CRISTINA ADELAIDE FIGUEIREDO

CRISTINA ADELAIDE FIGUEIREDO

Epidemiologia molecular do virus da rubéola isolados noEstado de São Paulo durante o período de 1997 a 2004

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Institutode Ciências Biomédicas da Universidadede São Paulo, para obtenção do Título emDoutor em Ciências.

São Paulo2010

CRISTINA ADELAIDE FIGUEIREDO

Epidemiologia molecular do virus da rubéola isolados no Estado de São Paulo durante o período de 1997 a 2004

Tese apresentada Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Instituto deCiências Biomédicas da Universidade deSão Paulo, para obtenção do Título deDoutor em Ciências.

Área de Concentração:

Microbiologia

Orientador:

Prof. Dr. Edison Luis Durigon

São Paulo2010

DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP) Serviço de Biblioteca e Informação Biomédica do

Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

© reprodução total

Figueiredo, Cristina Adelaide.

Epidemiologia molecular do vírus da rubéola isolados no Estado de São Paulo durante o período de 1997 a 2004 / Cristina Adelaide Figueiredo. -- São Paulo, 2010.

Orientador: Edison Luiz Durigon. Tese (Doutorado) – Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Departamento de Microbiologia. Área de concentração: Microbiologia. Linha de pesquisa: Virologia molecular e clínica Versão do título para o inglês: Molecular epidemiology of rubella virus isolated in State of Sao Paulo during 1997-2004. Descritores: 1. Rubéola 2. Vírus 3. Isolamento viral 4. Reação em cadeia da Polimerase 5. Epidemiologia 6. Genótipos I. Durigon, Edison Luiz II. Universidade de São Paulo. Instituto de Ciências Biomédicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia III. Título.

ICB/SBIB0118/2010

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

_________________________________________________________________________________________________________ _____

Candidato(a): Cristina Adelaide Figueiredo.

Título da Tese: Epidemiologia molecular do vírus da rubéola isolados no Estado de São Paulo durante o período de 1997 a 2004.

Orientador(a): Edison Luiz Durigon.

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Doutorado, em sessão

pública realizada a ................./................./................., considerou

( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)

Examinador(a): Assinatura: ............................................................................................... Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

Examinador(a): Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................



Presidente: Assinatura: ................................................................................................ Nome: ....................................................................................................... Instituição: ................................................................................................

A meus pais, Eduardo e Zulmira (in memorian), cuja

lembrança está sempre ao meu lado, por me mostrar o

caminho a ser seguido, pelo amor que só os pais podem

dar, pela maneira única de entender a vida, acreditar em

Deus e valorizar o próximo. Saudade infinita!

Aos meus irmãos, pelo amor, compreensão e incentivodurante a realização deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

Sou muito grata a todos aqueles que, direta ou indiretamente tornaram possível arealização desta tese,

Agradeço em especial,

Ao Prof. Dr. Edison Luiz Durigon, exemplo de profissional, meus sincerosagradecimentos pelos ensinamentos valiosos, pela orientação da tese, e peloincentivo à pesquisa e ao crescimento profissional, o meu imenso reconhecimento eadmiração.

A Dra. Suely Pires Curti, Diretora do Núcleo de Doenças Respiratórias, peloconstante apoio, incentivo e amizade.

A Maria Isabel de Oliveira, amiga e companheira de tantos anos, pelo incentivo àrealização dessa tese, pelas sugestões que muito contribuíram para a realizaçãodeste trabalho. Enfim, a tudo que passamos.

A Ana Maria Sardinha Afonso, amiga, companheira de tantos anos, pelo incentivo,pela colaboração, e apoio em todas as horas.

A Cleuza Rodrigues pela valiosa colaboração e sincera amizade.

A Maria Luiza Barbosa, amiga de tantos anos, pelo apoio, orientações, e correçõesvaliosas.

A todos os funcionários do Núcleo de Doenças Respiratórias, em especial, MárciaTheobaldo, Silvana Beres Castrignano, Tuneo Ishimaru, Lucilia Martins, Esmeraldada Cruz, Marcos Nascimento, Rita Paschoalin pelo apoio apoio, compreensão ecolaboração.

A Dra. Maria do Carmo Timentsky, diretora do Núcleo de Virologia, pela confiança,pelo respeito e apoio.

A Dra. Luiza T. Madia de Souza, pela confiança, respeito e amizade durante todosestes anos de convívio.

A Dra. Julia M.S.Felipe, pelo apoio constante e incentivo.

A Cecília Luiza Simões pelo constante incentivo e ensinamentos valiosos.

A todos os colegas do Núcleo de Virologia e Seção de Microscopia Eletrônica, peloapoio, incentivo e amizade.

A todos os funcionários da Secretaria da Pós-Graduação do ICB-USP,principalmente a Alice Shimabuku pelas intruções, colaboração e apoio.Aos colegas do ICBII pelo incentivo, apoio e amizade.

Ao Jansen Araujo, pela contribuição,colaboração e apoio para a realização destetrabalho.

A Danielle Bruna pela contribuição, colaboração e sugestões.

Escute o cumprimento do amanhecer,

Olhe este dia porque é a verdadeira vida.

Em seu breve curso está a realidade da nossa

existência,

a benção de crescer, o esplendor da beleza.

Porque o passado é só um sonho e o amanhã,

uma visão

Mas se você aproveitar bem o dia de hoje,

o passado será um sonho de felicidade, e o

amanhã,

uma visão de esperança.

Canto sânscrito

RESUMO

FIGUEIREDO, C. A. Epidemiologia molecular do virus da rubéola isolado s noEstado de São Paulo durante o período de 1997 a 200 4. 104 f. Tese (Doutoradoem Microbiologia)- Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo,São Paulo, 2010.

A rubéola é uma doença infecciosa aguda, normalmente com um curso clínico

suave. Porém quando adquirida nas primeiras 12 semanas de gestação, pode

causar severos defeitos de nascimento, conhecida como Síndrome da Rubéola

Congênita (SRC). A caracterização genética do vírus da rubéola é feita analisando a

seqüência da região hipervariável do gene da glicoproteína E1. Este estudo,

apresenta a primeira caracterização molecular de do vírus da rubéola isolados no

estado de São Paulo, Brasil. As amostras (sangue, urina, swab de orofaringe,

explante de fígado, produto de aborto e fluido cerebrospinal) foram coletados entre

1997 e 2004 de pacientes com sintomas clínicos de rubéola. O gene E1 vírus da

rubéola foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase em cadeia diretamente

de espécimes clínicos e isolados, e os fragmentos de DNA obtidos foram

seqüenciados. As seqüências foram alinhadas para a analise filogenética, com

seqüências representativas dos diferentes genótipos do vírus da rubéola. Vinte e

nove isolados foram obtidos, incluindo isolados relacionados com insuficiência

hepática aguda, encefalite e infecções congênitas. A análise filogenética mostrou

que 19 dos 29 virus da rubéola isolados pertencem ao genótipo 1a, e 10 pertencem

ao genótipo 1G. Este trabalho demonstrou dois genótipos do vírus da rubéola

circularam simultaneamente entre os anos de 1997-2004.

Palavras-chave: Rubéola. Vírus. Isolamento viral. Reação em cadeia da

polimerase. Epidemiologia. Genótipos.

ABSTRACT

FIGUEIREDO, C. A. Molecular epidemiology of rubella virus isolated in State ofSao Paulo during 1997-2004. 104 p. PhD Thesis (Microbiology)- Instituto deCiências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010. Rubella is an acute infectious disease with normally a mild clinical course.

However, infections during pregnancy, especially before week 12 of gestation

(WG), can cause severe birth defects known as congenital rubella syndrome

(CRS). Genetic characterization of wild-type rubella virus is based on

sequence analysis of a hypervariable region of the glycoprotein E1 gene. This

study presents the first molecular characterization of isolates from São Paulo,

Brazil. Samples (blood, urine, oropharyngeal swab, explanted liver, product of

conception and cerebrospinal fluid) were collected between 1997 and 2004

from patients with clinical symptoms of rubella. The rubella virus E1 gene

coding region was amplified by reverse transcriptase polymerase chain

reaction directly from clinical specimens and isolates, and the resulting DNA

fragments were sequenced. Sequences were assigned to genotypes by

phylogenetic analysis with rubella virus reference sequences. Twenty-nine

isolates were obtained, including isolates from acute liver failure, encephalitis

and congenital infections. Phylogenetic analysis showed that 19 out of 29

isolated in the São Paulo strains of rubella virus belonged to genotype 1a, and

10 strains to genotype 1G. This work demonstrated two genotypes of RV

circulated simultaneously between years 1997 and 2004 in the state of São

Paulo. The information reported in this paper may be useful for contributes to

understand better the molecular epidemiology of RV in São Paulo, Brazil.

Key-words: Rubella. Virus. Isolation. Polymerase chain reaction. Epidemiology.Genotypes.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Fotomicrografia eletrônica do virus da rubéolaisolado em cultura de células

22

Figura 2. Desenho da representação da partícula viraldo vírus da rubéola com seus principaiscomponentes.

24

Figura 3. Fotomicrografia eletrônica de células Veroinfectadas com o vírus da rubéola.

25

Figura 4. Esquema da representação da organizaçãogenômica do vírus da rubéola

28

Figura 5. Resolução do Comitê Executivo da OPAS 34

Figura 6. Distribuição dos genótipos do vírus da rubéolano mundo, no período de 1995-2008

38

Figura 7. Fluxograma do diagnóstico laboratorial paraos pacientes com suspeita de infecção pelovirus da rubéola

51

Figura 8. Esquema de amplificação do genoma daglicoproteína E1 do virus da rubéola a partirdo fragmento gerado pelos primers R2 e R7no PCR e R11 e R8c no nested.

62

Figura 9. Esquema da amplificação do genoma daglicoproteína E1 do virus da rubéola a partirdo fragmento gerado pelos primers R66, R65e R85 no PCR e R85 e R72 no nested-PCR.

66

Figura10. Análise por eletroforese em gel de agarose doproduto de PCR gerado com os primers R7,R2 (A) e no nested-PCR gerado com osprimers R11 e R8c (B).

74

Figura 11. Fotomicrografias das células Vero e SIRC nãoinoculadas (A e C) e inoculadas com o virusda rubéola (B e D).

77

Figura 12. Fotomicrografia eletrônica do virus da rubéola,isolado em cultura de células SIRC inoculadascom amostra do caso n° 27

78

Figura 13. Fotomicrografias obtidas do explante dofígado corado com hematoxilina-eosina(A,B,C,D,E,F). Fotomicrografias da detecçãoimunohistoquimica do antígeno do virus darubéola em parafina fixadas em formalina(G,H, I).

79

Figura 14. Arvore filogenética da seqüências daglicoproteina E1 do virus da rubéolaanalisadas neste estudo .

81

Figura 15. Análise de identidade e divergência, pelométodo ClustalX, das amostras seqüenciadasna região E1 do virus da rubéola quepertencem ao genótipo 1a

Figura 16. Análise de identidade e divergência, pelométodo ClustalX, das amostras seqüenciadasna região E1 do virus da rubéola quepertencem ao genótipo 1G

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Manifestações clinicas da Síndrome daRubéola Congênita:comuns, transitórias epouco freqüentes

Tabela 2- Relação dos casos que foram analisados eselecionados para sequenciamento gênico.

Tabela 3- Sequências dos primers utilizados na PCRpara diagnóstico da infecção pelo vírus darubéola

Tabela 4- Sequências dos primers utilizados na PCRpara seqüenciamento da glicoproteína E1 dovírus da rubéola

Tabela 5- Representação das linhagens de referênciados genótipos do vírus da rubéola, baseadono ano do isolamento, país e número deacesso no “GenBank

Tabela 6- Resultado das sorologias, RT-PCR nasamostras, Isolamento viral e RT-PCR dascélulas inoculadas

Tabela 7- Resultados de Máxima e Mínima Similaridadepelo método ClustalX, das amostrasseqüenciadas na região E1 do virus darubéola.

Tabela 8- Resultado dos genótipos obtidos dasseqüências amplificadas da região E1 dovirus da rubéola

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Gráfico da distribuição do numero de casosconfirmados de rubéola no Brazil, 1993-2004

30

Gráfico 2. Gráfico da distribição do numero de casos derubéola no Estado de São Paulo, 1992-2004

31

Gráfico 3. Gráfico da distribuição do número de casospor fixa etária no Estado de São Paulo em2000.

32

Gráfico 4. Gráfico da distribuição do número de casosde gestantes e SRC confirmados no Estadode São Paulo de 1992 a 2004

33

Gráfico 5. Gráfico da distribuição dos casos notificadosde rubéola nas Américas, 1980-2004

35

Gráfico 6. Gráfico da distribuição do número de casosde rubéola no Estado de São Paulo, 2000 a2008

36

Gráfico 7. Distribuição dos genótipos encontrados emSão Paulo no período de 1997 a 2004

85

LISTA DE ABREVIATURAS

cDNA DNA complementar

CDC Centers for Diseases Control and Prevention

DNA Acido dexoribonucleico

dNTP Desoxinucleotideos trifosfato (do inglês, Deoxynucleoside Triphosphates)DTT DitiotreitolECP Efeito citopáticoELISA Ensaio imunoenzimáticoICR Infecção Congênita por RubéolaIF Imunofluorescência

IgM Imunoglobulina da classe MIgG Imunoglobulina da classe GKda Kilodalton (103 daltons)L LitroM MolarmL Mililitro (10-3 litro)mM Milimolar (10-3 molar)mRNA RNA mensageironM Nanomolnt Nucleotideosp PoliproteinapH Potencial hidrogeniônicoPCR Reação em cadeia pela polimerase (do inglês: polymerase chain reaction)PM Peso MOlecularRN Recém-nascidoRNA Acido ribonucléico ( do inglês: ribonucleic acid)RNAse RibonucleaseRT Transcriptase reversa

PCR Reação em cadeia pela polimerase após transcrição reversa

SRC Síndrome da Rubéola Congênita

TA Temperatura Ambiente

TBE Tampão tris-borato EDTA

Tris Tris(hidroximetil)aminometano

VR Vírus da Rubéola

ºC Graus Celcius

µg Micrograma (10-6 grama)

µL Microlitro

% Porcentagem

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO --------------------------------------------- 182 REVISÃO DA LITERATURA---------------------------------- 202.1 Histórico------------------------------------------------------------------------------------ 202.2 Classificação ----------------------------------------------------------------------------- 222.2.1 Caracteristicas do Virus da Rubéola.------------------------------- 222.2.2 Organização Genômica--------------------------------------------------------------- 252.2.3 Multiplicação do Genoma------------------------------------------------------------ 262.3 Epidemiologia da Rubéola ------------------------------------------------------- 292.4 Genótipos da Rubéola -------------------------------------------------------------- 372.5 Transmissão--------------------------------------------------------- 392.6 Aspectos Clínicos---------------------------------------------------- 392.6.1 Infecção Adquirida Pós Nascimento-------------------------------- 392.6.2 Infecção Congênita-------------------------------------------------- 402.6.3 Resposta Imune Fetal----------------------------------------------- 422.7 Vacinas-------------------------------------------------------------- 422.8 Reinfecção----------------------------------------------------------- 452.9 Diagnóstico Laboratorial-------------------------------------------- 462.10 Diagnóstico da Síndrome da Rubéola Congênita (SRC)----------- 483 OBJETIVOS ----------------------------------------------- 493.1 Objetivo Geral 493.2 Objetivos Específicos 494 MATERIAL E MÉTODOS ------------------------------------ 504.1 Casuística------------------------------------------------------------ 504.2 Pacientes ---------------------------------------------------------------------------------- 524.3 Coleta das Amostras----------------------------------------------------------------- 544.4 Processamento das Amostras----------------------------------------------------- 554.4.1 Soro------------------------------------------------------------------ 554.4.2 Células Mononucleares---------------------------------------------- 554.4.3 Urina e Swab de Orofaringe---------------------------------------- 554.4.4 Líquido Cefalorraquidiano------------------------------------------- 564.4.5 Explante de Fígado ------------------------------------------------- 564.4.6 Produto de Aborto--------------------------------------------------- 574.5 Sorologia------------------------------------------------------------ 574.6 Isolamento Viral----------------------------------------------------- 584.7 Microscopia Óptica-------------------------------------------------- 584.7.1 Coloração com Azul de Toluidina----------------------------------- 584.7.2 Coloração com Hematoxilina-eosina------------------------------- 594.7.3 Imunohistoquimica-------------------------------------------------- 594.7.4 Microscopia Eletrônica---------------------------------------------- 614.8 Extração do RNA total---------------------------------------------- 614.9 Diagnóstico por RT-PCR-------------------------------------------- 614.9.1 Reação de Transcrição Reversa (RT)------------------------------- 634.9.2 Reação da Polimerase em cadeia (PCR)--------------------------- 634.9.3 Reação de nested-PCR---------------------------------------------- 634.9.4 Detecção do Produto Amplificado---------------------------------- 644.10 Sequenciamento da Glicoproteina E1------------------------------ 644.10.1 Reação de Transcrição Reversa (RT)------------------------------ 644.10.2 Descrição dos Oligonucleotideos (Primers)------------------------ 644.10.3 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) ------------------------ 674.10.4 Reação de nested-PCR---------------------------------------------- 68

4.10.5 Purificação do DNA para Reação de Seqüenciamento------------ 684.10.6 Reação de Seqüenciamento (Cycle Sequencing)----------------- 684.10.7 Purificação do DNA após Reação do Sequenciamento------------ 694.10.8 Edição e Alinhamento das Sequências do Gene E1 do Vírus da

Rubéola-----------------------------------------------------------69

4.10.9 Análise Filogenética------------------------------------------------ 705 RESULTADOS ------------------------------------------------ 725.1 Quadro Clinico------------------------------------------------------- 725.2 Sorologia------------------------------------------------------------ 735.3 Comparação das Técnicas de Isolamento Viral e RT-PCR para o

Diagnóstico do Virus da Rubéola---------------------------------73

5.4 Isolamento Viral em Cultura de Células 765.5 Coloração de Hematoxilina-eosina e Imunohistoquimica 785.6 Amplificação e Filogenia da região E1 do Genoma do Vírus da

Rubéola--------------------------------------------------------------80

6 DISCUSSÃO -------------------------------------------------------------------------- 877 CONCLUSÕES ----------------------------------------------------------------------- 93 REFERÊNCIAS-----------------------------------------------------------------------

94

1 INTRODUÇÃO

Descoberta no final do século XVIII, a rubéola tem sido eliminada em

vários países desenvolvidos nos últimos 30 anos, graças as campanhas de

vacinação. Embora seja uma doença benigna em crianças e adultos, assume

proporções às vezes devastadoras, quando acomete gestantes não imunes,

principalmente no primeiro trimestre da gestação. A Síndrome da Rubéola

Congênita (SRC) pode ser considerada uma doença viral crônica que inicia-se na

vida intra-uterina e continua na infância. O potencial lesivo do vírus da rubéola foi

confirmado no ínicio da década de 1960, quando iniciou-se técnicas para seu

cultivo e os critérios sorológicos para o diagnóstico da infecção em gestantes

foram definidos (WEBSTER, 1998). A rubéola e a SRC tem sido controlada pelos

diversos programas de imunização que ocorrem ao redor do mundo, entretanto,

surtos entre indivíduos não vacinados ainda ocorrem. Infelizmente, casos de SRC

ainda continuam ocorrendo em vários países apesar da cobertura vacinal. No

Brasil a vacinação rotineira contra a rubéola, nos programas públicos, iniciou-se

em 1992, no Estado de São Paulo e, gradativamente, foi implantada nos outros

estados. No ano de 2000 as 27 unidades da federação, já aplicavam a vacina

tríplice viral (contra o sarampo, caxumba e rubéola), no calendário básico, aos 15

meses de idade. No Brasil, nos anos de 1999, 2000, 2001 e 2007 ocorreram

epidemias de rubéola em vários estados que contribuíram significativamente para

elevar a incidência da rubéola, tendo como principal alvo homens e mulheres

jovens. Portanto, a rubéola ainda é um problema de saúde pública, com impacto

no orçamento de vários países. Em 2003, os representantes de diversos países

das Américas e da Organização Panamericana de Saúde (OPAS) marcaram até o

ano de 2010 para a erradicação da rubéola e da Síndrome da Rubéola Congênita

nas Américas.

Atualmente, a epidemiologia molecular tem sido utilizada no auxílio

do controle e monitoramento das doenças virais, pois a variabilidade da seqüência

nucleotídica de um agente etiológico permite sua classificação dentro de classes

ou genótipos (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2005, 2007). Na literatura

nacional, ainda não há relato sobre a filogenia do vírus rubéola no Estado de São

Paulo. A detecção do vírus da rubéola em amostras clínicas de pacientes com

18

suspeita da doença faz parte do Programa de Controle da Rubéola e da Síndrome

da Rubéola Congênita (SRC) realizado pelo Instituto Adolfo Lutz. A caracterização

deste vírus isolados das amostras clínicas enviadas ao Instituto Adolfo Lutz

possibilitará o estudo gênico desse vírus, além de proporcionar, melhor

compreensão nos mecanismos de infectividade dos vírus da rubéola circulantes no

Estado de São Paulo.

19

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Histórico

A rubéola já era conhecida na antiguidade pelos médicos árabes

como uma variedade do sarampo. A primeira descrição da rubéola data do século

XVIII, quando dois médicos alemães, Bergen em 1752 e Orlow em 1758

descreveram a doença, denominada inicialmente como sarampo alemão. Manton

em 1814 foi o primeiro a reconhecer que a rubéola era uma doença benigna,

distinta do sarampo e da escarlatina sendo então na época denominada Röthein

(COOPER, 1985). Em 1866, foi denominada Rubéola (do latim coisas vermelhas)

por Henry Veale (LEE; BOWDEN, 2000) mas, somente em 1881 durante o

Congresso Internacional Médico em Londres, a Rubéola passou a ser uma doença

distinta do sarampo e da escarlatina (ASSAD ; LJUNGARS-ESTEVES, 1985).

Feer (1922) afirmou que a rubéola poderia ser transmitida da

gestante ao feto, porém devido ao seu caráter benigno pouca atenção foi dada. O

agente etiológico da doença foi descrito por Hiro e Tasaka em 1938 (FORBES,

1969; SANTIS et al., 2005).

A rubéola só ganhou notoriedade em 1941, quando Norman

MacAlister Gregg, um oftalmologista australiano, constatou a sua teratogenicidade.

Nesse período, ocorreu na Austrália uma epidemia de rubéola e inúmeras crianças

nasceram com catarata congênita. Gregg estudou detalhadamente 78 recém-

nascidos (RN) portadores de defeitos congênitos, a maioria das mães, destes RN,

havia tido contato com pessoas com rubéola durante o primeiro ou segundo mês

da gravidez. Além da catarata outras alterações congênitas foram descritas:

lesões cardíacas e baixo peso. A descoberta de Gregg, causou profundo impacto,

pois, pela primeira vez, a origem das malformações não era atribuída somente a

alterações genéticas, mas à ação de um agente infeccioso sobre o feto

(HORSTMANN et al., 1976).

Inicialmente a descoberta foi recebida pela comunidade científica

com muitas ressalvas, mas, posteriormente outros relatos de epidemiologistas e

geneticistas, confirmaram a associação entre o vírus da rubéola e a ocorrência de

catarata congênita, além de outros defeitos como deficiência auditiva

(HORSTMANN, 1976; LEE; BOWDEN, 2000).

20

Green et al. (1965), realizaram estudos em pacientes voluntários e

mostram que a viremia ocorria no estágio pré eruptivo, provando que a infecção

poderia ocorrer sem lesão exantemática (HORSTMANN,1969;1976).

O vírus foi isolado cerca de 20 anos após a descoberta de Gregg, em

1962 por dois grupos de pesquisadores Weller e Neva em Boston e por Parkman,

Beuscher e Artenstein em Washington, DC (PARKMAN1962; WELLER, 1962).

Parkman et al. (1962) inocularam células de rim de macaco verde africano (VERO)

com amostra de lavado de garganta de pacientes com rubéola e demonstraram a

presença do vírus da rubéola pela resistência ao desafio com echovírus. Por sua

vez, Weller e Neva (1962) detectaram o crescimento do vírus da rubéola em

células de amnion humano utilizando amostras de sangue e urina. Os resultados

destes pesquisadores foram o alicerce para o desenvolvimento das vacinas (LEE;

BOWDEN, 2000).

Após as pandemias que ocorreram na Europa entre 1962 e 1963, e,

nos Estados Unidos da América (EUA), entre 1964 e 1965, com o custo de cerca

de 2 bilhões de dólares (WITTE et al., 1969), diversos conceitos foram descritos

sobre o risco de transmissão fetal, confirmando a gravidade desta infecção durante

o primeiro trimestre de gestação (SIEGEL et al., 1968; SEVER et al., 1965;

COOPER; PRELUB; ALFORD, 1995; WEBSTER, 1998).

A ocorrência de milhões de casos de rubéola e o nascimento de

crianças com malformações estimulou estudos para o desenvolvimento e

produção de uma vacina eficaz contra o vírus da rubéola e, entre 1965 e 1967

cepas vacinais já estavam sendo testadas (MEYER et al., 1969; PLOTKIN et al.;

1969; 2006).

Programas de imunização tem sido realizados em várias partes do

mundo, mas surtos entre indivíduos não vacinados ainda ocorrem (ROBERTSON,

2003). A Organização Panamericana de Saúde (OPAS), em 1997, tomou medidas

para implementar a campanha de vacinação para rubéola. Em setembro de 2003,

adotou uma resolução que visa eliminar a rubéola e a síndrome da rubéola

congênita até 2010 (BEST et al., 2005).

21

2.2 Classificação

O vírus da rubéola (VR) é um membro do gênero Rubivirus, da família

Togaviridae. O nome togavírus é derivado do latim toga, que significa manto

romano, uma referência dada ao envelope do vírus. A família Togaviridae possui

um outro gênero, o Alphavirus, que compreende pelo menos 27 espécies.

Enquanto os seres humanos são considerados os únicos hospedeiros naturais e

reservatórios do VR, os vírus do gênero Alphavirus são transmitidos por

artrópodes. O vírus da rubéola e os alphavirus têm características similares quanto

à estratégia de multiplicação e organização genômica (MURPHY et al., 1995; LEE;

BOWDEN, 2000; CHANTLER 2001; SCHLESINGER ; SCHLESINGER, 2001).

2.2.1 Características do Vírus da Rubéola

O vírus da rubéola apresenta-se como uma partícula esférica com

diâmetro de 60-70 nm quando visualizado por técnicas de microscopia eletrônica

(Figura 1).

22

Figura 1. Fotomicrografia eletrônica do vírus da rubéola isolado em cultura de células. Coloração negativa. Aumento 75.000X. Fotografia cedida pela Seção de Microscopia Eletrônica do Instituto Adolfo

Lutz.

O vírion consiste de um core elétron-denso de 30-35 nm, envolvido

por um envelope lipídico derivado da célula hospedeira. O core é formado de uma

fita única de RNA 40S e múltiplas cópias da proteína C (cápside), que interagem

com o RNA genômico. As outras duas proteínas estruturais codificadas pelo vírus,

são as glicoproteínas E1 e E2, ligadas entre si formando heterodímeros inseridas

no envelope, os quais se projetam na superfície do vírus como espículas de 5-6nm

de comprimento (Figura 2). (LEE; BOWDEN 2000, CHANTLER; WOLINSKY;

TINGLE, 2001). Essas proteínas tem a capacidade de aglutinar hemácias de ave

in vitro (FREY, 1994). A proteína E1 é a maior e principal proteína de superfície

viral. Tem peso molecular entre 58.000 e 62.000 Dalton. A proteína E1 é derivada

de um precursor polipeptídico intracelular e está diretamente envolvida na ligação

do vírus na superfície celular das células que compõem o sistema linfático para

que ocorra o início da infecção (LEE ; BOWDEN, 2000; CHANTLER; WOLINSKY;

TINGLE 2001). Além disso, é a molécula dominante da superfície celular, e por

isso, é o principal alvo do sistema imunológico (HOBMANN; CHANTLER 2007).

A proteína E2 pertence a uma família de moléculas com peso

molecular entre 42.000 a 54.000 Dalton classificadas em E2a e E2b, conforme o

seu grau de glicosilação (WAXHAM; WOLINSKY,1983; LEE; BOWDEN, 2000;

CHANTLER; WOLINKY; TINGLE, 2001) . A sua função esta associada com a

infectividade viral e com a hemaglutinação do vírus (GREEN et al., 1986;

HOBMANN; CHANTLER 2007).

23

Figura 2. Representação da partícula viral do vírus da rubéola com seus principais componentes. Fonte: Prefeitura da cidade de São Paulo

Secretaria da Saúde

24

Glicoproteínas E1 e E2 Espículos 5-6nm

Envelope Lípidico

RNA fita simples

Nucleocapsideo

2.2.2 Organização Genômica

O vírus da rubéola é uma molécula RNA de fita simples, polaridade

positiva, de aproximadamente 9.700 nucleotídeos. A extremidade 5’ tem um cap

de 7-metilguanosina, e na continuação do final 3’ uma cauda poliadenilada de 53

nucleotídeos em média. O genoma contém duas grandes estruturas em fase de

leitura (open reading frames, ORFs), separadas por uma região não codificadora

de 123 nucleotídeos. A ORF da extremidade 5” codifica as duas proteínas não

estruturais p150 e p90, necessárias á transcrição e multiplicação do RNA,

enquanto a ORF do final 3’ codifica as três proteínas que formam a estrutura viral:

as glicoproteína E1, E2 e a proteína C (LEE; BOWDEN, 2000; CHANTLER;

WOLINSKY; TINGLE, 2001). Além da região entre as duas ORF, há outras duas

regiões que não codificam proteínas, precedendo a primeira ORF e na região 3’ do

genoma, de 40 e 62 nucleotídeos respectivamente. Nessas três regiões há

estruturas secundárias às quais são atribuídas funções de regulação, replicação e

tradução do genoma (VAHERI et al., 1972; CHANTLER; WOLINSKY, TINGLE,

2001).

A sequência completa de nucleotídeos do vírus da rubéola para

algumas cepas atenuadas e selvagens já foram descritas (DOMINGUEZ, 1990;

FREY, 1993; PUGACHEV1997; CHANTLER, WOLINSKY; TINGLE, 2000;

KAKIZAWA et al., 2001; HOFMANN et al., 2003; ZHENG et al., 2003c). O vírus da

rubéola tem alta quantidade de guanosina e citosina (G e C), correspondente a

69% do genoma, a mais alta taxa de G+C identificada em um vírus RNA (LEE;

BOWDEN, 2000; CHANTLER; WOLINSKY; TINGLE, 2001). A comparação do

genoma de três cepa virais mostrou similaridade entre elas, variando de 97,2% a

99% e, em relação à seqüências de aminoácidos, a variação foi de 97,6% a 98,9%

(PUGACHEV; FREY, 1997).

25

2.2.3 Multiplicação do genoma

A multiplicação do vírus da rubéola é lenta, compreendendo um

período de 12 horas (BOWDEN; WESTAWAY, 1989; FREY 1994; LEE; BOWDEN,

2000). O inicio da replicação celular ocorre no citoplasma celular após a

penetração do vírus na célula por endocitose (Figura 3).

26

C

Figura 3. Microscopia Eletrônica de células Vero infectadas com o vírus da rubéola. A- Penetração do vírus por endocitose; B- A partícula viral dentro de um endossomos semelhantes a vacúolos. C- Note vários vírions da rubéola dentro dos vacúolos. X100. Fonte: Lee e Bowden (2000).

O ácido nucléico, RNA viral, liga-se ao retículo endoplasmático

rugoso, servindo como modelo para a tradução da proteína. Após a síntese das

glicoproteínas E1 e E2 no reticulo endoplasmático, ocorre o amadurecimento viral

dentro do Complexo de Golgi, mitocôndria ou retículo endoplasmático rugoso. A

capacidade do vírus amadurecer dentro dos vacúolos intracelulares e assim, evitar

a resposta do sistema imunológico, pode ser um fator determinante da estabilidade

e permanência da infecção em humanos (FREY et al, 1994). O vírus maduro é

transportado em vácuolos e expelido por brotamento intracelular.

Após a liberação do seu RNA genômico, este é utilizado como mRNA

para a produção das proteínas não estruturais que são utilizadas para a síntese da

fita complementar negativa do RNA, do RNA genômico e do RNA subgenômico

(LEE; BOWDEN, 2000). A ORF que fica na região 5’ do genoma é traduzida para

uma poliproteína de 240kd, que posteriormente é clivada em dois polipeptideos, de

150 e 90kd. A proteína p150 tem a função de protease e metil-transferase, esta

última aparentemente implicada no capping do RNA. A proteína p90 tem as

funções de replicase e helicase. Estas enzimas catalizam tanto a replicação do

RNA por meio da síntese do RNA antigenômico, quanto do mRNA subgenômico,

que dirige a síntese das proteínas estruturais. A tradução do mRNA subgenômico

produz uma outra poliproteína que dá origem às proteínas estruturais (Figura 4).

Os genomas replicados podem ou não ser traduzidos para produzir mais proteínas

estruturais ou participar da montagem (maturação) das partículas virais juntamente

com as proteínas estruturais, formando a progênie viral (BALL, 2001; CHANTLER;

WOLINSKY; TINGLE 2001; SCHLESINGER ; SCHLESINGER , 2001).

27

ORF NÃO ESTRUTURAL ORF ESTRUTURAL

10Kb

p200

p150

Clivagem proteolítica

Tradução

p90

Transcrição

Tradução

C E2 E1

p100

Figura 4. Esquema da representação da organização genômica do vírus da rubéola. P: proteína

28

2.3 Epidemiologia da Rubéola

A rubéola é de ocorrência sazonal, com aumento do número de

casos no final do inverno e inicio da primavera. No período anterior á vacinação

ocorriam epidemias a cada 6 a 9 anos, acometendo crianças entre 5 e 14 anos de

idade e, mais raramente, crianças menores de um ano de idade.

Nos Estados Unidos, em 1964, 12,5 milhões de pessoas adoeceram

por rubéola, sendo a maior epidemia de rubéola já descrita, resultando em cerca

de 13.000 mortes fetais e neonatais e 20.000 crianças afetadas pela SRC

(SIEGEL et al., 1968). Como conseqüência desta epidemia, a rubéola e a SRC

tornaram-se doença de notificação compulsória nos EUA em 1966. Entre 1969 e

1988, observou-se uma redução de 99% na incidência da rubéola após as

estratégias de vacinação adotadas (LINDEGREN et al., 1991). Atualmente, a

incidência de rubéola neste país está, desde 2001, em torno de 0,02 casos por

100.000 habitantes. Observam-se surtos esporádicos acometendo adultos, em sua

maior parte, originários de paises onde a vacinação contra a rubéola não é

realizada rotineiramente (REEF et al., 2002, ROBERTSON et al., 2003).

A SRC também acompanhou esta queda na incidência. Em 1964,

durante a epidemia, a incidência de SRC era de 16 casos por 100.000 nascidos

vivos, apresentando um decréscimo de 2,7 casos por 100.000 nascidos vivos em

1969 (LINDEGREN et al., 1991). Entre 2001-2004, foram notificados quatro casos

de SRC, sendo que três eram filhos de mulheres imigrantes. A baixa incidência de

rubéola e SRC e a ausência de transmissão endêmica nos EUA por mais de 12

meses levaram o CDC a considerar que houve a interrupção da transmissão da

rubéola endêmica em 2004 (ICENOGLE et al, 2006).

No Brasil a vacinação rotineira contra a rubéola, nos programas

públicos, iniciou-se em 1992, no Estado de São Paulo e, gradativamente, foi

implantada nos outros estados. No ano de 2000 as 27 unidades da federação, já

aplicavam a vacina tríplice viral (contra o sarampo, caxumba e rubéola), no

calendário básico, aos 15 meses de idade. A rubéola passa a integrar a lista de

doenças de notificação compulsória no Brasil, somente, na segunda metade da

década de 90. Em 1997, ano em que o país enfrentou a última epidemia de

sarampo, foram confirmados 32825 casos de rubéola, sendo que no período 1999-

29

2001 ocorreram surtos desta doença em vários estados brasileiros (Gráfico 1). Em

2001 e 2002 , foram notificados 15766 e 5867 casos de rubéola em todo Brasil

foram confirmados. A taxa de incidência de rubéola na população do Brasil em

2001, chegou a 5/100.000 mulheres, na faixa etária de 15 a 19 anos e a

6,3/100.000 mulheres, na faixa etária de 20-29 anos (Ministério da Saúde,

Vigilância Epidemiológica). Nesse período observou-se um aumento progressivo

no número de casos de síndrome da rubéola congênita (SRC), de 200 para 600

casos, refletindo o aumento da circulação do vírus na população adulta, bem como

o aumento das estratégias de vigilância para a detecção de casos suspeitos. A

vacinação de mulheres em idade fértil possibilitou uma importante redução dos

casos de SRC, sendo a ocorrência de 13 casos registrados em todo o país, em

2003.

No Estado de São Paulo, o Programa de Controle da Rubéola e da

O Programa de Controle da Rubéola e da SRC foi implantado em

1992, com a realização da campanha estadual de vacinação e a aplicação da

vacina tríplice viral em toda a população de um a dez anos de idade. A seguir, a

30

Gráfico 1. Distribuição do numero de casos confirmado de rubéola no Brasil, 1993 a 2004. Fonte: Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância Epidemiológica (ano 2005)

vacina foi incluída no calendário oficial do Estado de São Paulo, para ser aplicada

simultaneamente, aos 15 meses, com o 1º. reforço da vacina DPT (contra difteria,

coqueluche e tétano) e poliomielite. A cobertura vacinal atingida durante a

campanha estadual foi de 95,7%. O objetivo desta campanha foi diminuir a força

de infecção, com queda da circulação viral e conseqüente proteção às mulheres

em idade fértil (MASSADI et al., 1995). Para manutenção desta situação as

coberturas vacinais nas atividades de rotina, nos anos seguintes, deveriam

manter-se elevadas e homogêneas. No entanto, cerca de 30 a 40% dos

municípios do Estado, não atingiram a meta proposta, que era vacinar 95% das

crianças com um ano de idade com a vacina tríplice viral. Esse fato, aliado à falha

vacinal (5%), contribuíram para o aumento de suscetíveis. (CVE, 2010 ) (Gráfico

2).

0,67

1,64

2,37

3,05

0,42

1,86

1,21

3,95

6,93

1,15

0,330,390,73

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004

CA

SOS

0

1

2

3

4

5

6

7

8

C.In

c.

N º CASO S C .Inc.

Na epidemia de 2000 que ocorreu no Estado de São Paulo,

semelhante ao que ocorreu com o sarampo 1997, houve um deslocamento da

31

Gráfico 2 . Distribuição do número de casos de rubéola e coeficiente de inci- dência (100.000 hab), no Estado de São Paulo, 1992 a 2004. Fonte: Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo, Centro de Vigilância Epidemiológica, Instituto Adolfo Lutz.

2566

1486

152277216

536

797

1027

142

645

406 434

129

faixa etária de incidência da doença para a população de adultos jovens. A maior

proporção dos 2.566 casos confirmados, ocorreu em pessoas de 20 a 29 anos de

idade (58,6%), o risco de doença foi maior nesta faixa etária (23,7 casos/100 000

hab). (Gráfico 3).

A conseqüência destes surtos, com uma alta incidência entre adultos

jovens, foi um aumento da incidência da SRC. Em 2000 foram confirmados pelo

laboratório 138 casos de gestantes infectadas pelo vírus da rubéola (Gráfico 4).

Entretanto, devido a sub-notificação da doença estes números podem representar

apenas uma pequena parcela da real incidência (ANDRADE et al.,2006).

32

Gráfico 3 Distribuição do número de casos por faixa etária, Estado de São Paulo em 2000. Fonte: Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo, Centro de Vigilância Epidemiológica, Instituto Adolfo Lutz.

O principal objetivo do Plano Nacional de Controle da Rubéola é

reduzir a incidência de casos, visando o controle da Síndrome da Rubéola

Congênita. A Organização Panamericana da Saúde (OPAS), estabeleceu

como meta, em junho de 2003 a eliminação da rubéola e da SRC nas

Américas, até o ano 2010 (Figura 5).

33

Gráfico 4. Distribuição do número de casos de gestantes e Síndrome da Rubéola Congênita confirmados no Estado de São Paulo, 1992 a 2004. Fonte: Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo, Centro de Vigilância Epidemiológica, Instituto Adolfo Lutz.

Figura 5 Resolução do Comitê Executiva da OPAS, 132° Sessão Junho- 2003. Fonte: Organização Panamerica de Saúde (OPAS). (Ano 2003).

No Estado de São Paulo uma campanha de vacinação contra a

rubéola foi realizada, em novembro de 2001, para todas as mulheres na faixa etária

dos 15 aos 29 anos de idade (CVE, 2001). Após a realização da campanha,

verificou-se uma queda no número de casos confirmados de rubéola; em 2002

foram notificados 277 casos (0,73 casos/100 000 hab). (Gráfico 2).

A rubéola, entretanto, ainda é um problema de saúde pública, com

impacto no orçamento de vários países. No período de 1998 a 2006, 40 países e

territórios, representando cerca de 90% da população da Região das Américas

utilizaram estratégias de vacinação em massa para crianças, adolescentes e

adultos com o objetivo de interromper rapidamente a transmissão do vírus da

rubéola e prevenir a SRC (TINGLE, 1997; PAHO, 2002; CASTILLO-SOLORZANO

et al., 2003; MULLER et al., 2007). O número de casos confirmados de rubéola

diminuiu em 99% em 2004 nas Américas (Gráfico 5).

34

Gráfico 5 Distribuição dos casos notificados de Rubéola nas Américas, 1980–2004. Fonte: Organização Panamericana de Saúde. (ano 2005).

Durante a 27ª Conferência Sanitária Pan-Americana e 59ª sessão do

Comitê Regional, realizada em outubro de 2007 em Washington D.C., foram

reconhecidos os avanços alcançados na região e aprovada a formação de um

comitê técnico responsável pela documentação e comprovação da interrupção da

transmissão do vírus endêmico do sarampo e da rubéola nas Américas.

Entretanto, em 2006, em vários estados do Brasil, foi observado um

aumento significativo do número de casos confirmados de rubéola. Os surtos

inicialmente ocorreram nos estados de Rio de Janeiro e Minas Gerais. A

disseminação do vírus ocorreu durante todo o ano de 2007, afetando 20 dos 27

estados, totalizando 8.156 casos confirmados, distribuídos nas regiões Sudeste,

Sul, Nordeste e Centro-Oeste. Em 2007, no período que se estende de janeiro a 15

de dezembro, foram confirmados surtos de rubéola em 19 (70%) estados

brasileiros, em 478 (8,6%) dos municípios, perfazendo um total de 6.885 casos

confirmados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2010). A distribuição dos 6.885 casos

confirmados manteve o padrão do início do surto, A distribuição dos casos

confirmados configurou–se durante todo o surto, ou seja, 5.992 (69%) casos

confirmados no sexo masculino. A faixa etária mais acometida em ambos os sexos

35

Controle acelerado darubéola e SRC

é a de 20 a 29 anos de idade com 4.507 (52%) dos casos, seguida pelas faixas

etárias de 30 – 39 anos com 1.634 (18,9%) e de 12 - 19 anos com 983 (11,5%)

casos confirmados (Coordenadoria de Controle de Doenças, 2007).

Em São Paulo, durante o ano de 2007, foram confirmados 1.627 casos de

rubéola, sendo 886 (57%) em homens adultos, na faixa etária de 20 - 39 anos. Em

2008, foram confirmados 746 casos de rubéola (Gráfico 6) (Coordenadoria de

Controle de Doenças, 2007). Entre 2007 e 2008, foram notificados 33 casos

suspeitos de Síndrome da Rubéola Congênita e um caso de óbito fetal por rubéola

em mulher não vacinada, natural do Maranhão (ANDRADE et al., 2010).

Em 2008, no período de 9 de agosto a 12 de setembro, ficou

estabelecida a realização de outra campanha nacional de vacinação, dessa vez

para homens e mulheres entre 20 e 39 anos de idade. Foram aplicadas 6.544.911

36

Gráfico 6. Distribuição do número de casos de rubéola no Estado de São Paulo 2000 a 2008.

Fonte: Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo, Centro de Vigilância Epidemiológica, Instituto Adolfo Lutz.

doses da vacina contra a rubéola (tríplice viral e dupla viral) para indivíduos maiores

de 12 anos de idade, de acordo com Coordenação Nacional do Programa de

Imunizações. O intuito desta vacinação foi atingir a meta que foi estabelecida pela

OPAS para a eliminação da rubéola e da Síndrome da Rubéola Congênita em

2010.

2.4 Genótipos da Rubéola

A epidemiologia molecular tem sido utilizada no auxílio do controle e

monitoramento das doenças virais, pois a variabilidade da seqüência nucleotidica

de um agente etiológico permite sua classificação dentro de grupos e

posteriormente, em genótipos. Os genótipos do vírus da rubéola foram

determinados a partir da análise da glicoproteína E1 do vírus da rubéola. A

taxonomia da rubéola consiste de dois grupos: 1 e 2 ( FREY et al., 1998; KATOW

S., 1998; ZHENG et al., 2003a.; WHO, 2005). O grupo 1 é formado por 7 genótipos

do virus da rubéola (1a, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F e 1G) e o grupo 2 por tres genótipos

(2A, 2B, 2C) (WHO, 2005; 2007). Os genótipos designados em letras minúsculas,

são considerados provisórios, porque o número limitado destes vírus dificulta a sua

caracterização. A variação nucleotídica é de 5,8% e 8,0% para o grupo 1 e 2

respectivamente (ZHENG et al., 2003a; 2003c). Geograficamente, os vírus do grupo

1 circulam em todo o mundo, enquanto do grupo 2, estavam limitados a região

Asiática, porém, isto foi modificado durante as epidemias de rubéola que ocorrem a

partir do ano de 2006, onde foi encontrado o genótipo 2B em vários países da

Europa e região das Américas (VALINOTTO et al., 2010; ANDRADE et al., 2010;

CURTI, 2008).

O genótipo 1a compreende todos os vírus que circularam na década

de 60, entretanto, este genótipo tem sido encontrado em Myanmar, Mongólia e

Brazil (ZHENG et al., 2003a, 200c ; WHO, 2005, 2007; THANT et al., 2006;

FIGUEIREDO et al., 2008; 2010). O genótipo 1G tem sido encontrado na África,

Rússia, Europa, etc (CAIDI et al., 2008; WHO, 2007, 2005). Os genótipos 1B, 1C e

1E tem sido encontrado na America do Sul, Japão, África, China e Filipinas; 1D

Ásia, Etiópia, Canadá e USA; 1F na China (WHO 2005, 2007). O genótipo 1C foi

encontrado durante uma epidemia de rubéola que ocorreu no Japão que

posteriormente, surgiu nas Américas. Em 2007, três novos genótipos provisórios

37

foram adicionados: 1h, 1i, 1j. Em relação aos novos genótipos provisórios, o

genótipo 1i foi identificado na Itália nos anos de 1992 e 1994, respectivamente e

após este períodos, nenhum vírus deste genótipo foi encontrado, portanto este

genótipo é considerado provisório e inativo. O genótipo 1j foi identificado nos

Estados Unidos e no Japão e o genótipo 1h foi identificado na região de Belarus na

Rússia.

38

Figura 6. Distribuição dos genótipos do vírus da rubéola no mundo, no período de 1995-2008.

2.5 Transmissão

A rubéola é uma doença exantemática aguda e ocorre predominantemente

na infância e na adolescência. Tem distribuição universal e a incidência de casos

aumenta no final do inverno e no incio da primavera.

A transmissão ocorre por contato direto com indivíduos infectados por meio das

gotículas de secreções da nasofaringe. A transmissão por meio de objetos

contaminados é pouco frequente. O indivíduo infectado pode transmitir a doença

cerca de cinco dias antes e 7 dias após o aparecimento do exantema. Recém-

nascidos com rubéola congênita podem eliminar o vírus pela urina e secreções

nasofaríngeas por um período superior a um ano, sendo o risco de transmissão

mais importante nos primeiros meses de vida. Todos os recém nascidos devem ser

considerados excretores do vírus nos três primeiros meses de vida. O período de

incubação varia de 12 a 23 dias, sendo em média 17 dias (COOPER et al., 1995).

2.6 Aspectos Clínicos

2.6.1 Infecção Adquirida Pós Nascimento

A infecção pelo vírus da rubéola em uma criança ou em um adulto é

caracterizada por um exantema máculo-papular discreto, em comparação com o

sarampo e a escarlatina, com duração de três dias e distribuição crânio-caudal. À

medida que atinge os membros inferiores, começa a desaparecer da face, mas

permanece coalescente apenas no tronco. Nas crianças, geralmente, não há

pródromos, mas em adolescentes e adultos, cerca de um a cinco dias antes do

início do exantema, observa-se febre baixa, tosse, coriza, cefaléia, mal estar e

linfadenopatia. Embora o exantema seja o aspecto mais característico da doença,

este sintoma pode ser produzido por outras infecções ou mesmo por drogas, desta

forma, exceto nos períodos epidêmicos, o diagnóstico clínico da rubéola é dificil.

Estudos tem mostrado quadro clínicos clássicos de rubéola como sendo outras

doenças e, inversamente, casos atípicos como sendo rubéola verdadeira (BARON,

1996; HOBMAN; CHANTLER, 2007;). Em adultos, no entanto, a doença pode ser

mais grave, como poliartralgia e poliartrite (HERRMANN, 1995; SANTIS et al.,

39

2005). Outras complicações são encefalite (1:6000 casos) com uma taxa de

mortalidade de 50%, trombocitopenia com manifestação hemorrágica (1:3000

casos), Síndrome de Guillain-Barré, hepatite fulminante, neurites, encefalites,

cojuntivites, orquites (HOBMAN; CHANTLER, 2007; FIGUEIREDO et al., 2008,

2010a,b).

2.6.2 Infecção Congênita

A patogênese da SRC inicia-se com a viremia materna, atingindo a

placenta, e em seguida, pela migração das células infectadas, é transmitida

rapidamente para o feto. O risco de infecção e da SRC decresce com o aumento da

idade gestacional. A teratogenicidade do vírus da rubéola é inquestionável, mas o

mecanismo de acometimento ainda não foi totalmente esclarecido. A replicação

viral pode levar a anormalidades mitocondriais, alterações no esqueleto celular e

apoptose (LEE; BOWDEN, 2000).

Atualmente, é reconhecido que, quando a infecção ocorre nas

primeiras oito semanas de gestação, as anormalidade decorrentes dessa infecção

são geralmente graves. O retardo na organogênese e a desorientação celular levam

aos defeitos estruturais característicos: lesões ósseas, hepáticas, encefalite,

trombocitopenia púrpura e o retardo psicomotor progressivo frequentemente

observado à medida que a criança cresce (LEE; BOWDEN, 2000)

A infecção do feto inicia-se nos tecidos placentários (córion), induzindo

necrose celular nas células epiteliais e endoteliais. As células endoteliais

descamadas vão para o lúmem dos vasos e daí, são transportadas para a

circulação fetal. A lesões aparecem 10 dias após o exantema materno (TONDURY;

SMITH, 1966; CHANTLER; WOLINSKY; TINGLE; 2001). Os órgãos mais

acometidos são: fígado, miocárdio e órgão de Corti (PLOTKIN E VAHERI, 1967;

YONEDA, 1986). A rubéola congênita pode resultar em morte fetal, nascimento com

anomalias, e nascimento de crianças normais sem evidência de infecção (KATOW,

1998; WEBSTER, 1999; ANDRADE et al., 2006). A tríade de anormalidades

anatômicas são: catarata, surdez e lesões cardíacas, mas também, podem ser

observadas trombocitopenia, hepatite, microcefalia, retardo do crescimento, lesões

dos ossos longos, retinite, encefalite, panencefalite, hepatomegalia, diabete melito,

tireoidite (HOBMANN; CHANTLER, 2007). As manifestações clinicas podem ser

40

comuns, transitórias e pouco freqüentes (Tabela 1) (HOBMANN; CHANTLER ,

2007). A criança intra útero pode permanecer cronicamente infectada por meses

após o nascimento; nascer aparentemente normal e mais tarde desenvolver

exantema rubeliforme crônico, encefalopatia, pneumonite intersticial, retardo

psicomotor e surdez. Além disso, alguns pacientes com a SRC desenvolvem

Panencefalite Progressiva da Rubéola (PPR), após a doença congênita ou

adquirida. Estes pacientes apresentam deteriorização intelectual e distúrbio

comportamental semelhante ao da panencefalite esclerosante subaguda do

sarampo (PESS). A patogênese da panencefalite por rubéola é desconhecida,

entretanto alguns estudos mostraram não se tratar de doença imunológica ou de

desmielinização progressiva. Os pacientes vivem de 6 a 18 meses em franca

deteriorização cerebral, até entrar em coma e ir a óbito (COOPER; PRELUB;

ALFORD, 1995; FREY, 1997).

Tabela 1- Manifestações clinicas da Síndrome da Rubéola Congênita: comuns, transitórias e pouco freqüentes.

MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

COMUNS TRANSITÓRIAS POUCO FREQUENTES

Catarata e microftalmia Baixo peso ao nascer Glaucoma

Retinopatia Fontanela anterior aumentada Miopia sevra

Surdez, neurossensorial Hepatoesplenomegalia Criptoquirdia

Distúrbios de linguagem Adenopatia generalizada Hérnia inguinal

Retardo Mental Miocardite Diabete

Persistência Ducuts Hepatite Tireoidite

Arteriosus Anemia hemolítica Deficiência GH*

Estenose de artéria Meningoencefalite

Diplegia espática Púrpura trombocitopênica

GH: Hormônio do crescimento

41

2.6.3 Resposta Imune Fetal

A infecção do vírus da rubéola na gestante, se inicia antes do

desenvolvimento da resposta imune materna, o vírus se espalha por via

hematogênica, atingindo múltiplos tecidos maternos e até mesmo a placenta. A

produção dos anticorpos pela gestante provoca o desaparecimento do vírus na

corrente sanguínea, porém, podendo permanecer durante meses na placenta

(TONDURY; SMITH, 1966; RAWLS, 1968).

No inicio da gestação, o feto infectado é incapaz de se defender, pois

a transferência de IgG materna para o feto pela placenta se inicia somente na

metade da gravidez. Na 6ª semana de gestação, pode ser detectada

imunoglobulinas da classe IgG no liquido celômico, mas essa imunoglobulina

parece ser ineficiente nessa fase. No primeiro trimestre de gestação, as

imunoglobulinas circulantes no sangue fetal correspondem de 5 a 10% do nível

materno. A taxa de transferência materno-fetal de imunoglobulinas aumenta

progressivamente com a idade gestacional e a IgG no cordão umbilical, pode

exceder o da mãe (PREBLUD; ALFORD, 1990). Estudos realizados por Meitsch et

al (1997), entre recém nascidos com SRC e recém-nascidos infectados mas sem

sintomas ao nascimento mostrou que os recém nascidos com SRC demonstraram

baixos títulos de anticorpos direcionados para as proteínas E1 e E2 do vírus da

rubéola e, nos assintomáticos, títulos normais desses anticorpos, sugerindo uma

deficiência na resposta imune, tanto na humoral quanto na celular (MEITSCH et al.,

1997; PUSTOWOIT; LIEBERT, 1998; HOFMANN; LIEBERT, 2005).

2.7 Vacinas

A primeira vacina da rubéola foi desenvolvida por Parkman et al (1969)

utilizando o vírus atenuado cultivados em células de rim de macaco verde africano

(VERO) e foi chamada de HPV-77. Posteriormente, a Merck produziu a vacina

HPV-77 DE-5 que foi obtida após sucessivas passagens do vírus atenuado em

embrião de patos, sendo a primeira vacina licenciada para uso nos Estados Unidos.

Essa vacina mostrou-se bem tolerada, segura e imunogênica (LEE; BOWDEN,

2000). Huyglen e Peetrmans a seguir, desenvolveram na Bélgica a cepa Cendehill a

42

qual foi cultivada em células de rim de coelhos por diversas passagens. A terceira

vacina (wistar RA 27/3) foi desenvolvida por Plotkin em 1965, porém só foi liberada

em 1979 nos EUA. A partir desta data, a vacina HPV-77 foi retirada do mercado e a

vacina RA27/3 é hoje a única licenciada, tanto na forma monovalente como

combinada com as vacinas para sarampo e caxumba, recebendo a denominação

de vacina tríplice viral (HORSTMAN, 1976; Baron, 1996). A cepa RA27/3 é mais

imunogênica e menos reatogência que a HPV-77 e a Cendehill (PLOTKIN, 1973,

2004), e por isso hoje quase todos os países do mundo a utilizam, com exceção no

Japão que dispõe de cinco outras cepas: Matsubara, TCRB19, Takahashi,

Matsubara e TO-336 (UEDA, 2009).

Os níveis de anticorpos induzidos pelas vacinas são mais baixos do

que os produzidos pela doença adquirida naturalmente, aproximadamente 95% das

pessoas vacinadas tem soro conversão entre 14 e 28 dias após a vacinação. Porém

como todas a vacinas, a duração da proteção é uma questão preocupante. Estudo

realizado por Davidikin et al., (2008) mostrou que após 20 anos os níveis de

anticorpos para rubéola persistem sómente em indivíduos que receberam as duas

doses de MMR. Entretanto, estudos mostram que uma pequena proporção da

população pode não desenvolver a produção de anticorpos protetores (HOBMANN;

CHANTLER, 2007).

A vacinação contra a rubéola é o meio mais eficaz de prevenir contra a

infecção pelo vírus. No atual calendário de vacinação do Programa Nacional de

Imunizações é aplicada de forma combinada com as vacinas contra o sarampo e

caxumba (vacina tríplice viral), aos 12 meses de idade, com uma segunda dose

entre quatro e seis anos de idade. O objetivo da segunda dose é principalmente

imunizar as crianças que apresentem falha vacinal primária (cerca de 5%), após a

primeira dose.

A vacina da rubéola é bem tolerada e pouco reatogênica. No entanto

algumas pessoas vacinadas poderão apresentar reações locais (dor, edema, rubor

e calor), febre e exantema (entre o 5º e 12º dia após a vacinação), linfadenopatia

(entre o 5º e 12º dia), dor articular (7o e 21º dia) e reações imediatas de

hipersensibilidade. As reações adversas relacionadas com artralgia, artrite aguda,

geralmente transitória, ocorrem em 10%-30% das mulheres vacinadas com RA 27/3

(TINGLE, 1997; MITCHELL et al., 1993; POLK, 1982;). OU et al.1993, mostraram a

existência de uma associação de determinados haplótipos HLA DR, com uma

43

maior incidência de sintomas articulares após vacinação com RA27/3, sugerindo

que o virus da rubéola atenuado pode causar sintomas de artrite e artralgia em

indivíduos geneticamente predispostos.

Durante os últimos anos, a associação da vacina MMR

(sarampo/caxumba/rubéola) com o autismo, prejudicou os programas de

imunização em alguns paises (CHEZ; CHIN; HUNG, 2004; COFFIN, 2002). Chen et

al., 2004, realizaram um estudo retrospectivo, no qual foram analisados

aproximadamente 2.000 pacientes com mais de 30 anos, os quais receberam

vacinação com MMR ou tiveram infecção natural, para determinar se houve

aumento na incidência de autismo neste grupo, os resultados mostraram que não

houve qualquer aumento de autismo relacionado com a vacina ou com a infecção

natural.

A vacinação em gestantes, pessoas com imunodeficiência congênita

ou adquirida (exceto as crianças infectadas pelo vírus HIV assintomáticas),

naquelas com neoplasias malignas, nas pessoas em tratamento com corticóides

em doses elevadas (equivalente a prednisona na dose de 2 mg/kg/dia ou mais, por

mais de suas semanas) ou submetidas a terapêuticas imunodepressoras

(quimioterapia, radioterapia, etc) ou com história de reação anafilática em doses

anteriores ou a qualquer componente da vacina é contra-indicada, por se tratar de

uma vacina atenuada.

Em 2001, no Estado de São Paulo, houve uma campanha de

vacinação em massa, onde 6.473 mulheres gestantes foram vacinadas

inadvertidamente. Após acompanhamento e triagem, 811 gestantes que eram

susceptíveis, foram acompanhadas até o momento do parto. As amostras de

sangue de 27 recém-nascidos, apresentavam sorologia IgM reagente para o vírus

da rubéola, entre estes recém-nascidos, uma avaliação completa foi realizada em

18 e nenhum apresentou malformações compatíveis com a SRC (SATO, 2010).

44

2.8 Reinfecção

A reinfecção por rubéola em indivíduos vacinados ou em gestante é rara,

podendo ocorrer em individuos após a imunidade adquirida pela infecção natural ou

induzida pela vacina. As manifestações clínicas são geralmente suaves, porém

alguns indivíduos apresentam linfoadenopatia, exantema ruboliforme e artropatia .

Na reinfecção, ao contrário da infecção primária, a resposta imunológica consiste

no aumento de IgG, cujos níveis elevam-se rapidamente logo após o contágio.

Normalmente, não ocorre resposta tipo booster com base na IgM; altos títulos

desse anticorpo surgem apenas na infecção primária. Vale ressaltar que técnicas

sensíveis, como o ELISA de captura, podem detectar baixos níveis de IgM

específica em alguns pacientes com reinfecção, sendo difícil a diferenciação da

infecção primária. Nesses casos, a determinação da avidez da IgG pode trazer

subsídio ao diagnóstico, pois na infecção primária ocorre baixa avidez, enquanto na

reinfecção a mesma é elevada (HAMKAR et al., 2009,2005).

Os casos de reinfecção ocorrem com mais freqüência em individuos

com ou alteração da imunidade (defeitos no mecanismo humoral ou células

mediadas) ou falha vacinal (HORSTMANN 1970, 1969; MORGAN-CAPNER et al.,

1985a; CUSI et al., 1990,1993; BARFIELD et al., 1997; BEST; BANATVALA,2000).

Apesar de existirem poucos casos relatados na literatura, onde a infecção

fetal ocorreu após uma reinfecção materna, estudos mostraram que o risco de

infecção fetal nesse casos, pode chegar a 9% (MORGAN-CAPNER et al., 1985a;

FOGEL et al., 1996; BEST, 2007). Aboudy et al. (2000) relataram uma reinfecção

em uma gestante vacinada no qual, o recém-nascido não apresentou qualquer

sequela após o nascimento. Por outro lado, Alem et al. (1998), apresentaram o

relato de uma gestante infectada cujo recém-nascido apresentou catarata bilateral.

A SRC foi confirmada pelo alto titulo de avidez da mãe.

45

2.9 Diagnóstico Laboratorial

O diagnóstico laboratorial para um paciente com suspeita de infecção pelo

vírus da rubéola pode ser iniciado por testes sorológicos no soro. A grande maioria

dos casos de infecção pelo vírus da rubéola são manifestações subclinicas e o

diagnóstico diferencial em casos de doença exantemática é extremamente

importante. A análise sorológica baseada nos achados de anticorpos específicos,

em particular, IgM, IgG e avidez de IgG são os mais pesquisados. A infecção

aguda da rubéola é caracterizada pelo aparecimento de anticorpos específicos IgM,

presentes em 5 dias após o exantema e o aumento progressivo de títulos de

anticorpos IgG. Além disso, após uma semana, as classes de imunoglubulinas,

incluindo IgA, IgD e IgE estão presentes (CHANTLER; WOLINSKY; TINGLE; 2001;

HOBMAN; CHANTLER, 2007).

A investigação sorológica é realizada pelo teste imunoenzimático

(ELISA), porém, outros testes podem ser usados, como os testes de inibição de

hemaglutinação (IH) e imunofluorescência (IF), porém a confirmação, em casos

positivos, é feita pelo teste de ELISA (CVE, 2010; HOBMAN;CHANTLER, 2007). A

proteína E1 do vírus da rubéola induz a formação de anticorpos neutralizantes e

inibidores de hemaglutinação, os quais persistem por toda a vida, além disso, os

anticorpos fixadores de complemento podem ser detectados de 7 a 10 dias após o

exantema viral e não permanecem mais do que dois anos no soro dos pacientes.

Atualmente, vários laboratórios tem utilizado a técnica de pesquisa de

avidez de anticorpos para diferenciar infecção recente da infecção passada

(HAMKAR., et al., 2005, 2009; BEST 2007; VAULOUP-FELLOUS et al. 2007). Este

teste baseia-se na constatação de que a avidez de anticorpos para o seu alvo

antigênico aumenta com o tempo, refletindo a maturação da resposta imune, pela

inclusão de um detergente suave, como dietilamina ou uréia em tampão de lavagem

de um padrão de teste de ELISA IgG, a avidez de IgG pode ser medida. A

identificação de anticorpos de baixa avidez (índice de avidez igual ou inferior a

30%), sugere infecção primária recente.

O isolamento viral, ainda é considerado o gold standard para o

diagnóstico de infecção pelo vírus da rubéola. As células mais utilizadas para o

isolamento primário do vírus da rubéola são VERO (rim de macaco verde africano),

BHK-21 (rim de hamster), SIRC (córnea de coelho), RK-13 (rim de coelho) e

46

atualmente, VERO-SLAM (rim de macaco verde africano-Signaling linfocite activite

molecular). O crescimento do vírus da rubéola é lento e além disso, o seu efeito

citopático nem sempre é observado. As culturas de células inoculadas são

observadas durante 8 dias ou até o aparecimento do efeito citopático. Após este

período, as culturas que não apresentaram efeito citopático, são inoculadas em

novas passagens celulares até o surgimento do efeito citopático. As células são

repassadas até quatro passagens até o surgimento ou não de efeito citopático,

sendo posteriormente, submetidas as técnica de PCR para identificação do agente

isolado (FIGUEIREDO et al., 2004, 2009; HOBMAN; CHANTLER,2007).

O isolamento viral é indicado em situações clinicas que incluem, casos

suspeitos de rubéola nos quais não há possibilidade de confirmação sorológica ou

quando há complicações graves (encefalite, artrite, síndromes) e como indicativo

da persistência da infecção viral (FREY, 1997; CHANTLER; WOLINSKY; TINGLE

2001; FIGUEIREDO et al., 2008, 2009).

As técnicas de amplificação de ácidos nucleicos foram desenvolvidas

na década de 1990 para a detecção de RV em amostras clínicas (HO-

TERRY;TERRY, 1990; BOSMA 1995a,b.; CHANTLER et al., 1997; KATOW, et al.,

1998). Estudos realizados por BOSMA et al. (1995b), analisando material de

interrupção de gestação (placenta e tecidos fetais), detectaram o vírus da rubéola

em 67% dos casos, com infecção nas primeiras 12 semanas de gestação pelo

método de PCR e, quando associaram o PCR e isolamento viral, detectaram o vírus

em 70% dos casos. Revello et al. (1997), estudando 20 amostras de autópsias de

casos de rubéola congênita utilizando a técnica de PCR detectou 15 casos (75%),

o isolamento viral 6 (20%). Oliveira et al. (2001), utilizando a técnica de PCR

usando como amostra clinica soro de pacientes com suspeita de rubéola detectou o

vírus em 80% dos casos. Andrade et al.(2006), analisaram por nested PCR, entre

janeiro de 1999 e dezembro de 2002, o liquido amniótico e tecidos fetais de

mulheres grávidas com sinais clínicos de rubéola e presença de anticorpos

específicos, os resultados revelaram alta positividade para o vírus da rubéola. Os

métodos diretos para o diagnóstico fetal, como o PCR são, essenciais para o

diagnóstico precoce de infecção fetal.

47

2.10 Diagnóstico da Síndrome da Rubéola Congênita ( SRC)

O diagnóstico para SRC pode ser realizado usando os testes

sorológico, isolamento viral e PCR (CHANTILER; WOLINSKY; TINGLE, 2001;

RAJASUNDARi et al., 2008; BEST, 2007; JIN; THOMAS, 2007). Os recém-

nascidos afetados pelo vírus da rubéola possuem anticorpos circulantes, pois

durante o período de gestação, a mãe infectada pelo vírus, desenvolve anticorpos

da classe IgM e IgG, porém só transmite ao recém-nascido os anticorpos IgG, os

quais atravessam a placenta. Durante a infecção, o feto é capaz de produzir

anticorpos da classe IgM, evidenciando assim, uma infecção congênita. A detecção

de anticorpos IgM no recém nascido pode ser realizada usando o sangue do cordão

umbilical ou no soro do recém-nascido. A duração e persistência dos anticorpos da

classe IgM parecem estar relacionados com o tempo da infecção crônica

(COOPER; PRELUB; ALFORD 1995; HOBMANN; CHANTLER, 2007).

Os anticorpos específicos da classe IgG, também, são produzidos

pelos recém-nascidos infectados, porém a diferenciação entre os IgG produzidos

pela mãe é extremamente difícil. Após, o nascimento, o nível de anticorpos da

classe IgG da mãe tem uma meia vida de um mês, a presença de IgG em altos

níveis, após este período, é altamente sugestivo de infecção intra-uterina

(HOBMANN; CHANTLER, 2007). O diagnóstico é positivo para SRC quando há

presença de anticorpos da classe IgM depois do nascimento ou a persistência de

IgG na amostra de sangue da criança, colhida após um ano de vida (MILLER;

CRADOCK-WATSON, 1982).

Além disso, os testes de avidez para os anticorpos IgG tem sido utilizado

para demonstração de infecção recente ou não (BOTTIGGER et al., 1997;

CONDORELLI et al., 1999). Em conjunto com os testes de avidez, a técnica de

PCR tem sido utilizadas para o diagnóstico de SRC (JIN et al., 2007;

RAJASUNDARI et al., 2008).

48

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

Caracterização molecular do vírus da rubéola no Estado de São Paulo no período

de 1997 a 2004.

3.2 Objetivos Específicos

a) Otimização de técnicas de isolamento viral em amostras biológicas de

pacientes

com suspeita de infecção pelo vírus da rubéola.

b) Detecção do RNA do vírus da rubéola na população de estudo

c) Seqüenciamento dos fragmentos de DNA do vírus da rubéola detectados

d) Analisar por filogenia os vírus da rubéola que circulam no Estado de São

Paulo.

49

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Casuística

A população de estudo foi constituída por 29 pacientes com suspeita

de rubéola que foram aos Postos de Saúde ou Hospitais para coleta de sangue,

para a realização do diagnóstico sorológico, isolamento viral e posterior análise

molecular (Figura 7). A Seção de Vírus Produtores de Exantemas do Instituto

Adolfo Lutz, é referencia estadual do Programa de Controle da Rubéola e da

Síndrome da Rubéola Congênita recebendo diariamente amostras de todo o Estado

de São Paulo. O principal objetivo da Seção de Vírus Produtores de Exantemas é o

diagnóstico diferencial das doenças virais, particularmente aquelas relacionadas a

quadros exantematicos. As amostras foram selecionadas de pacientes

apresentando sintomas e sinais sugestivos de infecção pelo vírus da rubéola.

50

Figura 7. Fluxograma do diagnóstico laboratorial para os pacientes com suspeita de infecção pelo vírus da rubéola.

51

Postos de Saúde

ELISASOROLOGIA

POSITIVA

Amostras

IsolamentoViral

RT-PCRNested-

PCR

Sequenciamento

Sequenciamento

RT-PCRNested-PCRDiagnóstico

Hospitais

4.2 Pacientes

O estudo foi realizado com amostras clinicas colhidas nos Postos de

Saúde e Hospitais e enviadas para Seção de Vírus Produtores de Exantemas do

Instituto Adolfo Lutz no período de janeiro de 1997 a dezembro de 2004 (Figura 7 ).

Foram selecionadas amostras de 29 pacientes de ambos os sexos e idades entre 4

dias e 35 anos, com sintomas e sinais sugestivos de infecção pelo vírus da

rubéola, exceção do caso n°3 com suspeita de hepati te fulminante pelo virus da

rubéola e do caso n°4 com suspeita de encefalite vi ral. Entre os pacientes

analisados, dois pacientes com quadro clinico sugestivo de SRC (Síndrome da

Rubéola Congênita), um paciente com suspeita de ICR (Infecção Congênita por

Rubéola) e 4 pacientes com suspeita de reinfecção pelo vírus da rubéola (Tabela

2). Os pacientes com suspeita de reinfecção, dois apresentaram a carteira de

vacinação comprovando que no ano de 2001 tomaram a vacina RA27/3 (casos n°

27 e 28) e os outros dois pacientes, apresentaram exame com resultado de IgM

positivo, confirmando infecção primária pelo vírus da rubéola (casos n° 22 e 29).

(Tabela2)

52

Paciente Identificação Amostra Idade Data do Exa ntema Data da Vacina ção Diagnóst icoCaso n° Coleta Clinico

1 RVi/SP01.BRA/97 urina 20D 07/09/1997 08/091997 S/Informação rubéola2 RVi/SP01.BRA/98 sangue 04D sem exantema 05/03/1998 Não vacinado CRS (RN)

3 RVi/SP01.BRA/99 sangue/explante figado 2A sem exantema 28/03/1999 S/informação hepatite fu lminante

4 RVi/SP02.BRA/99 sangure/LCR 17A 10/05/1999 15/05/1999 Não vacinado encefalite

5 RVi/SP03.BRA/99 sangue 21A 10/06/1999 11/06/1999 Não vacinado rubéola


7 RVi/SP2.BRA/00 urina 20A 19/08/2000 23/08/2000 Não vacinado rubéola


9 RVi/SP4.BRA/00 urina 20A 28/08/2000 29/08/2000 S/Informação rubéola



12 RVi/SP7.BRA/00 urina 23A 23/08//2000 25/08/2000 Não vacinado rubéola


14 RVi/SP9.BRA/00 sangue 23A 25/09/2000 26/09/2000 S/Informação rubéola

15 RVi/SP.10/BRA00 urina 23A 15/10/2000 18/10/2000 S/Informação rubéola



18 Rvi/SP13..BRA/00 sangue 26A 15/12/2000 17/12/2000 Não vacinado rubéola19 Rvi/SP14..BRA/00 sangue 22A 20/12/2000 23/12/2000 Não vacinado rubéola20 RVi/SP01.BRA/01 sangue 24A 31/08/2001 31/08/2001 Não vacinado rubéola


22 RVi/SP01.BRA/02 urina 23A 10/01/2002 13/01/2001 Vacinado reinfecção

23 RVi/SP02.BRA02 sangue 27A 28/01/2002 29/01/2002 Não vacinado (Mãe)

24 RVi/SP03.BRA02/CRS sangue 08D sem exantema 29/01/2002 Não vacinado *SRC(RN)

25 RVi/SP04.BRA02/CRI produto aborto sem exantema 01/11/2002 Não vacinado *ICR

26 RVi/SP01.BRA/03 swab de orofaringe 3 15/08/2003 18/08/2003 S/Informação rubéola

27 RVi/SP01.BRA/04 urina 19 12/04/2004 15/04/2004 Vacinado reinfecção



D - DiasA- AnosSRC- Síndrome da Rubéola Congênita

ICR- Infecção Congenita por RubéolaS/Informação- Sem informação

53

Tabela 2- Relação dos casos que foram analisados e selecionados para o sequenciamento gênico

4.3 Coleta das Amostras

O estudo foi realizado em 18 amostras de sangue, 9 amostras de

urina, 1 produto de aborto, 1 swab da orofaringe, 1 líquido cefalorraquidiano e 1

explante de fígado (Tabela 1). A figura 5 mostra o fluxograma do procedimento

realizado após o recebimento das amostras. As amostras de sangue (10mL),

foram obtidas por punção venosa, via antecubital, com sistema de coleta a vácuo

utilizando tubo com anticoagulante para a realização da sorologia e sem

anticoagulante, para o isolamento viral. Nos pacientes menores de 1 ano, foram

colhidos, apenas 3mL de sangue. As amostras de urina (15 mL) foram colhidas

em coletores de urina ou tubo de polipropileno esterilizado e o liquido

cefalorraquidiano (10 mL) foi obtido por punção lombar em tubo de polipropileno

esterilizado. O swab da orofaringe foi colhido em tubo estéril contendo meio de

transporte (solução salina tamponada pH 7,2, contendo 2% de soro fetal bovino,

0.02% Tween 20, 100µg/mL gentamicina e 2µg/mL fungizone. O produto de

abortamento (restos placentários) foi colhido no momento da expulsão, sendo

acondicionado em recipiente contendo soro fisiológico. O explante de fígado foi

obtido durante cirurgia.Todas as amostras foram enviadas ao Instituto Adolfo Lutz,

para a Seção de Vírus Produtores de Exantemas em caixa de isopor com gelo

reciclável, sendo imediatamente processadas ou armazenadas a -80 °C.

54

4.4 Processamento das Amostras

4.4.1 Soro

O soro foi separado após centrifugação a 1.800g por 5 minutos a 4

°C. Após a separação do soro, as amostras foram arm azenadas em alíquotas,

utilizando-se microtubos devidamente identificados e mantidos a temperatura de -

20 °C até a data do seu processamento.

4.4.2 Células Mononucleares

As amostras de sangue colhidas em tubos com heparina, diluídas em

solução salina e adicionadas a um gradiente de separação por centrifugação

2.500 g por 20 minutos a 4 °C. Após a centrifugação , os linfócitos foram removidos

e transferidos para outro tubo de polipropileno, ao qual adicionou-se 8 mL de

solução salina tamponada com fosfato 0,01M, pH 72, (PBS) a 1.300g. Este

procedimento foi realizado três vezes e após a ultima centrifugação, as células

foram ressuspensas em 1mL de meio DMEM (Meio de Eagle modificado por

Dulbecco’s) contendo 2% de soro fetal bovino (Invitrogen, EUA). As células foram

mantidas a – 80 °C até o uso.

4.4.3 Urina e Swab de Orofaringe

As amostras de urinas foram centrifugadas a 2.500 g por 20 minutos

a 4 °C e o sedimento foi ressuspenso em 1mL de mei o de cultura (DMEM)

contendo 100�g/mL gentamicina e 100 U/mL de eritromicina armazenadas a -80

°C. Nas amostra de urina o pH da amostra foi corrig ido para 7,2 utilizando

bicarbonato de sódio. A amostra de swab de orofaringe foi armazenada a -80 °C.

55

4.4.4 Líquido Cefalorraquidiano

O liquido cefalorraquidiano foi colhido e enviado ao Instituto Adolfo

Lutz após confirmação da sorologia para o vírus da rubéola. A amostra foi enviada

em gelo e armazenada a -80 °C.

4.4.5 Explante de Fígado

O explante de fígado colhido durante a cirurgia, totalmente livre de

outros tecidos, foi processado para a realização de RT-PCR, coloração por

Hematoxilina-eosina e imunohistoquímica.

Para a RT-PCR a amostra foi lavada duas vezes em solução salina

tamponada pH 7,5. Após a lavagem, o explante fígado foi picado em pedaços

aproximados (0,3x0,3)cm e lavados duas vezes em solução salina tamponada. Aos

pedaços de fígado foi adicionado 800 �L RNAzol™ (Invitrogen, EUA ) e

armazenado a -80°C.

Para a realização das técnicas de coloração por Hematoxilina-eosina e

imunohistoquímica em lâminas, a amostra foi processada nas seguintes etapas:

1) A amostra de fígado foi fixada em solução de formalina a 10% em solução

salina tamponada, durante 24 horas.

2) Após a lavagem em solução salina tamponada, a amostra foi submetida a

desidratação em gradiente de etanol (do etanol 30% ao etanol Absoluto ) durante 1

hora.

3) A seguir, o processo de diafanização, em quatro banhos sucessivos em xilol,

durante 1 hora.

4) A etapa de impregnação foi feita em dois banhos sucessivos de uma hora cada

de parafina liquefeita (56-58°C).

5) Após a impregnação, o molde do bloco de parafina é confeccionado com a

amostra processada.

Os blocos foram cortados em micrótomo rotativo (Mícron HM325, Alemanha),

sendo obtidos cortes de três micrometros (3 �m). Cada corte foi colocado em

lâminas para microscopia e mantidas em estufa a 58 oC durante 6 horas para

56

completa fixação dos cortes. Estas lâminas foram submetidas á coloração de

Hematoxilina-eosina e aos procedimentos imunohistoquímicos.

4.4.6 Produto de Aborto

O produto de aborto colhido durante a cirurgia, totalmente livre de

outros tecidos, foi processado para a realização de RT-PCR. A amostra foi lavada

duas vezes em solução salina tamponada pH 7,5. Após a lavagem, o produto de

aborto foi picado em pedaços aproximados (0,3x0,3)cm e lavados duas vezes em

solução salina tamponada. Após a lavagem foi foi adicionado 800 µL RNAzol™

(Invitrogen, EUA ) e armazenado a -80 °C.

4.5 Sorologia

As sorologias para pesquisa de IgG e IgM específicas para o vírus da

rubéola, foi realizada utilizando-se o kit de ELISA (marca Behring Marburg GmbH-

Germany). Os pacientes com suspeita de reinfecção foram confirmados utilizando

a técnica de avidez de anticorpos IgG para o vírus da rubéola, marca Enzywell

Dieese, (Diagnóstica Senese, Italy). Índices iguais ou inferiores a 30%, foram

considerados de baixa avidez e acima destes valores, alta avidez (HEDMAN et al.

1993; THOMAS et al. 1991).

No caso n° 3, com insuficiênci a hepática aguda foram realizadas

pesquisa de IgG e IgM especificas, utilizando-se o kit de ELISA para sarampo

(marca Behring Marburg GMbH-Germany), citomegalovirus (marca Behring

Marburg GMbH-Germany), vírus Epstein-Barr (Biomerieux, France), parvovirus B19

(BiotrinTM Internacional, Dublin, Irlanda). O diagnóstico para herpes vírus tipo 6 foi

realizado utilizando-se Reação de Imunofluorescencia Direta (BiotrinTM,

Internacional, Dublin, Irlanda). As sorologia para os vírus hepatite A, B, C e E

foram realizadas no Instituto de Infectologia Emilio Ribas. No caso n°4 com

suspeita de encefalite, foram realizadas sorologias para herpes tipo 1,

citomegalovirus, varicela e sarampo (marca Behring Marburg GMbH-Germany).

57

4.6 Isolamento Viral

Células Vero (rim de macaco verde africano-ATCC CCL 81) e SIRC

(córnea de coelho-ATCC CCL 60 ), foram cultivadas em garrafas de plástico para

cultura de células de 25 cm2 de diâmetro, na concentração de 1x106 células/mL em

meio DMEM/RPMI (vol/vol) contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) inativado,

gentamicina 100�g/mL, 200 mL L-glutamina, As culturas foram mantidas a 37 °C

em atmosfera úmida com 5% de CO2 em estufa automática. O crescimento celular

foi acompanhado por observação diária em microscópio invertido. Após a formação

da monocamada, as células foram inoculadas com as amostras e incubadas

durante 1 hora a temperatura ambiente. Após a incubação, foi adicionado meio de

cultura (DMEM/RPMI) contendo 2% de soro fetal bovino e gentamicina 40mg/mL.

As culturas celulares inoculadas foram incubadas durante 8 dias a 37 °C em

atmosfera úmida com 5% de CO2 em estufa automática marca Forma Scientific. As

culturas foram examinadas diariamente, com o auxilio do microscópio óptico

invertido marca Zeiss para avaliação do efeito citopático. Após este período, a

suspensão celular foi obtida por raspagem com bastão de plástico, seguida de três

lavagens em meio DMEM sem soro. O sedimento final foi suspenso em RNasol

para o processamento de identificação do vírus por RT-PCR.

4.7 Microscopia Óptica

4.7.1 Coloração com Azul de Toluidina

Monocamadas de culturas de células confluentes inoculadas e não

inoculadas foram coradas pelo corante azul de toluidina. Antes da fixação, o meio

de cultura foi cuidadosamente retirado e as células foram fixadas em 1.0% de

glutaraldeído em tampão fosfato de sódio e potássio 0,15 M, pH 7,2. A fixação

ocorreu por dez minutos, à temperatura ambiente. A seguir, as células foram

lavadas em uma solução de lavagem contendo tampão fosfato e potássio 0,15M,

pH 7,2 durante 15 minutos e corados durante 10 minutos numa solução aquosa de

58

azul de toluidina 1%, pH 3,5. As culturas foram lavadas em solução de lavagem e

rapidamente observadas e fotografadas em microscópio óptico Olympus.

4.7.2 Coloração com Hematoxilina-eosina

As lâminas, com os cortes histológicos, selecionadas para esta

coloração foram submetidas ao seguinte procedimento (Stevens; Wilson, 1996):

1) desparafinização, por meio de imersão das lâminas, em dois banhos sucessivos

de uma hora cada, em xilol;

2) retirada do solvente (xilol) em três banhos sucessivos de álcool absoluto;

3) re-hidratação dos cortes em banhos de álcoois hidratados 95% e 80%;

4) re-hidratação completa em água corrente e enxágüe em água destilada;

5) imersão em solução corante hematoxilina de Harris (Harris, 1900) por um

minuto;

6) lavagem em água corrente e destilada;

7) desidratação parcial em banhos de álcool a 50%, 80% e 95%;

8) imersão em solução corante eosina amarelada a 0,5% (em álcool a 95%) por 30

segundos;

9) enxágue em banhos de álcool a 95% e absoluto para desidratação dos cortes;

10) diafanização em quatro banhos sucessivos de xilol;

11) montagem das lâminas com lamínula de vidro e resina sintética Entellan

(Merck, Alemanha) para realização do exame microscópico.

4.7.3 Imunohistoquimica

As lâminas, com os cortes histológicos, selecionadas para esta

metodologia, foram submetidas aos procedimentos 1 a 4 descritos acima.

A fixação do tecido em formalina, mais comumente empregada na rotina

histológica, apesar de preservar satisfatoriamente a morfologia das células,

dificulta o acesso dos anticorpos aos epítopos no decorrer da reação imuno-

histoquímica. Para contornar esta situação, as lâminas foram submetidas a

processo de recuperação antigênica, por calor úmido e sob pressão (Norton, 1994;

Miller, 1995), antes da incubação com a solução de anticorpos.

59

1) após re-hidratação completa dos cortes, as lâminas foram introduzidas em

solução de ácido cítrico 10 mM, pH 6,0 e submetidas a aquecimento a alta

temperatura em panela de pressão comum (doméstica) por três minutos sob

pressão;

2) a panela foi rapidamente resfriada sob água corrente e as lâminas lavadas

exaustivamente em água corrente e enxaguadas em água destilada;

3) imersão das lâminas em solução salina tamponada com fosfatos (PBS 10 mM

/ pH 7,4) por 10 minutos a temperatura ambiente;

4) pré-incubação dos cortes com solução de soro normal de bode a 5% em PBS,

por 30 minutos em câmara úmida a 37 oC;

5) retirada do soro normal de bode e incubação, por 12 horas em câmara úmida

a 4oC, com anticorpo monoclonal específico para glicoproteína E1 e proteína de

capsídeo (C), gentilmente cedidos por Dr. J. Icenogle (Centers for Disease Control

and Prevention, Atlanta-USA), diluídos, respectivamente, a 1:1000 e 1:200, em

solução de Albumina bovina a 1% em PBS;

6) lavagens, para retirada do excesso de anticorpos que não reagiram, em três

banhos de PBS de 5 minutos cada, a temperatura ambiente.

7) incubação com solução de polímeros de dextran conjugados com anti-

imunoglobulinas de camundongo e enzima fosfatase alcalina (Sabattini, 1998) (kit

Envision�, Dako Cytomation, E.E.U.U.), por 30 minutos em câmara úmida a 37° C;

8) lavagens, para retirada do excesso de conjugado que não reagiu, em três

banhos de PBS de 5 minutos cada, a temperatura ambiente.

9) revelação da reação com substrato cromogênico naftol-ASMX-fosfato e Fast

Red TR (kit Permanent Red Substrate-Chromogen, Dako Cytomation, E.E.U.U.),

por 5 minutos em câmara úmida a 37 oC;

10) lavagem, para retirada do excesso de solução que não reagiu, em água

corrente e enxágüe em água destilada;

11) contra-coloração leve com hematoxilina de Harris, lavagem em água corrente

para retirada do excesso de corante e enxágüe em água destilada.

12) pré-montagem com resina de base aquosa cristal mount (Biomeda, E.E.U.U.)

e montagem definitiva com lamínula e resina sintética entellan (Merck, Alemanha).

60

4.7.4 Microscopia Eletrônica

A morfologia do vírus da rubéola foi observada pela técnica de

coloração negativa (ALAIN et al., 1987). A adesão, das partículas virais, foi

efetuada em grades de cobre de 300 mesh (unidade de medida da malha)

recobertas com formivar e carvão. A grade foi colocada em contato com 0,03 mL

da amostra. Após 30 minutos, o excesso de amostra foi retirado da grade com

papel de filtro e corado por 5 minutos, com fosfotungstato de potássio a 2% pH 6,4.

Após a coloração, a grade foi examinada em microscópio eletrônico .

4.8 Extração do RNA total

Ao material biológico: linfócito, urina, liquido cefalorraquidiano,

explante de fígado, produto de abortamento, cultura de células inoculadas e não

inoculadas, após o tratamento com 800�L RNAzol™ (Invitrogen, EUA ) foi

adicionado a 200�L de clorofórmio isoamil (Sigma, EUA), incubado em banho de

gelo durante 5 minutos e microcentrifugado a 3.220g por 20 minutos a 4 °C. Após a

centrifugação, 500�L do sobrenadante, foram removidos e transferidos para outro

tubo de polipropileno, ao qual adicionou-se 500 �L de isopropanol. Após agitação

(vortex) a amostra foi mantida em banho de gelo por 20 minutos e

microcentrifugada a 3.220g por 15 minutos. O sedimento foi lavado com 1000�L

de etanol 75% e microcentrifugado a 1.260 g por 8 minutos a 4 °C. O sedimento foi

seco por 2 minutos a 94 °C e ressuspenso em 20�L de água Milli-Q.

4.9 Diagnóstico por RT-PCR

A reação de amplificação para o diagnóstico do virus da rubéola, foi a

preconizada por Bosma et al.(1995a). Primers (Invitrogen TM Life Technologies,

Carlsbad, CA, EUA) complementares, a glicoproteína E1 do vírus da rubéola,

foram utilizados. A localização de cada primer do genoma viral, polaridade e

sequências 5’�3’ estão representados na Figura 8 e Tabela 3 (BOSMA et al.,

1995a ). Os primers R2 e R7 foram utilizados na reação de PCR e os primers R11

e R8c foram utilizados para o nested-PCR.

61

Tabela 3- Sequências dos primers utilizados na PCR para diagnóstico da infecção pelo vírus da rubéola.

Primer Sequência 5’3’ Posição no Genoma

R2 (S) CAA.CAC.GCC.GCA.CGG.ACA.AC PCR 8807-8286

R7 (A) CCA.CAA.GCC.GCG.AGC.AGT.CA PCR 8991-8972

R11(S) CTC.GAG.GTC.CAG.GTC.CYG.CC n-PCR 8826-8845

R8C(A) GAA.TGG.CGT.TGG.CAA.ACC.GG n-PCR 8968-8949

(Bosma et al., 1995)

62

8807-8826

8826-8845

8972-8991

8949-8968

185pb

146pb

Figura 8. Esquema de amplificação do genoma da glicoproteína E1 do vírus da da rubéola a partir do fragmento gerado pelos primers R2 combinado com o primer R7 produzindo um fragmento de 185pb. A segunda am- plificação (nested-PCR), foi realizada com os primers R11 e R8c que amplificam um fragmento interno ao já amplificado, com 146pb.

4.9.1 Reação de Transcrição Reversa (RT)

Para a reação de RT foram adicionados, para cada 5 �L da amostra

do produto extraído, 10 mM de Tris-HCL (pH 8,3), 50 mM de KCl, 3 mM MgCl2, 1

mM de cada dNTP (desoxinucleotideo trifosfato), 1,0U inibidor de RNase, 3,85 mM

do primer R7, 2.5 U de transcriptase reversa, M-MLV (Moloney murine leukemia

vírus reverse transcriptase) e água Milli-Q para completar um volume final de 20

�L. Essa mistura foi incubada a 37 °C por 10 minutos , 42 °C por 30 minutos, 99 °C

por 7 minutos, 4 °C por 2 minutos e a seguir foi ut ilizada na reação de PCR.

4.9.2 Reação da Polimerase em cadeia (PCR)

A amplificação foi realizada adicionando-se 10 �L do produto da RT

a uma mistura contendo uma concentração final de 10 mM Tris-HCL (pH 8,3), 50

mM KCl, 2 mM MgCl2, 200 �M de cada dNTP (desoxinucleotideo trifosfato), 0,77

�M do primer R2 e R7, 2,5 U da Taq Polymerase (Invitrogen TM Life Technologies,

Carlsbad, CA, EUA) e água Milli-Q livre de Dnase e Rnase para completar o

volume final de 80 �L. As amostras foram submetidas a repetidos ciclos de

variação de temperatura em termociclador (Eppendorf MasterCycler ® Gradiente,

Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) os quais consistiram de um etapa de

denaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, 30 ciclo s caracterizados por 95 °C por

30 segundos, 60 °C por 30 segundos (anelamento dos primers) e 72 °C por 1

minuto (extensão) e 72 °C por 5 minutos para finali zação. A adição do produto

amplificado foi realizado em um ambiente separado da sala de PCR tomando todos

os cuidados para evitar a contaminação.

4.9.3 Reação de nested-PCR

A nested-PCR, foi feita com 1 �L do produto do PCR com Tris-HCl

(pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 �M de cada dNTP (desoxinucleotideo

trifosfato), 0,77 �M do primer R11 e R8C, 2,5 U da Taq Polymerase (Invitrogen

TM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e água Milli-Q livre de Dnase e Rnase

63

para completar o volume final de 100 �L. As amostras foram submetidas às

mesmas temperaturas aplicadas à primeira reação de amplificação (PCR), usando

sómente 25 ciclos. A nested PCR seguiu os cuidados descritos no item 4.8.3.

4.9.4 Detecção do Produto Amplificado

Um volume de 10 �L do produto final da PCR e nested-PCR foram

adicionados a 4 �L do tampão 10x BluejuiceTM Gel Loading Buffer (Invitrogen TM

Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Esta mistura foi aplicada em gel de

agarose 2% preparado com tampão TBE 1x e 0.5 �g/mL de brometo de etídio. Ao

gel também foi aplicado um marcador de peso molecular de 100 pb (Invitrogen TM

Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) para avaliação do tamanho do fragmento

obtido. O gel foi submetido a uma voltagem de 100 V por 1 hora e o produto

amplificado foi visualisado em um transiluminador de luz ultra violeta acoplado a

um sistema de captura de imagem (Image Acquisition and Analysis Software, UVP,

INC, CA, EUA) e fotografado com máquina Polaroid (Modelo MP-4 Lana Câmera,

Polaroid do Brasil Ltda) e filme (Polaroid 667) exposto através de filtro laranja de

75 mmx75 mm (Kodak, Wratten Gelatin Filter, Eastamm Kodak Company).

4.10 Sequenciamento da Glicoproteina E1

A região amplificada foi o fragmento do gene da glicoproteina E1 (nt

8731-9469) preconizado pela Organização Mundial da Saúde. As amostras foram

nomeadas segundo os critérios propostos pela Organização Mundial da Saúde

com as seguintes designações: Rvi: vírus da rubéola isolado de cultura de células,

Rvs: para o RNA extraído direto da amostra clínica; seguido da cidade, do número

da amostra, país onde foi isolado, ano, SRC se for caso de Síndrome da Rubéola

Congênita e ICR para infecção congênita por rubéola (WHO, 2005 ).

64

4.10.1 Reação de Transcrição Reversa (RT)

O cDNA foi obtido em duas etapas: Pré-RT e RT. A reação de pré-RT

foi realizada adicionando-se para cada 6 �L do produto extraído, 1 �L de Oligo dT

(Oligo dT12-18 Primer 0.5 �g/mL - Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA,

EUA) e 5 �L de água Milli-Q obtendo um volume final de 12 �L. Essa mistura foi

incubada a 95 °C por 3 minutos e a 25 °C por 25 min utos. Ao produto de reação de

pré-RT foram adicionados 4 �L de 10 mM de Tris-HCL (pH 8,3), 50 mM de KCl, 3

mM MgCl2, 1 mM de cada dNTP (desoxinucleotideo trifosfato), 1,0 U inibidor de

RNase, 0,5 �L de 5 U/�L transcriptase reversa (SuperScriptTM II One-Step ), 1 �L

RNAse OUT (Rnsase OUTTM Ribonuclease Inhibitior-Recombinant 40 U/�L). Essa

mistura foi incubada a 42 °C por 60 minutos95 °C po r 5 minutos.

4.10.2 Descrição dos Oligonucleotideos (Primers)

A detecção do ácido nucleico viral pela técnica da reação em cadeia

da polimerase (PCR) em amostras dos pacientes e culturas inoculadas foi

realizada utilizando os primers descritos por Frey et al. 1993, para amplificação do

vírus da rubéola. Os primers (Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA)

complementares a glicoproteína E1 do vírus da rubéola, foram utilizados para

amplificar e sequenciar as amostras do vírus da rubéola. O produto foi amplificado

com primers R66 combinado com o primer R65 produzindo um fragmento com 640

pares de base (Pb), o primer R85 combinado com o primer R9 produzindo um

fragmento com 602 pares de base (Pb). Logo após procedeu-se a uma segunda

amplificação (nested-PCR), utilizando primers (R85 e R72) que amplificam um

fragmento interno ao já amplificado, com 519 Pb. (Figura 9). A localização de

cada primer do genoma viral, polaridade e sequências 5’�3’ estão representados

na Tabela 4 (Frey et al. 1993).

65

66

8258 9700

PCR

9154-9170

8696-8712 9320-9336

C E2 E1 97006512 82587412

900 846 1443

Glicoproteína E1

R66 R65

R85 R99727-9756

nested-PCR

Genoma do Vírus da Rubéola

PCR

R85 R729154-9170 9649-9673

8768 8879 8880 8996

9380

9380

640pb

602pb

519pb

Figura 9. Esquema de amplificação do genoma da glicoproteínaE1 do virus da rubéola a partir do fragmento gerado pelos primersR66 combinado com o primer R65 produzindo um fragmento de640pb, o primer R85 combinado com o primer R9 produzindo umfragmento de 602pb. A segunda amplificação (nested-PCR) , foirealizada com os primers S(R85 e R72) que amplificam umfragmento interno ao já amplificado com 519 pb. As variaçõesnucleotídicas da glicoproteína E1: 8768, 8879, 8880, 8996, 9380.pb: pares de base

Tabela 4 Primers utilizados na PCR para seqüenciamento da glicoproteína E1 do vírus da rubéolaPrimer Sequência 5’3’ PCR Posição no

GenomaR66(S) CCA.GCA.CCC.TCA.CAA.GA PCR/SEQ 8696-8712

R65(A) GCT.GGT.GGA.AGG.CCT.TG PCR/SEQ 9320-9336

R85(S) TCG.AAA.TGC.CCG.AGT.GG PCR/SEQ 9154-9170

R9(A) TAT.ACA.GCA.ACA.GGT.GCG.GGA.ATC PCR/SEQ 9727-9756

R85(S) TCG.AAA.TGC.CCG.AGT.GG n-PCR/SEQ 9154-9170

R72(A) AAT.GTA.GTA.CAA.GCA.TTT.GGC.ACA n-PCR/SEQ 9649-9673

(Frey e Albernathy, 1993).

4.10.3 Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)

A amplificação foi realizada adicionando-se a 5�L do produto da RT,

uma mistura contendo uma concentração final de 10mM Tris-HCL (pH 8,3), 50mM

KCl) 10 x concentrado; 3mM MgCl2; 200�M de cada dNTP (desoxinucleotideo

trifosfato);10 pmol de cada primer, 2,5U da Taq Polymerase (Invitrogen TM Life

Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e água Milli-Q livre de Dnase e Rnase para

completar o volume final de 50�L. As amostras foram submetidas a repetidos

ciclos de variação de temperatura em termociclador (Eppendorf MasterCycler �

Gradiente, Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) os quais consistiram de um etapa de

denaturação inicial a 95 °C por 3 minutos, 35 ciclo s de 94 °C por 1 minuto

(denaturação); 55 °C por 1 minuto (anelamento dos p rimers) e 72 °C por 1 minuto

(extensão), e um aquecimento a 72°C por 7 minutos p ara extensão final.

67

4.10.4 Reação de nested PCR

Para a segunda amplificação, foram adicionados à 5�L do produto

da PCR, 10 �L de tampão de reação (20mM de Tris-HCl (pH 8,8), 10mM de KCl)

10x concentrado; 2m MgCl2, 0,2mM de cada dNTPs; 10 pmol de cada primers

(66/85; 66/65), 2.5 U Taq DNA Polymerase (Invitrogen TM Life Technologies,

Carlsbad, CA, EUA) e água Milli-Q livre de DNase e RNase para completar o

volume final de 50 �L. As amostras foram submetidas ao mesmo ciclo de variação

de temperatura da reação da PCR.

4.10.5 Purificação do DNA para Reação de Sequenciam ento

O DNA extraído, após eletroforese em gel de agarose, foi purificado

com o kit Gel Extraction System (Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA,

EUA)) conforme instruções do fabricante. O produto de purificação foi aplicado em

gel de agarose 2% preparado com Tampão TBE 1X contendo 0.25 �L de brometo

de etídeo. Também foi aplicado ao gel, 4�L de um padrão de massa molecular

(Low DNA Mass Ladder, Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), O

gel foi submetido a procedimentos semelhantes ao item 4.8.4 (Detecção do

Produto Amplificado). A concentração de DNA presente na amostra foi

determinada por comparação de intensidade das bandas das amostras com a

banda do padrão, conforme instruções do fabricante.

4.10.6 Reação de Seqüenciamento (Cycle Sequencing)

Após a purificação, as fitas de DNA foram sequenciadas utilizando-se

o kit ABI Prism® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing v 3.1 Ready Reaction

(Applied Biosystem�). O DNA obtido após a purificação, foi utilizado para reação

de seqüenciamento com um volume final de 10 �L, como segue: 5 �L de DNA

correspondendo de 10 a 30 ng do produto purificado foram adicionados a um

microtubro contendo 3,2pmol de primer, 2�L de BigDyeTM Terminator cycle

sequencing reaction (Applied Biosystems�), 2 �L de tampão de seqüenciamento

(save money- Tris HCl 200mM [ pH 9,0] e 5mM MgCl2) e água Milli-Q para

68

completar um volume final de 10�L. Todas as reações foram feitas em triplicatas,

sendo uma das reações de seqüenciamento com primer forward e duas para o

reverse. Após homogenização, a mistura foi levada ao termociclador (Eppendorf,

modelo mastercycler� ep, Alemanha), onde foi aplicado o seguinte programa de

amplificação: 96 °C a 20 segundos, 50 °C a 15 segun dos e 60 °C a 4 minutos

extensão da nova fita de DNA.

4.10.7 Purificação do DNA após Reação do Sequenciam ento

O produto amplificado foi purificado adicionando-se 50 �L de etanol

absoluto (Merck, SP) com 2�L de acetato de sódio, com posterior agitação

(vórtex) por 15 segundos e incubação à -20 °C dura nte 24 horas. Após este

período, o produto amplificado foi centrifugado a 15.800g (Eppendorf�, Alemanha)

por 30 minutos à temperatura ambiente. Todo o sobrenandante foi descartado e o

precipitado foi lavado, adicionando-se 150 �L de etanol 70%, seguido de agitação

(vórtex) por 15 segundos e centrifugação (15.800g x) por 15 minutos. Descartou-

se o sobrenadante, e após inversão do microtubo em papel de filtro; os microtubos

foram secos em uma centrifuga tipo speed vacuum (Eppendorf�, Alemanha) por

20 minutos à temperatura de 60 °C

As amostras secas foram ressolubilizadas em 10 �L de formamida Hi-

Di (Applied Biosystems, USA) e submetidas a vigorosa agitação (vórtex) por 30

segundos. Subsequentemente as amostras foram colocadas em uma microplaca,

sendo a seguir desnaturadas a 95 °C durante 5 minut os e aplicadas em um

seqüenciador automático (16 capilares), modelo ABI-3100 (Applied Byosystems�,

Inc., Foster, City, CA, USA). Foram utilizados parâmetros padronizados para

injeção e a separação eletroforética foi realizada com o uso do polímero POP6.

4.10.8 Edição e Alinhamento das Sequências do Gene E1 do Vírus da Rubéola

As sequências de nucleotídeos foram analisadas com o programa

Sequence Navigator versão 1.0 (Applied Biosystems Inc., EUA) para Power

Macintosh e alinhadas no programa Clustal W, versão 1.4 (THOMPSON et al.,

1994). Posteriormente, estas sequências foram traduzidas utilizando o programa

Edit SeqTM 4,05 – Expert Analysis Software – DNASTAR, Inc. para PC. As

69

sequencias de nucleotídeos correspondente à região E1, foram alinhadas

utilizando o programa Meg AlinTM 4.05 – Expert Analysis Software – DNASTAR,

Inc., EUA. Ambos foram analisados, concomitantemente, com o referido programa,

tendo como resultado a obtenção do grau de similaridade entre as sequências,

calculadas par a par, o que possibilitou a identificação das sequências de

nucleotídeos idênticas.

As sequencias obtidas também foram alinhadas com sequencias de

rubéola obtidas no GenBank pelo método Clustal W para posteriormente uso na

análise filogenética.

4.10.9 Análise Filogenética

A árvore filogenética para caracterização dos genótipos, foi construída

utilizando o programa MEGA versão 3.1 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)

(KUMAR et al., 2001). As 29 novas sequências obtidas e as amostras de rubéola

publicadas no GenBank e classificadas dentro dos genótipos publicados (WHO,

2005) (Tabela 5) foram alinhadas pelo método Clustal W conforme descrito no item

4.10.8 para obtenção da topologia da árvore. Também foi empregado o programa

PAUP∗4.0 versão Beta-Sinauer Associates, Inc, (SWOFFORD, 1998) para Power

Macintosh e Unix onde foram calculados os valores de bootstrap, com 100

réplicas, para a verificação da sustentação de ramos nas topologias da árvores

obtidas.

70

Tabela 5- Representação das linhagens de referência dos genótipos do vírus da

rubéola, baseado no ano do isolamento, país e número de acesso no

GenBank”.

Países Linhagen de Referência Genotipo Ano n° acesso

no GenBank

Bélgica Rv i/BEL /63 1a 1963 AF188704

Braz il RVs/Rio de Janeiro.BRA/97 1B 1997 AJ980442

RVs/Rio de Janeiro.BRA/99 1G 1999 AJ980443

China Rv i/Shandong.CHN/02 1E 2002 AY968210

RVI/Anhui.CHN/00 1F 2000 AY96821 5

Rv i/Shandong.CHN/00 1F 2000 AY968213

Rv i/Beijing.CH/79 2A 1979 AY258322

Rv i/Beijing.CH/80 2A 1980 AY58323

Israe l Rv i/ISR/88 1B 1988 AY968209

RVi/TelAviv i.ISR/68 2B 1968 AY968219

Japão Rv i/Akita.JPN/90 1C 1990 ABO003354

RVI/SAITAMA.JPN/94 1D 1994 AY968216

Rv i/Toyo.JPN/90CRS 1D 1990 AY968214

Rv i/Tokyo.JPNH/90(CRS) 1D 1990 AY968214

Russia Rv i/C4.Rus/67 2C 1967 DQ388279

Rv i/MOscow.RUS/97 2C 1997 AY247019

USA Rv i/LosAngeles.Cal.USA/91 1C 1991 AY968212

Rv i/Fla.USA/21.97 1E 1997 AY326356

Rv i/Seatle.Wah.USA/16.00 2B 1968 AY968219

71

5 RESULTADOS

5.1 Quadro Clinico

No período de 1997 a dezembro de 2004, foram incluídos 29 casos

de pacientes com suspeita de infecção pelo virus da rubéola. Dentre estes

pacientes, 28 foram analisados por sorologia, isolamento viral e PCR (Tabela 1),

sendo 11 (38%) do sexo masculino e 17 (58,6%) do sexo feminino. No caso de n°

25 de ICR, o produto de aborto foi analisado por RT-PCR. A maioria dos casos, em

todas as faixas etárias, não eram vacinados ou ignoravam seu passado vacinal.

Quatorze dos casos estudados foram procedentes da epidemia da rubéola que

ocorreu no Estado de São Paulo no ano de 2000 (Tabela 2).

Os casos n°2 e 24 relacionados a SRC, as mães dos recém-

nascidos, não apresentaram quadro clinico com exantema e febre em idade

gestacional, porém seus recém-nascidos apresentaram alterações pós nascimento:

1 apresentou retinopatia pigmentar e 1 apresentou malformação cardíaca. O caso

n° 25 de ICR, a paciente (mãe) apresentou exantema e febre na 10° semana de

gestação e devido a intensa infecção viral, abortou na 12°. semana de gestação.

Os casos n°03 e 04 apresentaram quadro clínicos gra ves associados ao vírus da

rubéola: insuficiência hepática aguda e encefalite. O paciente com quadro de

insuficiência hepática aguda (caso n°3), necessitou de um transplante de fígado 25

dias após o início dos sintomas. O paciente iniciou quadro de febre, dor abdominal,

diarréia, vômitos e, posteriormente, icterícia, urina escura e fezes cor de argila

foram notados. Não havia história de erupção cutânea. O agravamento da sua

situação clínica e o diagnóstico de encefalopatia grau II levou à sua transferência

para um serviço de transplante hepático pediátrico. O paciente não apresentava

história prévia de infecções graves, oportunistas ou repetidas. O caso n°4 foi

hospitalizado com febre, náusea, cefaléia intensa e confusão mental. Oito dias

antes dos sintomas acima descritos, o paciente teve exantema e febre e após visita

ao médico da família, foi diagnosticado como escarlatina, não sendo realizado a

sorologia para sarampo ou rubéola. Durante a hospitalização, teve convulsão,

porém não apresentou sinais de irritação na meninge e o seu eletroencefalograma

mostrou atividade lenta, mas sem atividade eliptogenica.

72

5.2 Sorologia

Entre os pacientes estudados, 24 apresentaram resultado de soro

diagnóstico reagente para IgM especifica para o vírus da rubéola (Tabela 5).

Quatro pacientes com suspeita de reinfecção ( casos no. 20, 25, 26 e 27) foram

não reagentes. As amostras destes pacientes foram processadas para o teste de

avidez e todos apresentaram alta avidez (80-90%).

No paciente com insuficiência hepática aguda (caso n°3), foram

realizadas sorologias para hepatite A, B e C; citomegalovírus, parvovirus B19,

herpes 6 e sarampo, todas negativas e sorologia positiva (IgM e IgG) para rubéola.

No paciente com encefalite (caso n°4) foram realiza das sorologias em amostras de

soro e liquor, para detecção de anticorpos para herpes virus tipo 1, varicela,

citomegalovírus e sarampo, no líquido cefalorraquidiano e soro, com resultados

negativos. A análise sorológica do liquído cefalorraquidiano do caso com suspeita

de encefalite apresentou anticorpos IgM e IgG positivos para o vírus da rubéola.

5.3 Comparação das Técnicas de Isolamento Viral e R T-PCR para o

Diagnóstico do Virus da Rubéola

A RT-PCR da amostra direta, foi positiva em 25/31 (80%) amostras

analisadas. Após a amplificação obtivemos um fragmento de 185 pb na PCR e

145 pB na nested-PCR, sendo 15 amostras positivas pela PCR e 10 por nested-

PCR. Das trinta amostras inoculadas em cultura de células, todas foram positivas

por RT-PCR (Tabela 5 ), sendo 25 amostras positivas pela PCR e 5 positivas por

nested-PCR.

73

Figura 10. A- Eletroforese em gel de agarose. A- 1-PM (marcador de peso molecular); 2- Produto da PCR de 185pb gerados com os primers R7 e R2. 3- Controle - negativo. B- 1-PM; 2- produto da nested-PCR de 143 pb gerados com os primers R11 e R8c; 3- Controle Negativo.

74

1 2 3 1 2 3

76

Paciente Amostra Intervalo entre Amostra Direta Cult ura de Células caso n°. clinica/coleta Sorologia RT-PCR Isolamento Vir al RT-PCR

1 urina 1D POS NEG POS POS2 sangue 4D POS POS POS POS3 sangue 25D POS POS POS POS

explante figado 25D POS não realizado não realizado4 sangue 5D POS POS POS POS

LCR 5D POS POS POS POS5 sangue 1D POS NEG POS POS6 sangue 3D POS POS POS POS7 urina 4D POS POS POS POS8 sangue 4D POS POS POS POS9 urina 1D POS NEG POS POS10 sangue 5D POS POS POS POS11 sangue 4D POS POS POS POS12 urina 2D POS POS POS POS13 sangue 4D POS POS POS POS14 sangue 1D POS POS POS POS15 urina 3D POS POS POS POS16 sangue 7D POS POS POS POS17 urina 1D POS NEG POS POS18 sangue 2D POS POS POS POS19 sangue 3D POS POS POS POS20 sangue 1D NEG POS POS POS21 sangue 4D POS POS POS POS22 sangue 3D POS POS POS POS23 sangue 1D POS NEG POS POS24 sangue 1D POS NEG POS POS25 produto aborto 35D não realizado POS POS POS26 swab de orofaringe 3D POS POS POS POS27 urina 1D NEG POS POS POS28 urina 1D NEG POS POS POS29 urina 4D NEG POS POS POS

D- DIASPOS-PositivoNEG-Negativo

75

Tabela 6- Resultado das Sorologias, RT-PCR da Amostra Direta, Isolamento Viral e RT-PCR das Culturas Inoculadas

.

5.4 Isolamento Viral em Cultura de Células

Trinta amostras (18 amostras de sangue, 9 amostras de urina, 1swab

da orofaringe, 1 liquor cefalorraquidiano e 1 produto de aborto ) inoculadas nas

linhagens celulares Vero e SIRC foram observadas diariamente para visualização

do efeito citopático (ECP). O ECP foi observado em 15 amostras inoculadas na

primeira passagem, em 12 amostras após a segunda passagem e em três somente

após terceira passagem. Desta forma, a utilização de duas passagens elevou a

taxa de positividade nos isolamentos em 34%. Em relação às linhagens celulares

empregadas, observou-se que a linhagem celular SIRC apresentou melhor

crescimento celular e melhor visualização do ECP quando comparada com as

células Vero. Após 72 horas, tanto nas células Vero como na SIRC, observou-se

focos de células arredondadas, vacuolização do citoplasma e contração do núcleo

celular (Figura 11). foi também observada através da microscopia eletrônica, a

estrutura do vírus da rubéola, do caso n°27, (Figur a 12).

76

A B

C D

Figura 11. A- Fotomicrogafias de células Vero não infectadas; B- Cultura de células Veroinoculadas com amostra do caso n° 27 incubadas dura nte 7 dias. C- Cultura decélulas SIRC não infectadas; D- Cultura de células SIRC inoculadas com amostrasdo caso n° 27 incubadas durante 7 dias. Ambas as cé lulas (Vero e SIRC) inoculadasapresentam expansão do citoplasma, arrondamento celular e contração do núcleocelular

77

Figura 12. Fotomicrografia eletrônica do vírus da rubéola, isolado em cultura decélulas SIRC inoculadas com amostra do caso n°27. C oloraçãonegativa. Aumento 75.000X. Fotografia cedida pela Seção deMicroscopia Eletrônica, do Instituto Adolfo Lutz.

5.5 Coloração de Hematoxilina-eosina e Imunohistoqu imica

O diagnóstico histológico do explante de fígado do caso n.03 mostrou células

gigantes e necrose hepática submassiva. Os hepatócitos gigantes apresentam

vários núcleos imersos no citoplasma. Entre a hipertrofia e hiperplasia das células

de Kupfer são encontrados vários leucócitos polimorfonucleares e linfócitos. A

arquitetura do fígado, apesar das extensas lesões continuam normais, com espaço

portal preservado com escassas células inflamatórias (Figura 13).

78

Figura 13. Fotomicrografias obtidas do explante de fígado corado com hematoxilina - eosina. A- Notar os hepatócitos gigantes, a presença de necrose

confluente, regeneração e colestase intracanalicular (HE, x100). B-Várioshepatócitos gigantes contendo varios núcleos imersos no citoplasma(HE,x400).C- Células de Kupffer hipertróficas e hiperplásicas onde sãoencontrados linfócitos e vários leucócitos polimorfonucleares (HE, x200). D-Notar que a arquitetura do fígado continua normal, os intervalos portaisestão preservados com a presença de escassas células inflamatórias (HE x40). E e F- Apesar da reação ductular, não apresenta hepatite de interface(HE x100, HE x200; ).

G, H, I. Fotomicrografias da detecção imunohistoquimica do antigeno dovirus da rubéola em parafina fixadas em formalina, mostrando o antígenoE1 do vírus da rubéola corado em vermelho cereja e os núcleos em azulnos hepatócitos e células Kupffer (G, H, x40, x200); I- células endoteliais ecélulas de Kupffer positivas para o antígeno E1(x400).

79

5.6 Amplificação e Filogenia da região E1 do genoma do vírus da rubéola

Foram amplificadas da região E1 do genoma do vírus da rubéola

trinta e uma amostras para caracterização molecular, entretanto, foram incluídas

para a realização da arvore filogenética, 29 amostras, pois os casos que possuíam

duas amostras (casos n° 3, 4 ) somente uma de cada caso foi incluída para a

realização da arvore filogenética. As sequencias geradas neste estudo, quando

alinhadas com sequencias representativas dos diferentes genótipos do vírus da

rubéola obtidas no GenBank resultou em uma árvore filogenética, que agrupou 19

amostras brasileiras no genótipo 1a e dez ao grupo do genótipo 1G demonstrada

na Figura 14. O genótipo 1a encontrado circulando em quase todos os anos

(Gráfico 7). No grupo das sequências do genótipo 1a estão as sequências obtidas

dos casos de hepatite fulminante, encefalite, reinfecções, SRC e casos da

epidemia de 2000. A similaridade entre as seqüências de nucleotídeos das

amostras intra-grupo do genótipo 1a variou de de 96,8% a 99,8% respectivamente

(Figura 15 e 16). Quando as seqüências nucleotidicas das amostras do genótipo

1a são comparadas com os outros genótipos temos resultados mostrados na

Figura 15. A similaridade nucleotidica entre os genótipos 1a isolados com o

genótipo 1a padrão (CEN) a maior similaridade foi de 98,3%. 99,8%. O genótipo

1G foi encontrado circulando apenas nos anos de 2000, 2002 e 2003 (Gráfico 7). A

similaridade intragrupo entre as sequências 1G amplificadas das amostras de

pacientes de São Paulo variou de 97.3% a 100% e em relação a sequencia

padrão 1G (RJBRA/99) variou de 98,8% 97.5% (Figura 16).

80

81--

Figura 14. Arvore Filogenética das seqüências da glicoproteína E1 do vírus da rubéola isolados no Estado de São Paulo, comparadas com as sequencias de referência do virus do rubéola depositadas no GenBank (Tabela 5).

1a

1G

1a

1G

100

85

80

80

80

75

100

85

100

10085

85

80

75

100

84

85

75

80

85

75

85

85

80

100

100

75

100

80

80

80

82

99.0

Figura 15. Análise de identidade e divergência, pelo método ClustalX, das amostras seqüenciadas na região E1 do virus da rubéola (401 nt) que pertencem ao genótipo 1a.

83

Figura 16. Análise de identidade e divergência, pelo método ClustalX, das amostras seqüenciadas na região E1 do virus da rubéola (401 nt) que pertencem ao genótipo 1G

84

Sequencias Isoladas Virus Padrão Similaridade

GeneBank GenótipoMáximaMinimaCen_1a1a99,80%98,30%B32_1B1B97%95,50%ANI_1C1C96,80%95,00%NC JP90_1D1D96,30%95,00%CAS_1E1E97,30%95,30%

Genótipo 1a AH2_1F1F96,50%96,50%BR_1G1G95,80%94,30%BRD1CH79_2A2A94,30%92,50%IS68_2B2B93,80%91,50%C74_2C2C95,30%95,50%BR_1G 1G98,80%97,50%Cen_1a1a97,00%96%ANI_1C1C96,30%94,80%SAI_1D 1D97,30%95,50%

Genótipo 1GCAS_1E1E97,30%95,30%AH2_1F1F96,00%96,00%BRD1CH79_2A2A93,30%92,30%IS68_2B2B92,30%89,80%C74_2C2C93,50%92,30%

Sequencias Isoladas Virus Padrão Similaridade GeneBank Genótipo Máxima Minima

Cen_1a 1a 99,80% 98,30%

B32_1B 1B 97% 95,50%

ANI_1C 1C 96,30% 95,00%

NC JP90_1D 1D 96,30% 95,00%

CAS_1E 1E 97,30% 95,50%Genótipo 1a

AH2_1F 1F 96,50% 95,30%

BR_1G 1G 95,80% 94,30%

BRD1CH79_2A 2A 94,30% 92,50%

IS68_2B 2B 93,80% 91,50%

C74_2C 2C 95,30% 94,00%

BR_1G 1G 98,80% 97,50%

Cen_1a 1a 97,00% 96%

B32_1B 1B 97,3% 96,30%

Genótipo 1GANI_1C 1C 96,30% 94,80%

SAI_1D 1D 96,30% 94,50%

CAS_1E 1E 96,30% 95,30%

AH2_1F 1F 96,00% 95,00%

BRD1CH79_2A 2A 92,30% 91,30%

IS68_2B 2B 92,80% 91,3%

C74_2C 2C 93,50% 92,30%

Tabela 7- Resultados de Máxima e Mínima Similaridade pelo método ClustalX, das amostras seqüenciadas na região E1 do vírus da rubéola.

85

Ano

Gráfico 7- Distribuição dos genótipos encontrados em São Paulo no período de 1997 a 2004.

86

Tabela 8- Resultado dos genótipo obtidos das sequências amplificadas pela região E1 do vírus da rubéola

Pac ien te Diagnós tic o Identificação A no G e nótipo

Caso n° Cli nic o

1 ru b éola R V i/S P0 1.B R A /97 199 7 1a

2 C RS (R N ) R V i/S P0 1.B R A /98 199 8 1a

3 h e pat i te f ulm in a n te R V i/S P0 1.B R A /99 199 9 1a

4 e nc e fa lite R V i/S P0 2.B R A /99 199 9 1a5 ru b éola R V i/S P0 3.B R A /99 199 9 1a

6 ru b éola R V i/S P0 1.B R A /00 200 0 1g

7 ru b éola R V i/S P2 .BR A /0 0 200 0 1a

8 ru b éola R V i/S P3 .BR A /0 0 200 0 1a

9 ru b éola R V i/S P4 .BR A /0 0 200 0 1g

1 0 ru b éola R V i/S P5 .BR A /0 0 200 0 1g

1 1 ru b éola R V i/S P6 .BR A /0 0 200 0 1a1 2 ru b éola R V i/S P7 .BR A /0 0 200 0 1a

1 3 ru b éola R V i/S P8 .BR A /0 0 200 0 1a

1 4 ru b éola R V i/S P9 .BR A /0 0 200 0 1g

1 5 ru b éola R V i/S P .1 0/ BR A 00 200 0 1g

1 6 ru b éola R V i/S P1 1.B R A /00 200 0 1a


1 8 ru b éola R vi /S P 13 . .B R A / 00 200 0 1a1 9 ru b éola R vi /S P 14 . .B R A / 00 200 0 1a



2 2 r e inf ec çã o R V i/S P0 1.B R A /02 200 2 1g

2 3 (M ãe ) R V i/S P0 2.B R A 0 2 200 2 1g2 4 S RC (RN ) R V i/S P0 3.B R A 0 2/CR S 200 2 1g

2 5 IC R R V i/S P0 4.B R A 0 2/CR I 200 2 1g2 6 ru b éola R V i/S P0 1.B R A /03 200 3 1g

2 7 r e inf ec çã o R V i/S P0 1.B R A /04 200 4 1a



87

6 DISCUSSÃO

A rubéola é uma doença infecciosa viral aguda, que acomete crianças,

adolescentes e adultos jovens. A rubéola é uma doença de importância devido à

ocorrência da SRC atingindo o feto de mães infectadas durante a gestação e pode

acarretar inúmeras complicações.

Os vírus da rubéola caracterizados, neste estudo foram isolados em

diferentes áreas do estado de São Paulo, em diferentes períodos: 1997-1999;

durante a epidemia de 2000-2001; e após o surto nos anos de 2002-2004. No

período de 1992 a 2000, o Estado de São Paulo, à semelhança do que ocorreu

com o sarampo, verificou-se o deslocamento da faixa etária para a população de

adultos jovens. No presente estudo, os casos relacionados a epidemia de 2000 e

2001, na maioria, são mulheres nesta faixa etária e não vacinadas. Estudo, de

soroprevalência, realizado por Figueiredo et al.(2009) mostrou que o percentual de

indivíduos com anticorpos da classe IgG contra a rubéola na faixa etária de 20-29

anos foi de 82,35%, abaixo daquela observada em faixas etárias inferiores ou

superiores. Os resultados mostram que a faixa etária de 20-29 anos do sexo

feminino oferecia meio de circulação para o vírus da rubéola por concentrar a

maioria dos suscetíveis acumulados ao longo dos anos, ou por não terem sido alvo

das campanhas de vacinação a partir de 1992 ou não terem adquirido a doença

naturalmente. No estado de São Paulo, frente a estes resultados, foi realizada em

2001 uma campanha vacinal onde 4.408.844 mulheres entre 15 a 29 anos de

idade foram vacinadas. A cobertura vacinal geral foi de 91,6%, sendo 100% para a

faixa etária entre 15 a 19 anos, 89% na faixa etária de 20 a 24 anos e 82,8% entre

a faixa etária de 25 a 29 anos de idade. Após esta campanha, houve redução da

incidência de 3,95 para 0,33 casos/100.000 habitantes em 2001 e 2004,

respectivamente.

Entre os casos incluídos neste estudo, temos dois casos que apresentaram

complicações graves após infecção pelo vírus da rubéola: insuficiência hepática

aguda e encefalite.

A Insuficiência hepática aguda em crianças é uma disfunção grave,

sem história prévia de doença no fígado (SQUIRES, 2007). Diversos fatores

podem desencadear esta doença em crianças de mais de um ano, como as

88

hepatites virais, exposição a drogas, alterações no sistema imune, doenças

metabólicas ou infecciosas, entretanto, a grande maioria dos casos relatados, a

etiologia é desconhecida. No caso descrito, foram investigados todos os fatores

que poderiam levar a insuficiência hepática aguda: agentes infecciosos (vírus e

bactérias), alterações metabólicas, doenças auto imunes, imunodeficiências. Os

resultados mostraram que o paciente teve infecção pelo vírus da rubéola, isolado e

amplificado do sangue e posteriormente, do explante do fígado. Além disso, os

resultados anatomo patológicos confirmaram o diagnóstico de hepatite, com

detecção imunohistoquímica do antígeno da rubéola (proteína E1) nos hepatócitos,

células de Kupffer e células endoteliais, demonstrando que houve replicação viral

ativa no figado (FIGUEIREDO et al., 2010).

A encefalite é uma complicação rara que pode ocorrer após a

infecção pelo vírus da rubéola, normalmente os sintomas iniciam no intervalo de 1

a 8 dias após o aparecimento do exantema. Os principais sintomas neurológicos

são dor de cabeça, ataxia e hemiplegia. Alterações da consciência, coma,

convulsões raramente são descritos (FREY, 1997). A grande maioria dos casos de

encefalite pelo vírus da rubéola ocorrem em crianças, sendo rara em adultos

jovens (CHANG et al., 1997; LAU et al., 1998; MERRER et al., 1999; GARLICKI et

al., 1998; SQUADRINI et al., 1977). Embora a determinação do fator etiológico é

muito importante para o tratamento das encefalites, na grande maioria das vezes,

este agente não é identificado. Os relatos publicados de encefalite devido ao virus

da rubéola, na sua grande maioria, o diagnóstico é confirmado apenas pela

presença de anticorpos da classe IgM ou IgG no soro e no liquido cefaloraquidiano

por teste imunoenzimático (ELISA). No presente caso, o vírus foi isolado e

amplificado do liquído cefalorraquidinao, indicando que o vírus tem a capacidade

de invadir o sistema nervoso central (FIGUEIREDO et al., 2010). BECHAR et al.

(1982) proporam que a patogênese das complicações neurológicas, após infecção

pelo vírus da rubéola, pode estar relacionada a dois mecanismos básicos: a

invasão direta do vírus no sistema nervoso central e da resposta imune do

hospedeiro. A recuperação do vírus da rubéola no liquido cefalorraquidiano,

demonstra que pode ocorrer a invasão do vírus dentro do sistema nervoso central

e multiplicação viral. As encefalites por RV apresentam uma taxa de mortalidade

de 7,8% a 20%, sendo que aproximadamente 24% dos pacientes apresentam

seqüelas após a infecção (DWYER et al., 1992).

89

As primeiras vacinas produzidas para controle da rubéola foram

licenciadas em 1969 e programas eficazes de vacinação levaram a eliminação da

rubéola e da SRC em algumas cidades (ROBERTSON et al., 2003). Normalmente,

a vacina da rubéola é produzida em combinação com o sarampo (SR) ou sarampo

e caxumba (SCR). Cerca de 95% da população vacinada desenvolve uma resposta

imunológica que pode persistir até 20 anos após a vacinação (HOBMANN;

CHANTLER, 2007). Neste estudo, dos quatro casos de reinfecção, dois casos

apresentaram soroconversão, após a infecção natural, confirmada por sorologia

positiva IgM/IgG e dois vacinados contra sarampo/rubéola no ano de 2001, após a

epidemia que ocorreu no estado de São Paulo, com sorologia positiva IgG Estes

pacientes não apresentavam qualquer sinal de imunodeficiência e não foram

submetidos a nenhum tratamento antiviral. Casos de reinfecção são raros, e

podem ocorrer em pessoas com a imunidade induzida pela vacina ou em pessoas

que adquiriram a imunidade pela doença. A reinfecção do vírus, adquirida

naturalmente após a vacinação, pode variar entre 10 e 22%, uma taxa dez vezes

maior entre os indivíduos que possuem baixos níveis de anticorpos contra rubéola

após a infecção natural (HOBMANN; CHANTLER, 2007). A realização do teste de

avidez de anticorpos permitiu distinguir uma infecção primária recente de uma

infecção passada ou reinfecção. A identificação de anticorpos de baixa avidez com

índices de avidez igual ou inferior a 30%, sugere infecção primária recente e acima

destes valores, infecção antiga. Estudo realizado por Valloup-Fellous e Grangeot-

Keros (2007) mostrou que após 6 meses ou mais após a infecção primaria ou

vacinação, todos os pacientes apresentaram um índice maior de 70% utilizando a

técnica de avidez para avaliação sorológica.

Os nossos resultados mostraram que técnica de RT-PCR direta do

material biológico apresentaram alta positividade quando comparada com o

isolamento. O alto percentual de positividade por este método também foi

encontrado por outros autores (BOSMA et al., 1985a, OLIVEIRA et al., 2001;

FIGUEIREDO et al., 2004). Entre os casos aqui estudados, tres amostras de urina

e uma de sangue colhidas no primeiro dia de exantema foram negativas pelo teste

de RT-PCR e positivas para o isolamento viral. Este resultado mostra que a carga

viral da amostra escolhida foi extremamente importante para o diagnóstico da

rubéola, reduzindo a possibilidade de resultados falso negativos. Não podemos

esquecer que o isolamento viral em cultura de células continua sendo considerado

90

o padrão ouro para a detecção de rubéola em amostras biologicas. A rubéola

cresce um uma variedade de linhagens células, porém o crescimento viral é lento

e o seu efeito citopático é de difícil visualização (Frey TK, 1994). Neste estudo, as

linhagens celulares Vero e SIRC foram utilizadas para o isolamento viral, visto que

estas linhagens são mais eficientes para o isolamento e propagação do vírus da

rubéola (HOBMANN; CHANTLER, 2005). Durante a realização deste estudo, as

células SIRC apresentaram alta sensibilidade e maior visibilidade do efeito

citopático (FIGUEIREDO et 2009b). A visualização do efeito citopático nas células

Vero é mais difícil pelo fato que estas células crescem formando mais de uma

camada celular. As passagens sucessivas realizadas, elevaram a taxa de

positividade nos isolamentos. Entretanto, o isolamento viral, é uma técnica mais

demorada quando comparada a RT-PCR. Devido as passagens sucessivas, os

resultados do isolamento só estariam disponíveis após aproximadamente 21 a 30

dias. Em contrapartida, a técnica de RT-PCR é um método rápido e eficiente,

porém é necessário que a amostra chegue ao laboratório em boas condições de

transporte da mesma. Estes resultados confirmam os achados por Bosma et al.

(1995b), Revello et al. (1997) e Andrade et al. (2006) que estudaram casos de

infecção materna. O diagnóstico clinico e laboratorial das infecções congênitas não

é uma tarefa fácil, pois aproximadamente 50% das gestantes são assintomáticas.

A ultra-sonografia tem valor limitado nos casos sem acometimento grave e o

diagnóstico intra utero possui o risco do próprio procedimento. Os recém nascidos

infectados, muitas vezes são assintomáticos, e uma análise minuciosa dever ser

feita para detecção das mínimas alterações clinicas nos mesmos (BEST, 2007).

Além disso, em alguns casos de SRC o recém-nascido tem ausência de IgM,

devido a imaturidade do sistema imune fetal, pois este não tem condições

organogênicas de produzir a imunoglobulina M, dificultando assim a sua utilização

como diagnóstico (ENDERS; JONATHA, 1987; ANDRADE et al., 2006). Embora o

feto se torne capaz de produzi-los ao redor da 20° semana de gestação, os

anticorpos IgM, parecem não conseguir combater completamente o vírus do

organismo fetal, apesar de sua atividade neutralizantes quanto testado in vitro

(COOPER; PRELUB; ALFORD, 1995; KATOW, 1998). Quanto a sorologia materna

a situação pode ser inversa, apresentando IgM falso positiva. Em uma gestante

sem história de infecção pelo vírus da rubéola, o resultado de IgM positiva, pode

significar infecção recente assintomática, reinfecção, resultado falso positivo ou

91

reação cruzada com outros agentes infecciosos (BEST et al., 2007; HOFMANN e

LIEBERT, 2005).

Os estudos moleculares baseados na sequência viral do gene E1 do

vírus da rubéola, classificou o vírus da rubéola em dois grupos: 1 e 2. O grupo 1

está presente na Europa, Norte da América, Ásia e grupo II na Ásia e

recentemente, América do Sul e Europa (WHO, 2005).

Os vírus da rubéola isolados e sequenciados neste estudo, quando

comparados a uma coleção de vírus de referência mundial disponíveis no

GenBank, mostrou que as amostras virais circulantes em São Paulo, pertencem ao

grupo 1, genótipos 1a e 1G.

O genótipo 1a está presente desde 1997 e também durante a

epidemia que ocorreu em 2000 e 2001. Esse genótipo foi primeiramente descrito

em 2002 e recentemente em 2007 associado a Síndrome de Guillain-Barré (REEF

et al., 2002; FIGUEIREDO et al., 2008, 2010). Este genótipo pertence aos vírus

isolados entre os anos de 1961 a 1986 que compreendem o grupo de genótipo

clássico internacional. Durante o período de 1966 a 1990 esse genótipo foi isolado

nos Estados Unidos da América, nas cidades da Califórnia, Geórgia, Michigan,

Nova York e Ohio e na Europa onde ele foi predominante na Bélgica e Inglaterra

(ICENOGLE et al., 2004; ZHENG et al, 2003a). Zheng et al. (2003b) encontrou

este genótipo na Itália em 1991 e 1997. Este genótipo não tem sido freqüente nos

últimos anos, entretanto, nos anos 2000 a 2002, este genótipo foi isolado em

Myanmar e Mongólia (WHO, 2005).Os isolados em Myanmar foram amostras

biológicas de crianças infectadas pelo vírus da rubéola durante o surto que ocorreu

na cidade de Yagon (THANT et al., 2006). Recentemente, o genótipo 1a foi

isolado em Honduras (comunicação pessoal, Joseph Icenogle, responsável pelo

Setor de Rubéola do CDC).

O genótipo 1G foi isolado durante a epidemia de 2000-2001, e

persistiu até 2003. Este genótipo foi isolado na Europa, África, Ásia e no Brazil, na

cidade do Rio de Janeiro (HAHNÉ et al., 2009; WHO, 2007, 2005; DONADIO et

al., 2003). Portanto, em São Paulo, houve a circulação destes dois genótipos

durante o período analisado: 1997 a 2004. Alguns estudos, demonstraram co-

circulação de genótipos distintos durante o mesmo surto (ZHU, Z et al., 2010;

ZHENG et al., 2003; DONADIO et al.2003).

92

Este estudo é pioneiro no país e o primeiro a seqüenciar e analisar

os genótipos desse vírus detectado em um grande numero de amostras. No futuro,

a epidemiologia molecular ajudará a monitorar o caminho da transmissão do vírus

da rubéola através do mundo e identificar vírus

93

7 CONCLUSÕES

A. A PCR pode ser utilizada para detectacção do vírus da rubéola em

amostras clinicas.

B. As amostras do vírus da rubéola isoladas e seqüenciadas foram do grupo 1,

genótipos 1a e 1G. Estes dois genótipos foram os responsáveis pela epidemia de

2000 que ocorreu no Estado de São Paulo.

C. O genótipo 1a foi pela primeira vez detectado nas Américas.

D. A pesquisa mostrou que a associação das técnicas de isolamento viral e

PCR possibilitou a detecção do primeiro caso de hepatite fulminante pelo virus da

rubéola

E. Primeiro relato na literatura de isolamento e sequenciamento gênico do

virus da rubéola em liquido cefalorraquidiano de um caso de encefalite por rubéola.

94

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CRISTINA ADELAIDE FIGUEIREDO