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Procesos Biotecnológicos II 2014
Trabajo Práctico Nº3- Primera Parte
COMPROBACIÓN EXPERIMENTAL DE UN MODELO TEÓRICO APLICADO A
UN BIORREACTOR CONTINUO CON ENZIMAS INMOVILIZADAS
En los últimos años la Biotecnología ha experimentado grandes avances y sus
aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria alimentaria
y farmacéutica se han acrecentado considerablemente. En la industria, los procesos
catalizados por enzimas son cada día más numerosos, ya que presentan una serie de
ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:
- presentan una gran actividad catalítica,
- muestran una gran especificidad hacia el sustrato,
- son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica normal [1].
Sin embargo, el uso de enzimas ha sido limitado debido a su alto costo, pequeñas
cantidades disponibles, inestabilidad y posibilidades limitadas de recuperación económica
de la enzima a partir de la mezcla de reacción. Los recientes desarrollos biotecnológicos en
el campo de la inmovilización enzimática permiten la superación de esta problemática [2].
Esta técnica consiste en confinar la enzima en una región definida del espacio por unión a
un soporte, dando lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y pueden
ser reutilizadas repetidamente [3].
Como ventajas del uso de las enzimas inmovilizadas podemos destacar [4]:
- el aumento de la estabilidad de la enzima,
- la posible reutilización disminuyendo los costos del proceso,
- la posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a
la aplicación de la enzima inmovilizada, permitiendo el empleo de cargas elevadas de
enzimas, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo.
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización enzimática son [5]:
- la alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo,
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- la gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte coexistiendo distintas fracciones
de proteínas inmovilizadas con un diferente número de uniones al soporte,
- suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización,
- el biocatalizador es más caro que la enzima nativa,
- la catálisis heterogénea se ve fuertemente afectada por el fenómeno de difusión [6].
El transporte de masa está limitado tanto por la difusión externa (debido a la capa de Nernst
que rodea al soporte de la enzima) como por la interna (depende de la interacción entre el
sustrato y el material de la matriz y la porosidad de la matriz) [7].
En general, los métodos de inmovilización enzimática [8] se suelen clasificar en dos
grandes categorías:
1) retención física y
2) unión química.
El atrapamiento enzimático consiste en la retención física de la enzima en las
cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros
fotoentrecruzados o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carragenano o
resinas de poliuretano. Con el objetivo de mantener la mayor actividad catalítica, la
inmovilización debe realizarse en condiciones suaves.
En el presente trabajo práctico se estudiarán las características cinéticas de un
biorreactor continuo consistente en enzimas utilizadas para la determinación bioquímica de
glucosa (kit comercial para análisis clínico) atrapadas en una matriz de alginato.
ALGINATO
El alginato es un polímero extraído de algas marinas que consiste en monómeros de
ácido-D-manurónico (M) y ácido-D-glucurónico (G) unidos por enlaces glucosídicos
1–4 formando un copolímero lineal. Las regiones ricas en unidades G forman cavidades
dentro de las cuales interaccionan cationes polivalentes tales como Al3+
, Ca2+
, Cu2+
.
Este polímero soluble en agua puede transformarse en un gel insoluble, resistente al
calor a través de un proceso denominado gelificación ionotrófica [9]; gracias a los puentes
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salinos formados entre bloques G adyacentes de diferentes cadenas y átomos polivalentes
como el Ca2+
.
𝑁𝑎+ 2 − 𝑎𝑙𝑔𝑖𝑛𝑎𝑡𝑜(𝑎𝑞 ) + 𝐶𝑎2+ → 2𝑁𝑎+ + 𝐶𝑎2+ − 𝑎𝑙𝑔𝑖𝑛𝑎𝑡𝑜(𝑔𝑒𝑙 )
ENZIMAS (kit para la determinación clínica de glucosa)
Este kit comercial consta de dos enzimas: la glucosa oxidasa (GOD) y la peroxidasa
(POD), las cuales catalizan la siguiente reacción:
𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝑂2 + 𝐻2𝑂 𝐺𝑂𝐷 á𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑔𝑙𝑢𝑐ó𝑛𝑖𝑐𝑜 + 𝐻2𝑂2
2𝐻2𝑂2 + 4 − 𝐴𝐹 + 𝑓𝑒𝑛𝑜𝑙 𝑃𝑂𝐷 𝑞𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑟𝑒𝑎𝑑𝑎 + 4𝐻2𝑂
GOD y POD son las enzimas a inmovilizar, y 4-AF corresponde a la 4-
aminofenazona. La quinona coloreada puede ser cuantificada realizando medidas de
absorbancia a 505 nm.
Procedimiento
El procedimiento para llevar a cabo este TP consta de 4 etapas. Las etapas A) y B)
ya fueron realizadas por los auxiliares a cargo de la preparación del TP y la etapa D) será
realizada la próxima semana en la segunda parte del TP.
A) Curva de calibración de glucosa
1.- Preparar 50 mL de solución de glucosa 1 g/L
2.- Preparar en un vaso de precipitado Reactivo de trabajo conteniendo:
50 ml de H2O
3,5 mL de reactivo 4-AF
3,5 mL de Reactivo Fenol
210 L de GOD/POD
H2O c.s.p. 70 mL.
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Es importante respetar el orden de agregado de cada uno de los reactivos y
homogeneizar bien antes de agregar el reactivo siguiente.
3.- Preparar la siguiente batería de tubos de Kahn con diferente concentración de glucosa,
cada uno por triplicado:
Tubo 1 2 3 4 5 6
[Glu] (g/L) 0 0.0005 0.0010 0.0015 0.0020 0.0025
React.
Trabajo 2,0 mL en cada tubo
4.- Incubar los tubos a 37ºC por 10 minutos.
5.- Medir absorbancia ( = 505 nm) de cada sistema por triplicado, promediar los valores
y graficar Absorbancia vs [Glu] en g/L.
B) Calibración de la bomba peristáltica (con el fin de determinar el caudal obtenido a las
diferentes velocidades indicadas en la perilla de la bomba peristáltica)
1.- Conectar 2 capilares a la bomba, sumergiendo el extremo de uno de ellos en un vaso
de precipitado con agua y el otro dentro de una probeta.
2.- Encender la bomba, llevar a la velocidad a utilizar y, al mismo tiempo, largar el
cronómetro. Realizar medidas del volumen emitido dentro de la probeta cada dos minutos.
3.- Repetir los pasos 1 y 2 para cada velocidad incluyendo los puntos intermedios 1,5 y
2,5.
4.- Graficar Volumen emitido (mL) vs tiempo (min) y obtener para cada velocidad el
caudal Q de la bomba (pendiente de la gráfica en mL/min).
C) Determinación de los parámetros cinéticos de la reacción de glicemia con las
enzimas inmovilizadas en un Reactor en Batch.
1.- Agregar 105 μL de la solución de enzimas GOD/POD a 35 mL de alginato 2% P/V.
Trabajar con agitación constante y homogeneizar durante 10 minutos.
2.- Colocar aproximadamente 40 ml de CaCl2 0,25 M en el vaso de plástico.
3.- Cargar la solución de alginato-GOD/POD en la jeringa procurando que no se formen
burbujas de aire.
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4.- Gotear la solución de alginato-GOD/POD sobre el CaCl2 hasta fabricar 100 esferas;
colarlas y escurrirlas con papel absorbente para secarlas, apoyando el papel por debajo del
colador.
5.- Colocar las esferas en el reactor y agregar, con agitación constante, primero 5,00 mL
de CaCl2 0,25 M y luego 2,50 mL del reactivo 4-AF.
6.- Colocar en la probeta 40 mL de la solución de glucosa (concentración S0
correspondiente a cada grupo) y 2,50 mL del reactivo Fenol. Homogeneizar bien la
solución.
7.- Setear la longitud de onda del espectrofotómetro en 505 nm y realizar el blanco agua.
8.- Verter el contenido de la probeta dentro del frasco, constituyendo así el reactor.
Comenzar el conteo con el cronómetro. Siempre trabajar con agitación. Calcular la
concentración inicial efectiva.
9.- Cada 5 minutos tomar 1 mL del reactor con pipeta pasteur, colocar en la cubeta y
medir la absorbancia de la muestra. Devolver la alícuota al reactor. Siempre limpiar las
paredes de la cubeta.
10.- Repetir este procedimiento hasta alcanzar los 60 minutos de trabajo
11.- Calcular la S0 en el reactor y la [quinona coloreada]; graficar [quinona coloreada] vs.
tiempo y determinar las velocidades de reacción inicial para cada S0.
12.- Realizar una gráfica del tipo Lineweaver-Burk y obtener los parámetros de Vmáx y Km
aparentes:
𝟏
𝐕=
𝟏
𝐕´𝐦𝐚𝐱+
𝐊´𝐦
𝐕´𝐦𝐚𝐱∗
𝟏
𝐒
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1.- Arroyo M. (1998) Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y aplicaciones.
Ars Pharmaceutica, 39, 23-29.
2.- Kayastha AM, Das N. (1999) A simple laboratory experiment for teaching enzyme
immobilization with urease and its application in blood urea estimation. Biochem Educ,
27, 114-117.
3.- Wingard LB. (1972) Enzyme Engineering, Interscience Publishers, New York.
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4.- Hartmeier W. (1985) Immobilized biocatalysts: from simple to complex systems.
Trends Biotechnol, 3, 149-153.
5.- Martinek K, Mozhaev VV. (1987) Immobilization of enzymes: an approach to
fundamental studies in biochemistry. Adv Enzymol, 57, 179-249.
6.- Grunwald P. (2000) Experimental treatment of the laws of heterogeneous catalysis
with immobilized yeast cells (Saccharomyces cerevisiae). Biochem Educ, 28, 96-99.
7.- Grunwald P. Determination of effective diffusion coefficients –an important parameter
for the efficiency of immobilized biocatalyst. Biochem Educ, 17, 99-102.
8.- Kennedy JF, Cabral JMS. (1983) Solid Phase Biochemistry. Schouten, WH. (ed)
Wiley Pub., New York.
9.- Klein J, Stock J, Vorlop KD. (1983) Pore size and properties of spherical Ca-alginate
biocatalysts. Europ J Appl Microbiol Biotechnol, 18, 86-91.
