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1
Inhibition des réactions
enzymatiques
Cours Franco-Québécois d’Enzymologie Avancée
Dr. Laurent SalmonLaboratoire de Chimie Bioorganique et Bioinorganique (LCBB)
Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay (ICMMO)
CNRS-UMR 8182, Directeur : Pr. Jean-Pierre MahyCentre Scientifique d'Orsay, Université Paris-Sud, bât. 420, 91405 Orsay Cedex, France
Bibliographie générale
2
Livres :
• L. Stryer : "Biochemistry" ( 3rd ed., Freeman)
• T. E. Creighton : "Proteins" (2nd ed., Freeman)
• D. Voet & J. G. Voet : "Biochimie" (2nd ed., DeBoeck Université)
• J. Pelmont : "Enzymes" (Presses Universitaires de Grenoble)
Sites internet/Bases de données :
• Entrez-PubMed : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
• Expasy : http://www.expasy.ch/
• Protein Data Bank : http://www.rcsb.org/pdb/
• Brenda : http://www.brenda-enzymes.info/
• EzCatDB : http://mbs.cbrc.jp/EzCatDB/
• Enzyme Nomenclature : http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
• Propka Web Interface : http://propka.ki.ku.dk/
Abbréviations utilisées
3
AS : activité spécifique
AT : activité totale
E : enzyme libre
EI : complexe enzyme-inhibiteur
EP : complexe enzyme-produit
ES : complexe enzyme-substrat
ESI : complexe enzyme-substrat-inhibiteur
I : inhibiteur
Ic : inhibiteur compétitif
Iirr : inhibiteur irréversible
kcat : constante catalytique
Ki : constante d'inhibition
Km : constante de Michaelis
P : produit
S : substrat
TO : turn-over
U : unité enzymatique (UI)
Vmax : vitesse maximale
Vo : vitesse initiale
Plan du cours
1. Présentation1.1. Généralités
1.2. Différents types cinétiques d’inhibiteurs d'enzymes
1.3. Intérêts et usages des inhibiteurs d’enzymes
1.4. Exemples d’agents thérapeutiques inhibiteurs d’enzymes
2. Inhibition réversible : généralités et cinétique2.1. Inhibition compétitive
2.2. Inhibition incompétitive (et par excès de substrat)
2.3. Inhibition non-compétitive pure
2.4. Inhibition non-compétitive mixte
3. Inhibiteurs réversibles : structure et mécanisme3.1. Inhibiteurs analogues de substrat
3.2. Inhibiteurs analogues de l’état de transition
3.3. Abzymes
4. Inhibiteurs irréversibles4.1. Marqueurs d'affinité
4.2. Inhibiteurs suicides
4
Cinétique de Michaëlis-Menten (rappels) :
E + S ESk1
k-1
E + Pk2
5
1. Présentation
1.1. Généralités
1
21m
[ES]
[E][S]
k
kkK
Constante de Michaelis-Menten
[S]
[S]VVo
s
maxK
Vitesse initiale
cat2 kk
1
1
[ES]
[E][S]
k
kKS
Constante de dissociation
de ES en E + S
1. Equilibre rapide entre E + S et ES et k2 lente :
2. Hypothèse de l’état quasi-stationnaire :
[S]
[S]VVo
m
maxK
Equation de Michaelis-Menten
Km = KS si k2 « k-1
[E]T = [ES] + [E]
Vmax = kcat[E]T
Vo = kcat[ES]
Inhibiteur d’enzyme (I) :
-Entité l’activité enzymatique ( la vitesse d’une réaction enzymatique) :
-En se liant à l’enzyme, un inhibiteur peut :
• empêcher la fixation de S au site actif,
• provoquer une déformation du site actif (notamment à l’état de transition) et rendre
l’enzyme moins active (voire inactive) vs S.
-L’affinité de I pour E est traduite par la constante d’inhibition Ki :
• Ki = cte de dissociation de EI en E + I (unité : M),
6
• Ki = [I] pour laquelle la moitié des sites enzymatiques est occupée,
• + Ki est petit, + l’affinité de I pour E est grande,
• Inhibiteur « idéal » : forte affinité (Ki petit) pour E et forte sélectivité vs S (Km/Ki
grand).
[EI]
[E][I]
i
i-i
k
kKE + I EI
ki
k-i
VoVo I
Exemple : PGI µM 200F6P
mK
nM 2005PAH
iK1000im KK
7
Conception des inhibiteurs :
-Beaucoup d'inhibiteurs (médicaments) ont été trouvés par hasard !
-Ethnopharmacologie
-Criblage à haut débit (HTS ou High Throughput Screening) de produits naturels ou
synthétiques (chimiothèques…)
-Criblage virtuel (screening « in silico »)
-Conception d’un I vs E ciblée par docking
Nature des inhibiteurs :
-Analogues de S (ou P)
-Analogues de l’ET ou IHE
-Complexants de métaux (EDTA…)
-Structures diverses (généralement trouvés par hasard)
« Mimes » : qui ressemblent à… sans être eux-mêmes transformés
CK2
POMs
Inhibition non-compétitive (IC50 = 3 nM) d’une protéine kinase (CK2) par un composé de type polyoxométallate (POM).
Chem. Biol., 2008, 15, 683-692
© CEA
8
1.2. Différents types cinétiques d’inhibiteurs d'enzymes
Inhibiteurs réversibles :
-Liaison non-covalente (ou covalente) peu stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexes
EI, ESI).
-L'inhibition est réversible (peut être levée), i.e. l’enzyme n’est pas irréversiblement
inhibée :
• Inhibiteurs compétitifs
• Inhibiteurs incompétitifs (et inhibition par excès de substrat)
• Inhibiteurs non-compétitifs purs
• Inhibiteurs non-compétitifs mixtes
Inhibiteurs irréversibles :
-Liaison covalente (ou non-covalente) stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexe E-I)
-Inhibition ne peut pas être levée (inactivation l’enzyme est irréversiblement inhibée) :
• Marqueurs d'affinité
• Inhibiteurs suicides (ou mécanistiques)
• Cas particulier : inhibiteurs dits à interaction lente et/ou à forte affinité :
inhibition non-covalente mais quasi-irréversible (slow-binding, tight-binding
inhibitors)
9
1.3. Intérêts et usages des inhibiteurs d’enzymes
Recherche fondamental :
-Etudes cinétiques des mécanismes enzymatiques :
• Mode d'interaction d'un inhibiteur ?
• Stoechiométrie et mécanisme de l'inhibition ?
• Effet de l'inhibiteur sur les paramètres cinétiques Km et Vmax (Kmapp, Vmax
app)
• Efficacité d'un inhibiteur (Ki vs Km)
• Comparaison de l'efficacité de ≠ inhibiteurs sur une cible (comparaison des Ki )
• Comparaison de l'efficacité d’un inhibiteur sur ≠ cibles (comparaison des Ki )
4PEA 0.028 1.7
4PEH 0.029 0.057
Ki (mM) Ki (mM)
Inhibiteur SoRpiA MtRpiB
SoRpiA : Rpi d’épinard, type AMtRpiB : Rpi de Mycobacterium tuberculosis, type B
Exemple : Etudes d’inhibition de ribose-5-
phosphate isomérases (Rpi) de type A et B
R5P (Km) 7.5 2.5
10
-Etudes cristallographiques des enzymes (complexes EI cristallisés) :
• Nature et rôle des résidus du site actif
• Mode de fixation du substrat (→ I analogues de S/P)
• Mode de fixation des intermédiaires réactionnels (→ I analogues de IHE/ET)
• Fonctionnement de l’enzyme (mécanisme)
-Etudes de métabolismes (rôle d’une enzyme dans un processus métabolique)
-Génération d’abzymes (anticorps catalytiques) :
• Enzymes artificielles générées par un organisme en réaction à la présence
d’un antigène (inhibiteur analogue de l’ET appelé « haptène »)
PDB 1G98
Biochemistry 2001, 40, 1560-1566
Complexe EI RmPGI-5PAA
5PAA
11
Applications thérapeutiques :
-Enzymes : cibles de choix
-Utilisation biomédicale des inhibiteurs : bien avant de connaître les enzymes !
-Difficulté : spécificité de l’enzyme inhibée : souvent, les cellules « cibles » et « hôtes »
possèdent les "mêmes" enzymes (→ parasites, cellules cancéreuses…)
-Correction d’un métabolisme défectueux :
• Hypocholestérolémiant (vs excès de cholestérol)
• Antidiabétique (hypoglycémiants)
-Correction d’un "désordre physiologique" :
• Antidépresseurs
• Antiépileptiques
• Antihypertenseurs
• Antihistaminiques (vs effets de l’histamine produite lors de réactions allergiques)
• Antipyrétiques (vs fièvre)
• Analgésiques (vs douleur)
• Antiinflammatoires
12
Environnement :
-Lutte contre les plantes parasitaires, les insectes et les champignons (xylophages…)
• Herbicides
• Insecticides
• Fongicides
Armes chimiques (!) :
-Neurotoxiques (gaz Sarin, Tabun) : → I irrév. d’une enzyme du SNC
-Vésicants (gaz Moutarde/Hypérite) : → irritants (peau, yeux, muqueuses…)
-Destruction d’un organisme pathogène :
• Antiparasitaires (paludisme, trypanosomiases…)
• Antibactériens
• Antifongiques (vs champignons)
• Anticancéreux
• Antiviraux (antirétroviraux) (vs maturation des virus, interaction virus-cible…)
Pesticides (produits phytosanitaires)
O P
O
F
O P
O
N
Sarin Tabun
13
1.4. Exemples d’agents thérapeutiques inhibiteurs d’enzymes
http://www.wellesley.edu/Chemistry/Chem101/hiv/HIV-2.html
Infection par le VIH
AZT
ddC
Ritonavir
Trithérapie
-4 cibles dont 2 principales ; d’autres multi-thérapies existent
-résistances vs RT du VIH
(vs résistances)
14
Ritonavir®
Ic Protéase (VIH)
Zidovudine®
3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine (AZT)AZT-TP :
Ic Transcriptase Inverse (VIH)
Aciclovir®
Aciclovir-TP :Ic ADN Polymérase (Herpes, VZV)
Antiviraux (antirétroviraux)
O
NH
RR'
S
P OP P
P OP P
AZT AZT
AZT-TP
kinases
X
2’,3’-dideoxy-cytidine (ddC) ddC-TP :
Ic Transcriptase Inverse (VIH)
P OP P
15
Antibactériens
Triméthoprim®
Ic Dihydrofolate ReductasePénicillineIirr Transpeptidase(paroi cellulaire bactérienne)
Sulfaméthoxazole®
Ic Dihydroptéroate Synthase
Autres activités
Kétoconazole®
AntifongiqueIc C14 -Demethylase à CytP450(biosynthèse de l’ergostérol de la paroi cellulaire des champignons)
Méthotrexate®
AnticancéreuxIc Dihydrofolate Reductase
Bactrim®
16
AspirineAnalgégique, antipyrétique, antiinflammatoireIirr Prostaglandine Synthase (Cyclooxygénase)
IsocarboxazideAntidépresseurIirr (suicide) Monoamine Oxidase
Allopurinolvs goutte/calculs rénauxIc Xanthine oxydase(biosynthèse acide urique)
Autres activités (suite)
CaptoprilAntihypertenseurIc Enzyme de Conversionde l’Angiotensine (ACE)
MévinolineHypocholestérolémiantIc Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase
17
2. Inhibition réversible : généralités et cinétique
2.1. Inhibition compétitive
Fixation réversible exclusive
Différents modèles de l’inhibition compétitive :
A. Modèle classique : S et I ont le même site de fixation
Arg304
Lys310
Ser109 Gln111
His113
His285
Glu138
6DCM
M6P
1.
S et I sont en compétition vs site actif
de part leur analogie de structure.
Zn
Site actif de la phosphomannose
isomérase (PMI)
Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 7100-7107
18
B. Modèles alternatifs : les sites de fixation de S et I sont distincts
2.
L’encombrement stérique de I
empêche la fixation de S
3.
S et I ont un groupe en commun
qui se fixe sur un 3ème site
4.
Les sites de fixation de S et I
se recouvrent
5.
Régulation allostérique :
La fixation de I induit un
changement de conformation de
l’enzyme qui déforme ou
masque le site de fixation de S
(et inversement)
"Enzyme Kinetics " I. Segel (1975), Ed. J. Wiley & Sons, Inc.
Exemples :
-aspartate transcarbamylase
-glutamine synthétase
k1S
EI
E +
I
k-1
kcat
Ki
E + P
+
ES
19
• S et I sont en compétition pour leur fixation sur E (inhibition exclusive)
• L’affinité apparente de E : Kmapp
• I peut être déplacé par un excès de S : Vmax n’est pas modifié
[ES]
[E][S]mK
[EI]
[E][I]iK Vo = kcat[ES][E]T = [E] + [ES] + [EI]
Cinétique de l’inhibition compétitive (rappels) :
20
Vmax
Vmax/2
Km Kmapp
Vo
[S]
[I] > 0
[S][I]
1
[S]VVo
m
i
max
KK
avec m
i
m
app [I]1 K
KK
Inhibition compétitive : Vo = f([S])
[S]
[S]VVo
appmax
mKsoit
21
-1/Km
Km/Vmax
1/[S]
1/Vmax +
+
+
+ +
1/Vo
-1/Km1app
sans inhib.
[I]1
[I]2
[I]3
Km1app/Vmax
Inhibition compétitive : 1/Vo = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)
[S]
1
V
[I]1
V
1
Vo
1
max
m
i
max
KK
[I]3 > [I]2 > [I]1
pente =max
m
i V
[I]1
K
K
oao = 1/Vmax
pente et oao = cte lorsque [I]
22
Inhibition compétitive (Lineweaver-Burk)
représentation secondaire : pente = f([I])
-Ki[I]
•
•
•
•
pour pente = 0, [I] = -Kipentei =
max
m
i
i
V
[I]1
K
K
23
50%
100%
VoI/Vo
[I]IC50
Mesure du paramètre IC50
IC50 = [I] pour VoI = Vo/2
IC50 = conc. d’inhibiteur pour laquelle Vo mesurée (VoI) = 50% Vo sans inhibiteur :
(mesure réalisée généralement à [S] = Km)
+
+
+
+
++
+
Inhibition compétitive : (IC50 = 2 Ki pour [S] = Km)i
m
i[S]IC50 K
K
K
24
2.2. Inhibition incompétitive
Un inhibiteur incompétitif (uncompétitif) ne se fixe que sur le complexe ES (le site de fixation de I est induit par celle de S) :L’affinité de E pour S (induit par la formation de ESI) : Kmapp
E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp
kcat
x
E + P
S
E
ES
ESI
KS
Ki
I
I
S
S
[ES]
[E][S]mK
Si [S] >> Km :
[E]T = [ES] + [ESI]
Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI])
(< Vmax)
[ESI]
[ES][I]iK Vo = kcat[ES]
[E]T = [E] + [ES] + [ESI]
25
[S][I]
1
[S]
[I]1
VVo
i
m
i
max
K
K
K
i
max
maxapp
[I]1
VV
K
[S]K
[S]VVo
m
appmaxapp
Inhibition incompétitive : Vo = f([S])
avec et
i
mm
app
[I]1
K
KK
• Lineneaver-Burk nous donne :
[S]
1
VV
[I]1
Vo
1
max
m
max
i KK
pente = cte et oao lorsque [I]
max
i
V
[I]1oao
K
-1/Km
Km/Vmax
1/[S]
1/Vmax
+
+
+
++
1/Vo
-1/Km1app
sans inhib.[I]1[I]2[I]3
1/Vmax1app
(IC50 = 2 Ki pour [S] = Km)
im i
[S]IC50 K
KK
Inhibition incompétitive : 1/Vo = f(1/[S])
soit
pente = Km/Vmax
26
Inhibition par excès de substrat
• Cas particulier de l’inhibition incompétitive : 2 molécules de S peuvent se lier à E, mais ne peuvent être transformées en P (autorégulation de l’activité enzymatique).
Exemple de l’excès d’acétylcholine vs acétylcholinestérase :
Site allostérique
Site actif
PDB 2HA4
E + S ES E + P
+
S
ESS
kcat
KS
KI
inactif
Bourne et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 29256
27
Inhibition par excès de substrat (suite)
http://ead.univ-angers.fr/~jaspard/Page2/COURS/4EnzymologieLicence/3CoursINHIBITEURS/6CoursInhib.pdf
[ES]
[E][S]mK
[ESS]
[ES][S]iK
Vo = kcat[ES]
[E]T = [E] + [ES] + [ESS] i
2
m
max
[S][S]
[S]VVo
KK
28
2.3. Inhibition non-compétitive pure
• Un inhibiteur non-compétitif peut se fixer sur E et sur ES (mais n’est pas en compétition avec S pour sa fixation à l’enzyme). Il ne peut être déplacé par augmentation de *S+
• E apparaît moins active (à cause de ESI, inactif) : Vmaxapp
• L’affinité de E (et EI) pour S n’est pas modifiée : Km n’est pas modifié (I nc pure)
[ESI]
[EI][S]
[ES]
[E][S]mK
[ESI]
[ES][I]
[EI]
[E][I]iK
Vo = kcat[ES]
[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]
k1
k-1
kcat
Ki
E + P
Ki
k1
k-1
x
29
Vmax
Vmax/2
Km
Vo
[S]
[I] > 0
[S]
[S]
[I]1
VVo
m
i
max
K
K avec
i
max
maxapp
[I]1
VV
K
[S]
[S]VVo
m
maxapp
Ksoit
Inhibition non-compétitive pure : Vo = f([S])
Vmaxapp
Vmaxapp/2
Si [S] >> Km :
[E]T = [ES] + [ESI]
Vmaxapp = kcat([E]T - [ESI])
(< Vmax)
30
-1/Km
Km/Vmax
1/[S]
1/Vmax
+
+
+
+ +
1/Vo
sans inhib.
[I]1
[I]2
[I]3
Km/Vmax1app
Inhibition non-compétitive pure : 1/Vo = f(1/[S]) (Lineweaver-Burk)
[S]
1
V
[I]1
V
[I]1
Vo
1
max
m
i
max
i
KKK
pente et oao lorsque [I]
1/Vmax1app
[I]3 > [I]2 > [I]1
pente =max
m
i V
[I]1
K
K
max
i
V
[I]1oao
K
IC50 = Ki
31
2.4. Inhibition non-compétitive mixte
• Par rapport au cas précédent, dans le cas d’un inhibiteur non-compétitif mixte, les affinités de E pour I (Ki) et de ES pour I (K’i) sont .
• Il en résulte que les affinités de E pour S (KS) et de EI pour S (K’S) sont également .
[ES]
[E][S]mK
[EI]
[E][I]iK
Vo = kcat[ES]
[E]T = [E] + [ES] + [EI] + [ESI][ESI]
[ES][I]iK'
[ESI]
[EI][S]mK'
ES
ESI
+
+
k1
k-1
kcat
K’i
x
E + P
I
+
Ki
I
EI S
k’1
k’-1
+
E S
32
Deux cas peuvent être distingués :
• Ki > K’i : Kmapp
• Ki < K’i : Kmapp
Dans les deux cas :
• Vmaxapp (à cause de ESI)
[S]α'
α
[S]
α'
VVo
m
max
K
avec
[S]
[S]VVo
m
appmaxapp
Ksoit
α'
VV
max
maxapp
et m
app
α'
αKKm
i
[I]1α
K i
[I]1α'
K'
Inhibition non-compétitive mixte : Vo = f([S])
• Lineneaver-Burk nous donne :
[S]
1
V
α
V
α'
Vo
1
max
m
max
K
Inhibition non-compétitive mixte : 1/Vo = f(1/[S])
pente =max
m
i V
[I]1
K
K
pente et oao lorsque [I]
max
i
V
[I]1oao
K'
33
Inhibition non-compétitive mixte : 1/Vo = f(1/[S])
-1/Km
Km/Vmax
1/[S]1/Vmax
+
+
+
+ +
1/Vo
sans inhib.
[I]1
[I]2
[I]3
1Km/Vmax
[I]3 > [I]2 > [I]1
’1/Vmax
m1
1
α'
αK
Ki < K’i
34
Inhibition non-compétitive mixte : 1/Vo = f(1/[S])
-1/Km
Km/Vmax
1/[S]1/Vmax
+
+
+
+
+
1/Vo
sans inhib.[I]1
[I]2
[I]3
1Km/Vmax
[I]3 > [I]2 > [I]1
’1/Vmax
m1
1
α'
α
K
Ki > K’i
35
Deux modèles alternatifs d’inhibition non-compétitive (mixte)
kcat
E + P
Ki
KS
K’S
kcat
E + P
Ki K’i
KS
EI peut fixer S (pour donner ESI inactif),
mais ES ne peut pas fixer I
ES peut fixer I (pour donner ESI inactif),
mais EI ne peut pas fixer S
36
Tableau comparatif des inhibitions réversibles
Finalement, les inhibitions compétitive, incompétitive et non-compétitive pure sont des cas particuliers de l’inhibition non-compétitive mixte :
Inhibition Effet sur Vmax Vmaxapp Effet sur Km Km
app
K’i = compétitive - Vmax Km
Ki = incompétitive Vmax / ’ Km/ ’
Ki = K’i non-compétitive pure Vmax / - Km
Ki > K’i non-compétitive mixte Vmax / ’ Km/ ’
Ki < K’i non-compétitive mixte Vmax / ’ Km/ ’
i
[I]1α
K i
[I]1α'
K'
37
3. Inhibiteurs réversibles : structure et mécanisme
3.1. Inhibiteurs analogues de substrats
• Leur structure ressemble à celle du S (ou cofacteur) dans son état fondamental
• Ils sont reconnus par E, sans être transformés (sauf dans le cas des substrats compétitifs)
• Les + courants et les + faciles à concevoir
• Cinétique d'inhibition compétitive
• N'exploitent que l'étape de reconnaissance de S (≠ aux analogues de l'état de transition)
• Sauf cas particulier, sont en général peu efficace (Km/Ki < 10)
• Souvent, il faut [I] >> [S] pour pouvoir entrer en compétition avec le S
Caractéristiques principales :
38
Structure des inhibiteurs analogues de substrat :
• La fonction réactive de S peut être supprimée ou remplacé par un groupe ne pouvant être transformé : I compétitif classique
• Un groupement de S autre que la fonction réactive peut être supprimée ou remplacé :
- soit I n'est pas transformé : I compétitif classique- soit I est transformé : I compétitif particulier = S compétitif
N
OHOP
O
-O
O- CH3
I analogue du cofacteur
N
OHOP
O
-O
O- CHO
PLP (cofacteur)
fonction
réactive
CHO
H
OH
OH
OH
CH2OH
H
H
H
H
I analogue de S (2d-G6P)
CHO
OH
OH
OH
OH
CH2OH
H
H
H
H
CH2OH
O
OH
OH
OH
CH2OH
H
H
H
PGI
G6P F6P
fonction
réactive
39
Exemples d'inhibiteurs analogues de substrat :
Inhibition de l'ornithine décarboxylase
-Enzyme à PLP impliquée dans la biosynthèse des polyamines (métabolites de la division cellulaire)
-Abondantes dans les cellules à division rapide (parasites, cellules tumorales…)
Km/Ki = 5 : moyen
NH2
NH2
HCOOH
Ornithine décarboxylase
PLPNH2
NH2
HH
L-ornithine Putrescine
R
PLP
R
N+
H
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
O
O H R
N+
HH
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
B
CO2+
R
N+
H
N
H
O-
OP
O
O-
O-
H HB+B
H2O PLPH2O
NH2
NH2
CH3COOH
-methyl-L-ornithine
I compétitif : Ki = 19 µm
(autre fonction remplacée)
Km = 100 µm
40
Inhibition de la dihydroptéroate (DHP) Synthase
• Enzyme présente uniquement chez les bactéries (exemple : M. leprae) : cible idéale !
• Impliquée dans la biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique nécessaire à la synthèse des
bases purines, pyrimidines (ADN) et de certains aa
• Inhibiteurs : dérivés sulfonamides (sulfamides)
Sulfaméthoxazole® (Bayer)
I compétitif : Ki = 0,03 M
Km/Ki = 20 ! Bon inhibiteur analogue de S,
et de plus, spécifique (la DHP Synthase
n'existe pas chez l'homme !)
J. Bacteriol. 1999,181, 6814-6821
N
N
N
HNH2N
OH
P2
+
N
N
N
HNH2N
OH
HN COO-
Dihydroptéridine acide p-aminobenzoïque
Dihydroptéroate
P2DHP Synthase
Km = 0,6 µM
autre fonction remplacée
NH2 COOH NH2 SO2NH
N O
41
Inhibition de la dihydrofolate réductase
-Biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique (suite)
-Enzyme présente chez l'homme et les bactéries (exemple : M. tuberculosis)
Trimethoprim
Km = 20 M
Km/KI = 3
N
N
N
HNH2N
OH
HN COO-
Dihydroptéroate
Glu
DihydrofolateSynthase
N
N
N
HNH2N
OH
HN CONH
DihydrofolateRéductase
Dihydrofolate
NADPH
NADP+
N
N
NH
HNH2N
OH
HN
Tétrahydrofolate
CH COO-
(CH2)2
COO-
CONH CH COO-
(CH2)2
COO-
Km = 4 µM
Km/Ki = 0,5
Mauvais I, mais sélectivité > efficacité !
H. sapiens : Km = 3 µM, Ki = 41 µM : Km/Ki = 0,07 FEMS Microbiol Lett. 2004, 232, 101-105
I compétitif sélectif de
l'enzyme bactérienne : Ki = 8 M
NNH2
N
NH2
OMe
OMe
OMe
fonction réactive
remplacée
sélectivité
(pas d’effets secondaires chez l’homme)
42
Résumé de la biosynthèse du tétrahydrofolate chez les bactéries
acide p-aminobenzoïque
Dihydroptéroate
Dihydrofolate
Tétrahydrofolate
DHP Synthase
DHF Synthase
DHF Réductase
acide folique
(vitamime B9)
mammifères
X
XTrimethoprim®
Sulfamethoxazole®
Purines
Pyrimidines
Aminoacides
Sulfamethoxazole®+
Trimethoprim®Bactrim®
S1
S2
I1
I2
Bithérapie antibiotique
43
Methotrexate® (anticancéreux à effets secondaires importants).
-I compétitif "spécial", dit "à forte affinité".
Inhibition de la dihydrofolate réductase (suite)
Methotrexate®
I compétitif : Ki = 6 pM !
DihydrofolateKm = 3 M
Km/Ki = 500 000 !
-En réalité, bien que cet I compétitif soit a priori analogue au S, des études structurales ont
montré qu'il se fixait dans le site actif de la DHF réductase à l'envers vs. S, du fait
d'interactions très favorables fortuites !Arch. Biochem. Biophys. 1971, 142, 417-425
NH
NN
N
NH
NH2
OH
O
O
O-
NH
O
O-
N
NN
N
N
NH2
NH2
O
O
O-
NH
O
O-
CH3
inhibe aussi la DHFR des cellules saines
Cf. C. Blonski : inhibiteurs dits « slow-/tight-binding »
CHO
CHO
COO-, Na+
COO-, Na+
Ethylène glycol Oxalate
alcool déshydrogénase
+
+
CHO
CH3
Ethanol Acétaldéhyde
COO-
CH3
Acétate
non toxique
S
I
44
Inhibition de l'alcool déshydrogénase par un substrat compétitif
-Alcool déshydrogénase (ADH) : enzyme à NAD+/NADH
-Intoxication à l'éthylène glycol (S de l'ADH) : 50 décès / an
-Cette réaction peut être inhibée compétitivement par ingestion d'un excès d'éthanol… si
l'intoxication est traitée à temps !
-L'éthanol, S naturel de l'ADH, est un I compétitif particulier : c'est un S compétitif de la
transformation de l'éthylène glycol
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH3
précipite dans les reins !
45
Inhibition de la transcriptase inverse du VIH
2’-deoxythymidine-5’-TP
(dTTP)
3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine-5’-TP
(AZT-TP)
O
N
N
NH
O
OHO
NN+-
3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine
(AZT, 1985, BW)(Jérôme Horwitz, 1964)
• AZT-TP (issu de l'AZT) : I compétitif (S
compétitif) ~ spécifique de la transcriptase
inverse du VIH, analogue du S dTTP
• AZT-TP est utilisé par l'enzyme, mais termine la
réplication de l'ADN virale (arrêt de chaîne → Ic)
• Effets secondaires importants :
AZT-TP vs. ADN polymérases humaines ?
AZT vs. thymidine kinase (TK) humaine ?
O
OH
N
NH
O
OOPOP
O
O
O
O- O-
P
O-O
O- O
N
N
NH
O
OOPOP
O
O
O
O- O-
P
O-O
O-
NN+-
fonction réactive
remplacée
enzyme propre aux rétrovirus
in
out
+ TKs
46
Inhibition de l'ADN-polymérase virale
-Aciclovir/Ganciclovir : Ic/Sc spécifiques de la thymidine kinase
du virus de l'Herpès-VZV, analogues de la déoxyguanosine .
Ki TKhumaine/Ki TKvirale = 3000(aciclovir)
-Les dérivés TP formés, Ic/Sc de l'ADN-polymérase, terminent
la réplication de l'ADN viral (→ Ic).
Ki ADN-Phumaine/Ki ADN-Pvirale
= 100 (aciclovir-TP)
NO
OH
OH
N
NHN
NH2
O
NO
O
OH
N
NHN
NH2
O
NO
O
OH
N
NHN
NH2
O
P PPPTKvirale TKcell.
ADN-polym.
Ganciclovir
Ganciclovir-TP
NO
OH
OH N
NHN
NH2
O
Aciclovir
Aciclovir-TP
NO
OH N
NHN
NH2
O
aucun effets
secondaires
2’-Déoxyguanosine (dG)
47
Aciclovir – Modèle du « dead-end complex » en présence du prochain dNTP(Cf. Barbara Selisko, Univ. Aix-Marseille II)
Liu et al., J. Biol. Chem. (2004), 281, 18193
48
3.2. Inhibiteurs analogues de l'état de transition
• I analogues de ET : analogues stables de S à l'ET (espèce instable !)
• Leur structure et ppts électroniques ressemblent à celles du S à l'état de transition (ET)
ou d'un intermédiaire réactionnel de haute énergie (IHE)
• La plupart des I dits "analogues de ET" sont en fait des I "analogues d'IHE" plus proches
de l'ET que du l'EF
• Ils sont reconnus par E, sans être transformés
• Conception rationnelle (si mécanisme connu ou postulé)
• Cinétique d'inhibition compétitive
• Exploitent l'étape de reconnaissance de S et l'étape catalytique
• Sont en général très efficaces (Km/Ki très grand)
• Même si [I] << [S], I peut entrer en compétition avec S
Caractéristiques principales :
• E a beaucoup plus d'affinité pour le substrat à l'ET (S≠) que pour le substrat à l'EF (S) :
Théorie : E doit avoir bcp + d'affinité pour un I qui ressemble (mime) à S≠ plutôt qu'à S
49
• I très efficace (Km/Ki très grand) ne signifie pas automatiquement que I est analogue de
ET/IHE (ex. : Methotrexate®). Pour cela, il faut en plus :
-Structures X comparatives
-log Ki = f[log(Km/kcat)] ≈ linéaire pour ≠ S et I analogues de l'ET correspondants :
O
NH
H CH2CH(CH3)2
O
YHN
R
NH
H CH2CH(CH3)2Y
HN
R
HO O-
PNH
H CH2CH(CH3)2
O
YHN
R
O O-
Substrats
IHE tétrahèdriquesO
I analogues de ET(phosphonamides)
Biochemistry (1983) 22, 4618-4624
log Ki
log(Km/kcat)
-5 -4 -3
-8
-7
-6
-5S
IHE
I
= G# (E+S→ES#)/RT
50
Exemples d'inhibiteurs analogues de l'ET/IHE :
Inhibition de la triosephosphate isomérase (TIM) de levure
La TIM a 100 x plus d’affinité pour le PGH que pour le DHAP
CH2OPO3
2-O
OHH
HB
CH2OPO3
2-
OH
O-
BH+
CH2OPO3
2-
O-
OH
BH+
CH2OPO3
2-OH
H O
B
DHAP IHEs 1,2-cis-ènediolate G3P
Km = 1,5 mM
O
CH2OPO3
2-O
-
Phosphoglycolate
NHOH
CH2OPO3
2-O
- H+
CH2OPO3
2-O
-N OH
Acide phosphoglycolohydroxamique (PGH)
Ki = 30 µMKm/Ki = 50
Ki = 15 µMKm/Ki = 100
enzyme glycolytique
51
boucle flexible
Glu165
PGH
His95
Structure du complexe TIM-PGH
[Allen, 1994]
PDB 7TIM
52
Inhibition de la phosphoglucose isomérase de lapin
enzyme glycolytique
CH2OH
O
PGI PGI
IHE 1,2-cis-ènediolate
5P-D-arabinonate Acide 5P-D-arabinonohydroxamique
- H+
Ki = 2 M Ki = 0,2 M
Km/K i = 100 Km/Ki = 1000
HO
OH
OH
CH2OPO32-
CHOH
O-
HO
OH
OH
CH2OPO32-
CHO
OH
HO
OH
OH
CH2OPO32-
F6P
Km = 200 M
G6P
O-
O
HO
OH
OH
CH2OPO32-
NHOH
O
HO
OH
OH
CH2OPO32-
N
O-
HO
OH
OH
CH2OPO32-
OH
Hardré et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1998) 8, 3435-3438
Hardré et al., Carbohydr. Res. (1999) 319, 110-115
Biochemistry 2001, 40, 1560-1566
Structure cristalline du complexe RmPGI-5PAA (1.9 Å)
(en collaboration avec l'équipe du Pr. Jeffery, Chicago)
PDB 1G98
5PAA
Structure du site actif de RmPGI-5PAA (1.9 Å)
Ser209
Lys210
Thr211
Thr214
Ser159
Site phosphate
Wat819
2.57 Å
Mime O1H de IHE ?
Arg272
Stabilisation IHE
Glu357
Base catalytique
-idem TIM, GlmS ...
His388* Lys518
Ouverture du cycle ?
Ser209
Lys210
Thr211
Thr214
Ser159
His388* Lys518
Glu357
Arg272
5PAH
(en collaboration avec l'équipe du Pr. Jeffery, Chicago)
PDB 1KOJ
Structure du site actif de RmPGI-5PAH (1.9 Å)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 5872
Ser209
Lys210
Thr211
Thr214
Ser159
His388* Lys518
Glu357
Arg272
5PAH
PDB 1KOJ
(en collaboration avec l'équipe du Pr. Jeffery, Chicago)
Structure du site actif de RmPGI-5PAH (1.9 Å)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 5872
5PAA
PDB 1G98
Ser209
Lys210
Thr211
Thr214
Ser159
His388* Lys518
Glu357
Arg272
PDB 1KOJ
5PAH
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, 5872
(en collaboration avec l'équipe du Pr. Jeffery, Chicago)
Structure du site actif de RmPGI-5PAH (1.9 Å)
Transfert de proton entre O1 et O2 des IHE
Représentation schématique
du site actif de RmPGI-5PAH
NO
OHO
OPO3
OHHO
O
OGlu357 NH2
HNH2N
HO
H O
H
241
423
H
OH
477
H H
NH
H
HO
H
205
2
Gln353
NH2
O
Arg272
Alignement structural PGI-5PAH et TIM-PGH
PGH
His95
5PAH
Wat241
PGI vs. TIM : pas de base nécessaire pour ce même transfert
H O
R O-
H
H O-
R O
H
F6P G6P
H O
R O-
H
H
O H
H O-
R O H
O H
H
ènediolate 1 ènediolate 2
OOP
O
-O
O-
HO
NH3
Lys518
NH
NH2
NH2
N
NH His388
Thr214
OH H
O
O
OH
Glu357
O
OHArg272
H+
-
+
déprotonation en C2
1
OOP
O
-O
O-
HO
NH3
Lys518
N
NH His388
OH H
OH
NH
NH2
NH2 O
O
Glu357
Arg272
O-
O
HH
OH H
+
+
transfert de protonentre O1 et O2
Thr214
2
OOP
O
-O
O-
HO
NH3
Lys518
N
NH His388
Thr214
OH H
OH
NH
NH2
NH2 O
O
Glu357
Arg272
OH
O-
H
+
+
reprotonation en C1(face Re)
3
OOP
O
-O
O-
HO
NH3
Lys518
NH
NH2
NH2
N
NH His388
Thr214
OH H
O
O
OH
Glu357
OH
Arg272
HR O+
-
+
G6P
F6P
4
Mécanisme de l'étape d'isomérisation
Schéma du site actif de la structure 3D de RmPGI-F6P à 1.8 Å
(obtenue à partir du G6P)
O
HO
OH
OH
O
P O
O-
-O
Thr214
O
NN
H
H
His388
+2.9
H
O
H
O
H
2
1
2.2
Lys518 NH3+ 2.7
Wat389
H
PDB 1HOX
[Lee, 2001]
(étude indépendante de Jeffery et coll.)
F6P (6P- -D-fructofuranose)
Structure 3D du complexe RmPGI-F6P
Superposition de structures tridimensionnelles
des complexes RmPGI-F6P et RmPGI-5PAH
F6P
5PAH
Arg272
Glu357
Val514
Lys518
Thr214
4 Å !
La ≠ce d’affinité de la PGI pour le S (F6P)
et l’I analogue de l’ET (5PAH) est visible
structuralement.
Mécanisme de l'étape d’ouverture de cycle
OOP
O
-O
O-
O
OH
OH
HO
NH3
Lys518
N
NH His388
Thr214
OH H
NH
NH2
NH2 O
O
Glu357
Arg272
+
H2O
34
-+
: départ de H2O
: déplacement Lys518
: rotation C3-C4 : 140°
2
OOP
O
-O
O-
HO
NH3
Lys518
NH
NH2
NH2
N
NH His388
Thr214
OH H
O
O
OH
Glu357
O
OHArg272
H+
-
+3
OOP
O
-O
O-
O
H
OH
OH
HO
NH2
Lys518
N
N
H
H His388
O
OH
HH
NH
NH2
NH2 O
O
Glu357
Arg272
+
15
+ -
Thr214
ouverture de cycle
G6P
1
OOP
O
-O
O-
O
H
OH
OH
HO
NH3
Lys518
N
N
H
H His388
O
OH
HH
NH
NH2
NH2 O
O
Glu357
Arg272
+
+
15
+ -
OOP
O
HO
O-
O
OH
OH
HO
NH3
Lys518
N
NH His388
Thr214
OH H
NH
NH2
NH2 O
O
Glu357
Arg272
+
H2O
34
-+
OOP
O
HO
O-
HO
NH3
Lys518
NH
NH2
NH2
N
NH His388
Thr214
OH H
O
O
OH
Glu357
O
OHArg272
H+
-
+ : départ de H2O
: déplacement Lys518
: rotation C3-C4 : 140°
Thr214
ouverture de cycle
autocatalyse par phosphate via Thr214 ?
G6P
1
2 3
Mécanisme de l'étape d’ouverture de cycle
64
Inhibition des glycosidases
OR2O
OH
HOX
H
OR1
X = OH, NHAcR1 = glycoside
R2 = H, glycoside
OR2O
OH
HOX H
OR2O
OH
HOX H
R1OHOR2O
OH
HOX
H
OH
IHE oxocarbonium stabilité par -COO - du site actif :
-par liaison électrostatique (inverting glycosidases : → , → )
-par liaison covalente (retaining glycosidases : → , → )
C anomère trigonal (plan) sp2
OR2O
OH
HOX O
H2O
HNHO
OH
HOHO OH
HNHO
OH
HOOH H
H
gluconolactones
X = NHAc, R 2 = H
Ki = 5 10 -7 M ( -N-Ac-glucosaminidase)
Km/K i moyen = 40 000
Km = 1 à 3 10 -3 M
nojirimycine
Ki = 6 10 -10 M (sucrase)
Km/K i moyen = 3 106 !
+
+
+
sp3sp2 sp2
sp3
sp2 sp2
65
Inhibition de la neuraminidase virale par le Tamiflu®
Oseltamivir® (Tamiflu®)
out in
O COOH
O R
OH
OH
OH
OH
H
AcHN
O+ COOH
OH
OH
OH
OH
H
AcHN
O COOH
OH
OH
OH
OH
OH
H
AcHN+ R OH
COOEt
NH2
OH
AcHN
COO-
NH2
OH
AcHN
IHE
I analogue IHE
sp2
sp2
acide sialique
(acide N-acétyl-neuraminique)Virus « accroché »
Virus « libre »
66
Inhibition des protéases
R
O
HN
R'
Nu
R
O-
Nu
NHR'
H+
R
O
Nu + R'NH2
IHE tétraèdriqueNu = OH -, SerO-, CysS-
R
O
OR'
Nu
R
O-
Nu
OR'
H+
R
O
Nu+ R'OH
IHE tétraèdriqueNu = OH -, SerO-, CysS-
Activité estérase
Activité peptidase
sp2
sp2
sp2
sp2sp3
sp3
RCOOH
RCOOH
R
HO Nu
NHR'
(NuH = H2O, SerOH, CysSH
67
Quelques types d'analogues de l’IHE des protéases
R H
O
R
HO Nu
H
aldéhydes
R CF2R'
O
R
HO Nu
CF2R'
cétones -difluorées
RB
OH
OH
RB
HO Nu
OH
acides boroniques/boronates
-
phosphates
RO P OR'
O
O-
phosphonates
R P OR'
O
O-
phosphinates
R P R'
O
O-
phosphonamidates
R P NHR'
O
O-
fluorophosphates(gaz Sarin)
RO P F
O
R'O
NuH NuH NuH
RO P Nu
ONuH HF
(inhibition irréversible)R
HO H
R'
alcools secondaires(Ritonavir® vs. protéase du VIH)
R’O
1
2
3
L’espèce tétraèdrique I anal. de l’IHE est formée par réaction réversible de l’E → complexe EI stable anal. de ES#
I anal. de l’IHE « classiques » (tétraèdriques)
I anal. de l’IHE « irréversibles »
HN
O
N
ONHR'
HN
N
ONHR'HO O-
RHN
O
HN
ONHR'
OH
+
O
N
S
HN
HO H
NH
O
OHN O
NS
N
O
R
O
R
HN
HO H
O
N
O NH
H
H
NH
O
N
H2NOC
Ritonavir
Saquinavir
68
Inhibition de la protéase du VIH (protéase à acides aspartiques)
sp2
R-Phe–Pro-R’
sp3
sp3
sp3
Alcools secondaires : liaison C–C
très stable, non-hydrolysable !
69
Stereoview of the overlay of the inhibitor bound to HTLV-1 protease with the clinical
inhibitors of HIV-1 protease.
Li et al. PNAS (2005)102,18332-18337
Amprenavir, Ritonavir, Nelfinavir, Saquivavir, Indivavir
70
3.3. Abzymes
• Application du concept des analogues
de l'état de transition :
1. Un analogue de l'état de transition
d'une réaction choisie est synthétisé
2. Cet "antigène" (appelé haptène)
injecté dans un organisme (souris)
va générer la production
d'anticorps dirigés contre lui
3. Cet anticorps, en théorie, est
similaire à une enzyme : il doit être
bien plus complémentaire de
l'analogue de l'ET que du substrat
de la réaction ciblée
• Abzymes = Anticorps catalytique =
Enzyme "artificielle"
S [ES#] PPas d’enzyme connue
I analogue de S# postulé(antigène ou haptène)
Production d’anticorps
S [AbS#] P
?
Si anticorps à
activité catalytique :
71
N
O
O
O
N
O
O
O-
OH
N
OH
O
+
O
HO
N
OP
O
O-
O
Haptène
(I anal. de l’IHE)
IHE (S#)
Abzyme : activité cocaïne hydrolase(détoxification de la cocaïne)
Exemple d'abzyme : la cocaïne hydrolase
kcat = 1.8 10-3 s-1 (abzyme)
kn = 3.3 10-6 s-1
kcat/kn = 540 (facteur d’accélération)
KTX = 0.88 10-6 M (affinité de E pour S#)
Ki = 2.0 10-6 M (affinité de E pour I)
Science (1993) 259, 1899
Cocaïne
Enzyme à activité estérase
Km = 4.7 10-4 M
TX
m
n
cat
K
K
k
k
Ki > KTX
I plutôt bon analogue de S#
72
4. Inhibiteurs irréversibles
4.1. Marqueurs d'affinité
• Principaux types d'inhibiteurs irréversibles : marqueurs d'affinité et inhibiteurs suicides
• Inhibiteurs irréversibles non-spécifiques du site actif (réactifs dits « résidus-spécifiques »)
[EI]
[E][I]
i
i-i
k
kKE + I EI E-I
k-i
ki kinact
complexecovalentinactif
• Marqueur d'affinité = Réactif chimique formant une liaison covalente stable avec un résidu du
site actif de l'enzyme (réactifs spécifiques du site actif ou « site-spécifiques »)
• "active-site irreversible inhibitors"
• Analogues de S ou de l'ET avec en plus un groupement réactif
• Réagissent de manière stoechiométrique
• L'enzyme est protégée de l'inhibition par le S (ou cofacteur) ou un I compétitif
• Modification irréversible (covalente) de l'enzyme par l'inhibiteur :
-inactivation irréversible de l'enzyme
-l'inhibiteur reste lié à l'enzyme même après dialyse ou filtration sur gel (ou membrane)
• Un I irréversible présente un équilibre de fixation (Ki) avec l'enzyme, avant l'étape de
l'inactivation proprement dite (kinact)
73
Cinétique de l'inhibition irréversible
- La perte d'activité de l'enzyme mesurée en fonction du temps à différentes concentration
de I suit une cinétique du premier ordre :
avec
i
inactobs
[I]1
K
kk
-La représentation de 1/kobs = f(1/[I]) permet de déterminer les paramètres Ki et kinact :
1/k
ob
s
1/[I]
+
+
+
+
-1/Ki
1/kinact
pente = Ki/kinact
[I]
111
inact
i
inactobs k
K
kk
ln (activité résiduelle
activité initiale) = kobs t
O
Cl
CH2Ph
HNS
O
OO
HN
O
NH
R
CH2Ph
R'
74
Exemple de marquages par affinité
Histidine du site actif de la Chymotrypsine :
Substrat Tosyl Phenylalanine Chloromethyl Ketone (TPCK)
-I irr. analogue de S (mime de S + gpe réactif)
-Egalement sur Cys du site actif de la papaïne
(Cys-S- 100 x plus réactif que His)
-halocétone
Liaison covalente stable : His du site actif de la
chymotrypsine est irréversiblement modifiée
Ts
O
Cl
CH2Ph
N
N
His
H
Ts
O
CH2Ph
N+
N
His
H
Ts
O
CH2Ph
N
N
His
75
Sérine (activée) du site actif des protéases (acétylcholinestérase) :
-I irr. analogue de l’IHE (mime de IHE + gpe réactif)
O
O
NMe 3
+
H2O AcOH
OHNMe 3
acétylcholine choline
E impliquée dans la régulation de la
transmission des impulsions nerveuses
aux muscles (notamment respiratoires) !
O
O-
NMe 3
OSer
+
IHE
O P
O
F
O O P
O
F
Gaz Sarindiisopropylphosphofluoridate
OSer
H
N
N
His
H
O P
O
F
O O P
O
O
O
Ser
N+
N
His
H
H
F-
Forte affinité de E pour I + Ser irréversiblement
inactivée : inactivation rapide de l’enzymeParalysie respiratoire (asphyxie)
76
Triosephosphate isomérase :
I irr. analogues des S (mimes de S + gpe réactif)
• Nombreux autres exemples
• Peu utilisés en thérapeutique, car forte réactivité chimique (armes chimiques !)
O
N
N
His OPO3
2-
HO
O
OPO32-
TIMO OPO3
2-OH
DHAP G3P
I
O
OPO32-
vs His du sa
OPO32-
vs Asp du sa
O
OH
OPO3
2-O
O
Asp
77
4.2. Inhibiteurs suicides
• Inhibiteurs basés sur le mécanisme : « mechanism-based inhibitors » (1978) :
1) Au départ, la réactivité de l'inhibiteur est cachée : il agit comme un substrat.
2) Ensuite, l'enzyme, par son activité, génère l'espèce inhibitrice active EI*.
• Caractéristiques d'inhibition analogues à celles des marqueurs d'affinité, si ce n'est la
participation de l'étape catalytique au processus d'inactivation (effet isotopique sur la
cinétique de l'inhibition).
• Présentent une sélectivité encore meilleure que celles des marqueurs d'affinité
• Absence de réactivité intrinsèque initiale : agents thérapeutiques de choix
• Autorise la génération de fonctions très réactives, inaccessibles aux marqueurs d'affinité
• Très nombreux exemples, notamment dans le cas des enzymes à PLP dont le mécanisme
implique la formation d'un carbanion, stabilisé par le PLP. En effet, le substrat "inhibiteur
suicide" restant lié au coenzyme n'aura pas tendance à diffuser en dehors du site actif.
E EI EI*
E-I+ I
I*
E +
ki
k-i
k3
k-3
kcat kinact
78
Inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO
(enzyme régulatrice de la biosynthèse des polyamines)
H2N
NH2
HCOOH
enzyme
PLPH2N
NH2
HH + CO2
• Le difluoromethylornithine (DFMO) est un inhibiteur suicide de cette enzyme
• Le DFMO est reconnu comme substrat (voir inhibition compétitive par l' -méthylornithine)
• L'espèce réactive formée au cours de la réaction (imine conjuguée, EI*) est un accepteur de
Michaël qui va réagir avec un nucléophile du site actif (Cys)
H2N
NH2
CF2HCOOHH2N
NH2
CH3
COOH H2N
NH+
H
F
-methylornithine DFMO EI*
1. - COOH ,
2. 2. - F-
79
DFMO + PLP
R
N+
CF2H
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
O
O H B R
N+
H
N
H
O-
OP
O
O-
O-
F
HF
HB+
H2O CO2
R
N+
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
F
H
H S Cys
B
R
N+
H
N
H
O-
OP
O
O-
O-
S
HF
Cys
HB+
HF
B
R
N+
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
S Cys
F HH
Mécanisme d’inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO
1. - COOH
2. - F-
3. + CysS-
4. + H+
accepteur de Michaël (EI*)
Liaison C–S stable : Cys irréversiblement modifiée → enzyme inactivée
