1 - CONTAGEM DIRETA AO MICROSCPIO (Ref. 1) um mtodo rpido, mas a preciso depende do tcnico e do nmero de contagens feitas. Pode ser utilizado inclusive, quando h slidos em suspenso. Permite, tambm, avaliar o nmero de clulas vivas e clulas no ativas, mediante o uso de azul de metileno ou da tcnica da colorao diferencial. 1.1 - EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS Microscpio Cmara de Neubauer e lamnula Pipetas Pasteur Pipetas de 1 ml Bales de diluio Azul de metileno 0,1 % (P/V)

1.2 - A CMARA DE NEUBAUER

Inicialmente era utilizada para a contagem de hemcias, da os nomes hemacitmetro ou cmara hematimtrica. Consiste em uma placa de vidro em cujo centro h dois campos escavados de igual profundidade. Sobre estes campos colocada a lamnula, formando, ento, um compartimento de volume conhecido, no qual introduzida a suspenso celular. Macroscopicamente, a cmara apresenta o seguinte aspecto:

Cada campo formado por uma matriz de 5 x 5, conforme ilustrado abaixo.

Ao visualizar em microscpio tico utilizando aumento de 400 vezes pode ser observado a rea referente ao de um quadrado dos 25 que compem ao volume total de 0,1 mm3. Na contagem, via de regra, utiliza-se um mtodo estatstico, que consiste em contar os quadrados assinalados. Sendo assim, faz-se necessrio adotar um critrio que indique com clareza qual linha deve ser considerada para a contagem. Um bom critrio considerar como pertencente ao quadrado de linhas superior e lateral esquerda, conforme indicado na figura seguinte.

Desta forma, so contadas as clulas que estejam sobre as linhas indicadas. direita e abaixo no so contadas as clulas, conforme ilustrado no exemplo a seguir.

1.3 - METODOLOGIA EXPERIMENTAL A - Em balo de diluio de volume apropriado, colocar gua destilada at a metade e adicionar azul de metileno 0,1 % (P/V) na proporo de 5 ml para cada 100 ml de volume total. B - Pipetar 1 ml de suspenso, completar o volume e homogeneizar. C - Fixar a lamnula sobre o campo. D - Com o auxlio de uma pipeta Pasteur, introduzir a suspenso diluda no compartimento formado entre a lamnula e a cmara de Neubauer, de modo que todo o campo seja preenchido.

E - Proceder contagem, utilizando aumento de 400 vezes e mdia luminosidade.

Aconselha-se fazer, no mnimo, 4 contagens para cada amostra. Para um bom resultado, a literatura recomenda que a diluio seja feita, de modo que se tenha entre 40 e 60 clulas em cada um dos 25 quadrados.

1.4 - CLCULOS Sejam: N: nmero de clulas em cada quadrado V: volume de cada quadrado, V = 4 x 10-4 ml (Volume de 1/25 = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm3 = 4 x 10-4 ml) N: mdia de clulas para cada contagem Logo: 1 5 N = ------ Ni (eq. 3) 5 i=1 e N X = ------- x fator de diluio x 25 (eq. 4) V X em nmero de clulas/ml calculada ao efetuar a contagem de uma nica cmara de placa de Neubauer. Para n contagens de cmaras ao microscpio calcular a mdia aritmtica, 1 n X = ------ Xi (eq. 5) n i=1

Observao ao microscpio de levedura S. cerevisiae com aumento de 400x, para contagem de clulas em soluo aquosa de azul de metileno

Referncia 1 - BSCS. US. Biological Science - Interaction of Experiments and Ideas, 2nd. Ed., Englewood Cliffs, Prentice Hall, London, 1970.