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VII CONGRESO LATINOAMERICANO Y DEL CARIBE DE PROFESIONALES Y
ESTUDIANTES DE CIENCIA Y TECNOLOGIA DE ALIMENTOS Y GASTRONOMIA
Cartagena de Indias, Colombia, octubre 10 al 14 de 2017
COMPOSICIÓN BIOACTIVA DE OLEORRESINA DE LA MICROALGA
HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS PARA APLICACIONES ALIMENTARIAS
Ruiz-Domínguez, M.C.1; Jauregui M.1; Espinosa, C. 1; Palma, J.C.1; Jaime, C.2;
Cerezal, P.1
1Laboratorio de Microencapsulación de Compuestos Bioactivos (LAMICBA),
Departamento de Alimentos, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de
Antofagasta. Avda. Universidad de Antofagasta # 02800 – Región de Antofagasta (Chile)
2 Atacama Bio Natural Products S.A, Vía 5 Esq. Vía 9, Bajo Molle, Iquique - Región de
Tarapacá (Chile)
Correo electrónico: [email protected]
(Investigación Parcial)
Resumen: Las microalgas son organismos fotosintéticos conocidas por contener entre
otras, compuestos de alto valor añadido como los carotenoides. Estos cumplen un papel
fundamental como antioxidantes y como agentes protectores sobre la salud humana. En
el presente trabajo se muestra el potencial de la microalga Haematococcus pluvialis
conocida por presentar elevadas concentraciones de astaxantina. Este pigmento tiene
propiedades antioxidantes, es protector contra la inflamación y contra el envejecimiento
y actúa como fotoprotector de la luz UV. Por consiguiente, se presenta el perfil de
carotenoides presentes en la oleorresina enriquecida al ~10% (p/p) en carotenoides
habiendo sido extraída mediante la tecnología limpia de extracción por CO2 supercrítico
Vol 26, No 44 (2018), Revista Alimentos Hoy -18
(SCCO2) a partir de la biomasa algal. Se realizó una hidrólisis alcalina de los compuestos
bioactivos para conocer la totalidad de antioxidantes presentes en la oleorresina. Estos
fueron posteriormente separados, identificados y cuantificados mediante HPLC con
detector UV-vis a través de una columna RP-18 y gracias a patrones de calibración. La
oleorresina proveniente de H. pluvialis presentó un perfil: astaxantina 47.69 mg/g, luteína
23.78 mg/g y cantaxantina 29.57 mg/g, respecto al ~10% (p/p) de carotenoides presentes
en las muestras de oleorresina. Finalmente, la extracción por SCCO2 a partir de la
biomasa H. pluviales enriquecida en carotenoides, da lugar a un eficiente
empaquetamiento de compuestos de alto valor con capacidad bioactiva proporcionando
durabilidad y estabilidad de los mismos en el tiempo, abriendo así, un mayor mercado de
las mismas tanto en la industria alimentaria y/o nutracéutica.
Palabras claves: oleorresina, SSCO2, astaxantina, industria alimentaria
Abstract: Microalgae are photosynthetic organisms which are known to contain high
added value compounds such as carotenoids. They play an important role as antioxidant
and as protective agents on human health. This work shows the potential of the microalga
Haematococcus pluvialis which is relevant because it has a high concentration of
astaxanthin. This pigment has antioxidant properties, it is protective against inflammation
and against ageing and it plays as a photoprotector of UV light. Therefore, the profile of
specific carotenoids presents in the oleoresin enriched in carotenoids (~10%, w/w) is
shown in this work. It was extracted by green technology called supercritical fluid
extraction with CO2 (SCCO2) using microalgal biomass. The profile was performed by
alkaline hydrolysis from oleoresin to obtain the total-free bioactive compounds in the
samples. Then, the bioactive compounds were separated, identified and quantified using
HPLC with UV-vis detector and RP-18 column with external standard to calibration. The
oleoresin of H. pluvialis showed a specific profile: astaxanthin 47.69 mg/g, lutein 23.78
mg/g and canthaxanthin 29.57 mg/g, respect to ~10% (w/w) of carotenoids on samples.
Finally, SSCO2 extraction from H. pluviales was an efficient packing of bioactive
compounds of high added value with bioactive capacity providing durability and stability
Vol 26, No 44 (2018), Revista Alimentos Hoy -19
during time, opening a greater market for them both in the food and / or in the
nutraceuticals industry.
Keywords: oleoresin, SSCO2, astaxanthin, food industry
1.- Introducción
Hoy en día, la tendencia de los
consumidores a ingerir productos
naturales está aumentando debido al
interés por una dieta saludable. Debido a
ello, la industria alimentaria está
desarrollando nuevos productos
alimenticios enriquecidos con
ingredientes funcionales que pueden
proporcionar un beneficio para la salud
más allá de los nutrientes tradicionales
que contiene (Milner 1999).
Particularmente, las microalgas son una
fuente relevante de ingredientes
funcionales con varias aplicaciones
potenciales de biotecnología (Michalak y
Chojnacka 2015). Son un gran grupo de
organismos fotosintéticos con una
estructura unicelular eficiente, que les
permite convertir la energía solar en
energía química. Los microalgas se
estudian intensamente por contener una
amplia gama de compuestos de alto valor
bioactivo con importantes aplicaciones
en alimentos, cosméticos, farmacéuticos
y biocombustibles (Amaro y otros 2011;
Gouveia y otros 2008) y estos
compuestos bioactivos han sido
reconocidos para prevenir enfermedades
humanas y mantener una buena salud
(Plaza y otros 2008; Rao y Rao, 2007).
En particular, el grupo de carotenoides
son la clase más extensa de pigmentos
sintetizados por microalgas, a pesar de
que no más de 30 de ellos juegan un
papel directo en la fotosíntesis de
microalgas (Varela y otros 2015). Son
indispensables en la recolección de luz y
transferencia de energía durante la
fotosíntesis e incluso son responsables
como mecanismo de defensa de primera
línea de la presencia de ROS (radical
oxidative species) y por tanto, contra el
daño fotooxidativo (Li y otros 2009). En
concreto, Haematococcus pluvialis es
ampliamente conocida como la mejor
microalga productora de astaxantina,
alcanzando hasta 3-5% de pigmento
natural en peso seco (Saini y Keum,
2017). Lo especial de este carotenoide
rojo-naranja insoluble en agua, es que es
un subproducto de β-caroteno en
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condiciones de estrés en la biosíntesis de
carotenoides (D’Alessandro y Antoniosi
Filho, 2016) y es un poderoso
antioxidante que es más eficaz que las
vitaminas C y E (α-tocoferol) u otros
carotenoides como β-caroteno, licopeno,
luteína y zeaxantina (Higuera-Ciapara y
otros 2006; Reyes y otros 2014). La
astaxantina tiene muchos beneficios
para la salud, tales como anti-
inflamatorio (Gross y otros 2006) e
incluso previenen enfermedades
cardiovasculares como arteriosclerosis
(Ciccone y otros 2013). Además, es
ampliamente utilizado en piensos de
pescado y particularmente en piensos de
salmón, crustáceos y aves, donde la
mayoría de las personas conocen que es
la astaxantina el principal responsable
del color rojo-naranja que muestran
(Mata y otros 2010; Sousa y otros 2008;
Spolaore y otros 2006). Muchos informes
se centran en el estudio y la
comprobación de diferentes métodos
para la extracción óptima de
carotenoides desde la biomasa en
comparación con los métodos
tradicionales (Grosso y otros 2015; Mäki‐
Arvela y otros 2014; Sowbhagya y
Chitra, 2010). Grosso et al. (2015). En
general, las metodologías más
relevantes descritas son; (i) extracción de
líquidos a presión atmosférica con
Soxhlet (maceración, microondas o
ultrasonidos), (ii) extracción líquida
presurizada, (iii) extracción asistida por
enzimas y (iv) extracción por fluidos
supercríticos (SFE), que a menudo se
basa en el uso de supercríticos de CO2
(SCCO2). Por otro lado, el método de
extracción desde la oleorresina es la
hidrólisis de la astaxantina esterificada
por una sustancia alcalina, hidrólisis
alcalina, o por enzima, hidrólisis
enzimática, para producir toda la
astaxantina libre antes de ser
cuantificada por HPLC. Varios métodos
de saponificación bajo nitrógeno se han
propuesto para proporcionar xantofilas
libres (Kamata y Simpson, 1987; Yuan y
Chen, 1999). En nuestro caso, el material
de estudio utilizado son las muestras de
oleorresina enriquecidas en carotenoides
(~ 10%, p/p) obtenidas desde la
microalga H. pluvialis por SCCO2.
Finalmente, la idea principal de este
trabajo de investigación es proporcionar
información adicional sobre el potencial
antioxidante mostrado en la oleorresina
desde H. pluvialis extraída por SCCO2
donde los carotenoides específicos de la
misma fueron extraídos por hidrólisis
Vol 26, No 44 (2018), Revista Alimentos Hoy -21
alcalina. Con estos resultados
prometedores, se abren potenciales
aplicaciones biotecnológicas por
contener elevadas concentraciones de
compuestos en la biomasa y
conservándose a lo largo del tiempo.
2.- Materiales y Métodos
Materiales
El material de estudio fue las
muestras de oleorresinas enriquecidas
de carotenoides (~ 10%, p/p), la cual se
extrajo desde la microalga
Haematococcus pluvialis mediante el
proceso de extracción por fluido
supercrítico con CO2 (SCCO2). La
compañía Chilena denominada Atacama
BioNatural Products S.A.
(www.atacamabionatural.com. Iquique,
Chile) suministró las muestras de
estudio. Todos los químicos usados en
este trabajo fueron de calidad
cromatográfica para HPLC (metanol,
acetonitrilo, acetato de etilo y agua).
Particularmente, los patrones de
calibración usados fueron; astaxantina,
luteína y cantaxantina obtenidos de
Sigma-Aldrich con ≥ 98% pureza.
Preparación de extractos para
hidrólisis alcalina
10 mg de oleorresina se mezcló
con 2 mL de DMSO y 3 mL de acetona, 2
mL de salmuera y 2 mL de n-hexano en
un vial de 15 mL. La mezcla fue volteada
durante 15 segundos y posteriormente
centrifugada (Eppendorf Centrifugue
5702) a 2147×g por 3 min. La fase de n-
hexano contenía los mezcla de los
carotenoides y se recolectó a un vial con
1.0 g de sulfato de sodio para eliminar la
humedad. Las extracciones se repitieron
con 2 mL de n-hexano hasta que el
extracto quedara sin color. La fase n-
hexano fue de nuevo transferida a un vial
de 50 mL donde el solvente se eliminó
mediante rotavapor (BÜCHI R-300) (40
°C) hasta concentrar la totalidad de
carotenoides presentes en la oleorresina.
El pellet seco se resuspendió
nuevamente en 10 mL de acetona para
luego ajustar la concentración de
carotenoides óptima por
espectrofotometría (Shimadzu UV-1280).
El rango de absorbancia fue entre 0.8-1.2
a una longitud de onda de lectura de 474
nm. Finalmente 3 mL de las alícuotas de
este extracto se usó para la hidrólisis
alcalina. Los análisis se realizaron por
triplicado.
Hidrólisis alcalina de extractos
de oleorresinas
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3 mL de los extractos se
evaporaron en el rotavapor a 40°C y
posteriormente disueltos en 2 mL de
metanol. La hidrólisis alcalina se llevó a
cabo mediante los métodos modificados
de (Mezquita y otros 2015; Yuan y Chen,
1999). Seguidamente, 0.1 mL de KOH a
10 g kg−1 se añadió a la mezcla y
volteado por 1 min. Los ésteres de
astaxantina se hidrolizaron a
temperatura ambiente bajo N2 y
oscuridad durante 18 h. La fase metanol
se extrajo con n-hexano y se lavó con
salmuera hasta alcanzar pH=7. El
extracto de n-hexano se secó
nuevamente con sulfato de sodio y N2.
Posteriormente, se resuspendió por 3 mL
en acetona para ser analizado por HPLC
(Merck Hitachi Lachrom)
Análisis de carotenoides
específicos mediante HPLC
Cada extracto rico en
carotenoides se filtró mediante filtros de
Ø 0.20 µm PTFE y se usaron en la
separación, identificación y
cuantificación de cada carotenoides
específicos mediante HPLC. El equipo
(Merck Hitachi Lachrom) contenía una
columna de separación RP-18 y detector
UV-vis. El método modificado descrito
por Young et al. 1997 se utilizó para
separar y determinar astaxantina, luteína
y cantaxantina, usando 450 nm como
longitud de onda detección. Las fases
móviles fueron, acetato de etilo (solvente
A) y acetonitrilo-agua (9:1, v/v) (Solvente
B). Los estándares (SIGMA – Aldrich) y
sus correspondientes curvas de
calibración se usaron como referencia
para identificar y cuantificar los
carotenoides específicos en miligramos
de carotenoides por gramos de
oleorresina.
Análisis estadístico
Los resultados experimentales se
expresaron como valores medios ±
desviaciones estándar al realizarse todo
por triplicado. La evaluación estadística
de los resultados se realizó utilizando
métodos estadísticos comunes y el
software de hoja de cálculo de Microsoft
Office Excel 2013. La comparación de la
varianza se efectuó mediante análisis
unidireccional de varianza (ANOVA). Las
diferencias se consideraron significativas
cuando p <0,05.
Vol 26, No 44 (2018), Revista Alimentos Hoy -23
3.- Resultado y Discusión
En la Figura 1 se presenta un
cromatograma modelo realizado por
HPLC con detector UV-vis de la
oleorresina extraída por SSCO2 a partir
de H. pluvialis. Los extractos de
carotenoides se llevaron a cabo por
hidrólisis alcalina, asegurando así la
totalidad de la extracción de los ésteres
presentes como antioxidantes en la
muestra. En la Tabla 1, se presenta la
concentración expresada en mg de
compuesto bioactivo respecto a los
gramos de oleorresina, siendo además
calculados por el contenido de
carotenoide total, que era alrededor del
10 % de la biomasa total de la
oleorresina. Por lo que se observa, la
presencia de astaxantina es superior a
los otros pigmentos también
antioxidantes, como luteína y
cantaxantina, siendo hasta un 50 %
superior la concentración de astaxantina
respecto a los otros carotenoides
específicos.
La aplicación de pigmentos
naturales con capacidad antioxidante es
cada vez más usado en diversos
formatos. Los carotenoides son
ampliamente usados como aditivos para
colorantes alimentarios en alimentos y es
muy usada la técnica de separación y
cuantificación como el HPLC para
evaluar la estabilidad del compuesto
(Mezquita y otros 2015).
Particularmente, el método de
extracción desde la biomasa es
determinante en la estabilidad del
compuesto, siendo uno de los más
empleados por su eficiencia y
estabilidad, la extracción por fluidos
supercrítico con CO2 (SSCO2) (Poojary y
otros 2016). Estudios actuales identifican
que la técnica SSCO2 es una de las
“tecnologías verdes” sostenibles para la
extracción del propio compuesto y para el
medio ambiente. La técnica utiliza fluidos
en estado supercrítico y en este caso
particular el fluido es el CO2, y estos se
encuentran a temperatura y presión por
encima de su límite crítico en la celda de
extracción del compuesto.
Dado que los fluidos supercríticos
poseen baja viscosidad y alta difusión,
proporcionan propiedades selectivas de
los compuestos a extraer (Lang y Wai,
2001). Otro de los beneficios de la
técnica SSCO2, es el no uso de solventes
orgánicos en la extracción y además el
aumento en el rendimiento de la
extracción (Zougagh y otros 2004).
Actualmente, el CO2 es el disolvente
Vol 26, No 44 (2018), Revista Alimentos Hoy -24
preferido, ya que puede alcanzar
fácilmente una concentración
supercrítica y tiene varias ventajas
incluyendo baja toxicidad, inflamabilidad
y costo además de alta pureza (Poojary y
otros 2016). Además, se presenta la
necesidad de la extracción de
ingredientes y compuestos funcionales a
partir de fuentes naturales como es la
microalga H. pluvialis. Este organismo
fotosintético posee una elevada
concentración intracelular de
astaxantina, entre otros compuestos,
pero presenta una resistente pared
celular que protege a la astaxantina de
las condiciones medioambientales,
aunque disminuye la biodisponibilidad
del pigmento, lo que hace necesaria su
extracción.
Una alternativa es la extracción
por SSCO2 la cual es capaz de extraer
desde dicha biomasa. Tal como se
observa en la Tabla 1, la mitad de los
carotenoides presentes en la oleorresina
es astaxantina. El método de extracción
desde la oleorresina hidroliza la
astaxantina esterificada por un químico
para producir toda la astaxantina libre
antes de ser cuantificada por HPLC. Esto
implica ver la totalidad de xantofilas
libres.
4.- Conclusiones
La extracción es un problema
significativo en la cuantificación de
carotenoides. Además, la hidrólisis
alcalina mejora la cuantificación de los
mismos desde los extractos de
oleorresina pues extrae todas las
xantofilas dejándolas libres y es mucho
más económica que la hidrólisis
enzimática.
5.- Agradecimientos
Financiamiento al proyecto PAI
n°79160037, VIU-FONDEF-VIU
n°155E0082 y n°15E0050 (CONICYT-
Chile) y a la corporación Atacama Bio
Natural Products S.A. (Iquique, Chile) por
la oleorresina de estudio.
Vol 26, No 44 (2018), Revista Alimentos Hoy -25
Figura 1. Cromatograma por HPLC-UV vis de carotenoides específicos presentes en la
oleorresina de H. pluvialis extraída por hidrólisis alcalina.
Tabla 1. Concentración de carotenoides específicos presentes en la oleorresina extraída
por Hidrólisis alcalina de H. pluvialis.
Carotenoides
específicos
Concentración
(mg/g oleorresina)
Astaxantina 47.69 ± 2.22
Luteína 23.78 ± 1.12
Cantaxantina 29.57 ± 1.38
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