CORRELAZIONE TRA POLIMORFISMO DEI GENI cagA e vacA … · 1.3. Caratteristiche generali del batterio ... ancora indentificati batteri flagellati e la patogenesi di gastrite ed ulcera

1

_________________________________________________

SCUOLA DI SPECIALIZZAZIONE

IN GASTROENTEROLOGIA

“CORRELAZIONE TRA POLIMORFISMO DEI

GENI cagA e vacA di HELICOBACTER PYLORI

E VARIETA’ ISTOLOGICA DEL CARCINOMA GASTRICO”

RELATORE

CHIAR.MO PROF. SANTINO MARCHI

CANDIDATA

DR.SSA CARMELA STEFANIA LARDIELLO

ANNO ACCADEMICO 2014/2015

2

INDICE

Considerazioni generali

Helicobacter pylori ..........................................................................5

1.1. Introduzione storica ..................................................................................... 5

1.2. Cenni di epidemiologia e modalità di trasmissione.................7

1.3. Caratteristiche generali del batterio ............................................................... 8

1.4. Caratteri patogenetici particolari e fattori di virulenza ................................ 10

a) Lipopolisaccaridi................................................................................................. 9

b) La citotossina vacuolante e il gene vacA.......................................................... 11

c) CagA e l’isola di patogenicità cag ..................................................................... 16

1.5 Meccanismi pro-infiammatori, immunità e produzione di radicali liberi ...... 20

1.6. Patologie gastrointestinali ............................................................................ 24

a) Gastrite cronica................................................................................................ 24

b) Ulcera peptica .................................................................................................. 27

c) Dispepsia........................................................................................................... 28

d) Malattia da reflusso gastroesofageo e carcinoma esofageo ........................... 29

e) Adenocarcinoma gastrico................................................................................. 29

f) Linfoma MALT gastrico ..................................................................................... 34

1.7. Manifestazioni extra-digestive...................................................................... 36

a) Apparato cardiovascolare ................................................................................ 36

b) Apparato respiratorio ...................................................................................... 38

c) Sistema nervoso ............................................................................................... 39

d) Sistema endocrino............................................................................................ 40

3

e) Manifestazioni ematologiche........................................................................... 41

f) Manifestazioni reumatologiche ........................................................................ 43

g) Cute .................................................................................................................. 44

h) Tessuto osseo….……………………………….……………………………………………………….…45

i) Patologia urologica............................................................................................ 46

j) Patologia ginecologica....................................................................................... 46

k) Infertilità........................................................................................................... 47

1.8. Diagnosi di infezione ..................................................................................... 47

a) Tecniche non invasive ...................................................................................... 49

b) Tecniche invasive ............................................................................................. 51

Infertilità ....................................................................................... 51

2.1. Definizione .................................................................................................... 51

2.2. Infertilità femminile ...................................................................................... 52

2.3. Infertilità maschile: ....................................................................................... 55

2.3.1. Introduzione .............................................................................................. 55

2.3.2. Cause principali.......................................................................................... 63

a) Fattori ambientali............................................................................................ 63

b) Alterazioni anatomiche.................................................................................... 64

c) Difetti genetici .................................................................................................. 65

d) Anomalie dello spermatozoo........................................................................... 68

2.3.3. Ruolo delle infezioni................................................................................... 69

Associazione con Helicobacter pylori……. ............................................................ 70

3. Ormoni regolatori dell’appetito ................................................. 72

3.1. Ghrelina......................................................................................................... 72

3.2. Obestatina..................................................................................................... 75

3.3. Altri ormoni regolatori dell’appetito............................................................. 77

4

3.4. Ormoni dell’appetito ed Helicobacter pylori................................................ 79

3.5. Ormoni dell’appetito e riproduzione ........................................................... 82

Parte sperimentale

4. Scopo della tesi ................................................................................................ 86

5. Risultati ................................................................................................... 88

7. Discussione....................................................................................................... 90

8. Conclusioni .............................................................................................. 93

Bibliografia ........................................................................................................... 94

5

Considerazioni generali

1. Helicobacter pylori

1.1 Introduzione storica

Nel 1982, Barry James Marshall (Kalgoorlie,

30 settembre 1951) e J. Robin Warren

(Adelaide, 11 giugno 1937) si trovarono di

fronte alla scoperta che nel 2005 valse loro il

premio Nobel per la medicina.

I due ricercatori australiani dimostrarono

mediante osservazione di campioni di

mucosa gastrica prelevati da pazienti affetti

da gastrite e ulcera, l’infezione da parte di un microorganismo che inizialmente,

a causa delle analogie morfostrutturali con i batteri del genere Campylobacter e

per il particolare tropismo, fu denominato Campylobacter pyloridis (poi corretto

in Campylobacter pylori). Il termine Helicobacter comparve per la prima volta

nel 1989, proprio per la necessità di una migliore definizione tassonomica di

questo e di altri batteri con analoghe caratteristiche morfologiche (Helicobacter

mustelae, Helicoabacter nemestrinae, Helicobacter felis) ritrovati nella mucosa

gastrica di alcuni animali (furetto, scimmia, cane e gatto). Con pylori si intende,

invece, la principale sede di isolamento del batterio (1).

La scoperta di agenti patogeni all’interno della mucosa gastrica ha, però, radici

più antiche. Alla fine del 1800 Giulio Bizzozero (Varese, 20 marzo 1846 –

Torino, 8 aprile 1901) osservò nello stomaco di alcuni cani e gatti la presenza di

particolari microorganismi a forma di spirale. Il 18 marzo del 1892 Bizzozero

riferì della sua scoperta alla Regia Accademia di Medicina di Torino, e nello

stesso anno descrisse alcune caratteristiche principali del batterio, tra cui la

Figura 1 – I premi Nobel Barry J. Marshall e J.

Robin Warren.

6

presenza dei flagelli e l’interessamento delle

ghiandole del fondo gastrico e del piloro (18).

Tre anni dopo, le tesi di Bizzozero furono

supportate da un medico tedesco, Hugo Solomon,

che descrisse la presenza di batteri spiraliformi

nella mucosa gastrica di cane e la possibilità di

isolare il patogeno e infettare cavie sane.

All’inizio del ventesimo secolo per la prima volta

vennero isolati batteri spiraliformi dalla mucosa

gastrica di pazienti affetti da carcinoma gastrico, merito di un altro ricercatore

tedesco, Krienitz, mentre nel 1906 Balfour li osservò in lesioni gastriche ulcerate

(2).

Tutte queste evidenze andavano nettamente in controtendenza rispetto all’assunto

comune secondo il quale la mucosa gastrica non potesse essere sede di alcuna

infezione batterica, a causa dell’ambiente ritenuto troppo avverso per la

colonizzazione. Questo dogma fu proprio infranto da Marshall e Warren,

mettendo in relazione l’infezione da parte di questi organismi e le varie patologie

del tratto superiore del sistema gastrointestinale, dimostrando con le loro

pubblicazioni il rapporto esistente tra la colonizzazione da parte di questi non

ancora indentificati batteri flagellati e la patogenesi di gastrite ed ulcera. Marshall

e Warren dimostrarono che il batterio rispettava i primi due postulati di Koch (era

presente nella mucosa gastrica del paziente affetto dalla patologia in esame,

ovvero la gastrite, e poteva essere isolato e coltivato) e per soddisfare il terzo e

quarto postulato (ovvero l’instaurarsi di un quadro patologico inoculando l’agente

in un soggetto sano e la possibilità di poter isolare nuovamente il batterio nel

paziente infettato sperimentalmente), lo stesso Marshall utilizzò sé stesso come

cavia (3). Oggi l’Helicobacter pylori è riconosciuto come principale causa delle

affezioni delle alte vie digestive e nel 1994 l’OMS lo ha inserito tra gli agenti

carcinogeni di primo livello, data la sua stretta correlazione con la patologia

neoplastica dello stomaco.

Figura 2 - Giulio Bizzozzero

7

1.2 Epidemiologia e modalità di trasmissione

L’infezione da Helicobacter pylori è un evento estremamente frequente, tanto da

colpire il 50% della popolazione mondiale (paradigmatico è il caso dell’aerea

metropolitana di Mosca in cui l’infezione da Helicobacter pylori ha un tasso di

incidenza dell’88%) (8). Da quanto emerge da numerosi studi, la prevalenza

dipende dall’area geografica, dall’età, dalla razza e dallo status socio-economico.

In particolare il tasso di infezione nelle aree in via di sviluppo è maggiore rispetto

alle regioni più industrializzate: in uno studio condotto nel villaggio di Linqu,

nella provincia di Shandong, in Cina, su 98 bambini esaminati ben il 70% era

positivo per l’infezione da Helicobacter pylori (9). Un esempio, invece, di come

le condizioni socio-economiche incidano sul rischio di infezione proviene dalla

città di Lipsia, in Germania, in cui è stato osservato un aumento della prevalenza

in gruppi di bambini d’età scolare provenienti da famiglie con basso tenore di

vita. Questi sono solo due esempi della molteplicità di studi effettuati a riguardo

(10).

Un altro fattore importante è la familiarità: la presenza di un parente prossimo

affetto da Helicobacter pylori aumenta notevolmente il rischio di infezione

(soprattutto per i bambini) (11), mentre in alcuni studi viene considerata la

possibilità di trasmissione da parte di un coniuge all’altro (12).

Il grafico soprastante (figura 3) (15) riporta un altro interessante dato: nelle

regioni in via di sviluppo c’è una maggiore prevalenza dell’infezione in

popolazioni di giovane età rispetto alle aeree geografiche sviluppate. Come

riportato sul sito www.gastronet.it, questa discrepanza è dovuta al cosiddetto

“effetto coorte”: i

soggetti residenti in

aeree a maggior

tenore di vita hanno

probabilmente vissuto

durante l’infanzia in

condizioni socio-

economiche più basse

rispetto al presente.

Figura 3 - Prevalenza dell'infezione per età di insorgenza

8

Ciò spiega da un lato quanto

sopra detto, dall’altro la

prevalenza più bassa nelle fasce di

età più giovani.

Per quanto riguarda la

trasmissione, nei paesi più

avanzati prevale la trasmissione

orale-orale. In alcuni studi è stato

possibile evidenziare la presenza

del batterio nella saliva di pazienti

affetti mediante metodiche di PCR-assay o isolando il batterio; altri, invece,

hanno dato risultati contrastanti. Particolare attenzione è stata rivolta verso la

placca dentaria: in alcuni studi è stato possibile isolare il batterio dalla placca, ed

è stato anche dimostrato che l’associazione della terapia eradicante con

trattamenti odontoiatrici atti all’eliminazione della placca risulta essere più

efficace rispetto alla sola terapia anti-Helicobacter (13-14). Un’altra possibile via

di trasmissione interumana è la via gastro-orale, da parte di individui positivi

all’Helicobacter pylori e portatori di reflusso gastro-esofageo o con episodi di

rigurgito.

La trasmissione oro-fecale avviene soprattutto in aeree geografiche meno

sviluppate, soprattutto attraverso l’approvvigionamento idrico da fonti

contaminate.

Esistono, inoltre, studi che prendono in considerazione una possibile trasmissione

zoonotica (tramite la saliva, il vomito o le feci di gatti infetti) e iatrogena

(attraverso metodiche endoscopiche) (16).

1.3 Caratteristiche generali del batterio

L’Helicobacter pylori si presenta come un bacillo Gram-negativo, non sporigeno,

flagellato, della lunghezza di 2.25-5 µm e con un diametro trasverso tra 0.5 e 1.2

µm. (1). Caratteristicamente il batterio si presenta ricurvo con conformazione

elicoidale (da cui il nome), ma in culture di lunga data o esposte all’aria il batterio

Figura 4 - Helicobacter pylori visto in microscopia

elettronica

9

può assumere una forma coccoide, aspetto che si verifica in ambienti di crescita

sfavorevoli (4).

Le condizioni ottimali di coltura sono ad una temperatura di 37° e a basso

contenuto di ossigeno (5-15%, il batterio infatti è microaerofilo), su agar-sangue o

cioccolato, formando dopo circa 3-4 giorni (massimo 8 giorni) colonie dalle

dimensioni tra 0,5 e 1 mm. (4-5).

Sotto il profilo biochimico, caratteristica peculiare del batterio è la sua capacità di

scindere l’urea. Proprio per questa proprietà possiamo dividere le specie di

Helicobacter conosciute in due categorie: ureasi positivi e ureasi negativi. Nel

primo gruppo vengono annoverate le specie che colonizzano prevalentemente lo

stomaco (Helicobacter pylori, Helicobacter heilmanii, Helicobacter felis), mentre

nel secondo possiamo inserire alcune specie riscontrabili a livello biliare e

intestinale (Helicobacter canis, Helicobacter epaticus, Helicobacter bilis).

L’ureasi prodotta dalle specie Helicobacter differisce dalle altre ureasi batteriche

per la presenza di due sub-unità, UreA e UreB, anziché tre. I geni deputati alla

produzione dell’enzima sono sette e sono localizzati in un singolo cluster di 6.13

kb (6). L’ureasi è estremamente importante ai fini dell’infezione: la scissione

dell’urea provoca la liberazione di ammonio e bicarbonato che, neutralizzando il

pH acido nelle immediate vicinanze del batterio, assicura la sopravvivenza

nell’avverso ambiente gastrico.

L’adesione del batterio alle cellule epiteliali gastriche avviene tramite più

molecole di adesione. In questo contesto ritroviamo la proteina BabA, il cui target

è l’antigene Lewis B, un normale costituente delle cellule di individui con gruppo

sanguigno 0. Oltre a BabA, sono state riconosciute altre molecole di adesione, tra

cui HpA, AlpA e AlpB, tutte facenti parte della famiglia delle Outer Membrane

Proteins.

La motilità dell’Helicobacter pylori (come anche precedentemente ricordato) è

garantita dalla presenza di flagelli, in numero da 4 a 6. Ogni flagello ha un

diametro di 30 µm, ed è costituito da un filamento interno di circa 12 nm,

circondato a sua volta da una guaina e da una membrana esterna che si continua

con quella della cellula. Nella parte terminale di alcuni flagelli sono presenti dei

bulbi, probabilmente implicati nei processi di fissazione del batterio (7). La spinta

10

dei flagelli unipolari (che producono un peculiare movimento “a cavaturaccioli”),

insieme all’azione lipolitica e proteolitica di alcuni enzimi specifici, fa sì che il

batterio riesca a penetrare nella porzione di muco sovrastante l’epitelio gastrico,

garantendosi un ambiente ideale per la crescita e ancorandosi alla mucosa

mediante adesine distribuite su tutta la superfice batterica (1).

1.4 Caratteri patogenetici particolari e fattori di virulenza.

L’azione patogena dell’Helicobacter pylori è determinata da alcune particolari

caratteristiche del batterio e fattori di virulenza che andiamo ora ad analizzare.

a) Lipopolisaccaride.

Comunemente a molte altre specie batteriche Gram-negative, anche

l’Helicobacter pylori esprime sulla sua superficie un LPS. Questa componente è

indispensabile per l’integrità del batterio e per l’interazione con l’organismo

ospite, ed è imputato nei meccanismi di immunomodulazione e

immunostimolazione (soprattutto tramite la componente lipidica, il lipide A).

L’LPS ha inoltre caratteri di tipo pirogenetico ed endotossico, e mutazioni della

componente saccaridica possono interferire con i normali processi di fagocitosi da

parte delle cellule mononucleate. L’LPS dell’Helicobacter pylori rientra in

maniera limitata nella patogenesi dell’infezione, tuttavia possiede delle

caratteristiche biochimiche uniche. Vari batteri condividono buona parte della

struttura dell’LPS, in particolare la catena polisaccaridica specifica O, il core

oligosaccaridico e la porzione del lipide A. La catena O, composta da 20-40 unità

(può contenere fino a 8 zuccheri), ha un’alta variabilità e possiede specifiche

funzioni di antigenicità e sierospecificità. Il lipide A (che invece ha una struttura

altamente conservata) connette l’LPS alla membrana esterna del batterio, mentre

il core oligosaccaridico (composto invece da una breve catena di zuccheri, da 10 a

15) è essenziale per il legame con i linfociti T attivati. (7)

11

L’LPS dell’Helicobacter pylori ha, invece, una scarsa immunogenicità. Questo è

probabilmente imputabile all’alto contenuto in acidi grassi del lipide A che

presumibilmente diminuisce il potenziale pirogenetico dell’LPS (1). E’ stata

osservata una forte affinità dell’LPS dell’Helicobacter pylori con la laminina,

proteina contenuta sia nella matrice extracellulare che nella membrana basale

delle cellule del tratto gastroenterico, che favorisce l’adesione del batterio

attraverso meccanismi di glicoconiugazione (legame lectin-like) (7). Questo

aspetto è stato osservato soprattutto in pazienti portatori di ulcera peptica.

Nella porzione polisaccaridica sono presenti componenti antigeniche analoghe

agli antigeni Lewis x (Le x) e Lewis y (Le

y), presenti anche (ed in maniera

consistente) come self sulle cellule dell’organismo umano. Le x e Le

y sono

espressi a livello dell’epitelio ghiandolare gastrico, e la dotazione delle stesse

molecole da parte del batterio provoca un

camuffamento di quest’ultimo, sfuggendo

così alla risposta immunologica soprattutto

negli stadi precoci dell’infezione. Gli

antigeni Lewis sono altresì coinvolti

nell’innesco di un processo di

autoimmunità, con produzione di auto-

anticorpi anti-gastrici. La presenza di auto-

anticorpi attivi contro la membrana

luminale dell’epitelio foveolare e contro la membrana canalicolare delle cellule

parietali è stata messa in relazione con l’insorgenza di gastrite, atrofia della

mucosa gastrica e riduzione del pepsinogeno. (20)

b) La citotossina vacuolante e il gene vacA

Nel 1988 uno studio di Leunk et al. osservò che alcuni ceppi dell’allora

conosciuto come Campylobacter pylori producevano una proteina in grado di

indurre vacuolizzazione in diverse linee cellulari (21). I ceppi produttori di questa

proteina sono maggiormente riscontrabili in pazienti con gastrite atrofica e ulcera

peptica, tuttavia sono stati prelevati campioni anche da pazienti asintomatici.

La produzione della citotossina vacuolante avviene a partire dal gene vacA,

presente in tutte i ceppi di Helicobacter pylori, ma la cui espressione è

Figura 5 - Struttura molecolare di VacA

12

strettamente legata alla presenza dell’isola di patogenicità cag. Gli alleli del gene

vacA hanno una lunghezza che va dai 3.864 ai 3.933 nucleotidi, e presentano

differenze considerevoli tra alleli di ceppi diversi. Nel contesto degli alleli sono

state individuate tre sequenze segnale (definite s1a, s1b e s2) e due regioni medie

(m1 e m2), le cui combinazioni (s1a/m1, s1a/m2 e così via) determinano un

polimorfismo tra i vari ceppi secernenti tossine, con livelli di virulenza differenti

(23). E’ stato infatti osservato che ceppi con l’allele m1 risultano essere associati

ad un maggior danno epiteliale rispetto ai ceppi m2 (che sono poco o non

tossigeni), così come i ceppi s1a/m1 hanno virulenza maggiore rispetto a quelli

s1b/m1 (22).

Figura 6 - Struttura del gene vacA e sequenze segnale

Il trascritto del gene vacA è monocistronico e codifica per una pro-tossina di 140

kDa, per un totale di 1300

aminoacidi. Nel passaggio

attraverso la membrana

citoplasmatica del batterio, la

porzione N-terminale della

proteina va incontro a clivaggio,

cosa che avviene anche per il terzo

C-terminale prima dell’esocitosi. A

questo punto si hanno monomeri di

90 kDa circa che, associandosi,

danno origine alla forma

13

oligomerica della proteina (con aspetto definito dagli anglosassoni “flower-like”)

(22). A contatto con l’ambiente acido dello stomaco, gli oligomeri si dissociano in

monomeri composti da

due subunità, i domini p37 e p58 (di 33 e 55 kDa rispettivamente), che

configurano la tossina nella sua forma attiva.

Molti studi hanno dimostrato che la regione responsabile del legame della tossina

alle cellule è contenuta della porzione C-terminale della tossina matura.

Ciò è stato osservato tramite la reazione di specifici antisieri con la subunità p58,

inibendo il legame della tossina alla cellula (7). I siti di legame presi in

considerazione sono molteplici (tab.1). Tra questi ricordiamo: l’eparansolfato,

presente in maniera ubiquitaria nell’organismo, il recettore per l’EGF (Epidermial

Growth Factor) e gli RPTP-α e RPTB-β (Receptor Protein-Tyrosine

Phosphatase), questi ultimi due scoperti solo recentemente.

Tab 1. Siti di legame per VacA e possibili funzioni dell’interazione.

Sito di legame per VacA

Ruolo nella interazione

Metodo usato Modello sperimentale

Recettore per EGF Recettore delle cellule epiteliali

Antagonismo con anticorpi, IP

Infezione in vitro

Fibronectina Legame dell’Helicobacter

pylori sulla cellula ospite

Legame, adesione cellulare ed assay

Legame in vitro

Glicosfingolipidi Legame per l’internalizzazione di VacA

Binding assy,

cromatografia, MS Legame in vitro

Eparansolfato Recettore/co-recettore sulle cellule epiteliali

Studi con biosensori SPR

Legame in vitro

Integrina β2 (CD18) Recettore dei linfociti T

Citometria di flusso, IF, imaging su cellule vitali, uso di cellule knockout

Trattamento di cellule in vitro, infezione in

vitro

Bilayer lipidico Formazione a basso pH di pori

AFM Legame in vitro

Zattere lipidiche Presunto sito di approdo e internalizzazione sulla superficie cellulare

Frazionamento cellulare, citometria di flusso, IF, studi con inibitori MCD

Trattamento di cellule in vitro

Vescicole lipidiche Sito di legame e di trasferimento della tossina nella cellula ospite

Light scattering e studi di trasferimento di energia

Legame in vitro

Fosfolipidi Sito di legame e di trasferimento della tossina nella cellula ospite

Studi di legame ANS, photolabelling

Legame in vitro

RPTP-α Recettore delle cellule IP, MS, studi Infezione in vitro,

14

epiteliali antisense silencing trattamento di cellule in vitro

RPTP-β Recettore delle cellule epiteliali, recettore per la fosforilazione di Git1 (proteina attivatrice della ARF GTPasi)

Citometria di flusso, IF, IP, siRNA, uso di topi e cellule knockout

Legame in vitro, infezione di topi e cellule

RACK-1 Sconosciuto PD, Y2H Legame in vitro Sfingomielina Recettore sulle cellule

epiteliali Siti di legame, ELISA, citometria di flusso, trattamento con sfingomielinasi

Legame e trattamento di cellule in vitro

Abbreviazioni usate: ANS (1-anilina-8-naftalensulfonato), AFM (microscopia a forza atomica),

EGF (fattore di crescita epidermico), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), IF

(immunofluorescenza), IP (immunoprecipitazione), MCD (metil-β-ciclodestrina), MS

(spettrometria di massa), PD (pull-down), siRNA (silencing RNA knockdown), SPR (risonanza

plasmonica di superficie), Y2H (Yeast-two-hybrid).

L’attività della tossina VacA ha come target due ATPasi, la H+-ATPasi tipo V e

la Na+,K+-ATPasi tipo P. Dopo la formazione di pori a livello della membrana

cellulare, con un aumento della permeabilità della stessa (l’alterazione della

ATPasi tipo P provoca un accumulo di sodio con assorbimento di acqua e

possibile sviluppo di edema intracellulare), avviene l’internalizzazione tramite

endocitosi dei canali anionici attivati. Una volta raggiunti gli endosomi, il legame

tra la tossina e la proteina rab7 qui espressa ostacola le fisiologiche funzioni degli

stessi, mentre l’interazione con l’ATPasi tipo V provoca un’alterazione della

permeabilità, con formazione di un canale selettivo per gli anioni. Ciò provoca un

aumento della concentrazione di H+, con abbassamento del pH e formazione di

una corrente di bicarbonati in entrata. Il vacuolo quindi aumenta di dimensioni,

cosa che si rende irreversibile quando le molecole in entrata vengono protonate

con formazione di NH4+.

Data la semipermeabilità delle membrane vacuolari, le basi andate incontro a

protonazione non possono più diffondere in senso opposto, determinando un

sempre maggiore aumento delle vescicole che occupano l’interno della cellula,

fino alla morte per disgregazione delle membrane.

Gli effetti della tossina VacA, tuttavia, non si esauriscono solo agli aspetti ora

descritti:

15

� Mitocondri: la molecola di VacA esercita a questo proposito un’attività simile a

quella della tossina difterica. La porzione p37 della tossina favorisce l’interazione

tra la membrana endosomiale e la membrana esterna del mitocondrio, laddove il

complesso TOM contribuisce nella formazione di un poro attraverso il quale

avviene l’importazione di VacA. In seguito VacA provoca la formazione di canali

ionici nel contesto della membrana interna mitocondriale, determinando una

iperpolarizzazione della stessa, con inibizione delle funzioni mitocondriali e

dissipazione del potenziale. Un altro fattore precipitante è il clivaggio della poli-

ADP-ribosio polimerasi (PARP), responsabile del rilascio del citocromo c e della

caspasi-3 da parte dei mitocondri. Tutte queste alterazioni conducono al

coinvolgimento di svariati fattori pro-apoptotici, tra cui la proteina Bax (24),

innescando il processo di morte cellulare.

� Cellule immunitarie: uno dei primi studi a riguardo ha evidenziato l’inibizione da

parte della citotossina VacA dei processi di presentazione dell’antigene da parte

dei linfociti T CD4+. VacA, inoltre, pare essere implicata nell’arresto della

maturazione dei fagosomi e l’inibizione dell’espressione della ossido nitrico-

sintetasi (eNOS), probabilmente causata dalla soppressione della kinasi integrino-

dipendente (ILK, Integrin-linked kinase).

La citotossina VacA interferisce con le normali funzioni dei linfociti T, avendo tra

i suoi target CD18. Dopo l’internalizzazione, VacA inibisce la mobilitazione di

Ca2+, provocando l’arresto delle calcineurina, una serina / treonina fosfatasi Ca-

dipendente. con attivazione di NFAT (Nuclear Factor of Activated T cell). La

conseguenza di ciò è la mancata espressione dei geni bersaglio di NFAT, in

particolare il gene di IL-2 e del recettore ad alta affinità per IL-2 (IL-2-R-α).

L’inibizione dei linfociti CD4+ può avvenire anche tramite il recettore CD28.

VacA può, quindi, inibire l’espansione clonale dei linfociti T attivati, manovra di

evasione nei confronti della risposta immune necessaria per la persistenza

dell’infezione.

� Risposta infiammatoria: oltre agli altri fattori di virulenza noti di Helicobacter

pylori, anche VacA è in grado di attivare la risposta infiammatoria. Un esempio è

l’attivazione di MAP-kinasi attraverso l’ATF-2 (Activation Transcription Factor-

2), effetto che sovente si verifica nelle cellule carcinomatose dello stomaco. La

porzione p38 della citotossina, come indicato da modelli sperimentali, stimola la

16

produzione di IL-8 (attraverso l’ATF-2), proteine CREB (cAMP Response

Element Binding) e NFkB (Nuclear transcription Factor kB). Quest’ultimo fattore

viene attivato anche a livello dei linfociti T con effetto pro-infiammatorio. Oltre a

ciò, VacA è in grado di aumentare l’espressione della ciclo-ossigenasi-2 (Cox-2)

da parte di neutrofili e macrofagi, sempre mediante induzione da parte della

componente p33, con incremento della secrezione di prostaglandina E2. Nei

mastociti, invece, è stato osservato un aumento del Ca2+, responsabile diretto di

aumentata chemiotassi e degranulazione (i meccanismi di promozione della

flogosi da parte di Helicobacter pylori sono approfonditi al paragrafo 1.5) (25).

c) CagA e l’isola di patogenicità cag

L’isola di patogenicità cag presente nel genoma dell’Helicobacter pylori, ed in

particolare la proteina CagA, sono state e sono tutt’ora oggetto di studio per la

spiccata virulenza dei ceppi portatori di questi fattori. Il gene cagA (cytotoxic-

associated gene A), sezione dell’isola di patogenicità cag-PAI, è stato rinvenuto

nel 50-70% dei ceppi di Helicobacter pylori isolati in occidente, ed è correlato a

patologie gastrointestinali avanzate.

Figura 8 - Isola di patogenicità cag con rappresentazione schematica dei trascritti

L’isola cag-PAI è una regione di 40 Kb, contenente circa 30 geni che possono

essere presenti in maniera variabile da ceppo a ceppo. La distruzione di uno di

questi geni diminuisce il potenziale di danno del batterio, soprattutto riducendo la

capacità di induzione della secrezione di IL-8 da parte delle cellule dell’epitelio

gastrico. Cag-PAI è divisa in due regioni: la regione a monte cagII, contenente

almeno 14 geni, e la regione a valle cagI, di 16 geni. Il gene cagA è localizzato

nella parte più distale della regione cagI, mentre in alcuni ceppi risulta essere

17

interposto ad un segmento definito IS605 (Insertion Sequence 605) (26). IS605

segna anche il limite tra le due sezioni di cag-Pai, e codifica per due trasponasi

(TnpA e TnpB), enzimi che rientrano nei meccanismi di riorganizzazione del

DNA e responsabili di delezioni o mutazioni.

Cag-PAI pare essere stata acquisita relativamente tardi da parte del batterio,

verosimilmente tramite plasmidi o fagi. In alcuni ceppi batterici compare in tutta

la sua interezza, in altri è deleta o riorganizzata, probabilmente proprio a causa

dell’attività della sequenza IS605 (22).

La secrezione della proteina CagA avviene tramite un apposito apparato di

secrezione di tipo 4, il

T4SS, generalmente

costituito da 11 proteine

definite VirB più la

proteina VirD4, tutte

codificate da cag-PAI. Il

sistema di secrezione 4 con

specifiche funzioni di

virulenza è utilizzato anche

da altri batteri oltre

all’Helicobacter pylori,

nella fattispecie

l’Agrobacterium

tumefaciens (da cui

derivano gran parte della conoscenze su questo tipo di sistema), la Bordetella

pertussis, la Legionella pneumophila e la Brucella suis (probabilmente lo stesso

sistema rientra nei anche meccanismi patogenetici di Rickettsia prowazekii,

Bartonella henselae e Actinobacillus actinomycetemcomitans). Le proteine del

T4SS costituiscono un articolato sistema: un complesso citoplasma/membrana

interna, il canale e un complesso esterno associato al pilo. La prima porzione è

costituita da tre NTPasi, (Virb4, 11 e VirD4) con VirB6 e 8; VirB7, 9 e 10 (il

cosiddetto “core complex”) che danno origine al canale trans-membrana che si

estende dalla membrana interna all’esterna, mentre il complesso esterno collegato

al pilo è costituito dalle componenti VirB2 e 5. VirB3 ha funzione sconosciuta:

Figura 9 - Sistemi di secrezione di tipo IV a confronto:

Agrobacterium tumefaciens (a sinistra) e Helicobacter pylori cag+

(a destra).

18

probabilmente è associata a VirB4, oppure potrebbe rientrare nella composizione

del sistema esterno (27). Nel meccanismo di traslocazione di CagA rilevante

importanza hanno CagF, che lega CagA per la porzione C-terminale, e

VirB5/CagL che si connette insieme a VirB10/CagY alla cellula ospite mediante

interazione con il recettore α5β1.

Una volta iniettata all’interno della cellula ospite, l’oncoproteina CagA subisce

alcune modificazioni che la rendono operativa. In particolare la proteina va

incontro a fosforilazione da parte delle Src tirosin-chinasi (tra l’altro noti fattori

oncogeni) e c-Abl presenti nella cellula ospite. In seguito alla fosforilazione,

CagA interagisce con la tirosin-fosfatasi SHP-2, inducendone l’attività e

determinando modificazioni citoscheletriche (soprattutto tramite fosforilazioni di

proteine leganti l’actina), che allungano le cellule e configurano il cosiddetto

“hummingbird phenotype” (con relativo aumentato rischio di metastasi per

carcinoma gastrico dovuto alla diminuzione dell’inibizione da contatto e la

produzione di uno scattering caratteristico) (27-28).

Figura 10 - Hummingbyrd phenotype ("fenotipo colibrì"): evidente allungamento delle cellule dopo

infezione da Helicobcater pylori cagA-positivo (wild type) rispetto alle cellule non infette (a sinistra) o

esposte a Helicobacter pylori con delezione di cagA (a destra).

L’attività di CagA non si limita solo a quanto sopra descritto, ma lede alla cellula

anche tramite effetti indipendenti dalla fosforilazione. Sono stati descritti ben 11

siti di legame per la CagA non fosforilata, primo fra i quali Grb2, una proteina

adapter che può interagire anche con la CagA fosforilata. Questa interazione si

associa ad un altro fattore, Sos (Son of Sevenless), creando un complesso

CagA/Grb2/Sos che promuove la formazione di GTP da parte di Ras e che avvia

una cascata di eventi responsabili di una incrementata dispersione (scattering) e

proliferazione cellulare (sistema Raf-Mek-Erk).

19

Un altro meccanismo patogenetico non correlato alla fosforilazione è la perdita di

polarità cellulare, con inibizione del sistema Par1b/MARK2 (partitioning-

detective 1/microtubule affinity-regulating kinase 2). Questo sistema è essenziale

per la stabilità dei microtubuli e la polarizzazione del fuso mitotico, con ritardo in

profase/metafase ed errato orientamento dei fusi. Recenti studi hanno dimostrato

che CagA lega anche altre proteine della stessa famiglia (Par1a, Par1c, Par1d),

determinando un’aumentata elongazione delle cellule (29).

Un altro importante effetto di CagA è la stimolazione della produzione di

citochine. La citochina maggiormente chiamata in causa è l’IL-8, secreta dalle

cellule epiteliali gastro-enteriche in risposta all’invasione batterica. I livelli di

questa interleuchina sono stati comparati tra ceppi cagA-positivi e negativi, con

un netto incremento nel primo gruppo (30). Livelli di IL-8 aumentati rispetto a

ceppi CagA-negativi sono stati osservati anche in altri studi: lo studio di Audibert

et al. ha osservato una induzione della produzione di IL-8 nel 58.7% dei batteri da

loro isolati (il gene cagA era presente nel 63% dei pazienti portatori di ulcera

duodenale e nel 56.5% dei soggetti con ulcera gastrica ) (32).

Circa l’oncogenicità di CagA, interessante è l’interazione di quest’ultima con la

proteina ASPP2, un fattore p53 correlato. ASPP2 è una proteina pro-apotpotica,

che esplica il suo compito attraverso l’attivazione del soppressore tumorale p53 e

che normalmente, in seguito a danno sul DNA o stimoli oncogeni, innesca la

cascata della morte cellulare programmata. Uno studio di Butia et al. ha

dimostrato che il legame tra CagA e ASPP2 provoca un sovvertimento funzionale

della proteina, con alterazione del normale meccanismo oncosoppressore di p53

attraverso una degradazione proteosomica di quest’ultima. CagA, quindi, dirotta

le normali funzioni di ASPP2, promuovendo la proliferazione cellulare (33).

Un’altra osservazione sulla correlazione pro-neoplastica di cag-PAI ci giunge da

uno studio sulla metalloproteasi-7 e sulla sua aumentata espressione in seguito

all’infezione da Helicobacter pylori. La MMP-7 fa parte della famiglia degli

enzimi proteolitici zinco-dipendenti, con proprietà pro-neoplastiche e che viene

espressa e secreta dalle cellule epiteliali. I ceppi cag+ provocano una

sovraregolazione di mmp-7, aspetto osservata in condizioni di malignità e pre-

malignità. La cascata che porta a questa condizione risiede in un’aberrazione della

20

catenina p120 a livello nucleare, che rimuove il blocco trascrizionale sul gene

della MMP-7 da parte della proteina “Kaiso” (34).

1.5 Meccanismi pro-infiammatori, immunità e produzione di

radicali liberi

Le modalità attraverso le quali l’Helicobacter pylori esplica la sua attività

patogena sono molteplici e agiscono a vari livelli. Innanzitutto il batterio è in

grado di provocare un danno diretto sulle cellule epiteliali, attraverso l’adesione e

la produzione della citotossina vacuolante. Circa l’attività patogena condotta sia

da VacA che dai prodotti dell’isola di patogenicità cag si è parlato nelle sezioni

precedenti, tuttavia val la pena soffermarsi sul processo di induzione

dell’infiammazione da parte del batterio. Un lavoro di Backert e Naumann ha

inquadrato in maniera molto esaustiva questi meccanismi, suddividendoli in più

punti. Innanzitutto l’infezione da parte dell’Helicobacter pylori provoca una

attivazione immediata di alcuni fattori definiti “precoci” attraverso l’interazione

con specifiche componenti, nelle fasi iniziali soprattutto con le flagelline o l’LPS,

che interagiscono con particolari recettori “Toll-like”. Il Fattore nucleare k-B

(Nf-kB), importante regolatore trascrizionale delle cellule eucariotiche, gioca un

ruolo chiave nella regolazione dell’immunità innata ed adattiva,

nell’infiammazione, e nei meccanismi di sopravvivenza cellulare. Per esempio,

questo fattore è coinvolto nella regolazione della flogosi attraverso l’induzione

alla produzione di citochine, chemochine, fattori di adesione cellulari e altri

effettori. Opinione diffusa è che l’Helicobacter pylori provochi la

sovraregolazione del fattore Nf-kB, soprattutto attraverso i suoi fattori di

virulenza.

AP-1 è un altro fattore di trascrizione implicato nei meccanismi di infiammazione

acuta e cronica. Come Nf-kB è attivato da svariati stimoli, rientrando anche nei

meccanismi di proliferazione, maturazione cellulare e apoptosi. La concomitante

attivazione di Nf-kB è essenziale anche in modalità fisiologiche nella regolazione

dei linfociti T nell’infiammazione cronica, in cui entrambi i fattori promuovono

l’attivazione di geni produttori di citochine.

21

Premesso questo, possiamo suddividere i meccanismi di induzione in base ad

alcune modalità:

1) Attivazione di Nf-kB T4SS dipendente-cagA indipendente. Protagonista è

cagPAI, ed in particolare la porzione implicata nella codifica delle componenti

del sistema T4SS. Probabilmente la porzione del pilo del sistema di trasporto o

l’iniezione di ureasi o peptidoglicano provocano l’attivazione di diversi sistemi

che inducono l’attivazione dell kinasi Nf-kB-induttrice (NIK) e di conseguenza

una sovraespressione di Nf-kB.

2) Attivazione di AP-1 T4SS dipendente-cagA indipendente. Questo meccanismo è

sostenuto da alcune kinasi (JNK-MKK4-PAK1) che contribuiscono all’attivazione

di citochine e chemochine pro-infiammatorie indotte dal sistema di trasporto di

Helicobacter pylori. L’attivazione di AP-1 sembra essere mediata direttamente

dalla kinasi JNK che da il via alla cascata enzimatica che porta all’attivazione di

AP-1.

3) Meccanismi cagA dipendenti. L’iniezione di CagA e la traslocazione di p65

all’interno provocano l’induzione e quindi il rilascio di IL-8., attraverso un

meccanismo guidato da una particolare cascata enzimatica, H-Ras-Raf-MEK.

Quest’ultimo sistema pare intervenga in circa 24 ore. (36).

Per quanto riguarda l’immunità non specifica, l’infezione da Helicobacter pylori

provoca una risposta da parte dei neutrofili, con persistenza di queste cellule

nell’infiammazione cronica. Ciò naturalmente è favorito dall’immissione in

circolo di chemochine, citochine e molecole di adesione che contribuiscono al

reclutamento e all’attivazione dei neutrofili. In particolare uno studio di Svensson

et al. ha evidenziato la sovra-espressione di una particolare molecola di adesione,

la E-selectina, in seguito ad infezione.

22

I ligandi di questa molecola sono Sialyl- e Lewisx, presenti su neutrofili e

monociti; anche lo stesso Helicobacter è in grado di legare l’E-selectina (37).

Figura 11 - Meccanismi pro-infiammatori di Helicobacter pylori

I fagociti mononucleati rivestono una parte importante nelle fasi precoci di

infezione, sia come fonte di mediatori pro-infiammatori sia come cellule

presentanti l’antigene. E’ inoltre possibile osservare un infiltrato di eosinofili, i

quali rilasciano proteine basiche che contribuiscono al danno endoteliale. La

degranulazione degli eosinofili è probabilmente scatenata da immunocomplessi di

IgA e antigeni solubili.

23

L’infiltrato di linfociti T e plasmacellule in corso di gastrite è il testimone

dell’immunità antigene-specifica e della risposta umorale. L’infezione

promuove lo sviluppo di follicoli linfoidi organizzati, che gradualmente

diminuiscono in seguito ad eradicazione. La presenza di cellule accessorie

(macrofagi e cellule dendritiche) facilita i meccanismi di presentazione

dell’antigene. (38) La risposta si avvale anche dei linfociti T, in particolare dei

linfociti CD4+, dei quali è stato osservato un incremento rilevante. La risposta

anticorpale è garantita dalla secrezione prevalentemente di IgG nel torrente

ematico, mentre, a livello locale, si ritrovano principalmente IgA secretorie.

Queste immunoglobuline sembrano non avere un ruolo determinante

nell’eradicazione dell’infezione; malgrado ciò, tra i loro bersagli sono annoverate

anche strutture chiave del batterio, tra i quali i flagelli e le ureasi. Sono immesse

in circolo anche immunoglobuline IgE, queste ultime implicate in reazioni di

liberazione di istamina da parte di mast-cellule e basofili.

Un altro punto interessante è costituito dall’incremento della produzione da parte

dell’Helicobacter pylori di radicali liberi dell’ossigeno (40-41). Sebbene questa

attività sia svolta prevalentemente dai neutrofili, anche il batterio se ne fa

promotore. L’Helicobacter è in grado di generare tali molecole attraverso varie

modalità: si ha, infatti, una produzione passiva di anione superossido O2-

attraverso la catena respiratoria mitocondriale. Inoltre, mediante l’ureasi, l’H.p.

promuove la produzione di altre molecole tossiche, tra cui le cloroammine,

derivate dalla reazione dell’anione clorossido (OCl-) e dell’ammoniaca, scissa

dalle stesse ureasi. CagA, oltre a ciò, favorisce la formazione di radicali liberi

tramite i mitocondri delle cellule dell’epitelio gastrico. Un metodo per ripararsi

dagli stessi radicali, altrimenti lesivi per il batterio, è costituito dalle catalasi e

dalle superossidodismutasi prodotte dallo stesso Helicobacter, che, oltre a

scindere le molecole ossidanti, ne riducono anche la produzione da parte dei

neutrofili (39-40).

Un altro aspetto da tener conto nell’infezione da Helicobacter pylori è l’induzione

di meccanismi di autoimmunità. Numerosi studi, infatti, correlano tale infezione

a numerose patologie a carattere autoimmune, sia a livello gastro-intestinale

(gastrite autoimmune) che extra-intestinale. Le patologie autoimmuni correlate ad

24

Helicobacter pylori saranno trattate in seguito nel contesto delle manifestazioni

extra-digestive dell’infezione.

1.6 Patolologie

gastrointestinali

a) Gastrite cronica

La forma di gastrite cronica da

Helicobacter pylori è sicuramente

la variante di gastrite più comune al

mondo, essendo l’infezione da

Helicobacter presente in circa il

90% dei pazienti con gastrite

cronica antrale (43).

L’evoluzione della gastrite da

Helicobacter pylori può

generalmente seguire due strade:

Gastrite antrale, caratterizzata da

infiammazione limitata all’antro.

Questo pattern è presente con

elevata percentuale in pazienti che sviluppano in seguito ulcera gastrica, a causa

di una elevata attivazione delle cellule secernenti gastrina e susseguente

ipercloridria;

1. Pangastrite e successiva gastrite atrofica multifocale, contraddistinta dal

coinvolgimento del corpo e dell’antro e dalla progressiva distruzione delle cellule

ossintiche e atrofia. Il risultato è una riduzione della secrezione acida, con

ipocloridria o anacloridria, e metaplasia intestinale, con incremento del rischio di

degenerazione neoplastica.

La metaplasia intestinale, come anche sopra ricordato, riveste un ruolo importante

in questa affezione. La classificazione di Filipe e Jass la suddivide in tre stadi

(44):

Figura 12 - Gastrite cronica antrale in maschio di 45 anni.

La colorazione Giemsa mette in risalto l'infezione da

Helicobacter pylori (Brown Medical School -

www.brown.edu)

Figura 13 - Aspetto endoscopico di gastrite da

Helicobacter pylori.

25

Tipo I (completa): cripte prive di alterazioni architetturali, rivestite da cellule

caliciformi mature e cellule assorbenti con un orletto di microvilli ben definito. Le

cellule caliciformi secernono sialomucine e occasionalmente solfomucine. Le

cellule assorbenti non presentano mucine; cellule di Paneth presenti alle basi delle

cripte.

Tipo II (incompleta): cripte con lievi alterazioni architetturali, rivestite da cellule

caliciformi interposte a cellule colonnari mucosecernenti, mentre le cellule

assorbenti sono assenti o rinvenibili in poche unità. Le cellule colonnari

contengono sialomucine e mucine neutre, le caliciformi sialomucine. Cellule di

Paneth rare o assenti;

Tipo III (incompleta): presenza di cripte tortuose e ramificate, con architettura

alterata. Sono presenti prevalentemente cellule colonnari immature secernenti

solfomucine rispetto alle cellule caliciformi contenenti sialomucine e/o

solfomucine. Cellule di Paneth estremamente rare.

Non sono del tutto chiare le modalità patogenetiche che indirizzano la gastrite a

sviluppare l’una o l’altra modalità, tuttavia pare che giochino un ruolo essenziale

alcune citochine, in particolare l’IL1β, che oltre ad essere un potente agente pro-

infiammatorio, induce un decremento della secrezione cloridrica, indirizzando il

quadro verso una pangastrite.

Istologicamente a livello macroscopico non esiste un aspetto endoscopico

caratteristico rispetto agli altri tipi di gastrite. Possono comparire aree di iperemia

e/o ipertrofia, erosioni (in base al grado della gastrite in atto) e, in caso di atrofia,

si osserverà un assottigliamento della mucosa. Microscopicamente, sono visibili

le colonie di Helicobacter pylori che rivestono la mucosa, interessando sia le

regioni antrali sia corpo-fundiche e cardiali. Nel caso sussista una estesa

metaplasia intestinale, le aree di infezione si limitano alle porzioni non

metaplastiche, in particolare a livello del corpo. L’infiltrato infiammatorio,

composto da linfociti e plasmacellule, oltre che da neutrofili nelle fasi attive,

risulta essere preponderante a livello del corpo, con follicoli linfatici iperplastici

(43).

Un altro fattore che riveste notevole importanza è l’ipocloridria. E’ stato

osservato, infatti, che l’ Helicobacter pylori è in grado di provocare ipocloridria

26

già in tre giorni dall’inizio dell’infezione. Questo, naturalmente, facilità la

colonizzazione e promuove l’attivazione di processi pro-infiammatori.

La diminuzione della secrezione acida può essere collegata o a distruzione delle

cellule parietali da parte dell’infiammazione o a un meccanismo di aggressione

condotto dal batterio stesso. Infatti, recentemente è stata dimostrata la capacità

dell’Helicobacter pylori di interferire con una subunità della H+K+ATPasi

(subunità α-catalitica HKα), indispensabile per la secrezione acida. Tale effetto è

realizzato da fattori prodotti dall’isola cagPAI (CagE, CagM, CagL, CagA),

capaci di reprimere la pompa protonica e, di conseguenza, la secrezione acida.

E’ stata evidenziato un ruolo dell’infezione da Helicobacter pylori anche per la

gastrite autoimmune. Infatti, la possibile attivazione di linfociti CD4+ Th1 può

far sì che essi cross-reagiscano con componenti self della mucosa gastrica, come

per esempio con la H+K+ATPasi, e con varie proteine dell’Helicobacter pylori.

Ciò può dare il via ad un processo di autoimmunità gastrica che può avere come

conseguenza finale l’atrofia. In particolare, è stata osservata una stretta omologia

tra le subunità β dell’ureasi batterica e dell’H+K+ATPasi, il ché suggerisceun

possibile mimetismo molecolare tra le componenti batteriche e alcuni

autoantigeni della parete gastrica. Sempre in questi meccanismi sembrano essere

implicati anche gli antigeni Lex e Ley, espressi sia dal lipopolisaccaride batterico

sia a livello della mucosa gastrica (46-47).

Figura 14 - Localizzazioni e interessamento degli strati della parete gastrica in corso di ulcera peptica

27

b) Ulcera peptica

L’ulcera peptica è una patologia estremamente rilevante dal punto di vista sociale:

il 2% della popolazione mondiale è affetta da ulcera attiva, mentre circa il 6-15 %

ha manifestato sintomi riconducibili a essa. Gli uomini sono colpiti con maggiore

frequenza, con un rapporto di 3:1.

Per definizione, si considera come ulcera peptica una lesione focale, con perdita

di sostanza a livello mucoso, che si approfondisce fino alla sottomucosa e supera

la muscularis mucosae. Alla base del fenomeno c’è un difetto dei meccanismi di

difesa della mucosa verso gli agenti dannosi, nella fattispecie l’acido cloridrico e

la pepsina. La localizzazione duodenale è la più frequente, fatta eccezione per le

casistiche giapponesi, in cui la localizzazione gastrica è nettamente preminente

(48). Nel 5-15% dei pazienti, inoltre, è possibile osservare una doppia

localizzazione, sia gastrica che duodenale.

Nella patogenesi dell’ulcera peptica, l’Helicobacter pylori ha un ruolo di primaria

importanza. Ulcere peptiche duodenali si associano sovente a manifestazioni

gastritiche antrali in cui sussiste uno stato di ipergastrinemia, dato che in questo

tipo di gastrite le ghiandole ossintiche risultano essere illese. A questo livello si

verifica un danneggiamento delle cellule D dell’antro, che rimuove l’inibizione

delle cellule G producenti gastrina con conseguente secrezione di acido cloridrico.

A ciò si combina una riduzione di produzione di bicarbonati, probabilmente

dovuta a VacA, che predispone il bulbo duodenale alla metaplasia gastrica, alla

colonizzazione da parte di Helicobacter pylori e al danno epiteliale, rendendo la

mucosa di questo distretto suscettibile all’attacco dei secreti acidi lesivi.

L’Helicobacter pylori rientra in maniera rilevante anche nella patogenesi

dell’ulcera gastrica. In questo caso il primum movens risiede in una alterazione

dello strato di muco che riveste la parete gastrica, con aggressione da parte degli

ioni idrogeno dell’epitelio. L’ulcera gastrica risulta essere, inoltre, maggiormente

correlata ad atrofia e metaplasia, con maggior rischio di trasformazione

neoplastica, probabilmente a causa dell’infiammazione e dell’ipocloridria che

approntano la localizzazione gastrica dell’ulcera. Le sedi di sviluppo più frequenti

sono le aree di transizione fundo-cardiale, antro-pilorica e corpo-antrale.

28

c) Dispepsia

Viene inteso come dispepsia un particolare quadro clinico caratterizzato da dolore

e/o discomfort localizzati ai quadranti addominali superiori (soprattutto in regione

epigastrica) e che persistono nel tempo. La sintomatologia si esacerba in

corrispondenza dei pasti, non si associa ad alterazioni dell’alvo e può avere un

andamento cronico (per almeno 12 settimane negli ultimi 12 mesi).

In termini etiopatologici, la dipsepsia può essere suddivisa in due categorie:

� Dispepsia secondaria, ovvero riconducibile a una nota patologia di base;

� Dispepsia funzionale (o idiopatica), qualora non sia possibile attribuire la causa

del disturbo a nessuna evidente alterazione organica, sistemica o metabolica, e la

cui diagnosi viene effettuata escludendo le cause di dispepsia secondaria. Questo

tipo di dispepsia può essere a sua volta suddivisa in:

� Simil-ulcerosa, presente in pazienti con predominanza di sintomi

quali bruciore retrosternale e dolore epigastrico. Questa tipologia

particolare può essere riconducibile all’infezione da Helicobacter

pylori (è presente una elevata sieroprevalenza dell’infezione in

gruppi di pazienti dispeptici) o a meccanismi di ipersecrezione

acida;

� Simil-motoria, associata prevalentemente a sintomi non dolorosi

(discomfort). La causa risiede probabilmente nel ritardato

svuotamento gastrico, in stati di ectasia dell’antro gastrico o nella

ridotta accomodazione fundica (49).

Le basi fisiopatolgiche della dispepsia indotta da Helicobacter pylori sono

complesse, e esistono numerosi studi a riguardo. L’ipersecrezione acida ha un

ruolo fondamentale: in pazienti con gastrite antrale e ipercloridria, è stata

osservata una riduzione della secrezione di somatostatina, con un conseguente

aumento del rilascio di gastrina e della secrezione acida.

Un altro dato interessante è quello riguardante la ghrelina (vedi seguito): in

diversi studi i livelli sierici dell’ormone risultano essere diminuiti in pazienti

dispeptici e portatori di Helicobacter pylori, specie in coloro che lamentavano

29

sazietà precoce e senso di gonfiore e peso post-prandiale. Da ciò si evince che

l’Helicobacter pylori riveste un ruolo anche nella patogenesi della dispepsia

simil-motoria, e che la determinazione dei livelli sierici di ghrelina può essere in

futuro un utile marker di valutazione per questo disturbo (51).

d) Malattia da reflusso gastroesofageo

L’infezione da Helicobacter pylori non sembra a oggi essere correlata in maniera

evidente con la malattia da reflusso gastro-esofageo (GERD). Dal punto di vista

epidemiologico, non è stata osservata una sostanziale differenza tra pazienti affetti

da GERD e controlli di soggetti non infetti. La questione sulla patogenesi, invece,

sembra essere più spinosa: alcuni studi hanno osservato che l’infezione provoca

una sorta di effetto protettivo nei confronti della patologia da reflusso, a causa

della soppressione delle secrezione acida in pazienti con pangastrite o gastrite

atrofica, escludendo così anche le complicazioni del GERD stesso (con in primis

l’esofago di Barrett e la degenerazione neoplastica). Ciò avverrebbe in maniera

più marcata in pazienti affetti da ceppi CagA-positivi, probabilmente a causa della

maggiore azione pro-infiammatoria che questi ceppi inducono a livello della

mucosa gastrica (49). Tuttavia, in altri studi, è stato osservato che l’eradicazione

dell’infezione non determina né un aggravamento né un miglioramento dei

sintomi in pazienti affetti da GERD e, al contempo, portatori di Helicobacter (50).

Una raccomandazione utile è, comunque, la ricerca dell’infezione in pazienti con

reflusso da lungo tempo trattato con PPI (inibitori della pompa protonica), in

quanto la presenza del batterio, unita all’inibizione della secrezione acida indotta

dal farmaco, possono accelerare il processo di atrofia della mucosa gastrica,

predisponendola allo sviluppo di neoplasie.

e) Adenocarcinoma gastrico

Il carcinoma gastrico è la seconda causa di morte per neoplasia nella popolazione

mondiale, tuttavia negli ultimi cinquant’anni si è assistito ad un declino

dell’incidenza di questa particolare patologia (fatta eccezione per il Giappone, in

cui l’adenocarcinoma assume i caratteri di malattia endemica). In Europa si

verificano annualmente circa 190.000 nuovi casi (23% di tutte le neoplasie), con

un rapporto maschi-femmine di quasi 2:1. L’Europa orientale (34 casi ogni

100.000 abitanti maschi) e meridionale (19 casi per 100.000) sono tra le regioni

30

più colpite (dati dell’Associazione Italiana Ricerca sul Cancro). In Italia

l’incidenza è maggiore nelle regioni centro-settentrionali rispetto al meridione,

con tassi tra 35 e 25 nuovi casi ogni 100.000 abitanti. L’età di insorgenza media è

oltre i 50 anni (sei casi su dieci si sono verificati oltre i 65 anni), raramente sotto i

30.

Per quanto riguarda l’etiopatogenesi, numerosi sono i fattori che possono incidere

sull’insorgenza del carcinoma gastrico. Le abitudini alimentari hanno un ruolo

decisamente importante, in particolare le diete carenti di vegetali o povere in

acido ascorbico e folati. Alcuni fattori genetici, inoltre, sono probabilmente

implicati nella patogenesi del carcinoma gastrico: nell’8% dei casi è stata

osservata una mutazione del gene dell’ E-caderina CDH1, che codifica per una

proteina calcio dipendente di adesione cellulare. Sono state osservate anche

mutazioni della p53 o del gene BRCA-2, e pare essere presente un’aumentata

suscettibilità nei pazienti portatori di HNPCC e con mutazioni germinali dei geni

del mismatch repair. La presenza di displasia, riscontrabile sia in aree di

metaplasia intestinale che in aree non metaplastiche, è un parametro di

valutazione importante, in quanto è stato dimostrato che l’85% delle lesioni con

displasia ad alto grado va incontro a degenerazione maligna in meno di 15 mesi

(43). La gastrite atrofica e la metaplasia intestinale risultano essere protagoniste

nella carcinogenesi, in molti studi considerate una sorta di punto di partenza per lo

sviluppo di un adenocarcinoma di tipo intestinale (52).

In particolare, lo stato di ipocloridria che si instaura nella gastrite atrofica

favorisce la proliferazione di microorganismi capaci di produrre nitriti (agenti

carcinogeni noti) partendo dai nitrati gastrici. Inoltre, c’è una riduzione della

secrezione di acido ascorbico, sostanza con caratteristiche anti-tumorali e che

controbilancia l’eccesso di nitriti.

I meccanismi molecolari attraverso i quali dall’infezione si può passare al

carcinoma sono svariati (fig.15), e contemplano l’effetto tossico diretto sulle

cellule epiteliali, con perdita di polarità e alterazione dell’adesione, lo stress

ossidativo Helicobacter-indotto, gli effetti sulla trasduzione del segnale e

sull’espressione dei geni con turbe nell’equilibrio apoptosi-proliferazione, e le

alterazioni del sistema del DNA mismatch repair (53).

31

Alla base di queste eventi ritroviamo i fattori di virulenza (vedi paragrafo 1.4). La

relazione tra l’infezione da ceppi CagA-positivi e il maggior rischio di

degenerazione neoplastica è supportata da numerosi dati, molti dei quali

provengono dalle regioni dell’Asia orientale. In queste regioni, infatti, esiste

un’alta prevalenza di carcinoma gastrico, con un’elevata percentuale di ceppi

CagA-positivi. Al contrario in Occidente tale percentuale è considerevolmente più

bassa, con una prevalenza del carcinoma gastrico altrettanto minore (54). Questo

evidenzia ancora una volta la stretta correlazione esistente tra il genotipo cag+ e

l’insorgenza di neoplasie.

Dati esaurienti sul rapporto tra Helicobacter pylori e carcinoma gastrico ci

vengono forniti da studi sull’importanza dell’eradicazione dell’infezione nei

pazienti ad alto rischio per tumore allo stomaco. Un trial eseguito in una regione

ad alto rischio della Cina, ad esempio, ha dimostrato che in gruppi affetti da

Helicobacter pylori esisteva una maggiore incidenza di cancro gastrico rispetto ai

controlli (pazienti non infetti), e che l’eradicazione del batterio (sebbene la

regressione della metaplasia intestinale, laddove presente, sia stata osservata solo

in pochi casi) poteva prevenire la comparsa sia di neoplasie de novo in pazienti in

assenza di lesioni precancerose, sia di recidive in soggetti affetti da “hearly

gastric cancer” e trattati con resezione endoscopica.

Per quanto riguarda la metaplasia intestinale, è stato ipotizzato una sorta di “punto

di non ritorno”, oltre il quale, nonostante l’eradicazione del batterio, la

regressione non è più possibile. I meccanismi molecolari alla base di questo

fenomeno, però, non sono chiari (56).

Figura 15 - Meccanismi molecolari di oncogenesi da Helicobacter pylori

32

A questo proposito, tuttavia, alcuni modelli sperimentali hanno dimostrato che

l’eradicazione dell’Helicobacter pylori può provocare una sostanziale

diminuzione delle citochine pro-infiammatorie. In particolare, sono stati dosati i

livelli di IFN-γ prodotta dai linfociti Th-1, evidenziandone una marcata riduzione

in seguito a terapia antibiotica in soggetti con lesioni precancerose. Ciò ha portato

a concludere che l’eradicazione dell’infezione può comportare un’attenuazione

dei processi di flogosi, con parziale regressione delle lesioni precancerose e, di

conseguenza, diminuita incidenza di carcinoma (58).

Tab 2. Classificazione di Borrmann del carcinoma gastrico.

Polipoide Massa a cavolfiore o villosa, scarsa tendenza

ad infiltrare la parete.

Fungoide Massa solida cupoliforme con ulcerazione

centrale. Rappresenta 1/3 dei carcinomi

avanzati

Ulcerativo Forma più comune. Ulcera profonda, fondo

necrotico, margini irregolari e nodosi.

Infiltrante 10% dei tumori avanzati. Non è visibile alcuna

massa, ma è presente un ispessimento della

parete a placca. La variante diffusa viene

definita come “linite plastica”, con stomaco

ridotto di volume e pareti rigide ed ispessite.

Tab 3. Classificazione di Lauren del carcinoma gastrico.

Intestinale Più frequente nei paesi ad alta incidenza, a sede

antro-pilorica con aspetto macroscopico

principalmente fungoide.

Diffuso Carcinoma ad anello con castone

Indefinito Coesistenza di aspetti di carcinoma intestinale

e diffuso

33

Figura 16 - Classificazione TNM del carcinoma gastrico

Interessante è anche il dato proveniente da studi condotti sulla progressione del

carcinoma gastrico in pazienti con ulcera gastrica e infezione da Helicobacter

pylori. L’eradicazione del batterio ha comportato una sostanziale riduzione di

nuovi casi rispetto al controllo (57).

Quanto sopra detto rimanda ad un concetto chiave: lo screening.

La determinazione dell’infezione e la tipizzazione del genotipo CagA+,

soprattutto in aree ad alto rischio, può essere un utile strumento di prevenzione nei

confronti del carcinoma dello stomaco e delle sue condizioni preneoplastiche,

nella fattispecie la gastrite atrofica e la metaplasia intestinale.

Figura 17 - Immagine istologica di linfoma MALT a

basso grado

34

f) Linfoma MALT gastrico

Il linfoma gastrico è una neoplasia di origine linfoide che si localizza

primitivamente allo stomaco. Il linfoma MALT (acronimo di Mucosal Associated

Limphoid Tissue) colpisce gli aggregati linfoidi della mucosa, localizzati

normalmente a livello dell’antro o alla base della mucosa ossintica. Questa

neoplasia vede tra le cause determinanti l’infezione da parte dell’Helicobacter

pylori, con un’associazione che può raggiungere percentuali elevatissime, fino al

98% dei casi osservati (ciò avviene in maniera molto meno frequente per i linfomi

B ad alto grado, in cui l’associazione tumore-Helicobacter è del 25-38 %).

All’esame istologico, il linfoma MALT si presenta macroscopicamente spesso

sotto forma di ulcere superficiali, erosioni, o come pliche mucose ispessite, con

penetrazione generalmente limitata alla mucosa o alla sottomucosa.

Microscopicamente, l’architettura riproduce il MALT normale, con cellule

neoplastiche disposte tra follicoli linfatici pre-esistenti. Con il progredire della

lesione, si ha una colonizzazione ed erosione dei follicoli, fino alla completa

scomparsa. Le cellule linfomatose hanno citoplasma chiaro, con nucleo a contorni

irregolari (43).

Le basi molecolari del linfoma MALT Helicobacter-indotto risiedono nella

cronica stimolazione antigenica effettuata dal batterio, con espansione clonale

delle cellule B. Infatti in corso di infezione da Helicobacter pylori si assiste, sotto

lo stimolo di linfociti T sensibilizzati, all’organizzazione di follicoli linfoidi e

centri germinativi con una zona mantellare ben definita, configurando un sistema

atto a controllare l’infezione. Questo tipo di tessuto, diverso dai normali aggregati

linfoidi sparsi della mucosa gastrica, viene definito come “MALT acquisito”, da

differenziare dal “MALT nativo” che può essere ben osservato nell’ileo distale o

nelle placche di Peyer. L’insorgenza del linfoma si verifica qualora una

popolazione monoclonale si sleghi dal resto della componente MALT, acquisendo

caratteri proliferativi tumorali (59). Finché il tumore resta vincolato alla

stimolazione antigenica, esiste una buona possibilità di regressione dopo

eradicazione dell’Helicobacter pylori, in seguito tale dipendenza svanisce e il

linfoma tende all’evoluzione maligna.

35

Il linfoma MALT Helicobacter-associato possiede alcune caratteristiche

molecolari che probabilmente sono alla base della patogenesi, tra cui delle

traslocazioni cromosomiche caratteristiche. Una di queste è la traslocazione

t(11;18), assente nei linfomi nodali, che provoca una fusione dei geni APJ2-

MALT1, il cui trascritto è probabilmente implicato nella sopravvivenza delle

cellule linfomatose attraverso meccanismi di inibizione dell’apoptosi. Questa

traslocazione pare essere un fattore predittivo di progressione di malattia, in

quanto non è stata riscontrata nei linfomi che regrediscono in seguito ad

eradicazione dell’infezione da Helicobacter pylori. Oltre a ciò, recenti studi hanno

osservato un’aumentata espressione di alcuni geni spesso associati a quadri di

malignità (lamin receptor-1, MDR-1, calgranulina A/Mrp-8), e una iper-

espressione di alcuni markers quali CD1c, CD40, CD44, CD53, CD83, CD86 e

membri della famiglia delle proteine HLA-D (particolarmente sovra-regolate nei

linfomi MALT). In aggiunta, sono state rinvenute metilazioni aberranti del DNA

a livello di vari geni, aspetto che probabilmente riveste un ruolo critico nella

patogenesi della malattia (60). Uno studio di Lehours et al. mette in relazione alla

patogenesi del linfoma MALT gastrico l’espressione degli antigeni Lex e Ley,

presenti nella porzione polisaccaridica del LPS di Helicobacter pylori e

probabilmente implicati nei meccanismi di sensibilizzazione dei linfociti T (61).

L’eradicazione dell’infezione è un provvedimento terapeutico indispensabile per

la remissione del linfoma. Sono stati condotti a riguardo numerosi studi che hanno

mostrato come la terapia anti-Helicobacter provochi una remissione di malattia,

totale o parziale, in pazienti affetti da MALT di basso grado in un’altissima

percentuale di casi (62). Tuttavia esiste una variabilità che è riconducibile a alcuni

fattori predittivi, la cui individuazione permette di capire quali pazienti

effettivamente trarranno beneficio dalla terapia antibiotica. In particolare questi

fattosi sono: il grado di malignità, lo stadio della malattia, la documentata

positività all’infezione, alcuni fattori demografici (età e sesso principalmente,

questi ultimi hanno una valenza limitata) e la durata del follow-up (49).

36

1.6 Manifestazioni extra-digestive

Qui di seguito verranno descritte una serie di patologie provocate da Helicobacter

pylori che esulano dal contesto gastro-intestinale.

a) Apparato cardiovascolare

Per quanto riguarda l’apparato cardiovascolare, da lungo tempo

l’aterosclerosi è stata accostata ad agenti infettivi, e, di conseguenza, la

cardiopatia ischemica è presto divenuta protagonista di studi circa questo tipo di

interazione. Studi sulla possibile compartecipazione infettiva hanno avuto come

protagonisti vari agenti patogeni, tra cui il virus Coxackie B4, il Cytomegalovirus,

l’Herpes simplex e la Chlamidia pneumoniae. Anche l’Helicobacter pylori è stato

chiamato in causa nella patogenesi della cardiopatia ischemica, e tale correlazione

è supportata da varie evidenze epidemiologiche. Il primo a mettere in relazione i

due fattori, Helicobacter e cardiopatia ischemica, è stato uno studio di Mendall et

al. del 1994 (63). Questo lavoro ha evidenziato l’alta prevalenza di infezione in un

campione di pazienti affetti da cardiopatia ischemica, e, soprattutto, in soggetti

infetti dall’età pediatrica. Altri studi in seguito hanno avvalorato questa tesi:

Pellicano et al., tramite misurazione delle IgG anti-Helicobacter pylori in pazienti

ricoverati presso l’Unità di Terapia Intensiva Coronarica dell’ospedale di Novi

Ligure, hanno riscontrato l’infezione nel 77% dei casi osservati (64).

Una review del 2007 curata da Manolakis et al. ha suddiviso gli studi riguardanti

la cardiopatia ischemica Helicobacter-correlata in vari “focus” patogenetici:

1. Lipidi: esistono evidenze sull’alterazione del bilancio delle lipoproteine e dei

trigliceridi in corso di infezione da Helicobacter. Le concentrazioni di HDL in

buona parte dei lavori risultavano essere basse, in maniera del tutto opposta ai

valori di trigliceridi e LDL. Queste rilevazioni sono state effettuate con

concomitante ricerca delle IgG e IgA anti-Helicobacter, e sono stati registrati

reperti significativi anche in campioni di non fumatori e non diabetici, con

aggiustamenti fatti per indice di massa corporea, età e classe sociale.

37

2. Infiammazione: la presenza di un processo infiammatorio cronico in corso di

infezione ha un ruolo decisamente importante (66). Questa ipotesi può essere

spiegata dalla presenza cronica in circolo di alti valori di citochine infiammatorie,

in particolare di IL-6, TNF-α, IL-1b e IL-8, che decrementano considerevolmente

in seguito ad eradicazione. Inoltre la sovra-espressione di molecole di adesione

promossa dall’Helicobacter pylori risulta essere correlabile all’instaurarsi e

all’aggravarsi di quadri di cardiopatia ischemica.

3. Assetto coagulativo: alti valori di fibrinogeno sono stati evidenziati in pazienti

con Helicobacter pylori, con considerevole diminuzione dopo terapia antibiotica

mirata. In questo senso, sono stati riscontrati anche alti livelli di protrombina in

pazienti con gastrite da Helicobacter pylori, confrontati con soggetti sani o con

gastrite Helicobacter-negativa. Inoltre, in modelli murini, è stata riscontrata

un’aumentata aggregazione piastrinica.

4. Omocisteinemia: in pazienti con Helicobacter pylori sono stati osservati alti

livelli sierici di omocisteina associati a riduzione di folati e diminuito

assorbimento di vitamina B12 (situazione importante anche da un punto di vista

neurologico, vedi seguito).

5. Cross-reattività: ipotesi importante è quella circa il mimetismo molecolare tra

antigeni del batterio e proteine omologhe self. Un esempio è dato dal

rinvenimento di anticorpi diretti contro una particolare proteina, hsp65, dei quali è

stato osservato un sostanziale decremento in seguito ad eradicazione

dell’Helicobacter. Inoltre, gli anticorpi anti-CagA pare reagiscano con

componenti citoplasmatiche e nucleari delle cellule muscolari liscie e endoteliali

6. Danno diretto: alcuni evidenze si sono incentrate, infine, sulla ricerca del DNA

batterico nelle placche aterosclerotiche con metodiche di polimerase chain

reaction (65).

I processi infettivi cronici si collocano come fattori di rischio importanti anche per

un’altra patologia altamente debilitante, lo stroke, e la loro identificazione e

terapia può contribuire alla profilassi. In questo caso, però, non è il singolo

batterio ad essere determinante, ma la pluralità dei patogeni a cui un soggetto può

essere esposto, e tra questi non va trascurato anche l’Helicobacter pylori (67).

38

b) Apparato respiratorio

In pazienti con reflusso gastro-esofageo e concomitante infezione da

Helicobacter pylori, qualora il batterio dovesse ritrovarsi all’interno del materiale

refluito, questo potrebbe colonizzare il sistema respiratorio e, potenzialmente,

scatenare un’infiammazione. E’ stata presa in esame una possibile relazione

dell’infezione con alcune patologie polmonari ostruttive croniche (COPD),

osservando la sieroprevalenza dell’infezione mediante titolazione delle IgG anti-

Helicobacter in pazienti affetti da tali patologie, e valutando la FEV1 (Forced

expiratory volume in 1 second) in un gruppo di pazienti Helicobacter-positivi e

negativi. Nel gruppo di soggetti positivi, è stata osservata una riduzione della

FEV1 più marcata rispetto ai pazienti negativi, il che suggerisce un’associazione

quantomeno prognostica con l’infezione (68).

E’ stata ipotizzata anche un’associazione tra l’esposizione al batterio e le

patologie allergiche respiratorie. Infatti secondo la “hygiene hypotesis”,

l’esposizione ai microbi, e in particolare alle infezioni croniche, attraverso lo

sviluppo di un fenotipo immunitario meno suscettibile, pare protegga dalle

manifestazioni allergiche e, nel caso dell’apparato respiratorio, soprattutto

dall’asma bronchiale. Tuttavia, gli studi condotti a riguardo non hanno chiarito a

fondo questa possibile associazione (69). E’ stato condotto anche uno studio sul

possibile ruolo patogenetico dell’Helicobacter pylori con la presenza di

bronchiectasie, tuttavia senza un riscontro positivo (70).

Interessante è, invece, una meta-analisi realizzata da Zuho et al., che metteva in

relazione l’infezione da Helicobacter e il carcinoma polmonare (71). Questa

ipotesi è nata dal presupposto che il polmone condivida le stesse origini

embrionali (endoderma) con le cellule che costituiscono l’apparato digerente.

Zuho et al. hanno selezionato quattro studi caso/controllo, e hanno osservato una

prevalenza dell’infezione da Helicobacter pylori nel 75.5% dei pazienti affetti da

carcinoma e il 57.1% nei controlli. Probabilmente, il meccanismo scatenante

risiede nella up-regulation dell’espressione della gastrina, della quale è

riconosciuta l’attività promuovente la proliferazione cellulare e l’angiogenesi.

Allo stesso tempo anche tossine, fattori di virulenza (CagA soprattutto) e

componenti batteriche possono rendere le cellule bronchiali maggiormente

39

responsive all’azione lesiva di sostanze genotossiche, come il fumo di sigaretta o

alcune componenti dell’inquinamento ambientale (72).

Un’altra patologia neoplastica dell’apparato respiratorio in cui l’Helicobacter

pylori può giocare un ruolo è il carcinoma laringeo. Sempre Zuho et al., in un

lavoro precedente a quello sopra riportato, suggerivano che l’infezione, associata

a reflusso gastro-esofageo e all’indebolimento della mucosa laringea da parte di

tossici ambientali e fumo di sigaretta, potesse essere determinante, seppure in

maniera indiretta, nella patogenesi di questa neoplasia (73)

c) Sistema nervoso

L’Helicobacter pylori potrebbe essere implicato nella patogenesi anche di alcune

patologie neurologiche, prima fra queste la malattia di Alzheimer. Sono stati

valutati i livelli di IgG anti-Helicobacter nel liquido cerebro-spinale di alcuni

pazienti affetti da morbo di Alzheimer, con incremento significativo rispetto ai

controlli, e miglioramento in seguito ad eradicazione (75). I possibili meccanismi

patogenetici sono svariati: la gastrite cronica da Helicobacter pylori, per esempio,

provoca un malassorbimento di vitamina B12 e folati, con difetto nel meccanismo

di metilazione del 5-metil-tetraidrofolato e accumulo di omocisteina. La stessa

omocisteina può dare il via a meccanismi di danno endoteliale che hanno come

risultato disordini atero-trombotici, contribuendo all’insorgere dell’Alzheimer.

Figura 18 - Possibili modalità attraverso le quali l'Helicobacter pylori può contribuire alla patogenesi della

malattia di Alzheimer

40

La stessa omocisteinemia, inoltre, può essere considerata un fattore prognostico di

gravità della demenza. L’Helicobacter pylori, per giunta, promuove l’incremento

dell’aggregazione piastrinica e il rilascio di un grosso quantitativo di citochine

pro-infiammatorie, fattori vasoattivi, eicosanoidi, e proteine di fase acuta, tutte

sostanze coinvolte in disordini di tipo vascolare. L’induzione delle cellule

mononucleate a produrre fattori pro-coagulanti che convertono il fibrinogeno in

fibrina, la formazione di radicali liberi dell’ossigeno (che danneggiano la barriera

endoteliale e promuovono l’adesione leucocitaria) e l’incremento della

produzione di ossido nitrico, sono tutti fattori che possono compartecipare alla

compromissione cerebrale (fig. 18) (76-77).

Le infezioni del tratto gastro-enterico sono state chiamate in causa anche per

un'altra patologia neurologica, il parkinsonismo idiopatico. Tra i possibili

patogeni presi in considerazione come fattori modificanti la prognosi, è stato

quotato anche l’Helicobacter pylori, risultando essere un elemento prognostico

sfavorevole (78). E’ stato osservato che il batterio è in grado di sfruttare l’L-

Dopa per i propri fini di sintesi e colonizzazione della mucosa gastrica (cosa che è

stato possibile valutare in terreni di coltura arricchiti con L-Dopa e noradrenalina,

con accelerazione dei processi di crescita del batterio), con conseguente

alleviamento in seguito a terapia eradicante (79). Inoltre l’infezione da

Helicobacter pylori pare possa contribuire nel peggioramento stesso della

malattia, con passaggio da un parkinsonismo ipercinetico ad un quadro bradi-

ipocinetico (80).

d) Sistema endocrino

Per quanto riguarda la patologia endocrina, studi effettuati negli ultimi

anni hanno preso in considerazione il possibile ruolo patogenetico

dell’Helicobacter pylori nell’insorgenza di patologie tiroidee, in particolare di

natura autoimmune. Questa associazione (posta anche la relazione tra tali auto-

anticorpi e quelli anti-tireoperossidasi e anti-tireoglobulina) è stata maggiormente

osservata in pazienti con infezione da ceppi CagA-positivi, con produzione di

auto-anticorpi monoclonali anti-CagA cross-reagenti con proteine della colloide

tiroidea. Inoltre nel contesto dell’isola di patogenicità cag è stato riscontrato un

gene codificante una perossidasi endogena, con possibile produzione di

immunoglobuline anche verso analoghi self (81). L’associazione Helicobacter

41

pylori-tiroide pare essere anche correlata ad un particolare profilo

immunogenetico legato agli antigeni HLA (nello specifico A1, B8 e

DRB1*0301), dato estrapolato da uno studio su pazienti di giovane età (82). A

rafforzare questa tesi contribuisce il dato della riduzione del titolo degli anticorpi

anti-tiroide in pazienti con infezione da Helicobacter pylori, osservato in seguito

ad eradicazione del batterio (83).

Altra patologia endocrina chiamata in causa tra le manifestazioni extra-digestive è

il diabete mellito. In alcuni studi, tuttavia, non è stata trovata alcuna relazione tra

l’infezione e lo status glicemico (84-85-86). Al contrario, uno studio di Gunji et

al. (2009) esaminava l’associazione tra l’infezione da Helicobacter pylori e

l’insulino-resistenza, dimostrando che “l’infezione da Helicobacter pylori

contribuisce significativamente e indipendentemente nel promuovere l’insulino-

resistenza in una popolazione asintomatica” (87). Wang et al, in uno studio

condotto su 130 pazienti con diabete mellito di tipo II, hanno dimostrato che

l’Helicobacter influisce sui livelli di glicemia giornalieri (88). Un’altra prova

giunge da uno studio di Estraghian et al., in cui su 71 pazienti asintomatici, 43

riportavano infezione da Helicobacter pylori e elevati livelli di insulina sierica a

digiuno, il che sottolinea la possibile relazione tra i due fattori (89). Importante è

anche il dato relativo a un lavoro di So et al (2009), in cui si prendevano in

considerazione gli effetti dell’infezione sulle cellule β pancreatiche su una

popolazione di 288 soggetti. In questo studio, è stato notato come il titolo di

anticorpi anti-Helicobacter pylori, così come il livello di adiponectina e di

leucociti, fossero fattori predittivi indipendenti per iperglicemia e ridotta

sensibilità all’insulina, cosa che contribuisce alla spiegazione dell’alta percentuale

di soggetti affetti da diabete di tipo II (nella fattispecie nella popolazione cinese) e

di come ciò, almeno in questo caso, sia slegato dallo stato di obesità (90).

e) Manifestazioni ematologiche

L’Helicobacter pylori potrebbe rivestire un importante ruolo in una

situazione clinica molto comune, l’anemia ipocromica iposideremica.

Recentemente sono stati condotti degli studi in America Latina (esattamente in

Bolivia, Brasile, Cuba, Messico e Venezuela) senza alcun riscontro

epidemiologico associativo (91). Tuttavia, in queste nazioni la componente

iposideremica delle anemie risulta essere minore rispetto al resto del mondo, e ciò

42

è dovuto anche al fatto che altre cause, tra cui malaria, schistostomiasi, carenze

alimentari e condizioni ereditarie (sferocitosi, talassemia), spesso non vengono

segnalate nel raccordo anamnestico dei soggetti presi in esame, compromettendo i

risultati degli studi (76). Contrariamente a queste osservazioni, infatti, altri studi

hanno portato avanti questa ipotesi: in uno studio condotto su bambini di età

compresa tra 7 e 12 anni, è stata osservata una significativa relazione tra il livello

sierico di ferro, la ferritinemia e il titolo di IgG anti-Helicobacter pylori, la cui

conclusione è che l’infezione da Helicobacter pylori può quantomeno influenzare

l’andamento dell’anemia sideropenica (92). Una meta-analisi di Zhang et al.,

redatta nel 2010, metteva in relazione gli effetti dell’eradicazione del batterio con

l’assetto marziale di pazienti affetti da anemia sideropenica. Sono stati inclusi

nello studio 8 studi per un totale di 800 partecipanti, osservando che, in seguito a

terapia eradicante condotta con successo, in un sottogruppo di pazienti si

osservava un incremento dei livelli ferritina (a un mese e a due mesi dall’inizio

del trattamento). Nelle conclusioni, gli autori di questo studio suggeriscono un

probabile ruolo dell’Helicobacter pylori nell’ostacolare l’assorbimento orale di

ferro e, quindi, nel contribuire allo sviluppo di una iposideremia (93). Oltre a

questo, il possibile sanguinamento occulto in pazienti con erosioni del tratto

gastro-intestinale (specie se affetti da ceppi CagA-positivi) può sortire lo stesso

effetto. In soggetti portatori di infezione cronica da Helicobacter pylori, inoltre,

sono stati riscontrati anticorpi anti-H+,K+-ATPasi, o comunque una auto-

immunità esaltata, e da ciò è possibile supporre un’origine auto-immunitaria

anche per l’anemia sideropenica Helicobacter-indotta (94).

Sempre nel contesto della patologia ematologica, l’Helicobacter pylori è stato

accostato anche alla porpora trombocitopenica idiopatica. In svariati studi è

stata osservato un incremento delle piastrine in seguito a eliminazione del

batterio, in contrapposizione, tuttavia, ad altri studi in cui non è stato riscontrato

alcun beneficio dalla terapia eradicante (citato in 72). Ciò nonostante, Scandellari

et al. suggerivano che il possibile ruolo dell’Helicobacter in questa particolare

patologia potesse essere appannaggio dei ceppi CagA-positivi. In pazienti affetti

da questa variante batterica, l’eradicazione ha sortito un effetto positivo

soprattutto nel gruppo di pazienti con anticorpi anti-CagA. Da ciò i ricercatori

hanno ipotizzato che ci potessero essere analogie tra CagA e alcune componenti

peptidiche piastriniche, e, di conseguenza, un possibile meccanismo di mimetismo

43

molecolare alla base dell’associazione tra questo particolare tipo di porpora e

l’Helicobacter pylori. Concludendo, gli autori di questo studio consigliano lo

screening e l’eradicazione del batterio in pazienti affetti da porpora

trombocitopenica idiopatica, specie se con presenza di anticorpi anti-CagA (95).

f) Manifestazioni reumatologiche

La partecipazione degli agenti infettivi nella patogenesi delle malattie

reumatiche è un punto che si è andato sempre più definendo negli ultimi venti

anni, riconoscendo predisponente l’attività artritogenica di virus e batteri. Non

sempre, però, è possibile isolare i microrganismi responsabili proprio a causa del

sistema immunitario, particolare che, naturalmente, lascia un velo di dubbio sulla

loro reale partecipazione (96).

La documentata attività promotrice dell’autoimmunità da parte dell’Helicobacter

pylori è stata chiamata in causa anche per la patologia reumatica, in particolare

per la Sclerosi Sistemica. Sebbene alcuni studi non abbiano rilevato una

correlazione tra tale patologia, il fenomeno di Raynaud che spesso si accompagna

a essa e l’infezione da Helicobacter pylori (97), altri lavori hanno, invece,

osservato un incrementato tasso di infezione, soprattutto da parte di ceppi CagA-

positivi, in pazienti con Sclerosi Sistemica (98). Alla base dell’associazione,

ritroviamo anche in questo caso il mimetismo molecolare, le reazioni

autoimmunitarie e l’attivazione della risposta cellulo-mediata (99).

Un'altra possibile associazione vagliata è quella con la Sindrome di Sjögren,

tuttavia i risultati di vari studi condotti a riguardo risultano essere contrastanti

(100-101).

Il ruolo dell’Helicobacter pylori nelle malattie reumatiche è stato investigato

anche per le malattie del connettivo. In particolare, uno studio di Kalabay et al.

(2002) poneva particolare attenzione sulla presenza di anticorpi cross-reagenti

tra la proteina hsp60 umana (heat shock protein 60) e la proteina hsp65

micobatterica, evento spesso presente nei disturbi autoimmuni concomitanti ad

infezione da Helicobacter. Alti livelli di anticorpi anti-hsp65 sono stati rilevati nei

pazienti affetti delle patologie sopra citate e Helicobacter-positivi, rispetto al

controllo di pazienti non infetti, suggerendo un possibile ruolo del batterio in tali

patologie autoimmuni (102). Quest’ultimo dato, tuttavia, trova come punto debole

44

la sieroprevalenza, che risulta essere bassa per quanto riguarda patologie quali

Lupus Eritematoso Sistemico, Dermato-polimiosite, Artrite Reumatoide e

Sindrome di Raynaud Primitiva (102-103).

g) Cute

Quello dermatologico è un altro possibile scenario in cui l’Helicobacter

pylori può avere una parte. Le evidenze al momento presenti in letteratura

indirizzano verso un collegamento con alcune patologie, in particolare con

l’orticaria cronica. Uno studio del 2009 di Abdou et al., si è avvalso di biopsie

effettuate tramite gastroscopia in 35 pazienti affetti da questo particolare disturbo,

per verificare l’effettiva incidenza dell’infezione e il suo eventuale collegamento

con l’orticaria cronica. Il 57% di essi erano positivi per l’Helicobacter pylori e

accusavano una sintomatologia più severa rispetto al resto del campione, con

remissione in seguito a terapia antibiotica specifica (104). Sempre sull’efficacia

della terapia eradicante in questa associazione, Akashi et al. hanno condotto uno

studio su 17 pazienti affetti da orticaria cronica e prurigo chronica multiformis,

evidenziando un effettivo miglioramento soprattutto nei soggetti con quest’ultima

variante. Gli autori, in definitiva, suggerivano di prendere in considerazione la

terapia eradicante, soprattutto in casi intrattabili proprio per il possibile ruolo

aggravante dell’Helicobacter pylori (105).

L’acne rosacea (o semplicemente rosacea) è una dermatite cronica che interessa

di solito l'area centrale del volto, e si manifesta con eritema, teleangectasie e

lesioni acneiformi. L’etiopatogenesi è incerta, e proprio a questo riguardo è stata

indagata la possibile causa infettiva, ponendo particolare riguardo per alcuni

patogeni quali Helicobacter pylori, Staphylococcus epidermidis e Chlamidia

pneumoniae. Sebbene alcune osservazioni risultino essere poco convincenti (106),

esistono in letteratura evidenze di un possibile ruolo proprio dell’Helicobacter

pylori. Effettivamente la prevalenza dell’infezione in pazienti affetti da rosacea è

risultata essere significativamente più elevata rispetto ai non infetti, dato rilevato,

ad esempio, in un lavoro effettuato nella città iraniana di Kerman nel 2003, in cui

su 29 individui affetti da rosacea i livelli di IgG anti-Helicobacter apparivano

45

nettamente maggiori rispetto al controllo (107). Oltre a ciò è stato evidenziato un

miglioramento della sintomatologia (sebbene in diversi gradi) in seguito a terapia

eradicante, soprattutto nei soggetti con variante papulo-pustolosa (108).

Altre due patologie dermatologiche sulle quali è possibile trovare in letteratura

delle associazioni con l’Helicobacter pylori sono il lichen planus e la psoriasi.

Per quanto riguarda la prima, è stato condotto uno studio basato su rilevamenti

bioptici endoscopici, che ha0 evidenziato la presenza di DNA batterico sia nelle

lesioni orali sia in quelle gastriche (109). Qayoom e Ahmad, invece, hanno

condotto uno studio sulla prevalenza dell’infezione in soggetti psoriasici del

dipartimento di dermatologia di Srinagar, nel Kashmir, con valori di IgG anti-

Helicobacter sì inscrivibili nei range di aspettativa per la regione in esame, ma

significativamente aumentati nel gruppo in esame rispetto al controllo di pazienti

non infetti (110).

h) Tessuto osseo

In letteratura esistono alcuni lavori che considerano l’osteoporosi come

una possibile manifestazione extra-digestiva dell’infezione da Helicobacter

pylori. Per la verità si tratta di un numero limitato di studi, ma da cui, tuttavia, si

può estrarre qualche dato interessante.

Nel 2005, Figura et al. si avvalsero della misurazione delle concentrazioni di

citochine regolatrici del turn-over osseo (TNF-α, IL-6 etc.) per verificare la

prevalenza di infezione (specie da parte di ceppi CagA-positivi) in pazienti

maschi affetti da osteoporosi, e, eventualmente, dimostrare l’esistenza di una

relazione tra i due fattori. Le differenze tra le concentrazioni dei vari markers,

sebbene differenti tra caso e controllo, non hanno raggiunto valori statisticamente

significativi, tuttavia è emerso che l’Helicobacter pylori può essere considerato

tra i fattori di rischio per l’osteoporosi maschile (111).

Kakehasi et al., in due lavori del 2007 e del 2009, tramite densitometria ossea,

hanno ricercato una possibile via attraverso la quale l’Helicobacter pylori potesse

incidere sull’insorgenza dell’osteoporosi in epoca post-menopausale, e di come la

gastrite cronica agisse sulla densità minerale dell’osso nelle donne, senza tuttavia

trovare una correlazione precisa in entrambi i casi (112-113).

46

Ozdem et al., invece, nel 2007, tramite misurazione dei markers di turn-over

osseo, hanno ricercato l’eventuale esistenza di un rimaneggiamento osseo in corso

di infezione nei bambini, osservando, però, soltanto una diminuzione dei livelli di

vitamina B12 (114).

i) Patologia urologica

Una review di Mohammed Al-Marhoon del 2008, si poneva come quesito

il ruolo dell’Helicobacter pylori nella patologia urologica, raccogliendo le

evidenze a carico sia di patologie neoplastiche sia di altra natura. Per quanto

riguarda il rene, è raccomandata l’eradicazione del batterio, qualora presente, in

pazienti uremici prossimi al trapianto, e, inoltre, è stata osservata un’aumentata

suscettibilità al linfoma renale in soggetti oltre i cinquanta anni di età ed infetti. A

livello della vescica, anche in questo caso la presenza del batterio è stata messa in

relazione con una maggiore incidenza di linfomi, con sostanziale regressione in

caso di eradicazione. La patologia prostatica, invece, è stata accostata

all’Helicobacter pylori soprattutto per il possibile concorso di quest’ultimo nello

sviluppo di prostatiti a carattere cronico. Probabilmente la relazione sta nello

sviluppo di una reazione infiammatoria secondaria ad antigeni sconosciuti, con un

aumento significativo di citochine rilevabili anche nel liquido seminale,

diventando quindi una possibile causa occulta. La patologia neoplastica è ancora

una volta riconducibile all’insorgenza di linfomi, probabilmente in seguito ad

eventi infiammatori cronici con sviluppo di tessuto displastico (115).

j) Patologia ginecologica

Per quel che concerne le patologie di interesse ginecologico, sono presenti

in letteratura alcuni studi circa le implicazioni dell’Helicobacter pylori nella

sindrome dell’ovaio policistico. E’ noto che le infezioni croniche possono

aumentare il rischio di infertilità nelle donne, e la PCOS è una delle cause più

comuni proprio di questa condizione. A questo riguardo è stata osservato un’alta

sieropositività in pazienti portatrici di tale sindrome evidenziata tramite ricerca

delle IgG specifiche (116).

Sono state inoltre prese in esame alcune patologie ostetriche, in particolare

l’iperemesi gravidica e la pre-eclampsia. L’esposizione all’Helicobacter pylori

sembra sia associata ad un incrementato rischio di iperemesi gravidica, sebbene

47

sia presente un’eterogeneità tra risultati di vari studi (117). Per quanto riguarda

invece la pre-eclampsia, è stato osservato un incremento della prevalenza e del

rischio di gestosi nelle pazienti portatrici del batterio (118).

k) Infertilità

Le modalità con cui l’Helicobacter pylori può interferire con la fertilità sia

femminile sia maschile (soprattutto per questa trattazione) verranno esposte nel

capitolo 2 e nella sezione sperimentale.

1.7 Diagnosi di infezione

Di seguito verranno esposte brevemente le metodiche attraverso le quali è

possibile effettuare diagnosi di infezione da Helicobacter pylori. Possiamo

suddividere le tecniche a nostra disposizione in due categorie: metodiche non

invasive e invasive.

a) Tecniche non invasive

I test non invasivi sono fondamentali per il management dei pazienti con

infezione, in quanto di più facile e ripetibile esecuzione e indispensabili nella

strategia “test and treat”.

Quest’ultimo punto prevede di effettuare questo tipo di test in pazienti di età

inferiore a 45 anni, non dispeptici, che non assumono FANS e in assenza di

“sintomi di allarme”. Inoltre tali metodiche sono di estrema utilità nel controllo di

pazienti trattati per valutare l’effettiva eradicazione del batterio.

48

� Analisi sierologica

La ben nota risposta anticorpale all’invasione della mucosa determina la

produzione di IgA e IgM a livello locale (riscontrabili nei succhi gastrici) e IgG

sistemiche. Le tecniche di valutazione degli anticorpi sono molteplici, tuttavia

risultano essere più convenienti quelle su “fase solida”, ovvero basati sul legame

di un antigene su una micropiastra e successiva reazione con gli anticorpi

specifici, presenti nel campione, e anticorpi marcati con molecole fluorescenti o

radioattive.

La metodica ELISA (Enzime Linked ImmunoAdsorbent Assay) , di gran lunga la

più utilizzata, si basa sulla coniugazione dell’anticorpo con enzimi (perossidasi,

fosfatasi alcalina) e sull’aggiunta di coloranti (p-nitrofenilfosfato) per determinare

la presenza di antigeni specifici o anticorpi specifici, con una specificità del 85%

e una sensibilità del 78%. Altre tecniche utili sono il Western Blot, che sfrutta la

separazione delle proteine cellulari tramite elettroforesi, e le reazioni di

agglutinazione con gelatine particolari o sfere di lattice.

L’efficacia dell’indagine sierologica è evidente soprattutto a scopi epidemiologici

o per indagini sui ceppi particolari, quali per esempio i CagA-positivi, oppure per

studi di patogenesi. Per quanto riguarda invece la diagnosi di infezione in atto (ci

danno solo dati sull’avvenuto contatto con il batterio ma non di infezione attiva) o

l’avvenuta eradicazione, queste metodiche sono poco attendibili, in quanto per

avere una significativa riduzione del titolo dell IgG anti-Helicobacter sono

necessari almeno 6 mesi, con una diminuzione media del 25% a 3 mesi e del 50%

a 6 mesi.

� UBT, Urea Breath Test

Analogamente al test all’ureasi, questo sistema sfrutta la capacità del

batterio di produrre questo particolare enzima. Viene utilizzata dell’urea marcata

con 14C o 13C (in Europa si utilizza il 13C), che diffondono attraverso lo strato

mucoso e vengono scisse in anidride carbonica e ammonio. Dopo poco tempo, è

possibile riscontrare l’isotopo marcato nel respiro, in quanto questo diffonde nei

49

vasi della mucosa gastrica. Previa sospensione di terapie a base di PPI, antibiotici

e bismutati almeno una settimana prima del test, viene fatto ingerire il composto

al paziente, determinando poco dopo nell’aria espirata la concentrazione di CO2

tramite apposito scintillatore, che esprime la radioattività in termini percentuali.

La sensibilità e la specificità del test si aggirano intorno al 97% e al 95%. Ad

oggi, il test UBT è considerato il gold standard non invasivo per la

determinazione dell’infezione da Helicobacter pylori.

.

� Determinazione degli antigeni fecali

Un altro strumento a disposizione del clinico per la determinazione

dell’infezione è il test immunoenzimatico su un campione di feci. Sensibilità e

specificità di questa metodica si aggirano intorno al 91% e al 93%, e alcuni studi

(in particolare l’European Helicobacter pylori study group nel 2000 e 2005)

raccomandano l’esecuzione di tale test in concomitanza con l’UBT, per una

diagnosi di certezza e in corso di follow-up.

b) Tecniche invasive

� Valutazione istologica

Le tecniche di diagnosi invasive presuppongono un approccio

endoscopico, tramite il quale è possibile un campionamento seriato della mucosa

e la successiva analisi. Alcuni dati suggeriscono che l’esecuzione di una sola

biopsia, effettuata lungo la piccola curvatura, garantisca la positività del campione

nella quasi totalità dei casi, tuttavia la sensibilità dell’esame può essere

implementata attraverso l’ulteriore campionamento di tessuto a livello dell’antro e

del fondo gastrico, soprattutto in uno stomaco con presenza di metaplasia. Una

volta campionato, il tessuto viene sottoposto a doppia colorazione ematossilina-

eosina, permettendo così la valutazione del grado di flogosi e del relativo

infiltrato infiammatorio. Le colorazioni Giemsa o Genta, inoltre, permettono

l’identificazione del batterio nel campione. Naturalmente, l’endoscopia permette

50

la valutazione della mucosa gastrica, e ciò rende questa metodica estremamente

utile specie in pazienti con gastrite manifesta e/o metaplasia.

� Esame colturale

Sempre grazie all’esame endoscopico è possibile prelevare materiale per

valutare l’infezione da Helicobacter pylori tramite coltura. E’ necessario

effettuare l’esame colturale in breve tempo, a causa della facilità con cui in

ambiente esterno il batterio perde le sue caratteristiche (anche se le biopsie

possono essere conservate per 24h a 4°C in un apposito medium). I terreni di

coltura utilizzati sono basati generalmente sulla formula agar-sangue, con

aggiunta di sostanze quali ciclodestrina, albumina bovina o antibiotici per creare

terreni selettivi. Come già descritto

nelle sezioni precedenti, il batterio

predilige condizioni di micro-aerofilia

(5% O2, 5-10% CO2), a una temperatura

di 37 °C per minimo sette giorni.

La specificità della tecnica è

elevatissima, tuttavia la sensibilità può

essere inficiata da inadeguato

campionamento, esposizione delle

coltura ad aria o operatore-dipendenza.

Anche in questo caso, ai fini di una corretta esecuzione, è necessaria la

sospensione da parte del paziente di terapie a base di PPI da almeno due

settimane.

� Test all’ureasi

La presenza di elevate concentrazioni dell’enzima ureasi al di sotto dello

strato di muco della parete gastrica in corso di infezione da Helicobacter pylori, è

alla base di quest’ultima tecnica che, solitamente, completa l’esame endoscopico.

Prelevato il campione di tessuto, questo viene messo a contatto con una soluzione

contenente urea: il test risulta essere positivo qualora, in presenza dell’enzima e,

quindi, dell’infezione, avvenga una scissione dell’urea, cosa che rende alcalina la

Figura 19 - Test all'ureasi: reperto positivo (a

destra), con caratteristico viraggio della

colorazione, e controllo (a sinistra).

51

soluzione. Ciò viene apprezzato attraverso un indicatore di pH, che evidenzia un

viraggio nella colorazione (figura 19). Questo test ha un’elevata accuratezza

diagnostica, tuttavia la sensibilità dipende dal numero di batteri presenti nella

biopsia e dallo spessore dello strato di muco (esso, infattti, può inficiare l’esame

se in pazienti con carica batterica importante esiste un elevato grado di gastrite,

con assottigliamento dello strato e una bassa rappresentazione di ureasi). Anche in

questo caso sono raccomandate biopsie multiple.

� Indagini molecolari

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è sicuramente la metodica

molecolare più utilizzata a scopo di ricerca per le indagini di infezione, soprattutto

per valutare la presenza di Helicobacter pylori nelle biopsie, nel succo gastrico,

nelle feci e in altri distretti. Sono parecchi i loci target di amplificazione utilizzati

per diversi primer, e tra questi ricordiamo il 16s RNA, i loci delle ureasi (A, B e

C), i loci di varie citotossine (vacA e cagA) e quello delle proteine da shock

termico. Inoltre alcune metodiche di amplificazione nucleica possono essere

utilizzate per la ricerca in campo terapeutico, come per esempio le antibiotico-

resistenza dovute a mutazioni puntiformi.

2. Infertilità

2.1 Definizione

Il concetto di infertilità è comunemente sovrapposto a quello di sterilità,

sebbene i due termini sottintendano due significati tecnicamente differenti. In

effetti, effettuando una semplice ricerca su internet è facile incappare in una

moltitudine di definizioni diverse, spesso discordanti o addirittura contraddittorie.

Storicamente, le idee stesse di infertilità e sterilità sono state quasi esclusivamente

relegate al sesso femminile, tuttavia le evidenze accumulatesi nel corso dei

52

decenni hanno contribuito a delineare con maggiore specificità il ruolo della

componente maschile e alla nascita del concetto di “coppia infertile” o “sterilità

di coppia”, inteso come una condizione di impossibilità nel riprodursi non ancora

approfondita clinicamente.

Sfogliando alcuni vecchi testi, nella donna, il termine sterilità sta ad indicare

l’assoluta incapacità riproduttiva, mentre per infertilità è descritta l’inidoneità

della gestante a portare a compimento una gravidanza fino all’epoca di vitalità del

feto. Nell’uomo, il concetto è più articolato, in quanto per uomo infertile viene

inteso il soggetto portatore di una qualche insufficienza del liquido seminale,

inadatto quindi a concepire. Quella di maschio sterile, invece, è una

rappresentazione che contempla l’assoluta mancanza di spermatozoi vivi e/o

validi nell’eiaculato (119).

Ad oggi il Consiglio internazionale per la distribuzione dell’informazione

sull’infertilità (INCIID, International Council on Infertility Information

Dissemination) e la maggior parte degli Autori specificano il concetto di

infertilità come “l’incapacità di concepire dopo un 1 anno di rapporti in assenza

di contraccezione”, presupponendo un sostanziale problema di “performance” a

monte dell’atto della riproduzione (120-121). In questa definizione va inoltre fatta

una distinzione, ovvero tra una infertilità primaria, in cui non è mai stato

possibile il concepimento, ed una secondaria, cioè qualora questa situazione si

verifichi dopo un periodo di documentata fertilità.

2.1 Infertilità femminile

53

L’infertilità femminile è un problema comune, esteso a tutte le latitudini e che

annovera disparate cause, con importanti implicazioni sia di tipo demografico che

in materia di salute pubblica. Una review del 2007 che esaminava studi su 25

popolazioni, con un campione totale di 172.413 donne, indicava una prevalenza di

infertilità del 9%, a fronte di altre stime con dati oscillanti tra il 3% e il 16%.

Basandosi su tale percentuale, Boivin et al. sostengono che ad oggi 72,4 milioni di

donne al mondo sono infertili e 40,5 milioni di esse sono alla ricerca di supporto

medico (esattamente il 56%) (122). Altri studi fissano il dato di prevalenza sul

14% della popolazione femminile mondiale, con valori che possono raggiungere

il 30% nell’Africa Sub-sahariana, il 12% in Europa e il 7.4% negli Stati Uniti.

Uno studio condotto nella provincia di Yazd, in Iran, fissa il dato al 5.3% per le

aree urbane e al 6.8% per le aree rurali, percentuali, quindi, più basse rispetto alle

altre nazioni (123).

Il declino della fertilità femminile (il picco di fertilità si posizione all’età di 23

anni circa) è un evento che si verifica solitamente tra i 32 e i 37 anni d’età per la

progressiva atresia ovarica e la riduzione degli ovociti fecondabili; tuttavia negli

ultimi anni si è assistito ad un netto incremento delle nascite in età superiore ai 30

anni (124).

Il grafico 1 mostra quali sono le cause principali di infertilità femminile, non

tenendo conto però della componente maschile (che risulta essere il 25% di tutte

le cause di infertilità di coppia).

Grafico 1 - Cause principali di infertilità femminile (fonte Stanford University,

www.stanford.edu)

54

Tali percentuali sono abbastanza uniformi in tutto il globo, come testimoniano

studi effettuati in Nigeria (125), Canada (126) o Israele (127-128).

� Infertilità femminile e Helicobacter pylori

Circa il ruolo delle infezioni nell’infertilità femminile si è già accennato

precedentemente; tuttavia il punto da analizzare in questa sede è il possibile

legame tra l’infezione da Helicobacter pylori e questa purtroppo frequente

condizione femminile. I dati in letteratura su questa associazione non sono molti,

tuttavia è possibile ritrovare vari esempi a supporto di questi tesi.

Kurotsuchi et al. incentrarono i loro sforzi sulla plausibilità del nuovo concetto di

“infertilità Helicobacter-correlata” attraverso uno studio retrospettivo su 204

donne. Questo lavoro evidenziò un’aumentata percentuale di sieropositività per

questa infezione nel campione di pazienti con infertilità idiopatica rispetto al

gruppo in cui era riconosciuto almeno un fattore di infertilità; tuttavia in questa

sede non è stato possibile evidenziare un dato epidemiologico significativo (130).

Nel 2010 un’equipe di ricercatori dell’Università degli Studi di Padova ha

pubblicato uno studio che poneva al centro dell’attenzione la presenza di Ig anti-

Helicobacter nel muco cervicale quale causa di infertilità. Sono state arruolate 67

donne con diagnosi di infertilità idiopatica, escludendo turbe ovariche tramite

misurazione ormonale e assenza di patologia tubarica o uterina tramite istero-

salpingografia e ecografia (sia trans-addominale che trans-vaginale). Inoltre sono

state indagate ed escluse infezioni da Chlamydia, Mycoplasma, virus epatitici,

HIV, patogeni del gruppo TORCH ed eventuali cause di infertilità maschile nei

partner. Nelle secrezioni cervicali di pazienti in periodo ovulatorio e positive

all’infezione sono stati individuati alti livelli di IgG anti-Helicobacter. Il muco

cervicale di queste donne è stato fatto interagire con del liquido seminale,

osservando che dopo un’ora soltanto pochi spermatozoi erano stati in grado di

progredire, mentre nel gruppo di controllo (donne non infette) la motilità degli

spermatozoi non è sembrata compromessa (cosa ancora più evidente dopo due

ore). La conclusione cui sono giunti i ricercatori è che la presenza di anticorpi

55

anti-Helicobacter pylori all’interno del muco cervicale possa in qualche modo

interferire con la motilità degli spermatozoi e di conseguenza impedire la

penetrazione di questi ultimi e quindi il concepimento, tuttavia l’esatto

meccanismo attraverso il quale ciò avvenga non è conosciuto. Queste evidenze

fanno sì che l’infezione sia iscritta nelle possibili cause d’infertilità femminile,

essendo assente in questo caso una componente patologica maschile, e fanno dello

screening di questa infezione un’ulteriore utile indagine in caso di infertilità di

coppia senza causa apparente. I titoli di IgG presenti nel muco e nel siero si sono

dimostrati proporzionali, pertanto gli autori dello studio suggeriscono di effettuare

prima uno screening sierico sulle pazienti, seguito dal campionamento del muco

cervicale qualora esse risultassero positive (131).

2.2 Infertilità maschile

2.3.1. Introduzione

Come anche in precedenza anticipato, nel passato, il problema

dell’infertilità vedeva come protagonista esclusiva la donna. Sebbene il problema

sia molto comune, è arduo stabilire quale sia il reale contributo della componente

maschile, cosa soprattutto dovuta alle difficoltà della diagnosi. Il 15% delle

coppie che tentano un primo concepimento ricorrono ad un iter diagnostico per

infertilità a causa dell’insuccesso. L’8% degli uomini in età riproduttiva si avvale

di assistenza medica per problemi legati alla fertilità e di questi l’1-10% riporta

una condizione che compromette il potenziale fecondante, con il varicocele quale

possibile causa più comune (35% circa) (132).

Come anche riportato per l’infertilità femminile, i dati di prevalenza sono diversi

tra le varie regioni del globo, con tassi maggiori nei paesi in via di sviluppo

(anche se da queste zone si hanno pochi dati epidemiologici circa l’infertilità

maschile) (139). Aspetti occupazionali e socio-economici sono stati presi in

considerazione quali fattori di rischio, con particolare attenzione (sebbene i dati

56

non abbiano raggiunto percentuali di elevato interesse statistico) per alcune

categorie di lavoratori, tra cui gli operai delle centrali radio-elettriche, del settore

tipografico e tessile e alcune categorie di impiegati (133). Stando a quanto

riportato da Sherrod e De Coster, non pare esista una differenza della

distribuzione dell’infertilità maschile in popolazioni di razza diversa dello stesso

paese: per esempio negli Stati Uniti non si osserva una significativa diversità

statistica tra soggetti afro-americani e caucasici (134).

Il problema di fondo resta comunque la diagnosi precoce, in quanto ancora oggi

larga parte degli uomini non si sottopone ad indagini di approfondimento.

L’Organizzazione Mondiale della Sanità ha proposto uno schema per la

classificazione diagnostica dell’infertilità maschile basata su un approccio

standardizzato attraverso la valutazione clinica e spermiografica dei pazienti,

tuttavia, molte di queste classificazioni propongono modelli controversi, non

sempre ben visti da parte di alcuni autori (135). Nonostante ciò, le linee guida

della WHO sono state più volte revisionate e aggiornate, fino all’ultima

pubblicazione avvenuta nel 2010.

Di seguito andremo ad analizzare alcuni aspetti di fisiologia della riproduzione

maschile utili nell’inquadramento del problema dell’infertilità.

� Lo spermatozoo.

Schematicamente possiamo suddividere lo spermatozoo in due tratti

principali, la testa e la coda (flagello). La testa è composta da due sezioni: il

nucleo, in cui è contenuta la cromatina aploide andata incontro a fenomeni di

addensamento (cosa possibile grazie alla presenza di particolari tipi di istoni

ricchi in arginina anziché in lisina), e l’acrosoma, struttura necessaria per

l’interazione con la cellula uovo. Quest’ultimo contiene enzimi litici che vengono

liberati al momento della reazione acrosomiale con l’ovulo, aprendo un varco

nella zona pellucida di quest’ultimo necessario per la fecondazione (136).

57

Il flagello degli spermatozoi umani può essere suddiviso in quattro regioni: una

corta porzione di connessione (collo), la porzione centrale, la porzione principale

e la porzione terminale. A livello del collo è presente un centriolo e la placca

basale, mentre nel tratto intermedio è presente la cosiddetta guaina mitocondriale

(ovvero il serbatoio di energia dello spermatozoo) che termina con una struttura

ad anello (annulus). Il tratto principale è costituito essenzialmente dal filamento

assiale rivestito dalle colonne striate, che finisce nel segmento terminale costituito

dalla sola componente microtubulare. L’assonema, o filamento assiale, percorre il

flagello per tutta la sua struttura, costituendo l’apparato motore dello spermatozoo

con la classica struttura 9+2

a doppiette di microtubuli

(suddivisi in sub-unità A e

B) riscontrabile nelle ciglia

e nei flagelli di molte altre

cellule eucariotiche. La

principale costituente dei

microtubuli è la tubulina,

con molecole riarrangiate in

filari a formare dei

protofilamenti. Tra le subunità A e B si protendono dei “bracci” costituiti da

un’ATPasi Ca2+ Mg2+ dipendente, la dineina, in grado di provocare lo

scivolamento delle doppiette di microtubuli l’uno sull’altra e quindi di garantire il

movimento. Le 9 doppiette di microtubuli sono a loro volta connesse tra di loro da

una proteina, la nexina, mentre i microtubuli centrali sono circondati da spirali di

fibre (137).

� Produzione e maturazione delle cellule spermatiche.

Il punto di partenza della produzione dei gameti maschili risiede nel

testicolo. La produzione degli spermatozoi avviene a livello dei tubuli seminiferi

(contenti le cellule del Sertoli) a loro volta circondati da una componente stromale

(in cui sono invece presenti le cellule di Leydig). La produzione degli

spermatozoi è un evento caratterizzato da vari aspetti, che sono la produzione dei

gameti, la loro maturazione e la regolazione ormonale.

Figura 19 - Rappresentazione anatomica del testicolo (Gray's

Anathomy)

58

Il complesso processo di divisione e differenziazione delle cellule germinali segue

un pattern preciso. La durata del ciclo di spermatogenesi (ovvero il primo step di

formazione degli spermatozoi) nell’uomo è in media di 16 giorni, mentre per lo

sviluppo e la differenziazione degli spermatozoi e la produzione di liquido

seminale maturo è necessario un periodo complessivo di circa 64 giorni. Il ciclo

completo di produzione può essere identificato in tre parti: la spermatogenesi

(ovvero la produzione dei gameti), la spermiogenesi (fase differenziativa) e la

spermiazione (ovvero il rilascio dal testicolo) La spermatogenesi inizia con la

divisione delle cellule staminali per mitosi (spermatogoniogenesi) e il

riarrangiamento meiotico delle cellule staminali da tetraploidi (spermatociti) a

aploidi (spermatidi). La meiosi è una fase critica nella gametogenesi, giacchè in

essa avviengono la ricombinazione del materiale genetico, la riduzione dei

cromosomi e lo sviluppo degli spermatidi. La spermiogenesi è il secondo atto del

ciclo, e può anch’esso essere suddiviso in quattro fasi:

1. Fase del Golgi, in cui appare la simmetria cranio-caudale e la bolla acrosomiale;

2. Fase del cappuccio, in cui gli spermatidi appaiono allungati e c’è lo sviluppo

dell’acrosoma che copre per 2/3 la sezione craniale;

3. Fase acrosomiale, in cui continuano la condensazione del nucleo e

l’allungamento della cellula e la maturazione del flagello arriva a completamento;

4. Fase maturativa, il cui principale evento è l’estrusione del citoplasma in eccesso

in quello che viene definito come corpo residuo.

Figura 20- Fasi di maturazione degli spermatozoi

59

La spermiazione è l’ultimo atto e

prevede il rilascio degli spermatozoi

maturi nel lume tubulare. Questo

evento può essere influenzato da

modificazioni ormonali, temperatura e

tossine.

Le cellule del Sertoli hanno un ruolo

importante in questi eventi. Scoperte

nel 1865 da Enrico Sertoli, sono cellule

somatiche localizzate nell’epitelio

germinale, e risultano essere

mitoticamente inattive nell’età adulta.

Il ruolo di queste cellule è molteplice:

contributo nella differenziazione delle

gonadi, repressione prepuberale della

meiosi, nutrizione/protezione delle cellule germinali, regolazione della

proliferazione e del differenziamento, regolazione dell’apoptosi degli

spermatogoni, produzione d’inibina (inibizione ipofisi) e attivina, concentrazione

degli androgeni, trasformazione del testosterone in di-idro-testosterone,

separazione del compartimento basale dal luminale, fagocitosi di corpi

estranei/batteri e della goccia citoplasmatica (corpo residuo), secrezione del fluido

tubulare, produzione del fattore anti-mülleriano (136).

� Controllo ormonale.

Il controllo ormonale della funzione testicolare è guidata dal sistema

ipotalamo-ipofisario. Il rilascio di LH e FSH da parte dalla ghiandola pituitaria

anteriore è garantito dalla produzione di GnRH da parte dell’ipotalamo attraverso

un meccanismo pulsatile.

Il rilascio di GnRH dipende dall’attivazione del recettore GPR54, stimolato dal

peptide kisspeptina. Nell’uomo il maggior ormone che controlla la secrezione di

GnRH è il testosterone, che può inibire la secrezione di gonadotropine con un

feedback negativo sia sull’ipofisi sia sull’ipotalamo (meccanismo anche sostenuto

Figura 21 - Schema ormonale regolatore della

funzione testicolare

60

dall’inibina B prodotta dalle cellule del Sertoli). Il testosterone è inoltre il

principale ormone rilasciato dal testicolo, seguito dal 5α-di-idro-testosterone,

androsterone, androstenedione, 17-idrossi-progesterone, progesterone e

pregnenolone. Il testosterone è sintetizzato dalle cellule di Leydig stimolate

dall’LH e in minima parte dalla corticale surrenalica, agendo come fattore sia

endocrino che paracrino.

Le gonadotropine e il testosterone a livello gonadico rientrano nei meccanismi di

produzione e maturazione delle cellule seminali. FSH e testosterone (quest’ultimo

di primaria importanza per la differenziazione sessuale) sono sicuramente

implicati nella regolazione della spermatogoniogenesi, soprattutto tramite

l’incremento della popolazione degli spermatogoni Ap, cui segue un aumento

delle successive popolazioni cellulari (vedi figura 21). I meccanismi di meiosi,

invece, sembra che siano slegati dal controllo di FSH e testosterone, mentre il

solo FSH pare giochi un ruolo nella condensazione della cromatina durante la

spermiogenesi (non è ancora chiaro quale sia il ruolo del testosterone in questa

fase). Si può concludere quindi che le azioni di LH/testosterone e FSH sono

necessarie per la promozione, il mantenimento e la re-iniziazione della normale

spermatogenesi.

Figura 22 - Organi target del testosterone

Esistono altri regolatori ormonali oltre a quelli già citati. Sono stati ritrovati

recettori di superficie per alcuni fattori di crescita, come TGFα e β, inibina ed

activina, insuline-like growth factor-1 (IGF-1), nerve-growth factor (NGF),

61

fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-1) e fattore di crescita epidermico (EGF-1)

(136).

� Maturazione nell’epididimo.

L’epididimo (suddiviso in caput, corpus e cauda) è un dotto di piccolo

diametro e strettamente avvolto che collega i dotti efferenti dal retro di ogni

testicolo al suo dotto deferente. A questo livello avvengono parte della

maturazione e l’acquisizione da parte dello spermatozoo della motilità coordinata

caratteristica. Il complesso assonemale degli spermatozoi testicolari, e quindi la

capacità di movimento, sono attivi solo in alcune cellule per l’attivazione indotta

dall’ATP, tuttavia, solo attraverso il passaggio nell’epididimo, lo status di

maturità dell’assonema è raggiunto, grazie soprattutto all’acquisizione di fattori

promuoventi e alla rimozione di fattori inibitori. Questo discorso include il

cambiamento del pH e delle concentrazioni di Ca2+ e ATP intracellulari, con

anche la modulazione dell’attività dell’adenilato ciclasi e della proteina fosfatasi

PP1γ2 (la cui inibizione sperimentale può provocare infertilità maschile per turbe

della motilità) (138). Anche il bicarbonato prodotto dalle anidrasi carboniche

delle cellule epiteliali epididimali risulta stimolare gli spermatozoi (136).

Il passo successivo della maturazione dello spermatozoo è lo sviluppo della

capacità di interagire con la cellula uovo, iniziando a livello epididimale per poi

completarsi nel tratto genitale femminile. Questa catena di eventi parte dallo

sviluppo dello spermatozoo dell’abilità di compiere la reazione acrosomiale

spontanea, attraverso modificazioni nella composizione dei lipidi di membrana

che permettono alle membrane dell’acrosoma di interagire con l’oocita. La

capacitazione avviene a livello del tratto genitale femminile, e l’interazione

spermatozoo-zona pellucida pare sia garantita da delle glicoproteine presenti

sull’oocita (glicoproteina Zp3). Tuttavia, è stato osservato che una glicoproteina

secreta dall’epididimo, la proteina P34H, è coinvolta attivamente nello sviluppo

della capacità di legare l’uovo, con dimostrazione di casi d’infertilità legata alla

deficitaria interazione spermatozoo-uovo dovuta proprio alla mancanza di questo

peptide (139).

62

Il liquido seminale viene quindi immagazzinato nell’epididimo. Gli spermatozoi

accumulati in questa sede sono quiescenti, in un ambiente arricchito dal fluido

epididimale, povero in sodio e ricco in potassio. Sono prodotti inoltre superossido

dismutasi e glutatione perossidasi per proteggere gli spermatozoi dal danno

ossidativo, mentre inibitori dell’acrosina evitano reazioni acrosomiali spontanee.

Un complesso di tight-junctions e fattori d’immunosoppressione proteggono

inoltre il liquido seminale da reazioni auto-antigeniche (136).

� Composizione finale del liquido seminale.

Il liquido seminale è composto di un gruppo eterogeneo di secrezioni, non

solo testicolari ma anche provenienti dalle ghiandole accessorie e dalla prostata.

Sono almeno tre i sistemi che contribuiscono alla composizione dell’eiaculato, i

cui prodotti vengono escreti in successione. La prima componente è quella

prostatica (contenente soprattutto fosfatasi acida, zinco, acido citrico e antigene

prostatico specifico), in secondo luogo c’è la componente spermatica proveniente

da testicoli, epididimo (che secerne anche L-carnitina, glicerofosfocolina e α-

glicosidasi neutra), vasi deferenti e ampolla, e per terzo la vescichette seminali

che secernono con i loro liquidi gran parte del fruttosio rinvenibile e provvedono

ad incrementare il volume del liquido seminale. Le ghiandole bulbo-uretrali di

Cowper secernono una soluzione alcalina (liquido di Cowper) con glicoproteine

che neutralizzano l’acidità del tratto urinario prima dell’eiaculazione (136). Il

liquido prostatico inoltre, come anche il fluido seminale nella sua interezza,

contiene anche un certo numero di ioni (principalmente citrato, cloruro, sodio,

potassio, zinco e magnesio), con concentrazioni che possono variare da soggetto a

soggetto (140).

Nel liquido seminale è possibile rinvenire anche alcuni ormoni. Per esempio,

Abbaticchio et al. hanno osservato la presenza di piccole quantità di ormoni

tiroidei (T3) legate all’albumina che incrementano in caso di flogosi (141), mentre

Brotherton, nel 1990, evidenziò la presenza e misurò le concentrazioni di

cortisolo e transcortina nel liquido seminale e nel liquido amniotico (142). Vari

studi si sono invece concentrati sulla rilevazione delle concentrazioni e sul

63

significato della presenza dell’ormone ghrelina (e obestatina) nel seme, aspetti

che verranno meglio descritti nel capitolo 3 e nella sezione sperimentale.

2.3.2. Cause principali

a) Fattori ambientali

Nella patogenesi dell’infertilità maschile, è opportuno prendere

preventivamente in considerazione alcune situazioni ambientali e tossiche quali

possibili cause. Infatti, alcuni modelli sperimentali hanno dimostrato l’insorgenza

di alterazioni spermatologiche in seguito al contatto con particolari agenti tossici,

come il dibromoetano (soprattutto a livello dell’acrosoma, guaina mitocondriale e

cromatina) (143), il parathion e il malathion, e composti clorurati (a livello di

testa, porzione intermedia e flagello) (144-145). Sostanze tossiche tra cui

idrocarburi, pesticidi, carburanti, olii e altri materiali di derivazione industriale,

possono, quindi, essere importanti fattori di rischio per infertilità.

Anche le radiazioni ionizzanti possono potenzialmente danneggiare gli

spermatozoi, con evidenza di difetti strutturali del nucleo e della cromatina in

modelli murini (146). Un esempio chiaro è lo studio di Bartoov et al. sui

sopravvissuti di Chernobyl e sugli abitanti delle zone circostanti, in cui si è

osservata una diminuzione della motilità degli spermatozoi e difetti ultrastrutturali

(147).

Il fumo di sigaretta è sicuramente un altro importante fattore di rischio, con un

incremento di spermatozoi anomali nei fumatori rispetto ai non fumatori. Un altro

effetto negativo del fumo di sigaretta si ha in associazione al varicocele, con

riduzione della concentrazione e della motilità degli spermatozoi (148-149).

64

b) Alterazioni anatomiche

Varicocele. Per varicocele

s’intende una lesione vascolare

caratterizzata da una dilatazione e

allungamento delle vene del

funicolo spermatico. Colpisce

prevalentemente gli adolescenti, con

un 15% d’incidenza nell’età adulta e

con percentuali sensibilmente più

alte in pazienti con infertilità primaria

e secondaria

Nel 90% dei casi il varicocele si presenta a sinistra, poiché in questa sede la vena

del testicolo s’immette ad angolo retto nella vena renale, a destra, invece, la vena

del testicolo drena direttamente nella vena cava inferiore. Questo provoca un

gradiente di pressione maggiore a sinistra, dando come risultato un più facile

sviluppo della patologia. E’ possibile classificare il varicocele in tre gradi clinici

secondo lo schema proposto da Dubin e Amelar:

1. Allargamento del plesso pampiniforme palpabile solo con manovra di Valsalva,

2. Plesso pampiniforme chiaramente palpabile anche senza manovra di Valsalva,

3. Visibile allargamento del plesso pampiniforme (136).

La diagnosi di certezza si ha solo in seguito ad esame eco-color-doppler che mette

in evidenza la dilatazione dei plessi venosi e la presenza di reflusso anomalo.

Il rapporto tra varicocele e infertilità venne per la prima volta affrontato nel 1965

da McLeod, che osservò alterazioni spermatologiche in pazienti affetti da questa

patologia (151). Oggigiorno quest’associazione è universalmente accettata,

ponendo come base vari possibili scenari patogenetici. In primo luogo

l’ipertermia pare giocare un ruolo fondamentale, poiché il ristagno di sangue

attorno ai testicoli può provocare un innalzamento della temperatura che altera le

normali meccaniche della spermatogenesi. Ciò risiede soprattutto nel fatto che gli

enzimi regolatori della sintesi del DNA e le polimerasi agiscono a una

Figura 23 - Varicocele

65

temperatura ottimale di 33-34° C, con

inibizione a temperature più alte.

Probabilmente, modificazioni della

pressione venosa, presenza di reflusso di

sostanze provenienti dal rene o dalle

ghiandole surrenali con vasocostrizione

cronica testicolare e diminuzione della

funzione, possibili disfunzioni ormonali e

stress ossidativo, possono ulteriormente

contribuire a causar

infertilità (152).

Criptorchidismo.

Per criptorchidismo (da κρυπτός, “occulto”, e ‘όρχις, ”testicolo”) si intende la

mancata discesa del testicolo nello scroto e colpisce il 3% dei neonati.

Solitamente si tratta di un arresto della normale discesa del testicolo, ritrovabile in

un punto del percorso tra il polo inferiore del rene e il sacco scrotale. Nella

maggior parte dei casi, il testicolo occulto si localizza in regione inguinale o

sottofasciale all’interno del canale inguinale (153).

Il criptorchidismo in quei soggetti che ne sono stati affetti si associa ad aumentato

rischio d’infertilità. Questo è dovuto alle modificazioni nelle cellule germinali che

avvengono nel primo anno di vita, epoca della comparsa degli spermatogoni di

tipo A (vedi figura 21), momento critico per la fertilità. Nel testicolo colpito da

quest’anomalia tale passaggio è inibito, e proprio per questo motivo la correzione

del difetto va effettuata entro i primi dodici mesi (154-155).

Con l’aumentare dell’età, la possibilità di divenire infertili incrementa

notevolmente: uno studio del 2007 ha evidenziato come già il 35% dei pazienti

criptorchidi non possieda cellule germinali nel testicolo affetto già a 11 anni

(156). Inoltre spesso è possibile evidenziare anche una degenerazione del testicolo

controlaterale in caso di criptorchidismo monolaterale (155).

Figura 24 - Alterazioni somatiche della sindrome di

Klinefelter

66

c) Difetti genetici

Una parte considerevole dell’etiologia dell’infertilità è rivestita da difetti

genetici (15-30%) e il 5% di tali alterazioni è causata delle anomalie

cromosomiche. Una situazione possibile è l’aneuploidia, ovvero la variazione

della normale quantitativo di cromosomi, condizione presente spesso in pazienti

con azoospermia. Un esempio di patologia cromosomica inerente a questa

situazione è la sindrome di Klinefelter, descritta per la prima volta da Henry

Klinefelter nel 1942. Tale condizione è spesso caratterizzata dalla presenza di un

cariotipo 47 XXY (“non mosaico”), ma possono anche sussistere aneuploidie più

alte, mosaici e anomalie strutturali del cromosoma X. La sindrome di Klinefelter,

oltre a presentare alterazioni fenotipiche caratteristiche (figura 25), determina un

arresto nella produzione di spermatociti primari e di conseguenza oligospermia o

azoospermia. Alcuni pazienti affetti dalla tipologia non mosaico di questa malattia

possiedono comunque spermatozoi nel liquido seminale, negli altri casi la

situazione è più severa, con solo dei residui di spermatogenesi a livello testicolare.

Esistono inoltre altre numerose alterazioni cromosomiche responsabili

d’infertilità, tra cui anche la presenza di traslocazioni derivate da errori in fase di

meiosi. Tra queste sono da ricordare le cosiddette traslocazioni robertsoniane, in

cui due cromosomi acrocentrici (ovvero con il centromero molto vicino al capo

del cromosoma) si fondono a livello del centromero, perdendo così il braccio

corto. In questo caso ci può essere un arresto della produzione delle cellule

germinali con conseguente infertilità. Oltre a queste possono verificarsi

traslocazioni reciproche o inversioni con risultato simile alle precedenti situazioni

descritte (157).

La trisomia 21, o sindrome di Down, è un’altra condizione cromosomica

(autosomica in questo caso) in cui si verifica infertilità per azoospermia o grave

oligospermia.

Importanti in patologie di derivazione cromosomica sono le alterazioni del

cromosoma Y, in quanto in questa sede sono presenti numerosi geni responsabili

del corretto svolgimento dei meccanismi di gametogenesi. Le anomalie possibili

sono molteplici: le microdelezioni del cromosoma Y, per esempio, sono

frequentemente responsabili d’infertilità, con discreta possibilità (15%) di

sviluppare un’azoospermia o una oligospermia (158). Le microdelezioni si

67

sviluppano principalmente sul braccio lungo, con interessamento di una

particolare area, l’azoospermia factor region (AZF, a sua volta costituita da tre

sotto-regioni), la cui delezione provoca un errore critico nello sviluppo dei gameti

(159).

Anche alcuni geni collocati sul cromosoma X possono essere coinvolti in

alterazioni della gametogenesi. Un esempio importante è costituito dalla

sindrome di Morris, detta anche sindrome da insensibilità agli androgeni o

femminilizzazione testicolare, in cui si osserva un’interruzione dello sviluppo

dell’apparato genitale in epoca fetale. Anche se con caratteri sessuali femminili, il

soggetto possiede corredo cromosomico 46 XY. A livello del braccio lungo del

cromosoma X di queste persone è presente una mutazione del gene AR (androgen

receptor), con conseguente insensibilità dei tessuti fetali agli androgeni

normalmente prodotti. I caratteri sessuali esterni, quindi, seguono la linea

femminile, al contrario di quelli interni il cui sviluppo in senso femmineo è stato

interrotto dal fattore anti-mülleriano prodotto dalle cellule del Sertoli. Questa

patologia tuttavia può seguire pattern diversi, dalla completa insensibilità agli

androgeni alla parziale risposta, fino a uno stato più lieve in cui i caratteri esterni

sono maschili (160-161). Essendo gli androgeni implicati nei meccanismi di

meiosi e di spermatogenesi, questi soggetti risultano infertili.

Le mutazioni autosomiche possono giocare un ruolo importante nella patogenesi

dell’infertilità. Per esempio, in pazienti affetti da fibrosi cistica (mutazione del

gene CFTR, cromosoma 7), è possibile osservare atipie dell’apparato genitale,

con atresia congenita dei dotti deferenti che provoca un’ostruzione al deflusso

degli spermatozoi e quindi azoospermia, appunto, ostruttiva (162). La mutazione

del gene SHBG (cromosoma 17), invece, determina un’alterazione di una

glicoproteina legante gli ormoni sessuali con funzioni regolatrici, alterando la

risposta a tali ormoni e quindi la spermatogenesi e la differenziazione sessuale

(163). Questi, tuttavia, sono pochi esempi della moltitudine di alterazioni studiate

e presenti in letteratura (che interessano il gene per il recettore del FSH, il gene

per il recettore degli estrogeni, la deleted azoospermia-like zone DAZL, MTHFR

e altri).

68

d) Anomalie dello spermatozoo

Lo spermatozoo può essere colpito da una serie di alterazioni di tipo

strutturale e funzionale in tutte le sue componenti. Le modificazioni possibili a

questo livello possono essere secondarie ad alterazioni genetiche oppure dovute a

patologie andrologiche, fattori ambientali, stress o risposte non specifiche ad

agenti nocivi.

Le stesse condizioni andrologiche prima descritte, come il varicocele, il

criptorchidismo, o le anomalie cariotipiche, così come anche i fattori tossici,

ambientali e il fumo di sigaretta,

possono essere causa

d’immaturità, apoptosi o necrosi

delle cellule spermatiche e

possono compromettere la

struttura delle cellule con

modificazioni della testa e della

coda degli spermatozoi.

Un esempio caratteristico è la

necrozoospermia, in altre parole

quando nell’eiaculato è presente oltre il 50% di spermatozoi non vitali e le cui

strutture spesso sono rinvenute in disfacimento (membrane rotte, cromatina

disorganizzata, assonema e mitocondri disassemblati). Nella genesi di questa

condizione pare siano coinvolti fattori epididimali, tuttavia il fenomeno è ancora

poco chiaro nelle sue dinamiche (164-165).

Esistono inoltre modificazioni dello spermatozoo che si presentano

sistematicamente, spesso con fenotipo dominante, eppure a oggi non è stato

descritto nessun gene sicuramente responsabile di tali aberrazioni. Anche in

questo caso tali alterazioni possono essere descritte a livello della testa e della

coda. Nel primo caso alcuni modelli sono il difetto “cratere”, con nuclei che

ricordano il disegno di una coppa, il difetto “testa tonda” (“globozoospermia”) e il

“miniacrosoma” (ipoplasia

dell’acrosoma) (166-168),

mentre nel secondo scenario

Figura 25 - Pionieristico disegno di Anton Van Leeuvenhoek dopo

osservazione con un primitivo microscopio ottico. E’ possibile

osservare l’eterogeneità delle teste degli spermatozoi.

69

si possono ritrovare esempi quali la presenza di spermatozoi acefali (169) o

l’assenza di componenti del flagello stesso.

2.3.3. Ruolo delle infezioni

Le infezioni del tratto urogenitale e l’infiammazione che da esse deriva

possono essere un importante fattore etiologico in materia di infertilità. Oltre a

queste, anche infezioni provenienti da altri distretti possono in qualche modo

compromettere la funzione spermatica, e tra queste può aver un ruolo importante

anche l’Helicobacter pylori.

Particolare importanza è rivestita dalle infezioni di tipo batterico, e a questo

proposito, infatti, sono stati dedicati numerosi studi per altrettanto molteplici

patogeni.

I micoplasmi genitali sono micro-organismi molto frequenti sia nei maschi fertili

sia infertili. Questo è particolarmente vero per l’Ureaplasma urealyticum e meno

per il Mycoplasma hominis e il Mycoplasma genitalium. Tali patogeni, sebbene in

maniera non molto chiara, possono essere causa di flogosi del tratto genito-

urinario (uretriti, prostatiti, raramente orchiti), spesso con produzione di specie

reattive dell’ossigeno che possono attaccare gli spermatozoi.

La Neisseria gonorrhoeae è riconosciuta essere causa di uretriti e, anche se

raramente, può provocare infezioni di altre parti dell’apparato genitale, inclusi i

testicoli, con conseguente danno alla capacità fecondante (170).

La Chlamydia trachomatis, batterio distribuito a tutte le latitudini, infetta

entrambi i sessi e ha un impatto maggiore sulle donne rispetto agli uomini. Il

contributo di questo batterio nell’etiologia dell’infertilità è oggetto di discussione,

tuttavia studi epidemiologici e la ricerca di anticorpi anti-LPS della Chlamydia

70

non hanno dato risultati significativi almeno per quanto riguarda la componente

maschile (171-172).

Altri patogeni come le Enterobacteriaceae sono stati considerati potenziali agenti

etiologici. L’Escherichia coli è una delle più comuni cause di epididimo-orchite

non sessualmente trasmessa ed è coinvolta nel 65%-80% delle prostatiti acute.

Cause di prostatiti ed epididimiti possono essere anche batteri quali Klebsiella,

Salmonella, Proteus e Pseudomonas aeruginosa, potendo in questo modo

interferire con la fertilità. Gli enterococchi, invece, possono essere responsabili

di oligospermia e teratospermia (170).

Le infezioni virali possono alla stessa stregua dei batteri giocare un ruolo

importante. DNA di Herpes-virus (in particolare i sierotipi 1 e 7) è stato ritrovato

frequentemente in pazienti infertili. In particolare l’HSV potrebbe essere causa di

leucocitospermia, anche se comunque il reale significato di questa alterazione

risulta poco chiaro in questo contesto (170-173-174-175). Infezioni da papilloma

virus (HPV) sono state riscontrate in biopsie testicolari di uomini azoospermici, e,

quando presente all’interno delle cellule, questo virus può debilitare la motilità

dello spermatozoo e dare astenospermia. Il virus dell’immunodeficienza

acquisita (HIV) è senz’altro responsabile d’infezioni opportunistiche del tratto

genito-urinario potendo essere responsabile d’infertilità; inoltre, la stessa terapia

anti-retrovirale può avere un impatto quasi devastante sull’apparato riproduttivo

maschile (170). Altri virus, come il cytomegalovirus o il virus di Epstein-Barr,

sono stati studiati senza dare risultati convincenti.

Per quanto riguarda i miceti, un possibile ruolo è stato riservato per la Candida

albicans, colonizzando spesso l’uretra e raramente le ghiandole accessorie. La

Candida può essere rinvenuta nel liquido seminale e può compromettere la

fertilizzazione in-vitro, oltre ad avere un effetto inibitore sulla motilità spermatica.

Tra i parassiti il Trichomonas vaginalis può essere causa di uretriti e prostatiti e

può anch’esso inibire la motilità degli spermatozoi (170).

� Associazione con Helicobacter pylori

71

Tra le manifestazioni extradigestive dell’infezione da Helicobacter pylori,

l’infertilità maschile è stata oggetto di alcuni interessanti studi.

Uno dei primi meccanismi ad essere stato preso in considerazione è il mimetismo

molecolare. Le cellule flagellate del liquido seminale, infatti, possiedono strutture

paragonabili ad alcune componenti batteriche e, quindi, possibili bersagli di una

risposta anticorpale. Nel 2002 Figura et al. applicarono questa teoria facendo

reagire spermatozoi umani con un siero iperimmune (creato attraverso

l’immunizzazione di siero di coniglio con componenti del batterio, tra cui VacA,

CagA e HspB - Heat shock protein B) e anticorpi ricavati da fluido follicolare

umano. Effettivamente è stata osservata una cross-reazione tra i sieri e gli

spermatozoi, soprattutto a livello della prima sezione del flagello e del centriolo

(strutture particolarmente ricche in tubulina) e in una piccola parte della zona

equatoriale. E’ stata inoltre osservata un’analogia strutturale tra la flagellina

dell’Helicobacter pylori e la tubulina umana, esempio di quella che potrebbe

essere l’origine di questa interazione e di come essa possa contribuire alla

diminuzione della motilità degli spermatozoi (176).

L’alterazione della qualità dello sperma da parte dell’Helicobacter pylori è stata

oggetto di un altro studio del 2008 di Collodel et al. In questo lavoro è stato

osservato che in soggetti con infertilità idiopatica e infettati dall’Helicobacter

pylori la qualità del liquido seminale dei portatori di ceppi CagA-positivi era

nettamente peggiore rispetto ai soggetti infettati da ceppi CagA-negativi. Nel

primo gruppo, infatti, la motilità e l’indice di fertilità erano diminuiti, così come

la quota di apoptosi e necrosi era aumentata. Queste osservazioni possono essere

ricondotte o a meccanismi di autoimmunità o a eventi legati all’infiammazione.

Alcuni cloni di Helicobacter pylori sono particolarmente efficienti nella

stimolazione della produzione di alcune citochine, in particolare TNF-α e IL-6, sia

a livello locale sia sistemico. Ciò ha portato all’ipotesi che l’alta patogenicità dei

ceppi CagA-positivi, soprattutto per la loro capacità di indurre la produzione di

citochine, può essere legata all’aumentata necrosi e apoptosi rilevata nei campioni

di liquido seminale (177).

72

3. Ormoni regolatori dell’appetito e altri

mediatori

3.1 Ghrelina

Negli ultimi anni sono stati descritti dei nuovi ormoni che rientrano nei

meccanismi di regolazione dell’appetito. Nel 1999 Kojima descrisse per la prima

volta l’ormone peptidico ghrelina, forse il più importante e più studiato ormone di

questa categoria (178).

La struttura dell’ormone è composta di 28 aminoacidi. Particolarità di

quest’ormone è la sua attivazione tramite acilazione della serina in posizione 3 da

parte dell’acido n-octanoico (un acido grasso), aspetto eccezionale per quanto

riguarda gli ormoni. L’acilazione permette alla ghrelina di attraversare la barriera

emato-encefalica. Esistono varianti non acilate della ghrelina che non possiedono

la capacità di legare il recettore GHS-R (vedi seguito), tuttavia possono avere

effetti biologici a livello miocardico (cosa evidenziata soprattutto nelle cavie) e su

alcuni tessuti neoplastici (179). L’acilazione in posizione 3 è indispensabile

affinché si abbia il corretto legame con il recettore (180)

La ghrelina è secreta prevalentemente a livello del fondo gastrico da parte di

cellule che colonizzano le ghiandole ossintiche (cellule X/A like) (181), anche se

altri tessuti possono secernerla sebbene in quantità più limitate (testicolo, rene,

ipofisi, ipotalamo, pancreas, intestino), con concentrazioni che decrementano

progressivamente lungo il tratto

intestinale.

La ghrelina è un ligando endogeno

del recettore secretagogo

dell’ormone della crescita, il

GHS-R (provvisto di due varianti,

1a, completa, e 1b), promuovendo

in maniera spiccata la liberazione

del GH. Il recettore GHS-R fu

scoperto e clonato nel 1996 da

Howard et al. (citato in 182) a Figura 26 – Ricostruzione della struttura dell'ormone

ghrelina

73

livello dell’ipotalamo e dalla ghiandola pituitaria umana e suina, tuttavia in

seguito è stato possibile riscontrarlo in altre strutture cerebrali, come l’ippocampo

e la sostanza nera. Questo particolare recettore è inoltre presente, benché espresso

in maniera minore, anche a livello gastrointestinale (stomaco e pancreas),

ghiandolare (tiroide, surreni, gonadi), a livello miocardico, osseo, linfatico e nel

tessuto adiposo (183-184).

Quali sono effettivamente le funzioni di questo nuovo ormone? Come anche

prima ricordato, il GHS-R è un ormone secretagogo del GH, quindi una delle

funzioni della ghrelina è proprio quella promotrice del rilascio dell’ormone della

crescita. Altra funzione importante è quella oressizzante, ovvero la stimolazione

dell’appetito. E’ stata evidenziata, infatti, la presenza di neuroni rilascianti

ghrelina a livello di vari nuclei dell’ipotalamo (arcuato, dorsale, ventrale,

paraventricolare) con ruolo nell’alimentazione umana. A livello del nucleo

arcuato tali neuroni sono particolarmente espressi, connettendosi ad altre cellule

encefaliche produttrici di neuropeptide Y (NPY) e di proteina agouti-associata

(AgRP), due peptidi oressizzanti. La ghrelina ha inoltre effetto inibitorio sulla

propiomelanocortina, sostanza con effetti anoressizzanti. Un altro sistema è quello

del nucleo paraventricolare, in cui la ghrelina determina un rilascio di ACTH e

cortisolo attraverso la produzione di NPY che inibisce la secrezione di acido γ-

ammino-butirrico (GABA) e promuove la liberazione dell’ormone di rilascio

delle corticotropine (CRH). La ghrelina è, inoltre, antagonista della leptina,

ormone che con i suoi effetti contrasta il rilascio di NPY e AgRP (182).

Il livello di ghrelina plasmatica, proprio a causa della sua attività oressizzante,

aumenta considerevolmente prima dei pasti, riducendo la sua concentrazione dopo

circa un’ora in maniera proporzionale alle calorie ingerite, fino a raggiungere la

quota minima (185). Inoltre la secrezione di ghrelina è provvista di un ritmo

circadiano, con livelli minimi notturni e massimi nella prima mattinata

(rispettivamente all’una di notte e alle nove del mattino).

Importante per la concentrazione della ghrelina è la massa adiposa. I soggetti

affetti da anoressia nervosa tendono ad avere elevati livelli di ghrelina, che

diminuiscono fino a rientrare nei livelli di normalità una volta aumentato il peso

corporeo. Effetto contrario si ha negli individui obesi, in cui i livelli di ghrelina

sono considerevolmente più bassi. L’acil-ghrelina stessa promuove la deposizione

74

di grasso, rientrando anche nella regolazione del metabolismo lipidico. Gli acidi

grassi liberi, inoltre, hanno un effetto soppressivo sul livello plasmatico di

ghrelina (182).

Oltre all’effetto promotore dell’appetito, la ghrelina svolge altre attività. A livello

gastrico stimola la secrezione acida e la motilità del viscere (186), con

promozione della secrezione di gastrina. Inoltre quest’ormone possiede attività

gastro-protettive, funzioni esplicate anche attraverso la produzione di PGE2 e

ossido nitrico da parte degli enzimi ciclo-ossigenasi e ossido nitrico-sintetasi

(COX e NOS). Quest’ultimo effetto ha naturalmente un’azione adiuvante per la

guarigione di eventuali ulcere peptiche (187).

Il metabolismo glucidico è un altro bersaglio della ghrelina, in particolare la

secrezione dell’insulina. Non c’è consenso unanime circa il reale ruolo della

ghrelina a questo livello, infatti, tra gli autori esistono pareri discordanti e sovente

antitetici. Sempre a livello endocrino, si è già accennato circa l’effetto induttore

sulle corticotropine. Alcuni studi hanno osservato, per giunta, diminuiti livelli di

ghrelina sierica in pazienti ipertiroidei (182).

A livello cardiovascolare la ghrelina ha effetti vasodilatatori, con riduzione della

pressione arteriosa media, migliorando anche la funzione di pompa cardiaca

(188).

Effetti della ghrelina possono manifestarsi anche a livello del sistema

immunitario, con il possibile ruolo nei meccanismi di proliferazione e

attivazione delle cellule immunitarie e in alcuni sistemi di regolazione

dell’infiammazione (vedi sezione sperimentale, par. 7).

Altri effetti studiati della ghrelina possono verificarsi a livello del metabolismo

osseo e nei meccanismi del sonno (promuove lo stato di veglia) e della memoria

(182).

75

3.2 Obestatina

Un altro prodotto del gene della ghrelina è l’obestatina, un peptide acido di 23

aminoacidi identificato per la prima volta nello stomaco di ratto. Così come la

ghrelina, l’obestatina pare abbia un ruolo nella regolazione dell’introito

alimentare e gli effetti furono inizialmente osservati nei topi. Nelle cavie, infatti,

l’iniezione intraperitoneale di obestatina sopprimeva l’assunzione di cibo in

maniera tempo e dose-dipendente. Stessa cosa si evidenziava iniettando

l’obestatina per via intra-cerebro-ventricolare. Il trattamento cronico con

obestatina, inoltre, riduceva, sempre nei ratti, il peso corporeo, la secrezione acida

gastrica e la motilità duodenale e digiunale.

E’ stato dimostrato che l’obestatina (prodotta

principalmente dallo stomaco, ma anche da

digiuno, duodeno, colon, pancreas, milza,

ghiandola mammaria e probabilmente a livello

seminale) è un ligando per un recettore

orfano, un G protein-coupled receptor

(GPR39), che possiede caratteristiche simili

al GHSR1a (una delle due varianti del

recettore GHSR) e la cui interazione

porterebbe all’inibizione dell’assunzione di

cibo (189). Questo recettore è infatti coinvolto in meccanismi di regolazione del

peso corporeo, della motilità intestinale, di alcune secrezioni ormonali e della

morte cellulare. Elevati livelli di GPR39 sono stati evidenziati tramite real-time

PCR a livello dell’amigdala, dell’ippocampo, della corteccia uditiva e

dell’ipotalamo, ma anche nel tratto gastro-enterico, fegato, tessuto adiposo e

pancreas. C’è da aggiungere che non tutti gli autori sono concordi sul legame

obestatina-GPR39, tuttavia la questione è ancora fonte di dibattito.

Alcune evidenze sull’attività dell’obestatina ci giungono sempre da modelli

murini. Secondo questi studi il ruolo dell’obestatina sarebbe di antagonista della

ghrelina, con modalità dipendenti dallo stato di nutrizione e dalla secrezione di

GH. Inoltre è stata evidenziata, come anche per la ghrelina, la presenza di un

Figura 27 - Ricostruzione della struttura

dell'obestatina

76

ritmo circadiano pulsatile (190). Al contrario, vari studi tendono a escludere il

ruolo dell’obestatina nella regolazione dell’introito alimentare, non attribuendone

alcuna influenza sull’apporto globale di cibo, perso corporeo, svuotamento

gastrico e motilità duodenale e digiunale.

La concentrazione plasmatica dell’obestatina non sembra essere influenzata

dall’apporto calorico; infatti, i livelli dell’ormone non variano sensibilmente in

seguito all’assunzione di pasti anche molto differenti nella quantità di kilocalorie.

I livelli plasmatici di obestatina risultano inferiori alla media nei soggetti obesi e

in individui sottoposti a gastrectomia (191), tuttavia altri studi suggeriscono

l’opposto. Nei pazienti anoressici, invece, esiste concordanza tra i vari risultati,

concludendo unanimemente che le concentrazioni di obestatina in questi individui

sono maggiori rispetto ai soggetti sani.

Oltre ai presunti effetti anoressizzanti, l’obestatina pare agisca anche ad altri

livelli. E’ stata osservata una inibizione della secrezione insulinica da parte

dell’obestatina esogena sempre in modelli murini (192). Osservazioni circa

possibili influenze dell’obestatina sulla secrezione dell’insulina indotta dal

glucosio hanno dato risultati discordanti. Effetto interessante si ha a livello delle

cellule β pancreatiche, con protezione di queste ultime tramite blocco

dell’apoptosi indotta da citochine. Un lavoro del 2007 ha evidenziato, infatti, una

maggiore incidenza di diabete mellito di tipo 2 e di stati di insulino-resistenza in

pazienti con bassi livelli di obestatina (193). L’importanza dell’obestatina sul

metabolismo glucidico, però, resta a oggi oggetto di dibattito.

Per quanto riguarda il metabolismo lipidico, è stato osservato nelle cavie che

l’obestatina provoca una riduzione del colesterolo sierico e dei livelli di

trigliceridi (182).

L’obestatina, inoltre, pare abbia anche un ruolo nell’inibizione della sete (194),

nella regolazione, alla stessa stregua della ghrelina, del ritmo sonno-veglia (195) e

della memoria (196) e nell’aumento della produzione di enzimi pancreatici (197).

77

3.3 Altri ormoni e mediatori

Leptina. La leptina, la cui scoperta risale al 1994, è una proteina costituita

da 167 aminoacidi, codificata dal gene Ob a livello del cromosoma 7. Questo

ormone è prodotto soprattutto a livello del tessuto adiposo bianco, tuttavia può

essere riscontrato anche a livello della mucosa del fondo gastrico, ipofisi, tessuto

muscolare e placenta. La concentrazione plasmatica della leptina è proporzionale

al peso corporeo e quindi al BMI, soprattutto nelle donne (198). Questo pare

essere dovuto alla promozione da parte degli estrogeni della produzione di leptina,

mentre al contrario il testosterone sembra inibirla.

L’attività della leptina si manifesta attraverso l’interazione con il recettore Ob-R

di classe I (componente della famiglia dei recettori delle citochine espresso in vari

organi), determinando una riduzione dell’introito alimentare con dissipazione di

energia (199). Il recettore Ob-R possiede varie isoforme, suddivise in “corte” e

“lunghe”: del primo gruppo fa parte l’isoforma Ob-Re, recettore solubile che lega

la leptina nel siero, mentre nel secondo ritroviamo Ob-Rb, espressa soprattutto a

livello del nucleo arcuato e paraventricolare dell’ipotalamo. Quando la leptina si

lega al suo recettore nel nucleo arcuato provoca un’inibizione della secrezione di

neuropeptide Y con effetto anoressizzante.

A livello pancreatico la leptina promuove la secrezione di glucagone e inibisce il

rilascio d’insulina: è stato osservato che nelle cellule β pancreatiche tale

inibizione avviene attraverso l’attivazione della fosfodiesterasi 3B (PDE3B)

(200). Altre azioni della leptina sono quella lipolitica e tireotropa (aumento del

T3).

Adiponectina. L’adiponectina fu scoperta nel 1995 nel tessuto adiposo

(201), ed è una proteina di 247 aminoacidi con 4 domini e struttura multimerica.

Esistono tre forme di adiponectina prodotta dagli adipociti: LMW formata da tre

monomeri, MMW da sei, e HMW da otto (202). La HMW sembra essere la forma

attiva dell’ormone, con possibili interazioni anche con l’insulina (203). E’ stato

78

osservato in modelli sperimentali che l’insulina stessa e l’insuline-like growth

factor stimolano l’espressione del gene dell’adiponectina.

Esistono due tipi di recettori conosciuti per l’adiponectina, l’adipoR1 e adipoR2,

il primo espresso soprattutto a livello muscolare mentre il secondo a livello

epatico.

L’adiponectina pare abbia un ruolo rilevante nella regolazione della funzione

dell’insulina e nell’omeostasi energetica, essendo infatti ridotta in soggetti con

diabete mellito di tipo II ed obesi (204-205). La concentrazione plasmatica

dell’ormone è inversamente proporzionale al BMI, al grado d’insulino-resistenza,

alla glicemia e alle concentrazioni di insulina e trigliceridi (206). Il meccanismo

d’azione non è del tutto stato chiarito, tuttavia pare che agisca soprattutto a livello

epatico diminuendo la produzione di glucosio e aumentandone il catabolismo a

livello muscolare. L’adiponectina può avere un ruolo anche a livello cardio-

vascolare (con effetti protettivi contro l’ischemia e il danno da riperfusione) e

muscolare (207).

Resistina. La resistina è una proteina ricca in cisteina codificata negli

esseri umani dal gene RETN, scoperta nel 2001 da un team di studiosi

dell’University of Pennsilvania School of Medicine. Il ruolo della resistina è

controverso, ma pare abbia un ruolo di primo piano nello sviluppo dell’obesità e

del diabete mellito di tipo 2. La resistina è una citochina derivata dagli adipociti,

che in modelli murini provoca insulino-resistenza e intolleranza al glucosio e

nell’uomo è iperespressa dal tessuto adiposo (208). A confermare il legame tra

resistina, obesità e diabete mellito di tipo II, uno studio di Stoppan et al. ha

dimostrato come l’espressione del gene della resistina sia ridotta marcatamente in

corso di trattamento con tiazolinedioni, TZD, farmaci anti-diabetici che legano i

recettori PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptors). La resistina,

inoltre, antagonizza l’insulina in modelli sperimentali in vitro; infatti, il

trattamento dei campioni con antisiero anti-resistina provoca un aumento

dell’ingresso di glucosio nelle cellule indotto dall’insulina (209).

Defensine. Le defensine sono piccole proteine costituite da 18-45

aminoacidi con otto residui di cisteina conservati. Le cellule del sistema

immunitario contengono questi peptidi, utili nella difesa contro batteri, funghi e

79

virus. Esistono tre categorie di defensine studiate. Le α-defensine (DEFA1-1B-3-

4-5-6) sono espresse dai neutrofili, linfociti NK e alcuni linfociti T, oltre che dalle

cellule di Paneth per quanto riguarda DEFA5 e 6. Le β-defensine (DEFB1, 2,

103A, 107B, 110, 136) sono secrete da leucociti e cellule epiteliali di varia natura,

come per esempio cellule polmonari e del tratto respiratorio, delle ghiandole

salivari, renali ed esofagee. Le θ-defensine (DEFT1P) sono rare e sono state

ritrovate solo in linfociti di primati.

Alcuni studi sperimentali hanno messo in relazione queste molecole con alcune

patologie, in particolare il diabete. E’ stato osservato in modelli murini che i

livelli di β-defensine (e Toll-like receptors) erano ridotti in ratti diabetici in

confronto a topi omologhi ma sottoposti a terapia insulinica. Questi bassi livelli

potevano essere riportati a normalità somministrando insulina, sottolineando

come il diabete possa diminuire l’efficacia dell’immunità innata (210-211).

Le α-defensine sono incrementate in condizioni infiammatorie croniche e in

alcune patologie neoplastiche. Inoltre, una riduzione delle defensine può

predisporre al morbo di Crohn: è stata infatti osservata una diminuzione dei livelli

di defensine in concomitanza con mutazioni del gene NOD2-CARD15, implicato

nella patogenesi di questa patologia, debilitando i meccanismi di difesa anti-

batterica (212).

3.4 Ormoni dell’appetito e Helicobacter pylori

Numerosi studi hanno messo in relazione l’infezione da Helicobacter

pylori con i livelli sierici di ghrelina e obestatina. In particolare questi ultimi due

ormoni sono secreti dalle cellule X/A presenti a livello delle ghiandole ossintiche,

che vanno incontro a decimazione a causa dell’atrofia in corso di gastrite da

Helicobacter. Questa naturalmente non è una condizione solo attribuibile

all’Helicobacter pylori ma anche ad altre forme di gastrite, come, per esempio, la

gastrite autoimmune.

Una review del 2011 a cura di Nweneka et al. ha raggruppato numerosi studi

riguardanti l’associazione tra ghrelina e Helicobacter per determinare la reale

80

esistenza di questo legame e, se presente, le sue caratteristiche. Gli studi presi in

considerazione prevedevano l’utilizzo di campioni infettati e di controlli sani e la

determinazione dei livelli di ghrelina prima e dopo l’eradicazione del batterio.

Nella grande maggioranza di questi studi è stato evidenziato come i livelli di

ghrelina sierica in pazienti sani fossero significativamente più elevati rispetto ai

pazienti infettati (213). Cindoruk et al., però, puntualizzano in un loro lavoro che

i livelli di ghrelina in pazienti infetti senza gastrite cronica non si discostano

significativamente dal campione, ponendo quindi la gastrite come una condicio

sine qua non (214).

I dati riportati da un lavoro di Nwokolo et al. sostengono che i livelli di ghrelina

dopo l’eradicazione dell’infezione aumentano sensibilmente, fino a una

percentuale massima stimata del 75% (215). La questione sugli effetti benefici

dell’eradicazione, però, è controversa. E’ plausibile che la terapia specifica anti-

Helicobacter provochi un incremento dei livelli sierici di ghrelina, tuttavia dal

momento che l’infezione da Helicobacter pylori causa atrofia a livello della

mucosa, questo concetto risulta essere effettivamente dipendente dalla durata

dell’infezione, dall’entità del danno sulle cellule produttrici di ghrelina e dal

tempo di recupero delle cellule stesse (213). Gli effetti sulle cellule secernenti

l’ormone esercitati dal batterio sono stati studiati tramite misurazione dell’mRNA

della ghrelina a livello gastrico, dimostrando una sensibile diminuzione di

quest’ultimo nei pazienti infetti, così come anche il numero stesso delle cellule

produttrici (216). Il grado stesso di atrofia, quindi, è una variabile importante. E’

stato inoltre osservato che la concentrazione di ghrelina può essere anche messa in

relazione con i livelli di alcuni zimogeni, nella fattispecie il pepsinogeno I e II, le

cui concentrazioni si riducono sensibilmente in corso di gastrite atrofica.

Le discrepanze presenti circa la risposta all’eradicazione dell’infezione possono

anche essere messe in correlazione ai vari ceppi di Helicobacter pylori. Isomoto

et al. hanno infatti dimostrato che la diversità dei ceppi è associata ai livelli di

ghrelina plasmatici e gastrici nell’uomo. Pazienti affetti da ceppi esprimenti VacA

e CagA possedevano livelli di ghrelina sierica nettamente inferiori ai pazienti con

ceppi cagA-negativi (217).

81

Essendo la ghrelina un ormone oressizzante, un suo marcato incremento provoca

anche un aumento dell’appetito con conseguente aumento del peso corporeo

(218).

Uno studio italiano del 2007 ha osservato, contrariamente a quanto finora

descritto, che in 25 pazienti con gastrite atrofica i livelli di ghrelina acilata

risultavano maggiori rispetto al controllo senza tuttavia trovare significative

differenze nel computo totale della ghrelina sierica. Ciò può dipendere da un

aumentato processo di acilazione della ghrelina residua (219).

Sono pochi, contrariamente alla ghrelina, gli studi condotti sul comportamento

dell’obestatina in corso d’infezione da Helicobacter pylori. Uno studio di Sin-

Yuan Gao et al. ha preso in considerazione una popolazione di 100 uomini,

comprendendo anche soggetti con età superiore a 65 anni, con un campione di 50

uomini affetti da gastrite atrofica e 50 controlli. I livelli plasmatici di obestatina,

in accordo con quelli della ghrelina, risultavano essere inferiori nei soggetti con

gastrite. E’ stata inoltre osservata una relazione negativa tra obestatina circolante

e BMI (body mass index), cosa invece non osservata nei pazienti gastritici (220).

L’infezione da Helicobacter può anche alterare il comportamento di altri ormoni

tra quelli descritti in questo capitolo. Tra questi ritroviamo la leptina, la cui

concentrazione e l’espressione del suo mRNA a livello dello stomaco aumenta in

maniera significativa nei soggetti positivi all’Helicobacter, con riduzione in caso

di eradicazione (221). Gli alti livelli di leptina si associano a un aumento della

produzione di IL-1, IL-6 e TNF-α, tipico dell’infezione da Helicobacter, e ciò può

essere ricondotto ad un potenziale ruolo delle leptina nei processi di

infiammazione e risposta immunitaria al batterio. La stessa risposta immunitaria è

associata con l’iperespressione di geni delle adipochine, tra cui anche quelli

dell’adiponectina e delle resistine (222). L’adiponectina e le resistine sono fattori

multi-task e rientrano in molteplici disordini, tra cui anche patologie esofagee, del

piccolo e del grosso intestino. Tuttavia, nell’uomo, bassi livelli di adiponectina

sono stati rinvenuti in soggetti giapponesi di mezza età portatori di gastrite

atrofica da Helicobacter pylori, ma il significato clinico di queste osservazioni

resta ancora poco chiaro (223).

82

E’ stato dimostrato che le cellule epiteliali gastriche sia in vivo sia in vitro

esprimo il peptide β-defensina di tipo I. Al contrario, in seguito ad infezione da

Helicobacter pylori le stesse cellule epiteliali secernono β-defensine di tipo II,

cosa che avviene anche in seguito a stimolazione con IL-1. Dati relativi ad alcuni

studi suggeriscono che tali defensine siano una componente della risposta immune

contro l’Helicobacter pylori (224).

3.5 Ormoni dell’appetito e riproduzione.

Gli ormoni regolatori dell’appetito sono stati per molti aspetti studiati per

quanto riguarda lo sviluppo sessuale e la riproduzione. I punti presi in

considerazione in questi studi sono svariati, ma la maggior parte di essi ha come

protagonista la ghrelina.

Per quel che riguarda le donne, recettori per la ghrelina sono presenti nelle ovaie

di mammiferi e di animali non mammiferi, e probabilmente questi organi sono

target per quest’ormone. Verosimilmente la ghrelina ha un ruolo nella regolazione

della funzione ovarica, con azione inibitoria sulla steroidogenesi ed effetti sullo

sviluppo e maturazione dell’ovocita (studi effettuati su modelli animali) (225).

Uno studio di Messini et al. (2009) ha valutato gli effetti della ghrelina sulla

secrezione delle gonadotropine durante il ciclo mestruale. Secondo tale studio non

esistono modificazioni sostanziali dei livelli di LH e FSH dovuti a un

innalzamento acuto di ghrelina in donne sane, quindi questo ormone esula dalla

regolazione di questo sistema (226). Schöfl et al. hanno invece ricercato il

significato dei bassi livelli di ghrelina riscontrati in donne con sindrome

dell’ovaio policistico (PCOS), non trovando in questo caso una diretta

correlazione dei livelli dell’ormone con LH e FSH ma configurando per la

ghrelina un ruolo nell’insulino-resistenza spesso presente in questa patologia

(227). Panidis et al. nel 2005, invece, osservarono che i livelli di ghrelina erano in

relazione inversamente proporzionale alle concentrazioni di androgeni,

probabilmente a causa del ruolo regolatore della ghrelina nella sintesi degli

steroidi e/o nei loro meccanismi d’azione. E’ anche riportato che le differenti

manifestazioni cliniche e biochimiche della PCOS possono essere anche dovute ai

83

diversi valori della ghrelina (228). Sempre Panidis et al. nel 2003 dimostrarono

ridotti valori di adiponectina in pazienti con policistosi ovarica (229). La

riduzione dell’ormone leptina è stata messo in associazione con alcuni disturbi

della fertilità femminile, tra cui l’amenorrea di origine ipotalamica (230).

Uno studio di El-Eshmawy et al. del 2010 s’incentrava sull’associazione tra

ghrelina e leptina con gli ormoni riproduttivi nel ritardo di crescita e pubertà nei

maschi. Come già prima riportato, la ghrelina rientra nei meccanismi di

secrezione del GnRH con meccanismo inibitorio, mentre la leptina pare abbia un

effetto stimolante. Secondo questo studio l’elevato valore di ghrelina e il ridotto

livello di leptina possono essere implicati nel ritardo di pubertà. Sono stati inoltre

valutati i livelli di FSH, LH e testosterone, ed è stato osservato che mentre la

leptina stimola la produzione di LH e FSH, la ghrelina ha un effetto negativo su

LH e testosterone, soprattutto nel periodo pre-puberale (231). L’associazione

ghrelina-LH è riportata in più studi: in modelli in vitro è stata dimostrata la

riduzione della risposta all’ormone rilasciante LH (LHRH), e per l’appunto ridotta

secrezione di LH in vivo (225).

Come la ghrelina possa rientrare nelle meccaniche della fertilità maschile è

oggetto di svariati studi. L’espressione della ghrelina è stata dimostrata a livello

genitale in roditori e altri mammiferi ed è presente nel testicolo umano,

soprattutto a livello delle cellule di Leydig e del Sertoli. Uno degli effetti della

ghrelina a questi livelli può essere correlato alla steroidogenesi testicolare. In

modelli murini e in vitro, l’incremento della ghrelina inibisce significativamente e

in maniera dose-dipendente il rilascio di testosterone sia hCG- che cAMP-indotto

da parte delle cellule di Leydig con modalità ancora poco chiare. Si può dire,

dunque, che i livelli di testosterone sierico sono inversamente proporzionali

all’espressione della ghrelina da parte delle cellule di Leydig (232–233). Altro

effetto della ghrelina si ha a livello dei tubuli seminiferi. E’ stato osservato che

l’iniezione intratesticolare di ghrelina nei topi provoca un’inibizione

dell’espressione di mRNA prodotto del gene dello Stem Cell Factor (SCF), un

segnale chiave per la produzione delle cellule staminali germinali e probabile

regolatore dello sviluppo delle cellule di Leydig. E’ stato dimostrato che

l’iniezione intratesticolare di ghrelina può anche inibire lo sviluppo delle cellule

di Leydig immature in epoca pre-puberale (234).

84

La ghrelina può essere rinvenuta nel liquido seminale e quest’aspetto e il suo

significato sono oggetto di studio di numerose trattazioni. I livelli di ghrelina nel

liquido seminale sono pari circa al 27% della corrispondente concentrazione

plasmatica di soggetti con normospermia (235.).

I livelli di ghrelina nel liquido seminale potrebbero essere correlati con

l’infertilità, soprattutto come risposta all’infezione da Helicobacter pylori.

Quest’ultima associazione, unita anche alla determinazione dei livelli di

obestatina, è materia della sezione sperimentale di questa tesi.

85

Parte sperimentale

86

4. Scopo della tesi

Lo scopo della presente tesi è di determinare se i tipi istologici di carcinoma

gastrico possono essere associati coi polimorfismi di cagA e di vacA di ceppi di

H. pylori isolati da pazienti gastroresecati per carcinoma gastrico.

Abbiamo visto come la proteina CagA, una volta inoculata nel mucocita, venga

fosforilata e trasformata in un'oncoproteina. Il sito di fosforilazione è costituito

dalla sequenza aminoacidica EPIYA. La regione variale (C'-terminale) di CagA è

polimorfa in quanto comprende una o più ripetizioni contenenti questa sequenza.

L'ipotesi è che maggiore è il numero di ripetizioni, più facilmente i ceppi batterici

che le ospitano possono concorrere allo sviluppo del carcinoma gastrico.

L'altro fattore di virulenza potenzialmente associato allo sviluppo di un carcinoma

gastrico è VacA, la tossina vacuolizzante che mostra anch'essa una variabilità

strutturale nelle sezioni s (da signal sequence) ed m (da middle sequence) della

proteina, cioè la parte iniziale e mediale. E' stato osservato che determinati

polimorfismi genomici di vacA, in particolare s1/m1, appartengano a a ceppi

isolati significativamente più spesso da pazienti con carcinoma gastrico.

Il carcinoma gastrico può essere classificato in due varianti istologiche principali:

il tipo intestinale e il tipo diffuso. Lo sviluppo di carcinoma gastrico tipo

intestinale è preceduto da alterazioni della mucosa gastrica, come atrofia,

metaplasia intestinale e displasia. Il carcinoma gastrico tipo diffuso, invece, non è

preceduto da alterazioni metaplastiche e apparentemente origina de novo dal

colletto iperplastico di ghiandole gastriche attraverso il coinvolgimento di vari

oncogeni e geni oncosoppressori.

87

SEZIONE SPERIMENTALE

Un gruppo di 28 pazienti con carcinoma gastrico non cardiale è stato selezionato

per questo studio; 15 pazienti avevano un carcinoma gastrico varietà intestinale e

13 un carcinoma gastrico varietà diffuso. I ceppi di H. pylori sono stati isolati

mediante coltura su agar selettivo. Da ciascun paziente sono stati isolate fino a 25

colonie di H. pylori. I ceppi venivano subcoltivati e conservati a – 80 °C in brodo

glicerolo fino al momento dell’esame genetico.

Estrazione del DNA e PCR

Un totale di 226 colonie è stato isolato dalla mucosa gastrica resecata. Il DNA di

ciascuna colonia è stato estratto in accordo al Puro gene DNA purificazione KIT

protocol (Gentrasystem Minneapolis, Minn).La concentrazione del DNA era

calcolata allo spettrofotometria. Il tipo strutturale cagA è stato determinato

utilizzando i primer sottoelencati, che comprendono tutta la regione variabile di

cagA.

CagA senso :AACCCTAGTCGGTAATGGGTTAT Cag A antisenso: GTAATTGTCTAGTTTCGC

Per aumentare la specificità della PCR, tutti gli amplificati sono stati ottenuti in

test di amplificazione interna (nested PCR) di ampliconi ottenuti con i seguenti

primer specificy per l’intero gene cagA.

CagA1 :AGCGGTATCAATGGCTAAAGC CagA2:CGTGCTCCATTCTGGATATTG

Gli ampliconi così ottenuti venivano separati elettroforeticamente in un gel di

agarosio e le dimensioni calcolati con 'ausilio di pesi molecolari noti.

Le regioni s ed m di vacA venivano amplificate coi primer sottoriportati

88

Allele Direzione Sequenza bp del prodotto

vacA1 senso 5’-GAAATACAACACACCGC-3’ 201 antisenso 5’-GGCTTGTTTGAGCCCCAG-3’ vacA3 senso 5’GGTCAAAATGCGGTCATGG-3’ 388 antisenso 5’-CATCAGTATTTCGCACCACA-3’ vacA4 senso 5-CCAGGAAACATTGCCGGCAAA-3’ 346 antisenso 5’-CATAACTAGCGCTTGCAC-3’

STATISTICA

I dati sono stati riportati in frequenze assolute e in percentuali. L’associazione tra

variabili considerate sono state valutate col il test del Chi quadro e un valore di p

<0,05 veniva considerato statisticamente significativo. Tutte le analisi sono

effettuate utilizzando in software SPSS v 17 (SPSS INC., Chicago, U.S.A.).

5. Risultati

Associazione tra ceppi cagA positivi e istotipo di carcinoma gastrico

I risultati sono stati riassunti nella tabella 1, riportata di seguito. Dei 226 ceppi

isolati, 214 erano cagA positivi (cagA+) e 12 erano cagA negativi (cagA-). I ceppi

ottenuti da pazienti con carcinoma gastrico tipo intestinale erano 119; quelli

ottenuti da pazienti con carcinoma gastrico diffuso erano 95 (44,3%). Tutti e 12 i

ceppi cagA- sono stati isolati da casi di carcinoma gastrico diffuso (p< 0,001,

Tabella 1).

Associazione tra tipi strutturali cagA e varietà istologica di carcinoma gastrico

Nessun ceppo con un particolare tipo cagA è stato trovato significativamente più

spesso in una delle due varianti di carcinoma gastrico. Ceppi con tipo strutturale

cagA C (no., 4) sono stati identificati soltanto in pazienti con carcinoma gastrico

istotipo intestinale (p=0,063) Il tipo strutturale cagA C corrisponde alla regione

variabile con il più alto numero di ripetizioni EPIYA.

89

Ceppi con tipi strutturali cagA diversi dal tipo C erano distribuiti in modo simile

nelle due varietà di carcinoma gastrico, suggerendo che lo sviluppo di carcinoma

gastrico intestinale o diffuso non dipendeva dal numero di motivi EPIYA presenti

nella regione variabile di cagA.

Dei 15 pazienti con carcinoma gastrico intestinale, 7 erano infettati da ceppi con

un solo tipo cagA, mentre 8 pazienti erano infettati da ceppi con più di un tipo

strutturale.

Tra i 13 pazienti con carcinoma gastrico diffuso, 9 erano colonizzati da ceppi con

un solo tipo cagA e 4 con più di un tipo. Queste differenze non erano

significative.

Questi risultati non dimostrano che il genotipo e il polimorfismo dell'agente

infettante possano influire sulla variante istologica del carcinoma gastrico.

Associazione tra sottotipi vacA e varietà istologica del carcinoma gastrico e tra

tipi strutturali cagA e sottotipi vacA

Il numero totale di ceppi con sottotipo vacA s1/m1 era 205, mentre i ceppi

sottotipo s1/m2 erano 21. Il 43.9% dei ceppi con sottotipo vacA s1/m1 era

associate con carcinoma gastrico intestinale, mentre l’80.9% dei ceppi sottotipo

vacA s1/m2 era isolato da casi di carcinoma gastrico istotipo diffuso (p<0.001).

Ceppi con sottotipo vacA s1/m1 erano distribuiti pressoché uniformemente tra I

diversi tipi strutturali cagA, eccetto il tipo C. L’89.9%, il 91.6% e il 94.2% dei

ceppi con questo sottotipo vacA erano associati con tipi strutturali cagA A(I), A e

B/D, rispettivamente.

Tutti i tipi strutturali cagAerano sottotipi vacA s1/m2.

Ceppi con il sottotipo vacA s1/m2, considerate meno carcinogenetico, erano

identificati per lo più in casi di carcinoma gastrico di tipo intestinale. Tuttavia, è

90

stato anche visto che tutti i ceppi col tipo strutturale cagA C erano del sottotipo

vacA s1/m2 e nessuno era vacA s1/m1 (Tabella 1).

6. Discussione

Associazione tra infezione da ceppi cagA+ e istotipo di carcinoma gastrico

E’ noto che il rischio di sviluppare un carcinoma gastrico associato ad infezione

da H. pylori aumenta ulteriormente se il ceppo colonizzanti esprimono la proteina

CagA (246-248). Il rischio è solo modestamente aumentato tra i soggetti infettati

da ceppi CagA-, rispetto alle persone non infettate. Se però stratifichiamo gli

individui per varietà tumorale, ci accorgiamo che le infezioni da ceppi CagA- non

sono strettamente associati allo sviluppo di una neoplasia gastrica, e possono solo

aumentare il rischio di sviluppare un carcinoma gastrico dell’istotipo diffuso

(247).

Un ulteriore studio ha riportato un’associazione tra l’assenza di cagA nel ceppi

infettanti e sviluppo di carcinoma gastrico diffuso (40).

Nonostante nei nostri pazienti l’infezione da ceppi cagA- fosse associate con un

carcinoma gastrico tipo diffuso, tutti i pazienti alberganti ceppi cagA- ospitavano

anche ceppi cagA+.

Associazione tra tipi strutturali cagA e varietà istologica del carcinoma gastrico

del carcinoma gastrico

In questo studio, abbiamo notato che nessun ceppo con un particolare tipo cagA

era maggiormente prevalente in una delle due varietà istologiche di carcinoma

gastrico, suggerendo che il numero di motivi EPIYA, presenti nella regione

91

variabile di CagA non contribuiva allo sviluppo di uno o dell’altro tipo istologico

di carcinoma gastrico.

Abbiamo anche notato la tendenza dei ceppi con tipo strutturale cagA C (no. = 4)

a concentrarsi nei pazienti con carcinoma gastrico istotipo intestinale (p=0.063); è

probabile che, se il numero dei casi fosse stato più alto, la maggior prevalenza di

ceppi col tipo strutturale cagA C nei pazienti con carcinoma gastrico intestinale

sarebbe stata significativa, in quanto nessun ceppi con tipo cagA C è stato isolato

da pazienti con carcinoma gastrico diffuso.

Associazione tra sottotipi vacA e varietà del carcinoma gastrico e tra tipi

strutturali cagA e sottotipi vacA

In questo studio, abbiamo fatto alcune osservazioni che meritano d’essere

discusse:

• La maggior parte dei ceppi col sottotipo s1/m2, che è considerato

meno carcinogenico, è stata identificate in casi di carcinoma gastrico

istotipo intestinale.

• Tutti i ceppi cagA tipo C erano vacA s1/m2 e nessuno era vacA

s1/m1 (Tabella 1).

92

Tabella 1. Istotipi di carcinoma gastrico, tipi strutturali cagA e sottotipi vacA dei

ceppi isolati.

Case

no.

Carcinom

a

histotype

No. of

colonies

examined

(cagA+and

cagA-)

No. of

colonies

cagAtyp

e A(I)

No. of

colonies

cagAtyp

e A

No. of

colonies

cagAtyp

e B/D

No. of

colonies

cagAtyp

e C

No. of

colonies

vacAtyp

e

s1/m1

No. of

colonies

vacAtyp

e s1/m2

1 Intestinal 6 and 0 0 3 3 0 6 0

4 Intestinal 10 and 0 0 4 4 2 8 2

6 Intestinal 9 and 0 0 4 3 2 7 2

11 Intestinal 4 and 0 4 0 0 0 4 0

12 Intestinal 4 and 0 0 0 4 0 4 0

13 Intestinal 25 and 0 0 25 0 0 25 0

14 Intestinal 5 and 0 5 0 0 0 5 0

15 Intestinal 4 and 0 0 0 4 0 4 0

16 Intestinal 9 and 0 0 3 6 0 9 0

19 Intestinal 8 and 0 0 4 4 0 8 0

21 Intestinal 6 and 0 0 3 3 0 6 0

24 Intestinal 4 and 0 0 4 0 0 4 0

26 Intestinal 4 and 0 0 4 0 0 4 0

27 Intestinal 13 and 0 1 3 9 0 13 0

28 Intestinal 8 and 0 0 3 5 0 8 0

2 Diffuse 4 and 1 0 0 4 0 1 4

3 Diffuse 4 and 0 0 4 0 0 4 0

5 Diffuse 4 and 0 0 4 0 0 4 0

7 Diffuse 4 and 1 0 0 4 0 1 4

8 Diffuse 12 and 3 5 6 1 0 15 0

9 Diffuse 14 and 0 2 3 9 0 14 0

10 Diffuse 6 and 0 0 0 6 0 6 0

17 Diffuse 12 and 4 5 6 1 0 16 0

18 Diffuse 14 and 0 2 4 8 0 14 0

20 Diffuse 5 and 2 0 0 5 0 2 5

22 Diffuse 4 and 1 0 0 4 0 1 4

23 Diffuse 8 and 0 0 8 0 0 8 0

25 Diffuse 4 and 0 0 4 0 0 4 0

93

Queste osservazioni suggeriscono che il ridotto potenziale neoplastico del

sottotipo s1/m2 di vacA potrebbe essere bilanciato dall’elevato potere

carcinogenico di cagA tipo C.

Il carcinoma gastrico è la quarta più comune neoplasia maligna e la sola associate

ad infezione batterica cronica. Gli istotipi intestinale e diffuso del carcinoma

gastrico sono entità differenti e hanno distinti processi carcinogenetici. Il tipo

intestinale di carcinoma gastrico è preceduto da alterazioni della mucosa gastrica,

come atrofia, metaplasia intestinale e displasia

Il carcinoma gastrico varietà diffuse origina su una base di infiammazione cronica

e non è preceduto dalla cosiddetta “cascata di Correa”. Il carcinoma gastrico

diffuso mostra uno sviluppo progressivo e invasivo e il fatto che non è preceduto

da atrofia gastrica e metaplasia intestinale potrebbe ritardare la diagnosi di cancro

e quindi peggiorare la prognosi (249).

7. Conclusioni

In conclusione, questi risultati dimostrano che tutti i pazienti esaminati erano

infettati da almeno un ceppo cagA+, che una considerevole proporzione dei

pazienti era infettata da ceppi con più d’un tipo strutturale cagA e che tutti i

pazienti avevano nel loro stomaco almeno un ceppo con sottotipo vacA s1/m1. Il

polimorfismo del gene cagA non è risultato associato con alcuna varietà istologica

del carcinoma gastrico, mente il polimorfismo di vacA, in particolare il sottotipo

s1/m2, può influire sull’istotipo della neoplasia, dato che l’80,9% dei ceppi con

questo sottotipo è stato isolato da casi di carcinoma gastrico diffuso (p<0.001).

94

Questi dati indicano che la variabilità genomica dei principali fattori di virulenza

di H. pylori può contribuire a determinare il tipo istologico del cancro. Infine,

questo studio suggerisce che, per una migliore comprensione del ruolo che hanno

i principali determinanti di virulenza nelle malattie associate ad infezione, è

necessario esaminare diverse colonie per paziente e non a limitarsi ad una,

considerata rappresentativa del clone infettante

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