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Control Biológico de Enfermedades de Plantas

Montevideo,17 al 28 de febrero de 2003

Programa de Desarrollo de las Ciencias Básicas (PEDECIBA) Área Química

¿Por qué es necesario identificar un agente biocontrolador?

Montevideo,21 de febrero de 2003

Dra. María Julia Pianzzola

Identificar para:

• clasificar en grupos existentes (¿es patógeno?) o es nuevo

• mantenimiento (en el almacenamiento puede contaminarse o mutar)

• diversidad: distinguirlo de otras cepas de la misma especie que no posean actividad controladora

• monitoreo: una vez liberado al ecosistema• registro: propiedad intelectual y comercialización

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Identificar ¿cómo?

• ¿Qué tipo de microorganismo?¿Bacteria?,¿ levadura?,¿ hongo filamentoso?• Métodos clásicos:

morfología, asimilación de nutrientes, actividades enzimáticas, etc.

• Bacterias• Levaduras• Hongos filamentosos

Bacterias

• Tinción de Gram, Tinción de esporas, cápsula, etc

• Pruebas primarias• Pruebas bioquímicas• Kits comerciales, ej. API

Bergey’s Manual

Levaduras

• Presencia de ascos, pseudomicelio, cápsula, etc.

• Kurtzman y Fell, 1998.

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Pruebas bioquímicas

Hongos filamentososObservación macro y microscópica: hifas, elementos de propagación y resistencia, etc

Crecimiento en distintos medios (Pitt, 1999)

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Muchas veces las características morfológicas y los cultivos no son suficientes para detectar la variabilidad interespecífica y diferenciar cepas muy cercanas

Técnicas moleculares para identificación de microorganismos

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• Métodos moleculares basados en PCR:Tratamiento de la muestra (cultivo puro, muestra de suelo, fruto, etc)Elección de la secuencia blancoSensibilidad

Ejemplos:• RFLP (restriction fragment length polymorphism): amplificación

por PCR de una secuencia, digestión enzimática y comparación de los fragmentos resultantes.

• RAPD (random amplifed polymporphic DNA)

• AP-PCR, rep-PCR

Secuenciación

Bacterias:

Amplificación por PCR del gen del 16S ARNr (1500pb)

• Comparación de la secuencia en bancos de datos

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Búsqueda de agentes biocontroladores

• Aislamiento• Selección• Identificación• Potenciación

Aislamiento• ¿Qué pasa con los microorganismos endófitos (bacterias y

hongos)?• Existen microorganismos endófitos que residen en los tejidos de las

plantas y en el sistema vascular sin ocasionar síntomas de enfermedad.• Por mucho tiempo se pensó que eran contaminantes o patógenos

latentes pero se ha demostrado que son capaces de promover el crecimiento y actuar como agentes biocontroladores.

• Se han aislado unas 129 especies de bacterias de tejidos internos de plantas, las más abundantes: Pseudomonas, Bacillus, Enterobacter, Agrobacterium

• Sin embargo, muchas son difíciles de cultivar por no conocerse las condiciones de crecimiento o estar en el estado de VBNC.

• ¿Cómo detectarlas y llegar a conocer su identidad?

¿Cómo conocer la identidad de los endófitos?

• Extracción del ADN de las bacterias a partir de tejido de planta.

• Amplificación por PCR con primers universales para 16S rARN de bacterias

• Clonado de los fragmentos amplificados en y un vector (plásmido)

• Transformación en una cepa de E. coli• Selección de los recombinates (librería de 16S rARN)• Secuenciado de los fragmentos clonados en cada uno de

los clones.• Comparación con banco de datos.

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Otras posibles técnicas moleculares :

• T-RFLP (terminal restriction fragmentlength polymorphism)

• SSCP (PCR-single-strand-conformation-polymorphism)

• PCR-D/TGGE (denaturing or temperaturegradient gel electrophoresis)

Bacterias viables pero no cultivables (VBNC)

→ (Xu et al., 1982):“ las bacterias son viables pero incapaces de dividirse suficientemente en un medio no selectivo para dar un crecimiento visible“Es un estado de dormancia de bacterias no esporuladas”Las condiciones que las inducen varían según las bacterias: presión osmótica, ∆T, desecación, exposición a metales pesados, falta de nutrientes.”la resucitación no siempre ocurre al revertir las condiciones que la ocasionaron”Para determinar VBNC se deben usar ensayos de viabilidad independientes del crecimiento: actividades metabólicas, presencia de ARN, ATP o integridad de membranas.

Selección

• Si conocemos el mecanismo por el cual el agente actúa como controlador, ejemplo, un antibiótico, y conocemos los genes responsables de su producción y/o regulación, entonces podemos diseñar sondas que permitan seleccionar de todos los aislamientos los que porten dicho gen.

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Hongos y levaduras:

Caracterización de patógenos de citrus

RAPD 5 RAPD 9 RAPD 10

• Penicillium digitatum• Penicillim italicum• Penicillium ulaiense• Pencilillium expansum

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 151 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

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P e n i c i l l i u m i t a l i c u m E 2P e n i c i l l i u m i t a l i c u m N 1 3P e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 4P e n i c i l l i u m i t a l i c u m N 1 7P e n i c i l l i u m i t a l i c u m N 3 aP e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 2 7P e n i c i l l i u m i t a l i c u m A 1 8P e n i c i l l i u m i t a l i c u m L 1 0P e n i c i l l i u m i t a l i c u m L 7P e n i c i l l i u m i t a l i c u m L 6P e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 3 0 bP e n i c i l l i u m i t a l i c u m E 6P e n i c i l l i u m i t a l i c u m L 1 1P e n i c i l l i u m i t a l i c u m N 2 1 bP e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 1 5P e n i c i l l i u m i t a l i c u m N 2 0P e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 3 3P e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 3 4 bP e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 2 0P e n i c i l l i u m i t a l i c u m C CP e n i c i l l i u m i t a l i c u m M 7P e n i c i l l i u m i t a l i c u m A 3P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m M 8P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m E 7P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m P P 4P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m S BP e n i c i l l i u m d i g i t a t u m N 3 cP e n i c i l l i u m d i g i t a t u m C SP e n i c i l l i u m d i g i t a t u m M 1P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m M 3 9P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m M 2 vP e n i c i l l i u m d i g i t a t u m N 4P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m N 8P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m L 1 2P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m B 2P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m V 3P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m B 1P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m X cP e n i c i l l i u m d i g i t a t u m N 2 5P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m V 1P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m M 5P e n i c i l l i u m d i g i t a t u m 7 vP e n i c i l l i u m d i g i t a t u m P P 1P e n i c i l l i u m u l a i e n s e C AP e n i c i l l i u m u l a i e n s e N 6 aP e n i c i l l i u m u l a i e n s e N 1 9 bP e n i c i l l i u m u l a i e n s e X aP e n i c i l l i u m u l a i e n s e N 3 uP e n i c i l l i u m u l a i e n s e M 3

1 0 0 9 0 8 0 7 0

Caracterización de patógenos de manzanas utilizando RFLP y RAPD

Fragmentos de restricción con Hae III

M1 8 9 Pb Pv Pc M1

Fragmentos de restricción con Taq I

M1 M2 7 8 9 Ps Pb Pv Pc 2 4 10 12 M2 Pv

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Fragmentos de restricción con Hind IIIM1 M2 Pc Pb Ps P7 PC AN P12 P13 P14 P15 P16 P17Pv M1

P . e x p a n s u m 1 4P . e x p a n s u m 1 9P . e x p a n s u m 1 6P . e x p a n s u m 1 3 D S M 1 9 9 4P . e x p a n s u m 3P . e x p a n s u m 1 7P . e x p a n s u m 4P . e x p a n s u m 2P . e x p a n s u m 1 5P . e x p a n s u m 1 0P . e x p a n s u m 1 2 D S M 2 4 4 7P . s o l i t u m 8P . s o l i t u m 9P . s o l i t u m 7 C B S 1 4 0 . 8 6 D S M 2 2 1 5

1 0 0 9 0 8 0 7 0 6 0

Dendograma resultante de la amplificación con el marcador RAPD 7 para cepas patógenas de manzanas

Diversidad genética de Aureobasidiumpullulans

(Postharvest Biol. Technol. 1999,17: 189-199)

Actividad biocontroladora de diferentes aislamientos de A. pullulans en manzanas contra B. cinerea

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AP-PCR realizados con los aislamientos de A. pullulans con los primers: A: (GACAG)3 B: (GACA)4, C: (CAG)5

Amplificación por RAPD con el primer D-20 de A. pullulans L47(1:cultivo puro) y de los reaislamientos obtenidos de frutas tratadas con el antagonista

Resultados:

• Alta variabilidad genética de 41 aislamientos de frutas

• A. pullulans durante muchos años fue conocido por diferentes nombres: extrema inestabilidad y heterocarionte (permitiendo intercambios genéticos durante la mitosis).

• Identificar un aislamiento específico es fundamental cuando el agente es liberado al ambiente y es necesario monitorear la dinámica de la población.

Detección molecular de A. pullulans

Plant disease, 2001, 86:54-60

• 205 aislamientos con dos marcadores RAPD.• Un fragmento característico de L4 se clona, secuencia y se

diseñan primers para región SCAR (sequence–charactherized amplification region) y una ribosonda de 242 pb

• Límite de detección: 20 pg/ µl• A partir de uno de los primers se obtiene un primer

Scorpion para detectar un amplicón de 150 pb por fluorescencia para demostrar la presencia del agente al penetrar la epidermis

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Construcción de cepas de Pseudomonas con actividad biocontroladora mejorada

• La colonización depende de muchos genes:• los que codifican el flagelo,• la señal de quimiotaxis, • estructuras involucradas en la adhesión y fijación

(fimbrias, lipopolisacárido, etc) y• multiplicación en los exudados de la raíz.

Ejemplo 1:• Existe un sistema regulatorio de dos componentes;

ColS/ColR y una recombinasa sitio específica: Sssnecesarios para la colonización de Ps. fluorescensWCS365

• Un mutante sss- no puede inducir la producción del sideróforo pioverdina cuando hay un estrés de Zn+2. Si se introduce un plásmido con el gen sss en mediocres biocontroladores (cepas WCS307 y F113) aumenta su actividad contra Fusarium (en un sistema de tomate).

Ejemplo 2:

• El transporte de hierro en Pseudomonas está ligado a la producción de quelantes de alta afinidad: pioverdina y salicilato. Estos compuestos se unen al Fe+3, funcionan como sideróforos y son reconocidos por receptores específicos en la membrana externa.

• Dadas 2 P. fluorescens: WCS358 que posee una variedad de receptores para sideróforos y WCS374 que sólo posee uno lo que le impide competir con la anterior, si se expresa PupA (por introducción de un plásmido) en esta cepa aumenta su población y compite con la otra.

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Ejemplo 3:• Los antibióticos phenazine-1-carboxylic acid

(PCA) y 2,4-diacetylphloroglucinol (Ph1) actúan contra Gaeumannomyces graminis (Ggt)

• Si en una cepa productora de Ph1 se introduce un plásmido con la vía biosintética de PCA, se potencia la actividad biocontroladora.

Conclusiones: las Ps. modificadas mejoraron su actividad, resta minimizar la transferencia horizontal (introducir modificaciones en el cromosoma y no por medio de plásmidos)

Levaduras como agentes de biocontrolen postcosecha:

1. Rápidamente colonizan y permanecen largos períodos de tiempo en la superficie de la fruta bajo diferentes condiciones.

2. Utilizan los nutrientes limitando su disponibilidad para los patógenos.

3. Son más resistentes a los fungicidas.4. Ej: Pichia guilliermondii, Candida oleophilaPERO:

No poseen un comportamiento adecuado en condiciones comerciales y deben suministrarse con bajas concentraciones de fungicidas o con tratamientos precosecha con un antagonista.

Expresión de un péptido antifúngico en Saccharomyces

• Derivado del Cecropin A inhibe germinación de Colletotrichumcoccodes (patógeno de tomate)

• Amplificación de la región del antibiótico con primers específicos a partir de una construcción previa

• Construcción de la fusión entre la secuencia señal de la levadura y el fragmento amplificado y clonación en pRS413

• Transformación en la levadura• Confirmación de la secuencia en una transformante (aislamiento y

secuenciado del fragmento)• Análisis Fast protein liquid chromatography (FPLC) en extractos de

la levadura (producción del antibiótico)• Ensayos de germinación del patógeno frente a extractos de la levadura

y ensayos de protección en la fruta