CONJUGACIÓN BACTERIANA

MARZO 2013

Conjugación. Un poco de historia

• La evolución biológica está basada en: la variación genotípica de los individuos, y la selección que favorece a esos individuos y que les permite prosperar como una nueva especie, o competir y desplazar al organismo precursor. A su vez, la selección puede ser suave, de modo que los variantes sean solo un poco más aptos que el precursor, y que la sustitución ocurra lentamente; o puede ser dramática, cuando sólo los variantes sobreviven y la mayoría de los otros mueren.

Conjugación

• Cuando Darwin bosquejó estos principios básicos, los conocimientos de genética eran aun muy escasos (Mendel acababa de describir los fundamentos de la herencia apenas unos años antes).

Conjugación

• Cuando empezamos a entender las bases moleculares de la biología, las mutaciones se concibieron como la única fuente de variación para los organismos que se reproducen asexualmente, como las bacterias

Conjugación

• Lentamente, empezamos a identificar otras fuentes de variación en las bacterias, especialmene aquellas derivadas de la transferencia horizontal de genes. Pero, antes de conocerlas del todo, desatamos una presión selectiva dramática sobre las bacterias. Las consecuencias del irresponsable abuso de los antibióticos, colectivamente conocidas como "resistencia a los antibióticos“.

• La definición del papel de las mutaciones en la variación biológica empezó con el trabajo de de Vries en plantas, alrededor de 1900, y se hizo extensiva a las bacterias gracias a Beijerinck, ese mismo año.

Conjugación

• Tomó casi 30 años más el descubrimiento de una nueva y extraña forma de variación, la transformación de neumococos avirulentos en virulentos.

• Y otros 16 años para que Avery, MacLeod y McCarty, tomando el trabajo pionero de Griffith, descubrieran, de paso, la función del DNA.

• En 1953, Lederberg y Cavalli, y Hayes por su cuenta, hallaron el primer plásmido conjugativo, el "Factor F".

Como podemos ver, justamente al iniciar la "era de los antibióticos", estábamos apenas descubriendo las bases de la genética bacteriana. Desafortunadamente, la mayoría de estas habilidades bacterianas se consideraron curiosidades de laboratorio y no fueron incluidas en el conocimiento teórico que guió el uso de los antibióticos.

Conjugación

• La conjugación es un proceso de transferencia de genes entre dos células en contacto. Este proceso se inicia cuando el pelo sexual de la célula donante alcanza la envoltura de una célula receptora. El contacto célula-célula se alcanza presumiblemente o por la contracción o por el desensamblaje del pelo sexual. El apareamiento entre las células es inestable en un principio pero luego es específicamente estabilizado mediante ciertas proteínas.

Conjugación

• La transferencia de genes mediante conjugación está codificada en ciertos tipos de plásmidos. – moléculas circulares de DNA extracromosomal que

se duplica en forma autónoma. Ciertos tipos de éstos pueden integrarse al cromosoma bacteriano y duplicarse como cualquier carácter cromosomal.

• Estos plásmidos que pueden integrarse se denominan episomas.

Conjugación

• Conjugativos pero no movilizables (Tra+ Mob-).

• No conjugativos pero movilizables (Tra- Mob+).

• Conjugativos y movilizables (Tra+ Mob) / auto-transferibles.

Conjugación

• La conjugación se ha estudiado ampliamente en Escherichia coli por medio del Factor F que es un plásmido conjugativo y movilizable de 94.5 kb capaz de integrarse al cromosoma bacteriano. Este factor codifica la síntesis y ensamblaje del pelo sexual, y las funciones que median la transferencia de una copia del Factor F a una célula receptora.

Conjugación• El Factor F contiene una región de 35

kb que están involucradas en la conjugación y transferencia. Esta región contiene al oriT que es el sitio en donde se inicia la transferencia de DNA y al menos 28 genes que son designados tra y trb. Esta región de 35 kb se denomina regulón tra, debido a que los genes traM y traJ forman transcriptos separados mientras que los restantes genes forman un único operón. El locus (sitio en el genoma) que contiene al oriT se denomina bom (Basis of Mobility-Bases de Movilidad). La presencia del locus bom en un plásmido indica que el plásmido puede ser transferido a otras células por medio de los productos de los genes tra de otros plásmidos conjugativos. Las células con el locus bom son denominadas Mob+.

Conjugación

• El pelo sexual F es un cilindro hueco de aproximadamente 20 µm de largo, 8 nm de diámetro externo y 2 nm de diámetro interno, que es lo suficientemente grande para el pasaje de una molécula de DNA simple cadena. Este pelo está formado por un única subunidad proteica denominada pilina que se encuentra codificada por el gen traA.

Conjugación

• El apareamiento efectivo entre dos células donantes es impedido por la exclusión de las superficies, la que requiere de los productos de los genes traS y traT localizados en la membrana citoplasmática y en la membrana externa, respectivamente.

• la transferencia de DNA ocurre después del apareamiento célula-célula que es estabilizado por los productos de los genes traG y traN.

Conjugación• El Factor F es transferido de la célula

donante hacia la célula receptora en forma de simple cadena lineal con el extremo 5' .

• El nickeado (rotura) de una de las cadenas del Factor F. Este Factor es nickeado en el oriT por el producto del gen traI, y que se mantiene unido al extremo 5' de la cadena cortada.

• La proteína TraI, que junto al producto del gen traY tiene actividad de endonucleasa, posee actividad actividad de helicasa y ATPasa, y separa la cadena de DNA conjugante durante la translocación utilizando ATP.

• el DNA simple cadena es protegido durante la transferencia por las proteínas SSB (Single Strand-Binding Proteins) tanto en la célula donante como en la célula receptora.

Conjugación

• La transferencia del extremo 5' es acompañada por la síntesis continua de la cadena de DNA complementaria en la célula donante. Mientras que en la célula receptora, el DNA simple cadena transferido sirve como templado para la síntesis discontinua de la cadena complementaria.

Conjugación Las células pueden denominarse de diversas

maneras en relación al estado en que se encuentra el Factor F dentro de ellas:

• Células F-: Estas células no contienen al Factor F y no transfieren ni genes F ni genes bacterianos. Son eficientes células receptoras durante la conjugación.

• Células F+: Estas células contienen al Factor F en el citoplasma. Conjugación. La transferencia de genes cromosomales ocurre con una muy baja frecuencia cuando el Factor F se encuentra en este estado.

• Células Hfr: Son células que contienen al Factor F integrado al cromosoma. Pueden transferir marcadores cromosomales con alta eficiencia desde un punto fijo del cromosoma, generando un gradiente de transferencia de marcadores.

• Células F': Son células que tienen en el citoplasma al Factor F asociado con ciertos segmentos del cromosoma bacteriano. Pueden transferir al Factor F y a los segmentos asociados del cromosoma con alta eficiencia, y pueden mediar la transferencia de genes cromosomales por su integración en regiones homólogas del cromosoma.

Resistencia a antimicrobianos

Resistencia mediada por intercambio genético

Resistencia DNA cromosomal

DNA extracromosomal (plásmidos)

Transformación Conjugación Transducción Mutación

Plásmidos

Propagación de la información genética

Determinante rDeterminante rfactor de

transferencia de resistencia

(FTR),

factor de transferencia de resistencia

(FTR),

ConjugativosConjugativos

Plásmidos R o Factores R

Plásmidos R o Factores R

Controla el proceso de conjugación

Sólo confiere resistencia a la célula que los posee

1 2

•FTR y r son replicones independientes que se unen para formar el Factor R

•FTR codifica la formación de pelos específicos por los cuales se lleva a cabo el proceso de conjugación

Mecanismos bioquímicos por los que se expresa la Resistencia

1. Disminución de la permeabilidad celular:

Se genera por cambios en receptores específicos y/o pérdida de la capacidad de transporte activo para una determinada droga. También se pueden producir cambios estructurales en la membrana celular que influyen en la permeabilidad en forma no específica. A causa del cambio en la permeabilidad celular los antimicrobianos no pueden penetrar en la célula, o lo hacen en muy pequeñas concentraciones.

Mecanismos bioquímicos por los que se expresa la Resistencia

2. Inactivación enzimática de la droga:

este tipo de resistencia se debe a ciertas enzimas que producen cambios conformacionales en las drogas. Las enzimas pueden ser constitutivas o inducibles. Generalmente la aparición de este mecanismo de resistencia se debe a plásmidos R.

Mecanismos bioquímicos por los que se expresa la Resistencia

3. Modificación del sitio blanco donde actúa la droga:

este tipo de resistencia se genera por mutaciones cromosómicas, o por la acción de plásmidos, que producen cambios en enzimas o sitios activos involucrados en reacciones metabólicas esenciales para la célula. Estos cambios provocan que el antimicrobiano pierda afinidad por el sitio blanco.

Inactivación del antibiótico por plásmidos

• Se realiza mediante la producción de enzimas que hidrolizan el antibiótico.

• Son ejemplos: B-lactamasa, B-lactamasa de amplio espectro, eritromicina estereasa y enzimas modificadoras de aminoglucósidos, cloramfenicol, lincosamidas y estreptograminas.

• Los antibióticos B-lactámicos como penicilina, oxacilina, cefalosporinas,actúan inhibiendo la enzima D-alanil D-alanin carboxipeptidasa (PBPS) encargada de la síntesis de la pared. La B-lactamasa hidroliza el enlace amida del anillo penicilánico o cefalosporínico resultando un derivado ácido inactivo