Contaje de placa aeróbica, Tinción Gram y Aislamiento

Laboratorio de Microbiología de Alimentos

Contaje de placa aeróbica

• Provee un estimado general de bacterias aeróbicas vivas

• Evalúa calidad• Predictor de “shelf-life”• Monitoreo ambiental• Excluye

– Anaerobos obligados– Microaerofílicos

Contaje en placas

• Asume– Cada colonia proviene de una sola célula

bacterial– Algunas colonias puede ser originadas de una

“agrupamiento”de bacterias• Se reporta como

- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ó ml.- NO como bacterias totales

Resultados del Contaje de placa aeróbica

• Evalúa la sanitación de una producto

• Predice la durabilidad (Shelf-life)

• Indicador de seguridad (Safety)

• Monitorea el ambiente

Limitaciones del contaje de placa aeróbica

• Sólo se consideran organismos aeróbicos• No se sabe el tipo de bacteria• El medio de cultivo permite el crecimiento de

ciertas bacterias• Limitaciones visuales/Errores humanos• Difícil de distinguir entre partículas de alimentos

y bacterias• No se debe utilizar en alimentos fermentados• Las colonias podrían ser muy pequenas para verse

Tipos de muestra

• Líquidas– Líquidos no viscosos se miden con pipetas– Líquidos viscosos se pesan

• Sólidas– Pesar asépticamente

• Hisopo– Tomar muestra pasando un hisopo por un área definida

• Ambientales y de envases– Enjuage el interior del envase– Abra una placa para tomar una muestra del aire– Placas RODAC

Protocolo para Contaje en Placas

• Prepare un homogenado de la muestra– Dilución 1:10– 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen

total

• Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2 minutos

10 g/ml muestra 90 ml of diluyente

1:10 Dilución – 10-1

Protocolo para contaje en placas

• Prepare diluciones seriadas– Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 20-

200 en una placa

– Utilice una pipeta estéril entre cada dilución

– Ponga la pipeta usada en el área designada

• Mezcle cada botella de dilución 25 veces en un arco de 90 grados por 7 segundos

• Use amortiguador de fosfato o peptona para diluir

Diluciones

Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent

10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

(1:10) (1:100) (1:1000)(1:10000)

(1:100000)

Sample Homogenate

Placas

10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml 1 ml1 ml1 ml1 ml

Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish

Protocolo Contaje de placas

• Anada 18-20 ml de agar (45-50F), a la placa petri– El agar no puede estar muy caliente porque mata las

bacterias

• Método estándar ó agar de placa (Plate Count Agar)

• Mueve 10x en cada dirección• Deje que solidifique• Incube las placas invertidas a 35-37 por 48

horas.

Esterilización

• El equipo y el medio de cultivo debe estar estéril• Esterilización en aire caliente

– 170 C por una hora• Ponga en horno por 2 horas luego que éste alcance la

temperatura• Envuelva en papel o papel de aluminio

• Esterilización por vapor– 121C por 15 min. Debe alcanzar el autoclave 15 psi

de presión• Equipo y medio líquido• No ponga las tapas apretadas

Tinción Gram

• Gram positivo ó negativo

• Basado en la estructura de la pared

• Gram positivo– Pared gruesa por la capa de peptidoglicano

• Gram negativo– Capa fina con presencia del lipopolisacárido

Obtención de colonias aisladas

• La meta es obtener colonias aisladas del alimentos y/o cultivo

• Las colonias pueden ser identificadas y evaluadas

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•Collect loopful of culture•Streak in each area starting with area 1•Flame Loop in between areas

Contaje de placas

• Sólo cuente las placas que tengan entre 20 y 200 colonias

• Más de 200– TNTC

• Menos de 20– TFTC

Contaje de placas

-175---Average

10150TNTCTNTCTNTC2

192200TNTCTNTCTNTC11

1:1000001:100001:10001:1001:10Plate

1 Too Numerous to Count2 Too Few to Count

•Average two countable plates and Multiply by Dilution Factor•Count is 175 x 104

•Must Convert to TWO Significant Digits•1.8 x 106 cfu/ml or g

Contaje-Ejemplos

TFTC125250-Average

20100200TNTC2

10150300TNTC1

10-410-310-210-1Plate

Use ALL FOUR even though 300 is outside range. If ONE PLATE is in RANGE, use BOTH for Average.

250 x 102 – 2.5 x 104

125 x 103 – 1.3 x 105

AVERAGE – 7.8 x 104 cfu/g or ml

Contaje - Ejemplos

350---Average

400TNTC TNTCTNTC2

300TNTCTNTCTNTC1

10-410-310-210-1Plate

All Dilutions are outside Range so we MUST use counts Outside range

350 x 104 – 3.5 x 106 cfu/ml or g*Use an “*” when using dilutions outside countable rangesThis means it is an ESTIMATED count

Contaje- Ejemplos

125250-Average

5400TNTC2

10300TNTC1

10-310-210-1Plate

If Both Dilutions are outside Range, use the Higher Dilution(LOWER COUNTS)

7.5 x 103 cfu/ml or g*

Placas con muchas colonias

• Cuente la dilución mayor y utilice las rejillas en el contador de colonias– 1 rejilla = 1 cm2

– Una placa plástica estándar tiene 56 cm2 de área de superficie• Si <10 colonias/cm2 cuente 12 cuadrados (6 consecutivos

verticales y 6 consecutivo horizontales)– Totalice y divida por 12 (promedio). Multiplique por 56

para obtener – el número total de colonias en la placa. Reporte como

estimado• Si >10 colonias/ cm2

– Cuente 4 cuadrados, promedie y multiplique por 56

Variaciones al contaje aérobico

• Psicotróficos– Incube a 5-7 C por 10 días

– Use esparcido

• Termodúricos– Ponga 5 ml de la muestra o la dilución 1:10 de la

muestra sólida en bano de agua entre 60-80n C por 30 minutos

– Enfríe en hielo por 10 minutos

– Ponga en placa e incube

Primer Período

Esquema

Segundo Período

Petrifilms

Ventajas y desventajas de utilizar los petrifilms

• VentajasRápidoMenos espacioFácilesNo hay que preparar medioDistinción entre CFU vs. Partículas de alimentos

• DesventajasMorfología de la coloniaCostosoDifícil de leer