CONTAGEM DE CÉLULAS EM

CÂMARAS DE NEUBAUER

Relatório de Imunologia

Vila Nova de Gaia - Junho de 2008

OBJECTIVO DO TRABALHO

Efectuar a contagem do nº de células em

câmara de Neubauer.

Contagem de células em câmaras de

Neubauer

Actualmente este métodos é utilizado como técnica

básica em muitos laboratórios de investigação,

para testar teses experimentalmente (por exemplo

testar um novo fármaco).

Como material de estudo utilizou-se células THP1

(linha celular de monócitos humanos), sendo este um

conjunto de células que derivam de uma única

célula, tendo por isso as mesmas características.

Contagem de células em câmaras de

Neubauer

Existem dois tipos de linhas celulares:

Primarias: dizem respeito ás células que se encontram

presentes no organismo;

Secundárias: são obtidas por transformação das

células primárias. Essa transformação ocorre ao nível

do DNA, para que estas se tornem imortais.

Apresentam um tempo de vida superior ás primárias;

Contagem de células em câmaras

de Neubauer

Este método baseia-se no preenchimento da câmara com a suspensão de células a contar. Começa-se por humedecer com água destilada as duas cavidades da câmara, colocando de seguida a lamela com uma suave pressão, partindo da extremidade, deslizando pela câmara.

Nota: A formação de um “arco-íris”

entre a lâmina e a lamela indicam que

esta foi colocada correctamente

Contagem de células em câmaras

de Neubauer De seguida, colocamos a

suspensão de células na ranhura existente entre a superfície inferior da lamela e a parte central da câmara de contagem, encostando a ponta da pipeta na borda da lamela, preenchendo cuidadosamente a câmara.

O líquido deve preencher apenas um dos lados da câmara e não deve chegar aos canais de cada lado da área de contagem. O enchimento não deve ser em demasia para não haver agregados de células, nem por defeito com o objectivo de não ocorrer a formação de bolhas de ar.

Contagem de células em câmaras

de Neubauer

Após o enchimento da câmara, efectua-se a contagem das células propriamente dita.

A contagem das células deve seguir um sentido específico, com o objectivo de não haver contagens repetidas.

Utilizando o microscópio, é possível contar o número de células presentes em cada quadrado e, assim, conhecer o número de células por unidade de volume

Material

Laminas

Lamelas

Eppendorfes

Suporte de eppendorfs

Suporte de tubos de ensaio

Pipetas de Pasteur de Plástico

Micropipetas (de 20, 100 ou 200 e 1000µl)

Pontas de micropipetas

Câmaras de Neubauer

Microscópio óptico

Agulha de dissecção

Álcool a 70%

Luvas

Solução de lixívia 10%

Goble com solução de Lixívia

Procedimento

Inicialmente, efectuou-se uma preparação extemporânea dasuspensão de células THP1 em PBS1X 2%BSA. De seguida,efectuaram-se 3 diluições da suspensão de células THP1, emPBS1X 2%BSA: a primeira foi feita numa relação de 1:10, istoé, diluíram-se 10µl de suspensão de THP1 em 90µl PBS1X2%BSA.

Após a primeira diluição, repetiu-se o mesmo processo duasvezes. Entretanto, procedeu-se á preparação da câmara deNeubauer, que consistiu em fixar a lamela á câmara, paraposterior enchimento da mesma. Estes enchimentos foram feitosatravés de uma pipeta, em ambos os dois campos de visão dacâmara.

RESULTADOS

Diluição

Contagem do

nº d células

1.10 1:100 1:1000 Solução

Original Sem

Diluição

Quadrado

Superior

1ª Contagem

2ª Contagem

3ª Contagem

2

2

2

2

2

2

0

0

0

41

41

41

Quadrado

Inferior

1ª Contagem

2ª Contagem

3ª Contagem

0

0

0

2

2

2

0

0

0

40

40

40

Média (1:10) = 2+2+2+0+0+0 = 6/6 = 1

Média (1:100) = 2+2+2+2+2+2 = 12/6 = 2

Média (solução Original) =41+41+41+40+40+40 = 243/6 = 40.5

RESULTADOS

1. Calculo da concentração de células na suspensão

original:

Nº de células x 10 x diluição

a)1 x 10 x 10 = 100 células/µl

b)2 x 10 x 100 = 2000 células/ µl

c)Não foi possível efectuar o cálculo para a diluição de

1000, porque não foram observadas nenhumas células.

RESULTADOS

2.Cálculo do nº de células presentes na suspensão original de células THP1:

100 (número de células na diluição 1:10) + 2000

(número de células na diluição 1:100) = 2100/2 =

1050células/µl

C = n /V <=> 1050 células/ µl = n/100 = 105.000 células

Conclusão

Este trabalho teve como finalidade, a contagem de

células vivas em várias diluições (1:10; 1:100;

1:1000).

Na diluição de 1:10, foram observadas 100 células/

µl

Na Diluição de 1:100 foram observadas 2000 células/

µl

Na Diluição de 1:1000 foram observadas 0 células/ µl

Conclusão

Podemos assim dizer que não era o esperado,

pois o resultado deveria de ser: uma diminuição de

células conforme vão aumentando as diluições,

neste nosso trabalho, o resultado foi de que na

diluição 1:10, o resultado foi de 100 células, e na

diluição 1:100 o resultado foi de 2000 células, ou

seja houve um aumento de células, só na diluição

1.100 é que o resultado foi o esperado, não

contendo alguma célula.

Contagem de células em câmaras de

Neubauer

Obrigado pela

Vossa Atenção