7

Click here to load reader

Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

������������ � ��� �� ������ �� ������ ���� �

������������ ����� �

������ ����� ��� �� ������ ������ ������ ���� ������ � � ���

���������� �� ��� �������� ��� ������� ����� �� ��� �� ����������� ���� �� �!�� "����

�������� � ����� � !" ������� �# $���� � !" ������� %� $���� � !

��������

$ ����&������ ����� �� ������ ���� � ������������ ����� � '� ����������� ����( ��� � )�* ������ ��� ��

���������� ��� �� �+$ ,� �������������� ��(������ � ��� ������ �� )%* ��,�� ������ ��� ��� '��� ������,�� ����-

.����� �����������&��(���� ����� '��� �������� ,����� �# ����� � ��������� ����������� ��������� ����� � ,� '����

�+$ ���������� ,� ������ ���� ���� �� ��������(��� ������ � ��� � � ������� �� �/������- .�� ��������( � ���

������ ��� �� �01&% '� � ������ ����� �� ����� ,� �������2�(��� ) �,���3��* �� �# ����� � �� $��������� �� � �� ��

,�� �� �������� �� ���� �������� �,��� ��� ��,��- �01&% �+$ ������� �� $# �� � '� ���������� ,� �������������� ����

��� ����� ��(���3�� �# ����� � �����- 4� ���� ������ ����� ������� �����������&��(���� ������ '��� ��������- �����

������ �/��,���� ������ �� �������������� '��� ��� �� �+$� ,��� �� $# �� � �� �� ������ �# ����� � ������ �

�� ��� ��������- ����( ��� � ��� ���������� ���� �,������ ��1%%� '� ���� �������� �� ��� ��� ��� ����� �������� ��,��

�� �# ����� �- 5���� �� ��� ��� '��� ���� �� �# ����� �� ������� ��� ��� �� ����� ������� � ,���&��( ����� ���

����,�� ���� '��� �/ ���� �� ����� ,����� �� ������ �# ����� �- $ ������ � ��� ��� ����������� ,� ��(���� '���

�4�6%% �� ���������� �� $# �� � �� ��� $���7&4 �( ��� �� �4.8 ��������( ������� ���� ��������� '��� ������� ��

$# �� � �� '��� ���� �� �������������� � �# ����� �- $ ��( ������ ���� ,���� ��� �� ��������( ��� �������� �

���4$� �� ������������ �������� ������ ����(���� ���899� '� ���� �� ,� ����������� ���� ��� �����������&��(����

�# ����� � ����� �� ��������� ��,��- ���� ��� � ��������� ������ �� ��,�� ��� ��� '��� ������,�� ���� �����������

��� ���� ������� ����&������ ����� �� ���� �������-

������%& ������ ����" 0�������������" ������������ ����� � " :�� �� ������" ����������� ���;�����

�� ���� ����

������������ ����� � �� ,������� �� ��� &

2�� ���� �� ��� ����(������ � ������� ���� �����&

�������� <�=6>- 7�� ������� ��������� ����� ��������(

����������������� ; ,���� ����������� ��3� ���

�� ((��������� �� ������� ��� ,��� �����'��

<8>- ��'����� ������ �� ���'� ��(����( ��� �����;�

������ ����������� �� ������� � ������� � �����

�������� ��������� �����- �� ����� ��� ����� �����

,� ��� ���� �� ����(������� �� � (���� � ����

��(��� ��� ,��� ������ �� �/�������" �� �/ &

���� ����� �������( ; ,��� ��,���� ); ,������* <1>�

�������� <�=#>� �� ((�������� < >� �� ������� <�9>�

�� ������ ����� ����� <����%>-

96!#&�9 ! ? ! ? @�!-99 A � ! .�������� � 0������ B����,����(��� 5��������- :�,������ ,� 0������� 5������ 4-C-

��� 5 9 6 ! # & � 9 ! ) ! * 9 9 � # & 1

� ������������( �����- ���- E F#� )8�#* %1 �199"./E F#� )8�#* %% ##�!" 0& ��E .G�9%��!H��������-��-2�

.0B5 B����,����(� D������ �1% )� !* �!1=�#�

Page 2: Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

�������� ������� �� ��� ���� ������ � ����

��� ���� ��� � ����������� ��� �� ��������

���� � ���� �� ���� � ���� �������� � �� �

�� ������ ����� �� ��� � �� ����� �� ������ ��

�� ������ ������� ���� �� � �� ������ �� �� �� �

���� � � �� ������� �� ����� �� ������ �� �

����� ��� ��� ���� ������� �� ���� ��� �����

���� �� �� ���� ������ �� �� ���� �� ��� ��������

���� ���� ������� � �� ��� �� �� �� ������ ��

� �� ������� �� ������ �� ���� ���� �� �� ���

������ �� �� ���� � ������ ���� ��� ���� �� �����

��������� �� ��������� ������ ���� � �� ������

���� ��������

�������� !"#� �� � ��� �� ���� ������ �� !$#

�� � �� ������ � � �%&�' !&#� � ������ �����

��� ���� �� ������ �� ����� �� �()�&! ����

����������� ���������� �� ��� ������� �� ����

������� �� �(*$ ���� �� ������� ��� +,*!-!-

��� ������ �� � �� ���� ���� ��� �� ���������

���� � �� ������ ������.���� � ������ ��

����/� �� ���� �� ��� !0#� 1�� ���� � ��� ���

��� � ��� �������� �� ��������� ���� ���

����� �������� �������� �� �� ����� � ��

����� �� ������ ���� ��������� ��� ��

� �� ������� ,��� � ����� ���������� �� �� �

�� �� ����� ������� �� �� �� ������� �� ���

�� �� ������ �� � ���

�� �� ����� ���� �� ��� �� �� � �� �� ���

������� �� �� �� �� � �� ������� 2 � ���

�� �� ��� � �� �� � ���� ������ �� �� ���

����� !

(�� ���� ��� ���

, ��� ,������ ����� ��

�� ��� �(!-! ������ ,��/� 1��� 7�� �� 8����

� �� ������

9�&''� 9�&"! +� �� ������� �� ����� �� �� ,:0-� � �����

9�&'! +� �� ������� �� ����� �� �� 4,6&� � �����

;�11 ""'55 ;������ ���� 1�� ��� 1����� ��

")!� � "5' ;�� ���������*��� :���� � �� *������ <�������� *4�

:,;

7=!� (4! >�� ��� �

,:0-� ,:0" ,��� :���� � �� 3����� ,������ ,���� 8����

4,'0� 4,")� 4,6& ?��� (� 1������ ��� ������ 8����

2&-� 2)"� !0@! 7� �. >����� ����� =�� �� 1������� 1���� ������ 8����

%,>&!� %,>!&6� %,>!)5 ,�� �� 1������ �� +������ 1�� ��� >���� 8����

8�$� 97' ������� :���� � =�� �� ,������ �������� 8����

)!� 8((�1 <���� ,����� � :���� � �� :���A� ,�����

!)@!- =���� <������ :���� � �� 3�� ����� 1�����

>�!� >�!$� >�!&� >�'!� >�'"� >�"'� >�"&� >�$-�

>�$!� >�$0� >�$5� >�$)� >�$!� >�$0� >�$5� >�$)�

>�!"!� >�!&!� >�'-)� >�'!"

>��� =�� �� 1������� >���� 8����

����� '

%��� ������ �� �B������ �� � �� ������ ��� � � �%&�' =?; �������� ���� ����� � �� ������ ��� �� �� ���

+����� � =����

� �� ������ �� ���

� "5' ""'55 %,>&! ,:0- 4,6& �(!-!

� "5' &�!-� - - - - -

""'55 - 5�!-� - - - -

%,>&! "�!-� - !�!-� - - -

,:0- !�!-� !�!-� '�!-� !�!-� "�!-� -

4,6& !�!-� &�!-� 5�!-� $�!-� '�!-� -

�,���� � ������ ������ �� @�� =?;� :�������� ����� ���� � ������������ ������ �� �� �� ��� �������� �������� ��� �� ���� �� ���� �� �� � ���� �� ��C ")!� ,:0"� 4,'0� 7=!� %,>!&6� %,�!)5� 2&-� 2)"� 8�$� 97'�

�� ��������� �� �� � ���� ����������� ������� ��� �!!"# �"�$�%�!50

Page 3: Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

��� �������� � � ���� ������ ������ ��

��� ������� �� ������ �� ���� �� ���� �����

���� �� �� ����������� ����� ������ ����� �����

�� ��� �� �� ������ ��� �� �� ������ �� ��

��� �� �� ���������� �� ���!�� � ���� � ���� ��

������ ��� ��� ����"������� �� �������� ��

#$%& ��� �� ��� �� �������� ������ �� ���� ���

�'()�� #$*& ����� ������� �� ����� � ������� ��

�� � ��� ��� �� )�* "� �(+ ������� � �����

,��������� ��� �'-./ �� ������ �� ���� ���� ���

� ������� ��� ���� ���"��� 0��� ���������

������ �������� ��� � ��� ���� � �� �� ����

����� � ������ �� �� ��� ������� ��� �� ������

����� ����� �� ��������� � ����� ��������

�� � �� � ��� ������ �12.33 �� ������ ��

������� � �12'�$ ��� �� ��� ������ ������

������� 0�� ������ ������� �� ���� �� �� ��������

���� � ���� ���� ������ ��� � �� ������ ������

� � �12.�3 �� �� ������� ��� �12.33�

�� �������� �� ��� ��

���� ���� ��� �� ���� ��� ��������

�� ���������� ���� ��� �� ��� �� ��� ���

�� �� �� 0���� $� 4����� ����� �� ������� ��

��� �� 4����"��-� ,5������ � � -����� 6����

������ -7/� 0�� ���� �� ������ ��� ��

����� ������ � �������� ���� ����� ��� ���� �

����� ����� ���� � �������� �������� #$%&� 4�����

��� �� ����!�� ���� � 8����� 4����� 9� ,8���

��� 6��2 6������/�

�� ���������� ���� ���� ��� ���� ������������ ,�:

;<� $3: 2� ��� *�: ��/ �� '2+ �� � ,����

=����/ �������� �� �� � ��� �� ��� ,3��:/ ����

�� ,� ��>��/ ��� �������� ,$ ��>��/� 0�������

�� ���� ���� �� � '2+����� ��� � �� ������ ���

� ������� ,� ��>��/ ��� �: ��!����� �� ����

���� -� ������ ������� �� ��� ������� ,�

��>��/ �� ����� �� '2+�

���� ����������� �� �� ���������� ����

��������������� ����� ������������

0������������ �� ���?� � ������ �������� ����

��� ���� ����� �� �� ��� ������ �� � .@; �����

���� �� � �3 �A 0��������� ���� ��B�� �2 C�3

��� ��������� �� $ �� � �� ��� ��B�� �� ����

��� $33 �� � �� ���������� ������ �� ������

��� ������ �� � )%@; �� )3 ���� 0������ �� ����

���� ����� ���� �� � $3 �� � ����� ����B����

����� ��� ��� ���� �� ) �� � '2+ ������ ���

���� �� ���� ���� ���

���� ��� ��� �����

���� ���� �� �� �������� � �������� ������

��� #$)& �� � ���� ���!�� ��� '���D� ��� �����

���� ��� �3 �� � '2+ ����� ��� ���� ������ ��

������� ���� ����� �� �� ��� ������ �� �����

���� �� � $3 �� � ����������� ������� ���� �����

�� �� �� ,$3: �������� ��� $ �A A�;��/ ���

��� �� ��������� �� � ���� �"�� ���� ������

���� �� �� ������ �� �?��� ����� ,)33E�33 ��/

� �� ��� �� ��� ���?� � �3 �� � �� ����

������ ���� ����� �� � � �� � ��� �� ����

������� ������� ���� � �� � � ���� ���� ���

��� "�� � ��� �� � ��� ��� ��� ����� ��

C � � ��� "F ,$$ "F>��/ ���� 6��� 0������

0���� )

;������ � ���� ���� �� �H�������� � �� ��� �� �� �� ��� ����� ���� �� � �12.33 ��� �����

(������� ���

����� �12.33

�5C3 � ��� ,2'$3$/ 12��� �5C3 � ��� ,2'$3$/

12��� $�$3� $�$3� ��$3� ��$3� )�$3�

12�)$ ��$3� ��$3� .�$3� $�$3� $�$3�

�5C3 *�$3� � $�$3� )�$3� G�$3� ��$3�

12��$ ��$3� )�$3� %�$3� G�$3� *�$3�

7�G� ��$3� � $�$3� C�$3� ��$3� *�$3�

����� � ���� ������ ��� >�� ������ ��� ,������� � ���� ���������� ��������� /�

�� ��������� �� ��� !�" �� �#������ $���� � �%� &�''() �(%*�+� $%%

Page 4: Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

��������� ��� �� �������� ������������ ����

��� ������� ����������� � ��� ��� ���!�� �� � ���

��"�� #$� %�! ����� �� ��� "�&����!� ��� ��� "���

!�!���!���! %��� ����! ����� ���� ' �� � #$� ���

�� ��������� � �� � ��� ������������ ����� ��� ������ ������� +.

Page 5: Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

��������� ����������� �� ��� � � �� �

������� � ��������� ������� ���������� �������

��� �������� ����� ��� ��� !! "�� ������ ���

�"��� #$%! ��� $� ���� ��������� ������������

�� ������� � �������

���� ������� �� � ������� ���� ������ ��

�� ������

�� ������ ������ &'(! ��� )&*� +����� %, "��

���� � ��� ������ ������� ����� ���� ��������

-./ �� ��� � ��� �� ������ ������ ���� ��

��� +����� �,0 �� ������ � ��� ��������

������0 "���� "�� ���� � ������� -./

��� �� ������ ������ 1% 2� 3� "�� �������

���� &'(! ��� )&*� ����� �������� � ��������

���4����� ������ �� "���� -./ �� �� ���

"�� �5������0 ��� ����������������� ������� "���

�� �5������ � �� ������� �� ����� �� �����������

����������� ���� �� ������ ���� �� ��� ���

�������

��� �������� ����� "�� ���� ������ "��� �����

��������� � ����������� �� �������� ����0 ���

�"�� �� ���������� "��� ����� -./ ������

�� �� ���� 3� ����������������� ������� "��

������ ���� ��� ��������6�� �����0 ���� �����

������� ���� ������� -./ � ����� �������

����� /� �5������0 ������������������ ������

"�� ������� ��� �� ��������������������

&'(! )&*� +* ��� %% ������0 �����������,� .

���������� "�� ������� �� ��� ��� ������

�������� � "����� �� ���� "�� ������ "���

�������������� � �������� �� ����� ������ ���

��� ��� �������� ��6���� ��� ��� � �������� �

������ ������� -./ �� ����� ���0 ���������

�� ���0 "��� �7��� �8��������0 ������������ ����

����� "�� �������� 9 ������� �����0 ��� � ���

���������� "�� ���������� � ���5�������

�! ��������� �� ������������� ���0 ���"�� ��

�" ���������� ����������� ��������� :� ���� �����

�0 ������ ������������������� ��������� "��

�������� ;�� � ��� ������������������� ������

�� ���� ��������� ���� ������� "�� ���� �5�

������ � ��� �������� � ��� �� � ���������

/� ��"� �� ����� 0 ���� � ����� ������0 ����

������� ����� ��� ��� % +���������� � &'(!,

9��� %� ��������� � ��� ������ ��������� ������� ��� !!0 ��� ���������� � ������ ���� ��� �!� ��� ������� �������

��� *� "�� ��������� �� �������� ��� ����3�������� ������� � ��� ������ ������� ���:/% +��� �5, ������� �� �� ��������

������� /��� ��!(� ��� ��� ����3 ���� � ��� �� ��� ������� �:= �� +���� ����> �5,� ���� "�� ���� �������� "��� ��� ���=3�:

������� �� ����� +��������� ��������� ��>�0 �������� �� �:9 0 ������ �5, � ������� ��� !!� ���� ������� ���������

������ �� �� ������ ��� ���>�� ������ ������ ��� ���3����=3 ������� +��"� �� �&, "�� ������� �� ��� !!0 ��� ������� �� ���

�������>� ������� �� �&)%%#! ������� �� ���3����=3 �������� +������ �5, � ������� ������� ��� �!� ��� �������� ���3 ����

���� +��"� �� ��, "�� ��� ����� � ������6� ��� ���� ��6�� �0 � ������� ���������� "�� ������� �� �������� �� ����� ��������

������ �0 ��� � ��� ���������� ���� ��� ��� �������� ��?����� � ����� �������� ����� "�� ���������

�����

���������� �8��������� � ����� ���������� � �� ��� �������� ������ "��� ������� ��� !! ��� ��� �!

=�������� -�

��� !! ��� �!

����� ;�% % :)% %(@% %#@%! ��� �� ��� ����� ���

&'(! �%!� ��%!� �%!� %�%!� �%!� ��%!� ��%!� �%!� ��%!�

����� ��%!� �%!� (�%!� �%!� �%!� ��%!� �%!� (�%!� �%!�

;�% % ��%!� %�%!� ��%!� %�%!� ��%!� %�%!� %�%!� �%!� ��%!�

:)% ��%!� #�%!� �%!� %�%!� ��%!� ��%!� ��%!� (�%!� %�%!�

%(@% �%!� � �%!� � �%!� �%!� � �%!� �%!� � �%!� �%!� � �%!�

%#@%! �%!� � �%!� ��%!� %�%!� (�%!� ��%!� ��%!� �%!�� ��%!�

��� �%!� ��%!� �%!� ��%!� *�%!� (�%!� �%!� �%!� %�%!�

�&�"� �� ���� ����� �����@�� ������� -./ +������ � ���� ����������� �5��������,� '�������� 4���� ����� �����������

���������� � ��� ������ ������

�� �������� � ��� � �� � ���!����� " �� �� �#$ %�&&'( �'#)�*� %�*

Page 6: Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

��� ����� ����� �� �� ������ ������� � �����

��� ��� �� ���� ��� �� �������� � ���� �� � ����

� � !������" #�� � �$� ������� � %

� �� �����&� �� �$ �� �" ��� �� � � �

� ���� � � � �� '� �� �������� � �� � � ���

��� ��� ��� �� ����" ����� �� ��������

��� �($��' ��� �� ��� �� �� � ��� ���

�� �������� � ����) ��� �' � ������� �

% �*' �$ �� �" ����� ��� $�� �� � �����

�� �$ � � $���" �� ��+��� �� ����� �� ���

�$�� �� � � �� ��' ����� �&'� &�� � *�� ����

� �,'� �� ��� �� � � � %' ���-'�� %��./�$0�

1���� � �%��� % �� ��� �$ �� ��� � �

��� � �234"

�� � ��������� �� �������

5 �0 � �� � � �% ��� � ������ �� ��$ �

� ��� ��� % ���� ���� � �% ' �� ��� �����"

6'� �� � ������ ��� % ��*���&�� � ����%��

%�� ��� ��� $���& ���7�84 ��� ���7�� ��� ��

���������� ���7�� ��� �� ����������� ���

���7�� ��� �� ���� 9�:;� � � ��� �� � �����

��� � �� ��� ����$� ��� ��� �&� � �� �

�7<=��� ��� � �$ ��& ������ � ������ �

� ���� � �� � �� ���� �7�4�" #� ���<>�7

��&�� �� ����� ��� �����& � ' ���'��� �

��� ��� ��* ��� �� �&� � �� � ��� �� �

�&� ���%���� � ������� ��� � �$ ��& � ���

���� � � ���� � �� � �����" #�������

�� � � �% ���� �� � �� ' �� �� �� � �������

� ���� �� �� ���7�� �� ��&��� � �� �� ���

���������" #��� � ������ ���&�� � ���844 �1�&"

��� � ��� � � �% ' �� �� �������� %��$� �� ' ��

��'�������� �� � �� � �&� �� �4 �$%�$ �

$� �� � �%��� �� ' ���'���" >� ���� ����

���844 ��� �� +� �� ��� � &�� �) �����

��%���& ���844 ($�� �� ' =?8 ��'� �� �� �

��' ���� ��� �� � ���� �� ' ���'����

� ��$&� @?�4 ��'� ��� ($�� �� � �����"

����� ������� � ���844 ��� ��� &�� �

�������� � � � �($��' �� �4�?�4� ��$ � �&

���� ����� ��� �� ��� �44��� � ��&� ���

�� � ����� ��� �#�% =�" �$ � ��� ��&� ����

���� ��� !����'� ��� � �� �������� �� �� ����

����� � ����� �#66 ==�::� 7�� ��� �@A�4� ���

�$�� �������� � �� � ���844 ���� ��

��� �� ����� �� � �� ����$� �� �������� � �����

� %� � � �� �� �($��'� �4�?�4� ��$ � �&

��� �#�% 8�" �� 0�� �� �� %�� �� �������

� � ��� �� ��� ���� ��� ��� �� � �

�44?�444��� � ��&� !����'" >� ��� 0���� �

B��=� ��� ��$�� � 0��%� �� � ��&��' �&����

������ ���� � � �234 ��� ����"

���� ������������ �� ������� �����

� ��$&� ���844 ��� � C� � ����� ��$�� �

% ����% �� � ��� ��& � �% ' �� �� ��������� � �

�� �$ � ��, �� ��"@ *% ��� �� �& � �����

$��($ � ���& �� �" ���� � ��� ��� �� � ��

�� �� &��� �� � ��� ��� ��� $�*����� �

� �� � � &�� � ��� �� � ���� %' ���

&� ��� �� � ����$� � �� ��� �,'�� ��� ���

�$ ��,� ���� �� ��� %' ������� ��� �� � �� ����

����� �����" ��� �� � ��� � ������

�$� �% ���� � $�� �% �� �� �������� ���

� �� $� ' ����� � ��� � � �" #�

� � � �� ��� �� � ��� � �$ � �� &��� �

($�� �� � �%� � ' � ��*� �� � D�E ��� D� %E�

��� �� '� �� � ���� �� 1�&" �" ����� ��

��� �$ �� � �� ��� �� � &��� ��� $���&

� � �� ��� �� � ��*� �� � D�E � ��

�% ����" #� &��� ��� �� �� � ��� ��� ��

�� �������� ��� �$� � ��� �� ��� �� ��*� ��

D<�E"

7��� �� � �%�� �%��� ����� � ��>����<>

��&�� ��� ���844 ���� �� 1�&" �� ��� � �

��� � ��� �� � � �� '� ��* ��&�� ��

�����@4 �F�������� ����� ����� ��� %� 0�

���� %' ���<> ��� ���> ��$% ��&� ���" #�

��� � ��> ��&�� ��6� ��� � �� � �" �

�� � ����� �� � � �� �$ � ��, �� @"� *% ���

���&�� � ���8�4 ��� �$� �% ����" #��� � �����

������ �� $��($ � ����& �� � ������ %' �� ��*�

�� 1�&" ��� ��� ��� ���� ���� �� � �% ' �� ���

���844 �� �� ��������" #� !����' �� ������

�� ��� �� � ���8�4 ��� �� ' ($��� � � ��

�� � ���844 �#�% 8�"

>� �$���'� � ��� &�� � ����� � ����

�� �� �������� �� ��� ������� � ����� ���

%' � ���� ��� &�� �� �� � � ��$�� ��� � �%

� ������ �� � � � � �% ��* ��� � ����&

�� �" #��� ���� � $ � � ��� ��� � �'� � ��

�� �������� �� �� % $��$ �� &� �� � $���

�� ��� �����"

�� ��������� �� �� !�"� "����#������ $������ %& '%(()* %)&+%,%�@4

Page 7: Construction of a plasmid vector for transformation of Porphyromonas gingivalis

����������

��� ����� �� �� ���� � �� � ����� �� ���������� � ��� ����

���� �� ������ �!������"�� �# ���������� ����� � "�

���$���� !�"��� � "�"�"�� � !��%� ��"�� �# ! �"�����"�"� �&"�

�& '(�� ))*)+

�'� ������ � ��� ,"��%��� �� �- ������ ���������� ����� ��

���������� ���������� ��� ���������� � ������������������

��� "� $���� ! �"������� �"� �� � � .�"� / �"������� �)�

�)*�(

�(� 0������ ��� 1 2������ �� ��� ������ � ������ ���&3 !"%�

� �� � ���������� �!! "� �$ $���� ���� &��"�2 �# &� ��

��� ('� ���*'4(

�5� 6 �&�� 1� ����'� ���� � �!��� � "� ! �"������� �"� �� �7

&��� �� &��& !�� � / �"������� 8(� ((�*())

�)� "&3"����� /� ���"�" &� �-� 9��$"����� � ��� 6 �&��

1 ������ ��� &���� &���"�% ��� � :� �&"�% �# �$ % � ��

&��"�% �$ ;���"�� �����"� !��� "� �# ���������� ����� �

� ��&� �"�� �+4� �8)�*�88)

�8� -������ �-� 1"%%� 6� �$��� �� <"��"���� � <����& � -

��� 1�� ���� � ����4� .���"�% ��� =!� ��"�� �# � �������

������ ����� � !��� �� % � "� ���������� �� � -�&$

>��� �"�� () ���!!��� �)�*�8�

�+� ����% ��� 6� ,�!�"�� � �� / ��:�"�� / ��� ��2�����

����'� .���"�%� =!� ��"��� ��� � :� �&"�% �# � !��� �� % �

����� #��� ������������ ����� � <�( "� ���������� �� �

�# &� ���� 84� (��8*(��'

��� /����?� @� /�� �!�� �� /"3 � 1@� /��&$�A3�� B� �" # ��

�.� C���"�� � ��� ����� /� ����)� ��� &���� &���"�%

��� ����&����� &$���&� �"A��"�� �# �$ -�%�%"�%"!�"� !��� "��

�� �# ������������ ����� � � �"�� .$ � '+4� �44+*

�4�4

��� /��%���3 ���=� -� C��D������ � ��� ����� �. ������ C$

=!� ��"�� ��� #��&�"�� �# � ���������� ����� � $ ��%%���

�"�"� % � "� ���������� �� � >��� �"&���"�� ������ 5�

�'�*�(�

��4� ������3����� C ��� ����� �. ����(� .���"�% �# �D� �"��

�"�&� $ ���2�"� % � � #��� ������������ ������������ ���

��� � "� ���������� �� � �"&���"�� /��$�� �)� (+*5�

���� ������ �-� � �� ��"� �� ��� /��%���3 ���=� - ������ � ��

�";&��"�� ��� � :� �& ����2�"� �# � � �$2��� % � "� ����

��������� ����� � @�&� "& -&"�� 1 � ��� 5���*5��'

��'� ,������ - ��� 1�� ���� � ����5� .���"�% ��� =!� ��"�� "�

���������� �� � �# �$ ���� % � #��� ������������ ����

�� � "��"&�� � �$�� � ���@��& �2��$ =����"�"��� "� �� ��� ��

� ����� �����&"�� � �"!�!��� "� �"&���"���%2 �54� ((��*

(548

��(� 9��$"����� �� C�3�$��$"� 9� ������� @ ��� E� �����

C ����(� 6 � �"& �����#�����"�� �# ������������ ����� �

�2 � &���!����"�� >��� �"&���"�� ������ �� '4�*'�'

��5� �" �� �� � ��� <"��$� 1 ������ C����#�����"�� �# ��&� �"�

D"�$ !����"� @- �2 � &���!����"�� -��� �"�&$ � �+4�

(�*55

��)� /��%���3 ���=� -� >� ��� � -� �������� . ��� �&-��

�$��� </ ������ C����# � �# !����"� !�)�' #��� ����������

�� � �� ���������� ����� � ��� �� ���������� >��� �"&���

�"�� ������ 5� �('*�(5

��8� �$� ��3 �� @�� 6��$�" � �/� ���2 ��� -- ��� 6���� ��

�� ����)� ��"� �& �$�� &�"����2&"� � �"����& % � �# ����

������� !����"� !��5 "� � �����!����� � � �� � ��&� �"��

�8'� 8'8*8('

��+� 9��$"����� � ��� E� ����� C ����4� .$���&� �"A��"�� ���

!$2�"&�� ��!!"�% �# !����"� �# ���&3�!"%� �� � ����������

>��� �"&���"�� ������ )� '4�*'�'

���� ���"� �� �� 1���"%� A� 1,� 6� � � /�� � ���&$� �.�

� 2� 3 �� �,� ��2 �� �<� .����� �� ��� ���3�D� �

���++� .������&�"�� ��� &$���&� �"A��"�� �# � D &���"�% � �

$"&� � - ����"!��!�� &���"�% �2�� � 6 � '� �)*��(

�� �������� �� � � � ��� �������� �� !����� "#$ �"%%&� "&#'"(" ���