Controllo della crescita microbica

I microrganismi sono praticamente ubiquitari . In un laboratorio possono contaminare:

- aria

- superfici e strumenti

- operatori

Sia che si lavori con colture pure, sia che si lavori con materiale contaminato da associazioni più o meno complesse di microrganismi è necessario evitare che il materiale sperimentale sia contaminato dai microrganismi presenti nell’ambiente.

Per evitare la contaminazione è necessario :

• prevenire per quanto possibile la contaminazione con microrganismi presenti nell’aria, o sulle superfici del laboratorio o sul corpo dell’operatore

• utilizzare substrati sterili

• utilizzare attrezzi sterili

In microbiologia è molto importante tenere sotto controllo la

Crescita microbica

Tale sorveglianza può avvenire attraverso un processo di

inibizione

Oppure attraverso un processo di distruzione dei microrganismi detto

sterilizzazione

Metodi fisici per il controllo della crescita microbica

1. Calore

2. Radiazioni

2. filtrazione

Scopo dell’esercitazione

Descrivere le principali attrezzature e strumenti presenti in un laboratorio di microbiologia:

• le precauzioni di asepsi

• strumenti e tecniche per la sterilizzazione

STERILIZZAZIONE

Per sterilizzazione si intende quella procedura che permette di liberare un oggetto da tutte le forme viventi che vivono sulla sua superficie o al suo interno.

Il termine ha un valore assoluto, nel senso che non esistono sostanze o oggetti poco o quasi sterili, ma solo sterili o non sterili.

La sterilizzazione può essere ottenuta:• con metodi fisici

• calore• secco• umido

• radiazioni•UV•raggi gamma•filtrazione

• con metodi chimici• ossido di etileneLa scelta del metodo di sterilizzazione dipende dal

materiale da trattare

TECNICHE DI STERILIZZAZIONE

Sterilizzazione mediante calore

Per tutti i microrganismi esiste una temperatura massima di crescita oltre la quale muoiono

A temperature elevate le macromolecole perdono struttura e funzionalità per un processo chiamato

Denaturazione

Effetto della temp sulla vitalità di un batterio mesofilo: il 10% delle cellule rimarrà vivo dopo 3 minuti a 70°, 12 min a 60°, 42 min a 50°

Questo concetto di tempo necessario per poter distruggere dei microrganismi è fondamentale per la sterilizzazione

Infatti il tempo di sterilizzazione sarà più lungo a temperatureinferiori e più breve a temperature maggiori

Una sterilizzazione efficace sarà considerata tale solo se temperatura e tempo saranno ottimali

Altro concetto importante è il tipo di calore utilizzato che puòessere secco o umido

Il calore umido è sicuramente il più efficace in quanto ha un potere di penetrazione maggiore del calore secco e

permette di ottenere a parità di temperature e temp o una riduzione più rapida del numero dei microrganismi vitali

Il parametro utilizzato per caratterizzare la sterilizzazione mediante calore è il

Tempo di riduzione decimale D : tempo necessario per ridurre di dieci volte, a una data temperatura la densità di popolazione

a. Organismo mesofilo, sono necessari 20 sec a 110 °C,

b. per un termofilo servono 10 min alla stessa temperatura

Il tempo di riduzione decimale non è però facile da determinare per cui si preferisce utilizzare il concetto di

Tempo di inattivazione termica : tempo necessario per uccidere tutte le cellule di una popolazione ad una data temperatura

Il tempo di inattivazione termica viene determinato sottoponendo ad una fonte di calore popolazioni microbiche diverse

Inoltre dipende anche dalla grandezza della popolazionemicrobica

> è la popolazione maggiore dovrà essere il tempo e viceversa

Strumenti utilizzati per la sterilizzazione mediante calore

1. Autoclave (calore umido)

2. Pentola di Kock (calore umido)

3. Stufa di Pasteur (calore secco)

1. Autoclave : è una camera chiusa ermeticamente che permette l’immissione di vapore saturo sotto pressione

La normale procedura prevede il riscaldamento a una pressione di 1,1 Kg/cm2 che permette una temperatura di 121 °C

Questa è la temperatura che permette di raggiungere la sterilizzazione in 10-15 minuti

Concetto fondamentale : non è la pressione a provocare la morte dei microrganismi ma

l’elevata temperatura che può essere raggiunta in condizione di vapore a una pressione

superiore a quella atmosferica

Ciclo di sterilizzazione : la temperatura dell’oggetto sterilizzato aumenta più lentamente della temperatura

dell’autoclave

manometrotermometro

cestello

coperchio

Tipica autoclave da laboratorio

2. Pentola di Kock (calore umido)

Funziona come una pentola con acqua calda, quindi la temperatura non supera mai i 100 °C

Si usa per composti termolabili che non possono essere scaldati a temperaure superiori ai 100 °C

Sterilizzazione frazionata o tyndalizzazione :

In presenza di ingredienti termolabili si può ricorrere alla sterilizzazione frazionata, che consiste in un trattamento al calore del materiale termosensibile con vapore fluente (100°C) per 30’ e per 3 giorni consecutivi (pentola di Koch). Le endospore non vengono uccise a 100° e trovandosi in ambiente favorevole, immediatamente dopo il raffreddamento del mezzo cominciano a germinare, ciò rende le cellule più suscettibili al calore nel trattamento del giorno successivo.

3. Stufa di Pasteur (calore secco)

Viene utilizzata quando è indesiderabile che il vapore in pressione giunga a contatto con il materiale che stiamo utilizzando

Viene normalmente utilizzata per vetreria e strumenti in metallo

Temperatura 150 °C per 2-4 ore

Differenze fra i diversi metodi di sterilizzazione mediante calore

•Calore umido: Coagulazione delle proteine; le forme sporali vengono distrutte in minuti

•Calore secco: ossidazione dei costituenti chimici; forme sporali distrutte in ore

•calore secco (per vetreria, strumenti in metallo): in stufa a circolazione d’aria, con il materiale avvolto in fogli di alluminio, carta speciale o in contenitori: 150°C, 90 min o 180°C, 60 min .

• calore umido (per substrati, vetreria, materiali in plastica): in autoclavi verticali o orizzontali: 121,1°C (1 atmdi sovrappressione) per 15-20 min .

Pastorizzazione

È un processo che riduce la popolazione microbica di alimenti che non possono essere trattati ad alte temperature. Prende il nome da Louis Pasteur

I termini sterilizzazione e pastorizzazione non sono sinonimi in quanto con la seconda non si ha la totale distruzione dei microrganismi a causa delle temperature più basse

Con la pastorizzazione si eliminano solo i microrga nismi patogeni

La pastorizzazione del latte avviene facendo passare i latte stesso attraverso uno scambiatore di calore

a. Pastorizzazione istantanea: 71°C per 15 sec

b. Pastorizzazione di massa: 65°C per 30 min

Sterilizzazione mediante radiazioni

Le radiazioni elettromagnetiche sono una via efficace per il controllo della crescita microbica

Si conoscono:

1. Raggi UV

2. Raggi X

3. Raggi γ

Le radiazioni agiscono sull’organismo con il quale vengono a contatto rompendone il DNA, e portando così l’organismo stesso alla sua morte

STERILIZZAZIONE MEDIANTE LE RADIAZIONI

Vengono utilizzate:

•Radiazioni ionizzanti- raggi γ, i raggi X emessi da materiale radioattivo posseggono una tale energia da determinare l’allontanamento di elettroni da molecole organiche. Efficaci sterilizzanti, utilizzati per materiale plastico termolabile. Necessarie opportune precauzioni.

•Radiazioni UV: effetto germicida dovuto alla capacità del DNA di assorbire a 260-280 nm. Utilizzati per sterilizzare l’aria in ambienti confinati. In realtà è disinfettante in quanto alcune spore resistono agli UV. Inoltre potere di penetrazione modesto, non passano attraverso il vetro, la plastica, le soluzioni dense.

Sterilizzazione per filtrazione

La sterilizzazione per filtrazione è un metodo molto efficace per sterilizzare liquidi che sono sensibili al calore

I filtri sono sostanze con pori troppo piccoli per il passaggio dei microrganismi, ma abbastanza larghi per il passaggio di liquidi e gas

Le dimensioni dei pori per evitare il passaggio dei M.O. non devono essere superiori a 10 µm ne inferiori a 0,2 µm

Tipi di filtri

1. Filtri a spessore: costruiti con strati fibrosi di carta, lana di vetro, amianto. Le particelle rimangono intrappolate nei pori tortuosi che si creano. Vengono utilizzati come pre-filtri

2. Membrane filtranti: sono i tipi di filtri più comunemente utilizzati in microbiologia, sono costituite da dischetti di acetato o nitrato di cellulosa. Sono costruite in modo che le dimensioni dei pori siano ridottissime. La loro funzione è simile ad un setaccio

3. Filtri tipo Nucleopore: utilizzati in microscopia a scansione per la facilità con la quale il microrganismo può essere rimosso. Si ottengono trattando un sottile strato di policarbonato con radiazioni nucleari e poi con un composto chimico corrosivo. Il diametro dei pori può essere controllato dosando il composto chimico

Parte preventivamente sterilizzata con calore

Uso delle membrane filtranti

Metodi chimici per il controllo della crescita microbica

Tutti i giorni sia a casa che a lavoro si utilizzano dei prodotti chimici quali saponi, detergenti la cui funzione è quella di limitare la crescita microbica

Agente antimicrobico : composto chimico naturale o di sintesi che uccide i microrganismi o ne inibisce la crescita

Gli agenti che uccidono hanno il suffisso –cida

•Battericidi

•Fungicidi

•Virocidi

Gli agenti che inibiscono ma non uccidono i microrganismi hanno il suffisso –statico

•Batteriostatici

•Fungistatici

•Virostatici

Gli agenti antimicrobici possono o no avere unatossicità selettiva . La tossicità selettiva è molto utile per il trattamento delle malattie infettive in quanto è possibile uccidere i microrganismi senza danneggiare l’ospite (es. antibiotici)

Effetti sulla crescita degli agenti antimicrobici

Le modalità di azione possono essere diverse a seconda che l’agente sia –statico, -cida o –litico

• Gli -statici agiscono sulla sintesi proteica, inibendola (molti antibiotici funzionano così)

• I -cida provocano la morte della cellula senza provocarne la lisi

• I -litici determinano la morte della cellula per lisi cellulare, si ha la distruzione fisica delle cellule (azione di antibiotici quali la penicillina)

Le tre possibilità di azione degli agenti antimicrobici. Al tempo indicato dalla freccia, ad una coltura in fase esponenziale è stata aggiunta una concentrazione di agente inibente per la crescita. Notare la relazione fra conta totale e conta vitale

Misura dell’attività antimicrobica

L’attività antimicrobica si misura determinando la concentrazione più bassa del composto in esame necessaria per inibire la crescita di un dato organismo

Questo valore viene detto

MIC: Minimun Inhibiting Concentration (minima concentrazione inibente)

Concentrazioni sempre maggiori di antibiotico vengono aggiunte ad una serie di provette inoculate ed incubate

Antisettici, disinfettanti, sterilizzanti

Antisettici : composti chimici che possono provocare la morte o inibire la crescita dei MO. Sono poso tossici per l’uomo. Vengono utilizzati per disinfettare mani e ferite superficiali

•Alcool (solubilizza i lipidi)

•Composti contenenti fenolo (distrugge la membrana cellulare)

•Detergenti cationici (interagisce con i fosfolipidi di membrana)

•Perossido d’idrogeno (agente ossidante)

•Composti iodofori (agente ossidante)

•Nitrato d’argento (precipita le proteine)

Disinfettanti e sterilizzanti : provocano la morte dei MO e vengono usati per oggetti inanimati. Sono chiamati anche germicidi

•Alcool (solubilizza i lipidi)

•Cloro gassoso (agente ossidante)

•Detergenti cationici (interagisce con i fosfolipidi di membrana)

•Composti clorati (agente ossidante)

•Solfato di rame (precipita le proteine)

•Ossido di etilene (agente achilante)

•Formaldeide (agente achilante)

•Composti fenolici (denaturano le proteine)

•Acido peracetico (forte agente ossidante)

MODALITA’ AZIONE AGENTI ANTIMICROBICI

Danneggiamento della parete cellulare: alcuni grampositivi sono attaccati dall’enzima lisozima presente nelle lacrime, nei leucociti. Enzimi prodotti da parecchie specie di batteri sono capaci di degradare la struttura della parete cellulare di altre specie. La disintegrazione è seguita dalla lisi. Altre volte l’effetto antimicrobico è dovuto all’inibizione della sintesi della parete. (Es. penicillina)

Antimetaboliti: interferenza in una biosintesi specifica. Es. blocco della sintesi dell’acido folico da parte della solfaniddamide.

MODALITA’ AZIONE AGENTI ANTIMICROBICI

Alterazione della permeabilità cellulare: la membranaplasmatica preserva l’integrità dei costituenti cellulari. Alcune sostanze (composti fenolici) distruggono la permeabilità selettiva della membrana, permettendo la fuga dei costituendi cellulari.

Inibizione dell’attività enzimatica: Ciascuna delle centinaia delle reazioni è un potenziale bersaglio per un inibitore. Es. il fluoruro inibisce la glicolisi, l’arsenico trivalente il ciclo di Krebs.

Inibizione sintesi acidi nucleici:due categorie inibiscono la sintesi degli acidi nucleici

1.Composti che interferiscono con la formazione delle basi

2.Composti che interferiscono con la polimerizzazione.

Agenti antimicrobici utilizzati in vivo

Sono classificati in base alla loro struttura e del loro meccanismo di azione. La loro caratteristica fondamentale è la

TOSSICITÀ SELETTIVA

Cioè la capacità di inibire batteri o altri patogeni senza produrre danni collaterali nell’ospite. Vengono chiamati anche agenti chemioterapici

Due grandi categorie:

• Composti sintetici

• Antibiotici

Principali bersagli dei chemioterapici

Agenti chemioterapici antifungini: essendo i funghi degli eucarioti, gli agenti antibatterici non funzionano

Spettro d’azione antimicrobica di alcuni agenti chemioterapici