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Análisis del procedimiento de tinción para la citología cervico-vaginal, en una visión global.
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Conocimientos básicos para la tinción de
citología cervico-vaginal Manual de tinción
Cit. Claudia Elizabeth Mares Alatorre
Septiembre del 2008
Análisis del procedimiento de tinción para la citología cervico-vaginal, en una visión global.
Conocimientos básicos para la tinción de citología cervico-vaginal
Septiembre del 2008
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Introducción.
Este es un trabajo de investigación
especialmente elaborado a petición de la
Dra. Ana María Gallardo Muñiz. Directora
del Laboratorio Regional de Citología
Exfoliativa del IMSS sección Jalisco.
Esperando sirva de apoyo en la técnica del
procedimiento de tinción de citologías
cervico-vaginales.
Conocimientos básicos para la tinción de citología cervico-vaginal
Septiembre del 2008
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Políticas de operación, normas y lineamientos.
La Norma Oficial Mexicana NOM 014 SSA2-1994, para la prevención, detección,
diagnóstico, tratamiento y vigilancia epidemiológica (modificada 2006), es un documento
técnico de observancia obligatoria para todas las unidades de los sectores público, social
y privado en el ámbito nacional, y las actividades y tareas en el laboratorio de citología
encuentran su sustento básicamente en ella.
La vigilancia para la aplicación de los lineamientos respecto a la tinción y montaje en los
laboratorios de citología cérvico-uterina corresponde a la Secretaria de Salud tanto del
nivel federal, como estatal, en sus respectivos ámbitos de competencia.
El director o coordinador del laboratorio deberá verificar que el personal encargado de
la tinción y montaje de las muestras citológicas realice las actividades
correspondientes.
El incumplimiento de estas políticas y normas se sancionará conforme a la Ley Federal
de Responsabilidades de los Servicios Públicos.
Propósito.
Realizar un proceso de calidad, el técnico en tinción o el citotecnólogo capacitado para
la tinción y montaje de las muestras citológicas.
Campo de aplicación.
La coloración descrita se aplica a las laminillas portadoras de muestras de frotis cérvico
vaginal para realizar el diagnóstico citológico.
Requisitos para una tinción de calidad.
El procesamiento manual de las muestras de frotis cervical fijado comprende los
siguientes sub-pasos:
Reparación ocasional de las láminas quebradas aceptadas.
Preparación y manejo de la batería de tinción.
Tinción de las muestras.
Montaje de las muestras.
Distribución de las láminas en las bandejas.
La técnica será exitosa si:
Todas las láminas aceptadas son procesadas en el tiempo establecido y se
mantiene su integridad (no se quiebran) e identificación durante el
procesamiento.
Todas las láminas están teñidas en forma apropiada lo que significa:
I. Una buena definición del detalle nuclear.
II. Una transparencia del citoplasma.
III. Una diferenciación celular.
Todas las láminas están montadas adecuadamente, lo que significa que el frotis
está protegido de la sequedad del aire, encogimiento y de desteñirse por la
oxidación y, además, proporciona una imagen transparente en el microscopio.
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Las bandejas para los citotecnólogos están preparadas correctamente lo que
significa que contienen el número de láminas que corresponde, están libres entre
sí (no pegadas), y colocadas en el orden correlativo del número de registro
citológico.
Los insumos involucrados en el procesamiento de las muestras se usan
eficientemente.
El personal se mantiene libre de problemas de salud asociada al trabajo en la
sala de procesamiento de muestras.
Área de tinción.
Características:
Físicamente separada de otros espacios.
Con una excelente ventilación hacia el exterior, ya que debido a los
contaminantes químicos, es un área de alto riesgo.
Señalizadas las medidas a tomar en caso de siniestro.
Con regadera anti-incendios y extintores.
Campana de extracción de gases tanto para la tinción, como para el montaje.
Se recomienda que los insumos sean de buena calidad.
Contar con un área de bodega protegida de incendios para los reactivos y
tinciones inflamables.
La sala debe contar con un sector de lavado, equipado con lavadero.
Los recursos de una sala de procesamiento manual se clasifica en:
a. Mobiliario.
b. Equipos.
c. Insumos.
Mobiliario y equipos del área de procesamiento de muestras.
Mobiliario. Lavatorio dotado de llaves de agua potable con filtro de agua, en lo posible de acero inoxidable. Mesón de acero inoxidable de 190 x 70 x 90 cm. donde esta montado el lavatorio. Mesas altas de laboratorio de 190 x 70 x 90 cm. en lo posible, de acero inoxidable. Estantes con vidriera para insumos. Sillas.
Equipos e insumos. Campana de extracción de gases. Horno de secado de láminas (opcional). Mechero de Bunsen. Cronómetro. Cubetas de tinción de 1000 ml. con tapa. Gradilla de tinción para laminillas.
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Bandejas para lectura de laminillas con capacidad para 60 y de 10 laminillas por corrida cómodas. Probetas graduadas de 1000, 500, 100 y 10 ml de vidrio. Frascos de Erlenmeyer de Pyrex de 1000 y 2000 ml. Vasos de precipitado de Pyrex de 10, 100 y 1000 ml. Embudo de plástico. Pipetas graduadas de 10 ml. Garrafón de agua destilada. Papel filtro Whatman no. 4 Frascos de vidrio color oscuro para almacenamiento 1000 ml. Gasa para montar y limpiar laminillas. Balanza. Pinza pequeña. Lápiz con punta de diamante. Láminas portaobjetos de vidrio de 75 x 25 x 0.6 a 1.2 mm. Laminas cubreobjetos de vidrio de 50 x 24 x 0.25 mm. Guantes desechables
Insumos. (Colorantes y reactivos.) Hematoxilina de Harris. Colorante OG 6 Colorante EA 50 Acido clorhídrico fumante. Etanol 96% Etanol 100% CH3CH2OH Xilol. C6H4(CH3)2 Medio de montaje. (resina sintética para extendidos, bálsamo de Canadá o liquido para montaje). Otros (carbonato de litio, hidróxido de amonio, ácido Fosfotúngsticico o reactivos para hacer colorantes)
Campana de extracción de gases.
La campana de extracción de gases generalmente tiene una velocidad de 100 pies por
minuto. Se usa para los gases y vapores riesgosos generados al interior del espacio de
la campana sean capturados antes de entrar a la zona de respiración del operador. Sirve
para reducir la exposición a contaminantes aéreos. Tanto la batería de tinción como el
montaje de láminas requieren campana de extracción de gases.
Cubetas de tinción.
Las cubetas de tinción grandes permiten disminuir significativamente el tiempo de
tinción. Se recomienda utilizar cubetas de vidrio o de buen acero inoxidable diseñadas
especialmente para tinción citológica o histopatológica. Al contar con tapas herméticas
disminuye considerablemente la evaporación de los colorantes y alcoholes.
Material de laboratorio.
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La cantidad de material de laboratorio como probetas, embudos, mecheros, etc., varían
según si se compran colorantes listos para usarse o se compran los ingredientes para
prepararlos.
Portaobjetos y cubreobjetos.
Conviene comprar material de vidrio de buena calidad.
Insumos.
En cuanto a insumos, los Laboratorios de Citología tienen distintas modalidades de
adquisición de los insumos para el procesamiento de las muestras y de dicha modalidad
dependerán los insumos específicos requeridos. Las cantidades necesarias de insumos
son afectadas por el rendimiento de la batería de tinción.
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Principio y ventaja del método de tinción de Papanicolaou.
La tinción de Papanicolaou es un método de tinción poli crómico que consta de una
tinción nuclear y un contraste citoplasmático. Tiene como ventaja:
a. Una buena definición del detalle nuclear, evidenciando el patrón de cromatina
de las células.
b. Un aspecto transparente de los citoplasmas y una diferenciación celular, que
permite apreciar grados de maduración celular y actividad metabólica.
Es un método basado en la diferenciación de color de los diversos componentes
celulares, se aplica a los diversos tipos celulares para el diagnóstico de cambios
malignos y la tipificación celular.
La tinción de Papanicolaou tiene cuatros pasos principales:
Fijación (realizada al momento de tomar la muestra).
Tinción del núcleo con la hematoxilina.
Tinción del citoplasma con Orange G y EA.
Aclaramiento.
La tinción de Papanicolaou usa tres colorantes:
Hematoxilina.
OG 6
EA 50
Los pasos de la tinción están entremezclados con soluciones que hidratan, deshidratan
y enjuagan las células.
Coloración básica Coloración ácida.
Hematoxilina de Harris Eosina. Orange G.
Tinción.
Es importante señalar que éste es un procedimiento que tiene variaciones e incluso
preferencias personales en la coloración.
Enjuague.
El enjuague se realiza con agua corriente y/o agua destilada, pero siempre hay que
verificar que el pH del agua se encuentre entre 6.5 y 7.
Hidratación.
La hidratación antes del colorante de hematoxilina puede ser:
Gradual usando alcohol en concentraciones decrecientes 80-70-50 %
Abrupta, sumergiendo el material celular desde altas concentraciones de alcohol
y al agua directamente.
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Tinción del núcleo.
Existen dos métodos para teñir el núcleo:
Método progresivo. Se tiñe el núcleo con la intensidad de color deseada.
Método regresivo. Se sobre-tiñe con hematoxilina no acidificada, luego se
remueve el exceso de tinción con ácido clorhídrico diluido.
Después de la hematoxilina, las laminillas se lavan en agua.
Tinción del citoplasma.
Orange G 6, es una tinción monocromática y EA 50, es una tinción policroma
compuesta.
Colorante. Elementos celulares.
Hematoxilina de Harris. Afinidad por la cromatina. Tiñe el núcleo.
OG 6 Tiñe la queratina. Penetra rápidamente al citoplasma.
EA 50 Tiñe el citoplasma de las células escamosas cianofílas y eosinofílas. Nucléolos y cilios.
Aclaramiento.
Es el paso final de la tinción y produce transparencia celular. Se suele usar Xilol como
solución aclaradora.
Montaje.
Objetivo del montaje.
Es la unión del portaobjetos mediante un medio de montaje que cubre el área bajo el
cubreobjetos para:
Obtener una muestra cubierta.
Proteger la muestra contra el secado y arrugamiento del material celular.
Sellar, evitando así la oxidación de la muestra.
Características del medio de montaje.
1. Debe ser soluble en el agente aclarante.
2. Debe tener un índice de refracción que coincida con la muestra y el
cubreobjetos, logrando una imagen lo más transparente posible.
3. Debe tener un pH neutro.
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Preparación de soluciones.
Fundamentos.
Las soluciones son mezclas homogéneas de dos o mas sustancias. Una solución es una
mezcla de un soluto en un disolvente, entendiéndose por soluto la sustancia que esta en
menor proporción y disolvente la sustancia que esta en mayor proporción.
Existen soluciones solidas, liquidas y gaseosas.
Tipos de soluciones:
Para conocer la cantidad de soluto que hay en un volumen dado de solución es
necesario conocer la concentración de nuestra solución: las cantidades relativas de
soluto y disolvente.
Si el soluto se encuentra en exceso con respecto a la cantidad de disolución del
disolvente se tendrá una solución saturada.
Una solución saturada permite definir con precisión la solubilidad de un sólido en un
liquido.
La solubilidad es la capacidad de una determinada sustancia para disolverse en un
liquido. Puede expresarse en:
moles por litro.
Gramos por litro.
Porcentaje de soluto/disolvente.
Cuando se mezclan un soluto y un disolvente se libera energía porque las partículas del
soluto y del disolvente se atraen.
Soluciones empíricas:
Son aquellas en las que las cantidades de soluto o de solvente se conocen en forma
relativa pero no exacta. Estas soluciones se utilizan principalmente en análisis
cualitativo y dentro de estas se encuentran:
Solución diluida:
Formada por una mínima cantidad de soluto en relación de la cantidad de
disolvente.
Ejemplo: solución de HCL al 5%
Solución saturada:
Es la que a la temperatura ambiente del disolvente disuelve el máximo del soluto
posible.
Ejemplo: solución saturada de Li2CO3 (carbonato de litio).
Solución sobresaturada:
Es aquella que contiene mas soluto del indicado por la concentración de
equilibrio.
Ejemplo: cuando en la solución saturada de Li2CO3, al prepararse se
agrega una cantidad mayor de carbonato de litio de la requerida.
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Macroscópicamente observamos una solución mas blanquecina y en el
fondo del recipiente se observan gránulos de Li2CO3 que no se
disolvieron por la sobre-saturación.
Para preparar este tipo de solución se debe disolver el soluto a una temperatura mayor
que la temperatura de equilibrio.
Soluciones de concentración conocida.
Son aquellas en las que se conoce el contenido del soluto respecto a la cantidad del
disolvente o de solución. Este tipo de soluciones se utilizan en análisis cuantitativo y
dentro de estas se encuentran:
Solución porcentual. %
Solución formal. F
Solución molar. M
Solución normal. N
Partes por millón. ppm
Fracción mol. X
Solución titulo. T
SOLUCIÓN PORCENTUAL.
El porcentaje normalmente se utiliza para especificar la concentración de la solución
preparada al diluir un liquido puro en otro liquido. Por ejemplo, una solución acuosa de
metanol al 5% indica que dicha solución se preparo al diluir 5 ml de metanol puro con
agua hasta 100ml de solución
Preparación de colorantes
La preparación de los colorantes en el Laboratorio permite disminuir los costos de la
batería de tinción.
Preparación de los colorantes para la citología cervino-uterina adaptada de Koss.
Hematoxilina de Harris.
Reactivos para preparar 1000 ml de hematoxilina de Harris.
Hematoxilina cristales obscuros 5 g
Etanol 100% CH3CH2OH 50 ml
Sulfato de amonio y aluminio 100 g
Agua destilada 1000 ml
Oxido de mercurio (HgO) 2.5 g
Procedimiento para prepara hematoxilina.
a. Disolver cristales de hematoxilina en etanol.
b. Disolver el sulfato de amonio y aluminio en agua destilada por
calentamiento.
c. Añadir la solución de hematoxilina a la solución de sulfato.
d. Hacer que la mezcla anterior alcance la temperatura de 95°C.
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e. Retirar de la llama, añadir lentamente y agitando el óxido de mercurio
hasta que la solución tome un color púrpura oscuro.
f. Introducir inmediatamente la solución en un baño de agua fría.
g. Filtrar la solución cuando esté fría.
h. Guardar la solución en frascos de color marrón oscuro y dejar en reposo
durante 48 hrs.
i. Para el uso: diluir la cantidad requerida con un volumen igual de agua
destilada y filtrar de nuevo.
Esta preparación tiene una duración de meses a años.
Orange G 6
Existen al menos dos fórmulas para la tinción Orange G, una de las cuales es OG
6 y la otra OG modificado. Se detallara a continuación la fórmula OG 6.
Reactivos para preparar 1000 ml de Orange 6.
Cristales de Orange G 10 g
Agua destilada 100 ml
Etanol al 95% 1000 ml
Acido fosfotúngstico 0.15 g
Procedimiento para preparar Orange G 6
1) SOLUCIÓN MADRE 1
Preparar una solución acuosa de Orange G al 10% del siguiente
modo: disolver 10 g de cristales de Orange G (color Índex
Number 16230) en 100 ml de agua destilada. Agitar bien y dejar
en reposo durante una semana antes del uso.
2) SOLUCIÓN MADRE 2
Preparar una solución al 0.5% del siguiente modo: tomar 50 ml de
la solución madre N°1 y añadir etanol al 95% hasta un volumen
de 1000 ml.
3) COLORACION FINAL.
Tomar 1000 ml de la solución madre N°2 y añadir 0.15 g de ácido
fosfotúngstico. Mezclar bien. Conservar en frasco de color marrón
oscuro con tapón.
Utilizar la concentración máxima. Filtrar antes de uso.
Eosina Alcohol 50
Existen varias formas para preparar el colorante EA 50. Se describe a continuación
la preparación de EA 50.
Reactivos para preparar 2000 ml de EA 50
Eosina amarillenta 10 g
Pardo Bismark amarillento 10 g
Verde luz SF amarillento 10 g
Agua destilada 300 ml
Etanol al 95% 2000 ml
Acido fosfotúngstico 4 g
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Carbonato de litio saturado 20 g
Procedimiento para preparar EA 50
a) Soluciones acuosas madres
Preparar soluciones al 10% separadas de cada uno de los
colorantes del siguiente modo:
Disolver 10 g de eosina en 100 ml de agua destilada.
Disolver 10 g de pardo Bismark en 100 ml de agua
destilada.
Disolver 10 g de verde luz SF en 100 ml de agua
destilada.
b) Colorante final
Soluciones alcohólicas preparadas en base a las soluciones
acuosas.
Tomar 50 ml de solución madre de eosina, 10 ml de
solución madre de pardo Bismark y 12.5 ml de
solución de verde luz SF y añadir etanol al 95% hasta
obtener la mezcla de 2000 ml.
Añadir 4g de ácido fosfotúngstico y 20 gotas de
solución de carbonato de litio saturada. Mezclar bien.
Conservar la solución en frascos de color marrón
oscuro herméticamente cerrados.
Utilizar la concentración máxima. Filtrar antes del uso.
La solución madre saturada de carbonato de litio se
prepara con :
+ Carbonato de litio (Li2CO3) 1.5 g
+ Agua destilada 100 ml
La solución de trabajo saturada de carbonato de litio
se prepara agregando 30 gotas de solución madre a
1000 ml de agua destilada.
Solución de ácido clorhídrico al 0.5 %
Reactivos Acido clorhídrico 1N Acido clorhídrico 12N (fumante)
HCL Acido clorhídrico
60 ml 5 ml
Agua destilada Completar a 1000 ml Completar a 1000 ml
Procedimiento.
Preparar una solución al 5% de ácido clorhídrico agregando 60 ml de
ácido clorhídrico IN, a una probeta graduada de 1000 ml con 700 ml de agua
destilada aproximadamente, deje enfriar y agregue agua destilada adicional a la
probeta para completar un volumen total de 1000 ml. si tiene ácido clorhídrico
fumante o concentrado, con una concentración de aproximadamente 12N, debe
usar solo 5 ml de acido clorhídrico.
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Solución amoniacal al 0.5 %
Preparar una solución al 5% de hidróxido de amonio agregando 5 ml de
hidróxido de amonio y completar un volumen de 1000 ml.
Resina o liquido para montaje.
Existen varias opciones como medio de montaje:
a. Bálsamo de Canadá.
Índice de refracción 1.53 es una oleorresina natural, se obtiene del
abeto.
Desventajas:
Toma color amarillo.
Se decoloran las placas.
Demora mucho tiempo en secarse.
La lámina se necesita secar en un horno después del montaje.
b. Resina sintética.
Debe ser de buena calidad, de tal manera que se adhiera rápida y
firmemente al cubreobjetos.
Ventajas:
Se conserva transparente.
El secado en horno es opcional.
c. Estellán.
Índice de refracción 1.49. Sintético. Es una combinación de resinas
(solución de polímeros) disueltos en xilol o neoclear.
Ventajas:
Seca en 20 minutos.
Se conserva transparente.
Las placas duran aproximadamente 5 años sin decolorarse.
d. Neomount.
Puede considerarse esta opción que específicamente utiliza neoclear.
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Cuidados a los colorantes.
Se deberán tener los siguientes cuidados:
1. Verificar que las soluciones estén rotuladas indicando:
A. Fecha de preparación.
B. Nombre de la solución.
C. Titulación.
D. Concentración.
E. Requisitos para almacenar.
F. Advertencias para su manejo.
G. Fecha de vencimiento.
2. Conservar los colorantes en:
A. Envases oscuros
B. Bien tapados porque son sensibles a la luz.
C. Se * oxidan a temperatura ambiente.
D. Almacenar las soluciones inflamables en un área aprobada anti-fuego.
E. No manejar los colorantes cerca de estufas o fuentes oxidantes.
F. Almacenar las soluciones de tinción entre 15°C Y 25°C. después de abrir
el frasco si es almacenado entre 15°C y 25°C es utilizable hasta la
fecha de caducidad indicada.
*oxidación. Corrosión seca, reacción de un material con el medio
ambiente. Reacción de un material con el oxigeno, si este oxido es
estable se formara una capa en la superficie, el material aumenta su peso
y volumen.
3. El tren de tinción se cambiara:
A. Cada 2000 laminillas teñidas.
B. Cada 6 u 8 semanas.
4. Batería de tinción:
A. Preparar una batería de tinción exclusiva para las muestras de examen
de Papanicolaou.
B. Rotular las cubetas.
C. Los colorantes se deben filtrar inmediatamente antes de llenar las
cubetas, usando un embudo y papel filtro.
D. La batería de tinción requiere estar bajo campana de extracción de
gases.
E. La batería de tinción debe encontrarse en una sala con buena
ventilación.
5. Si el laboratorio procesa muestras no ginecológicas, estás deben teñirse en una
batería diferente, pera prevenir el riesgo de contaminación cruzada.
6. Se deberá realizar dos tipos de mantenimiento en los colorantes:
A. Mantenimiento general.
Filtrar los colorantes cada 8 días para remover cualquier material celular
que se haya desprendido usando papel filtro.
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Si se usa un papel filtro de mediana velocidad se retiene la
mayoría de las partículas microscópicas produciendo un filtrado
claro. El papel filtro tiene un número que indica su poder de
retención.
Limpiar las cajas de todo residuo de colorante y verificar que estén
libres de sedimentos.
Controlar diariamente el nivel de las soluciones de la batería de tinción.
Rellenar las cubetas si falta solución.
Tapar las cubetas con soluciones y colorantes cuando no se usen y el
mayor tiempo posible cuando estén en uso, para evitar evaporación.
B. Mantenimiento específico.
En la hematoxilina, se debe retirar la capa de aspecto metálico
que se forma sobre el colorante con papel absorbente o
filtración.
El Orange G y EA deben ser remplazados cada semana.
El HCl al 0.5 % debe ser remplazado diariamente.
El etanol es altamente *higroscópico. Es indispensable
mantenerlo bien tapado.
*higroscópico. Todos los compuestos que atraen agua, estos
compuestos son utilizados como desecantes.
Los alcoholes para re- hidratar y deshidratar usados antes de la
tinción del citoplasma, deberían remplazarse semanalmente.
Descartar los alcoholes de enjuague si están muy teñidos.
Los alcoholes usados después de la tinción del citoplasma se
cambian generalmente de un modo rotatorio, es decir, se
descarta el alcohol que sigue a la tinción y los otros dos se
mueven a la 1ra y 2da posición.
Los alcoholes absolutos deben ser mantenidos libres de agua con
el agregado de pellets de Silica Gel con esto se puede disminuir
el riesgo de la contaminación acuosa del xilol.
El xilol debe cambiarse si aparece teñido con colorantes del
citoplasma.
Si tiene agua la solución aparece como lechosa y se puede alterar
el aclaramiento.
Tinción de las muestras.
1.-Poner las láminas en los carros de tinción, ordenadas y todas en la misma
posición. El técnico debe trabajar con guantes.
2.-Se especifica el procedimiento detallado de tinción con el método regresivo
para tinción nuclear.
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3.-Se recomienda que cada laboratorio mantenga por escrito su procedimiento de
tinción en un lugar visible de la sala de procesamiento de tinción y en un lugar
visible de la sala de procesamiento para contribuir a una rutina de tinción
estable.
Eliminación del fijador.
Para iniciar el proceso de tinción nuclear es necesario eliminar el fijador de las
laminillas, que usualmente es en base a polietilenglicol. Para ello se realiza un
lavado con agua destilada o sumergiendo las láminas en etanol al 95%, seguido
por un lavado con agua destilada.
Evitar problemas con los alcoholes o colorantes.
Los carros de tinción deben ser completamente escurridos entre una y otra
cubeta para evitar la dilución de los colorantes o la alteración de los alcoholes,
sin llegar al secado del frotis lo que produciría una coloración irregular. Se
recomienda que el carro de tinción repose por unos segundos en papel
absorbente después que ha sido retirado de una cubeta.
Tiempos de inmersión.
Cada inmersión del carro de tinción con laminas en las cubetas de soluciones o
colorantes debe durar 1 0 2 segundos y se efectúa suavemente sin llegar a
tocar la base de la cubeta, para que no se desprendan las células.
Intentar mantener las cubetas tapadas el mayor tiempo posible durante el
proceso de tinción.
Las láminas teñidas se deben mantener en una cubeta con xilol hasta el
momento del montaje.
Asear cuidadosamente los materiales ocupados y la superficie de trabajo una
vez terminada la tinción de un conjunto de láminas.
Lavarse cuidadosamente las manos.
Montaje de las láminas.
Todo el procedimiento de montaje de las láminas debe realizarse bajo campana de
extracción de gases si se usan medios de montaje con solventes.
Tomar, bajo la campana de extracción de gases, la laminilla teñida y
retirarla de la canastilla.
Revisar que esté seca la parte posterior de la muestra, antes de iniciar el
montaje.
Utilizar un medio de montaje de preferencia de secado rápido.
Aplicar una gota de resina sobre el portaobjetos y colocar sobre éste el
cubreobjetos.
Retirar el excedente de resina y colocarla sobre la charola
ordenadamente.
Cuidados que se deben tener con la resina:
1. Cuidar que no se formen burbujas
2. No se agregue resina en exceso.
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3. Limpiar con gasa los bordes.
4. Separar una de otra las laminillas para evitar que no se peguen.
Asear cuidadosamente todos los implementos usados para procesar
muestras o descartarlos después del uso.
Puede ocurrir contaminación cruzada durante el montaje si el gotario o
la pipeta usada para aplicar el medio de montaje toca las células de una
muestra y después de otra muestra.
Lavar cuidadosamente las manos.
Reparar las laminillas quebradas aceptadas.
Cuando se ha aceptado una lámina quebrada, el trozo del portaobjeto donde se
encuentra la mayor parte del frotis extendido, se adosa con un clip a un portaobjeto en
un buen estado y de este modo se somete a tinción.
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OBJETIVO DE CADA REACTIVO.
Función general.
Hematoxilina Tinción nuclear.
OG 6 y EA 50 Tinción citoplasmática.
C6H4(CH3)2 Xilol
Aclaramiento.
CH3CH2OH Alcohol absoluto.
Deshidratación total.
Alcohol etílico La función principal es deshidratar, puede ser sucesiva, gradual o abrupta según el lugar que ocupe dentro de la tinción. La función secundaria es el enjuague
Agua Enjuague.
Solución de HCL .05% Remueve el exceso de hematoxilina.
Función especifica.
Reactivo. Función en el colorante. Función en la célula.
Hematoxilina. El componente activo es la hemateína (tiene cargas negativas) que se obtiene de la oxidación (maduración)
Una vez que se da la maduración toma un color rojo vinoso, tonalidad que toman los núcleos.
Sulfato de potasio y aluminio.
*Mordiente. Piedra alumbre. Color ámbar claro. Con esta sustancia se da color a la hematoxilina.
Suministra cargas positivas, que actúan como puentes químicos para unirse a las cargas negativas de la hemateína y del ácido fosfórico de las cadenas de DNA nuclear. Graba el color en las células.
CH3COOH glacial. Acido acético glacial.
Diferenciador. Estabiliza el colorante. Previene la oxidación.
Incrementa la precisión de la tinción nuclear.
Alcohol 96% Evita la contaminación con hongos
Agua destilada Medio de trasporte para disolver el sulfato de potasio y aluminio por calentamiento.
HgO. Oxido de mercurio. (Rojo o amarillo).
Activa la hematoxilina para obtener POR OXIDACIÓN la hemateína. (Maduración).
LA HEMATEINA da la tonalidad a los núcleos.
Reactivo. Función en el colorante. Función en la célula.
Orange G Cristales. Colorante especifico para teñir células queratinizadas.
Penetra rápidamente al citoplasma. Tiñe el citoplasma del
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epitelio escamoso simple maduro y queratinizado.
Acido fosfotúngstico. *Mordiente.
Graba el color en la célula.
Etanol 95% Evita la contaminación con hongos.
Agua destilada. Medio de trasporte para Disolver los cristales de Orange G
Reactivo. Función en el colorante. Función en la célula.
Eosina amarillenta. Colorante de fondo o contraste.
En unión con el colorante nuclear da tono rosa al citoplasma. Colorea el citoplasma de las células escamosas, nucléolos y eritrocitos.
Verde luz SF amarillento. Colorante diferencial. Da tono verde azul a los citoplasmas de: Células intermedias. Células de la capa profunda. Células columnares. Histiocitos. Leucocitos.
Vesuvina o Pardo Bismark amarillento.
Reactivo de contraste.
Determina los colores verde-azul o rosa de los citoplasmas.
Acido fosfotúngstico. *Mordiente Une el light green con las proteínas de la célula. Graba el color en la célula.
Li2CO3 Carbonato de litio.
Diferenciador.
Alcohol 96% Evita la contaminación con hongos.
Agua destilada. Medio de transporte. Básico para soluciones madre. Disolver reactivos. Como solución acuosa saturada en combinación con el carbonato de litio.
*MORDIENTE. Un reactivo mordiente es el que sirve de intermedio eficaz para fijar los
colorantes. Graba el color en la célula.
Resultados de tinción.
Componente. Coloración. Función.
Núcleo. Coloración perfecta. Colorante nuclear.
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20
Cromatina. Color azul o púrpura. Dar coloración perfecta a todos los componentes del núcleo.
Membrana nuclear. Color azul o púrpura.
Nucléolo. Color rojo, rosado o naranja.
Citoplasma. Color eosinófilo y/o cianófilo. Color amarillo o naranja, si hay presencia de queratina. Coloración homogénea, estable y transparente.
Colorante citoplasmático. Permitir la diferenciación entre las células
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Problemas con la tinción.
Coloración nuclear demasiado pálida. Fijador con aerosol:
Mal agitado antes de usar.
Aplicado muy cerca o muy lejos del frotis.
Deficiente remoción del fijador de los frotis.
Hematoxilina:
Contaminada con fijador, esto reduce su capacidad de penetrar al núcleo.
Tiempo insuficiente con hematoxilina.
Hematoxilina diluida con agua porque las láminas no fueron bien estiladas.
Hematoxilina poco madura. HCL:
Muy concentrado.
Demasiadas inmersiones en HCL.
HCL mal removido. Tinción antigua, sobre-usada o usada por mucho tiempo. Frotis desecado antes de ser fijado. Lavado en agua corriente con mucho cloro (muy acida) o por tiempo excesivo blanquea el núcleo. Otros.
Coloración nuclear muy oscura. Células sobre-teñidas en caso de frotis irregular con áreas gruesas y finas.
En frotis hemorrágicos el pH cambia y hay mayor afinidad por la hematoxilina.
Laminas fijadas en alcohol de mayor concentración.
La muestra fue sobre-teñida con hematoxilina.
Mal enjuague.
Se hicieron pocas inmersiones en HCL.
La concentración de HCL es más baja que la recomendada.
Otros.
Citoplasma pálido Laminas después de OG 6 y EA sometidas mucho tiempo o a muchas inmersiones en alcohol que remueve el
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color del citoplasma y lo deja muy pálido.
Falta de colores citoplasmáticos contrastante.
Colorantes OG y EA están agotados.
Color del citoplasma no consistente. Frotis secado al aire antes de la fijación.
Niveles de soluciones insuficientes en una o mas cubetas.
Deficiente remoción de polietilenglicol del fijador
Láminas demasiado tiempo en el alcohol o soluciones aclarantes después de OG y EA.
Tiempo excesivo en hematoxilina.
La hematoxilina no se removió antes de OG y EA.
Lavado de las láminas entre soluciones inadecuadas.
Lavado insuficiente después de los colorantes.
Estilado inapropiado de láminas entre enjuagues.
El pH del agua destilada no es suficientemente alcalino.
Variación de la temperatura del agua.
Grosor irregular de la muestra.
Sumersión inadecuada de las láminas en las cubetas de otros colorantes.
Otros.
Citoplasma demasiado verde o azul o rosado.
Debe revisarse la tinción EA, puede tener un exceso de colorante verde u otra variación.
Citoplasma rojizo o rosado sin diferenciación.
Frotis seco antes de ser fijado.
Presencia de bacterias cocáceas en el frotis.
Colorante agotado que debe reemplazarse.
Citoplasma gris o púrpura. Exceso de tinción de hematoxilina o mala remoción de ella con HCL.
Lámina irregularmente teñida. Fijador con aerosol mal agitado antes de usar.
La fijación es irregular.
Láminas muy pálidas en general. Fijador con aerosol aplicado muy cerca o muy lejos del frotis.
Apariencia deslustrada, grisácea nebulosa de las células de las láminas.
Mala remoción del fijador antes de teñir.
Se han contaminado con agua las soluciones deshidratadoras y
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aclarantes.
Contaminación cruzada de las láminas.
Células desprendidas de un frotis que se adhieren a otro cuando quedan suspendidas en
el liquido de alguna cubeta de la batería de tinción.
Se reconoce al microscopio ya que se observa en un plano visual diferente o porque
presentan una coloración distinta y acentuada.
Para disminuir el riesgo de contaminación cruzada se requiere:
Mantener una batería de tinción exclusiva para las muestras
ginecológicas.
Filtrar los colorantes y las soluciones diariamente.
Agitar suavemente los canastillos de tinción.
Usar un sistema de filtro separador.
Problemas en el montaje de láminas.
Espesamiento del medio de montaje. La evaporación del solvente del medio de montaje produce espesamiento. Es necesario verificar la viscosidad del medio de montaje.
Burbujas en la lámina. La evaporación muy rápida del solvente genera burbujas de aire en el medio de montaje a medida que se seca.
Coloración café del núcleo o citoplasma. Cuando los frotis se dejan secar antes de ser montados y cubiertos con resina puede ocurrir este fenómeno. La observación de áreas de de color pardo indica la presencia de aire en el proceso de montaje. Para arreglarlas se ponen al xilol, después alcohol absoluto. Alcohol 95%, agua corriente y se retiñe el citoplasma (OG y EA).
Hongos en las láminas Se presenta en sitios muy húmedos y con calor. Se evita no exponiendo las láminas al aire y filtrando los líquidos de la batería de tinción.
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Métodos de coloración.
Manual de procedimientos de Lima 2000.
Método de coloración Merck.
ALCOHOL 96% 10 seg ALCOHOL 96-80-70-50 %
H2O H2O
HEMATOXILINA 1-3 min HEMATOXILINA 3 min
H2O
SOL’N HCL 0.5% 1-4 veces
H2O
SOL’N AMONICAL 0.5% 1 min
H20
ALCOHOL 96% 10 seg ALCOHOL 50-70-80-96 %
OG 6 2 min OG 6 3 min
ALCOHOL 96% 5 seg ALCOHOL 96%
ALCOHOL 96% 5 seg ALCOHOL 96%
EA 36 2 min EA 31 o 50 3 min
ALCOHOL 96% 5 seg ALCOHOL 96%
ALCOHOL 96% 5 seg ALCOHOL 96%
ALCOHOL ABSOLUTO 10 seg ALCOHOL ABSOLUTO 5 min
ALCOHOL ABSOLUTO 10 seg
XILOL 10 seg ALCOHOL-XILOL
XILOL 10 seg XILOL
XILOL 10 seg XILOL 2 min
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Manual de procedimientos OMS. 2002
Tinción e interpretación. 2006
Alcohol 96 % 10 inmersiones
H20 3 min H2O H2O DESTILADA
10 inmersiones 10 inmersiones
HEMATOXILINA 3 min HEMATOXILINA 2-5 min
H2O 3 min H2O
SOL’N HCL 0.5% 20 inmersiones SOL’N HCL 0.5% 3-5 inmersiones
H20 5 min H2O DESTILADA 10 inmersiones
ALCOHOL 96% 10 inmersiones Alcohol 96 % 10 inmersiones
ALCOHOL 96% 10 inmersiones Alcohol 96 % Alcohol 96 %
10 inmersiones 10 inmersiones
OG 6 2 min OG 6 1.5-6 minutos
ALCOHOL 96% 10 inmersiones ALCOHOL 96% 10 inmersiones
ALCOHOL 96% 10 inmersiones ALCOHOL 96% ALCOHOL 96%
10 inmersiones 10 inmersiones
EA 50 1.5 min EA 50 1.5-6 minutos
ALCOHOL 96% 10 inmersiones ALCOHOL 96% 10 inmersiones
ALCOHOL 96% 10 inmersiones
ALCOHOL ABSOLUTO 10 inmersiones ALCOHOL ABSOLUTO 10 inmersiones
ALCOHOL ABSOLUTO 10 inmersiones ALCOHOL ABSOLUTO 10 inmersiones
ALCOHOL ABSOLUTO 10 inmersiones ALCOHOL ABSOLUTO 10 inmersiones
XILOL 10 inmersiones XILOL 10 minutos
XILOL 10 inmersiones XILOL 10 minutos
XILOL mantenimiento XILOL 10 minutos
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Introducción al citodiagnóstico. 1975
Atlas of Cytology. Papanicolaou. 1954,1956 y 1963
ALCOHOL 96% 15-20 min ALCOHOL 80-70-50 %
H20 10-15 seg H2O DESTILADA
HEMATOXILINA 3 minutos HEMATOXILINA 6 minutos
H20 10-15 seg H2O
SOL’N HCL 0.5% 2-5 seg SOL’N HCL 0.25% 6 tiempos
H20 10-15 seg H20 6 minutos
SOL’N AMONICAL 1% 4-7 seg
H20 10-15 seg
ALCOHOL 96% 25-30 seg ALCOHOL 50-70-80-95 %
OG 6 2 minutos OG 6 1.5 MINUTOS
ALCOHOL 96% 20 seg ALCOHOL 95% ALCOHOL 95%
EA 50 3 minutos EA 50 1.5 MINUTOS
ALCOHOL 96% 10 seg ALCOHOL 95%
ALCOHOL 96% 10 seg ALCOHOL 95%
ALCOHOL 96% 10 seg ALCOHOL 95%
ALCOHOL ABSOLUTO 10 seg ALCOHOL ABSOLUTO
ALCOHOL ABSOLUTO 10 seg
XILOL 20 seg ALCOHO-XILOL 50%
XILOL 20 seg
XILOL 20 seg XILOL
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Observaciones.
Cada inmersión de la canastilla debe durar 1 o 2 segundos.
Se efectúa suavemente sin llegar a tocar la base de la cubeta para que no se
desprendan las células y para evitar el quebrar la cubeta.
Preparación de colorantes.
Algunos métodos de tinción proponen el uso de una solución amoniacal al 5%, también
se puede utilizar una solución saturada de carbonato de litio o agua caliente, si el
agua es alta en su concentración mineral se puede utilizar a temperatura ambiente.
Se utiliza para obtener un cambio abrupto del pH ácido obtenido y provocar un viraje
celular o azulamiento, gracias a la descolorización controlada, para llegar a una tinción
nuclear que sea óptima.
Para madurar la hematoxilina se puede utilizar como agente oxidante el oxido de
mercurio o el yodatato de sodio, en algunos manuales indican la utilización de 1 ml de
ácido acético por cada 200 ml de colorante para intensificar la tinción nuclear. 24 hrs
antes de usar, (para la conservación del colorante).
Para madurar el OG 6 y EA 50 se puede agregar 0.5 g de ácido fosfotúngstico en una
solución de 5ml. 24 hrs antes de usar.
Si el xilol se nota blanco pero sin burbujas se pude agregar unas gotas de alcohol
absoluto para que disminuir lo turbio del xilol.
Para retirar todo el fijador se puede agregar unas gotas de la solución de HCL 5% al
alcohol antes de la hematoxilina.
Se pueden utilizar concentrados de EA 36 (eosina original en la tinción de Papanicolaou
porque la diferenciación entre las células basofilas o acidofilas es mejor), EA 50 o EA 65.
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Reactivos
OG-6 COLORANTE PAPANICOLAU Solución colorante utilizada en laboratorios de histopatología para tinción celular según procedimiento de Papanicolaou. Se OG-500 Envase con 500 ml. complementa con la Hematoxilina de Harris y con el EA-50 OG-1000 Envase con 1000 ml. de Papanicolaou. C16H10N2O7S2Na2 P.M. 452. 38 CAS: 1936-15-8
f
xi
t
rojo
EA-50 COLORANTE PAPANICOLAU Solución colorante utilizada en laboratorios de histopatología para tinción celular según procedimiento de Papanicolaou. EA-500 Envase con 500 ml. Se complementa con la Hematoxilina de Harris y con el OG-6 de Papanicolaou. EA-1000 Envase con 1000 ml. Papanicolaou.
f
t
rojo
HEMATOXILINA DE HARRIS Solución colorante utilizada en laboratorios de histopatología Para tinción celular según procedimiento de Papanicolaou. Se HH-500 Envase con 500 ml. complementa con Los colorantes EA-50 y con el OG-6 de HH-1000 Envase con 1000 ml. Papanicolaou. C16H14O6 P.M. 302. 29 CAS: 517-28-2
f
xn
rojo
ACIDO ACETICO GLACIAL A.C.S. SOLUCIONES CH3COOH P.M. 60.05 1 lt = 1.05 kg Material corrosivo CAS 64-19-07 MK Index 10,47 ACG-500 Envase con 500 ml. ACG-1000 Envase con 1000 ml.
c
xn
Bco.
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ACIDO CLORHIDRICO A.C.S. SOLUCIONES 3 0 HCl 37% aprox. P.M. 36.46 1 lt = 1.9 kg Material corrosivo CAS 7647-01-0 MK Index 10,4682 ACL-500 Envase con 500 ml. ACL-1000 Envase con 1000 ml.
c
xn
Bco.
HIDROXIDO DE AMONIO ACS PREPARACIONES NH4OH P.M. 35.05 CAS 7783-28-0 MK Index 10,561
t
c
Bco.
RESINA SINTETICA AL 60% EN XILOL Medio de montaje para microscopía.
RSX-560 Envase con 500 ml. RSX-1060 Envase con 1000 ml.
xn
xi
f
Rojo.
ALCOHOL ETILICO ABSOLUTO A.C.S. CH3CH2OH P.M. 46.07 Líquido combustible CAS 64-17-5 MK Index 10,212 AEA- 1000 Envase con 1000 ml. AEA-3500 Envase con 3.5 litros AEA-18000 envase con 18 litros.
f
xn
Rojo.
XILOL ACS C6H4(CH3)2 P.M. 106.17 Líquido inflamable. CAS 1330-20-7 MK Index 10,9890 XL-1000 Envase con 1 litro. XL-3500 Envase con 3.5 litros. XL-18000 Envase con 18 litros.
xi
xn
Rojo.
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30
EOSINA AMARILLENTA Solución colorante saturada en alcohol EOAA-250 Envase con 250 ml. C20H6Br4 Na2O5 P.M. 691. 88 EOAA-500 Envase con 500 ml. CAS: 17372-87-1 EOAA-1000 Envase con 1000 ml.
f
Rojo.
PARDO DE BISMARCK Solución colorante alcohólica saturada utilizada como contraste en histología. PB-250 Envase con 250 ml. C18H20Cl2N6 P.M. 419. 33 PB-500 Envase con 500 ml. PB-1000 Envase con 1000 ml.
f
xn
Rojo.
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31
IDENTIFICACION DE LOS CODIGOS INFORMATIVOS DE PELIGRO, ALMACENAJE, PROTECCION Y ADVERTENCIAS
DE USO UNIVERSAL.
Símbolos de Peligro
E
sustancias explosivas
C
sustancias corrosivas
F
sustancias inflamables
O
sustancias oxidantes
R
sustancias radioactivas
T
sustancias tóxicas
Símbolos de Peligro menor
XN
sustancias dañinas
XI
sustancias irritantes
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32
Códigos de Control de Almacenaje
Corrosivo
Tóxico
Mínimo o sin riesgo
Inflamable
Oxidante
Sugerencias de Protección y Transporte
Lentes de protección
Gafas y protección facial
Campana de extracción
Mandil resistente a corrosivos
Guantes resistentes a corrosivos
Transporte aéreo permitido
Transporte terrestre permitido
Bata de laboratorio
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33
Códigos de niveles de peligro según NFPA
Salud (color azul). Reactividad (amarillo). Valores: 0 mínimo. 1 ligero. 2 moderado. 3 alto. 4 severo. Flamabilidad (color rojo).
0 mínimo. +93°C 1 Moderado. +37°C 2 Alto. +33°C 3 Severo. -23°C
Riesgos específicos (color blanco): OXY oxidante. ACID ácidos. ALG alcalinos. CORR corrosivos. W no usar agua.
RIESGO PARA LA SALUD
Corresponde al riesgo de toxicidad de una sustancia química, cuando es inhalada, ingerida o absorbida a través de la piel y considera daños agudos y crónicos, producto de exposiciones únicas o continúas.
GRADO DE RIESGO
SIGNIFICADO
0 Sustancia No Tóxica
1 Sustancia Ligeramente Nociva, a la cual una exposición única o continua
en el tiempo podría causar una irritación o lesión residual leve.
2 Sustancia Moderadamente Tóxica o Nociva, a la cual una exposición intensa
o continuada, podría causar una incapacidad temporal o posible lesión residual,
a menos que se de un tratamiento médico rápido.
3 Sustancia Tóxica en Grado Severo, donde una exposición breve o prolongada,
podría causar una importante lesión temporal o residual, aún cuando se de un
tratamiento médico rápido
4
Sustancia Extremadamente Tóxica o Venenosa, donde una corta o larga
exposición puede causar la muerte o lesión residual importante, aún cuando se
de un tratamiento médico rápido.
RIESGO DE INFLAMACION
Corresponde a la susceptibilidad de una sustancia química a inflamarse, lo que queda
determinado por su temperatura de inflamación.
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GRADO DE RIESGO
SIGNIFICADO
0
Sustancia No Combustible. En este grado se incluye cualquier sustancia que no
se quema en el aire cuando está expuesta a una temperatura de 816ºC por un
período de 5 minutos.
1
Sustancia Levemente Combustible, que debe ser calentada para que se produzca
su ignición. En este grado se incluyen:
- Sustancias con temperatura de inflamación de 93ºC
- Sustancias que se queman en el aire al ser expuestas a una temperatura
de 816ºC, por un período de 5 minutos.
2
Sustancia Combustible o Moderadamente Inflamable, que debe ser calentada
para que se produzca su ignición. En este grado se incluye:
- Sustancias con temperatura de inflamación superior a los 37ºC, pero inferiores a 93ºC
3
Sustancia Inflamable en Grado Severo, que puede ser encendida en cualquier condición de temperatura ambiental. En este grado se incluyen:
- Sustancias con temperatura de inflamación entre 22.8ºC y 37.8ºC
- Sustancias con temperatura de inflamación menor que 22.8ºC y temperatura de ebullición igual o mayor que 37.8ºC
4
Sustancia Extremadamente Inflamable, que entran en combustión con facilidad. En este grado se incluyen:
- Sustancias con temperatura de inflamación menor que 22.8ºC y temperatura de ebullición menor que 37.8ºC
- Gases inflamables
RIESGO DE REACTIVIDAD Y OXIDACION
Corresponde al riesgo de reactividad y oxidación de una sustancia química, cuando entra en contacto con el aire, agua, otros productos químicos y materiales o condiciones de temperatura y presiones elevadas.
GRADO DE RIESGO
SIGNIFICADO
0 Sustancia Estable, no reactiva ni oxidante.
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35
1
Sustancia Normalmente Estable. Se incluyen en este grado:
- Sustancias que pueden volverse inestables en caso de exponerse a temperaturas y/o presiones elevadas.
- Sustancias que pueden reaccionar con el agua, aire u otros productos y generar energía, pero no violentamente.
2
Sustancia de Moderada Estabilidad. Se incluyen en este grado:
- Sustancias que pueden experimentar cambios violentos, pero sin detonar.
- Sustancias que reaccionan violentamente, o forman mezclas potencialmente explosivas con el agua, o reacciones similares con el aire u otros productos.
3
Sustancia de Severa Reactividad u Oxidante. Se incluyen en este grado:
- Sustancias que por sí mismas, son capaces de detonar o de reaccionar en forma explosiva con fuente iniciadora fuerte, golpes mecánicos o térmicos, a temperaturas o presiones elevadas.
- Sustancias que pueden explosar con el agua, sin necesidad de calor, confinamiento o reacciones similares con el aire u otros productos.
4
Sustancia de Extremada Reactividad o fuertemente Oxidante. Se incluyen en este grado:
- Sustancia que por sí misma o por golpes mecánicos o térmicos, es capaz de detonar o de reaccionar en forma explosiva a temperaturas y presiones normales.
RIESGO POR CONTACTO
Corresponde al riesgo por contacto de una sustancia química con alguna parte del cuerpo de una persona, con la consecuencia de efectos agudos o crónicos.
GRADO DE RIESGO
SIGNIFICADO
0 Sustancia Sin Riesgo por Contacto
1 Sustancia Levemente Irritante, que puede producir una ligera inflamación de la piel u otras áreas del cuerpo con que entra en contacto, producto de una exposición única o contínua en el tiempo.
2 Sustancia Irritante, Moderadamente Corrosiva o Nociva si ingresa por la piel, que en contacto con la piel u otra zona del cuerpo, puede generar inflamaciones o quemaduras químicas moderadas o un efecto tóxico menor.
3 Sustancia Corrosiva o Tóxica si Ingresa por la piel en Grado Severo, que puede producir importantes quemaduras químicas en partes del cuerpo o un efecto tóxico importante, con posibilidad de daño permanente.
4 Sustancia Extremadamente Corrosiva o Tóxica si ingresa por la piel, que genera graves quemaduras químicas y ulceraciones en el cuerpo o efecto tóxico extremo, con daño permanente esperado.
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36
ALMACENAMIENTO
CONSIDERACIONES GENERALES Un adecuado almacenamiento de las sustancias químicas, tiene como objetivo primordial el evitar que se lleguen a juntar productos químicos incompatibles, ya que de ocurrir así, se pueden producir reacciones violentas con la posibilidad de que se generen incendios, explosiones y/o emanaciones de gases venenosos o corrosivos que pueden comprometer a las personas, instalaciones y/o medio ambiente. Para cumplir con el propósito planteado, las sustancias químicas deben almacenarse en sus respectivos envases, en lugares seguros, considerándose los riesgos inherentes y la incompatibilidad con otros productos químicos y las condiciones del medio, como el calor, fuentes de ignición, luz y humedad. En relación a los reactivos químicos para análisis y sus soluciones, nuestra Empresa propone, en base a normas norteamericanas, realizar una separación considerando cinco categorías de riesgo, de acuerdo a características químicas similares. Posteriormente, los productos químicos deben ser almacenados en bodegas y/o cabinas.
CODIGO DE ALMACENAJE WINKLER
De acuerdo a las consideraciones indicadas y con el propósito de lograr un almacenamiento seguro de sustancias químicas, nuestra Empresa utiliza el Código de Almacenaje Winkler, en base a colores representativos, como son el Rojo (Inflamables), Amarillo (Oxidantes), Blanco (Corrosivos), Azul (Tóxicos) y Verde (Normal). Para casos especiales de productos químicos pertenecientes al mismo grupo de riesgo, pero que presentan un peligro especial, sobre el color correspondiente, se escribe la palabra SEPARADO, lo que significa que se deben guardar en la misma área, pero alejados del resto de las sustancias químicas
Clasificación Significado Código de Almacenaje
Winkler
Inflamables Área de almacenamiento de reactivos y soluciones químicas con riesgo de inflamación.
Sustancias químicas que presentan riesgo de incendio. Rojo
SEPARADO
Oxidantes
Área de almacenaje de reactivos y soluciones químicas con riesgo de oxidación y reactividad.
Sustancias químicas que pueden reaccionar violentamente con el aire, agua u otras condiciones o productos químicos. Posibilitan la ocurrencia de incendios y lo acrecientan si están presentes.
Amarillo
SEPARADO
Corrosivos Área de almacenamiento de reactivos y soluciones químicas con riesgo por contacto.
Sustancias químicas que pueden ocasionar quemaduras en la piel, ojos y membranas mucosas.
Blanco
SEPARADO
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37
Tóxicos Área de almacenamiento de reactivos y soluciones químicas con riesgo para la salud.
Sustancias químicas tóxicas por inhalación, ingestión o absorción a través de la piel. Azul
SEPARADO
Normal Área general de almacenamiento de reactivos y soluciones químicas.
Sustancias químicas que no ofrecen un riesgo importante para ser clasificadas en alguno de los grupos anteriores.
Verde
Importancia:
Resultados que se obtienen al mezclarse reactivos en el caso de accidente.
Corrosivos + inflamables= explosión/fuego.
Corrosivos + tóxicos = gas tóxico.
Inflamables + oxidantes = explosión/fuego.
Ácidos + bases = humos corrosivos/calor.
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ORGANIZACIÓN INTERNACIONAL DEL TRABAJO.
(OIT)
Las frases que figuran entre paréntesis ya no están ya en vigor.
Naturaleza de los riesgos específicos atribuidos a sustancias y preparaciones peligrosas
R1 Explosivo en estado seco.
R2 Riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición.
R3 Alto riesgo de explosión por choque, fricción, fuego u otras fuentes de ignición.
R4 Forma compuestos metálicos explosivos muy sensibles.
R5 Peligro de explosión en caso de calentamiento.
R6 Peligro de explosión, en contacto o sin contacto con el aire.
R7 Puede provocar incendios.
R8 Peligro de fuego en contacto con materiales combustibles.
R9 Peligro de explosión al mezclar con materiales combustibles.
R10 Inflamable.
R11 Fácilmente inflamable.
R12 Extremadamente inflamable.
(R13 Gas licuado extremadamente inflamable.)
R14 Reacciona violentamente con el agua.
R15 Reacciona con el agua liberando gases fácilmente inflamables.
R16 Puede explosionar en mezcla con sustancias comburentes.
R17 Se inflama espontáneamente en contacto con el aire.
R18 Al usarlo pueden formarse mezclas aire-vapor explosivas/inflamables.
R19 Puede formar peróxidos explosivos.
R20 Nocivo por inhalación.
R21 Nocivo en contacto con la piel.
R22 Nocivo por ingestión.
R23 Tóxico por inhalación.
R24 Tóxico en contacto con la piel.
R25 Tóxico por ingestión.
R26 Muy tóxico por inhalación.
R27 Muy tóxico en contacto con la piel.
R28 Muy tóxico por ingestión.
R29 En contacto con el agua libera gases tóxicos.
R30 Puede inflamarse fácilmente al usarlo.
R31 En contacto con ácidos libera gases tóxicos.
R32 En contacto con ácidos libera gases muy tóxicos.
R33 Peligro de efectos acumulativos.
R34 Provoca quemaduras.
R35 Provoca quemaduras graves.
R36 Irrita los ojos.
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39
R37 Irrita las vías respiratorias.
R38 Irrita la piel.
R39 Peligro de efectos irreversibles muy graves.
R40 Posibilidad de efectos irreversibles.
R41 Riesgo de lesiones oculares graves.
R42 Posibilidad de sensibilización por inhalación.
R43 Posibilidad de sensibilización por contacto con la piel.
R44 Riesgo de explosión al calentarlo en ambiente confinado.
R45 Puede causar cáncer.
R46 Puede causar alteraciones genéticas hereditarias.
(R47 Puede provocar defectos congénitos.)
R48 Riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada.
R49 Puede causar cáncer por inhalación.
R50 Muy tóxico para los organismos acuáticos.
R51 Tóxico para los organismos acuáticos.
R52 Nocivo para los organismos acuáticos.
R53 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.
R54 Tóxico para la flora.
R55 Tóxico para la fauna.
R56 Tóxico para los organismos del suelo.
R57 Tóxico para las abejas.
R58 Puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente.
R59 Peligroso para la capa de ozono.
R60 Puede perjudicar la fertilidad.
R61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
R62 Posible riesgo de perjudicar la fertilidad.
R63 Posible riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
R64 Puede perjudicar a los niños alimentados con leche materna.
Combinación de Frases R
R14/15 Reacciona violentamente con el agua, liberando gases extremadamente
inflamables.
R15/29 En contacto con el agua, libera gases tóxicos y extremadamente inflamables.
R20/21 Nocivo por inhalación y en contacto con la piel.
R20/22 Nocivo por inhalación y por ingestión.
R20/21/22 Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.
R21/22 Nocivo en contacto con la piel y por ingestión.
R23/24 Tóxico por inhalación y en contacto con la piel.
R23/25 Tóxico por inhalación y por ingestión.
R23/24/25 Tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.
R24/25 Tóxico en contacto con la piel y por ingestión.
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R26/27 Muy tóxico por inhalación y en contacto con la piel.
R26/28 Muy tóxico por inhalación y por ingestión.
R26/27/28 Muy tóxico por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.
R27/28 Muy tóxico en contacto con la piel y por ingestión.
R36/37 Irrita los ojos y las vías respiratorias.
R36/38 Irrita los ojos y la piel.
R36/37/38 Irrita los ojos, la piel y las vías respiratorias.
R37/38 Irrita las vías respiratorias y la piel.
R39/23 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación.
R39/24 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel.
R39/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por ingestión.
R39/23/24 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación y contacto con la
piel.
R39/23/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación e ingestión.
R39/24/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel e
ingestión.
R39/23/24/25 Tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación, contacto con la
piel e ingestión.
R39/26 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación.
R39/27 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel.
R39/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por ingestión.
R39/26/27 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación y contacto
con la piel.
R39/26/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación e ingestión.
R39/27/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por contacto con la piel e
ingestión.
R39/26/27/28 Muy tóxico: peligro de efectos irreversibles muy graves por inhalación, contacto
con la piel e ingestión.
R40/20 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación.
R40/21 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles en contacto con la piel.
R40/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por ingestión.
R40/20/21 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación y contacto con la piel.
R40/20/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación e ingestión.
R40/21/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles en contacto con la piel e ingestión.
R40/20/21/22 Nocivo: posibilidad de efectos irreversibles por inhalación, contacto con la piel e
ingestión.
R42/43 Posibilidad de sensibilización por inhalación y en contacto con la piel.
R48/20 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por inhalación.
R48/21 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por contacto con la piel.
R48/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por ingestión.
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R48/20/21 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por inhalación y contacto con la piel.
R48/20/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por inhalación e ingestión.
R48/21/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por contacto con la piel e ingestión.
R48/20/21/22 Nocivo: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada
por inhalación, contacto con la piel e ingestión.
R48/23 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por
inhalación.
R48/24 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por
contacto con la piel.
R48/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por
ingestión.
R48/23/24 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por
inhalación y contacto con la piel.
R48/23/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por
inhalación e ingestión.
R48/24/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por
contacto con la piel e ingestión.
R48/23/24/25 Tóxico: riesgo de efectos graves para la salud en caso de exposición prolongada por
inhalación, contacto con la piel e ingestión.
R50/53 Muy tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos
negativos en el medio ambiente acuático.
R51/53 Tóxico para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.
R52/53 Nocivo para los organismos acuáticos, puede provocar a largo plazo efectos negativos en el medio ambiente acuático.
Frases de Seguridad empleadas
Las frases que figuran entre paréntesis ya no están ya en vigor.
S1 Consérvese bajo llave.
S2 Manténgase fuera del alcance de los niños.
S3 Consérvese en lugar fresco.
S4 Manténgase lejos de locales habitados.
S5 Consérvese en ... (líquido apropiado a especificar por el fabricante).
S6 Consérvese en ... (gas inerte a especificar por el fabricante).
S7 Manténgase el recipiente bien cerrado.
S8 Manténgase el recipiente en lugar seco.
S9 Consérvese el recipiente en lugar bien ventilado.
S12 No cerrar el recipiente herméticamente.
S13 Manténgase lejos de alimentos, bebidas y piensos.
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S14 Consérvese lejos de ... (materiales incompatibles a especificar por el fabricante).
S15 Conservar alejado del calor.
S16 Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar.
S17 Manténgase lejos de materiales combustibles.
S18 Manipúlese y ábrase el recipiente con prudencia.
S20 No comer ni beber durante su utilización.
S21 No fumar durante su utilización.
S22 No respirar el polvo.
S23 No respirar los gases/humos/vapores/aerosoles [denominación(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante].
S24 Evítese el contacto con la piel.
S25 Evítese el contacto con los ojos.
S26 En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase
a un médico.
S27 Quítese inmediatamente la ropa manchada o salpicada.
S28 En caso de contacto con la piel, lávese inmediata y abundantemente con ... (productos a
especificar por el fabricante).
S29 No tirar los residuos por el desagüe.
S30 No echar jamás agua a este producto.
S33 Evítese la acumulación de cargas electrostáticas.
(S34 Evite cualquier choque o fricción.)
S35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las precauciones posibles.
S36 Úsese indumentaria protectora adecuada.
S37 Úsense guantes adecuados.
S38 En caso de ventilación insuficiente, úsese el equipo respiratorio adecuado.
S39 Úsese protección para los ojos/la cara.
S40 Para limpiar el suelo y los objetos contaminados por este producto, úsese ... (a especificar
por el fabricante).
S41 En caso de incendio y/o explosión, no respire los humos.
S42 Durante las fumigaciones/pulverizaciones, úsese equipo respiratorio adecuado.
[Denominación(es) adecuada(s) a especificar por el fabricante].
S43 En caso de incendio, utilizar ... (los medios de extinción los debe especificar el fabricante).
(Si el agua aumenta el riesgo, se deberá añadir: "No usar nunca agua").
(S44 Si siente malestar, acúdase al médico y, si es posible, muéstrele la etiqueta.)
S45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstrele la etiqueta).
S46 En caso de ingestión, acúdase inmediatamente al médico y muéstrele la etiqueta o el
envase.
S47 Consérvese a una temperatura no superior a ...°C (a especificar por el fabricante).
S48 Consérvese húmedo con... (medio apropiado a especificar por el fabricante).
S49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen.
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S50 No mezclar con... (a especificar por el fabricante).
S51 Úsese únicamente en lugares bien ventilados.
S52 No usar sobre grandes superficies en locales habitados.
S53 Evítese la exposición. Recábense instrucciones especiales antes del uso.
(S54 Obtenga el permiso de las autoridades de control de contaminación antes de eliminar el
producto hacia las plantas de tratamiento de aguas residuales.)
(S55 Trate el producto, aplicando las mejores técnicas disponibles, antes de verterlo al desagüe o al medio acuático.)
S56 Elimínense esta sustancia y su recipiente en un punto de recogida pública de residuos
especiales o peligrosos.
S57 Utilícese un envase de seguridad adecuado para evitar la contaminación del medio
ambiente.
(S58 A la hora de eliminar el producto, considérelo como residuo peligroso.)
S59 Remitirse al fabricante o proveedor para obtener información sobre su recuperación/
reciclado.
S60 Elimínense el producto y su recipiente como residuos peligrosos.
S61 Evítese su liberación al medio ambiente. Recábense instrucciones específicas de la ficha
de datos de seguridad.
S62 En caso de ingestión no provocar el vómito: acúdase inmediatamente al médico y
muéstrele la etiqueta o el envase.
Combinación de Frases S
S1/2 Consérvese bajo llave y manténgase fuera del alcance de los niños.
S3/7 Consérvese el recipiente bien cerrado y en lugar fresco.
(S3/9 Consérvese en lugar fresco y bien ventilado.)
(S3/7/9 Consérvese el recipiente bien cerrado, en un lugar fresco y bien ventilado.)
S3/9/14 Consérvese en lugar fresco y bien ventilado y lejos de... (materiales incompatibles,
a especificar por el fabricante).
S3/9/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen, en lugar fresco y bien ventilado.
S3/9/14/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen, en lugar fresco y bien ventilado
y lejos de... (materiales incompatibles, a especificar por el fabricante).
S3/14 Consérvese en lugar fresco y lejos de... (materiales incompatibles, a especificar por
el fabricante).
S7/8 Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar seco.
S7/9 Manténgase el recipiente bien cerrado y en lugar bien ventilado.
S20/21 No comer, ni beber, ni fumar durante su utilización.
S24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
S36/37 Úsense indumentaria y guantes de protección adecuados.
S36/39 Úsense indumentaria adecuada y protección para los ojos/la cara.
S37/39 Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
S36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados y protección para los ojos/la cara.
S47/49 Consérvese únicamente en el recipiente de origen y a temperatura no superior a...
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ºC (a especificar por el fabricante).
S3/7 Consérvese el recipiente bien cerrado y en lugar fresco.
S7/47 Manténgase el recipiente bien cerrado y consérvese a una temperatura no superior a... ºC (a especificar por el fabricante).
S29/56 No tirar los residuos por el desagüe. Elimínense esta sustancia y su recipiente en un
punto de recogida pública de residuos especiales o peligrosos.
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Reglas básicas de seguridad en el laboratorio.
Orden y limpieza en el laboratorio.
Estos 2 aspectos son fundamentales para reducir el riesgo y las condiciones inseguras.
Hábitos en el trabajo.
Trate de trabajar lo más cómodo posible, la ergonomía es importante.
No trabaje en forma apresurada.
Mantenga su espacio limpio y ordenado.
Nunca corra en el laboratorio.
Nunca haga bromas (en acciones) en el laboratorio.
No deje puertas y gabinetes abiertos.
Recomendaciones generales.
Use su sentido común.
Conozca las reglas de seguridad y póngalas en práctica.
Asegúrese que conoce los procedimientos de emergencia.
Reporte todo incidente o accidente.
No trabajar nunca una persona sola en el laboratorio y muy especialmente en el caso
de realizarlo fuera de las horas habituales.
No trasporte frascos de vidrio o aparatos debajo del brazo.
No guarde piezas de vidrio u objetos punzantes de cualquier tipo en los bolsillos de la
bata o ropa.
No ingerir alimentos en el laboratorio.
No fumar dentro del laboratorio.
Manipular las sustancias volátiles, inflamables y explosivas en la campana de extracción
o en un lugar ventilado.
Ubicar salidas de emergencia, extintores, regadera y botiquín.
Usar lentes de seguridad.
Lavarse las manos con frecuencia cuando este en constante contacto con sustancias
químicas.
Nunca pipetear con la boca.
Tener a la mano material absorbente, para utilizar en caso de derrames.
Etiquetar los frascos con las soluciones que contengan.
Cuando trabaje con líquidos flamables evitar tener mecheros encendidos cerca.
Leer siempre las etiquetas de los frascos reactivos.
Cuando manipule reactivos no se lleve las manos a la boca.
Nunca adicione agua a un acido concentrado. Para diluir ácidos estos se deben agregar
poco a poco al agua y agitar constantemente la dilución, de lo contrario el calor que se
desprende en la reacción puede proyectar el ácido.
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Ropa y accesorios.
El cabello largo y la ropa suelta o la joyería debe asegurarse cuando se trabaja en un
laboratorio.
Pueden quedar atrapados en equipos o maquinaria en movimiento.
La ropa o cabello pueden quemarse.
No se deben utilizar sandalias o zapatos descubiertos.
Se recomienda utilizar bata de manga larga, de preferencia de algodón.
Antes de retirarse del laboratorio.
Recoja los materiales, equipos, etc.
Desconecte todos los equipos que no son necesarios, cerrar llaves de agua, gas, etc.
Contar con puertas de acceso y salidas de emergencia, regaderas, controles maestros de
energía, botiquín y diferentes tipos de extintores.
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Hematoxilina
Fórmula: C16H14O6.xH2O
La hematoxilina es un colorante natural, fue usada alrededor de 1863, se utiliza en
combinación con sales de aluminio, hierro, cromo, cobre o tungsteno, en algunos
manuales en donde se incluye la preparación de colorantes a esta combinación de
sales se les conocerá como alumbre, termino utilizado desde la edad media.
Este colorante se utiliza para la tinción de los núcleos en las células.
es un compuesto que se obtiene de la planta leguminosa Haematoxylum campechianum,
conocida también con el nombre de Palo de Campeche. Es un producto natural que al ser
oxidado constituye una substancia de color morado oscuro denominada hemateína (esta se
forma por la oxidación de la hematoxilina. Este proceso, es conocido como
“maduración”).
Esta maduración también puede ocurrir espontáneamente si las soluciones de
hematoxilina se dejan en reposo por varios días.
Tal como se obtiene de la planta e incluso luego de sufrir el proceso de oxidación, su capacidad de tinción es muy limitada. Por lo tanto, debe combinarse con iones metálicos, especialmente las sales de hierro (III) o aluminio (II), que actúan como mordientes.
Si bien la hematoxilina es una sal neutra, suele ser denominada como un colorante básico, ya que el componente cromógeno reside en el complejo catiónico (básico) de la misma. Es de notar que la tinción histológica por hematoxilina no indica tanto la constitución química de los componentes celulares, sino la densidad de cargas eléctricas negativas de los mismos.
Se utiliza para teñir los componentes aniónicos (ácidos) de los tejidos, a los que da una coloración violeta. Tiñe intensamente los núcleos de las células, dado que estos contienen ácidos nucleicos ricos en radicales ácidos.
La hematoxilina puede combinarse junto con otros tintes, tales como la eosina o el ácido pícrico, y en conjunto son capaces de teñir otras estructuras citoplasmáticas
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Hay dos procedimientos de hematoxilina usados en los laboratorios; los métodos de
Harris (regresivo)(en histología, también tiñe las estructuras tisulares, citoplasma, tejido
conectivo, entre otros) y de Mayer (progresivo).
Eosina
C20H6Br4Na2O5
es un colorante ácido de color rosado oscuro usado en preparaciones histológicas cuya
propiedad está basado en su polaridad negativa lo que le permite enlazarse con constituyentes
celulares de carga positiva. Por ello colorea componentes y orgánulos citoplasmáticos mas no
los nucleares (por estar el ADN cargado negativamente). Aquellos componentes que se tiñen
con eosina son conocidos como acidófilos o eosinófilos. Los demás componentes que se tiñen
con colorantes básicos se les llama basófilos.
Existen dos tipos: eosina B y eosina Y, las cuales producen los mismos resultados.
Para reforzar la tonalidad rosada de la eosina, con anticipación se diluye la eosina al 1% con agua destilada y se prepara con ácido acético glacial (1 gota por cada 100 ml de eosina al 1%). Esta solución se calienta a 60 grados C por media hora (30 minutos).
Hematoxilina – Eosina
Es costumbre y rutina histológica usar la eosina conjuntamente con la hematoxilina para teñir tejidos a ser observados bajo el microscopio. Una vez completada el procedimiento de tinción de los tejidos, los núcleos de las células se verán de color morado oscuro (producto de la hematoxilina) y el citoplasma, así como las fibras de colágeno se verán de color rojo o rosado oscuro.
ORANGE G
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C16H10N2Na207S2
Es un colorante del que se habla muy poco y al que se le da poca importancia. Solución
colorante modificada por su punto de solubilidad en Etanol para obtener una tinción bien
definida de las células con citoplasma orangeofílicas. Formulada para la identificación de
sustancias orangeofílicas, como sustancia queratósica en células queratinizadas; dándole un
tinte anaranjado encendido. Su tiempo óptimo de tinción es de 2 minutos
La Queratina o Keratina es una sustancia proteica, muy rica en azufre, que constituye el componente principal de las capas más externas de la epidermis de los vertebrados y de otros órganos derivados del ectodermo, como pelos, uñas, plumas, cuernos o pezuñas.
La queratina es la responsable de la dureza y resistencia de los cuernos y uñas.
Es una proteína con una estructura secundaria, es decir, la estructura primaria de la proteína, se pliega sobre sí misma, adquiriendo tres dimensiones. Ésta forma nueva, tiene forma de espiral, llamándose así proteína α-hélice. Esta estructura se mantiene con esa forma tan característica gracias a los puentes de hidrógeno y a las fuerzas hidrofóbicas, que mantienen unidos los aminoácidos de dicha proteína. Todo esto unido, le da a la proteína esa especial dureza característica.
Fórmulas de preparación de colorantes y soluciones de Métodos Histotecnólogicos del
Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos DE América
(AFIP).
Hematoxilina de Mayer.
Sol’n matriz.
Alumbre de amonio o de potasio. 50.0 gr
Agua destilada. 1000 ml
Hematoxilina. 1.0 gr
Yodato de sodio. 0.2 gr
Acido cítrico. 1.0 gr
Hidrato de cloral. 50.0 gr
En lugar de los 0.2 gr de yodatato de sodio se pueden usar 20 ml de una sol´n al 2% de
yodatato de sodio. Añádalos directamente a la sol´n matriz después de que la
hematoxilina se haya disuelto.
Disuelva el alumbre en el agua destilada usando un agitador. Añada la hematoxilina y
después el yodatato de sodio, revolver por 10 minutos y después añadir el acido cítrico.
Revolver 10 minutos y agregar el hidrato de cloral y revuelva hasta que todo este
disuelto.
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La sol´n resultante tendrá un color vino oscuro, si se ha preparado correctamente.
1 ml de la sol´n de agua ligeramente tibia añadida, la tornara azul inmediatamente.
Hematoxilina de Harris.
Hematoxilina.
Etanol al 100%. 5.0 gr
Alumbre de potasio o de amonio. 50.0 ml
Agua destilada. 100.0 gr
Oxido rojo de mercurio. 2.5 gr
Acido acético glacial 20 ml
Use un frasco de 2000 ml para el alumbre y el agua, y uno mas pequeño para el etanol
y la hematoxilina. Disuelva el alumbre de potasio en el agua destilada con la ayuda de
calor y de un agitador. Agite para disolver la hematoxilina en el alcohol, a temperatura
ambiente.
Remueva el alumbre y el agua destilada de la fuente de calor. Lentamente combine las
dos soluciones. Devuelva las soluciones ya combinadas a la fuente de calor y hágalas
hervir, aproximadamente 1 minuto. Remueva del calor y lentamente añada el óxido de
mercurio (si lo hace rápido, la reacción hará que la solución se derrame).
Devuelva la sol´n a la fuente de calor hasta que tome un color púrpura oscuro,
remuévala del calor, y póngala en un recipiente con agua fría hasta que baje la
temperatura. Añada 20 ml de acido acético glacial para intensificar la tinción nuclear.
Filtre la solución cada vez antes de usar.
Sol´n de Eosina
Solución matriz.
1 gr de eosina amarillenta, hidrosoluble en 20 ml de agua destilada.
Añada 80 ml de etanol al 95%.
Solución diaria.
1 parte de solución matriz y añadir 3 partes de etanol al 80% y 0.5 ml de
ácido acético glacial por cada 100 ml de colorante.
Sol´n de acido acético al 1%
1 ml de acido acético glacial en 99 ml de agua amoniacal.
Sol´n de HCL al 1%
1 ml de HCL en 99 ml de etanol al 70%
Agua amoniacal.
2 a 4 ml de hidróxido de amonio al 28% en 800 ml a 1000 ml de agua destilada.
Sol´n de carbonato de Litio
Solución saturada.
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1.54 gr de carbonato de litio en 100ml de agua destilada.
Medios de montaje.
Hay tres medios de montaje que se pueden utilizar; resinas naturales, resinas sintéticas
y medios acuosos.
El bálsamo de Canadá (resina natural) fue la más utilizada, sin embargo, el largo tiempo
que tomaba en secar la hizo impráctica para usos rutinarios. Además puede reducir la
intensidad de la tinción después de algunos años.
Los medios acuosos se usan cuando los tintes o estructuras están alterados o destruidos
por causa de deshidratación o de medios basados en xileno.
Técnicas para la preparación de las soluciones colorantes y reactivos utilizados en la
técnica de coloración de Papanicolaou. Avances en citología, año 22, núm. 2, 1972 págs.
2,3
Hematoxilina de Harris.
Hematoxilina. 5.0 gr
Alcohol etílico absoluto. 50.0 ml
Alumbre de potasio. 100.0 ml
Agua destilada. 1000.0 ml
Oxido rojo de mercurio. 2.5 gr
Disuelva la hematoxilina en alcohol y el alumbre en agua con ayuda de calor.
Quítese del calor y mezcle las dos soluciones. Luego llévese a ebullición lo mas rápido
posible (1 minuto o menos) y remueva continuamente. Quítese del calor y agregue el
oxido de mercurio lentamente. Caliéntese de nuevo a poca temperatura hasta que tome
un color purpura obscuro. Retírese del calor y póngase en un recipiente con agua fría
para enfriar la solución. El colorante está listo para usarse tan pronto como se enfríe.
Fíltrese antes de usar.
Orange G-6
Orange G 10.0 gr
Agua destilada 100 ml
Alcohol etílico de 95% 1000 ml
Acido fosfotúngstico. 0.15 gr
Disuelva 10 grs de Orange G en 100 cc de agua destilada. Agítese bien y permítase
reposar por una semana.
Después de reposar, ponga 50 cc de la solución preparada y 950 cc de alcohol etílico de
95%. Agregue 0.15 grs de ácido fosfotúngstico; mézclelo bien y almacénese en botellas
obscuras. Fíltrese antes de usar.
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Solución EA-36 (equivalente a EA-50)
Eosina (amarillenta) 10.0 gr
Pardo Bismarck 10.0 gr
Light green S.F. (Amarillento) 10.0 gr
Agua destilada 300.0 ml
Alcohol etílico de 95%. 2000.0 ml
Acido fosfotúngstico. 4.0 gr
Sol´n acuosa saturada de carbonato de litio 20 gotas
Preparar por separado 10 grs de eosina en 100 cc de agua destilada; 10 grs de light
green S,F en 100 cc de agua destilada. En un recipiente coloque 22.5 ml de solución de
eosina; agregue 450 ml de alcohol de 95%, 5 ml de sol´n de pardo Bismarck, 450 ml de
alcohol de 95%., 4.5 ml de sol´n de light green y otros 450 ml de alcohol de 95%.
Disolver 2 gr de ácido fosfotúngstico en el mortero y mezclar con el resto de los
colorantes, finalmente agregue 10 gotas de carbonato de litio. Filtrar antes de usar.
Alcohol acido.
1 ml de HCL EN 100 ml de alcohol etílico de 96%
Alcohol amoniacal.
I ml de amoniaco con 100 ml de alcohol etílico de 96%
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Índice.
Políticas de operación, normas y lineamientos……………………………………………………….3
Área de tinción…………………………………………………………………………………………………………..4
Principio y ventaja del método de Papanicolaou…………………………………………………….7
Tinción…………………………………………………………………………………………………………………………7
Preparación de soluciones (fundamentos)……………………………………………………………….9
Preparación de colorantes………………………………………………………………………………………….10
Cuidados y conservación de los colorantes……………………………………………………………..14
Preparación de la batería de tinción y su mantenimiento………………………………………15
Función general y especifica de los colorantes y reactivos…………………………………..18
Problemas con la tinción……………………………………………………………………………………………22
Métodos de coloración………………………………………………………………………………………………24
Observaciones (en los reactivos)……………………………………………………………………………….27
Reactivos (etiquetado)…….…………………………………………………………………………………………28
Identificación de los códigos informativos de peligro, protección………………………….31
Almacenamiento…………………….……………………………………………………………………………………33
Frases de riesgo y seguridad (OIT)…………………………………………………………………………….38
Reglas básicas de seguridad en el laboratorio…………………………………………………………..45
Historia de colorantes y formulas para prepararlos………………………………………………..48
Índice……………………………………………………………………………………………………………………………54
Bibliografía……………………………………………………………………………………………………………………55
Conocimientos básicos para la tinción de citología cervico-vaginal
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55
Bibliografía.
Química General Aplicada. Instituto Politécnico Nacional. Unidad
Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología 2006.
Tinción e interpretación de la muestra de Citología Cervical 2006.
Procedimientos para diagnostico en citología cérvico-vaginal. Instituto
Nacional se Salud. Lima Perú 2000 y 2005.
Procedimientos de laboratorio de Citología. Organización Mundial de
la Salud 2002.
Soluciones de Papanicolaou, soluciones polícromas Merck.
Introducción al Citodiagnóstico. U de G. Gustavo López Amado.
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Andrion A, Pira E. What’s new in maneging health hazards in
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