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Anatomia di un microscopio
StativoFonte di illuminazione
Fotocamera o telecamera
Oculari
Diaframma di campo
Revolver con obiettiviTavolino
traslatore
Vite macrometrica e micrometrica
Condensatore
OSSERVAZIONI A FRESCO
Microscopia Ottica
• Prime osservazioniPrime osservazioni• Il preparato si deteriora
velocemente• Poco informativePoco informative
• Descrizioni brevi ed inesatte
Preparati in campo chiaro a goccia schiacciata
Su un vetrino porta-oggetto si pone una goccia di acqua o soluzione fisiologica
Il materiale da osservare viene posto sulla goccia ed osservato
Microscopia Otticaa Contrasto di fase
• Gli oggetti visti in campo chiarocampo chiaro hanno poco poco contrastocontrasto
• Per migliorare le immagini è possibile sfruttare le sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazionelievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare rispetto al mezzo circostante
• Applicando nel condensatore delle variazioni di fase alla luce che raggiunge il preparato e applicando variazioni opposte nell’obiettivo
• I raggi luminosi che sono stati modificati generano fenomeni di interferenza che rendono più chiari o più scuri gli oggetti illuminati
Microscopia Ottica a Contrasto di fase
Permette, tramite sistema di lenti di osservare le cellule a frescoLe varie parti della cellula appaiono come strutture con diverse tonalità di grigio
Osservazione in campo scuroUn particolare tipo di
condensatore nell’osservazione in campo scuro consente di deviare i fasci di luce in modo che le lenti frontali dell’obiettivo siano attraversati soltanto dai raggi di luce diffratti o diffusi dal preparato.Gli oggetti appariranno Gli oggetti appariranno chiari su uno sfondo chiari su uno sfondo scuro.scuro.In questo modo è possibile osservare oggetti anche al di sotto del potere di risoluzione del microscopio ottico
Uso di colorazioni per migliorare il contrasto dei
preparatiUtilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio
Coloranti vitaliColoranti vitaliLe cellule possono essere colorate senza fissazione e sono quindi solo minimamente alterate dal trattamentoOggi vengono utilizzati coloranti fluorescenti per colorare selettivamente specie diverse o strutture cellulari diverse
Coloranti che richiedono fissazioneColoranti che richiedono fissazioneLe cellule devono essere disidratate prima della colorazione, con possibile alterazione delle strutture cellulari e della forma delle cellule
Preparazione di un Campione Biologico per la Microscopia
Ottica
• AcquisizioneAcquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3)• Biopsia, intervento chirurgico,
autospia postmortem• Prelevato rapidamente utilizzando
strumenti adatti (bisturi)
• FissaggioFissaggio del campione (immobilizzare, "uccidere" e preservare)• Generalmente per mezzo di aldeidi
reattive (formaldeide)• Cross-link delle macromolecole, in
particolare le proteine• Si ottiene un effetto indurente sui
tessuti "molli"• Deve essere fatto rapidamente per
evitare che gli enzimi persenti degradino il tessuto
• DisidratazioneDisidratazione del campione attraverso passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo• ParaffinaParaffina (materiale usato per
l'inclusione) non è solubile in H2O
• EliminazioneEliminazione dell'etanolo e passaggi in xilene• Paraffina non è solubile nemmeno
nell'etanolo
• InclusioneInclusione del campione in in mezzo appropriato paraffina o resina• Tessuti sono "molli" e fragili• Diversi passaggi in paraffina calda• La paraffina occupa lo spazio
precedentemente occupato dall'H2O• La paraffina fredda si indurisce e
permette di sezionare il campione
Sezione non colorata
TaglioTaglio per mezzo di un microtomo, che produce sezioni dello spessore di 1-10 m
MontaggioMontaggio delle sezioni su vetrini per microscopia
ColorazioneColorazione delle sezioni con il metodo più appropriatoI coloranti sono a base acquosa, per cui si
elimina lo xilene attraverso passaggi in etanolo
Colorazione automatizzata
Colorazioni
• ColorazioneColorazione• Con un colore brillante di
certe componenti del tessuto
• Contro colorazioneContro colorazione• Del resto del tessuto con un
colore contrastante
• EmatossilinaEmatossilina• Ha affinità per le molecole
cariche negativamente (DNA, RNA ed alcune proteine)
• EosinaEosina• Ha affinità per le molecole
cariche positivamente (proteine del citosol)
Ematossilina/Eosina
Perchè questa "slide" è blu Perchè questa "slide" è blu ……
• Se una porzione di Se una porzione di tessuto o di una tessuto o di una cellula si colora di cellula si colora di blu/porporablu/porpora, viene , viene detta detta basofilabasofila
• È colorata È colorata dall'dall'ematossilinaematossilina
• Nuclei e ribosomiNuclei e ribosomi generalmente sono generalmente sono basofilibasofili
… … e questa rossa ?e questa rossa ?• Se una porzione si colora in rosso rosso /arancio/rosa/arancio/rosa, viene detta acidofilaacidofila o o eosinofilaeosinofila
• È colorata dall'eosinaeosina
• Sono le proteine del proteine del citosolcitosol
Altre colorazioni• PAS PAS (Acido Periodico-Reattivo di (Acido Periodico-Reattivo di
Schiff)Schiff)• Per sostanze ricche in
zuccheri (muco)
• Tricromica o Hazan-Tricromica o Hazan-MalloryMallory• Per i tessuti
connettivi• Le fibre si colorano in
blu• Con E&E sono rosa
Le aree bianche sono lipidi
Adiposo Bianco
• Osmio o Sudan blackOsmio o Sudan black • Per
grasso/lipidi/mielina• I lipidi non incorporano
coloranti acquosi
• Argento ed oroArgento ed oro• Per fibre delicate e
processi cellulari
• GiemsaGiemsa• Per le cellule del
sangue• Simile ad E&E
Mielina
Cellule nervose
Cellule del sangue
E le aree "bianche"?• I fluidi presenti nei
tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E• Sangue, linfa etc.
• Si riconoscono come ampi spazi bianchi
• Anche i lipidi ed il grasso non si colorano Mesenchima
Interpretate il campione !!!
• Dovete pensare in 3 dimensioni3 dimensioni• Sezioni serialiSezioni seriali sono l'ideale per
l'interpretazione e la ricostruzione
“Artefatti”• ShrinkageShrinkage
• Lascia dello spazio aggiuntivo
• Disidratazione e fissaggio
• Fratture al piano Fratture al piano di tagliodi taglio• Tagli netti e ben
visibili• Lama deteriorata
• Colorante Colorante precipitatoprecipitato• Macchie di colore a
"grano di pepe”
• Tessuto "pinzato"Tessuto "pinzato"• Strumento per
l'excisione deteriorato
• Durante o dopo il sezionamento
• PieghePieghe• Durante il
montaggio
Microscopia Elettronica a Trasmissione
• Elettroni hanno una lunghezza d'onda corta• Alta risoluzioneAlta risoluzione
• Sezioni molto sottili e coloranti elletrondensi
• Gli elettroni passano attraverso il campione
La maggiore risoluzione del TEM permette di visualizzare strutture non visibili con il microscopio otticoRisoluzione Risoluzione dell'occhiodell'occhio: 0.2 mm = 200 µmRisoluzione del MORisoluzione del MO: 200 nm = 2,000 AngstromsRisoluzione del TEM:Risoluzione del TEM: 2 Angstroms1 mm = 1000 µm1 µm = 1000 nm1 nm = 10 Angstroms
Pinocitosi
Preparazione di Campioni Biologici per TEM
• AcquisizioneAcquisizione del campione e taglio in pezzi (1cm3)
• FissaggioFissaggio del campione con glutaraldeide e poi tetrossido di osmio• L’osmio è un metallo pesante che si lega ai
lipidi, rendendoli elettrondensi (neri)• Coloranti non legano i lipidi, che nelle
sezioni appaiono chiari
DisidratazioneDisidratazione dei campioni tramite passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo
InclusioneInclusione dei campioni in piccoli blocchi di resina
TaglioTaglio dei campioni inclusi con un ultra-microtomoultra-microtomo dotato di lama al diamante (a volte vetro)La superfice da analizzare deve essere di circa 0.2 mmLo spessore della sezione varia da 40 a 100 nm (di solito 65-80 nm)
MontaggioMontaggio delle sezioni su di una grigliaColorazione delle sezioniColorazione delle sezioni con nitrato o acetato di uranile e citrato di piomboVisualizzazioneVisualizzazione al TEMFotografia, sviluppo ed analisi delle immagini
Freeze-fracture
• Il tessuto prelevato viene congelato a -140/150 °C
• Con un martelletto viene provocata la frattura, secondo le linee di forza del tessuto
• Evaporazione e deposizione di metalli pesanti
• Eliminazione materia organica
Autoradiografia
Utilizzando isotopi radioattivi si possono marcare strutture cellulari ben definite e visualizzarle poi tramite microscopia ottica od elettronica
Microscopia Elettronica a Scansione
SEM fa una scansione della superfice del campione
Produce immagini 3-D
Preparazione dei campioni per SEM
• AcquisizioneAcquisizione del campione• Trattandolo con cura in modo
da non danneggiare la superficie
• Fissazione e disidratazioneFissazione e disidratazione• NonNon si include
• Poggiato su di un supporto e ricoperto con un metallo• Oro, cromo,
palladio, carbone• Deve essere
elettron-conducente (non elettrondenso)
• Visualizzato al microscopio
• Fotografato• Si possono
analizzare le componenti chimiche tramite raggi X
Microscopia a Fluorescenza
• Il campione viene colorato con anticorpi oppure sostanze specifiche coniugate con fluorocromi
• La luce utilizzata ha lunghezze d’onda specifiche per eccitare i fluorocromi
• I fluorocromi emettono radiazione blu, rossa o verde
Microscopia Confocale
• La luce monocromatica, di lunghezza d’onda breve, è emessa da una sorgente laser, attraverso un diaframma e deviata da uno specchio dicroico, che permette il passaggio di determinate lunghezze d’onda
• Le lenti dell’obbiettivo focalizzano la luce in un punto del piano ottico del campione
• I fluorocromi usati per colorare vengono eccitati ed emettono a lunghezza d’onda maggiore, in grado di attraversare lo specchio e focalizzarsi nel piano del diaframma
• Il foto-moltiplicatore amplifica l’intensità del segnale e lo trasmette al computer che elabora l’immagine
• La luce che proviene dai piani superiori o inferiori al piano focale non passa attraverso il diaframma e non contribuisce alla formazione dell’immagine
• Diversi punti dello stesso piano e dei paini consecutivi vengono illuminati e registrati mediante la scansione col laser
Metodi analitici
Come si analizzano gli organelli o la Come si analizzano gli organelli o la struttura fine?struttura fine?
Metodiche che permettono l’isolamento dei componenti cellulari intatti
Centrifugazione, semplice o Centrifugazione, semplice o differenzialedifferenziale
Permette l’isolamento sia delle cellule da un tessuto sia delle singole componenti cellulari