Condiciones que favorecen la desnaturalización

•Alta temperatura

•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)

•Alto pH (desprotonación de bases)

Monitoreo de la desnaturalización

•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm

Nucleótidos libres> ssADN> dsADN

•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo es denominada Tm

•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitudLa Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud

•La condición standard es 0.12 M buffer fosfato de sodio (0.18 M en ion sodio

DESNATURALIZACION POR CALORDESNATURALIZACION POR CALOR

•Oligonucleótidos cortos

Tm = (A+T)x2oC + (C+G)x4oC

•Oligonucleótidos largosTm = 81.5 +16.6Log [Na+]+ +0.41 (%CG) – 625/N

N –length of oligo

Hidrólisis de ácidos nucleicosHidrólisis de ácidos nucleicos

Ruptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídicoRuptura de enlaces en el esqueleto polinucleotídico Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y Hidrólisis ácida (1 mM HCl): ruptura del enlace glicosídico entre purinas y

desoxiribosa (producto: ac. apurínicodesoxiribosa (producto: ac. apurínico Hidrólisis alcalina (Hidrólisis alcalina (RNA)RNA)– clivaje del enlace fosfodiester– clivaje del enlace fosfodiester

RenaturalizaciónRenaturalización La desnaturalización es un proceso reversibleLa desnaturalización es un proceso reversible Reanealing – reasociación de las cadenas de ADNReanealing – reasociación de las cadenas de ADN

La reasociación de ADN no repetido se produce en un La reasociación de ADN no repetido se produce en un rango de 2-logrango de 2-log

Cinética de renaturalizaciónCinética de renaturalización

Definición de CotDefinición de Cot1/21/2: función inversa de la : función inversa de la

constante de velocidad (constante de velocidad (kk))

tkCc

c

00 1

1

CC00t t ½ ½ :: valor de Cvalor de Coot cuando se t cuando se

reasoció un 50%reasoció un 50%

1)1(2

10 tkC

tkC01

1

2

1

2)1( 0 tkC

1120 tkC

ktC

12/10

¿Complejidad del Genoma ?

¿Qué es?

AAAAAAAAAAAAAAAA

ATATATATATATATATA

ATCATCATCATCATCA

C= 1; L=16

C= 2; L=16

C= 3; L=16

ATCGCTAGAACGTCTG C= 16; L=16

Curvas de reasociación de ADN no Curvas de reasociación de ADN no

repetitivorepetitivo (fragmentos de 500 nt)(fragmentos de 500 nt)

If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)N (genome size) is determined directly from CN (genome size) is determined directly from C00tt1/21/2

C = NC = N

(N)(N)

106

repeats

3 genes

200 genes ≈ 4,000

genes

≈ 10,000 genes

CC00tt1/21/2

Reasociación para EucariotesReasociación para Eucariotes

> 2 logs: diferentes poblaciones> 2 logs: diferentes poblaciones

≈ 25-30% Moderadamente Repetitivo 350 copias

≈ 45-55% Copia única

≈ 20-25% altamente repetitivo: 2x106 copias

Leer del Lodish!!!!Leer del Lodish!!!!

¿Qué representan las secuencias ¿Qué representan las secuencias únicas, moderadamente repetidas y únicas, moderadamente repetidas y altamente repetidas???altamente repetidas???

Empaquetamiento del ADN Eucariota

En el genoma humano tenemos 3 x 109 bp distribuidos en 23 cromosomas

La forma B-DNA ocupa 3.4 A/bp

Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de 5 m (10.000 veces)

El DNA durante la interfase se encuentra condensdo formando un complejo nucleoproteico denominado cromatina

La longitud total del ADN celular humano es de 2 metros!!!

Chromatin Proteins

Chromatin proteins 1. Histone Proteins (small, positively charged—rich in lysine and arginine residues) Core histones: H2A, H2B, H3, H4 Linker histone: H1 2. Nonhistone chromosomal proteins

El ADN se enrolla alrededor del núcleo histónico: Nucleosomas2 H2A2 H2B2 H32 H4

Nucleosomes-Contain a histone core octomer + 146 bp core DNA-Spaced ~200 bp apart(146 bp core DNA + 20-60 bp linker DNA)

“Beads on a String”

-Core DNA is protected DNases

La Histona H1 une 2 hélices de ADN

30-nm Fiber

2 Modelos para la fibra de cromatina de 30-nm

Un modelo de la estructura del cromosoma

DNA exists in chromatin form during interphase

DNA in most compact form (chromosomes) during metaphase of mitosis

¿Qué es el superenrollamiento?

Qué es el superenrollamiento?

El superenrollamiento se produce en casi

todos los cromosomas (circular o lineal)

Relajado vs Superenrollado

El ADN relajado no está superenrollado

En el superenrrolamiento negativo el ADN está subenrollado (favorece el desapareamiento de la doble hélice (el ADN circular aislado de células siempre se encuentra superenrollado negativamente

Linking Number (L or Lk) = número de veces que dos cadenas están entrelazadas

Twists (T or Tw) = número de vueltas de hélice

Writhes (W or Wr) = número de veces que el dúplex se entrecruza consigo mismo

L = T + WL = T + W

L = T + W

T = +3 T = +2 T = +1T = +0W = +0 W = +1 W = +2 W = +3

T = –3 T = –2 T = –1T = –0W = +0 W = –1 W = –2 W = –3relaxed

relaxed

Qué hacen las topoisomerasas?

1. Cambian el linking number de la molécula de ADN mediante:A) Cortando una o ambas cadenas y luego,B) Enrollarlas mas o menos y uniendo nuevamente los extremos.

2. Usualmente relajan el ADN superenrollado

Type I Topoisomerases

Topo I from E. coli 1) acts to relax only negative supercoils2) increases linking number by +1 increments

Topo I from eukaryotes 1) acts to relax positive or negative supercoils2) changes linking number by –1 or +1 increments

Maximumsupercoiled

3 min.Topo I

25 min. Topo I

Relaxation of SV40 DNA by Topo I

Type II Topoisomerases

All Type II Topoisomerases Can Catenate and Decatenate cccDNA molecules

Circular DNA molecules that use type II topoisomerases:

E. coli Eukaryotes-plasmids -mitochondrial DNA-E. coli chromosome -circular dsDNA viruses (SV40)

An E. coli Type II Topoisomerase: DNA Gyrase

Topo II (DNA Gyrase) from E. coli 1) Acts on both neg. and pos. supercoiled DNA2) Increases the # of neg. supercoils by increments of 23) Requires ATP

Sample Linking Number Questions

1) You have a relaxed 5,500 bp plasmid DNA molecule,which you treat with DNA gyrase to add 50 negative supercoils

A. How many helical turns are there in the relaxed molecule? B. What is the linking number of the molecule after treatment with DNA gyrase?

A. 5500 bp X 10 bp/turn = 550 turns

B. L = T + W = 550 – 50 = 500

•Virus cuyo material hereditario es ADN. •Virus cuyo material hereditario es ARN. •Virus cuyo material hereditario es ARN-ADN. •Virus cuyo material hereditario es ADN-ARN.

LOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓNLOS CROMOSOMAS DE VIRUS: CLASIFICACIÓN

Los virus pueden clasificarse en:

•Bacteriofagos o fagos: virus que parasitan a bacterias

•Virus Animales.

•Virus vegetales

Considerando el tipo de organismo que parasitan

Desde el punto de vista genético

VIRUS CUYO MATERIAL HEREDITARIO ES ADN

VIRUS ADN

Tipo de Molécula Tipo de HéliceTipo de virus según

huésped.Familia de virus

Circular

SencillaFago

ØX174 M13

Animal Parvovirus

Doble Animal

Papovavirus (SV40, polioma)

Adenovirus Herpetovirus

(Herpes) Poxvirus (viruela) Iridovirus (peste

porcina)

Lineal Doble Fago

Extremos cohesivos: Fago

Ø80, 434, P2, 186) Redundancia terminal: serie T-

par, T3 y T7  

                                                                                                                              

Fago filamentoso

M13

                                                                                                                                                                                                         

Esquema del bacteriofago

M13

                                                                                                                              

Fago filamentoso

M13

                                                                                                                                                                                                         

Esquema del bacteriofago

M13

                                                                                                                              

Fago filamentoso

M13

                                                                                                                                                                                                         

Esquema del bacteriofago

M13

Ha sido empleado ampliamente en estudios sobre la replicación del ADN

•tienen una cápside poliédrica •molécula de ADN circular de hélice sencilla (hebra +) con 5.400 nt

•forma replicativa duplex

de la hebra - se sintetiza el ARN mensajero que se traducirá para producir las proteínas de la cápside

ØX174

El bacteriofago M13 tiene una cápside de tipo filamentoso dentro de la cual se encuentra una molécula circular de ADN de hélice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al igual que ØX174, también pasa por una forma replicativa dúplex.

Fago filamentoso M13Fago filamentoso M13

SV40 (Papovavirus)

tiene una cápside icosaédricaADN circular doble hélice de 5.243 pares de nucleotidos.

Su ADN se asocia con las histonas de la célula huésped

El fago posee una cápside icosaédrica con una cola. Dentro de la cápside existe una molécula de ADN doble hélice lineal con 48.000 pares de bases.

fago

fagos de la serie T

cápside icosaédrica con cola que encierra en su interior ADN doble hélice lineal (aproximadamente 166.000 pb).

Presentan redundancia terminal: repetición de una secuencia de 2.000 a 6.000 bp en los dos extremos

LOS CROMOSOMA DE LAS BACTERIAS: ORGANIZACIÓN EN DOMINIOS

la primera evidencia citológica se obtuvo más tarde (Cairns, 1963) marcando radiactivamente el ADN, realizando una autorradiografía y analizando los resultados al microscopio óptico.  

La circularidad del cromosoma de E. colise demostró mediante estudios genéticos de construcción de mapas de tiempo mediante la técnica de la conjugación interrumpida (Jacob y Wollman, 1958).

F. JacobF. Jacob E. L. WollmanE. L. Wollman

En bacterias se han encontrado proteínas con características muy semejantes a

las histonas de los organismos eucariontes.

•la HU que es un dímero de subunidades diferentes y semejante a la histona H2B

•la proteína H dímero de subunidades idénticas y semejante a la histona H2A

•la proteína P semejante a las protaminas,

•la subunidad H1,

•el dímero HLP1 y

•el monómero HLP1.

PROTEÍNAS BACTERIANAS SEMEJANTES A LAS HISTONAS

PROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIASPROTEÍNAS BÁSICAS DETECTADAS EN BACTERIAS

ProteínaProteína ComposiciónComposición Contenido por Contenido por célulascélulas

Semejanza con Semejanza con eucarionteseucariontes

HUHU

Dímero Dímero subunidadesubunidades s y y de de

9.000 d.9.000 d.

40.000 dímeros40.000 dímeros Histona H2AHistona H2A

HH

Dímero Dímero subunidadesubunidades idénticas s idénticas de 28.000 d.de 28.000 d.

30.000 dímero30.000 dímero Histona H2BHistona H2B

IHFIHF

Subunidad Subunidad de de 10.500 d. 10.500 d.

Subunidad Subunidad de 9.500 de 9.500

d.d.

DesconocidoDesconocido DesconocidaDesconocida

H1H1 Subunidad de Subunidad de 15.000 d.15.000 d. 10.000 copias10.000 copias DesconocidaDesconocida

HLP1HLP1 Monómero de Monómero de 15.000 d.15.000 d. 20.000 copias20.000 copias DesconocidaDesconocida

PPSububnidad de Sububnidad de

3.000 d.3.000 d. DesconocidoDesconocido ProtaminasProtaminas

LOS PLASMIDIOS

.

Los plasmidios se pueden se clasifican según las funciones o el tipo

de información que llevan en: •Factores de Fertilidad o factores F. •Factores de resistencia de transferencia a drogas, factores RTF o

factores R. •Factores colicinógenos, factores Col o factores Cf. Las colicilinas son

sustancias que matan a las bacterias. Naturalmente las bacterias

productoras de colicilinas son inmunes a ellas.

Moléculas de ADN doble hélice circular que se replican de forma autónoma e independiente a la del cromosoma principal y que pueden, en algunas situaciones, integrarse en el cromosoma principal bacteriano y a partir de ese momento replicarse al mismo tiempo.

elementos genéticos extracromosómicos

El tamaño y número de los plasmidios es muy variable (2.000 a 100.000 pares de bases/1-100 copias por célula)

Algunas preguntas-ejercicios….Algunas preguntas-ejercicios….