Metodi di studio

Il primo microscopio ottico

Un microscopio semplice Hooke, 1665

Un moderno microscopio

Microscopi ottici da esercitazione

Anatomia di un microscopio

StativoFonte di illuminazione

Fotocamera o telecamera

Oculari

Diaframma di campo

Revolver con obiettiviTavolino

traslatore

Vite macrometrica e micrometrica

Condensatore

Anatomia di un microscopio

Anatomia di un microscopio

Anatomia di un microscopio

Microscopia Microscopia OtticaOttica

OSSERVAZIONI A FRESCO

Microscopia Ottica

• Prime osservazioniPrime osservazioni• Il preparato si deteriora

velocemente• Poco informativePoco informative

• Descrizioni brevi ed inesatte

Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata

Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica

Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato

Preparati in campo chiaro

Un batterioCampo chiaro, 1000x

Cellule

Microscopia Otticaa Contrasto di fase

• Gli oggetti visti in campo chiarocampo chiaro hanno poco poco contrastocontrasto

• Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazionelievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante

• Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nell’obiettivo

• I raggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati

Microscopia Ottica a Contrasto di fase

Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a frescoLe varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio

Un batterio400x

Un lievito(S. cerevisiae)

400x

Una muffa(G. candidum)

400x

Osservazione in campo scuroUn particolare tipo di

condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato.Gli oggetti appariranno Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo chiari su uno sfondo scuro.scuro.In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico

Osservazione in campo scuro

Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei

preparatiUtilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio

Coloranti vitaliColoranti vitaliLe cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamentoOggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse

Coloranti che richiedono fissazioneColoranti che richiedono fissazioneLe cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule

Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia

Ottica

• AcquisizioneAcquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3)• Biopsia, intervento chirurgico,

autospia postmortem• Prelevato rapidamente utilizzando

strumenti adatti (bisturi)

• FissaggioFissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare)• Generalmente per mezzo di aldeidi

reattive (formaldeide)• Cross-link delle macromolecole, in

particolare le proteine• Si ottiene un effetto indurente sui

tessuti "molli"• Deve essere fatto rapidamente per

evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto

• DisidratazioneDisidratazione del campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo• ParaffinaParaffina (materiale usato per

l'inclusione) non è solubile in H2O

• EliminazioneEliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene• Paraffina non è solubile nemmeno

nell'etanolo

• InclusioneInclusione del campione in in mezzo appropriato paraffina o resina• Tessuti sono "molli" e fragili• Diversi passaggi in paraffina calda• La paraffina occupa lo spazio

precedentemente occupato dall'H2O• La paraffina fredda si indurisce e

permette di sezionare il campione

Sezione non colorata

TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 m

MontaggioMontaggio delle sezioni su vetrini per microscopia

ColorazioneColorazione delle sezioni con il metodo più appropriatoI coloranti sono a base acquosa, per cui si

elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo

Colorazione automatizzata

Colorazioni

• ColorazioneColorazione• Con un colore brillante di

certe componenti del tessuto

• Contro colorazioneContro colorazione• Del resto del tessuto con un

colore contrastante

• EmatossilinaEmatossilina• Ha affinità per le molecole

cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine)

• EosinaEosina• Ha affinità per le molecole

cariche positivamente (proteine del citosol)

Ematossilina/Eosina

Perchè questa "slide" è blu Perchè questa "slide" è blu ……

• Se una porzione di Se una porzione di tessuto o di una tessuto o di una cellula si colora di cellula si colora di blu/porporablu/porpora, viene , viene detta detta basofilabasofila

• È colorata È colorata dall'dall'ematossilinaematossilina

• Nuclei e ribosomiNuclei e ribosomi generalmente sono generalmente sono basofilibasofili

… … e questa rossa ?e questa rossa ?• Se una porzione si colora in rosso rosso /arancio/rosa/arancio/rosa, viene detta acidofilaacidofila o o eosinofilaeosinofila

• È colorata dall'eosinaeosina

• Sono le proteine del proteine del citosolcitosol

Altre colorazioni• PAS PAS (Acido Periodico-Reattivo di (Acido Periodico-Reattivo di

Schiff)Schiff)• Per sostanze ricche in

zuccheri (muco)

• Tricromica o Hazan-Tricromica o Hazan-MalloryMallory• Per i tessuti

connettivi• Le fibre si colorano in

blu• Con E&E sono rosa

Le aree bianche sono lipidi

Adiposo Bianco

• Osmio o Sudan blackOsmio o Sudan black • Per

grasso/lipidi/mielina• I lipidi non incorporano

coloranti acquosi

• Argento ed oroArgento ed oro• Per fibre delicate e

processi cellulari

• GiemsaGiemsa• Per le cellule del

sangue• Simile ad E&E

Mielina

Cellule nervose

Cellule del sangue

E le aree "bianche"?• I fluidi presenti nei

tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E• Sangue, linfa etc.

• Si riconoscono come ampi spazi bianchi

• Anche i lipidi ed il grasso non si colorano Mesenchima

Interpretate il campione !!!

• Dovete pensare in 3 dimensioni3 dimensioni• Sezioni serialiSezioni seriali sono l'ideale per

l'interpretazione e la ricostruzione

Ricostruzione per mezzo di sezioni seriali

“Artefatti”• ShrinkageShrinkage

• Lascia dello spazio aggiuntivo

• Disidratazione e fissaggio

• Fratture al piano Fratture al piano di tagliodi taglio• Tagli netti e ben

visibili• Lama deteriorata

• Colorante Colorante precipitatoprecipitato• Macchie di colore a

"grano di pepe”

• Tessuto "pinzato"Tessuto "pinzato"• Strumento per

l'excisione deteriorato

• Durante o dopo il sezionamento

• PieghePieghe• Durante il

montaggio

Microscopia Microscopia ElettronicaElettronica

Microscopia Elettronica a Trasmissione

• Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta• Alta risoluzioneAlta risoluzione

• Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi

• Gli elettroni passano attraverso il campione

La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio otticoRisoluzione Risoluzione dell'occhiodell'occhio: 0.2 mm = 200 µmRisoluzione del MORisoluzione del MO: 200 nm = 2,000 AngstromsRisoluzione del TEM:Risoluzione del TEM: 2 Angstroms1 mm = 1000 µm1 µm = 1000 nm1 nm = 10 Angstroms

Pinocitosi

Preparazione di Campioni Biologici per TEM

• AcquisizioneAcquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3)

• FissaggioFissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio• L’osmio è un metallo pesante che si lega ai

lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)• Coloranti non legano i lipidi, che nelle

sezioni appaiono chiari

DisidratazioneDisidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo

InclusioneInclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina

TaglioTaglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomoultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro)La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mmLo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm)

MontaggioMontaggio delle sezioni su di una grigliaColorazione delle sezioniColorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piomboVisualizzazioneVisualizzazione al TEMFotografia, sviluppo ed analisi delle immagini

Freeze-fracture

• Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150 °C

• Con un martelletto viene provocata la frattura, secondo le linee di forza del tessuto

• Evaporazione e deposizione di metalli pesanti

• Eliminazione materia organica

Autoradiografia

Utilizzando isotopi radioattivi si possono marcare strutture cellulari ben definite e visualizzarle poi tramite microscopia ottica od elettronica

Ottico Elettronico

Microscopia Elettronica a Scansione

SEM fa una scansione della superfice del campione

Produce immagini 3-D

Preparazione dei campioni per SEM

• AcquisizioneAcquisizione del campione• Trattandolo con cura in modo

da non danneggiare la superficie

• Fissazione e disidratazioneFissazione e disidratazione• NonNon si include

• Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo• Oro, cromo,

palladio, carbone• Deve essere

elettron-conducente (non elettrondenso)

• Visualizzato al microscopio

• Fotografato• Si possono

analizzare le componenti chimiche tramite raggi X

Microscopia a Fluorescenza

• Il campione viene colorato con anticorpi oppure sostanze specifiche coniugate con fluorocromi

• La luce utilizzata ha lunghezze d’onda specifiche per eccitare i fluorocromi

• I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde

Microscopia a Fluorescenza

Microscopia Confocale

• La luce monocromatica, di lunghezza d’onda breve, è emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda

• Le lenti dell’obbiettivo focalizzano la luce in un punto del piano ottico del campione

• I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati ed emettono a lunghezza d’onda maggiore, in grado di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel piano del diaframma

• Il foto-moltiplicatore amplifica l’intensità del segnale e lo trasmette al computer che elabora l’immagine

• La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale non passa attraverso il diaframma e non contribuisce alla formazione dell’immagine

• Diversi punti dello stesso piano e dei paini consecutivi vengono illuminati e registrati mediante la scansione col laser

QuickTime™ and aMotion JPEG A decompressor

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Metodi analitici

Come si analizzano gli organelli o la Come si analizzano gli organelli o la struttura fine?struttura fine?

Metodiche che permettono l’isolamento dei componenti cellulari intatti

Centrifugazione, semplice o Centrifugazione, semplice o differenzialedifferenziale

Permette l’isolamento sia delle cellule da un tessuto sia delle singole componenti cellulari

CentrifugazioneCentrifugazione

Centrifugazione Centrifugazione differenzialedifferenziale