-En biochimie, on utilise surtout des IgG (+ affinité)

-On peut préparer des Ac polyclonaux (sérum d’un animal immunisé) ou

des Ac monoclonaux (technique des hybridomes).

-on peut être amené à devoir purifier ces préparations (Protéine G ou

Protéine A).

La spécificité (pas de reconnaissance croisée avec d’autres protéines)

Les Outils et techniques immunologiques

Rappels sur la réaction antigène-anticorps et ses applications

La réaction Ag-Ac a deux grands types d'applications : La détection et le dosage des antigènes (par des méthodes dont il faut vérifier la spécificité, la reproductibilité et la sensibilité). La détection et le titrage des anticorps (vis-à-vis d'un Ag ou d'un mélange d'Ag).

La réaction antigène - anticorps (Ag-Ac) est due à l'interaction entre les épitopes de l' antigène et les paratopes de l'anticorps.

Elle fait intervenir quatre types de liaisons non covalentes (des liaisons hydrogènes, des liaisons électrostatiques, des liaisons hydrophobes et les forces de Van der Waals).

Les Ac constituent des sondes moléculaires spécifiques vis à vis de n'importe quelle substance antigénique.

Interaction Antigène-Anticorps

Ac + Ag Ac-Ag k1=constante de vitesse d'association

k2=constante de vitesse de dissociation

ka= k1/k2 = constante d'association ou d'affinité (l/mol)

k1

k2

Affinité: force par laquelle un ligand (épitope) entre en interaction avec un site de liaison (paratope). Ex : forte affinité : 1011 l.mol-1 faible affinité : 104 l.mol-1

Valence Ag: nombre de molécule Ac qui se fixe sur Ag à saturation.

Valence Ac: nombre de site de fixation de l'Ag, 1 IgG (bivalent), 1IgM (decavalent).

Avidité: force de liaison entre l’Ag (multivalent) et l’Ac (multivalent) plus proche de la réalité. (affinité, conformation Ag, valence)

3

4

Mesure de l’ affinité: détermination de Ka

Dialyse à l’équilibre

Ac + Ag Ac-Ag

Ka

[Ac-Ag]

[Ac]x[Ag]

Ka =

Ag marqué radioactivement

Membrane semi-perméable

Valence (site de fixation)

Ac monoclonal Ac 1a plus forte affinité que 1b

2

-Ka

1a

1b

sérumpolyclonal #3 plus forte affinité que #1b

Courbes de Scatchard

Réaction de précipitation

(pour les molécules)

Précipitation

-Ag soit au moins bivalent ou multivalent

Il faut que: -Ac soit bivalent

zone d'équivalence

2 types de précipitation: *En milieu liquide (qualitatif)

*En milieu semi-solide (gélosé) (quantitatif et qualitatif):

a) Immunodiffusion radiale (Méthode de Mancini) *Méthode quantitative :mesure des diamètre

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b) Immunodiffusion double (Méthode d'Ouchterlony)

*Méthode qualitative

7

8

b) Immunodiffusion double (Méthode d'Ouchterlony)

Comparaison des épitopes d'Ag différents

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c) Immuno-electrophorèse

Réaction d'Agglutination (pour des cellules)

Ac peuvent agglutiner des bactéries, cellules (hématies).

Ex: l'Hémagglutination : Globules rouges (GR) + Ac anti GR

Hémagglutination (réseau)

Dilution croissante des Ac anti Globules Rouges

ELISA

(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

*Méthode très sensible pour doser (Ag ou Ac) et titrer des Ac.

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13

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

anti-espèce du primaire

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L’ELISpot But quantifier

les cellules

produisant la

molécule

recherchée

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Le Western Blot (Immuno Blot)

Conditions dénaturantes et reductrices

Ac I+ AcII-Enz

révélation

HRP:

Horseradish

peroxidase

HRP

Ac I anti-Protéine

d’intérêt

Ac II couplé à une enzyme anti-Ac I (anti espèce)

SDS + agent réducteur de ponts dissulfures

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Peroxydase Phosphatase Peroxydase Phosphatase

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L’immunoprécipitation (IP)

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L’immunoprécipitation d’une ou plusieurs protéines d’intérêt recherche de partenaires de la protéine d’interêt

Cytofluorométrie en flux (FACS :Fluorescence-activated cell sorting)

gate

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Immuno-Histochimie Immuno-Fluorescence

Immuno-Electromicroscopie

Les méthodes de fixation des tissus ou des cellules vont influer sur la structure des épitopes de l’antigène, donc jouer sur la reconnaissance des anticorps.

Plusieurs méthodes de fixation et de durée devront être testés pour que l’anticorps puisse reconnaître l’épitope.

Fixations de durée variable : Glutaraldéhyde Formaldéhyde Méthanol -20°C Acétone

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Immunohistochimie

Mouse monoclonal [H10E4C9F] to Mineralocorticoid Receptor

Microscopie optique

Immunofluorescence

Microscopie à fluorescence

Ac anti pericentrine Ac anti tubuline DAPI (marqueur ADN)

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Immuno-Electroscopie

Microscopie électronique

(Or colloïdale ou Férritine)

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Microscopie électronique à transmission

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1-10-Fonctions antimicrobiennes des Ig

1) Neutralisation

Agglutination:

De multiples pathogènes sont

aggrègés par les molécules

d’Ac

Pathogène anticorps

2) Activation de la voie classique du complément

1er composant du

complément

Pathogène quelconque Pore

-L’Ac se fixe sur le pathogène

-Fixation du 1er élément d’un réseau complexe de protéines sériques (“le complément”)

-Activation de la cascade du complément

-Formation d’un pore et lyse du pathogène

Lyse médiée par le complément de la bactérie E. coli.

=aide à la phagocytose

Macrophage

Récepteurs au Fc Opsonisation

Fc

-Macrophage reconnait les parties Fc des Ac par récepteurs Fc (RFc), activation de la phagocytose.

Principalement IgG et récepteur RFc.

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3) Opsonisation

3) Lyse ADCC (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)