UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL DE LA AMAZONA FACULTAD DE INGENIERA Y CIENCIAS AMBIENTALESCARRERA PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

CROMATOGRAFIA, APLICACIONES CUALITATIVAS Y CUANTITATIVAS- HPLCTRABAJO EXPERIMENTAL

CURSO : QUMICA ANALTICA. PRESENTADO POR : ABRAHAM BUSTAMANTE VALLEJOS

DOCENTE : Dr.QCO.FCO. NERY GRIMALDO CRDOVA.

PUCALLPA2015

AGRADECIMIENTOS Agradecemos, a nuestro Dios, que nos da la sabidura para profundizar nuestros conocimientos en la ciencia de investigacin, y todos los que nos apoyaron para la realizacin de este trabajo.

DEDICATORIA El trabajo de investigacin, lo dedicamos a las personas que confiaron en nuestra capacidad de anlisis e investigacin; a nuestros profesores quienes son nuestros guas en el aprendizaje, que nos brindan grandes conocimientos que nos servirn en el futuro.INDICE GENERAL: 1. INTRODUCCION2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVOS GENERALES2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS3. MARCO TEORICO3.1 ANTECEDENTES3.2 BASE CIENTIFICA3.3 TERMINOLOGIA 4. CLASIFICACION4.1 CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA4.1.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL4.1.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)4.1.3 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA4.1.4 CROMATOGRAFIA DE GASES5. CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC):5.1 CLASIFICACION 5.1.1 CROMATOGRAFA DE ADSORCIN (LQUIDO-SLIDO). 5.1.2 CROMATOGRAFA DE REPARTO/ADSORCIN 5.1.3 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO. 5.1.4 CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR. 5.1.5 CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL 5.1.6 CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA (INVERSA)5.2 INSTRUMENTACIN 5.2.1 SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MVIL5.2.1.1 LA BOMBA 5.2.1.2 TIPOS DE BOMBAS5.2.1.3 SISTEMAS DE MEZCLA DE FASE MVIL5.2.1.4 MEZCLADO A ALTA PRESIN5.2.1.5 MEZCLADO A BAJA PRESIN5.2.1.6 SISTEMAS DE INYECCIN5.2.1.7 LA COLUMNA 5.2.1.8 ELECCIN DE LA COLUMNA Y DE LA FASE MVIL 5.3 ECUACIONES FUNDAMENTALES 5.4 PROCEDIMIENTO PARA UN ANALISIS CROMATOGRAFICO HPLC 5.5 CARACTERISTICAS QUE DEBE TENER UNA FASE MOVIL (SOLVENTE)6. APLICACIONES EN CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN (HPLC6.1 APLICACIONES CUANTITATIVAS Y CUALITATIVAS 7. CONCLUSIONES 8. BIBLIOGRAFIA 1. INTRODUCCION

La cromatografa es una tcnica que se emplea para separar entre si los componentes de una sustancia.Esta tcnica fue creada por el botnico ruso Michael Tswett en 1906, el cual llam a su mtodo cromatografa, palabra griega que significa escritura a color, porque lo utilizo para separar compuestos coloreados. Tswett llev a cabo una extraccin de una mezcla de pigmentos de hojas verdes utilizando ter de petrleo, un disolvente no polar, y descubri que era capaz de separar los pigmentos al hacer pasar el extracto atravs de una columna, un tubo de vidrio rellenado con carbonato de calcio (tiza). Tswett utiliz como detector del experimento la simple observacin, ya que los compuestos que separ tenan color y era posible detectar bandas o zonas de distintas materias por su color en la columna, demostrando que la clorofila es solo uno de los muchos pigmentos que se encuentran en las hojas de las plantas.A pesar de que el mtodo cromatogrfico prometa simplificar la separacin de sustancias de mezclas complejas, no fue sino hasta finales de la dcada de los 30 y principio de los 40 cuando se empez a desarrollar la tcnica teniendo este mtodo diversas aplicaciones. En la actualidad la cromatografa se emplea principalmente para separar compuestos incoloros pero el nombre permanece para describir cualquier tcnica que se base en los mismos principios.La columna sencilla de Tswett, un tubo vertical de cristal, abierto por su parte superior, rellena de un slido comn donde el eluyente se mueve conducido por supropio peso, ha evolucionado hasta los modernos equipos que hoy conocemos (fig1).Fig. 1. Cromatgrafo de gases con espectrmetro de masas Fig. 2. Equipos para HPLC (C. de alta resolucin para lquidos)

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVOS GENERALES:

Conocer la definicin de Cromatografa y los Tipos de Tcnicas de Separacin cromatografas en diferentes sustancias.

Determinar las aplicaciones cualitativa y cuantitativamente en el proceso de Cromatografia Liquida de Alta Resolucin-HPLC.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS:

Aportar informacin para futuros trabajos de investigacin sobre las diferentes tcnicas de separacin de la cromatografa. Conocer las tcnicas de separacin de las molculas orgnicas a travs de diferentes tipos de la cromatografa. Conocer los Instrumentos usados en el Proceso de Separacin Cromatografico. Conocer las fases para la Separacion Cromatografica Tipo HPLC. Reconocer cualitativa y cuantitativamente la diferencia de una muestra analizada en el proceso cromatografico-HPLC.

3. MARCO TEORICO3.1 ANTECEDENTES

La Cromatografa gaseosa fue descubierta por un botnico ruso llamado Mikhail Tswett quien separ los pigmentos de las plantas sobre una columna de tiza en 19033. Qumicos Britnicos Martin y Synge desarrollaron la cromatografa de particin en 1942; Martin y James desarrollaron la (GC) in 1952. Desde 1940, qumicos utilizaron columnas de silica para purificar materiales orgnicos. En los ltimos aos de la dcada 60, LC cambi debido a que se empacaron columnas con pequeas partculas que necesitaron bombas de presin. en 1906, martin tswett public un artculo sobre la cromatografa. tswett separo los componentes de la clorofila utilizando carbonato de calcio como absorbente y ter de petrleo como eluyente. En 1931, Kuhn y sus colaboradores aislaron y carotenos de la zanahoria, empleando el mismo mtodo de Tswett. Por los aos de 1940, Martin y Synge trabajaron en las bases Tericas de la cromatografa, lo cual hizo posible el definir Mtodos que habilitan la eficiencia de la separacin cromatografica. Ello hizo posible que la Cromatografa tuviera una amplia aceptacin. En la dcada de 1950, el mtodo cromatografico fue aplicado a la cromatografa de Gases. En 1957, Golay propuso el uso de Columnas Capilares para la Cromatografa de Gases. En la dcada de 1960, naci la Cromatografa Liquida de alta performance (HPLC). En 1975, Small y sus colaboradores propusieron la Cromatografa de Intercambio Inico de Alta Performance. 1979, Gierde y sus colaboradores desarrollaron el sistema de Cromatografa de iones supresores.

Anteriormente a los aos 60, pocos mtodos cromatografico confiables estaban disponibles comercialmente para el cientfico del laboratorio. Durante los aos 70, la mayora delas separaciones qumicas eran realizadas usando una variedad de tcnicas incluyendo la cromatografa columna abierta, la cromatografa de papel, y la cromatografa de capa delgada. Sin embargo estas tcnicas cromatograficas eran inadecuadas para la cuantificacin de compuestos similares.Durante este tiempo, la cromatografa de presin liquida comenz a ser utilizada para disminuir el tiempo del flujo, reduciendo as tiempo de purificacin de los compuestos que son aislados por la columna cromatografica.

A fines de los 70s, los nuevos mtodos incluyendo la cromatografa liquida de la fase reserva permitieron una mejor separacin entre los compuestos similares.

3.2 BASE CIENTIFICA

En la cromatografa se separan los componentes de las mezclas a medida que son transportadas por un fase fluida mvil a travs de una fase estacionaria slida o lquida, la separacin de las molculas se logra porque la movilidad de cada soluto depende de un equilibrio en la distribucin entre la fase mvil y la estacionaria, y esta separacin se puede realizar en funcin de sus cargas, masas, tamaos moleculares, la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox.Como resultado hay una gran variedad de tcnicas para llevar a cabo la separacin de una sustancia, que se clasifican en cuatro grandes grupos segn el mecanismo de separacin: C. de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad. C. de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin. C. de exclusin: separa solutos segn el peso molecular. C. de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica.Tambin se pueden clasificar segn el estado de la fase mvil en : C. de gases: la fase mvil es un gas y pueden ser dos sistemas: C. gas-liquido C. gas-slido C. lquida: la fase mvil es un liquido y puede ser: C. liquido-liquido C. liquido-slido C. de exclusin C. de intercambio ionicoLas nicas sustancias que no pueden ser examinadas por cromatografa son las insolubles y aquellas que se descomponen con el solvente o con la fase estacionaria. Dentro de las tcnicas cromatogrficas no se incluyen los mtodos que utilizan campos elctricos para separar molculas cargadas, mtodos que se denominan electro separaciones, electromigraciones o electroforesis.El proceso cromatogrfico, aparentemente simple, es en realidad una compleja unin de fenmenos tales como hidrodinmica, cintica, termodinmica, qumica de superficie y difusin. Hasta la fecha se han propuesto muchas teoras, que incluyen complejos matemticos para poder explicar el comportamiento de los solutos en las columnas cromatogrficas, por citar alguna de estas teorias las ms estudiadas son: Teora de los Platos Tericos (Martin & Synge). Teora Cintica (Van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg & Sjenitzer). Teora Desarrollada para Columnas Capilares (Golay).

3.3 TERMINOLOGA

" Absorcin: es la retencin de una especie qumica por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene sta a formar mezcla o a reaccionar qumicamente con la misma." Adsorbente: fase estacionaria en la C. de adsorcin y de reparto." Adsorcin: Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la superficie de un slido, quedando limitado el fenmeno a la superficie que separar las fases o superficie interfacial, esta retencin superficial puede ser fsica o qumica." C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar." C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar." Disolvente o revelador: Cualquier fase mvil." Elucin: Proceso de extraer un soluto de la fase estacionaria." Eluyente: La fase mvil una vez que se extrae de la columna." Fase estacionaria: Material que permanece dentro de la columna cromatogrfica durante la cromatografa y que retiene algn componente de la muestra, posee una gran rea superficial y puede ser un slido o un lquido dispuesto sobre un slido que acta como soporte." Fase mvil: Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico que se usa como portador de la mezcla y que se hace pasar a travs de la columna cromatogrfica y la fase estacionaria." Origen: Lugar fsico donde se coloca la muestra al principio." Revelado: Proceso de separar un soluto de la muestra por medio de cromatografa." Soporte: El material slido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase estacionaria lquida en su sitio." Sorbente: Cualquier fase estacionaria

4. CLASIFICACIN

4.1 CROMATOGRAFIA PLANA Y CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

La cromatografa puede llevarse a cabo por cinco tcnicas analticas: C. En papel C. En capa fina C. en columna C. de Gases C. Lquida de alta resolucin HPLC

4.1.1 CROMATOGRAFIA EN PAPEL

Es una forma combinada de cromatografas de particin y adsorcin en la que la fase estacionaria es el agua absorbida presente en el papel, y el soporte es el papel mismo. La fase mvil es una solucin que consiste de un solvente o de una mezcla de varios lquidos, incluyendo el agua. Se deja secar sobre el papel unas gotas del extracto de la muestra y se forma una mancha.Para impedir la evaporacin, el papel se cuelga dentro de una cmara de tal forma que la mancha pueda ser irrigada con la fase mvil ya sea hacia abajo por efecto de la gravedad, hacia arriba u horizontalmente por efecto de la capilaridad. Cuando la fase mvil ha saturado el papel hasta una distancia predeterminada en la que se logre la separacin cromatogrfica, se saca el papel de la cmara y se desarrolla el cromatograma rociando agente reveladores.En el caso de sustancias coloreadas tales como los colorantes de alimentos, la separacin resulta evidente aun sin la ayuda de tales agentes. Las sustancias no polares tambin pueden separarse recubriendo el papel con un compuesto no polar y usando solventes polares como fase mvil. Es una tcnica barata pero relativamente lenta, con limitaciones en el uso de agentes reveladores, algunos de los cuales pueden atacar y destruir el papel. Las manchas tienden a ser difusas.

4.1.2 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)

Es un procedimiento rpido y sencillo para separar mezclas de sustancias y para identificar/caracterizar o para determinar semicuantitativamente componentes individuales.

La separacin se basa en que las sustancias investigadas se reparten de modo diferencial entre una fase estacionaria y otra mvil: en la TLC el eluyente (fase mvil) se desplaza por una fina capa del sorbente (fase estacionaria), transportando as los componentes individuales de la mezcla de sustancias ms o menos lejos dependiendo de su solubilidad y/o de su comportamiento frente a la adsorcin. Al contrario, que en la cromatografa en columna, el proceso separativo transcurre en un sistema abierto, la placa separativa plana. El recorrido particular de cada sustancia se emplea as para su identificacin.

Las separaciones se realizan generalmente por el procedimiento ascendiente, introduciendo el borde inferior de la placa cromatografa en el solvente, que ser succionado por accin de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa.

APARATOS Y MATERIALES. GENERALIDADES

- Cubeta cromatogrfica (con tapa hermtica); la mayora de las veces se trata de la cubeta Normal (profundidad del espacio para el gas: 3mm)- Placas de cromatografa: preparadas por uno mismo o ya fabricadas.- Pipetas de microlitro- Recipiente de vidrio con pulverizador- Probeta o matraz Erlenmeyer con tapn (para preparar y mezclar la fase mvil)- Secador- Plantilla para TLC o regla- En caso necesario: lmpara UV para comprobar la fluorescencia o la disminucin de la misma.

DESARROLLO

El eluyente, cuya composicin depende de cada problema concreto, se pone en la cubeta cromatogrfica por lo menos 30 minutos antes del principio de la separacin hasta una altura de 0.5 cm. La cubeta se cerrar con su tapa para que se sature con los vapores del disolvente y se coloca en un lugar adecuado. Para que la saturacin sea mejor, se recubre la cubeta con papel secante (se indicar en el protocolo en el caso que sea necesario).Para desarrollar la placa, su extremo inferior se introduce en el diluyente y se vuelve a cerrar la cubeta inmediatamente. Para evitar eluciones, las manchas cargadas debern estar completamente por encima del nivel de eluyente.El eluyente se ve impelido hacia arriba por capilaridad a travs del recubrimiento. El recorrido ser, dependiendo de la separacin, de 5 a 15 cm mximo, y el tiempo necesario depender del sorbente, del espesor del mismo y de la composicin del eluyente. El recorrido ptimo es por lo general de 10 cm.

CLCULOS

Tras el desarrollo del cromatograma, se saca la placa de la cubeta y (despus de marcar el frente) se seca cuidadosamente al aire o con un secador. La posicin de las manchas se determina:

-por su color propio-por su fluorescencia-por la disminucin o amortiguacin de la fluorescencia-por reaccin qumica: la placa una vez seca se roca parcial o totalmente con un determinado reactivo, de manera que aparecern coloraciones caractersticas o una fluorescencia particular.

La identificacin de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y del denominado valor rf (factor de retencin , llamado tambin factor Rf o hRf (=Rf x 100), es decir, el cociente entre el recorrido de la sustancia (ls) y el del eluyente (lL).

rf = ls [cm] / lL[cm]

Para conseguir la identificacin, los colores propios o consecuencia del revelado y los rf se comparan con los de sustancias de referencia, obtenidos en las mismas condiciones de desarrollo y tincin (si es posible en el mismo cromatograma). Como control se realizan adicionalmente los denominados cromatrogramas mixtos (la disolucin problema y la de la sustancia de referencia se cargan en una misma mancha).

4.1.3 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA

Fue la forma original de cromatografa lquida realizada por primera vez en 1906 por Tswett. La fase estacionaria normalmente se encuentra dentro de una columna de vidrio de 5 a 30 mm de dimetro. Se utilizan muchas clases de materiales de empaque que van desde la almina, gel de slice, tierra de diatomeas, hasta resinas sintticas y derivados polisacridos.Se usan todos los tipos de cromatografa lquida. Lo habitual es que la fase mvil se deje percolar a travs de la columna por gravedad. No se usa mucho en el anlisis de alimentos ya que es una tcnica para la separacin cromatogrfica de mezclas de sustancias. Sin embargo, hoy en da existe un sistema cromatogrfico completo y automtico diseado para el anlisis bioqumico que se conoce como cromatografa lquida rpida para protenas. Estos instrumentos emplean un rango de fases en columnas de plstico de 5 o 10 cm que operan bajo presin moderada.

Se revolucion el uso de la cromatografa en columna para la purificacin de soluciones de prueba o para extraer las sustancias deseadas de las soluciones, debido a la introduccin de cartuchos cortos de plstico y desechables de minicolumnas, preempacados con una variedad de fases de separacin con partculas de tamao relativamente grandes, por ejemplo, cartuchos de Bond-Elut y Sep-Pak. Las soluciones de prueba, de lavado o extraccin pasan rpidamente a travs de los cartuchos con un poco de vaco generado a travs de una bomba de agua. La mayora de los mtodos de purificacin tales como la extraccin lquido-lquido, la TLC y la cromatografa en columna de vidrio que se usan antes de la espectofotometra, la GLC, la HPLC etc, pueden ahora realizarse en forma ms eficiente usando estos cartuchos.

4.1.4 CROMATOGRAFA DE GASES:

Se utiliza para la separacin de sustancias gaseosas. La Fase Mvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un slido (Cromatografa Gas-Slido) o una Pelcula de lquido de alto punto de ebullicin (Generalmente Polietiln-Glicol o Silicn) recubriendo un slido inerte (Cromatografa Gas-Lquido). El cromatgrafo de gases est constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyeccin, una columna normalmente localizada en el interior de una cmara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatgrama. La muestra se introduce a travs del sistema de inyeccin dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separacin. La columna de aluminio, acero inoxidable, vidrio o tefln contiene la fase estacionaria slida o lquida y est sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de slice. La fase mvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a travs de la columna, por esta razn debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusin gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la deteccin y cuantificacin de las sustancias, midiendo conductividad trmica y electronegatividad de las sustancias eludas. Se produce una seal tipo elctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la sustancia se registra en un cromatgrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el rea del pico.

5. CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC):

La cromatografa lquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografa de elucin. En sta, un lquido (fase mvil) circula en ntimo contacto con un slido u otro lquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de substancias (analitos) en la corriente de fase mvil, cada analito avanzar a lo largo del sistema con una velocidad diferente que depender de su afinidad por cada una de las fases. Esto supone que despus de terminado el recorrido de la muestra por la columna, cada una de las substancias introducidas en el sistemaeluir con un tiempo diferente, es decir, estarn separadas.

5.1 CLASIFICACIN DE LA CROMATOGRAFA LIQUIDA

Los diferentes tipos de cromatografa lquida se pueden clasificar de diferentes maneras, pero la forma ms habitual de clasificacin es la realizada en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya que es sta la que impone fundamentalmente el mecanismo de separacin; de este modo, se pueden enumerar cuatro tipos de tcnicas:

5.1.1 CROMATOGRAFA DE ADSORCIN (LQUIDO-SLIDO).La fase estacionaria es un adsorbente y la separacin se basa en repetidas etapasde adsorcin-desorcin.

5.1.2 CROMATOGRAFA DE REPARTO/ADSORCIN (FASES LIGADAS QUMICAMENTE).La separacin en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase mvil yla fase estacionaria.

5.1.3 CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO INICO.Este tipo de cromatografa se da cuando la fase estacionaria presenta en susuperficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de signocontrario que circulan en la fase mvil.

5.1.4 CROMATOGRAFA DE EXCLUSIN MOLECULAR.La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamao de porocontrolado, que permite la entrada de ciertas molculas de manera selectiva,dejando fuera otras de mayor tamao.El mecanismo de retencin en los dos primeros casos es similar, variando nicamente el tipo de interacciones que se producen y cul de ellas es la predominante; por esta razn, en la prctica se realiza otra divisin de los dos primeros tipos de cromatografa atendiendo a polaridad de la fase estacionaria:

5.1.5 CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL:La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interaccionesque se producen con el soluto son especficas del grupo activo. La fase estacionaria puede ser un slido adsorbente (slice o almina), o bien, un soporte al que se unen qumicamente molculas orgnicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc).

5.1.6 CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA (INVERSA):La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas, grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecficas (efecto solvfobo).

5.2 INSTRUMENTACIN

Si bien es cierto que para realizar una cromatografa lquida tan solo es necesario disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografa de lquidos de alta eficacia, debido al pequeo dimetro de las partculas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilizacin de unos dispositivos que constituyen el cromatgrafo.Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos son:

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes). Dispositivo de inyeccin. Conducciones y conexiones. Detector y registrador. Columna.Los componentes bsicos de un cromatgrafo se muestran en la figura 1.

Figura 1.- Esquema de un cromatgrafo de lquidos

Adems de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden incorporar en el sistema otros que pueden simplificar el trabajo o bien mejorar algn aspecto concreto de la tcnica cromatogrfica, como pueden ser: Inyectores automticos. Colectores de fracciones. Hornos termostatizados para las columnas Sistemas de tratamiento de datos.

5.2.1 SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE MVIL

5.2.1.1 LA BOMBA

La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por la presin en cabeza de columna,y ya que sta puede variar por obstruccin de las lneas de conduccin, del filtro de la cabeza de la columna, etc.Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes caractersticas: - Estar construido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil.- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.- Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador de stas, ya que las pulsaciones, aunque no afectan a la separacin en s, pueden contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.

- Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango de caudales para las columnas que se utilizan habitualmente vara desde los 10 :l/min hasta los ml/min (columnas microbore, analticas y semipreparativas).

- El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de l depende la reproducibilidad de los tiempos de retencin.

5.2.1.2 TIPOS DE BOMBAS

Una primera clasificacin de las bombas utilizadas en CLAE, se puede realizaratendiendo a la fuerza motriz, as se tendrn:

Bombas neumticas.Bombas de desplazamiento directo.Bombas amplificadoras de aire.

Bombas de motor elctrico.Bombas de jeringa.Bombas alternantes (pistn o membrana).

Bombas neumticas: (A) Bomba amplificadoras de aire. (B) Bomba de desplazamiento directo.

Bombas de motor elctrico. (A) Bomba de jeringa. (B) Bomba alternante (membrana)

5.2.1.3 SISTEMAS DE MEZCLA DE FASE MVIL

En cromatografa de lquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrtico, cuando la fase mvil mantiene la misma composicin durante la elucin, y en gradiente, cuando la composicin de la fase mvil cambia segn una funcin dependiente del tiempo.Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo cromatogrficotenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes con un control preciso yreproducible.Los dos principales mtodos de mezclado de los componentes de la fase mvil se conocen como mezclado a alta presin y mezclado a baja presin.

5.2.1.4 MEZCLADO A ALTA PRESIN

Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno de los disolventes que se vana mezclar, estando la salida de cada bomba conectada a una conexin en "T" o a una pequea cmara de mezcla. La denominacin de mezcla en alta presin es debida a que la mezcla se realiza una vez que los disolventes han pasado la bomba y, por lo tanto, han adquirido la presin de trabajo.

5.2.1.5 MEZCLADO A BAJA PRESIN

En los equipos de mezcla en baja presin, el mezclado de los diferentes componentes se lleva a cabo antes de stos entren en la bomba (en la zona de baja presin del sistema), controlndose el caudal del sistema cromatogrfico por medio de una sola bomba. El mezclado de los componentes se realiza por medio de vlvulas porcentuales controladas por rels, que estn calibradas para dar la mezcla adecuada. El dispositivo de control simplemente abre cada vlvula durante un perodo de tiempo adecuado, que ser funcin del porcentaje de cada componente que se precise en la mezcla (figura 6).

Figura 6.- Sistema de mezcla en baja presin

5.2.1.6 SISTEMAS DE INYECCIN

El mtodo de introduccin de la muestra en CLAE, es de importancia capital, pues un mal sistema de inyeccin puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatogrfica que deterioren la eficacia del sistema cromatogrfico.Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:- Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms estrecha posible.- Ser de fcil manejo.- Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatogrfica.- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de vlvula.

5.2.1.7 LA COLUMNA

La columna es el elemento fundamental de un cromatgrafo de lquidos, puesto que es en ella donde tiene lugar la separacin; por lo tanto, resulta fundamental una correcta eleccin nde la columna adecuada para cada separacin, ya que con una columna inadecuada o de mala calidad se nunca se obtendrn buenos resultados aunque se disponga del mejor instrumental.

Las partes de que se compone una columna de cromatografa lquida se muestran en la figura 21.

Las columnas ms utilizadas en cromatografa de lquidos son las de relleno; estas columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de una fase estacionaria adecuada al tipo separacin que se pretende llevar a cabo. El dimetro interno vara entre 2 y 60 mm dependiendo su utilizacin, a escala analtica o semipreparativa, y su longitud vara entre 5 y 30 cm.Tambin se encuentran hoy en da en el mercado columnas de pequeo dimetro (microbore), con dimetros comprendidos entre 2 y 0,5 mm y longitudes entre 25 y 100 cm. Este tipo de columnas permite reducir el consumo de disolventes y, por lo tanto, facilitan la posibilidad de acoplar la cromatografa lquida a otras tcnicas analticas (fundamentalmente espectrometra de masas). Por otro lado, se empieza a introducir la denominada cromatografa de lquidos capilar, en la que se utilizan como columnas tubos (de slice fundida generalmente) de un dimetro interno muy pequeo (entre 200 y 500 :m) y de gran longitud (varios metros); en este tipo de columnas, la caracterstica ms importante es que la fase estacionaria se encuentra ligada qumicamente a las paredes del tubo, por lo que se hace innecesaria la utilizacin de partculas de fase estacionaria como en los dos casos anteriores.

Las caractersticas de la columna que influyen sobre su capacidad de separacin son:- Dimetro interno- Longitud- Conexiones (reducciones)- Relleno- Tamao de partcula del relleno.

5.2.1.8 ELECCIN DE LA COLUMNA Y DE LA FASE MVIL

La eleccin del sistema cromatogrfico debe realizarse en funcin de la naturaleza de las substancias a separar.El conocimiento de la naturaleza de la substancia va a permitir, a priori, orientar alcromatografista sobre qu mecanismo de separacin puede ser el mas apropiado o, dicho de otro modo, cul es la propiedad para la que existen diferencias ms notables entre las substancias a separar (tamao, carga, polaridad, etc.), lo que dar una idea de la fase estacionaria que puede ser apropiada (Figura 24).Es necesario, por lo tanto, conocer los mecanismos de separacin ms generales utilizados en cromatografa de lquidos. Bsicamente stos se pueden dividir en:

- Adsorcin. Cromatografa lquido-slido (CLS).- Adsorcin/reparto. Cromatografa con fases ligadas (CFL). Cromatografa de fase normal (CFL). Cromatografa de fase reversa (CFR).- Intercambio inico. Cromatografa de intercambio inico (CII). Cromatografa de cambio catinico. Cromatografa de cambio aninico.- Tamao molecular. Cromatografa de exclusin molecular (CEM). Cromatografa de filtracin en gel (CFG).

5.3 ECUACIONES FUNDAMENTALES

Constante de distribucin:En general, los equilibrios de distribucin implicados en cromatografa se describen por ecuaciones sencillas que suponen la transferencia de una analito entre las fases estacionaria y la mvil. As, para el soluto A, se puede escribir:

A mvil A estacionario

La constante de equilibrio K para este proceso se denomina constante de distribucin y mide la distribucin del analito entre la fase mvil y la estacionaria.

Entonces tenemos: K = CS/CM

Donde:CS : Es la concentracin molar del soluto en la fase estacionariaCM : Es la concentracin molar del soluto en la fase mvil.

La resolucin cromatogrfica de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar sus analitos.

Se la define como: Rs = 2 [(TRb- TRa)/(WA +WB)]Donde:

WA y WB son la anchura de los picos A y B en el cromatgrafoTR: Es el tiempo que tarda en aparecer el mximo de un pico.

A partir de esto se deduce que si R> 1,5 la separacin de los componentes es completa, no ser as si R