Cromossomo X

Mamíferos: fêmeas XX e machos XY

inativação de um dos cromossomos X durante o desenvolvimento inicial.

compensação de dose nas fêmeas

Inativação do X

• Três “ondas” de inativação:– Trofoectoderme – Endoderme primitiva do blastocisto

Inativação sujeita ao impriting, exclusiva do X paterno (Xp)– Células do epiblasto originadas da massa de células

interna (ICM)

Inativação aleatória (Xp ou Xm)

Tecidos extraembrionários

Xist

• Responsável pela inativação do X.

• RNA não traduzido.

• Cobre o cromossomo X in cis.

• Causa o silenciamento de genes do cromossomo X que cobriu.

• Cromossomo X ativo: Xist inativo.

• Cromossomo X inativo: Xist ativo.

Xist

• Em células do tecido embrionário: – “encapamento” do cromossomo X pelo Xist é

rapidamente seguido de silenciamento gênico.

• Durante o desenvolvimento inicial:– Expressão do Xist a partir do estágio de duas a

quatro células.– Expressão apenas de origem paterna.– Expressão do Xist materno: apenas no estágio

de mórula.

• Primeiros sinais citológicos detectáveis da inativação do X: apenas no estágio de cinquenta células.

• Logo após a fertilização: Xm e Xp ativos.• Estudos com RT-PCR: alguns genes paternos já

possuem transcrição diminuída na embriogênese inicial.

• Predisposição do X paterno à inativação: devido à sua passagem pela linhagem geminativa masculina (vesícula sexual).

Muitas questões não resolvidas a respeito da iniciação e cinética da inativação do X

Xist e mudanças iniciais na cromatina do Xp

• Exame do Xp “encapado” com Xist durante a embriogênese pré-implantação.

• Embriões nos estágios de duas células até blastocisto.

• Análise direta, sem cultura in vitro. • Hibridização in situ com RNA fluorescente

(FISH). • Imunofluorescência.

Metodologia

Detecção de Xist

• Acúmulo de Xist em todos os blastômeros interfásicos a partir do estágio de quatro células.

• Estágio de duas células: pequeno sinal de Xist.

Estado inicial da cromatina no Xp

• Fisch• Imunofluorescência H3K9 e H3K27 e

interações com Eed e Enx1

características de cromossomos X em inativação

* H3K9 está associada com o Xp durante a espermatogênese

• Estágio de quatro a oito células: – Não há acumulação de H3 metilada em K9 ou

K27.

Estado inicial da cromatina no Xp

– Não há acumulação de Eed e Enx1.

• Estágio de 16 células:

– Detecção destes marcadores em alguns blastômeros.

• Acumulação dos marcadores no Xp tem intervalo similar

• Enx => metiltransferase de histonas que metila a K27

• H2A => acumula no mesmo intervalo de tempo que esses marcadores.

Mudanças principais na cromatina do Xp começam neste estágio (16 células)

Estado inicial da cromatina no Xp

• Proporção de blastômeros que contêm os marcadores varia nos estágios de 16 a 32 células.

• Blastocisto: 90% dos blastômeros possuem os marcadores.

* Metilação na H3K9 começa mais tarde (32 células) => marcador independente

Estado inicial da cromatina no Xp

• Outras análises:– hipoacetilação da H3K9 – hipometilação da H3K4

Estado inicial da cromatina no Xp

eventos iniciais na inativação do X em células de tecidos embrionários

•4 células: nenhum sinal destas modificações

•8 células: detectados em alguns blastômeros

•32 células: mais de 90% dos blastômeros

ocorrem após o “empacotamento” pelo Xist mas antes dos outros marcadores

Xist e atividade transcricional do Xp

Metodologia

• Análise do silenciamento do Xp em nível transcricional em células únicas.

• Anticorpo (H5): reconhece a forma elongadora da RNA PolII (presente em cromatina transcricionalmente ativa).

• Em células ES em diferenciação: exclusão da RNA PolII do cromossomo X logo após o empacotamento pelo Xist.

• Em embriões na pré-implantação:

• 2 células: não há exclusão da RNA polII.

Atividade transcricional do Xp

•4 células: primeiros sinais de exclusão.

•32 células: quase 100% de exclusão.

• Confirmação do silenciamento transcricional de Xp:

• RNA FISH para detectar transcritos do gene Chic1/Brx do cromossomo X.

Atividade transcricional do Xp

• 8 células: um sinal dentro do domínio do Xist em alguns blastômeros.

•16 células: sinal não é mais visto em mais de um blastômero.

• 2 células: dois sinais de transcrição, um adjacente ao Xist em alguns embriões.

• Início da inativação da transcrição do Xp: – Estágio de quatro a oito células

• Inativação do Xp:– No estágio de 32 células atinge a grande

maioria dos blastômeros

Atividade transcricional do Xp

Inativação do X começa bem antes da diferenciação celular

Blastômeros contêm o Xp inativo

• Exclusão de Pol II

• Modificação de histonas

• Associação de Eed/ Enx1

Blastômeros contêm o Xp inativo

• Presença de RNA Xist• Presença de Eed e Enx1

Inativação de Xp no ICM• Imunocirurgia: retirada do trofoectoderma

• Blastocistos no início:– Presença de RNA Xist– Exclusão de RNA Pol II– Hipoacetilação na H3K9– Hipometilação na H3K4– Metilação na H3K9 e K27– Acumulação de Eed e Enx1

Inativação de Xp no ICMBlastocisto no início

• Acumulação de Eed e Enx1

Inativação de Xp no ICM Blastocisto no início

• Metilação na K27

Inativação de Xp no ICM• Blastocistos tardios:

– RNA xist estava disperso ou ausente– Ausência de acumulação de Eed e Enx1– Metilação na H3K27

• Blastocistos no início cultivados por 24hs– Presença de RNA xist e as características da

mórula e trofoectoderma

• Blastocistos tardios cultivados por 24hs– Perda de RNA xist, Eed e Enx

Inativação de Xp no ICMBlastocisto tardio

• Ausência de acumulação de Eed e Enx1

Inativação de Xp no ICM Blastocisto tardio

• Metilação na H3K27

Inativação de Xp no ICMBlastocisto em cultura

• Presença de RNA Xist

Inativação de Xp no ICM

Conclusão

Conclusão

Conclusão• Ciclo dinâmico da inativação de Xp

Xp inativado – reativação – inativação randômica

Esse estudo propõe que RNA Xist é o único imprint necessário para levar modificações

na cromatina que levam a inativação preferencial do Xp.