CROMATOGRAFIA LIQUIDA A CROMATOGRAFIA LIQUIDA A FASE INVERSAFASE INVERSA

Fase stazionariaFase stazionaria e’ costituita da catene idrocarburiche e’ costituita da catene idrocarburiche apolariapolari (butile, ottile, ottadecile) che formano un film (butile, ottile, ottadecile) che formano un film liquido legato al supporto di siliceliquido legato al supporto di silice

Fase mobileFase mobile è un solvente è un solvente polare polare (puo’ essere un (puo’ essere un tampone acquoso, metanolo, acetonitrile o miscele)tampone acquoso, metanolo, acetonitrile o miscele)

La fase stazionaria è essenzialmente inerte ed instaura La fase stazionaria è essenzialmente inerte ed instaura solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti. solo interazioni apolari (idrofobiche) con gli analiti.

La separazione cromatografica avviene principalmente La separazione cromatografica avviene principalmente sulla base delle caratteristiche della fase mobile. sulla base delle caratteristiche della fase mobile.

Gli analiti polari eluiscono per primi Gli analiti polari eluiscono per primi

e quelli non polari per ultimie quelli non polari per ultimi

Poiché il numero di piatti teorici è correlato Poiché il numero di piatti teorici è correlato all’area di superficie della fase stazionaria, all’area di superficie della fase stazionaria,

ne consegue che particelle di dimensioni ne consegue che particelle di dimensioni minori forniranno un minori forniranno un

grado di risoluzione maggiore grado di risoluzione maggiore

In In HPLC (HHPLC (High igh PPressure ressure LLiquid iquid CChromatography) si hromatography) si utilizzano resine con un diametro inferiore rispetto a quelle utilizzano resine con un diametro inferiore rispetto a quelle usate nella cromatografia classica. usate nella cromatografia classica.

aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente aumenta anche la resistenza al flusso dell'eluente ((aumento di pressioneaumento di pressione) )

Colonna cromatografica rivestita in Colonna cromatografica rivestita in acciaioacciaio

numero più alto di piatti teoricinumero più alto di piatti teorici

Le tecniche di centrifugazione si basano sul comportamento delle molecole quando Le tecniche di centrifugazione si basano sul comportamento delle molecole quando esse sono sottoposte ad un campo centrifugo, assumendo che i parametri delle esse sono sottoposte ad un campo centrifugo, assumendo che i parametri delle molecole analizzate – quali la massa molecolare relativa, la forma e la densità – molecole analizzate – quali la massa molecolare relativa, la forma e la densità – siano correlati al loro comportamento in un campo gravitazionale.siano correlati al loro comportamento in un campo gravitazionale.

Particelle in soluzione, se lasciate in condizioni di quiete, tenderanno a Particelle in soluzione, se lasciate in condizioni di quiete, tenderanno a sedimentare per effetto della gravità. Per ogni particella, la velocità alla quale sedimentare per effetto della gravità. Per ogni particella, la velocità alla quale essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata, per cui le particelle essa sedimenta è proporzionale alla forza applicata, per cui le particelle sedimentano più rapidamente quando la forza applicata è maggiore di quella di sedimentano più rapidamente quando la forza applicata è maggiore di quella di gravità esercitata dalla terra.gravità esercitata dalla terra.

In alcuni casi (In alcuni casi (fluidi biologicifluidi biologici) il) il tempotempo impiegato per la sedimentazioneimpiegato per la sedimentazione spontaneaspontaneasarebbe troppo lungo ed alcune particelle impiegherebbero anni per sedimentare.sarebbe troppo lungo ed alcune particelle impiegherebbero anni per sedimentare.

Lo scopo delle tecniche centrifugative è quindi quello di esercitare una forza Lo scopo delle tecniche centrifugative è quindi quello di esercitare una forza maggiore del campo gravitazionale terrestre, aumentando in tal modo la velocità maggiore del campo gravitazionale terrestre, aumentando in tal modo la velocità di sedimentazione delle particelle.di sedimentazione delle particelle.

Ai fini della centrifugazione, le particelle di interesse sono risospese Ai fini della centrifugazione, le particelle di interesse sono risospese in un adatto solvente e poste in provette o bottiglie alloggiate in un in un adatto solvente e poste in provette o bottiglie alloggiate in un rotore.rotore.Il rotore è posto centralmente sull’albero motore della centrifuga.Il rotore è posto centralmente sull’albero motore della centrifuga.

Particelle che differiscono per densità, forma o dimensioni possono Particelle che differiscono per densità, forma o dimensioni possono essere separate poiché sedimentano con velocità diverse quando essere separate poiché sedimentano con velocità diverse quando sono sottoposte ad un campo centrifugo, ogni particella con una sono sottoposte ad un campo centrifugo, ogni particella con una velocità direttamente proporzionale al campo centrifugo applicato. velocità direttamente proporzionale al campo centrifugo applicato.

LaLa velocità di sedimentazionevelocità di sedimentazione dipende dal campo centrifugo applicato (G), diretto dipende dal campo centrifugo applicato (G), diretto radialmente verso l’esterno; il campo è funzione del quadrato della velocità radialmente verso l’esterno; il campo è funzione del quadrato della velocità angolare del rotore (angolare del rotore (ωω, espressa in rad s, espressa in rad s-1-1) e della distanza radiale (r, espressa in ) e della distanza radiale (r, espressa in cm) della particella dall’asse di rotazione, in base all’equazione:cm) della particella dall’asse di rotazione, in base all’equazione:

G = G = ωω22rr

Dunque se la provetta contenente il campione di interesse è fatta ruotare in Dunque se la provetta contenente il campione di interesse è fatta ruotare in circolo, la soluzione è sottoposta ad una forza di gravità artificiale circolo, la soluzione è sottoposta ad una forza di gravità artificiale proporzionale alla distanza dal centro di rotazione ed al quadrato della velocità proporzionale alla distanza dal centro di rotazione ed al quadrato della velocità di rotazione. di rotazione.

Dal momento che ogni rivoluzione del rotore è pari a 2Dal momento che ogni rivoluzione del rotore è pari a 2 radianti, la sua velocità radianti, la sua velocità angolare (in rad sangolare (in rad s-1-1) può essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto ) può essere espressa in termini di rivoluzioni al minuto (rev min(rev min-1-1), che è poi il modo più frequente di esprimere la velocità del rotore:), che è poi il modo più frequente di esprimere la velocità del rotore:

= = 22 rev min rev min-1-1

6060

Il campo centrifugo (G) espresso in termini di rev minIl campo centrifugo (G) espresso in termini di rev min-1-1 diventa quindi: diventa quindi:

G = G = 4 4 22 (rev min (rev min-1-1))22 r r 36003600

Generalmente il campo centrifugo è espresso come multiplo della forza Generalmente il campo centrifugo è espresso come multiplo della forza gravitazionale terrestre (g = 980 cm secgravitazionale terrestre (g = 980 cm sec-2-2), cioè come rapporto tra il peso della ), cioè come rapporto tra il peso della particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa sottoposta alla particella sottoposta al campo centrifugo ed il peso della stessa sottoposta alla sola forza di gravità. Esso è quindi riportato in termini di sola forza di gravità. Esso è quindi riportato in termini di Campo Centrifugo Campo Centrifugo RelativoRelativo (RCF) o, più semplicemente, come “numero di g”. (RCF) o, più semplicemente, come “numero di g”.Quindi:Quindi:

RCF= RCF= 4 4 22 (rev min (rev min-1-1))22 r r3600 x 9803600 x 980

Per il calcolo del Per il calcolo del campo centrifugo relativocampo centrifugo relativo in una centrifuga in una centrifuga si utilizza la seguente formula:si utilizza la seguente formula:

RCF = 1,12r (RPM/1000)RCF = 1,12r (RPM/1000)22

RPM = velocità di rotazione giri minRPM = velocità di rotazione giri min-1-1 (rev min (rev min-1-1) ) r = raggio dell’equipaggiamento espresso in mmr = raggio dell’equipaggiamento espresso in mm

Quando si riportano le condizioni per la separazione delle particelle tramite Quando si riportano le condizioni per la separazione delle particelle tramite centrifugazione devono essere specificaticentrifugazione devono essere specificati velocitàvelocità del rotore, dimensioni del del rotore, dimensioni del raggioraggio ee tempotempo di centrifugazione.di centrifugazione.

Dal momento che le analisi biochimiche sono condotte di solito su particelle Dal momento che le analisi biochimiche sono condotte di solito su particelle disciolte o sospese in soluzione, la loro velocità di sedimentazione dipende disciolte o sospese in soluzione, la loro velocità di sedimentazione dipende non solo dal campo centrifugo applicato, ma anche da:non solo dal campo centrifugo applicato, ma anche da:

1.1. MassaMassa della particella, una funzione del suo volume e della sua densitàdella particella, una funzione del suo volume e della sua densità

2.2. DensitàDensità ee viscositàviscosità del mezzo nel quale essa sta sedimentandodel mezzo nel quale essa sta sedimentando

3.3. Da quanto la sua forma differisce da quella sfericaDa quanto la sua forma differisce da quella sferica

Quando una particella sedimenta deve spostare una parte di liquido nel Quando una particella sedimenta deve spostare una parte di liquido nel quale si trova sospesa, generando una spinta apparente verso l’alto, pari quale si trova sospesa, generando una spinta apparente verso l’alto, pari al peso di liquido spostato. al peso di liquido spostato. Assumendo che una particella sia sferica, con volume e densità noti, dopo Assumendo che una particella sia sferica, con volume e densità noti, dopo aver corretto la sua densità per la “galleggiabilità” dovuta alla densità del aver corretto la sua densità per la “galleggiabilità” dovuta alla densità del mezzo, allora la forza (F) che incontra quando è centrifugata con una mezzo, allora la forza (F) che incontra quando è centrifugata con una velocità angolare velocità angolare ωωradsrads-1-1 è data da: è data da:

F F 44 r rpp33 ( (ρρpp – – ρρmm) ) ωω22rr

33

dove 4/3 dove 4/3 r rpp3 3 è il volume della sfera di raggio rè il volume della sfera di raggio rpp, , ρρpp è la densità della è la densità della

particella, particella, ρρmm è la densità del mezzo in cui essa si trova sospesa, ed r è la è la densità del mezzo in cui essa si trova sospesa, ed r è la

distanza della particella dall’asse di rotazione.distanza della particella dall’asse di rotazione.

Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano nella soluzione;Tuttavia, le particelle generano attrito quando migrano nella soluzione;se si tratta di una particella rigida, di forma sferica che si sposta con una se si tratta di una particella rigida, di forma sferica che si sposta con una velocità nota, la forza di attrito (Fvelocità nota, la forza di attrito (F00) che si oppone al suo spostamento è data ) che si oppone al suo spostamento è data

da: da: FF00 = vf = vf

dove v è la velocità di sedimentazione della particella , ed f è il coefficiente dove v è la velocità di sedimentazione della particella , ed f è il coefficiente d’attrito per quella particella nel solvente.d’attrito per quella particella nel solvente.Il coefficiente d’attrito f di una particella dipende dalle sue dimensioni, forma Il coefficiente d’attrito f di una particella dipende dalle sue dimensioni, forma e grado di idratazione, oltre che dalla viscosità del mezzo. e grado di idratazione, oltre che dalla viscosità del mezzo.

Una particella sferica, non idratata, di volume e densità noti, sospesa in un mezzoUna particella sferica, non idratata, di volume e densità noti, sospesa in un mezzoa densità costante, sottoposta ad un campo centrifugo, è soggetta ad a densità costante, sottoposta ad un campo centrifugo, è soggetta ad accelerazione finchè la forza applicata non diventa uguale alla forza d’attrito che accelerazione finchè la forza applicata non diventa uguale alla forza d’attrito che si oppone al suo movimento nel mezzo. si oppone al suo movimento nel mezzo.

Nella pratica, l’equilibramento tra queste due forze si realizza abbastanza Nella pratica, l’equilibramento tra queste due forze si realizza abbastanza rapidamente, dopo di che la particella si muove con velocità costante, poiché la rapidamente, dopo di che la particella si muove con velocità costante, poiché la forza di attrito aumenta con la velocità della particella. In queste condizioni, la forza di attrito aumenta con la velocità della particella. In queste condizioni, la forza risultante che agisce sulla particella è pari a zero; perciò essa non accelera forza risultante che agisce sulla particella è pari a zero; perciò essa non accelera più, avendo raggiunto la velocità massima che la porta a sedimentare con una più, avendo raggiunto la velocità massima che la porta a sedimentare con una velocità costante.velocità costante.

La velocità di sedimentazione di una particella (v) può anche essere espressa inLa velocità di sedimentazione di una particella (v) può anche essere espressa intermini di velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato, termini di velocità di sedimentazione per unità di campo centrifugo applicato, più comunemente definitapiù comunemente definita coefficiente di sedimentazionecoefficiente di sedimentazione,, ss..

Quando la composizione del mezzo di sospensione è definita, la velocità di Quando la composizione del mezzo di sospensione è definita, la velocità di sedimentazione è proporzionale ad sedimentazione è proporzionale ad ωω22r (G) r (G) → v = s→ v = sωω22rr

Il valore determinato sperimentalmente per di coefficiente di sedimentazione è Il valore determinato sperimentalmente per di coefficiente di sedimentazione è una funzione di temperatura, viscosità e densità della soluzione.una funzione di temperatura, viscosità e densità della soluzione.Per convenzione il coefficiente di sedimentazione determinato è corretto in quel Per convenzione il coefficiente di sedimentazione determinato è corretto in quel valore che si otterrebbe in acqua, a 20°C e viene riportato come coefficiente di valore che si otterrebbe in acqua, a 20°C e viene riportato come coefficiente di sedimentazione standard (ssedimentazione standard (s20,w20,w). ).

s = v / s = v / ωω22rr

Per la maggior parte delle molecole biologiche, i coefficienti di sedimentazione Per la maggior parte delle molecole biologiche, i coefficienti di sedimentazione sono valori molto piccoli, quindi si utilizza come unità di misura sono valori molto piccoli, quindi si utilizza come unità di misura l’unità l’unità SvedbergSvedberg ( (SS), pari a 10), pari a 10-13 -13 s.s.Esempio: una molecola di RNA ribosomale avente coefficiente di Esempio: una molecola di RNA ribosomale avente coefficiente di sedimentazione pari a 5 x 10sedimentazione pari a 5 x 10-13-13 s ha un valore 5 S. s ha un valore 5 S.In generale una particella più grande ha una unità Svedberg maggiore e quindi In generale una particella più grande ha una unità Svedberg maggiore e quindi una maggiore velocità di sedimentazione.una maggiore velocità di sedimentazione.La centrifugazione può essere adoperata per separare molecole con diversi La centrifugazione può essere adoperata per separare molecole con diversi coefficienti di sedimentazione.coefficienti di sedimentazione.

1 10410310210

Rib

onu

clea

si A

(12

.4 k

Da)

Em

oglo

bina

(68

kD

a)

Fib

rino

geno

(33

0 kD

a)

RN

A r

ibos

omal

e (

1100

kD

a)

Rib

osom

a E

.col

i (2

500

kD

a)

Vir

us m

osai

co t

abac

co (

4x10

4 kD

a)

Bat

teri

Lis

osom

i

S

enzimi – enzimi –

ormoni peptidici - ormoni peptidici - proteine solubiliproteine solubili

2 – 25 S2 – 25 S

acidi nucleiciacidi nucleici 3 - 100 S3 - 100 S

polisomipolisomi 20 - 220 S20 - 220 S

virusvirus 40 - 1000 S40 - 1000 S

lisosomilisosomi 4000 S4000 S

membranemembrane 100 - 100.000 S100 - 100.000 S

mitocondrimitocondri 20.000 - 70.000 S20.000 - 70.000 S

nucleinuclei 4x104x1055 – 4x10 – 4x1077 S S

centrifughecentrifughe

separazioni rapide di separazioni rapide di sospensioni grossolanesospensioni grossolane

da bancoda banco

analisi di particelle già pure analisi di particelle già pure per studiare le per studiare le

caratteristiche di caratteristiche di sedimentazione delle sedimentazione delle

macromolecolemacromolecole

analiticheanalitiche

separazioni preparative di separazioni preparative di particelle diverse particelle diverse

fra lorofra loro

preparativepreparative

CENTRIFUGAZIONE DIFFERENZIALE

• Si basa sulla diversa velocità di sedimentazione di particelle con diversa forma e densità

• Il materiale è separato in un certo numero di frazioni per centrifugazioni successive aumentando gradualmente il campo centrifugo applicato

• Si tratta di una metodica adoperata per l'isolamento degli organuli cellulari a partire da omogenati di tessuto

CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀCENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITÀ

Consente di determinare la densità idrostatica ed Consente di determinare la densità idrostatica ed il coefficiente di sedimentazione delle molecoleil coefficiente di sedimentazione delle molecole

Zonale:Zonale:• dipendente dal tempo di centrifugazione dipendente dal tempo di centrifugazione • utilizza un gradiente preformato utilizza un gradiente preformato • la separazione si basa principalmente sulle diverse dimensioni molecolarila separazione si basa principalmente sulle diverse dimensioni molecolari

Isopicnica (uguale densità):Isopicnica (uguale densità):

• è una tecnica all'equilibrioè una tecnica all'equilibrio

• indipendente dal tempo di centrifugazioneindipendente dal tempo di centrifugazione

• utilizza un gradiente autoformantesi utilizza un gradiente autoformantesi

• separa particelle di dimensioni simili (organuli cellulari) ma diverse in densità (nonsepara particelle di dimensioni simili (organuli cellulari) ma diverse in densità (non separa proteine solubili che possiedono densità molto simili)separa proteine solubili che possiedono densità molto simili)

Il gradienteIl gradiente

• è costituito da una materiale inerte nei confronti del materialeè costituito da una materiale inerte nei confronti del materiale biologico (CsCl per acidi nucleici, saccarosio per proteine e biologico (CsCl per acidi nucleici, saccarosio per proteine e particelle subcellulari)particelle subcellulari)

• stabilizza la colonna di liquido all'interno della provettastabilizza la colonna di liquido all'interno della provetta

• previene il rimescolamentopreviene il rimescolamento • migliora la risoluzione della separazionemigliora la risoluzione della separazione

• consente la separazione della maggior parte o, talora, di tutti iconsente la separazione della maggior parte o, talora, di tutti i componenti di una miscelacomponenti di una miscela

ULTRACENTRIFUGA ANALITICAULTRACENTRIFUGA ANALITICA

1.1. determinazione della massa molecolare relativadeterminazione della massa molecolare relativa2.2. analisi delle variazioni conformazionalianalisi delle variazioni conformazionali3.3. studi sulla purezza del campionestudi sulla purezza del campione

Velocità massima= 500.000 g (campo centrifugo relativo)Velocità massima= 500.000 g (campo centrifugo relativo) E’ costituita da: motore, rotore contenuto in una cameraE’ costituita da: motore, rotore contenuto in una camera refrigerata in cui sia fatto il vuoto,refrigerata in cui sia fatto il vuoto, sistema ottico di rivelamento delsistema ottico di rivelamento del campione che sedimenta durante la campione che sedimenta durante la centrifugazionecentrifugazione

DETERMINAZIONE DELLA MASSA MOLECOLAREDETERMINAZIONE DELLA MASSA MOLECOLARE

A)A) Metodo della velocità di sedimentazioneMetodo della velocità di sedimentazione Durante la sedimentazione una molecola tende a diffondere radialmente Durante la sedimentazione una molecola tende a diffondere radialmente nella soluzione in funzione della sua densità.nella soluzione in funzione della sua densità.Tale fenomeno si riflette in un allargamento del picco di sedimentazione.Tale fenomeno si riflette in un allargamento del picco di sedimentazione.Essendo costante la v di sedimentazione è possibile risalire al coefficiente Essendo costante la v di sedimentazione è possibile risalire al coefficiente di diffusione D misurando l’incremento dell’area del picco in funzione di diffusione D misurando l’incremento dell’area del picco in funzione del tempo.del tempo.

Equazione di Svedberg:Equazione di Svedberg:

PM sRTPM sRT D(1-vD(1-vρρmm))

volume specifico parzialevolume specifico parziale = l’aumento di volume che si verifica = l’aumento di volume che si verifica quando 1 g di soluto è aggiunto ad un volume infinito di quando 1 g di soluto è aggiunto ad un volume infinito di soluzione soluzione

B) Equilibrio di sedimentazione (l’equilibrio è tra la forza centrifuga che fa sedimentare la molecola e la tendenza di questa a diffondere nel solvente)

Facendo girare il rotore a basse velocità la molecola si dispone nella cella secondo un gradiente di concentrazione che va dal menisco al fondo della cella. Si misurano due valori di concentrazione della molecola (ca e cb)in due punti che distano diversamente dal centro di rotazione (ra e rb, rb>ra).

PM = 2 RT ln(cb-ca) ω2(1-vρ) (r2

b-r2a)

ccii : concentrazioni a distanza r : concentrazioni a distanza rii dall’asse di rotazione dall’asse di rotazione

R: costante dei gasR: costante dei gasT: temperatura in KelvinT: temperatura in Kelvin

ANALISI DELLE VARIAZIONI CONFORMAZIONALIANALISI DELLE VARIAZIONI CONFORMAZIONALI

Le variazioni conformazionali di una molecola possono essere saggiate Le variazioni conformazionali di una molecola possono essere saggiate esaminando le differenze di velocità di sedimentazione.esaminando le differenze di velocità di sedimentazione.

Molecola più compatta minore attrito con il solventeMolecola più compatta minore attrito con il solvente

Molecola meno compatta Molecola meno compatta maggiore attrito maggiore attrito (sedimentazione più lenta) (sedimentazione più lenta)

DNA a singola o doppia elicaDNA a singola o doppia elica DNA lineare o circolareDNA lineare o circolare

Proteine trattate con urea o altri denaturanti possono essere Proteine trattate con urea o altri denaturanti possono essere disaggregate nelle subunità costituenti (protomeri)disaggregate nelle subunità costituenti (protomeri)

Proteine allosteriche possono subire variazioni conformazionali in Proteine allosteriche possono subire variazioni conformazionali in seguito al legame col substrato e/o piccoli ligandi (attivatori e seguito al legame col substrato e/o piccoli ligandi (attivatori e inibitori)inibitori)

L'ultracentrifugazione analitica è utilizzata per determinare la purezza delle L'ultracentrifugazione analitica è utilizzata per determinare la purezza delle preparazioni di:preparazioni di:

• DNADNA• VirusVirus• ProteineProteine

L'omogeneità della soluzione è verificata mediante l'analisi del fronte di L'omogeneità della soluzione è verificata mediante l'analisi del fronte di sedimentazione (essa è generalmente caratterizzata da un unico e ben sedimentazione (essa è generalmente caratterizzata da un unico e ben definito fronte di sedimentazione)definito fronte di sedimentazione)

Le impurità si traducono in picchi addizionali, spalle del picco principaleLe impurità si traducono in picchi addizionali, spalle del picco principale o asimmetria del piccoo asimmetria del picco

STUDI SULLA PUREZZA DEL CAMPIONESTUDI SULLA PUREZZA DEL CAMPIONE