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BIOTECNOLOGÍA PARA TODOS:
Socialización de conceptos, aplicaciones y beneficios
Conceptos básicos de la tecnologíade ADN recombinante
ADN recombinante
Una molécula de ADN híbrida formada por la unión de
dos secuencias de ADN provenientes de dos
organismos distintos.
2
Vector de clonación
ADN de interés
ADN
recombinante
Molécula de ADN recombinante. Tomado de
http://www.slideshare.net/mrtangextrahelp/18a-cloning
● Aislamiento de la secuencia de ADN de interés (ADN genómico,ADNc o ADN copia o bien un ADN obtenido mediante PCR).
● Unión de la secuencia de ADN de interés a un vector declonación.
● Introducción de la molécula de ADN recombinante en unacélula huésped que puede ser procariota (bacterias) oeucariota (levaduras).
Creación ADN recombinante
● Identificación y purificación de los clones queposeen la molécula de ADN recombinante deinterés.
● Crecimiento y amplificación de las células huéspedque incorporaron el ADN recombinante de interés.
Creación ADN recombinante
Creación ADN recombinante
Pasos básicos en la creación de una molécula de ADN recombinante. Tomado de
http://www.zo.utexas.edu/faculty/sjasper/images/20.1.gif
Clonación depende de las endonuclesas de
restricción.
Enzimas que cortan la molécula de ADN en sitios
específicos denominados: sitios de restricción
(secuencias de 4 – 8 pares de bases).
Mecanismo de defensa de las bacterias contra la
infección por fagos.
• Bacterias metilan su propio ADN.
Enzimas de restricción
Reconocen secuencias de ADN palindrómicas.
Producen cortes en las dos cadenas.
Enzimas de restricción:
Extremos cohesivos o pegajosos (EcoRI)
Extremos romos (Hind II)
Enzimas de restricción
Enzimas de restricción
Modo de acción de las enzimas de restricción. Tomado dehttps://biologiamolecularinteractiva.wordpress.com/about/enzimas-de-restriccion/
Enzima de
restricción
Enzima de
restricción
Extremos cohesivos
Secuencia
específica
corte corte
Extremos romosExtremos cohesivos
Sitio reconocimiento
EcoRI
Sitio reconocimiento
SmaI
A B
Enzimas de restricción
Mecanismo de acción de las enzimas de restricción: (a) extremos cohesivos y (b) extremos romos. Tomado y
modificado de http://synbio101.org/genetic-engineering/2-3-the-restriction-enzymes-as-molecular-scissors/
Molécula de ADN que vehiculizará al fragmento de
interés y permitirá su multiplicación.
Componentes:
• Un origen de replicación.
• Un gen marcador.
• Sitio de clonación múltiple o sitio de restricción
múltiple: segmento corto de ADN con muchos
sitios de restricción distintos.
Vector de clonación
Vecto
r c
lon
ació
n
Sitio múltiple
de clonación
Gen marcador
( por ejemplo selección a antibióticos)
Origen de replicación
Diagrama básico de un vector de clonación bacteriano (plásmido). Tomado y
modificado de http://oregonstate.edu/instruct/bb331/lecture04/FigF6.html
Móleculas de ADN circular, doble banda, extracromosómicos.
Ventajas como vector de clonación:
• Tamaño pequeño.
• Circulares.
• Replicación independiente del ADN cromosómico.
• Presencia múltiples copias en la células bacteriana.
• Presencia de genes de resistencia a antibióticos.
Transferencia a la célula hospedera por transformación
utilizando choque de calor o electroporación.
Plásmidos
Estos vectores se caracterizan por poseer las secuencias
regulatorias (promotor, terminador, secuencias de unión
al ARNr) que permitan la adecuada expresión del gen de
interés.
Asimismo, poseen un sitio de replicación, un sitio de
clonación múltiple (MCS) y un gen marcador que permita
la selección de las células que incorporaron el vector.
Vector de expresión
Vecto
r e
xp
resió
npromotor
MCS
terminador
Origen de replicación
Gen de
selección
Diagrama básico de un vector de expresión. Tomado y modificado dehttp://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/constitutive_gene_expression_lactococcus.html
Paso 1: restricción y ligación del ADN
Plasmido recombinante
ADN ligasa
ADN de interés
Corte conEcoRI
Corte conEcoRI
Sitios de corte
Vector declonación
Paso 2: Introducción del ADN en una célula hospedera
Vector de
clonación
ADN de interés
Transformación
Transformación Transformación
Crecimiento en el medio con
el antibiótico
Ligación del ADN
de interés
Ligación del vector
de clonación
No hay crecimiento en el
medio con el antibiótico
Fragmento de ADN original
Nucleótidos
Cebadores
Desnaturalización Annealing Extensión
Desnaturalización (94-96 ºC)
Annealing (35 ºC a 60 ºC)
Elongación (72 ºC)
PCR
Esquema general de la reacción en cadena de la polimerasa. Tomado y modificado dehttps://zh.wikipedia.org/wiki/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E5%BA%94
Electroforesis
Técnica de electroforesis: separación de moléculas según su tamaño en unamatriz porosa. Tomado y modificado dehttp://www.bio.utexas.edu/faculty/sjasper/bio212/biotech.html
Construcción artificial de un ácido nucleico
bicatenario por el apareamiento de bases
complementarias de dos ácido nucleicos
monocatenarios.
Sonda: fragmento determinado de ADN o ARN
marcado química o radioactivamente y que es
utilizada para localizar secuencias de ácidos
nucleicos.
Hibridación
Southern blot
Enzimas de restricción ADN
electroforesisTransferencia a la mebrana
Sonda marcada radioactivamente
Hibridación Detección
Esquema general de la técnica Southern blot. Tomado y modificado dehttp://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasialeprojekter/genteknologi/teori/4genteknologisketools/southern-blot
Northern blot
Esquema general de la técnica Northern blot. Tomado y modificado dehttps://vimeo.com/channels/563554/69633383
Muestra
ARN
electroforesis
Transferencia a la
mebrana
Sondas marcadas
radioactivamente
hibridación
Detección
Western blot
Esquema general de la técnica Western blot. Tomado y modificado dehttp://www.leinco.com/includes/templates/LeincoCustom/images/WesternBlotFinal.gif
Membrana de nylon con las proteínas
Proteína Anticuerpo primario
Anticuerpo
secundario
Detección de la señal
Secuenciación química de ADN
Secuenciación química del ADN desarrollada por Maxam y Gilbert . Tomado ymodificado de http://pt.slideshare.net/suryasaha/sequencing-32243702
Corte de las bases
nitrogenadas en
Secuenciación de ADN
Secuenciación del ADN desarrollada por Sager. Tomado y modificado dehttp://www.geopaloma.com/biologia_2b/unidades/ejercicios/act14biointema6.htm