CROMATOGRAFÍA

Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido

Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de manera diferente con las dos fases estableciéndose un

reparto entre ambas

Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas

α = [moléculas adsorbidas] [mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]

coeficiente de reparto

FASE ESTACIONAR

IA

FASE MÓVIL

Clasificaciones de cromatografía

1. Según como se encuentre la fase estacionaria

b. batch

a. columna

c. plana cromatografía en papel y en capa fina

2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil

Fase estacionaria

Líquido adsorbido

Fase móvil

Sólida Líquida o gaseosa

Líquida o gaseosa

3. Según el tipo de flujo empleado

a. Gravedad

b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fluído a presión (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography)

Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión

Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad

El material empacado en las columnas está formado por pequeñas partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable o vidrio grueso

FPLC (fast protein liquid chromatography)

Es una variante del HPLC con columnas y equipamiento especialmente diseñado para separar o purificar proteínas

Las columnas de FPLC soportan menos presión que las de HPLC

4. Según la finalidad del experimento

Separación y purificación Preparativa

Separación, cuantificación y caracterización

Analítica

4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto

a. Cromatografía de intercambio iónico carga-carga

b. Cromatografía de interacción hidrofóbica efecto hidrofóbico

c. Cromatografía de afinidad variada pero específica

d. Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC)

e. Cromatografía de fase normal y reversa dipolo-dipolo

enlaces coordinación

Cromatografía de intercambio iónico

La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado

Las interacciones son electrostáticas

Dos tipos

Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos

Intercambio aniónico: matriz cargada positivamente (DEAE, TEA, QAE)

Intercambio catiónico: matriz cargada negativamente (CarboxiMetilos (CM), Sulfonatos (S), fosfatos)

DEAE

Q (DEPEA)

Q (TMEA)

CM

S

Cromatografía de intercambio iónico

La carga neta de la proteína depende de su p.Isoeléctrico y el pH

Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o ambos

Interacción con:

Intercambiador catiónico

Intercambiador aniónico

Cromatografía de intercambio iónico

Amonio Quaternario

Cromatografía de intercambio iónico

Cromatografía de afinidad

Se basa en una interacción biológica específica:

Enzima-sustrato

Anticuerpo-antígeno

Enzima-coenzima

Proteína-ligando específico

La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción

Cromatografía de afinidad

Interacción Biológica específica:

La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la columna GSH / Imidazol) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces de debilitar la interacción (bajar el pH, etc.)

Inmovilizado en Columna

Glutatión

Proteína A (o G)

Streptavidina

Quelante con Ni2+

Proteína

Recombinante de fusión con GST

Anticuerpo - IgG

Conjugada con biotina

Recombinante de fusión poliHistidina

IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas)Principalmente a los iones divalentes de metales de transición como Fe, Co, Ni, Cu y Zn

La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el imidazol a distintas concentraciones (hasta 500 mM) o cambios en el pH

Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes

Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct

Cola de (Histidina)6

Ni2+

Cromatografía de interacción hidrofóbica

El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos (eter, c4-c8) u otros grupos hidrofóbicos (Fenilos)

La interacción es de tipo hidrofóbica (guiada por entropia)

La fase móvil debe tener una alta concentración de sales ((NH4)2SO3 2 – 4 M)

Salting out

Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía de interacción hidrofóbica

Cromatografía de fase reversa

Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica pero son diferentes

El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos/ C8-C18) y la densidad de sustituyentes es mayor

La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no polares para la elución

Desnaturaliza proteínas Se usa mas para péptidos y algunas proteínas particularmente hidrofóbicas

Se utiliza en HPLC

Cromatografía de fase reversa

Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular / SEC)

No es una cromatografía estrictamente porque no ocurre adsorción

La separación se da por tamaño radio hidrodinámico

El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga

Las proteínas mas pequeñas pueden entrar por difusión simple en las partículas en la fase estacionaria, por lo que son retenidas más tiempo y salen más tarde en una cromatografía.

Aplicaciones:

Cambios de buffer / desalado PD-10 (gravedad) / HiTrap (FPLC)

Aplicaciones:

Determinación del peso molecular

Aplicaciones:

Purificación de proteínas

La pregunta más importante…

¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?

Concluyendo….