos

professores Henrique Lins de Barros, Eliane Wajnberg e Daniel Avalos,

todos sempre dispostos a ajudar.

À Professora Thaís Souto Padrón, pela grande ajuda no processo

de aprovação da banca examinadora.

À Drª Leida Abraçado, pela ajuda com as bobinas e com a “parte

física” da dissertação.

VI

Aos meus companheiros do LABUP, Drª. Juliana Martins, Karen

Silva, Thais Silveira, Fernanda Abreu, Julia Albuquerque, Herval, Iamé,

Gisele, Bianca, Tamires, Roberta e Daniele. Obrigado pela amizade e

companheirismo. Todos vocês fazem do LABUP um lugar muito

prazeroso de se trabalhar.

Aos meus ex-colegas do Laboratório de Biomineralização, Mair

Oliveira, Leonardo Tavares, Rachel Leal e Leonardo Andrade.

Ao Sr. Carlos Van Der Ley e ao Sr. Osmani Bento da Silva pela

ajuda na confecção das bobinas.

Aos meus colegas de trabalho do CIEP-341 Anne, Patrícia, Priscila,

Graça, Lúcia, Sônia, Juraci, Lucimere, Alex, Laudicéia, Valcira, Cilas,

Paula e Carlos pelo incentivo, amizade e companheirismo. Vocês são o

maior exemplo de como a rede pública de ensino, apesar das péssimas

condições de trabalho, ainda conta com profissionais competentes e

dedicados.

Aos meus amigos Maron, Adriana, Carolina, Luiz, Amanda, e

Rodrigo pelas conversas jocosas às sextas-feiras no quiosque do china.

Aos membros da banca examinadora, por aceitar participar da

minha avaliação e pela compreensão em relação ao pouco tempo entre

a entrega da dissertação e a defesa.

À SEEDUC por pagar o meu salário.

VII



APLICADO

Orientador: Profª. Drª. Carolina Neumann Keim Co-orientador: Prof. Dr. Ulysses Garcia Casado Lins

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ é uma bactéria magnetotáctica multicelular composta por 18 ± 4 células Gram-negativas. Dentro das células, há estruturas intracelulares compostas por cristais magnéticos envoltos por membranas biológicas denominadas magnetossomos. As células são organizadas em um arranjo radial, que resulta em uma estrutura esférica onde cada célula encontra-se em íntimo contato com as células vizinhas e apresenta uma face em contato com um compartimento interno acelular e uma face em contato com o ambiente apresentando múltiplos flagelos. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ move-se como uma unidade ao longo de linhas de campo magnético. O alinhamento do organismo às linhas de campo se dá de forma passiva, devido ao torque exercido pelo campo magnético sobre os magnetossomos, enquanto a natação se deve à rotação ativa dos flagelos. Além do movimento avante, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ pode ainda realizar rápidas excursões no sentido inverso, seguido de movimento avante (escape motility). Os objetivos do presente trabalho foram (i) o desenvolvimento de uma metodologia para estudar as trajetórias helicoidais de microrganismos, (ii) a quantificação dos parâmetros que descrevem a natação em trajetórias helicoidais de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob ação de diferentes campos magnéticos aplicados e (iii) a observação do efeito de luz ultravioleta sobre a motilidade destes microrganismos. A metodologia aplicada, baseada em vídeo-microscopia e processamento de imagem, permitiu a análise de um grande número de trajetórias. As trajetórias que observamos são bastante alongadas para as bactérias na presença dos campos magnéticos aplicados neste trabalho. Estas trajetórias alongadas sugerem uma otimização do movimento avante. A comparação dos dados obtidos neste trabalho com os dados das trajetórias de outros procariotos de tamanho similar sugere que a forma das trajetórias depende do tamanho e/ou disposição dos flagelos na superfície dos microrganismos. O presente trabalho também analisou o

VIII

efeito da aplicação de pulsos de laser ultravioleta sobre ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. Indivíduos diretamente atingidos pelo pulso de laser perderam a sua integridade estrutural, passando a apresentar grupos de células destacadas do arranjo esférico. Um segundo efeito observado foi uma resposta coletiva de “escape motility” nos demais microrganismos não diretamente atingidos pelo pulso de laser. Essa resposta coletiva desapareceu após o terceiro pulso de laser indicando que houve adaptação ao estímulo, o que levou à hipótese de que essa resposta seja uma reação de fototactismo negativo. Palavras-chave: 1. Magnetotaxia 2. Bactérias magnetotácticas 3. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ 4. Vídeo-microscopia 5. Motilidade bacteriana

Rio de Janeiro Março de 2009

IX



APLICADO

Orientador: Profª. Drª. Carolina Neumann Keim Co-orientador: Prof. Dr. Ulysses Garcia Casado Lins

Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ is a multicellular magnetotactic prokaryote (MMP) composed by 18 ± 4 Gram-negative cells. In the cells, there are intracellular structures composed of magnetic crystals enveloped by biological membranes, called magnetosomes. The cells are organized in a radial arrangement that results in a spherical shape where each cell has close contact with the adjacent cells and present a face in contact with an internal non-cellular compartment and a face in contact with the environment, displaying multiple flagella. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ moves as a unit along magnetic field lines. The alignment of organism to the magnetic field lines is passive, due to the torque exerted by the magnetic field on the magnetosomes, while swimming is due to the active flagella rotation. In addition to the forward movement, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ can also perform fast excursions backwards, followed by a forward movement (escape motility). The aim of this work were (i) to develop a method to study the helical trajectories of microorganisms, (ii) to quantify the parameters that describe the helical swimming of ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ and (iii) to observe the effects of ultraviolet light on the motility of these microorganisms. The methodology applied in this work, based on video microscopy and image analyses, enabled the analyses of a large number of trajectories. The elongated trajectories suggest that the forward movement is optimized. Comparison of the data obtained in this work with data of the trajectories of other prokaryotes of similar size suggests that the shape of the trajectories depends on the size and/or distribution of flagella on the surface of the microorganisms. The present work also analyzed the effect of ultraviolet laser pulses on ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. Individuals hit directly by the laser lose their structural integrity, presenting groups of cells detached from the spherical array. A secondary effect observed was a collective response similar to the escape motility in the microorganisms not directy

X

hit by the laser. This collective response disappeared after the third pulse of laser, suggesting that there was adaptation to the stimulus, which lead to the hypothesis that this is a negative fototactism reaction. Key-words: 1. Magnetotaxis 2.Magnetotactic bacteria 3.’Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ 4.videomicroscopy 5.Bacterial motility

Rio de Janeiro March, 2009

XI

LISTA DE ABREVIATURAS ‘Ca. Magnetoglobus Multicellularis – ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ A – Raio das Trajetórias Helicoidais D – Declinação do campo geomagnético DIC – Contraste por Interferência Diferencial E. coli – Escherichia coli F – Intensidade total do campo geomagnético H - Intensidade horizontal do campo geomagnético I – Inclinação do campo geomagnético IF – Infravermelho LPS – Lipopolissacarídeo MMA – Multicellular Magnetotactic Aggregate MMO – Multicellular Magnetotactic Organism MMP – Multicellular Magnetotactic Prokaryote Nd-YAG – Laser de Neodymium-Doped Yttrium Aluminium Garnet nm – Nanômetro NS – Bactéria magnética north-seeking nT – Nanotesla PVC – Poli-cloreto de vinila SS – Bactéria magnética south-seeking t – Tempo UV – Ultravioleta V0 – Velocidade inicial Vt – Velocidade tangencial X – Componente norte da intensidade horizontal do campo geomagnético X0 – Posição inicial no eixo X Y – Componente leste da intensidade horizontal do campo geomagnético Y0 – Posição inicial no eixo Y Z – Intensidade vertical do campo geomagnético Z0 – Posição inicial no eixo Z θ- Ângulo entre a velocidade angular e a velocidade instantânea λ – Comprimento de onda / passo da hélice µm – Micrômetro ν – Velocidade de natação Τ – Período das trajetórias helicoidais υ – Velocidade Instantânea Φ – Fase arbitrária ω – Velocidade Angular

XII

XIII

1. INTRODUÇÃO.......................................................................... 1

1.1. FLAGELO BACTERIANO ........................................................................................................................ 3 1.2. QUIMIOTAXIA ....................................................................................................................................... 6 1.3. FOTOTAXIA ........................................................................................................................................... 8 1.4. BIOFÍSICA DO MOVIMENTO DE MICRORGANISMOS ........................................................................... 9 1.5. MOVIMENTO HELICOIDAL ................................................................................................................. 11 1.6. CAMPO GEOMAGNÉTICO .................................................................................................................... 12 1.7. BACTÉRIAS MAGNETOTÁCTICAS........................................................................................................ 14 1.8. MAGNETOSSOMOS E MAGNETOTAXIA .............................................................................................. 18 1.9. MAGNETO-AEROTAXIA....................................................................................................................... 19 1.10. PROCARIOTOS MAGNETOTÁCTICOS MULTICELULARES.................................................................. 27 1.11. CARACTERÍSTICAS GERAIS DA BACTÉRIA MAGNETOTÁCTICA MULTICELULAR ‘CANDIDATUS

MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ ....................................................................................................... 28

2. OBJETIVOS ........................................................................... 33

2.1. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................................... 33 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................... 33

3. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................ 34

3.1. COLETA E CONCENTRAÇÃO MAGNÉTICA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’..................................................................................................................................................................... 34 3.2. PRODUÇÃO DE CAMPO MAGNÉTICO APLICADO PARA EXPERIMENTOS DE VÍDEO-MICROSCOPIA. . 36 3.3. VÍDEO-MICROSCOPIA DAS TRAJETÓRIAS DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ SOB CAMPO MAGNÉTICO APLICADO ........................................................................................................... 39 3.4. AVALIAÇÃO DA RESPOSTA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ A PULSOS DE

LASER ULTRAVIOLETA E A LUZ ULTRAVIOLETA.......................................................................................... 40

4. RESULTADOS ........................................................................ 43

4.1. TRAJETÓRIAS HELICOIDAIS DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ SOB CAMPO

MAGNÉTICO APLICADO................................................................................................................................ 43 4.2. RESPOSTA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ A PULSOS DE LASER

ULTRAVIOLETA............................................................................................................................................. 45 PRANCHA 1 ......................................................................................................................................... 48 PRANCHA 2 ......................................................................................................................................... 51 PRANCHA 3 ......................................................................................................................................... 54 PRANCHA 4 ......................................................................................................................................... 57 PRANCHA 5 ......................................................................................................................................... 60 PRANCHA 6 ......................................................................................................................................... 63 PRANCHA 7 ......................................................................................................................................... 66 PRANCHA 8 ......................................................................................................................................... 69 PRANCHA 9 ......................................................................................................................................... 72 PRANCHA 10 ...................................................................................................................................... 75 PRANCHA 11 ...................................................................................................................................... 78

5. DISCUSSÃO .......................................................................... 81

5.1. VANTAGENS E DESVANTAGENS DA NOVA METODOLOGIA DESENVOLVIDA PARA O ESTUDO DO

MOVIMENTO DE MICRORGANISMOS ........................................................................................................... 81 5.2. QUANTIFICAÇÃO DOS PARÂMETROS DAS TRAJETÓRIAS HELICOIDAIS DE ‘CANDIDATUS

MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ NOS DOIS DIFERENTES CAMPOS MAGNÉTICOS APLICADOS, E

SUAS IMPLICAÇÕES PARA O MOVIMENTO .................................................................................................. 85

XIV

5.3. COMPARAÇÃO DO MOVIMENTO DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ COM O DE

OUTRAS BACTÉRIAS .................................................................................................................................... 90 5.4. RESPOSTA DE ‘CANDIDATUS MAGNETOGLOBUS MULTICELLULARIS’ A PULSO DE LASER E LUZ

ULTRAVIOLETA. ........................................................................................................................................... 94

6. CONCLUSÕES........................................................................ 97

7. BIBLIOGRAFIA ................................................................... 100

XV

XVI

1. INTRODUÇÃO

As bactérias podem interagir de diversas formas com o ambiente,

tanto o alterando quanto estando sujeitas às suas condições físico-

químicas. O resultado de quatro bilhões de anos de evolução dos

organismos procariotos gerou uma diversidade de aproximadamente

7000 espécies reconhecidas, pertencentes aos domínios Bacteria e

Archaea, número que pode chegar a centenas de milhares se

considerarmos as espécies ainda não descritas (GARRITY, LIBUM & BELL

2005; MADIGAN & MARTINKO, 2006).

Tamanha quantidade de espécies se reflete na grande diversidade

metabólica observada entre os microrganismos, e na imensa variedade

de nichos ecológicos que tais seres podem ocupar. Diferentes espécies

necessitam de diferentes nutrientes e condições ambientais para a sua

sobrevivência, e tais fatores podem variar no espaço de maneira

relevante, mesmo em dimensões tão pequenas quanto poucos

micrômetros (MADIGAN & MARTINKO, 2006).

A capacidade autônoma de deslocamento observada em

indivíduos dos mais diferentes grupos taxonômicos constitui uma das

características mais fundamentais da vida, tendo crucial importância nos

processos ecológicos e evolutivos (NATHAN, 2008). A capacidade de

deslocamento a favor ou contra um estímulo presente no meio pode

significar a diferença entre a sobrevivência e a morte de um

microrganismo (MADIGAN & MARTINKO, 2006).

As bactérias podem apresentar mecanismos de locomoção que

lhes permitem explorar diferentes regiões do meio onde se encontram,

proporcionando a busca e posicionamento em locais que possuam os

nutrientes e condições ambientais necessárias à sua existência. A

capacidade de movimentação pode, ainda, evitar a predação das

bactérias por outros microrganismos. Nesse sentido, a velocidade de

deslocamento e o padrão de natação “run and reversal” observado em

bactérias marinhas seriam exemplos de parâmetros determinantes na

prevenção da predação (MITCHELL et al., 1995; JÜRGENS & MATZ,

2002).

O tamanho pequeno dos organismos procariotos, que torna difícil

a percepção de gradientes físico-químicos ao longo do seu corpo (no

caso uma ou poucas células), análises teóricas estimam o limite de

tamanho de um microrganismo para percepção espacial em menos de 1

µm. Contudo, a maioria das bactérias se orienta no meio ambiente

comparando o status físico e/ou químico do meio em função do tempo.

Isso significa que, à medida que se desloca, a bactéria compara a

presente condição do meio com aquela percebida em um passado

recente (DUSENBERY, 1998).

A vantagem em possuir capacidade de movimento ativo se torna

explícita quando consideramos a velocidade de difusão de moléculas em

meio aquoso implícito ao movimento Browniano. Uma molécula se

desloca ao longo de uma bactéria de 1 µm em 0,5 ms, mas demora

1000 s para se deslocar 1mm no meio. Isso porque o tempo de

deslocamento aumenta com o quadrado da distância (MITCHELL &

KOGURE, 2006).

Já foram descritos diferentes mecanismos pelos quais as bactérias

se deslocam. Muitas bactérias são capazes de se movimentar sobre

superfícies sólidas por meio de gliding (deslizamento). Outras possuem

mecanismos que permitem regular a sua posição em colunas d’água por

meio de vesículas gasosas. Entretanto, a grande maioria das bactérias

se desloca devido à rotação de flagelos (MADIGAN & MARTINKO, 2006).

2

1.1. Flagelo Bacteriano

O flagelo bacteriano é uma estrutura protéica com formato

helicoidal, constituída por subunidades de flagelina, uma proteína

codificada pelo gene FlgC. A forma do filamento é determinada em parte

pela estrutura e arranjo das moléculas de flagelina e em parte pela

reação à rotação da estrutura. A figura 1 mostra a estrutura típica de

um flagelo de bactéria Gram-negativa.

A base do flagelo difere do filamento flagelar. Trata-se de uma

estrutura mais espessa, denominada gancho, formada pelas flagelinas

associadas ao gancho, codificadas pelos genes FlgK, FlgL e FliD. Tanto o

flagelo quando o gancho são estruturas externas à célula.

O flagelo é conectado através do gancho a um motor protéico

ancorado à parede celular e à membrana plasmática. O motor consiste

em uma haste que atravessa quatro anéis associados a diferentes

estruturas do envoltório celular (BERG, 2003).

As bactérias Gram-negativas apresentam parede celular contendo

pequenas quantidades de peptídeoglicano e uma membrana externa,

constituída de lipopolissacarídeo, lipoproteínas e outras macromoléculas

complexas. Nessas bactérias, o flagelo é conectado ao envoltório celular

de forma que o anel mais externo (anel L) encontra-se associado à

camada de lipopolissacarídeo (LPS). Abaixo, encontra-se o anel P,

ancorado à camada de peptideoglicanas da parede celular. O anel MS

localiza-se na membrana plasmática e o anel C, o mais interno, situa-se

na interface entre a membrana plasmática e o citoplasma (Figura 1).

O motor do flagelo bacteriano é constituído por aproximadamente

20 tipos de proteínas e possui dimensões que não excedem 50 nm. O

motor pode apresentar rotação em frequências da ordem de 100 Hz,

3

cujo torque causa a rotação do flagelo, estrutura responsável pelo

deslocamento da célula (BERG, 2003).

Flanqueando os anéis mais internos do motor (MS e C), existe

uma série de proteínas motoras (Mot), responsáveis pela rotação do

flagelo; e um conjunto de proteínas Fli, cuja função é determinar o

sentido de rotação do motor em resposta a estímulos intracelulares.

Os anéis C, MS e P constituem o corpo basal, atuando como um

rotor. Em volta do corpo basal, as proteínas Mot geram o torque para a

rotação da estrutura. A fonte de energia que move o motor flagelar

provém da passagem de prótons através da membrana plasmática e

através das proteínas Mot associadas aos anéis MS e C. A forma como a

rotação do motor realmente ocorre ainda não é conhecida. Um modelo

proposto para esse fenômeno, “turbina de prótons” (Figura 2), sugere

que a passagem de prótons pelas proteínas Mot exerça forças

eletrostáticas nas cargas das proteínas do rotor dispostas de forma

helicoidal. A atração entre cargas positivas e negativas causaria, então,

a rotação do corpo basal. (BERG, 2003; MADIGAN & MARTINKO, 2006).

4

Figura 1: Estrutura do flagelo de bactérias Gram-negativas. O flagelo é conectado à superfície da célula por um gancho ligado à haste do motor rotatório. Associado ao LPS se encontra o anel mais externo (L). O anel P é ancorado à camada de peptídeoglicano da parede celular. O anel S é associado à membrana plasmática e o anel C encontra-se na face interna da membrana plasmática, em contato com o citoplasma. Os anéis P, MS e C constituem o corpo basal, que funciona como um rotor que é impulsionado pelo fluxo de prótons através das proteínas Mot. Entre os anéis MS e C encontram-se proteínas Fli, cuja função é alternar o sentido de rotação do motor em resposta a sinais intracelulares (Adaptado de Madigan & Martinko, 2009).

Figura 2: Modelo de “turbina de prótons” proposto para explicar a rotação do flagelo. O fluxo de prótons pelas proteínas Mot exerceriam forças nas cargas presentes nos anéis MS e C, causando a rotação da estrutura (Adaptado de Madigan & Martinko, 2009).

5

1.2. Quimiotaxia

Os estímulos que direcionam as bactérias a favor ou contra um

determinado micro-ambiente podem ser de natureza física ou química.

Os exemplos mais relatados na literatura são as respostas à luz

(fototaxia) e a substâncias químicas (quimiotaxia).

A quimiotaxia consiste no movimento ativo de células ou

organismos em resposta a substâncias presentes no meio. Esse

deslocamento pode ocorrer tanto a favor quanto contra o estímulo

químico, onde a natureza da substância e a espécie ou tipo celular em

questão determinam o tipo de resposta (EISENBACH, 2007).

Grande parte dos estudos relacionados à quimiotaxia tem como

modelo a bactéria Escherichia coli. Trata-se de uma bactéria comum do

trato intestinal humano que tem forma de bastão e possui

aproximadamente seis flagelos emergindo de pontos aleatórios da

membrana celular.

Cada flagelo é propelido por um motor protéico rotatório,

ancorado à membrana plasmática e parede celular. Quando os flagelos

giram em sentido anti-horário, tendo como referência o plano da

superfície onde o flagelo se insere, ocorre a formação de um tufo

sincronizado de flagelos, que propele a célula avante, em trajetórias

aproximadamente retilíneas (run) (TUNER, RYU & BERG, 2000). Este

padrão de movimento não constitui uma trajetória perfeitamente

retilínea devido à susceptibilidade da bactéria ao movimento browniano

rotacional e translacional, causados pela colisão da bactéria com

moléculas presentes no fluido circundante. O movimento browniano é

desprezível quando comparado com o movimento de natação

translacional da célula. Contudo, o movimento browniano é significativo

6

para o movimento rotacional, causando dispersão angular da trajetória

(MITCHELL & KOGURE, 2006).

Quando um ou mais flagelos giram em sentido horário, o tufo de

flagelos se desfaz e a célula passa a se mover em padrão errático,

denominado tumble, que causa a reorientação da célula em nova

direção devido à energia térmica do meio. E. coli realiza quimiotaxia

executando runs e tumbles alternadamente (TUNER, RYU & BERG,

2000).

E. coli possui dimensões muito restritas para detectar diferenças

espaciais na concentração das substâncias dispersas no meio. Contudo,

é capaz de realizar comparações temporais à medida que nada. A

bactéria compara a concentração de substâncias químicas atrativas ou

repelentes com aquelas presenciadas há poucos instantes. Isso permite

à E. coli modular a taxa de runs e tumbles em função da diferença de

concentração da substância presente no meio.

Caso E. coli esteja presente em um gradiente químico atrativo, os

movimentos randômicos existentes em situações de ausência de

estímulos ambientais tornam-se movimentos não aleatórios. À medida

que a bactéria avança para zonas com maior concentração da

substância atrativa, as corridas tornam-se mais longas e os tumbles

menos frequentes. Consequentemente, a tendência é que o

microrganismo se desloque para regiões de maior concentração da

substância atrativa. Caso o gradiente seja de uma substância repelente,

o mesmo mecanismo é aplicado. Entretanto, é a redução da

concentração da substância que promove o aumento das corridas e a

redução dos tumbles (LOCSEI, 2007).

7

1.3. Fototaxia

Diversos microrganismos apresentam alteração no padrão de

natação em resposta à condição de luz do ambiente. Existem três tipos

conhecidos de resposta à luz. A resposta escotofóbica é caracterizada

por uma “fobia ao escuro”: a bactéria entra em tumble, cessa ou reverte

a direção de natação quando percebe uma redução na intensidade de

luz do meio. A fotocinese é caracterizada por uma alteração na taxa de

motilidade do microrganismo devido a diferenças na intensidade de luz

do meio. A fototaxia propriamente dita envolve o movimento orientado

da célula a favor ou contra uma fonte de luz (OBERPICHLER et al.,

2008).

A priori, a vantagem da fototaxia seria permitir aos organismos

fototróficos se posicionar em regiões onde o comprimento de onda e a

intensidade da luz recebida sejam os mais adequados para a

fotossíntese. Isso pode ser observado quando se ilumina com um

espectro de luz uma lâmina de microscópio com bactérias fototróficas.

As bactérias se acumulam na região de máxima absorção de seus

pigmentos fotossintetizantes (MADIGAN & MARTINKO, 2006).

Entretanto, a resposta à luz pode ser observada em espécies

heterotróficas. E. coli responde a pulsos intensos de luz azul realizando

tumbles. A fototaxia em E. coli parece estar relacionada com a síntese

de ferroquelatase, a enzima que catalisa a etapa final de incorporação

de Fe+2 pela protoporfirina IX (YANG, INOKUCHI & ADLER, 1995). A

mutação no gene que codifica a ferroquelatase impede a formação do

grupamento heme (molécula orgânica com estrutura em anel associada

a íons de ferro), causando acúmulo de protoporfirina IX na célula. Cepas

mutantes para o gene hemH que codifica a ferroquelatase respondem à

luz azul (396-450nm) realizando “tumbles”. A retirada da luz azul faz

com que as células passem a apresentar “runs”. As cepas mutantes para

8

hemH são aproximadamente 100 vezes mais sensíveis à luz azul que as

cepas selvagens (YANG et al., 1996).

1.4. Biofísica do movimento de microrganismos

O deslocamento dos microrganismos em meio aquático possui

limitações físicas distintas das observadas na natação de organismos

superiores, como peixes e mamíferos aquáticos. O deslocamento dos

microrganismos na água é regido pela viscosidade do meio. A inércia,

fator relevante na natação de organismos de maior dimensão, torna-se

desprezível para microrganismos como as bactérias.

Para que um microrganismo seja propelido em meio aquoso, é

necessária a atuação ativa e constante de apêndices de superfície, como

cílios e flagelos. A interrupção do batimento ou rotação dessas

estruturas causa a interrupção imediata do movimento avante. Por outro

lado, mesmo que o microrganismo não possua cílios ou flagelos, haverá

movimento. Microrganismos em suspensão em meio aquoso estão

sujeitos à movimentação passiva, de forma randômica, devido ao

movimento térmico das moléculas de água, fenômeno conhecido como

movimento browniano.

Se considerarmos uma população de células se difundindo a partir

de um ponto sobre uma reta, em apenas uma dimensão, observamos

que com o passar do tempo, cada indivíduo da população se afasta cada

vez mais de sua posição inicial, gerando uma curva de distribuição de

posições que é Gaussiana. Com o passar do tempo, a largura da

Gaussiana aumenta. Este tipo de distribuição pode ser caracterizado

pela medida do desvio quadrático médio das partículas, dado quando se

considera apenas uma dimensão por: , onde t é o tempo

decorrido e D é o coeficiente de difusão, que depende do tamanho e da

Dtr 22 >=<

9

forma da célula, dentre outros fatores, e < > significa uma média

realizada sobre todos os indivíduos da população. Por exemplo, para

uma bactéria com raio de 1µm em meio aquoso à 37ºC, o coeficiente de

difusão é igual a Quando consideramos duas e três

dimensões, temos e , respectivamente.

scm /105 29−×

Dtr 42 >=< Dtr 62 >=<

Dada a natureza randômica e lenta do deslocamento celular em

meio aquoso devido à energia térmica, a capacidade de natação através

de propulsão proporcionada por estruturas de superfície celular constitui

uma importante vantagem para a sobrevivência dos microrganismos

(BRAY, 1992).

Quando um microrganismo nada propelido por cílios ou flagelos,

ele se depara com duas forças de resistência ao movimento avante: o

arrasto causado pela viscosidade do meio e a resistência inercial do

fluido. O Número de Reynolds é um parâmetro adimensional

determinado pela razão entre as forças de inércia e de viscosidade do

meio (NOGUEIRA & LINS DE BARROS, 1995). Números de Reynolds

abaixo de 0,001 indicam que o movimento é influenciado basicamente

pela viscosidade do meio e que as forças inerciais são desprezíveis

(BRAY, 1992).

Para a natação de um dado organismo, o número de Reynolds

depende da dimensão do organismo, da velocidade de natação e da

densidade e viscosidade do meio líquido, sendo dado por:

ηρ

ηρ vL

vLLv

idadevisfinérciaf

===22

)cos()(Re (1)

Onde (L) é a dimensão linear do organismo, (v) é a velocidade, (ρ) é a

densidade e (η) a viscosidade do meio. Analisando a equação, temos

que para organismos com dimensões grandes (L grande), o número de

Reynolds também será grande. Nesse caso, o movimento terá grande

influência da inércia. Para o caso de microrganismos, cujas dimensões

são muito reduzidas, tem-se um número de Reynolds extremamente

10

baixo. Para uma bactéria de 1µm de comprimento nadando em meio

aquoso, o número de Reynolds é igual a 10-5, sendo o movimento

dominado pelas forças devido à viscosidade do meio.

Uma das conseqüências do movimento sob o regime de baixo

número de Reynolds é que o formato da célula não constitui nenhuma

vantagem em termos de hidrodinâmica, uma vez que isso só ocorre sob

regime inercial, onde a forma do organismo está relacionada com a

turbulência gerada durante o movimento (BRAY, 1992).

1.5. Movimento Helicoidal

A natação em trajetórias helicoidais é uma característica comum a

diversos microrganismos e células com dimensões entre 5 e 500µm

(JENNINGS 1901, 1904; CRENSHAW, 1993a), sendo observadas em

ciliados, flagelados, células germinativas de animais vertebrados e

invertebrados (CRENSHAW, 1993a). Jennings (1901) realizou a primeira

análise da cinemática do movimento helicoidal em microrganismos,

afirmando que a natação helicoidal envolve dois componentes de

rotação: um paralelo e outro perpendicular ao eixo de movimento. Tais

análises, entretanto, não forneceram uma descrição completa do

movimento helicoidal, nem tampouco discutiram suas consequências.

Organismos com natação em padrão helicoidal respondem a

estímulos do meio através do alinhamento do eixo da trajetória em

direção ao estímulo. A alteração da direção do eixo de natação se dá por

meio de alterações na velocidade rotacional (angular) em resposta ao

estímulo (BROKAW, 1958; CRENSHAW, 1993b).

Em situações onde uma face do organismo sempre aponta para o

eixo da hélice, tanto a velocidade translacional quanto a velocidade

rotacional sempre apontam para a mesma direção em relação ao corpo

11

do microrganismo ou alteram a direção somente em um plano em

relação ao corpo do organismo (CRENSHAW, 1993a).

Organismos que nadam em trajetórias helicoidais podem alterar a

direção de natação em resposta a estímulos do meio simplesmente

variando a velocidade rotacional em função da intensidade do estímulo.

Esse tipo de resposta consiste em uma taxia verdadeira: não há

componentes randômicos nesse mecanismo de orientação (CRENSHAW,

1993b).

Uma peculiaridade da resposta quimiotáctica ou fototáctica de

organismos com natação helicoidal é o fato de que a intensidade do

estímulo percebido sofre variação em função da espiral descrita pelo

microrganismo. Em organismos quimiotácticos com natação helicoidal, a

intensidade resultante do estímulo constitui uma função senoidal em

relação ao tempo. A taxa na qual o microrganismo gira em relação ao

seu eixo anterior-posterior é, por exemplo, proporcional à concentração

de uma substância presente no meio. A orientação pode ser a favor ou

contra um gradiente químico, dependendo da relação entre a

intensidade do estímulo e a velocidade rotacional (CRENSHAW, 1993c).

1.6. Campo geomagnético

A terra atua como um grande magneto esférico, sendo envolto por

um campo magnético que varia no tempo e no espaço. Considerando-se

a terra como um grande dipolo magnético, o eixo desse dipolo encontra-

se desalinhado com o eixo de rotação da terra em aproximadamente

11º. Isso significa que os pólos norte e sul magnético e os pólos norte e

sul geográfico não se sobrepõem.

A qualquer momento ou local, o campo geomagnético pode ser

caracterizado por uma direção e intensidade mensuráveis. Os principais

12

parâmetros que caracterizam o campo magnético são a declinação (D),

a intensidade horizontal (H) e a intensidade vertical (Z). A partir desses

três elementos, todos os demais parâmetros do campo geomagnético

podem ser calculados (Figura 3).

O campo geomagnético varia em diferentes locais da superfície do

planeta. Nos pólos geomagnéticos, a agulha de uma bússola tende a

permanecer na vertical em relação à superfície da terra: a intensidade

horizontal é igual a zero e a bússola não aponta a direção norte-sul (a

declinação é indefinida). No pólo norte magnético, a terminação norte

da bússola aponta para baixo. No pólo sul magnético, a ponta norte da

agulha aponta para cima. No equador magnético, a inclinação da agulha

é zero (a agulha permanece paralela ao eixo norte-sul geomagnético).

A caracterização completa do campo geomagnético se dá através

de sete parâmetros: declinação (D), inclinação (I), intensidade

horizontal (H), componente norte (X) e componente leste (Y) da

intensidade horizontal, intensidade vertical (Z) e intensidade total (F).

Os parâmetros que descrevem a direção do campo magnético são

a declinação (D) e a inclinação (I), expressos em graus. A intensidade

do campo geomagnético total (F) é descrita pela componente horizontal

(H), pela componente vertical (Z) e pelas componentes norte (X) e leste

(Y) da intensidade horizontal. Essas componentes podem ser expressas

em unidades de Gauss ou, mais comumente, em nano-Tesla (1 Gauss =

105nT). A intensidade do campo geomagnético varia entre 25.000 e

65.000 nT (0,25 e 0,65 Gauss).

A declinação magnética é o ângulo entre o norte magnético e o

norte geográfico. A declinação é considerada positiva quando o ângulo

medido se encontra a leste do norte geográfico e é negativo quando se

encontra a oeste.

A inclinação magnética é o ângulo entre o plano horizontal e o

vetor do campo magnético total, sendo positivo quanto aponta em

13

direção ao chão (latitudes superiores à do equador magnético) e

negativo quando aponta para cima (latitudes inferiores à do equador

magnético) (National Oceanic and Atmospheric Administration - USA,

WWW.noaa.gov.br).

(b)(a)

Figura 3: (A) Eixo de rotação da terra, o eixo do dipolo geomagnético e orientação das linhas de campo geomagnético ao redor do globo terrestre. (B) Parâmetros do campo geomagnético: campo geomagnético total (F), componente horizontal (H), componente vertical (Z), componente norte (X) e leste (Y) da intensidade horizontal.

1.7. Bactérias magnetotácticas

Há pouco mais de trinta anos, um novo tipo de resposta

microbiana ao ambiente foi descrito por Richard P. Blakemore, então

aluno de graduação em microbiologia na Universidade de

Massachusetts. Durante uma tentativa de isolar Spirochaeta plicatilis de

sedimentos pantanosos coletados em Woods Hole, no Estado de

Massachusetts (EUA), Blakemore observou microrganismos que

nadavam persistentemente para um dos lados da gota de água e

sedimento observada ao microscópio óptico. Blakemore demonstrou

14

experimentalmente que tais bactérias respondiam ao campo magnético:

a direção para a qual esses microrganismos nadavam mudava

rapidamente quando um ímã era posicionado próximo à amostra

(BLAKEMORE, 1975).

A microscopia de transmissão desses microrganismos demonstrou

que tais bactérias apresentavam formato aproximadamente esférico,

com diâmetro médio de 1µm. Possuíam dois tufos de flagelos, cada qual

constituído por aproximadamente sete unidades, além de apresentar

duas cadeias citoplasmáticas contendo entre cinco e dez estruturas

eletrondensas de aspecto cristalino, cujo elemento predominante era o

ferro (fato demonstrado através de microanálises de raios-X).

Blakemore cogitou a magnetita (Fe3O4) como mineral constituinte

dessas estruturas (BLAKEMORE, 1975), o que foi confirmado poucos

anos depois através de espectroscopia de Mössbauer de células

cultivadas (FRANKEL, BLAKEMORE & WOLFE, 1978).

Richard Blakemore usou pela primeira vez os termos “bactéria

magnetotáctica” e “magnetotaxia” em referência a bactérias que

respondem ao campo magnético e ao movimento de bactérias em

resposta ao campo magnético, respectivamente. Segundo Blakemore,

tais inclusões ricas em ferro atuariam como dipolos magnéticos,

conferindo momento magnético às células e, consequentemente,

orientando-as sob campos magnéticos (BLAKEMORE, 1975; FRANKEL,

WILLIAMS & BAZYLINSKI, 2007). Desde então, todos os trabalhos

relacionados a bactérias magnetotácticas se referem, de uma maneira

ou de outra, às idéias propostas por Blakemore para a magnetotaxia

(FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI, 2007).

As bactérias magnetotácticas ocorrem na coluna d’água ou em

sedimentos alagados com estratificação química vertical, ocorrendo

predominantemente na interface de transição óxica-anóxica (zona de

transição entre regiões com e sem oxigênio dissolvido), em regiões

15

anóxicas ou em ambas (BAZYLINSKI et al., 1995; BAZYLINSKI &

MOSKOWITZ 1997; SIMMONS et al., 2004). Apresentam uma grande

diversidade de tipos morfológicos, como espirilos, vibriões, cocos,

bacilos e formas multicelulares. A parede celular das bactérias

magnetotácticas possui características similares às de bactérias Gram-

negativas. Todas são propelidas por flagelos, cujo arranjo varia de

acordo com a espécie ou cepa, podendo ser monotríqueos polares

(flagelo emergindo em um dos pólos da célula), bipolares (emergindo

em dois pólos da célula) ou estar presente na forma lofotríquea (grupo

de flagelos emergindo de um pólo da célula) (BAZYLINSKI & FRANKEL

2004).

As bactérias magnetotácticas conhecidas até hoje se encontram no

domínio Bacteria e são associadas a diferentes subgrupos de

Proteobacteria e com o filo Nitrospira (SPRING & BAZYLINSKI, 2000;

SIMMONS et al., 2004). Todas possuem magnetossomos, estruturas

intracelulares contendo cristais magnéticos compostos pelo óxido de

ferro magnetita (Fe3O4) e / ou pelo sulfeto de ferro greigita (Fe3S4),

envoltos por uma membrana biológica (GORBY, BEVERIDGE &

BLAKEMORE, 1988; BAZYLINSKI & FRANKEL, 2004; ABREU et al.,

2008). As bactérias produtoras de magnetita são encontradas tanto em

ambientes marinhos quanto em ambientes de água doce. Já as bactérias

magnéticas produtoras de greigita são encontradas somente em

ambientes com alguma influência marinha. Em ambientes marinhos

estratificados onde ambos os tipos de bactérias coexistem, as bactérias

produtoras de magnetita são encontradas no topo da quimioclina,

enquanto as produtoras de greigita ocorrem na base ou abaixo da

quimioclina (BAZYLINSKI et al., 1995; SIMMONS et al., 2004).

Os cristais biomineralizados pelas bactérias magnetotácticas

possuem comprimento da ordem de 35 a 220 nm (BAZYLINSKI &

FRANKEL, 2004; McCARTNEY et al., 2001), e se encontram organizados

16

em cadeias paralelas de comprimentos diversos, algumas vezes

formando feixes (HANZLIK et al., 1996) ou grupos planares (SILVA et

al., 2007).

Quando observadas ao microscópio óptico, bactérias

magnetotácticas mortas, por exemplo, por fixação com vapor de

tetróxido de ósmio, não apresentam migração, embora as células não

aderidas à lâmina se alinhem passivamente a campo magnético aplicado

quando a direção deste é alterada. Isso demonstra que a natação da

bactéria de deve à rotação ativa dos flagelos (BLAKEMORE, 1975).

Devido à presença dos magnetossomos, as bactérias magnéticas

são alinhadas passivamente, enquanto se deslocam de maneira ativa

devido à rotação dos seus flagelos (BLAKEMORE, 1975). As velocidades

de natação reportadas na literatura para microrganismos dessa natureza

variam de 40 a 1000 µm/s (BLAKEMORE, 1975; MARATEA &

BLAKEMORE, 1981; MOENCH, 1988; COX et al., 2002). De maneira

geral, os espirilos magnéticos apresentam as menores velocidades de

natação (<100µm/s) (MARATEA & BLAKEMORE, 1981) e os cocos

magnéticos apresentam as maiores velocidades (>100µm/s)

(BLAKEMORE, 1975; MOENCH, 1988; COX et al., 2002).

As bactérias magnetotácticas são de difícil isolamento e cultivo,

existindo atualmente poucas culturas puras desses microrganismos. A

maior dificuldade na obtenção de culturas puras de bactérias

magnetotácticas reside no fato destas serem microaerófilas obrigatórias

ou anaeróbias (BAZYLINSKI & FRANKEL 2004). Apesar disso, as

bactérias magnetotácticas são facilmente detectadas em amostras

coletadas do ambiente por meio de isolamento magnético (LINS et al.,

2003).

As espécies reconhecidas atualmente incluem Magnetospirillum

magnetotacticum MS-1 (MARATEA & BLAKEMORE, 1981; BLAKEMORE,

MARATEA & WOLFE, 1979; SCHLEIFER et al., 1991), Magnetospirillum

17

gryphiswaldense (SCHLEIFER et al., 1991), Magnetospirillum

magneticum AMB-1 (MATSUNAGA, SAKAGUCHI & TADOKORO, 1991) e

Desulfovibrio magneticus (SAKAGUCHI, ARAKAKI & MATSUNAGA, 2002).

Existem ainda espécies cultivadas, mas parcialmente

caracterizadas, como vibriões marinhos MV-1 e MV-2 (BAZYLINSKI,

FRANKEL & JANNASCH, 1988; MELDRUM et al., 1993a), cocos MC-1

(MELDRUM et al., 1993b) e espirilos MMS-1 (anteriormente MV-4)

(BAZYLINSKI & FRANKEL, 2000; MELDRUM et al., 1993b).

1.8. Magnetossomos e Magnetotaxia

As dimensões dos nanocristais magnéticos de magnetita (Fe3O4)

e/ou greigita (Fe3S4) biomineralizados pelas bactérias magnéticas, da

ordem de 35-120nm, caracteriza-os magneticamente como cristais de

domínio simples. Isso significa que eles atuam como dipolos

permanentes, alinhando-se a linhas de campos magnéticos de forma

semelhante à agulha de uma bússola.

Os cristais de magnetita ou greigita de domínio simples são

uniformemente magnetizados, possuindo máximo momento de dipolo

magnético por unidade de volume (FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI,

2007). Os magnetossomos encontram-se intimamente associados a

filamentos de citoesqueleto (KOMEILI et al., 2006; SCHEFFEL et. al,

2006).

O torque exercido pela interação entre o dipolo magnético dos

magnetossomos e campos magnéticos externos causa o alinhamento

passivo da célula às linhas de campo, enquanto as células nadam devido

à propulsão gerada pela rotação dos seus flagelos (FRANKEL, WILLIAMS

& BAZYLINSKI, 2007).

18

Quando observadas ao microscópio óptico sob condições

ambientais de [O2] e sob a influência de campo magnético gerado por

um ímã ou por um par de bobinas eletromagnéticas, as bactérias

magnetotácticas nadam alinhadas ao campo magnético aplicado, em

trajetórias retilíneas ou helicoidais. Quando a direção do campo

magnético aplicado é alterada em 180º, as bactérias se reorientam,

realizando um “U-turn” ou “volta em U” (a bactéria altera a sua direção

de natação em 180°, passando a nadar no sentido oposto ao observado

antes da reversão do campo).

A organização dos magnetossomos em cadeias faz com que a

interação magnetostática entre os cristais resulte em um momento

magnético permanente para a cadeia como um todo (FRANKEL, 1984).

A direção da natação da bactéria seria resultado do torque exercido pela

interação do campo magnético externo com o momento magnético da

célula. Por outro lado, a energia térmica do meio atua como um fator de

perturbação do alinhamento da bactéria durante a natação. O

alinhamento médio da bactéria enquanto nada alinhada a um campo

magnético é dado pela razão entre a energia magnética e a energia

térmica do meio (FRANKEL, 1984).

1.9. Magneto-aerotaxia

O modelo originalmente proposto para a magnetotaxia baseava-se

em dois pressupostos: que todas as bactérias magnetotácticas

possuiriam polaridade fixa em relação à direção de natação, e que todas

seriam microaerófilas (com crescimento apenas em concentrações de

oxigênio reduzidas em comparação às concentrações atmosféricas)

(BLAKEMORE 1975; BLAKEMORE & FRANKEL 1981). No hemisfério

norte, o vetor do campo magnético total é inclinado para baixo: as

19

linhas de campo apontam em direção à superfície da terra. No

hemisfério sul, o campo magnético aponta para o sentido inverso, para

cima. Isso significa que, para nadar para o fundo do sedimento, em

direção a menores [O2], bactérias no hemisfério norte nadam de forma

paralela ao campo magnético. No hemisfério sul, nadar em direção ao

sedimento significa nadar de forma antiparalela ao campo geomagnético

(FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI, 2006).

As bactérias que nadam persistentemente em direção ao norte

magnético são denominadas NS (do inglês “North-seeking” - que nada

para o pólo norte magnético) enquanto as que nadam com orientação

antiparalela são demoninadas SS (“South-seeking” - que nada em

direção ao pólo sul magnético) (FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI,

2006).

Segundo o modelo original proposto para a magnetotaxia, a

inclinação do campo magnético poderia guiar as bactérias verticalmente

no sedimento para regiões com concentrações de oxigênio reduzidas.

Uma vez alcançada tal região, presumia-se que as bactérias cessassem

a migração, aderindo-se ao sedimento até que houvesse alguma

alteração na concentração de oxigênio.

Esta teoria se apóia no fato de haver predominância no hemisfério

norte de bactérias magnetotácticas polares NS, e predominância de

bactérias magnetotácticas polares SS no hemisfério sul observadas sob

condições aeróbias (BLAKEMORE 1975; BLAKEMORE, FRANKEL &

KALMIJN, 1980; NOGUEIRA & LINS DE BARROS, 1995). Contudo, a

descoberta de grandes populações de bactérias magnetotácticas na

coluna d’água em regiões de quimioclina de habitats marinhos, a

obtenção de culturas puras de bactérias microaerófilas obrigatórias e a

descoberta de populações de bactérias SS no hemisfério norte não

poderiam ser explicadas pelo modelo original proposto para a

magnetotaxia.

20

O modelo original proposto para a magnetotaxia não explicava

como bactérias na zona anóxica da coluna d’água se beneficiavam da

magnetotaxia e não explicava como cocos magnetotácticos polares

como MC-1 formavam bandas microaerófilas horizontais quando em

meio semi-sólido com gradiente de oxigênio, ao invés de se acumular e

crescer no fundo do tubo (FRANKEL et al., 1997; SIMMONS,

BAZYLINSKI & EDWARDS, 2006).

Culturas puras de cocos magnetotácticos marinhos denominados

MC-1 formam bandas microaerófilas em capilar de vidro achatado com

gradiente de oxigênio e campo magnético aplicado. Estas bactérias são

capazes de migrar em ambas as direções do campo magnético, usando

tanto a resposta magnetotáctica quanto a resposta aerotáctica para se

posicionar em regiões onde a concentração de oxigênio é mais adequada

(FRANKEL et al., 1997).

Sob condições homogêneas de oxigênio (uma gota d’água

observada ao microscópio óptico), células de MC-1 nadam

persistentemente na mesma direção de sentido do campo magnético

aplicado, ou seja, apresentam comportamento NS. Quando o campo

magnético é revertido, as células realizam uma volta em U (u-turn) e

continuam a nadar paralelas ao campo aplicado.

Quando inseridas em um capilar de vidro com gradiente de

oxigênio, as células MC-1 formam bandas microaerófilas, nadando tanto

de forma paralela quanto de forma antiparalela ao campo aplicado,

revertendo o sentido de natação quando ultrapassam o limite da banda

(Figura 4c). Se o campo magnético for invertido, as células nadando em

cada direção realizam um u-turn, permanecendo na mesma direção

relativa ao campo antes da reversão, o que tende a desfazer a banda

em dois grupos de células que se afastam em sentidos opostos da

posição da banda original. Quando o campo é novamente revertido para

a orientação original, a banda microaerófila se refaz. Isso demonstra

21

que os cocos MC-1 podem nadar a favor ou contra o sentido do campo

magnético aplicado, mantendo seus dipolos magnéticos alinhados de

forma paralela ao campo em ambos os casos (FRANKEL et al., 1997).

Os mesmos experimentos de resposta ao gradiente de oxigênio e

à inversão do campo magnético foram realizados com Magnetospirillum

magnetotacticum, com resultados diferentes. Quando observados ao

microscópio óptico sob condições homogêneas de oxigênio e campo

magnético aplicado, M. magnetotacticum nada em ambas as direções do

campo aplicado, mesmo após a reversão do campo magnético. Quando

em capilares com gradiente de [O2], M. magnetotacticum formam

bandas microaerófilas, assim como o observado em MC-1. A reversão do

campo aplicado faz com que as células girem 180º. Entretanto, ao

contrário do observado em MC-1, a banda não se desfaz (Figura 4b)

(FRANKEL et al., 1997).

A formação de bandas microaerófilas observada em M.

magnetotacticum é consistente com o mecanismo temporal-sensorial

(SEGALL et al., 1986; FRANKEL et al., 1997), onde a concentração de

oxigênio determina o sentido de rotação do flagelo. Para essa bactéria, o

campo magnético determina apenas o eixo do movimento, enquanto a

direção de natação é dada em função da resposta aerotáctica. Esse

comportamento foi denominado magneto-aerotaxia axial.

O comportamento observado em MC-1 não pode ser explicado por

uma resposta sensorial-temporal à concentração de oxigênio do meio,

uma vez que a banda se desfaz quando o sentido do campo magnético é

invertido. Assim como MC-1, a maioria das bactérias magnetotácticas

possui magnetotaxia polar (Figura 5). Isso significa que, sob condições

aeróbias, as bactérias NS nadam persistentemente de forma paralela ao

campo magnético, enquanto bactérias SS nadam persistentemente de

forma antiparalela (FRANKEL et al., 1997).

22

O modelo de “dois estados” proposto para as bactérias que

apresentam magneto-aerotaxia polar (Figura 6) sugere que, sob

concentrações de oxigênio acima da ideal, as células NS nadam de

forma paralela ao campo magnético devido à rotação dos flagelos no

sentido anti-horário (“estado oxidado”). Quando a célula presencia

concentrações de oxigênio inferiores à concentração ótima, a célula

reverte a rotação dos flagelos para o sentido horário, passando a nadar

com orientação antiparalela ao campo magnético (“estado reduzido”).

Os sentidos de rotação dos flagelos assumidos para a natação paralela

(anti-horário) e antiparalela (horário) ao campo magnético são

arbitrários, porém consistentes com o sentido de rotação observado

para outras bactérias em que a rotação dos flagelos no sentido anti-

horário é observada na direção predominante de natação (FRANKEL et

al., 1997).

23

Figura 4: Distinção entre magneto-aerotaxia polar e axial. (a) Representação esquemática de um fino capilar onde células crescidas em meio reduzido são inseridas, resultando em um menisco (M) em ambas as extremidades. Um campo magnético (B) da ordem de poucos Gauss é aplicado orientado de forma paralela ao capilar. O oxigênio se difunde a partir das extremidades dos capilares, gerando gradiente de [O2] que aumenta do centro do capilar em direção às extremidades. (b) A formação de banda pela bactéria magnetoaerotáctica axial Magnetospirillum magnetotacticum ocorre em ambas as extremidades. A rotação do campo em 180º após a formação da banda faz com que as células girem 180º, contudo, sem desfazer as bandas. (C) A formação de banda pela bactéria magnetoaerotáctica polar MC-1 ocorre somente na extremidade do capilar onde o campo magnético e a [O2] possuem orientação oposta entre si. A reversão do campo em 180º faz com que as células girem 180º e continuem nadando com a mesma orientação observada antes da reversão do campo, o que desfaz a banda (BAZYLINSKI & FRANKEL, 2004).

24

Figura 5: Representação da polaridade das bactérias magnetotácticas do tipo NS e SS. Ambas as bactérias possuem dipolo magnético intrínseco orientado de forma paralela ao campo magnético. Sob condições ambientais de [O2], a rotação do flagelo no sentido anti-horário faz com que as bactérias NS nadem com orientação paralela ao campo magnético, enquanto o mesmo sentido de rotação de flagelo nas bactérias SS produz natação com orientação antiparalela ao campo magnético. Sob condições de baixa [O2] o flagelo passaria a girar em sentido horário, invertendo o sentido de natação em ambos os casos (Adaptado de FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI 2006).

25

Figura 6: Esquema demonstrando como a magneto-aerotaxia polar manteria a bactéria em ambientes microaeróbios, na zona de transição óxica-anóxica em colunas d’água com estratificação química vertical. Tanto no hemisfério norte quanto no hemisfério sul, bactérias submetidas a concentrações de oxigênio acima da ideal apresentam natação avante em consequência da rotação do flagelo no sentido anti-horário (“estado oxidado”). Isso faz com que as bactérias NS e SS nadem em direção ao sedimento até concentrações de oxigênio abaixo da ideal (“estado reduzido”), o que causa a reversão do sentido de rotação do flagelo para o sentido horário e, consequentemente, faz com que as bactérias passem a nadar na direção oposta (em direção à superfície) (Adaptado de FRANKEL, WILLIAMS & BAZYLINSKI 2006).

26

1.10. Procariotos magnetotácticos multicelulares

Microrganismos magnetotácticos de natureza multicelular são

reportados na literatura desde a década de 80 (FARINA et al., 1983). Ao

longo dos anos, diferentes denominações foram atribuídas a tais

microrganismos. Farina e colaboradores atribuíram o termo

“Magnetotactic Multicellular Aggregates (MMAs)” para designar

microrganismos magnetotácticos compostos por várias células envoltas

por membranas duplas coletados na Lagoa Rodrigo de Freitas, Rio de

Janeiro, Brasil (FARINA et al., 1983; LINS DE BARROS, ESQUIVEL &

FARINA, 1990; KEIM et al., 2007). Em 1990, Rodgers et al. adotaram o

termo “Many-celled Magnetotactic Prokaryotes (MMPs)” para denominar

um microrganismo similar encontrado no Estado da Nova Inglaterra,

Estados Unidos (RODGERS et al., 1990). Uma terceira designação,

“Magnetotactic Multicellular Organisms (MMOs)”, foi adotada por Keim

et al. para um microrganismo multicelular magnetotáctico encontrado

na Lagoa de Araruama, Estado do Rio de Janeiro, Brasil (KEIM et al.,

2004a).

As bactérias magnetotácticas multicelulares são microrganismos

compostos por 10-40 células Gram-negativas organizadas em um

arranjo esférico que se move como uma unidade sob campos

magnéticos (FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS, 1990; RODGERS et

al., 1990; KEIM et al., 2007; LINS et al., 2007; ABREU et al., 2007;

WENTER et al., in press). Possuem diâmetro variando entre 2,2-12,5µm

(LINS & FARINA, 1999; RODGERS et al., 1990; KEIM et al., 2007;

WENTER et al., in press), velocidade de natação entre 30 e 175µm/s

(FARINA et al., 1983; RODGERS et al., 1990; KEIM et al., 2007) e

cristais magnéticos constituídos por óxido ou sulfeto de ferro (PÓSFAI et

al., 1998b; KEIM et al., 2007; LINS et al., 2007; WENTER et al., in

press). Cada célula apresenta uma face voltada para um compartimento

27

interno acelular e outra face voltada para o ambiente apresentando

múltiplos flagelos (KEIM et al., 2004a, 2007). Sob situação de estresse,

o microrganismo se desagrega em células individuais, que nunca

apresentam motilidade, apesar de se orientarem passivamente a

campos magnéticos aplicados (FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS,

1990; LINS & FARINA 1999; KEIM et al., 2004a, 2007; ABREU et al.,

2006). Até o presente momento não existem culturas puras de bactérias

magnetotácticas multicelulares, sendo todos os trabalhos publicados até

então realizados a partir de amostras coletadas do ambiente.

Filogeneticamente, os procariotos multicelulares magnetotácticos

pertencem ao grupo das δ-Proteobacteria, sendo agrupados dentro de

um grupo de bactérias redutoras de sulfato, onde formam um ramo

coeso (DeLONG et al., 1993; ABREU et al., 2007; SIMMONS &

EDWARDS, 2007; WENTER et al., in press). Recentemente, foi descrito

um novo microrganismo dentro deste grupo, denominado ‘Candidatus

Magnetomorum litorale’. Os genes dsrAB e aprA, marcadores de

bactérias redutoras de sulfato, foram detectados em DNA isolados de

amostras de ‘Candidatus Magnetomorum litorale’. Este microrganismo

apresentou resposta quimiotáctica positiva a acetato e propionato,

substâncias comumente utilizadas como fontes de energia e carbono por

bactérias redutoras de sulfato (WENTER et al., in press).

1.11. Características gerais da bactéria magnetotáctica

multicelular ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’

A existência de bactérias multicelulares magnetotácticas no

sedimento da Lagoa de Araruama foi relatada por Keim et. al (2004a).

As características de organização celular, ciclo de vida, propriedades

magnéticas, coordenação de movimento e habitat dessa bactéria

multicelular magnetotáctica, somada à análise do rRNA 16S,

28

possibilitaram que a esse organismo fosse dado um nome na categoria

Candidatus (ABREU et al., 2007).

Indivíduos de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ possuem

18 ± 4 células gram-negativas, dispostas em um arranjo esférico (KEIM

et al., 2004a) onde cada célula apresenta uma face exibindo flagelos

(em média 30 por célula) voltados para o meio externo (SILVA et al.,

2007). Possuem faces laterais planas em contato íntimo com as células

adjacentes e uma face voltada para um compartimento interno acelular

(KEIM et al., 2004a).

Sob condições de mudança de pressão osmótica ou quando

expostos à observação prolongada no microscópio óptico, o ‘Ca. M.

multicellularis’ se desagrega em células individuais (Figura 7), que não

apresentam mobilidade (ABREU et al., 2006).

Figura 7 – Microscopia óptica interferencial de Nomarski de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. (a) Organismo intacto. (b) organismo desagregado. Barra = 5 µm (retirado de SILVA et al., 2007).

29

O ciclo de vida proposto para o ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ (Figura 8) sugere que o organismo como um todo

inicialmente aumenta o seu volume por meio do aumento do volume de

suas células. Posteriormente, há uma divisão sincronizada das células,

duplicando o número de células do agregado. Em seguida, as células

alteram sua disposição fazendo com que o agregado adquira uma forma

alongada. Uma constrição é formada na região intermediária dessa

estrutura, levando em seguida à divisão do organismo inicial em dois

novos indivíduos (KEIM et al., 2004b).

Figura 8: Seqüência de micrografias de microscopia eletrônica de varredura ilustrando o ciclo de vida proposto para ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’. (a) microrganismo no início do ciclo, apresentando número reduzido de células. (b) aumento do volume das células. (c) divisão celular. (d) alongamento do microrganismo. (e) constrição do microrganismo na região mediana. (f) divisão em dois microrganismos (retirado de KEIM et al., 2004b).

As células que constituem o ‘Candidatus Magnetoglobus

Multicellularis’ apresentam magnetossomos contendo greigita (Fe3S4)

como mineral magnético (KEIM et al., 2004a), envoltos por membranas

do tipo bicamada lipídica no interior do citoplasma (ABREU et al., 2008).

30

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ possuem flagelos

peritríqueos quando se considera o agregado com um todo. Porém, cada

célula individualmente apresenta flagelos apenas na face voltada para o

ambiente (KEIM et al., 2004a; SILVA et al., 2007).

Microrganismos com morfologia, ultraestrutura e comportamento

semelhante foram descritos em diversas partes do mundo (FARINA et

al., 1983; FARINA, ESQUIVEL & LINS DE BARROS, 1990; RODGERS et

al., 1990; MANN et al., 1990; PÓSFAI et al., 1998a, 1998b; LINS &

FARINA, 1999; GREENBERG et al., 2005; SIMMONS et al., 2004;

SIMMONS, BAZYLINSKI & EDWARDS, 2006; LINS et al., 2007;

SIMMONS & EDWARDS, 2007; WENTER et al., in press).

Quando sob campo magnético aplicado, ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ se desloca como uma unidade em

trajetórias retas ou helicoidais (KEIM et al., 2004a), com o eixo de

simetria alinhado à direção do campo magnético (Vídeo 1), com sentido

antiparalelo, exibindo velocidade de (9 ± 2)x10 µm/s (SILVA et al.,

2007). As trajetórias helicoidais apresentam sentido anti-horário,

acompanhada de rotação do microrganismo ao longo do seu próprio

eixo, também no sentido anti-horário (com o microrganismo se

afastando do observador), sendo que, a cada passo da hélice, a célula

gira 2πrad em torno do seu próprio eixo (KEIM et al., 2007). A reversão

do campo magnético durante a natação causa a reorientação do

organismo em 180º (u-turn).

Se não há restrições para o movimento, ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ e os outros procariotos multicelulares

nadam para frente ao longo das linhas do campo magnético local

segundo trajetórias helicoidais ou aproximadamente retilíneas (free

motion). Quando os ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ atingem

o limite de uma gota d’água, passam a exibir rotação ao longo do seu

próprio eixo (rotation) (Vídeo 2) (ABREU et al., 2007; KEIM et al.,

31

2007), com eventuais e curtas excursões paralelas ao campo magnético

acompanhadas de desaceleração até cessar o movimento, voltando

então a nadar com aceleração crescente em sentido antiparalelo ao

campo (Vídeo 3) (GREENBERG et al., 2005; ABREU et al., 2007; KEIM et

al., 2007). Tais excursões, referidas como trajetórias “ping-pong” ou

“escape motility”, são observadas com maior frequência sob campos

magnéticos elevados em relação ao campo magnético terrestre

(GREENBERG et al., 2005). O movimento de escape (escape motility)

também é observado quando estes microrganismos nadam livremente,

ou seja, sem a existência de uma interface água / ar (GREENBERG et

al., 2005).

Em campos magnéticos menores (da ordem do campo

geomagnético), estes microrganismos passam a exibir um padrão de

movimento chamado “walking”, que consiste em uma trajetória

complexa de “looping”, não alinhada ao campo magnético, realizada

próxima à borda da gota (GREENBERG et al., 2005; ABREU et al., 2007;

KEIM et al., 2007).

32

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Estudar o comportamento e motilidade da bactéria magnetotáctica

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético

aplicado superiores ao campo geomagnético.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Desenvolver uma metodologia que permita quantificar os

parâmetros das trajetórias helicoidais descritas por microrganismos

magnetotácticos (raio, passo da hélice, período, frequência, velocidade

média, velocidade instantânea e velocidade angular) através do uso de

vídeo-microscopia e análise de imagens.

- Quantificar os parâmetros das trajetórias descritas pela bactéria

magnetotáctica ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo

magnético superior ao campo geomagnético.

- Avaliar a resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’

a pulsos de laser ultravioleta e a luz ultravioleta.

33

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Coleta e concentração magnética de ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’

Amostras de água e sedimento na proporção aproximada de 1:1

foram coletadas na Praia da Baleia, localizada no Município de São Pedro

da Aldeia, Estado do Rio de Janeiro, Brasil (Latitude 22º 52’ 10,82” Sul e

Longitude 42º 06’ 40,42” Oeste). A coleta foi realizada com o uso de

recipientes plásticos de 1000 ml e as amostras foram armazenadas no

laboratório à temperatura ambiente e sob iluminação indireta. Os

experimentos de vídeo-microscopia e de resposta ao laser e à luz

ultravioleta foram realizados até duas semanas após a coleta das

amostras.

Indivíduos de ‘Ca. Magnetoglobus multicellularis’ foram

concentrados magneticamente seguindo o protocolo descrito por Lins et

al. (2003). Água e sedimento da lagoa foram introduzidos em um

frasco de vidro especialmente construído para concentrar

microrganismos magnetotácticos, que possui uma abertura superior por

onde a água e o sedimento são introduzidos; e um capilar lateral, por

onde o concentrado de ‘Ca. Magnetoglobus multicellularis’ é retirado

(Figura 9a).

O vidro concentrador abastecido de água e sedimento da Lagoa de

Araruama foi inserido em uma bobina confeccionada manualmente com

o uso de cano de poli-cloreto de vinila (PVC) de 150 mm de diâmetro e

fio de cobre esmaltado de 0.33mm de diâmetro (Figura 9b). Esta

bobina, quando conectada a uma fonte de corrente contínua, produz um

campo magnético homogêneo no seu interior, com direção paralela ao

seu eixo longitudinal. O capilar lateral do vidro concentrador foi

34

orientado de forma antiparalela ao campo magnético gerado pela

bobina. Com isso, ‘Ca. Magnetoglobus multicellularis’ presentes na

amostra nadaram em direção ao capilar lateral, permanecendo ali

concentrados. Foi utilizada a fonte de corrente contínua de 0,5 Ampère.

Com o uso de uma micropipeta, 20µL de concentrado de ‘Ca.

Magnetoglobus multicellularis’ foram recolhidos do capilar lateral do

vidro concentrador e depositados sobre lâmina e lamínula espaçados por

um o-ring de 500µm de espessura (Figura 9c). O tempo de

concentração magnética foi de cinco minutos. Para os experimentos no

laboratório de pinças ópticas, o mesmo volume foi depositado em uma

placa de petri perfurada, com uma lamínula colada no fundo (Figura 9d).

35

Figura 9: Ilustrações dos materiais utilizados para concentrar e observar os ‘Ca. Magnetoglobus multicellularis’. (a) Frasco de vidro utilizado para concentrar microrganismos magnetotácticos preenchido com água e sedimento da lagoa. A amostra é inserida na abertura superior e após a exposição a um campo magnético devidamente orientado, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ concentrados são recolhidos pelo capilar lateral. (b) Bobina e fonte utilizadas para concentrar ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. (c) Amostra concentrada de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ entre lâmina e lamínula separadas por um o-ring de 500µm de espessura para os experimentos de análise das trajetórias helicoidais sob campo magnético aplicado. (d) Placa de Petri perfurada com lamínula aderida ao fundo usada nos experimentos de resposta ao laser UV.

3.2. Produção de campo magnético aplicado para experimentos

de vídeo-microscopia.

Campos magnéticos uniformes e de intensidade controlada para os

experimentos de vídeo-microscopia das trajetórias de ‘Ca.

Magnetoglobus multicellularis’, foram obtidos com o uso de pares de

bobinas eletromagnéticas (Figura 10).

36

Figura 10: Representação esquemática das bobinas eletromagnéticas

A estimativa do campo produzido por um par de bobinas

eletromagnéticas leva em conta o número de espiras (N), o raio interno

(Ri), o raio externo (Re), a espessura (L), a corrente (i) e a distância

entre as bobinas (d), conforme ilustrado na figura 10.

Foram montados dois sistemas distintos de bobinas para a

geração de campos magnéticos de 3,9 e 20,0 Gauss. O primeiro, uma

bobina de Helmholtz, foi acoplado a um microscópio Zeiss universal e o

segundo em um microscópio Zeiss Axioplan 2 (Figura 11a).

Cada par de bobinas foi alimentado por uma fonte de corrente

contínua Instrutherm FA-3005, com tensão de saída variável de zero a

trinta Volts e corrente de saída variável de zero a cinco ampères. As

correntes aplicadas para a geração dos campos magnéticos de 3,9

Gauss e 20,0 Gauss foram, respectivamente, 5 e 0,15 ampères. No

sistema acoplado ao microscópio Zeiss foi adaptada uma peça de acrílico

para a movimentação da lâmina a fim de evitar a influência de campo

magnético gerado pela platina do microscópio, que se encontrava

imantado (Figura 11b). Para facilitar os experimentos, uma chave para

reversão de corrente foi conectada entre a fonte e as bobinas,

permitindo assim a rápida reversão do campo magnético (Figura 11c).

O primeiro sistema de bobinas para a aplicação de campo

magnético (20,0 Gauss) utilizado neste trabalho foi construído fora das

37

condições de bobina de Helmholtz. Entretanto, na região correspondente

ao campo de observação das trajetórias (~1000µm2), as linhas de

campo encontram-se distribuídas de forma uniforme, paralelas à

superfície da lamínula.

Para a aplicação de um campo magnético com intensidade de 3,9

Gauss, um segundo par de bobinas foi construído sob condições

próximas às de uma bobina de Helmholtz, ou seja, Re~Ri e d~Re,. Isso

assegurou a uniformidade do campo aplicado sobre as amostras. Uma

descrição detalhada dos sistemas de bobinas pode ser obtida em

http://omnis.if.ufrj.br/~lpo/Bobina.pdf.

Figura 11: Sistema utilizado para produção de campo magnético aplicado de 3,9 Gauss utilizado para vídeo-microscopia das trajetórias percorridas por ‘Ca. Magnetoglobus multicellularis’. (a) Sistema de vídeo-microscopia com a bobina de Helmholtz acoplada ao microscópio óptico Zeiss Axioplan 2. (b) Peça de acrílico adaptada à platina do microscópio (c) Chave para a reversão de corrente da bobina.

38

3.3. Vídeo-microscopia das trajetórias de ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado

As trajetórias do ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob

campo magnético aplicado foram filmadas com o uso de uma câmera

CCD JVC TK-1270 conectada a um computador equipado com uma placa

de captura de vídeo Pixel View PlayTV. As amostras concentradas

magneticamente foram colocadas entre lâmina e lamínula separadas por

um espaçador de 500µm de diâmetro e observadas por um tempo não

superior a 20 minutos. As análises das trajetórias para cada um dos

valores de campo magnético aplicado foram realizadas a partir de

amostras de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ provenientes de

coletas distintas.

As trajetórias foram filmadas em campo claro, com objetiva de

40x. Os vídeos foram capturados com o uso do software Pinnacle Studio

8, com uma resolução de 320 x 240 pixels, a 30 fps, no formato AVI.

Os vídeos gerados foram processados e analisados utilizando o

aplicativo ImageJ (NIH). Os filmes foram submetidos a um filtro de

background e binarizados. Com o uso da ferramenta Mtrack2, foram

obtidas planilhas com as coordenadas XZ de cada uma das trajetórias

(com o eixo Y paralelo ao eixo óptico do microscópio).

As trajetórias senoidais 2D obtidas foram assumidas como

projeções de trajetórias helicoidais cilíndricas em 3D, possuindo eixo de

simetria paralelo ao campo magnético gerado pelas bobinas acopladas

ao microscópio. Os parâmetros usados para a caracterização das

trajetórias foram escolhidos em concordância com equações que

descrevem a posição do centro de massa do “Ca. M. multicellularis” em

função do tempo em trajetórias helicoidais:

39

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ += ϕπ

TtAX 2cos (2)

tVZZ 00 += (3)

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛ += ϕπ

TtAY 2sin (4)

onde A = raio da hélice cilíndrica (amplitude), t = tempo; T = período;

ϕ = fase arbitrária; Z0

= posição inicial arbitrária no plano Z. A

velocidade de natação (V0) foi obtida a partir da regressão linear do

gráfico Z versus t. O raio (A) e o período (T) foram obtidos por meio de

regressão não linear da posição X versus t. A velocidade ao longo do

traço da trajetória, a qual denominamos velocidade tangencial (Vt), é

dada por:

2

22)2(T

AVtλπ +

= (5)

onde TV ⋅= 0λ (5) define o passo da hélice. Os dados obtidos permitiram a

projeção tridimensional das trajetórias e a verificação da existência de

correlações entre os parâmetros das trajetórias.

3.4. Avaliação da resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ a pulsos de laser ultravioleta e a luz ultravioleta.

Um sistema de pinças ópticas (Figura 12 a-c) consiste em um

microscópio óptico invertido montado sobre uma mesa pneumática anti-

vibração. Sobre a mesma mesa podem ser montados diferentes tipos de

lasers, lentes, espelhos e diafragmas, de modo a permitir que o feixe

gerado pelos lasers penetre de forma controlada no eixo óptico do

40

microscópio, através da abertura de epi-iluminação do sistema de

fluorescência.

Sobre um sistema de pinças ópticas utilizando um laser

infravermelho Nd-YAG de comprimento de onda de 1064nm, foi

acoplado um laser UV (Figura 12c) com comprimento de onda igual a

337,1 nm que gera pulsos de duração inferior a 3.5 ns, com energia de

170µJ por pulso. Este tipo de laser atua como um bisturi óptico. Assim

como o laser infravermelho usado para pinçar objetos, o laser UV foi

posicionado de forma incidir seguindo o eixo óptico do microscópio

através da abertura da epi-iluminação do sistema de fluorescência.

Para os experimentos de resposta ao laser UV, ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ foram concentrados magneticamente por

vinte minutos e depositados sobre uma placa de petri adaptada (Figura

9d).

As amostras foram observadas em um microscópio óptico

invertido Nikon Eclipse TE300 acoplado ao sistema de pinça óptica, na

modalidade campo claro, com o uso de uma objetiva Plan Fluar 100x

com abertura numérica de 1.4. As imagens foram obtidas por uma

câmera CCD Hamamatsu C2400 e digitalizadas por uma placa de

captura de imagens SCION (Figura 7d).

Com o uso de um ímã, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’

foram direcionados para a borda da gota, onde pulsos de laser UV foram

aplicados sobre a amostra.

Sob as mesmas condições dos experimentos de pulsos de laser

UV, a disponibilidade de uma platina motorizada possibilitou o registro

em grande aumento da natação de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ alinhada ao campo magnético gerado por um ímã

posicionado próximo à amostra.

Para a avaliação da resposta à iluminação UV, ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ foram depositados sobre lâmina e

41

lamínula separados por um o-ring e observados ao microscópio Axioplan

2, na modalidade DIC, sob epi-iluminação com lâmpada de mercúrio

com 50W de potência associada a um filtro para selecionar luz UV.

Figura 12 (a-d): Sistema de pinça óptica do Laboratório de Pinças Ópticas da COPEA-UFRJ, situado no Instituto de Ciências Biomédicas / Centro de Ciências da Saúde-UFRJ. (a) Visão geral do sistema de pinça óptica onde pode ser visualizado o microscópio óptico Nikon Eclipse TE 300 sobre uma mesa pneumática anti-vibração Newport. (b) Laser de Neodymium-YAG infravermelho (1064nm). (c) Laser ultravioleta (337,1nm). (d) Sistema de captura e processamento de imagem.

42

4. RESULTADOS

4.1. Trajetórias helicoidais de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ sob campo magnético aplicado

As trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob

campo magnético aplicado foram filmadas a partir de amostras

concentradas magneticamente com o uso de sistema de vídeo-

microscopia equipado com um par de bobinas eletromagnéticas. As

coordenadas xz do centro de massa ao longo das trajetórias de

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ foram obtidas quadro a

quadro, totalizando duzentas trajetórias sob campo magnético aplicado

de 3,9 Gauss e duzentas trajetórias sob campo magnético aplicado de

20,0 Gauss.

Os parâmetros vx (velocidade no eixo x), vz (velocidade no eixo z),

raio (А) e período (Τ) das trajetórias helicoidais foram obtidos a partir

de regressões lineares e não lineares dos gráficos gerados a partir das

coordenadas X(t) e Z(t). Uma das trajetórias analisadas pode ser

observada na figura 13. Os parâmetros velocidade média (ν), velocidade

angular (ω), comprimento de onda (λ), velocidade instantânea (υ) e

ângulo entre velocidade angular e velocidade instantânea (θ) foram

determinados a partir da trajetória. No total, foram analisadas 180

trajetórias sob campo magnético aplicado de 3,9 Gauss e 184 trajetórias

sob campo magnético aplicado de 20 Gauss. As médias são

apresentadas na tabela 1.

43

Tabela 1: Valores médios e erros padrão dos parâmetros das trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ sob campo magnético aplicado

(В)

Campo

magnético

(G s) aus

(А)

Raio

(μm)

(ν)

Velocidade

Média

(μm/s)

(Τ)

Período

(S)

(υ)

Velocidade

Instantânea

(μm/s)

(ω)

Velocidade

Angular

(rad/s)

(λ)

Passo da

Hélice

(μm)

(θ)

Theta

(Graus)

N

3,9 5,0 ± 0,1 (9 ± 1,6)x10 1,1 ± 0,02 (9 ± 1,6)x10 6,0 ± 0,1 (9 ± 3)x10 18,0 ± 0,8 180

20 4,0 ± 0,1 (11 ± 1,9)x10 0,80 ± 0,02 (12 ± 1,8)x10 8,0 ± 0,2 (9 ± 2)x10 16,0 ± 0,5 184

Testes-t (ou probabilidade-t) para dados não-pareados com

variância desigual foram aplicados para verificar a existência de

diferença estatística significativa entre os valores médios obtidos para

cada parâmetro sob os diferentes campos magnéticos aplicados.

Os histogramas do raio das trajetórias sob campos de 3,9 Gauss

(Figura 14a) e 20,0 Gauss (Figura 14b) mostram que no campo

magnético aplicado de maior valor a distribuição do raio se deslocou

para valores menores. O valor obtido no teste-t, 0,00015, (Figura 14c),

indica que as médias são estatisticamente diferentes (o critério usado foi

p<0,05).

Os histogramas para a velocidade média (Figura 15a-b) mostram

que a distribuição foi deslocada para valores maiores quando aplicado o

campo magnético de 20 Gauss. A probabilidade-t para este grupo de

dados (Figura 15c) foi inferior a 0,0001, indicando que a velocidade

média é estatisticamente distinta para cada valor de campo magnético

aplicado.

As figuras 16a e 16b mostram os histogramas de período sob

campo magnético de 3,9 e 20,0 Gauss, respectivamente. As médias são

estatisticamente distintas, com valor de probabilidade-t inferior a

0,0001 (Figura 16c). Os resultados indicam que o período das trajetórias

diminuiu quando foi aplicado o campo magnético de maior intensidade.

44

Assim como a velocidade média (ν), o valor médio obtido para a

velocidade instantânea (υ) foi maior sob campo de 20,0 Gauss. As

distribuições da velocidade instantânea das trajetórias sob 3,9 e 20,0

Gauss são mostradas nas Figuras 17a e 17b. O resultado do teste-t é

apresentado na Figura 17c. O valor de probabilidade-t (<0,0001)

demonstra que as médias são estatisticamente distintas para cada valor

de campo aplicado.

As figuras 18a e 18b apresentam os histogramas da velocidade

angular sob os diferentes campos magnéticos. O resultado do teste-t

(<0,0001) é apresentado na figura 18c. Os resultados indicam que o

valor médio da velocidade angular foi maior sob o campo aplicado de

20,0 Gauss.

O passo da hélice (λ) observado em ambos os campos magnéticos

aplicados apresentou valores médios próximos. O valor da

probabilidade-t <0,7132 indica que as médias não são estatisticamente

distintas. Os histogramas de comprimento de onda e o resultado do

teste-t são apresentados nas figuras 19a-c.

O ângulo médio entre a velocidade angular (ω) e a velocidade

instantânea (υ) também foi distinto para cada valor de campo

magnético aplicado. Os histogramas de θ para os campos aplicados são

apresentados nas figuras 20a e 20b. O resultado do teste-t é

apresentado na figura 20c. O valor da probabilidade-t (0,0001) indica

que as médias obtidas sob os diferentes campos magnéticos são

estatisticamente distintas.

4.2. Resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ a

pulsos de laser ultravioleta

Os experimentos de resposta a pulsos de laser ultravioleta foram

realizados em um sistema de pinças ópticas conectado a um sistema de

aquisição de imagem.

45

Amostras de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’

concentrados magneticamente foram depositadas sobre uma lamínula e

observadas no microscópio em campo claro. Com o uso de um ímã,

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ foram direcionados para uma

das extremidades da gota d’água, acumulando-se em múltiplas fileiras.

Exatamente no plano focal da interface ar-água, foi observada somente

uma fileira de microrganismos. Poucos micrômetros a partir da interface

ar-água, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ foram observados

em mais de um plano focal.

Nessas condições, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’

apresentaram rotação em torno do seu próprio eixo com diferentes

sentidos e velocidades. Eventos de escape motility não foram

observados entre os microrganismos acumulados na região

imediatamente adjacente à interface ar-água, dentro do campo de

aquisição de imagem (Vídeo 4, frames 1-359).

Um pulso de laser ultravioleta com duração inferior a 3,5ns foi

aplicado sobre a amostra. O efeito da interação do pulso de laser com

um dos indivíduos de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ pode

ser visualizado durante 0,16s (Figura 21; Vídeo 4, frames 360-364).

Imediatamente após esse intervalo de tempo foi observada uma

resposta coletiva em que os microrganismos não atingidos diretamente

pelo laser nadaram no sentido oposto, afastando-se da borda da gota.

Após 2,5s, apenas dois indivíduos permaneciam no campo de visão, sem

apresentar motilidade (Figura 22; Vídeo 4, frame 437).

Aproximadamente 10 segundos após a aplicação do pulso de laser

UV, ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ voltaram a se acumular

na interface ar-água e, após 20s, a densidade de microrganismos na

borda da gota encontrava-se comparável com a observada antes do

pulso (Vídeo 4, frame 1137).

46

Os danos causados aos ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’

diretamente alvejados pelo pulso de laser UV podem ser observados na

figura 23 e no Vídeo 4 (frames 700-1235). Um pequeno grupo de

células foi destacado do arranjo esférico, permanecendo aderidas ao

microrganismo, possivelmente expondo o compartimento interno

acelular para o meio externo (Figura 23).

Um segundo pulso de laser UV foi aplicado sobre a amostra (vídeo

4, frames 1242-1248). O efeito coletivo novamente foi observado.

Contudo, dois indivíduos atingidos pelo laser permaneceram no campo

de observação apresentando rotação em torno do seu próprio eixo com

velocidade muito superior à observada quando ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ se encontram na interface ar-água.

(Vídeo 4, frames 1297- 1663). Várias células encontravam-se

destacadas do arranjo esférico, porém, ainda conectadas ao agregado.

Após aproximadamente 12 segundos não foi mais observada motilidade

nesses indivíduos.

Um terceiro pulso de laser (Vídeo 4, frame 1940) foi aplicado

sobre a amostra, atingindo um indivíduo já desagregado pelos pulsos de

laser anteriores. A resposta coletiva dos demais indivíduos foi menos

intensa que a observada nos dois primeiros pulsos (Vídeo 4, frames

1940-2691).

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis expostos a iluminação

com lâmpada HBO demonstraram resposta fóbica à luz UV, porém, de

forma menos intensa à observada na aplicação de pulsos de laser UV

(Vídeo 5). Quando iluminados com lâmpada de tungstênio, apresentam

alteração de motilidade (rotation) quando um filtro verde é posicionado

entre a fonte de luz e a amostra (Vídeo 6). A natação ao longo do

campo magnético aplicado em grande aumento é mostrada nos vídeos 7

e 8.

47

PRANCHA 1

48

Figura 13: Trajetória helicoidal de um indivíduo de ‘Candidatus

Magnetoglobus multlicellularis’ sob campo magnético aplicado de 20,0

Gauss.

(a) Ajuste linear da posição x(t) de uma trajetória helicoidal à

função , onde B corresponde à velocidade no eixo X. BAxy +=

(b) Ajuste não linear da posição z(t) da mesma trajetória em

função de ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+++= 5

4321

2cos PP

xPxPPy π . Os parâmetros P2, P3 e P4

correspondem, respectivamente, à velocidade no eixo Z, ao raio e ao

período da trajetória. A velocidade de natação é dada por 22zx vvv += .

49

50

PRANCHA 2

51

Figura 14: Raio das trajetórias (А) de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ sob campo magnético aplicado.

(a) Histograma do raio das trajetórias helicoidais sob campo

magnético aplicado de 3,9 Gauss.

(b) Histograma do raio das trajetórias helicoidais sob campo


(c) Resultado do teste-t entre o raio das trajetórias de ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado de 3,9

Gauss e 20,0 Gauss.

52

53

PRANCHA 3

54

Figura 15: Velocidade média (ν) das trajetórias helicoidais de


aplicado.

(a) Histograma da velocidade média sob campo magnético

aplicado de 3,9 Gauss.

(b) Histograma da velocidade média sob campo magnético

aplicado de 20,0 Gauss.

(c) Resultado do teste-t entre a velocidade média das trajetórias

de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético

aplicado de 3,9 Gauss e 20,0 Gauss.

55

56

PRANCHA 4

57

Figura 16: Período (Τ) das trajetórias helicoidais de ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético aplicado

(a) Histograma do período das trajetórias helicoidais sob campo


(b) Histograma do período das trajetórias helicoidais sob campo


(c) Resultado do teste-t entre o período das trajetórias de



58

59

PRANCHA 5

60

Figura 17: Velocidade instantânea (υ) das trajetórias helicoidais de


aplicado.

(a) Histograma da velocidade instantânea das trajetórias

helicoidais sob campo magnético aplicado de 3,9 Gauss.

(b) Histograma da velocidade instantânea das trajetórias

helicoidais sob campo magnético aplicado de 20,0 Gauss.

(c) Resultado do teste-t entre a velocidade instantânea das

trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo

magnético aplicado de 3,9 Gauss e 20,0 Gauss.

61

62

PRANCHA 6

63

Figura 18: Velocidade angular (ω) das trajetórias helicoidais de


aplicado.

(a) Histograma da velocidade angular das trajetórias sob campo


(b) Histograma da velocidade angular das trajetórias sob campo


(c) Resultado do teste-t entre a velocidade angular das trajetórias

de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob campo magnético


64

65

PRANCHA 7

66

Figura 19: Passo da hélice (λ) das trajetórias helicoidais de


aplicado.

(a) Histograma do passo da hélice das trajetórias helicoidais sob

campo magnético aplicado de 3,9 Gauss.

(b) Histograma do passo da hélice das trajetórias helicoidais sob

campo magnético aplicado de 20,0 Gauss.

(c) Resultado do teste-t entre o passo da hélice das trajetórias de



67

68

PRANCHA 8

69

Figura 20: Ângulo entre a velocidade angular e a velocidade

instantânea (θ) das trajetórias helicoidais de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ sob campo magnético aplicado.

(a) Histograma do ângulo entre a velocidade angular e a

velocidade instantânea das trajetórias sob campo magnético aplicado de

3,9 Gauss.

(b) Histograma do ângulo entre a velocidade angular e a


20,0 Gauss.

(c) Resultado do teste-t do ângulo entre a velocidade angular e a


3,9 Gauss e 20,0 Gauss.

70

71

PRANCHA 9

72

Figura 21: Série de imagens de vídeo-microscopia demonstrando o

efeito da aplicação do pulso de laser ultravioleta sobre um ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’. As setas indicam uma alteração

morfológica na região de incidência do laser sobre o microrganismo.

Barra de escala=6,6µm.

73

74

PRANCHA 10

75

Figura 22: Série de imagens de vídeo-microscopia mostrando os

2,7 segundos subsequentes à aplicação do pulso de laser ultravioleta

sobre a amostra de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’. Observa-

se que apenas dois microrganismos permanecem imóveis na região

observada. Barra de escala=30µm.

76

77

PRANCHA 11

78

Figura 23: ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ diretamente

atingido pelo pulso de laser ultravioleta. Um grupo de células se

encontra destacado do arranjo. Barra de escala=3,3µm.

79

80

5. DISCUSSÃO

Dados das trajetórias de bactérias, tais como comprimento de

onda, diâmetro da hélice, período da trajetória helicoidal e período da

rotação do microrganismo sobre seu próprio eixo, são muito difíceis de

obter em bactérias de tamanho regular (~1 µm), por causa do limite de

resolução do microscópio ótico (~ 0,2 µm). Por outro lado, procariotos

flagelados de tamanho grande (> 5 µm), cujas trajetórias são mais

facilmente observadas ao microscópio ótico, não são cultivados até o

momento. Algumas vezes, estes microrganismos ocorrem em grandes

números na interface entre a água e o sedimento de ambientes

marinhos, de onde podem ser coletados e estudados (ver, por exemplo,

FENCHEL, 1994 e FENCHEL & THAR, 2004). Dadas as dificuldades e o

pequeno número de microrganismos estudados, o estudo do movimento

de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ vem, portanto, contribuir

para o entendimento do movimento dos procariotos flagelados.

Os parâmetros que descrevem a natação em trajetórias helicoidais

(free motion) da bactéria magnetotáctica multicelular ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ sob dois campos magnéticos aplicados

(3,9 e 20 Gauss), ambos superiores ao campo geomagnético local (~0,2

Gauss), foram quantificados. A metodologia aplicada permitiu a análise

eficiente de um grande número de trajetórias através de vídeo-

microscopia e processamento de imagem, tendo atingido o objetivo de

gerar dados dos parâmetros das trajetórias.

5.1. Vantagens e desvantagens da nova metodologia

desenvolvida para o estudo do movimento de microrganismos

As técnicas de microscopia desenvolvidas no último século

permitiram a obtenção de uma grande quantidade de informações em

relação ao movimento dos microrganismos. O baixo contraste observado

81

em imagens obtidas por microscopia de campo claro, que limitava a

observação de microrganismos vivos, foi suplantado pelo

desenvolvimento de técnicas como o contraste de fase, campo escuro e

contraste por interferência diferencial (DIC).

Além da óptica dos microscópios em si, os sistemas de registro,

armazenamento e análise de imagens evoluíram muito. A micrografia de

longo tempo de exposição e a cine-fotomicrografia deram lugar a

câmeras de vídeo, detectores CCD, dispositivos digitais de captura,

armazenamento e processamento de imagem.

O grande desenvolvimento tecnológico da vídeo-microscopia se

reflete nos elevados custos dos sistemas oferecidos pelas empresas de

microscopia e de equipamentos científicos. Contudo, a adaptação de

equipamentos não necessariamente desenvolvidos para o uso específico

em vídeo-microscopia pode proporcionar bons resultados para

aplicações que não careçam de sistemas de alto desempenho.

A metodologia aplicada no presente trabalho é um exemplo de

como dispositivos de vídeo desenvolvidos para uso doméstico e

encontrados no mercado a preços acessíveis podem ser empregados na

vídeo-microscopia.

Câmeras fotográficas digitais podem ser adaptadas a um

microscópio com relativa facilidade. A atual resolução e freqüência de

captura dessas câmeras (em torno de 720x480 pixels e 30 fps)

possibilitam a sua aplicação com finalidades que vão desde um mero

registro qualitativo até a obtenção de dados quantitativos do espécime,

como os obtidos no presente trabalho.

Placas profissionais de captura digital de imagem e computadores

com elementos de hardware e software específicos para a aplicação em

vídeo-microscopia analítica podem também ser substituídos por placas e

programas domiciliares para captura e conversão de vídeos a partir de

dispositivos analógicos, como gravadores de videocassete. Somado a

82

isso, o desenvolvimento e distribuição on line de softwares freeware

como o ImageJ (NIH) proporcionaram uma alternativa de custo zero em

relação aos onerosos aplicativos de análise de imagens disponíveis no

mercado.

A metodologia aplicada para o estudo das trajetórias helicoidais de

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ constitui uma alternativa

eficiente e de baixo custo aos protocolos comumente utilizados no

estudo do movimento de microrganismos, como micrografia com longo

tempo de exposição e reprodução da natação quadro a quadro

diretamente de um monitor com o uso de filmes plásticos transparentes.

Uma das maiores dificuldades encontradas no estudo do

movimento de microrganismos reside no fato de que suas dimensões

pequenas requererem o uso de objetivas de grande aumento. Sob tais

condições, a reduzida profundidade de campo faz com que seja difícil

manter um microrganismo em foco enquanto nada. Por outro lado,

reduzir o espaço disponível para a natação no eixo Y (paralelo ao eixo

óptico do sistema) pode influenciar a motilidade devido ao aumento do

arrasto hidrodinâmico e, até mesmo, causar a adesão dos

microrganismos à lâmina ou lamínula. Sistemas de vídeo-microscopia

capazes de manter em foco bactérias com dimensões compatíveis às de

E.coli são relatados na literatura (BERG, 1971; THAR, NICHOLAS &

KÜHL, 2000). Contudo, tratam-se de aparatos complexos não

disponíveis comercialmente.

A vídeo-microscopia de bactérias magnetotácticas sob campo

magnético aplicado demonstra-se mais simples devido ao fato do campo

magnético fazer com que as trajetórias fiquem alinhadas de forma

aproximadamente paralela ao plano da superfície da lamínula. Isso faz

com que a posição do microrganismo varie pouco no eixo Y,

possibilitando o uso de objetivas de maior aumento e,

83

conseqüentemente, proporcionando a aquisição de dados com maior

resolução espacial.

O acompanhamento das trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ sob campo magnético aplicado em grande aumento

(objetiva de 100x) pôde ser obtido com o uso de uma platina

motorizada (Vídeos 7 e 8). O resultado preliminar demonstrou-se

promissor para o estudo mais detalhado das peculiaridades da natação

desse microrganismo, como o sentido de rotação do microrganismo em

torno do seu próprio eixo.

Outra ferramenta que pode fornecer informações relevantes em

relação à coordenação da rotação dos flagelos é a microscopia de

fluorescência. TUNER, RYU & BERG (2000) e BERG et al. (2007)

obtiveram importantes resultados em relação à dinâmica da rotação do

flagelo de E. coli. utilizando essa técnica. A provável dificuldade desse

tipo de ensaio em ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ é o

reduzido comprimento e a alta densidade de flagelos em comparação à

E. coli. ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ possui em média 30

flagelos por célula, com comprimento variando entre 0,9 e 3,8µm e

diâmetro entre 12 e 20nm (SILVA et al., 2007). E.coli possui 3±2

filamentos por célula com comprimento de 6±3µm (TUNER, RYU &

BERG, 2000). Além disso, os filamentos flagelares de ‘Ca.

Magnetoglobus multicellularis’ nunca completam um comprimento de

onda, diferentemente dos vários comprimentos de onda observados nos

flagelos de E.coli.

84

5.2. Quantificação dos parâmetros das trajetórias helicoidais de

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ nos dois diferentes

campos magnéticos aplicados, e suas implicações para o

movimento

A literatura existente até o momento pertinente ao estudo do

movimento da bactéria magnetotáctica ‘Candidatus Magnetoglobus

Multicellularis’ caracteriza os tipos de movimentos realizados por este

microrganismo em quatro categorias: movimento livre (free motion),

rotação (rotation), motilidade de escape (escape motility) e caminhada

(walking) (KEIM et al. 2006).

Em relação à natação alinhada a linhas de campo magnético

aplicado (free motion), Keim et al. (2004a) relatou que este tipo de

movimento poderia se dar em trajetórias retilíneas ou helicoidais. A

metodologia adotada por Keim et al. (2004a) para o estudo das

trajetórias utilizou microscopia de campo escuro em baixo aumento e

micrografia com longo tempo de exposição.

No presente trabalho não foram observadas trajetórias retilíneas.

Um dos critérios adotados durante a análise das trajetórias helicoidais

foi o registro de pelo menos um passo de hélice no campo de visão do

microscópio, que mede 155x116 µm. Trajetórias com comprimento igual

ou inferior a ¼ de comprimento de onda foram observadas, porém, não

analisadas.

Os valores médios obtidos para o passo da hélice das trajetórias

foram muito superiores aos valores médios de raio; e as médias de

velocidade de natação e velocidade instantânea foram próximas entre si

sob ambos os campos. O elevado valor de passo da hélice em

comparação com o valor do raio das trajetórias poderia fazer com que

trajetórias com raio próximo ao limite inferior da distribuição para este

parâmetro (~1,0µm) fossem registradas como trajetórias retilíneas

85

quando registradas em micrografias obtidas em campo escuro com

longo tempo de exposição. Nesse caso, as trajetórias retilíneas relatadas

por Keim et al. (2004a) poderiam ser trajetórias helicoidais com raio

pequeno e/ou passo da hélice muito grande.

Os valores encontrados para passo da hélice e raio da trajetória

demonstram que as trajetórias helicoidais em ambos os campos são

alongadas. Isso indica grande eficiência na coordenação da rotação dos

flagelos para a natação avante nesses microrganismos. Assim como os

resultados obtidos por Winklhofer et al. (2007), que demonstram um

elevado grau de otimização magnética em ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ (~80%), nossos resultados demonstram um elevado

grau de otimização do movimento avante. Também do mesmo modo

que a otimização magnética (WINKLHOFER et al., 2007), a otimização

do movimento avante implica em um nível elevado de organização entre

as células que compõem os indivíduos de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’.

Sob o campo magnético de 20,0 Gauss, as trajetórias

apresentaram médias superiores tanto para a velocidade média quanto

para a velocidade instantânea. As médias para o raio e para o ângulo θ

sob 20,0 Gauss, inferiores aos obtidos sob 3,9 Gauss, indicam que a

hélice descrita sob esse valor de campo magnético aplicado é mais

estreita quando comparada com as trajetórias descritas sob 3,9 Gauss.

O passo da hélice não variou de forma significativa com o aumento

do campo magnético aplicado. Como o raio sob 20,0 Gauss foi menor, a

distância percorrida durante cada passo de hélice foi inferior sob esta

intensidade de campo aplicado. Tais dados indicam que a natação

avante se torna ainda mais eficiente com o aumento do campo

magnético aplicado, visto que a bactéria nada menos no plano

perpendicular ao eixo de simetria da hélice e percorre uma distância

menor ao longo da trajetória helicoidal, para uma mesma velocidade

86

média. O período necessário para cada passo da hélice sob 20,0 Gauss

também foi menor. A figura 24 apresenta um resumo da variação dos

parâmetros para os diferentes campos magnéticos aplicados.

Figura 24: Comparação da variação dos parâmetros das trajetórias helicoidais de ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ sob 3,9 e 20,0 Gauss.

O ligeiro aumento da eficiência da natação avante sob campo de

20,0 Gauss poderia ser resultado de um maior alinhamento passivo do

microrganismo às linhas de campo magnético ou de alguma influência

sobre a rotação dos flagelos causada pela intensidade do campo

magnético.

Apesar das diferenças entre os valores médios encontrados para

raio da hélice, velocidades média e instantânea, período, velocidade

angular e ângulo θ, a forma dos histogramas de distribuição dos

parâmetros das trajetórias de ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’

não sofreram grandes alterações entre os diferentes campos magnéticos

aplicados. Houve apenas um deslocamento das médias para mais ou

para menos dependendo do parâmetro, o que indica que as diferenças

87

encontradas entre os dados obtidos sob dois campos magnéticos

distintos são reais, e não artefatos metodológicos.

Greenberg et al. (2005) demonstraram que o escape motility em

um procarioto magnetotáctico multicelular é influenciado pela

intensidade do campo magnético aplicado. O escape motility raramente

ocorre sob campos magnéticos baixos, sendo que a probabilidade de tal

evento ocorrer aumenta com o módulo do campo magnético aplicado. A

variação na aceleração observada durante esse movimento não pode ser

explicada pelo modelo de torque passivo, o que sugeriu que este

microrganismo apresenta algum tipo de magnetorrecepção.

A alteração dos parâmetros que descrevem a trajetória helicoidal

de ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ não pode ser explicada

apenas por um maior alinhamento passivo do microrganismo em relação

ao campo, pois nesse caso, os valores médios do passo da hélice seriam

diferentes para cada valor de campo magnético aplicado.

Lins de Barros, Farina & Esquivel (1990) demonstraram que a

velocidade de natação de bactérias magnetotácticas aumenta até certo

ponto com o aumento do campo magnético aplicado. As médias de

velocidade obtidas para cada valor de campo se sobrepõem a uma curva

ajustada a partir da Função de Langevin. Tal modelo parte do

pressuposto de que uma população de bactérias magnéticas pode ser

comparada a uma distribuição de dipolos magnéticos submetidas a

interações térmicas. Uma vez que uma célula encontra-se

suficientemente distante da outra, o modelo físico será idêntico ao

adotado para descrever materiais paramagnéticos.

Os dados do presente trabalho sugerem que a intensidade do

campo magnético aplicado influencia a natação de ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ de alguma forma além da orientação

passiva, o que é evidenciado pelas diferenças encontradas nos

parâmetros das trajetórias.

88

O fato de que as medidas sob os diferentes campos magnéticos

foram obtidas a partir de amostras distintas oriundas de diferentes

coletas não pode ser desconsiderado. As condições ambientais no

momento das coletas podem ter influenciado a motilidade dos

microrganismos e, consequentemente, alterado o formato das

trajetórias. Nesse caso, seria esperado que, entre as amostras, um ou

mais parâmetros apresentasse diferença significativa na sua

distribuição. Mesmo entre diferentes amostras de uma mesma coleta

poderia haver variações, pois o microambiente onde vivem os

microrganismos pode variar em distâncias da ordem de micrômetros.

Para a comprovação da hipótese de um mecanismo de

magnetorrecepção sensível ao módulo do campo aplicado em

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’, experimentos realizados a

partir de uma mesma amostra serão necessários. A análise das

trajetórias sob um número maior de campos magnéticos com

intensidades distintas pode fornecer informações indicando a partir de

que intensidade de campo magnético os parâmetros na natação são

alterados.

No sedimento de ambientes aquáticos, onde os ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ e outros procariotos magnéticos

multicelulares são encontrados, existem muitos obstáculos físicos à

natação unidirecional: os grãos de sedimento. Dessa forma, estes

microrganismos devem ter mecanismos para desviar desses obstáculos.

‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ possui flagelos com

comprimento médio de 2,4±0,5µm. Sob a influência do campo

magnético terrestre, os flagelos curtos causam desalinhamento da

trajetória, fazendo com que a bactéria altere a sua direção de natação

quando, por exemplo, se choca com um obstáculo no meio (NOGUEIRA

E LINS DE BARROS, 1995; FRANKEL et al., 1997). Isso é evidenciado no

vídeo 8, onde microrganismos que se chocam com obstáculos enquanto

89

nadam alinhados a um campo magnético gerado por um ímã conseguem

facilmente contornar o obstáculo e seguir nadando avante.

As velocidades observadas sob condições aeróbias e sob campo

magnético aplicado superior ao campo geomagnético utilizados neste

trabalho não correspondem necessariamente às observadas no

ambiente. O campo geomagnético no local da coleta é muito inferior aos

campos utilizados no presente estudo. O fato dos experimentos terem

sido realizados sob condições aeróbias também pode ter influenciado os

valores obtidos para os parâmetros de natação helicoidal.

5.3. Comparação do movimento de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ com o de outras bactérias

A maioria das bactérias encontradas em ambientes marinhos com

gradiente vertical de oxigênio apresenta elevada velocidade de natação,

o que pode ser considerado uma adaptação comum a este tipo de

ambiente (FENCHEL & THAR, 2004). São exemplos Ovobacter propellens

e Thiovulum majus, ambas as bactérias flageladas e de tamanho grande

relativamente à maioria dos procariotos (FENCHEL, 1994; FENCHEL &

THAR, 2004). ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ também se

encontra em ambiente com estratificação vertical de oxigênio e

apresenta alta velocidade de natação. O tamanho relativamente grande

do indivíduo multicelular permitiu o estudo das trajetórias deste

microrganismo utilizando microscopia ótica de campo claro, mesmo

sendo as células individuais de tamanho normal (~1µm de diâmetro).

A natação em trajetórias helicoidais é um fenômeno comumente

observado em microrganismos com dimensões entre 5 e 500µm

(CRENSHAW, 1999a). Purcell (1977) sugere que microrganismos

propelidos por estruturas cilíndricas como cílios e flagelos sob regime de

90

baixo número de Reynolds tendem a nadar em trajetórias helicoidais,

pois qualquer falta de uniformidade no corpo do microrganismo pode

gerar uma componente rotacional no movimento.

A razão pela qual as bactérias com dimensões da ordem de 1µm

não nadam em trajetórias helicoidais se dá pelo fato de que a

componente rotacional é mais afetada pelo movimento browniano

(BERG, 1983; FENCHEL, 1994; FENCHEL & THAR, 2004). Como tal

efeito é inversamente proporcional ao cubo do diâmetro celular,

microrganismos apresentando diâmetros maiores são menos afetadas

pela energia térmica do meio (FENCHEL, 1994). ‘Candidatus

Magnetoglobus Multicellularis’, Ovobacter propellens e Thiovulum majus

possuem dimensões grandes o suficiente para que a componente

rotacional de suas trajetórias seja pouco afetada pelo movimento

browniano.

A bactéria Ovobacter propellens possui diâmetro entre 4 e 5µm,

formato ovóide, parede celular Gram-negativa, e um proeminente tufo

de flagelos. Essas bactérias comumente nadam com velocidades entre

0,6 e 0,7mm/s, sendo observados indivíduos que nadam a 1mm/s. A

trajetória da natação consiste em uma hélice com sentido anti-horário

(com o microrganismo se afastando do observador). O momento

angular dos motores dos flagelos faz com que a célula gire no sentido

horário. As trajetórias possuem raio entre 2 e 3µm, com passo da hélice

entre 5 e 10µm e período entre 0,1 e 0,2s. As células podem alterar a

direção de natação de forma abrupta, mas sem realizar tumble. Isso

ocorre através da alteração da razão entre a velocidade de natação e a

velocidade instantânea. Tipicamente, as células realizam curvas de

180°, mas são observadas alterações da direção de natação com

ângulos entre 110° e 270° (FENCHEL, 1994; FENCHEL & THAR, 2004).

A bactéria Thiovulum majus possui diâmetro entre 5 e 25µm,

apresenta flagelos peritríqueos e, assim como ‘Candidatus

91

Magnetoglobus multicellularis’ e Ovobacter propellens, nada em

trajetórias helicoidais. Tanto a trajetória quanto a célula giram no

sentido anti-horário (com a bactéria de afastando do observador). O raio

das trajetórias varia entre 5 e 40µm, com passo da hélice entre 40 e

250µm. O período varia entre 0,2 e 1s. A velocidade tangencial varia

entre 150 e 600µm/s, com velocidades máximas obtidas sob condições

de O2 que excedem a concentração ótima. Em experimentos sob

condições de gradiente de oxigênio, as células que nadam para fora da

banda realizam um u-turn de 150-200µm, o que faz com que retornem

para a banda (FENCHEL, 1994). A tabela 2 apresenta os valores de

alguns dos parâmetros das trajetórias helicoidais de ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’, Ovobacter propellens e Thiovulum majus

e os dados disponíveis para E. coli, para comparação.

Tabela 2: Parâmetros da natação helicoidal de bactérias de ambiente marinho com estratificação vertical de oxigênio. Dados de E. coli

estão na tabela para comparação.

Bactéria Diâmetro

(μm)

Velocidade

(μm/s)

Rotação da

Trajetória

Rotação do

microrganismo

Raio da

Trajetória

(μm/s)

Passo da

Hélice (μm) Período (s) Refs.

Ovobacter

propellens 4‐5 600‐700 Anti‐horária Horária 2‐3 5‐10 0,1‐0,2

FENCHEL &

THAR, 2004

Thiovulum majus 5‐25 150‐600 Anti‐horária Anti‐horária 5‐40 40‐250 0,1‐1,0 FENCHEL,

4 199

*KEIM et al.,

2004b;

*KEIM et al., ‘Candidatus

Magnetoglobus

Multicellularis’

6‐9,5* 30‐170** Anti‐horária* Anti‐horária* 1‐10** 20‐200** 0,8‐1,0** 2006

**ESTE

TRABALHO

DARNTON et

al., 2007 Escherichia coli 2,5 x 0,9 29 ± 6 Horária

92

Os valores médios obtidos para os raios das trajetórias de

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ (5 e 4µm sob os campos

magnéticos de 3,9 e 20,0 Gauss, respectivamente) são também muito

próximos aos valores médios do raio dos microrganismos, entre 3 e 5

µm (KEIM et al., 2004b). De modo similar, os valores de raio do

microrganismo e da trajetória são relativamente próximos em Ovobacter

propellens e Thiovulum majus. Se a semelhança entre estes valores é

mera coincidência ou resultado do mecanismo de propulsão destes

microrganismos, permanece uma questão a ser respondida.

‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ apresenta a rotação da

trajetória helicoidal e do corpo no mesmo sentido. Essa característica,

também observada em Thiovulum majus, pode ser consequência do tipo

de flagelação. Thiovulum majus apresenta flagelos curtos (comprimento

total menor que o comprimento de onda), com distribuição peritríquea

(DE BOER, RIVIÈRE & HOUWINK; 1961; SILVA et al., 2007). Se

considerarmos o microrganismo como um todo, ‘Candidatus

Magnetoglobus Multicellularis’ apresenta esse mesmo tipo de flagelação

(SILVA et al., 2007). Ovobacter propellens apresenta rotação da

trajetória e da célula em sentidos opostos. Apesar de possuir dimensões

próximas às do ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ e Thiovulum

majus, Ovobacter propellens apresenta um tipo de flagelação distinta,

caracterizada por um proeminente tufo de flagelos emergindo de um dos

lados da célula. Para organismos propelidos por flagelos lofotríqueos

(tufo de flagelos emergindo de um ponto da célula), como Ovobacter

propellens, a frequência de rotação do corpo é proporcional à frequência

de rotação do flagelo. Contudo, não se pode afirmar o mesmo para

microrganismos com flagelação peritríquea (com flagelos emergindo de

diferentes pontos da superfície celular).

A comparação entre os parâmetros das trajetórias helicoidais

entre ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’, Thiovulum majus e

93

Ovobacter propellens sugere que o padrão de distribuição dos flagelos

pode ter implicação no passo da hélice das trajetórias. Candidatus e

Thiovulum, que possuem flagelos peritríqueos, apresentam valores de

passo da hélice bem maiores e bem mais próximos entre si quando

comparados com Ovobacter (Tabela 2). A rotação da célula e da

trajetória no mesmo sentido parece ser também consequência desse

tipo de distribuição de flagelos.

Apesar de Thiovulum majus e ‘Candidatus Magnetoglobus

Multicellularis’ possuírem o mesmo padrão de movimento, distribuição e

tamanho de flagelos (DE BOER, RIVIÈRE & HOUWINK; 1961; SILVA et

al., 2007), Thiovulum majus apresenta velocidade de natação bastante

superior à observada em ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’

(150-600µm/s). Isso pode ser consequência da fisiologia do

microrganismo, ou ainda de uma maior eficiência na coordenação dos

flagelos em Thiovulum majus, dada a sua natureza unicelular.

Por outro lado, a natação em ‘Candidatus Magnetoglobus

Multicellularis’ pressupõe um mecanismo mais complexo de controle da

rotação dos flagelos, dada a sua natureza multicelular. A coordenação

da rotação dos flagelos entre as diferentes células que constituem o

‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ seria, nesse caso, menos

eficiente que a observada em Thiovulum majus.

5.4. Resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ a

pulso de laser e luz ultravioleta.

OBERPICHLER et al. (2008) classifica a resposta de bactérias à luz

em três tipos: escotofóbica, fotocinética e fototáctica (HÄDER, 1987;

RAGATZ et al., 1994; 1995; GEST, 1995). A resposta escotofóbica é

caracterizada por uma ‘fobia ao escuro’: bactérias que nadam para

94

regiões onde a intensidade da luz é reduzida realizam tumble, cessam o

movimento ou revertem a direção de natação. A fotocinese é descrita

como uma alteração na taxa de motilidade, ou seja, na velocidade do

movimento causada por diferenças na intensidade da luz. A resposta

fototáctica, por sua vez, consiste na orientação do movimento da

bactéria em resposta a uma fonte de luz.

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’, quando concentrados

magneticamente na borda de uma gota d’água, apresentam resposta

claramente fotocinética quando realiza movimento do tipo Rotation: as

células passam a girar mais lentamente em torno do seu próprio eixo

quando um filtro verde é posicionado entre a fonte de luz e a amostra

(Vídeo 6). Contudo, as respostas observadas em ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ quando expostos a pulsos de laser e à luz

ultravioleta não se enquadram perfeitamente em nenhuma das

respostas de microrganismos à luz descritas acima.

No caso do laser ultravioleta, houve a morte do indivíduo atingido

diretamente (como esperado) e um efeito coletivo dos microrganismos

próximos, que nadaram na direção oposta, retornando após vários

segundos. Como houve a morte do indivíduo diretamente atingido pelo

laser, há a possibilidade de que alguma substância liberada pela lise

celular tenha induzido a resposta fóbica. Contudo, mesmo atingindo

novamente o mesmo microrganismo já morto, a resposta ocorre, mas

após algumas repetições o efeito diminui. O fato de que uma resposta

similar foi observada com luz UV, que não induziu a morte de nenhum

indivíduo durante a observação, sugere que um mecanismo de

adaptação, similar ao utilizado em quimiotaxia, está presente.

A adaptação em quimiotaxia ocorre quando a sensibilidade do

receptor diminui, fazendo com que uma concentração maior do ligante

seja necessária para produzir a mesma resposta. A adaptação permite

às bactérias quimiotácticas seguir um gradiente de concentração

95

utilizando um mesmo receptor, desde a menor até a maior

concentração, pois o receptor vai se “adaptando” às concentrações

crescentes do ligante (perdendo sensibilidade) pelo caminho (MADIGAN

& MARTINKO, 2006).

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ é encontrado

predominantemente no sedimento, onde a incidência de luz é pequena

ou inexistente. Quando observado ao microscópio óptico, a exposição à

luz parece ter um efeito deletério: amostras observadas durante longo

tempo perdem progressivamente a motilidade. É provável que a luz,

sobretudo a UV, constitua um fator de estresse para estes

microrganismos. As diferenças observadas entre a resposta da aplicação

da luz e do laser UV provavelmente se dão em função da densidade de

energia luminosa aplicada sobre a amostra.

Alterações na motilidade de bactérias em função da exposição à

luz UV são relatadas na literatura. Cianobactérias, por exemplo, são

extremamente sensíveis à luz ultravioleta, mesmo sob níveis ambientais

de UV-B. Sob condições de luz solar, tanto a motilidade quanto a foto-

orientação são afetadas. Halobacterium ssp., uma bactéria heterotrófica

de ambientes hipersalinos, reverte a direção de movimento quando sai

de regiões iluminadas com luz verde ou quando penetra em regiões

iluminadas com luz ultravioleta ou azul. Similarmente ao observado em

nossos resultados, a iluminação UV causa a dispersão dos indivíduos do

campo de observação (HÄDER, 1987).

A similaridade da resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ ao laser e à luz ultravioleta com o “escape motility” é

muito grande: ambas envolvem movimento no sentido oposto, seguido

de “free motion”. Apesar do nome, até o momento não há qualquer

evidência de que o “escape motility” seja uma resposta a estímulos

negativos ou prejudiciais. A resposta ao ultravioleta seria a primeira

evidência neste sentido.

96

6. CONCLUSÕES

• Os parâmetros que descrevem a natação em trajetórias helicoidais (free motion) da bactéria magnetotáctica multicelular ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ sob dois campos magnéticos aplicados (3,9 e 20 Gauss) foram quantificados.

• Foi desenvolvida uma metodologia que permite a análise eficiente

de um grande número de trajetórias de bactérias magnetotácticas através de vídeo-microscopia e processamento de imagem.

• Os valores de passo da hélice e raio das trajetórias obtidos no

presente trabalho sugerem que as trajetórias retilíneas de ‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ previamente relatadas na literatura podem ser trajetórias helicoidais com raio pequeno e/ou passo da hélice muito grande.

• As trajetórias helicoidais em ambos os campos magnéticos

aplicados são alongadas, indicando grande eficiência na coordenação da

rotação dos flagelos para a natação avante nesses microrganismos.

• Assim como o elevado grau de otimização magnética em

‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’, a otimização do movimento

avante implica em um nível elevado de organização entre as células que

compõem os indivíduos.

• A natação avante de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’

aparentemente se torna mais eficiente com o aumento do campo

magnético aplicado.

97

• A intensidade do campo magnético aplicado influencia a natação

de ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ de alguma forma além da

orientação passiva. Experimentos realizados a partir de uma mesma

amostra e sob um número maior de campos magnéticos com

intensidades distintas serão necessários para a comprovação da

hipótese da existência de mecanismo de magnetorrecepção sensível ao

campo magnético aplicado.

• As velocidades de natação observadas em ‘Candidatus

Magnetoglobus multicellularis’ corroboram a hipótese de que elevadas

velocidades de natação constituem uma adaptação comum a bactérias

encontradas em ambientes marinhos com gradiente vertical de oxigênio.

• A comparação entre os parâmetros das trajetórias helicoidais de

‘Candidatus Magnetoglobus Multicellularis’ com os de outras bactérias

sugere que o padrão de distribuição dos flagelos pode ter implicação no

passo da hélice das trajetórias. A rotação da célula e da trajetória no

mesmo sentido parece ser também consequência do tipo de distribuição

de flagelos.

• A menor velocidade de natação de ‘Candidatus Magnetoglobus

Multicellularis’ quando comparada com a observada em Thiovulum

majus pode ser consequência da fisiologia do microrganismo, ou ainda

de uma maior eficiência na coordenação dos flagelos na bactéria

unicelular.

• ‘Candidatus Magnetoglobus multicellularis’ apresenta resposta

fotocinética quando realiza movimento do tipo Rotation: as células

passam a girar mais lentamente em torno do seu próprio eixo quando

um filtro verde é posicionado entre a fonte de luz e a amostra.

98

• As respostas observadas em ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ quando expostos a pulsos de laser e à luz ultravioleta não

se enquadram perfeitamente em nenhuma das respostas de

microrganismos à luz descritas até o momento na literatura.

• A redução da resposta coletiva observada após sucessivos pulsos

de laser UV e o fato de que uma resposta similar ter sido observada com

luz UV sugere que um mecanismo de adaptação, similar ao utilizado em

quimiotaxia, está presente em ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’.

• A similaridade da resposta de ‘Candidatus Magnetoglobus

multicellularis’ ao laser e à luz ultravioleta com o “escape motility”

constitui a primeira evidência de que este padrão de movimento seja

uma resposta a estímulos negativos ou prejudiciais.

99

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