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CONTROL INTEGRADO DELA MARCHITEZ BACTERIANA

DE LA PAPA

S. Priou, P. Aley, E. Chujoy, B. Lemaga and E. French

CONTROL INTEGRADO DE LAMARCHITEZ BACTERIANA DELA PAPA

Autores: S. Priou, P. Aley, E. Chujoy, B.Lemaga y E. R. French

Ralstonia solanacearum es elagente causal de la MarchitezBacteriana (MB) de la papa. Estabacteria afecta a más de 30especies de plantas, de las cualesla papa, el tomate, la berenjena, eltabaco, el pimiento, el plátano y elmaní son los cultivos másafectados. La presencia delagente patógeno a nivel mundialse debe a su diseminación através del tubérculo-semilla coninfección latente. La marchitezbacteriana es el segundo factorlimitante más importante para laproducción de papa en lasregiones tropicales y subtropicalesdel mundo. La cuarentena, medidanecesaria para evitar el ingreso dela enfermedad a las áreas noinfectadas limita la producción desemilla de papa y lacomercialización de papa paraconsumo entre los países asicomo entre regiones infectadas yno infectadas dentro de un mismopaís. La limitada disponibilidad desemilla de alta calidad y la falta deconocimiento de los agricultoresde las prácticas agronómicasadecuadas, amenazan la

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DISTRIBUCION MUNDIAL DERalstonia solanacearum DE LA PAPA

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PROSPECCION Y DIAGNOSTICO

sostenibilidad del cultivo de papaen el mundo en desarrollo. Laincidencia de la MB sólo puedereducirse si se combinan diversoscomponentes de control. Estoincluye principalmente el uso desemilla sana en suelo libre delpatógeno, variedades resistentes,rotación con cultivos nohospedantes y la aplicación dediversas prácticas agrícolas desaneamiento. Un buen manejointegrado de esta enfermedadpuede conducir a la reducciónsignificativa e incluso a laerradicación de la marchitezbacteriana.

DISTRIBUCION MUNDIAL DER. solanacearum DE LA PAPALa marchitez bacteriana se hadiseminado a la mayoría de paísesproductores de papa. Estaenfermedad se encuentraafectando en todo el centro y surde África, y constituye una gravelimitación para la producción enUganda, Etiopía, Kenia, Madagas-car, Ruanda, Burundi, Nigeria yCamerún. Aunque no es unaenfermedad grave en Egipto, lainfección latente de los tubérculosha provocado la disminución delas exportaciones de papa haciaEuropa. En el sur de Asia, la MBafecta a los cultivos ubicados aaltitudes moderadas de losHimalayas en Pakistán, Nepal y

Bután; también a altitudesmoderadas y planicies de la India,donde está siendo eficazmentecontrolada. En Indonesia,Filipinas, Vietnam del Sur, Laos,Japón y sur de China, ubicados enel oriente y sudeste de Asia, la MBconstituye una enfermedadsevera. A comienzos de los añosnoventa, la MB se convirtió en unagrave amenaza para la producciónde papa en los países europeos,incluyendo a Bélgica, Inglaterra,Francia, Países Bajos, España,Italia y Portugal. Se ha encontradotambién en Rusia. En Suecia hubouna incidencia de MB pero selogró erradicar. En América Latina,se ha reportado la existencia deesta enfermedad en todos lospaíses productores de papa conexcepción de Ecuador. Supresencia en Australia y en elsudeste de los Estados Unidos haestimulado las investigacionessobre la enfermedad en estospaises.

PROSPECCION YDIAGNOSTICOLa inspección de los campos depapa es de gran importancia paralos esquemas de certificación desemilla. De esta manera seidentifican las áreas infectadasdonde los servicios nacionales deprotección de cultivos daran lasmedidas necesarias sobre el

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Síntomas en tubérculos

Marchitez unilateral

Marchitez total

Exudado bacteriano en los ojosdel tubérculo

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Síntomas en el follaje

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Exudado bacteriano del anillo vascular

control y la cuarentena. Asimismo,el diagnóstico precoz de laenfermedad permite que losagricultores puedan definir unaadecuada estrategia de manejo.El diagnóstico en los camposinfestados con MB se puederealizar mediante la identificaciónde los síntomas en el follaje ytubérculos durante el períodovegetativo o durante la cosecha.

Síntomas en el follaje

Marchitez unilateral y total de laplanta de papaEl síntoma característico de laenfermedad es la marchitez, y aveces un ligero amarillamiento. Lamarchitez puede iniciarse en unsolo lado de la hoja, tallo o planta.Otro de los síntomas consiste enun oscurecimiento de los hacesvasculares que se puede observarexternamente o al hacer un cortetransversal del tallo. Si eldesarrollo de la enfermedad esrápido, toda la planta se marchitasin mostrar amarillamiento. O eltallo enfermo puede marchitarse

completamente y secarse,mientras que el resto de la plantapermanece aparentemente sano.

Síntomas en el tubérculo

Exudado bacteriano en los ojosdel tubérculoCuando la infección es grave lossíntomas externos en el tubérculoson visibles durante la cosechaformando un exudado bacterianoque se concentra en los ojos deltubérculo o al extremo delestolón, ocasionando que la tierrase adhiera a las secreciones.

Exudado bacteriano del anillovascularEl síntoma del tubérculo sedescribe por lo general comopudrición parda. Un corte transver-sal en el tubérculo muestra unacoloración marrón del anillo vascu-lar y si se presiona ligeramente,exuda un mucílago lechoso.

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Prueba deKOH

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Diagnóstico en campo

Prueba del flujo vascular

También puede ocurrir que laexudación sea en forma naturalsin necesidad de ejercer presión.

Necrosis por infecciónsecundariaEl anillo vascular o el tubérculoentero se pueden desintegrarcompletamente en las etapas másavanzadas de desarrollo de lanecrosis. Esto a menudo incluyeuna infección secundaria conbacterias saprofíticas (Erwiniaspp., Clostridium sp.) u hongos(Fusarium sp., Pythium sp.).

Diagnóstico en campo

Prueba del flujo vascularEs necesario efectuar una pruebade diagnóstico ya que la marchitezde la planta causada por la bacte-ria Ralstonia solanacearum puedeconfundirse con los síntomasinducidos por otros agentespatógenos como Fusariumeumartii, Verticillium sp., Erwiniachrysanthemi, por dañosmecánicos o por los causados porinsectos en la base del tallo. Eldiagnóstico en el campo se puede

realizar fácilmente: se corta unpedazo de 2-3 cm de largo de labase del tallo y se coloca en agualimpia en un recipiente de vidrio.Se puede sujetar el tallo con unclip abierto para mantener suposición vertical. En pocosminutos se observarán filamentosfinos y lechosos que emanan deltallo cortado. Este exudadolechoso del tallo refleja lapresencia de R. solanacearum enel sistema vascular.

Prueba de KOHLos síntomas de la pudriciónparda en los tubérculos se puedenconfundir con los de la pudriciónanular causada por Clavibactermichiganensis subsp. sepedonicus(antes llamada Corynebacteriumsepedonicum). Se puede realizaruna prueba diferencial y rápidadirectamente con el exudadobacteriano del tubérculo paradiferenciar ambas bacterias. Secolocan dos gotas de hidróxido depotasio (KOH) al 3% en elexudado y se mezclan con unaansa o un mondadientes demadera durante 10 segundos. Laformación de un hilo lechoso allevantar el mondadientes indica lapresencia de R. solanacearum(bacteria Gramnegativa). En elcaso de C. michiganensis subsp.sepedonicus (bacteriaGrampositiva), no se forma el hilo.

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Necrosis por infección secundaria

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Diferenciación de R. solanacearumen biovares

PRUEBASBIOQUIMICAS

- - + + +- - + + -

Oxidación de :

• manitol

• sorbitol, dulcitol

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BIOVARES

- + + - +Utilización de :

• lactosa, maltosa y celobiosa

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Aislamiento de Ralstonia solanacearumen medio Kelman modificado

Prueba depatogenicidad

Papa

Tomate

Identificación en laboratorio

Aislamiento deR. solanacearum en medioKelman modificadoEl agente causal de la MB puedeser aislado de tubérculos o tallosinfectados sembrando el exudadobacteriano del tubérculo o dosgotas de la suspensión obtenidaen la prueba del flujo vascular enmedio Kelman modificado (TZCcon solo 2.5 g de dextrosa).Después de 48 h de incubación a30°C, las colonias fluidas yligeramente rojizas de R.solanacearum se distinguenfácilmente de otras bacteriassaprofíticas (colonias redondeadasy de color rojo oscuro).

Prueba de patogenicidadPara confirmar la patogenicidadde R. solanacearum se inoculanplantas de tomate o de papa conun cultivo purificado en medioKelman. Se inoculan los tallos de

plántulas jóvenes de papa o detomate inyectando 20 µl (o seauna gota) de una suspensiónbacteriana de R. solanacearum a108 ufc/ml con una jeringa depropileno de un milímetro y conuna aguja hipodérmica. Otrométodo de inoculación consiste eninsertar un mondadientes conbacterias crecidas en medioKelman en la axila de la tercerahoja . Las condiciones deinvernadero que favorecen eldesarrollo de la enfermedad son28±4º C, H.R. de 80-90%, y luznatural. Las plantas se riegannormalmente hasta un día antesde la inoculación. Si el aislamientoes un variante patogénico de R.solanacearum, la marchitez de lasplántulas de tomate o de papa sepuede iniciar en menos de unasemana o, en todo caso, en cuatrosemanas. Una vez que aparecenlos síntomas, se puede realizar laprueba del flujo vascular y aislarnuevamente el agente patógenosegún el procedimientoanteriormente descrito.

Diferenciación deR. solanacearum en biovaresExisten dos sistemas declasificación para R.solanacearum: el sistema de razasy el sistema de biovares. Elsistema de biovares consiste en

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Identificación en laboratorio

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Determinación de biovares

Equivalencias entre Razas y Biovaresen Ralstonia solanacearum

Biovares Distrib. geográfica

11 1, 3, 41, 3, 4SolanáceasSolanáceas

y y otrosotros

Zonas bajas Zonas bajas dede

los trópicoslos trópicos

2 1, 3Musáceas

= MokoAmérica y Asia

tropical

33 2A2A PapaPapaTomateTomate

Zonas fríasZonas frías

Noconocida

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Principalmente en zonas

bajas de sudamérica

4

2T Numerosos

China

HospedantesRazas

Morera

pruebas bioquímicas basadas enla capacidad de la bacteria parautilizar tres disacáridos y/u oxidartres alcoholes de hexosa. Laclasificación de biovar se basa en:Bv 1 = reacción negativa para lautilización de los disacáridos y laoxidación de los alcoholes;Bv 2 = positivo para la utilizaciónde los disacáridos, negativo parala oxidación de los alcoholes;Bv 3 = positivo para la utilizaciónde los disacáridos y la oxidaciónde los alcoholes;Bv 4 = negativo para la utilizaciónde los disacáridos, positivo para laoxidación de los alcoholes;Bv 5 = positivo para la utilizaciónde los disacáridos, positivosolamente para la oxidación delmanitol.

Determinación de biovaresTodas estas pruebas bioquímicasse pueden realizar juntas enplacas de microtitulación. El usode disacáridos o la oxidación delalcohol producen la acidificacióndel medio, expresada por elcambio de color del medio deverde (pH neutro) a amarillo (pHácido).

Equivalencia entre raza y biovaren R. solanacearumEl sistema de razas se basa en lagama de hospedantes encondiciones de campo. Se puedendistinguir cuatro razas:• La raza 1 afecta a una amplia

gama de solanáceas queincluyen a la papa y variasmalezas. Algunos variantespueden afectar al maní, eljengibre y al plátano diploide.Es común en las regionesbajas así como en los trópicosy subtrópicos.

• La raza 2 afecta a las plantasde la familia Musaceae, comoel plátano triploide, platanillo yHeliconia spp. en los trópicos.

• La raza 3 afectaprincipalmente a la papa yocasionalmente al tomate yotros cultivos y malezassolanáceas. Es común enzonas o latitudes mayores(climas fríos).

• La raza 4 afecta a la morera ysólo se presenta en la China.

Existe una equivalencia entre razay biovar: la raza 3 coincide con elbiovar 2A. La raza 1 coincide conlos biovares 1, 3 y 4; el biovar 1siendo el más común en papa. Nose ha establecido ninguna razapara el biovar 2T, el cual seencuentra principalmente en las

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CONTROL

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CICLO DE LA MARCHITEZ BACTERIANACICLO DE LA MARCHITEZ BACTERIANACICLO DE LA MARCHITEZ BACTERIANA

SueloinfestadoPlantas y tubérculos

de papa enfermos

Suelo

Restos decosecha

Cultivos y malezashospedantes

Agua deriego

Tubérculosemilla

Suelo enherramientas

y zapatos

Nematodose insectosen el suelo

bacterianaMarchitez

de la papa

Plantas voluntarias

tierras bajas de la cuencaamazónica. Tiene numerososvariantes con una amplia gama dehospedantes al igual que la raza1; sin embargo, los variantes delbiovar 2T son menos agresivas.

CICLO DE LA MARCHITEZBACTERIANAPapas infectadas (tubérculos-semilla, restos de cosecha oplantas infectadas), o suelosinfestados, o ambos, constituyenlas principales fuentes de inóculo.El patógeno puede sobrevivir en elsuelo (principalmente en losdesechos de planta) y en elsistema radicular y la rizósfera demuchos hospedantes (malezas,otros cultivos hospedantes, papasvoluntarias, etc.). R. solanacearumse disemina principalmente por elmovimiento de tubérculos-semillainfectados. Otros factores quecontribuyen a la diseminación dela enfermedad son el agua deriego contaminada y el sueloinfestado que se adhiere a loszapatos y herramientas de losagricultores. Las heridasproducidas por las herramientasdurante el cultivo después de laemergencia de la planta, así comolas producidas por los nematodose insectos del suelo contribuyen alingreso de la bacteria en las raícesde la papa.

CONTROL

Manejo integrado de lamarchitez bacterianaEl uso de semilla sana y lasiembra en suelos libres delpatógeno son los principalescomponentes para controlar yerradicar la marchitez bacteriana.Sin embargo, muchos son losfactores adicionales que influyenen la incidencia de la bacteriatales como las condicionesambientales (la temperatura y lahumedad del suelo), la rotacióncon plantas no hospedantes, eluso de variedades menossusceptibles y de prácticasculturales (saneamiento y controlde nematodos). Por lo tanto, sólouna estrategia de control integradopuede tener éxito para reducir laincidencia de la MB, e inclusoerradicarla. Esta estrategia esespecífica para cada lugar. De losfactores de control existentes ydisponibles, se deben seleccionarlos que son factibles, apropiados y

�� Sanidad del cultivoSanidad del cultivo

•• Rotación Rotación•• Control de Control de nematodosnematodos

COMPONENTESCOMPONENTESSemilla infectadaSemilla infectada Suelo infestadoSuelo infestado

Manejo integrado Manejo integrado de la de la MarchitezMarchitezBacterianaBacteriana

�� Semilla sanaSemilla sana

•• Variedad resistente Variedad resistente

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Sembrar en suelos libres deR. solanacearum

Resistente

Susceptible

Resistencia

eficaces para una determinadalocalidad (ver la diapositiva No 47).Además, se deben tener encuenta los factores sociales yeconómicos que influyen en lasdecisiones de los agricultoresdentro del esquema de manejo.

Uso de semilla sanaLos tubérculos-semilla infectadosconstituyen el medio principal parala diseminación de R.solanacearum (en particular paralos variantes de la raza 3). Enclimas fríos por encima de los2500 m, las plantas infectadaspueden no mostrar sintomas, sinembrago pueden albergar a labacteria y transmitirla a lostubérculos en los cuales semantienen en forma latente,produciendo severos brotes de laenfermedad, cuando estostubérculos se siembran en lugarescálidos. En los procesos decertificación de semillas laincidencia de MB debe ser 0%.Para la producción de semillas,sólo se deben usar tubérculos-semilla libres de MB provenientesde áreas no infectadas. El materialde siembra usado en el programade multiplicación de semilla(tubérculos-semilla básicos y pre-básicos) debe ser sometido a unaprueba de detección de infección

latente para descartar la presenciade R. solanacearum. En las áreasendémicas, donde hay escasez detubérculos-semilla sanos, unaalternativa es el uso de semillasexual de papa (TPS) o esquejesprovenientes de micropropagaciónbajo condiciones controladas.

Sembrar en suelos libres de R.solanacearumSi un cultivo ha sido infectado conMB, se debe evitar la siembra depapa u otros cultivos hospedantespor lo menos durante dos años.Se puede efectuar una rotacióncon cereales o pastos paraeliminar el inóculo del suelo. Laduración de la rotación necesariapara eliminar el inóculo varía, yaque la supervivencia de R.solanacearum en el suelodepende de las condicionesambientales (temperatura,humedad) y de las característicasdel suelo (factores bióticos yabióticos). Algunos suelos sonsupresivos, en los cuales labacteria no sobrevive por periodoslargos, sin embargo, losmecanismos responsables de estainhibición son desconocidos.

Resistencia de la plantaLa siembra de variedadesresistentes es el medio másefectivo para controlar la MB. Sin

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Uso de semilla sana

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... y tubérculos podridos

Eliminación de malezas

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Eliminación de rastrojos

Saneamiento y prácticas culturales

embargo, aunque se haencontrado muchas variedades depapa que tienen cierto grado deresistencia, sin embargo,continúan transmitiendo lainfección latente a su progenie.Por lo tanto, el uso de variedadesmoderadamente resistentes debeser incluido en un programa desemilla que proporcionetubérculos-semilla libres de MB.La resistencia es específica paracada variante y no es efectivacuando las condicionesambiantales son mas favorables aldesarrollo de la MB (temperaturaelevada, alta humedad del suelo,heridas en las raíces y estolones,etc.). Un paso esencial en eldesarrollo de variedadesresistentes es la evaluación local.Las variedades que se siembranlocalmente deben ser estudiadaspara determinar su tolerancia a laMB ya que algunas variedades,sin que hayan sido mejoradaspara resistencia a la MB, sonmenos susceptibles a estaenfermedad (por ejemplo, var.Achat en Brasil, Cruza 148 enÁfrica oriental y Perú).

Saneamiento y prácticasculturalesEl saneamiento y las prácticas decultivo tienen como fin evitar olimitar la supervivencia y

diseminación del patógeno. Por logeneral, estas mismas medidas seusan para controlar otrasenfermedades y plagas de lapapa.

Eliminación de rastrojosDespués de la cosecha de uncultivo infectado con MB, se debeneliminar del campo los rastrojosde papa y quemarlos o enterrarlosen el fundo de las pendiantes,pero en lugares alejados de loscanales de riego.

Eliminación de los tubérculospodridosDespués de la cosecha, se debeeliminar los restos de cosecha ydestruirlos siguiendo elprocedimiento anteriormenteseñalado.

Eliminacion de malezasR. solanacearum sobrevive enciertas especies de malezas, porlo tanto, deben ser eliminadasantes de sembrar papa y cualquierotro cultivo incluido en la rotación.

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Otras prácticas culturales

. Labranza mínima después de la emergencia

. Inundación de campos (arroz)

. Exposición al sol de los suelos removidos

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Desinfestación deherramientas

Desinfestación de la maquinaria

Uso de agua nocontaminada

Eliminación de plantasvoluntarias de papaLa plantas voluntarias constituyenotro medio para la supervivenciade R. solanacearum por lo tantodeben ser eliminadas pocodespués de su emergencia.

Eliminación de plantasmarchitasSi la incidencia de MB es baja, lasplantas marchitas de papa debenser eliminadas del campo tanpronto como se observe suaparición para evitar quecontagien a las plantas sanas.Estas plantas deben sereliminadas cuidadosamente ydestruidas siguiendo el mismoprocedimiento que para losrastrojos de papa.

Desinfestación de herramientasPara prevenir el movimiento desuelo de un campo infestado a uncampo libre del patógeno, todaslas herramientas deben serdesinfestadas con agua ehipoclorito de calcio (o cualquierotro bactericida) o esterilizadascon fuego.

Desinfestación de la maquinariaLa maquinaria, los vehículos, loscascos de los animales usadospara la tracción y los zapatos delpersonal que provienen de uncampo infestado deben serlavados por lo menos con aguaantes de ingresar a otro campo.

Uso de agua no contaminadaSe debe evitar el flujo del agua deun campo infestado hacia loscampos vecinos. En las áreasinfestadas, es preferible usar elagua de pozo en vez de las aguasprovenientes de los ríos o canalesde irrigación.

Otras prácticas culturales• Se recomienda hacer un solo

aporque durante el períodovegetativo para evitar el dañoa las raices. También espreferible el deshierbo a mano.

• La inundación de camposespecialmente los de arroz(en los países asiáticos),reduce significativamente laspoblaciones de R.solanacearum en el suelo.

• En las áreas cálidas, el barbecho o la exposición al sol de los suelos removidos también reduce el nivel poblacional de la bacteria.

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Eliminación deplantas marchitas

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Eliminación de plantas voluntariasde papa

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42

Evitar cultivo de

Maní

Jengibre

Evitar otros cultivossolanáceas

BerenjenaAjí

Rotación conLiliáceas ybrasicáceas

Rotación con leguminosas

Rotación con cucurbitáceas

RotaciónLa rotación con plantas nohospedantes es una maneraefectiva para disminuir lapoblación de R. solanacearum enel suelo, siempre que las plantasvoluntarias sean continuamenteextraídas del campo a medida deque ellas emerjan.

Rotación con cerealesLa rotación con cereales y pastosdisminue rápidamente el potencialdel inóculo en el suelo. Sin em-bargo, el tiempo necesario para laerradicación deberia serdeterminado para cada localidad.

Rotación con liliáceas ybrasicáceasSe pueden sembrar cebolla, ajo,poro, coliflor y repollo después deque un campo de papa ha sidoinfectado con MB.

Rotación con leguminosasLas leguminosas (fabáceas) comofrejol, arveja y haba pueden serutilizadas como cultivo de rotaciónpara la papa. Además, tienen elbeneficio adicional de incrementarla fertilidad del suelo fijando elnitrógeno atmosférico. También la

asociación de frejol con maízreduce el potencial del inóculo enel suelo.

Rotación con cucurbitáceasLas cucurbitáceas (calabaza,pepino, zapallito italiano) no sonplantas hospedantes para R.solanacearum por lo que puedenser utilizadas para la rotación decultivos.

Evitar el cultivo del tomateSe debe evitar el cultivo deltomate ya que es altamentesusceptible a la MB causada portodos los variantes de R.solanacearum.

Evitar otros cultivos desolanáceasNo se debe sembrar berenjena,pimiento o tabaco después de queun campo de papa haya sidoinfestado con R. solanacearum .

Evitar el cultivo de jengibre ymaníNo se debe sembrar jengibre nimaní en un campo de papa en elque prevalezca la raza 1 de R.solanacearum (trópicos bajos).

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Rotacióncon cereales

Trigo

Maíz

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Rotación

Evitar el cultivo de tomate

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47

44

Cuarentena

DEFINICION DE UNA ESTRATEGIA DE CONTROL

Nematodo del nudo (Meloidogyne incognita)

Evitar transporte desemilla infectada a

zonas no contaminadas

Factores para formular una estrategia de control Raza 3 Raza 1

Tubérculos-semilla libres de R. solanacearumVariedades resistentesSuelo no infestado con R. solanacearumSuelo supresivoRotación con plantas no hospedantesEliminación de plantas marchitas Eliminación de plantas voluntariasControl de malezasEliminación de restos de cosechaUso de agua no contaminadaLabranza mínima post-emergenciaControl de nematodosDesinfestación de las herramientas , cascosde animales y zapatosExposición al sol de los suelos removidosInundación de campos (arroz)

747254423243

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727233223143

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Control de nematodosLos nematodos abren el caminopara que las bacterias ingresen ala planta a través de lesiones enlas raíces. Por consiguiente,deben controlarse para evitar suinteracción con R. solanacearum.La fumigación de los suelos, larotación con cereales, laaplicación de cantidades altas deenmiendas orgánicas (libres de R.solanacearum) y la siembra devariedades resistentes anematodos constituyen losprincipales componentes decontrol.

Síntomas causados por elnematodo del nudo de la raízEl nematodo más importante en lainteracción con MB es elnematodo del nudo de la raíz(Meloidogyne incognita), quepredomina principalmente enclimas cálidos y suelos arenosos.

CuarentenaUna vez que se haya detectado laenfermedad en un área, debe serdeclarada en cuarentena paraevitar la diseminación de la MBhacia zonas no infectadas. Lasmedidas cuarentenarias restringenla producción de semilla de papa yprohiben la comercialización depapa de consumo hacia los países

o regiones que no han sidoafectadas con MB. Esta situaciónafecta la economía de lasregiones en cuarentena.

Evitar el transporte detubérculos-semilla infectados azonas no contaminadasSe debe evitar el transporte detubérculos-semilla o papa deconsumo provenientes de áreasinfectadas para evitar ladiseminación de la enfermedad.Aunque muchas veces es difícilcontrolar la comercialización depapa, ésta es una de las mejoresmedidas disponibles deprevención.

DEFINICION DE UNAESTRATEGIA DE CONTROLSe han definido los componentesmás eficientes para el control de laMB. En base a esta información,en el siguiente cuadro seenumeran los principales factoresque se deben considerar para eldesarrollo de una estrategia parael control de la enfermedadcausada por las razas 1 ó 3. Cadafactor varía en una escala del 1 al7. Mientras más alto sea elnúmero para un determinadofactor, éste se considera másefectivo para el control de laenfermedad. El valor asignado

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Control de nematodos

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50

Detección en tubérculoscon infección latente

MaceraciónMaceración

Extracto Extracto dedetubérculotubérculoLavado Lavado yy

desinfeccióndesinfección Extracción delExtracción delanillo anillo vascularvascular

ENRIQUECIMIENTO =Incubación en caldo SMSA

a 30°C durante 48 h

COLOCACION DE LAS MUESTRAS EN LAMEMBRANA DE NITROCELULOSA (NCM)

PRUEBA SEROLOGICA:

ELISA-NCM

EXTRACCION DE LAS MUESTRAS

Esquema Esquema de de detección detección de de R. R. solanacearumsolanacearumen en tubérculos tubérculos con con infección latenteinfección latentemediante el mediante el kit ELISA-NCM kit ELISA-NCM del del CIPCIP

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METODOS DE DETECCION

para cada factor puede cambiarsegún la importancia del factordado en cada localidad. La sumade valores debe alcanzar por lomenos 14 para esegurar un buencontrol o la erradicación de la MB.

Detección en tubérculos coninfección latenteEl método clásico para detectaruna infección del tubérculoconsiste en incubarlo durante 3 a4 semanas a 30°C, y observar siexiste o no exudado en los ojos ocortar el tubérculotransversalmente para observar lapresencia de exudado en el anillovascular. Sin embargo, estemétodo toma mucho tiempo yespacio y puede que no detectelas infecciones leves. Por estarazón, el CIP ha desarrollado unatécnica simple, sensible, rápida yeconómica para detectar lainfección latente en el tubérculo:ELISA-NCM (pruebainmunoenzimática en la mem-brana de nitrocelulosa). El kit seestá distribuyendo a losprogramas de semilla en todo elmundo.

Esquema de detección deR. solanacearum en tubérculoscon infección latenteLos principales pasos para ladetección de R. solanacearum entubérculos con infección latenteson:1) Preparación de los extractos a

partir del tejido del anillovascular de los tubérculos;

2) Proceso de enriquecimiento:incubación de los extractos de

Factores para formular una estrategia de control Raza 3 Raza 1

Tubérculos-semilla libres de R. solanacearum 7 7Variedades resistentes 4 2Suelo no infestado con R. solanacearum 7 7Suelo supresivo 2 2Rotación con plantas no hospedantes 5 3Eliminación de plantas marchitas 4 3Eliminación de plantas voluntarias 4 2Control de malezas 2 2Eliminación de restos de cosecha 3 3Uso de agua no contaminada 2 1Labranza mínima post-emergencia 4 4Control de nematodos 3 3Disinfestación de las herramientas, cascos deanimales y zapatos 2 1Exposición al sol de los suelos removidos 1 3Inundación de campos (arroz) 1 3

METODOS DE DETECCION

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53

Extracto de tubérculoinoculado y enriquecido

Rs en solución tampónde citrato (tiras de control)

10 8

10 6

10 5

10 7

+ Eufc / mlufc / ml

106

104

103

101

105

0.1

102

- E

Control negativo:TE (-E)

Control negativo: TE (+E)

TE (-E): TE (-E): ExtractoExtracto de de tubérculo sano tubérculo sano (control (control negativonegativo ))TE (+E): TE (+E): Extracto Extracto de de tubérculo sano mezclado tubérculo sano mezclado com SMSA y com SMSA y enriquecido durante enriquecido durante 48 48 horas horas (control (control negativonegativo ))

Sensibilidad de ELISA-NCMsin (-E) y con (+E) enriquecimiento

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PRUEBAELISA-NCM Bloqueo

Anticuerpo policlonal de conejo

Desarrollo de la coloración

Anticuerpo de cabra conjugado

Lavados

Lavados

Colocación de las muestras en la membrana

Antígeno

Anticuerpos policlonalesde conejo

Anticuerpos de cabraanti-conejo conjugadoscon fosfatasa alcalina

Proteína (caseína) debloqueo

Sustrato enzimático

Membrana denitrocelulosa

los tubérculos durante 48 h a30°C en un caldo semi-selectivo (SMSA); y

3) Colocación (dot-blotting) de las muestras enriquecidas sobre la membrana de nitrocelulosa (NCM) y prueba serológica (ELISA).

Detección de la infecciónlatente en semilla de papaEl número mínimo de muestrasque se necesita es de 250tubérculos por hectárea (muestreoa la cosecha o en el almacén)para ser analizarlas en 10 sub-muestras de 25 tubérculos. Lostejidos del anillo vascular sacadosde cada uno de los 25 tubérculosse maceran en una bolsa indi-vidual después de añadir elvolumen del tampón de extraccióncorrespondiente al doble del pesode los tejidos. Para cada sub-muestra, se mezcla 0.5 ml (500 µl)de extracto de los tubérculos conel mismo volumen del caldo SMSAen un tubo Eppendorf y se incubadurante 48h a 30ºC agitándolo dosveces al día. Por cada extractoenriquecido se colocan dosmuestras sobre la membrana.

Prueba ELISA-NCMELISA-NCM es un ensayoinmunoenzimático. Utiliza unamembrana de nitrocelulosa en

lugar de una placa demicrotitulación como soporte paralas muestras y reactivos. Laprueba consiste en:1. Colocar una pequeña cantidad

del extracto de los tubérculos(20 µl) sobre una membrana denitrocelulosa con unamicropipetta (dot-blotting);

2. Bloquear con caseína de lecheel área de la membrana dondeno están colocadas lasmuestras (1 hora deincubación);

3. Añadir los anticuerpos deconejo específicos de R.solanacearum (2 horas deincubación);

4. Añadir los anticuerpos decabra anti-conejo conjugadoscon fosfatasa alcalina (1 h deincubación); y

5. Añadir el sustrato que reacciona con la enzima y produce una reacción de coloración (de 5 a 20 minutos).

Sensibilidad de la pruebaELISA-NCM sin y conenriquecimientoUna coloración morada revela lapresencia de R. solanacearum enlas muestras (todos los variantespueden ser detectados con losanticuerpos policlonales). Laintensidad de la coloración esproporcional a la concentración debacterias. Después del

51

Incubar a 30°C durante 48 hAgitar dos veces al día

Colocar las muestras en lamembrana por duplicado

Extraer de cada tubérculo, fra gmentos delanillo vascular (< 0.5 g por tubérculo )

Número de muestra = 250 tubérculos/hapara ser analizados en

10 sub-muestras de 25 tubérculos

. . . . . .

Macerar

500 µlextracto

Agitar

500 µlSMSA

1 2

500 µlextracto

500 µlSMSA

Macerar

500 µlextracto

Agitar

500 µlSMSA

9 10

500 µlextracto

500 µlSMSA

Colocar los fra gmentos extraídos de 25 tubérculosen una bolsa, pesarlos, y adicionar 2 ml de la solucióntampón de extracción por gramo de te jido

DETECCION DE INFECCION LATENTEDETECCION DE INFECCION LATENTEEN SEMILLA DE PAPAEN SEMILLA DE PAPA

28 29

55Detección de R. solanacearum en suelo

con ELISA-DAS después del enriquecimiento

SensibilidadSensibilidad de ELISA- de ELISA-DAS DAS sin sin enriquecimientoenriquecimiento (-E) y con (+E) (-E) y con (+E)

108

107

20

102

106

105

104

103

Rs en tampóncitrato

Rs en extracto de suelo

Extracto de suelono infestado

- E + E

108

107

106

105

Tampóncitrato

Controlesnegativos:

- E + E

ufc / mlufc / ml

enriquecimiento (o sea lamultiplicación de la población debacterias en el extracto), se puedellegar a detectar hasta un mínimode 10 bacterias por ml del extractode los tubérculos (células/ml),mientras que se necesitan 107 ómás células/ml si no se realiza elenriquecimiento antes de llevar acabo el ensayo inmunoenzimático.Por lo tanto, el enriquecimientoaumenta la sensibilidad de laprueba serológica un millón deveces, permitiendo la detección deR. solanacearum en tubérculos depapa (o tallos) que estáninfectados en forma latente, esdecir con niveles de infección muybajos que no producen ningúnsíntoma visible.

Detección de R. solanacearumen el suelo

Bioensayo con tomateDebido a la alta susceptibilidad deltomate a la MB a temperaturasaltas, el ensayo biológico deltomate es la prueba más fácil paraevaluar la infestación del suelocon R. solanacearum. Sin em-bargo, necesita espacio en elinvernadero y toma tiempo, puessólo la observación del desarrollode los síntomas puede demorarhasta seis semanas. También sepuede realizar en el camposembrando surcos de tomate y

observando el desarrollo de la MB.Para las pruebas en elinvernadero, se colocan 2 kg detierra en una bandeja de plástico yse trasplantan 50 plántulas detomate de dos semanas(alrededor de 10 cm de altura).Para cada muestra de tierra, setrasplantan 100 plántulas (en dosbandejas), y se riegannormalmente. Desde los 7 díashasta los 45 días se registra elporcentaje de plantas marchitasdos veces a la semana. La pruebadel flujo vascular y KOH confirmaque la marchitez ha sido causadapor R. solanacearum y no porotros patógenos de suelo comoPythium sp., Verticillium sp. yClavibacter michiganensis subsp.sepedonicus.

Detección de R. solanacearumen suelo con ELISA-DASdespués del enriquecimientoEn el CIP, se ha desarrolado un kitpara detectar niveles bajos depoblación de R. solanacearum. Elmétodo se basa en la preparaciónsencilla de los extractos de suelomezclando 10 g de suelo con 90ml de la solución tampón PBS.Después de una agitaciónconstante durante 30 minutos, sedeja que la solución decante porun minuto y se retira 2 ml delsobrenadante, el cual se mezclaen un frasco estéril conteniendo

28 29

54

Detección de R. solanacearum en suelo

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METODOS DE EVALUACIONDE LA RESISTENCIA A MB

Evaluación encampo

Inoculación eninvernadero

38 ml de caldo SMSAcomplementado con caldo depapa e incubado durante 48 h a30°C con agitación (proceso deenriquecimiento). Los extractosenriquecidos se analizan en un“Dobble-antibody sandwich”(DAS-ELISA) en placas demicrotitulación. Se puede detectarhasta un mínimo de 20 bacteriaspor gramo de suelo. Para unasemi-cuantificación de laspoblaciones, los extractos delsuelo pueden diluirse antes de suenriquecimiento.

Prueba ELISA-DASEl “Double-antibody sandwich”(DAS-ELISA) es un ensayoinmunoenzimático que se realizaen placas de microtitulación.Consiste en los cuatro pasossiguientes:1) Cubrir los hoyos de la placa de

microtitulación coninmunoglobulinas (IgG) deconejo específicos de R.solanacearum (3 h deincubación);

2) Colocar las muestras en loshoyos (incubación toda lanoche);

3) Colocar las IgG de conejoespecíficos de R.solanacearum y conjugadascon fosfatasa alcalina (3 h deincubación);

4) Desarrollar la reacción de coloración añadiendo el sustrato de la enzima (1 h).

METODOS DE EVALUACION DELA RESISTENCIA A MBEvaluación en campoLa evaluación de la resistencia dela papa a la MB requiere de uncampo con un nivel moderado yrazonablemente uniforme deinfestación (entre 30 y 50% deincidencia de marchitez en elcultivo anterior de papa). Se debeidentificar la raza/biovar de losvariantes presentes en el campo(las razas 1 y 3 pueden estarpresentes juntas). El diseño dellote debe seleccionarse según elnúmero de tubérculos por clon quese va a analizar y la uniformidadde la diseminación del inóculo enel campo pero con por lo menos20 tubérculos por genotipo (en 4repeticiones de 5 tubérculos).Durante el periodo vegetativo,seregistra el número de plantasmarchitas una vez por semana apartir de los 40 hasta los 80 díasdespués de la emergencia. Du-rante la cosecha, también seregistra la infección visible de lostubérculos (e infección latente sino se ha producido marchitezdurante el periodo vegetativo) y elrendimiento de los tubérculos contamaño comercial.

30 31

56

PRUEBAELISA-DAS

Colocación de las IgG de conejo

Antigen

Placas demicrotitulación

Antígeno (muestra)

Inmunoglobulina (IgG)de conejo específica delantígeno

Sustrato enzimático

Colocación de las muestras

Colocación de las IgGde conejo conjugadas

Lavados

Lavados

Lavados

Desarrollo de la coloración

Inmunoglobulina (IgG)de conejo específica delantígeno y conjugada confosfatasa alcalina

Inoculación en invernaderoLos esquejes apicales de lasplantas de papa o los esquejes delos tubérculos brotados sesiembran en macetas pequeñasconteniendo un sustrato adecuado(por ejemplo una mezcla de suelo,muzgo y arena a la proporción2:1:1). Sin embargo, los mejoresresultados se han obtenidousando el sustrato Promix BX®

(Premiers Brands, INC, Stamford,Canadá). A la siembra se debeaplicar un fertilizante completo (N-P-K 20-20-20 diluido al 0.5% enagua). Cuando las plantasalcanzan aproximadamente 15cms de altura se llevan alinvernadero un día antes de lainoculación. Las condiciones delinvernadero que favorecen eldesarrollo de la enfermedad son28±4º C, y 85-90% H.R. Lasplantas se riegan diariamente,excepto un día antes de lainoculación. Cada maceta,conteniendo una planta se inoculacon 25 ml de suspensiónbacteriana de R. solanacearum a108 células/ml. Se inoculan 20plantas por genotipo. Las plantasse incuban durante 30 días y losíndices de la enfermedad seregistran cada semana en base ala siguiente escala:

• 1 = planta sin síntomas;• 2 = planta una hoja marchita;• 3 = planta con hasta el 50% de marchitez;

REFERENCIAS

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• 4 = planta con hasta el 75%de marchitez;

• 5 = planta completamentemarchita.

Los cultivares Cruza 148(resistente a la marchitez pero quearbora infección latente en tallo ytubérculos), Molinera (tolerante),Revolución e Yungay(susceptibles) se usan comotestigos en el CIP de Lima. Comomínimo se debe usar la variedadCruza 148 como testigo menossusceptible, junto con unavariedad local susceptible.

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