CTB Biorreactores

7/14/2019 CTB Biorreactores

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BiotecnologBiotecnologa Industriala Industrial

ProducciProduccin industrial de Metabolitosn industrial de Metabolitos

BiorreactoresBiorreactores

CONCEPTOS y TECNICAS deCONCEPTOS y TECNICAS de

BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA

((FCEyNFCEyN UBA )UBA )

Miryan CassanelloPINMATE Dep. Industrias, FCEyN-UBA

E-mail: [email protected]


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Estadstica: ao 2002(Fuente: Kent y Riegel, 2007)

Relevancia econmica de losproductos generados industrialmente

mediante procesos biotecnolgicos

ProductosProductosbiotecnolbiotecnolgicosgicos:: estn en todos los sectores de la

drogas (genricasy no-genricas)

productos de

bellezaprocesamiento dealimentos parahumanos y

animalesprocesamientotextil y artculosde limpieza

aplicacionesindustriales:

produccin masivade alcohol

suplementosnutricionales

vida diaria:


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Productos Organismo tpico utilizado Mercado

mundial(ton/ao)

Alcoholes Etanol Saccharomyces cerevisiae 20 millones

Butanol/acetone Clostridium acetobutylicum 2.000

cidosorgnicos

Acido ctrico Aspergillus niger 230.000

Acido glucnico Aspergillus niger 50.000

Acido lctico Lactobacillus delbrueckii 20.000

Aminocidos Acido L-glutmico Corynebacterium glutamicum 300.000

L-lisina Brevibacterium flavum 30.000

L-fenilalanina Corynebacterium glutamicum 2.000

L-arginina Brevibacterium flavum 2.000Antibiticos Penicilinas Penicillium chrysogenum 40.000

Cefalosporinas Cephalosporium acremonium 10.000

Tetraciclinas Streptomyces aureofaciens 10.000

Productos obtenidos mediante procesos biotecnolProductos obtenidos mediante procesos biotecnolgicosgicos

(Fuente: Doran, 1995)(Fuente: Doran, 1995)


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Producto Organismo tpico utilizado Mercado mundial

(ton/ao)Enzimas Proteasas Bacillus spp. 600

-Amilasa Bacillus amyloliquefaciens 400

Glucoamilasa Aspergillus niger 400

Glucosa isomerasaBacillus coagulans 100

Pectinasa Aspergillus niger 10

Polmeros Xantanos Xanthomonas campestris 5.000

Dextrano Leuconostoc mesenteroides 200Vitaminas B12 Propionibacterium shermanii 10

Vacunas Difteria Corynebacterium diphterie < 50 kg/ao

Ttanos Clostridium tetani Pequea

Protenasteraputicas

Insulina Escherichia coli recombinante < 20 kg/ao

Interfern-2 Escherichia coli recombinante 10

Hormona de

crecimiento

Escherichia coli recombinante o

clulas recombinantes de

mamferos

Pequea


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BiotecnologBiotecnologaa

ROJAROJA


BLANCABLANCA


VERDEVERDE


AZULAZUL

Biotecnologa BLANCA (o industrial):Aplicacin en la industria en general,

productos qumicos, nuevos materiales,biocombustibles, etc.

Biotecnologa VERDE:Aplicacin en agro-alimentos

Biotecnologa AZUL:Aplicacin enorganismos marinosBiotecnologa ROJA:

Aplicacin en medicina

IngenierIngenieraa QuQumicamica

QuQumicamica

BiologBiologaa

BioquBioqumicamica


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INDUSTRIALINDUSTRIAL

Biotecnologa : actividad multidisciplinaria que comprende la

aplicacin de los principios cientficos y de la ingeniera al

procesamiento de materiales por agentes biolgicos para proveer

bienes y servicios. (Definicin de la OECD)

Agentes biolgicos: clulas microbianas, animales, vegetales y

enzimas.Bienes: cualquier producto industrial (alimentos, bebidas,

productos medicinales, etc.

Servicios: especialmente los relacionados con la purificacin deaguas y tratamiento de efluentes.


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Bibliografa libros de texto

Bioprocess Engineering. Basic concepts, Michael L. Shuler, FikretKargi, Prentice Hall Int. Series, 2nd Ed. 2002.

Kent and Riegels Handbook of Industrial Chemistry and

Biotechnology, J.A. Kent (Ed.), Chapter 30: Industrial

Biotechnology: Discovery to Delivery, G. Chotani, T. Dodge, A.Gaertner, M. Arbige, Springer, 11th Ed. 2007.

Principios de Ingeniera de los bioprocesos, Pauline M. Doran,

Editorial Acribia S.A, Zaragoza, Espaa. 1995. (Traducido 1998)Biochemical Engineering Fundamentals, James E. Bailey, David. F.

Ollis, McGraw-Hill Int. Ed., 2nd. Ed. 1986.

Biochemical engineering and biotechnology, Ghasem Najafpour,Elsevier, (2007) ISBN-10: 0444528458; ISBN-13: 978-0444528452

Bioreaction Engineering Principles, Jens Nielsen, John Villadsen,

Gunnar Lidn. Springer, 2da. Ed. (2005). ISBN-10: 0306473496;

ISBN-13: 978-0306473494


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Bibliografa algunos reprints de biotecnologia industrialXu, J., Ge, X., Dolan, M.C., Towards high-yield production of pharmaceutical

proteins with plant cell suspension cultures.Biotechnology Advances 29 (2011)278299

Brennan, L., Owende, P., Biofuels from microalgaeA review of technologies for

production, processing, and extractions of biofuels and co-products.Renewable and

Sustainable Energy Reviews 14 (2010) 557577Huang, T-K., McDonald, K.A., Review: Bioreactor engineering for recombinant

protein production in plant cell suspension cultures.Biochemical Engineering

Journal 45 (2009) 168184

Rosche, B., Li, X.Z., Hauer, B., Schmid, A., Buehler, K., Microbial biofilms: aconcept for industrial catalysis? Trends in Biotechnology 27 (2009) 636643Lacaze, G., Wick, M., Cappelle, S., Emerging fermentation technologies:

Development of novel sourdoughs. Food Microbiology, 24 (2007) 155160

Gavrilescu, M., Chisti, Y., Biotechnologya sustainable alternative for chemical

industry. Research review paper.Biotechnology Advances, 23 (2005) 471499Butler, M., Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the

production of biopharmaceuticals.Appl Microbiol Biotechnol, 68 (2005) 283291Kretzmer, G., Industrial processes with animal cells.Appl Microbiol Biotechnol, 59

(2002) 135142


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Objetivo de la

produccin

industrial de

clulas o de

microorganismos

Producir las mismas clulas omicroorganismos (biomasa) en

gran escala

Producir en gran escala

compuestos (intracelulares o

extracelulares) resultantes del

crecimiento celular

(metabolitos)

Metabolitos

Primarios

Metabolitos

Secundarios


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Metabolitos primariosMetabolitos primarios

-Molculas generalmente sencillas, que participan de los caminosmetablicos esenciales. Son casi idnticos en todos los organismos.

-Son ms baratos y sencillos de producir, tienen bajo contenido de

actividad biolgica y frecuentemente son commodities

1. Componentes esenciales de las clulas/microorganismos:

protenas, cidos nuclicos, polisacridos (gelanos, xantanos) y

polisteres, cidos grasos (insaturados), esteroles.

2. Derivados del metabolismo intermedio: azcares (fructosa,ribosa, sorbosa), cidos orgnicos (gluconato, cido lctico,

ctrico, actico, propinico, succnico, fumrico), alcoholes

(xilitol, etanol, glicerol, sorbitol, butanol), aminocidos (Lys,Thr, Glu, Trp, Phe), vitaminas (B2, B12), nucletidos

saborizantes (cidos inocnico y guanlico), polisacridos y

polisteres de reserva.

Microorganismos productores:bacterias, levaduras y hongos


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Metabolitos secundariosMetabolitos secundarios

-Molculas mas complejas, que participan de caminos metablicosno-esenciales, pero confieren capacidades de supervivencia en

situaciones de stress.

-Son muy variados y su estructura es fuertemente dependiente de la

especie y variedad utilizada para su produccin. Se generan en

condiciones particulares y son ms valiosos y complicados de

producir alto contenido de actividad biolgica

-Generalmente son productos especiales (alto precio). Funcionanen los organismos que los producen como:

1. Armas contra otros microorganismos (antibiticos, toxinas,

inhibidores enzimticos, pesticidas)2. Factores de crecimiento (hormonas)

3. Ionforos

4. Agentes de interaccin microbiana

5. Efectores externos


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PROCESOS BIOTECNOLOGICOS oPROCESOS BIOTECNOLOGICOS o

FERMENTACIONESFERMENTACIONES

Biorreactoro

Fermentador

Procesos que se llevan a cabo en un bio-reactor mediante los cuales

se transforman los sustratos de un medio de cultivo (materias primas)

en metabolitos y/o en biomasa (productos) empleando para este finmicroorganismos, clulas o enzimas.

Operacionesunitarias

Operacionesunitarias


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Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:

1)Propagacin de cultivos: comienza en un tubo de ensayo o un tubo

congelado o liofilizado donde se conserva la cepa de inters, o de

una colonia del microorganismo previamente seleccionado. Se

propaga en el laboratorio progresivamente aumentando el volumen

del medio de cultivo.

Esterilizacin

Preparacin de

medios

FermentacinSeparacin

Purificacin

Propagacin

de los cultivos

2)Fermentacin: Se prepara el medio de nutrientes y se esteriliza. Se

siembra un tanque de inculos cuyo volumen depende de la escala

industrial. Vinoculos~50-1000L y Vfermentador industrial~10-1000 m3).

Tratamiento

de efluentes


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3)Separacin y purificacin: operaciones mecnicas de ruptura de

clulas; separacin de insolubles por filtracin, centrifugacin osedimentacin; separaciones primarias por extraccin, absorcin,

adsorcin, ultrafiltracin; purificacin por extraccin lquido-

lquido, extraccin en dos fases acuosas o cromatografa de

afinidad; aislamiento y acondicionamiento del producto.

Principales etapas de un proceso biotecnolPrincipales etapas de un proceso biotecnolgico industrial:gico industrial:

Esterilizacin

Preparacin demedios

FermentacinSeparacin

Purificacin

Tratamiento

de efluentes

Propagacin

de los cultivos

4)No tiene relacin directa con el producto pero es una etapa

imprescindible por los volmenes involucrados y para preservar el

medio.


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SelecciSeleccin (n (screeningscreening))

En la seleccin del microorganismo/clula, se debe tener en cuenta:

1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.

2. La velocidad de crecimiento debe ser alta.

3. La cepa debe estar libre de contaminantes.

4. Sus requerimientos nutricionales deben cubrirse con medios de

cultivo de costo reducido.

5. Deben ser de fcil conservacin por largos perodos de tiempo sin

prdida de sus caractersticas.

6. Debe realizar el proceso fermentativo completo en tiempo corto.

7. Si el objetivo es un producto, este debe ser de alto rendimiento y

de fcil recuperacin a partir del medio de cultivo.


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Los nuevos mtodos de screening incorporan tcnicas de ingeniera

gentica para crear diversidad.


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PreparaciPreparacin de medios de cultivon de medios de cultivoEsterilizaciEsterilizacinn

Los componentes de los medios de cultivo son los efectoresexternos de naturaleza qumica que deben cumplir con los

requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y

suministrar energa para el mantenimiento celular.

Componentes de un medio de cultivo:

1. Macronutrientes, agregados en concentraciones de g/L, fuentes

de C, N, S, P, K y Mg

2. Micronutrientes o elementos trazas, representados por las sales

de Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co, agregados en conc. de mg o g/L

3. Factores de crecimiento, constituidos por compuestos orgnicos

que no son sintetizados por las clulas y de funcin metablica

especfica; se suministran en baja concentracin (vitaminas,

algunos aminocidos, etc.)


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PreparaciPreparacin de medios de cultivon de medios de cultivoEsterilizaciEsterilizacinn

Los medios pueden clasificarse considerando la naturalezaqumica de los componentes en:

1. Medios sintticos o medios qumicamente definidos

2. Medios complejos, en cuya composicin intervienen

sustancias de origen animal o vegetal (ej.: extracto de

levadura, macerado de maz, harina de soja, etc.) que aportan

las sustancias fundamentales pero son qumicamenteindefinidas y de composicin variable.

Cualquiera sea el medio de cultivo, se debe esterilizar previamente

a ponerse en contacto con el inculo.Esterilizar significa eliminartoda forma de vida de un medio o material. Generalmente se lleva

a cabo por filtracin o calentamiento.


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SeparaciSeparacin y purificacin y purificacin (n (downstreamdownstream)): depende de la

eficiencia del proceso y del producto a obtener


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Cintica de crecimiento de biomasa

Definiciones

Crecimiento en cultivos discontinuos o batch: Factores que afectan

Cuantificacin de la velocidad de crecimiento: Modelos, Ecuacin

de Monod

Crecimiento en cultivos continuos: Quimiostato, turbidistato

FermentacionesFermentaciones --fermentadores ofermentadores obiorreactoresbiorreactores

Es el corazn del proceso y debe optimizarse para evitar posterioresetapas de separacin y purificacin.

Fermentaciones

Para el diseo de los biorreactores se debe considerar la cintica del

crecimiento de las clulas o microorganismos (biomasa) y la

velocidad de formacin de los productos deseados.

discontinuas o batch

semicontinuas (fed-batch)

continuas


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CinCintica de crecimiento microbianotica de crecimiento microbiano

nXPXS ++

El crecimiento microbiano es un ejemplo de reaccin auto-cataltica. La velocidad de crecimiento est relacionada con la

concentracin de clulas.

biomasade

cantidadmayor

aresextracelul

productosbiomasaustratoS ++

aumento en el nmero de clulas

aumento del tamao de las clulasCrecimiento

dtdX

X1

neta X: concentracin msica de clulas (g/L)

t: tiempo (h)

Velocidad especfica neta decrecimiento (h-1):


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La velocidad especfica neta de crecimiento es la diferencia entre la

velocidad de crecimiento y la velocidad de desaparicin de biomasa

por muerte celular o por metabolismo endgeno:

Tambin se puede expresar la velocidad en funcin de la

concentracin de nmero de clulas en lugar de la concentracin

msica de las mismas. Si no se pueden medir las dos, se prefierela concentracin msica.

Formas de medir la concentracin de clulas

Directos

IndirectosMtodos

Se busca un mtodo rpido, fcil de seguir en lnea o de respuestarpida.

dgnetak=


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DeterminaciDeterminacin de la concentracin de la concentracin mn msica de csica de clulas:lulas:

Mtodos directos (en ausencia de otros slidos en suspensin):Masa de clulas secas (centrifugado/filtrado/lavado/secado)

Volumen de clulas centrifugadas en condiciones estndar

Absorcin de luz por clulas en suspensin

Mtodos indirectos: se basan en un efecto que inducen, como ser la

velocidad de consumo de un sustrato o de formacin de un producto.

Productos: etanol, CO2Sustratos: consumo de O2 o de un sustrato base de C o N

Propiedades fsico-qumicas: viscosidad, pH

Ejemplo: seguir la concentracin de ATP, proporcional a la masade clulas.

UZLOATPuciferinalluciferasa

2 ++

Sensible

> 10-12 gATP/L


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CinCintica de crecimiento de un cultivo entica de crecimiento de un cultivo enbatchbatch

Etapas:Etapas:

1) de latencia o

induccin

2) de crecimientoexponencial

3) de desacelera-

cin

4) estacionario

5) de muerte odeclinacin

celular

1)1)LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende del inculo(edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptarex-situ.

2)2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulascrecimiento balanceado (composicin de clulas constante).

3)3)DesaceleraciDesaceleracin:n:por consumo de un nutriente esencial o generacin desubproductos txicoscrecimiento desbalanceado, las clulas deben

readaptarse a las condiciones hostiles.

4)4)Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas an son

activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej. antibiticos,hormonas) productos de la desregulacin celular

5)5)Muerte:Muerte:baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite con la

etapa anterior.


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1)1)LatenciaLatencia:: adaptacin del inculo al medio. Depende del

inculo (edad y tamao) y de los nutrientes. Se puede adaptarex-situ.

2)2) Crecimiento exponencial:Crecimiento exponencial: rpida multiplicacin de clulascrecimiento balanceado (composicin de clulas constante).

3)3)DesaceleraciDesaceleracin:n:por consumo de un nutriente esencial ogeneracin de subproductos txicoscrecimiento

desbalanceado, las clulas deben readaptarse a las condiciones

hostiles.

4)4)Estacionario:Estacionario: velocidad de crecimiento nula. Las clulas anson activas y pueden producir metabolitos secundarios (ej.

antibiticos, hormonas) productos de la desregulacin celular

5)5)Muerte:Muerte:baja el nmero de clulas, difcil definir el lmite conla etapa anterior.


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t

0netanetag

netaeXXdtX

dX

dt

dX

X

1 ===

Crecimiento balanceado: todos los componentes de las clulas

crecen con la misma velocidad

la composicin media de lasmismas permanece constante. Es vlido para la etapa de crecimientoetapa de crecimiento

exponencialexponencial.

En este perodo, la velocidad de crecimiento es independiente de los

nutrientes y resulta en una cintica de primer orden.

netad0

)2ln(X2X

==

Tiempo necesario para duplicar la biomasa:


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Crecimiento no balanceado: los componentes de las clulas no

crecen con la misma velocidad

la composicin media se modifica.Esta situacin caracteriza especialmente a la etapa estacionariaetapa estacionaria

El estrs producido por la falta de nutrientes o por la existencia de

subproductos o toxinas inhibidoras que generan un medio hostil

induce una reestructuracin de las clulas para adaptarse a las nuevascondiciones.

dgnetagk=

Puede ocurrir:La concentracin msica de clulas (X) es constante pero baja el

nmero de clulas viables.

X baja por lisis de clulas. Puede aparecer un segundo perodo

de crecimiento, los productos de lisis o las clulas muertasconstituyen un sustrato alternativo (crecimiento crptico).

X constante pero su metabolismo es activo; cambia la regulacin

celular produciendo metabolitos secundarios.


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Coeficiente de mantenimientoCoeficiente de mantenimiento:: se emplea para definir la velocidad

especfica de consumo de sustrato para energa de mantenimiento.

mdtSd

X1-m =

EnergEnerga de mantenimientoa de mantenimiento:: necesaria

para mantener la membrana celular activa

y el transporte de nutrientes, y parafunciones metablicas esenciales como la

movilidad y la reparacin de estructuras

daadas.

Si no hay sustrato disponible, el mantenimiento inducir prdida de

masa celular (metabolismo endgeno para adaptarse al medio).


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Otras definiciones: Coeficientes de rendimientoOtras definiciones: Coeficientes de rendimiento: se definen en base

a la cantidad consumida de otro componente.

Rendimiento de formacin de clulas por masa

de sustrato consumida (g clulas/g S)

YX/S es un valor constante en la etapa de

crecimiento exponencial.Luego de la etapa de crecimiento exponencial, YX/S deja de ser

constante, es un rendimiento aparente porque el sustrato se emplea

para otros fines:

tenimiento-manpara

energia

cimiento-crepara

energiaproductosde

formacionbiomasade

formacionSSSSS +++=

Tambin se pueden definir rendimientos basados en otros componentes:

S

PY;

DO

XY

P/SOX 2

=

=

/

S

XY

S/X =


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g/g4,19,0Y;g/g6,04,0Y2X/OS/X

==

Ejemplo: Organismos creciendo en condiciones aerbicas en glucosa;

para la mayora de las bacterias y levaduras:

(en condiciones anaerbicas suelen ser menores)

Los rendimientosdependen del medio

y de la fuente de C.

Para la mayora delos casos:

=

consumidoCdegbiomasag

g/g4,01YS/X


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(c) qP no-asociada al crecimiento celular (etapa estacionaria, donde

la g=0) ej.: metabolitos secundarios como antibiticos.

RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del crecimiento de biomasa con la formacin den de

productos:productos:

gX/PPY

dt

dP

X

1q ==Definimos la velocidadespecfica de formacinde producto, qP

X/PgP

Yq ==

+= gP

q

Se encuentran 3 situaciones:

(a) qP asociada al crecimiento celular, ej: produccin de una

enzima constitutiva de la biomasa (metabolito primario).

(b) qPparcialmente asociada (etapa de desaceleracin y

estacionaria), ej: fermentacin de cido lctico, xantanos y algunos

metabolitos secundarios.

0;tetanconsq gP ===


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RelaciRelacin del crecimiento de biomasa con la formacin del crecimiento de biomasa con la formacin den de

productos:productos:

dt

dX

X

1YY

dt

dP

X

1q

X/PgX/PP===

gPq = +=

gPq =

Pq

Asociada Parcialmente asociada No asociada

Metabolitos primarios Metabolitos secundarios


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Factores que influyenFactores que influyen Temperatura del medioTemperatura del medio

-psicrfilos (Top < 20C)

-mesfilos (20


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Por encima de Top ocurre muerte celular disminuye el nmero

de clulas viables cuando la velocidad de muerte supera la decrecimiento.

Ambas velocidades siguen una ecuacin tipo Arrhenius con

Ea 1020 kcal/mol Ed 6080 kcal/mol

La muerte celular es ms sensible a T que el crecimiento(importante para la esterilizacin)

La T tambin afecta la velocidad de formacin de producto pero

la Top

y la Ea

suelen ser distintas.

Tambin influye sobre el YX/Sporque para T>Top, la energa de

mantenimiento es mayorbaja YX/S

Para organismos inmovilizados puede cambiar el control.

)/exp(' RTEA ag = )/exp( RTEAk ddd =

Factores que influyenFactores que influyen pHpH del mediodel medio


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Factores que influyenFactores que influyenpHpHdel mediodel medio

Variacin de la velocidad especfica de crecimiento con el pH. Existe un

pH ptimo para cada tipo de clula, generalmente prximo a 7. Se puedeincrementar el rango adaptando las clulas por incrementos pequeos.

Rango de

pH ptimo


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El pH ptimo suele ser distinto para el crecimiento que para la

formacin de producto.

Los pH aceptables varan en 1 o 2 unidades respecto del ptimo.

El pH ptimo depende de la biomasa, el rango va de 3 a 8.

- levaduras: 3 6- hongos: 3 7

- clulas vegetales: 5 6

- clulas animales: 6,5 7,5Algunos organismos pueden regular el pH empleando energa de

mantenimiento.

El pH puede variar mucho por efecto del medio (fuente de N,aminocidos, CO2)

Factores que influyenFactores que influyen concentraciconcentracin de On de O

disuelto (DO):disuelto (DO):


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Factores que influyenFactores que influyenconcentraciconcentracin de On de O22disuelto (DO):disuelto (DO):

Es un sustrato importante para las fermentaciones aerbicas.

Debido a la baja solubilidad del O2 en agua, puede ser un limitante de

la velocidad de crecimiento.

La solubilidad del oxgeno en agua depende de la presin, de la

temperatura y de las sales disueltas (a presin atmosfrica es 7ppm).

La concentracin crtica de oxgeno

disuelto CO2,critica es aquella por debajo

de la cual comienza a controlar lavelocidad de crecimiento:

510% de la concentracin de

saturacin para bacterias y levaduras y

1050% de la concentracinde saturacin para hongos (segn

el tamao)

Transporte de oxgeno a las clulas


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Transporte de oxgeno a las clulas

El O2 se

introduce por

burbujeo y su

concentracin

depende de la

agitacin.

=

bO*OLGL

22

CCakOTR

Velocidad de consumo

de oxgeno (OUR):2

2O/X

g

O Y

X

XqOUR

==

Velocidad detransferencia:


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Factores que influyenFactores que influyenotros factoresotros factores

Potencial redox: afecta las reacciones de xido-reduccin. Esta relacionado

con la concentracin de O2, el pH y las concentraciones de otros iones.Potencial de reduccin del medio:

Se puede reducir bajando la concentracin de O2 (burbujeo de nitrgeno) o

por agregado de agentes reductores (cistena, Na2S, HCl).

Concentracin de CO2 disuelta puede afectar. Puede ser txica para algunas

clulas y necesaria para otras.

Se regula modificando la concentracin en la corriente de burbujeo.

Fuerza inica: afecta el transporte de ciertos nutrientes desde y hacia el

interior de las clulas. Depende de la concentracin y de la carga de los iones

en el medio:

( ) ( )+

++= HP060EmVE 2O0 loglog,

=i

2ii

2

1 ZcFI

G iG i d l i i t i bid l i i t i bi


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GeneraciGeneracin de calor por crecimiento microbianon de calor por crecimiento microbiano

4050% de la energa suministrada por las fuentes de C se

convierten en ATP (forma en que las clulas acumulan energa)

el resto se libera como calor.

El calor liberado se puede calcular a partir de las entalpas de

combustin del sustrato y de la biomasa formada:celulasOHCO

22++

Ciclo entlpico

para calcular elcalor generado

Combustin de

las clulasHc (kJ/g)

Crecimiento

microbiano yrespiracin1/YH (kJ/g clula)

OHCOOSustrato22

)g/kJ(Hsustrato,

delcombustion

2S + +

cS/XS

S/XH

Hc

S/X

S

HYH

YY

Y

1H

Y

H

=+=


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Algunos valores tpicos: Hc ~ 20 25 kJ/g clulasYH ~0,42 g/kcal (glucosa); 0,30 g/kcal (malato); 0,18 g/kcal (etanol)

0,12 g/kcal (metanol); 0,061 g/kcal (metano)

El grado de oxidacin del sustrato afecta fuertemente la cantidad de

calor que evoluciona por el metabolismo de las clulas.

Para clulas en crecimiento activo, el requerimiento para

mantenimiento es bajola evolucin de calor est directamente

relacionada con el crecimiento.

Velocidad total de generacin de calor en una fermentacin batch se

calcula considerando la velocidad de crecimiento.

En una fermentacin aerbica, se correlaciona con la velocidad de

consumo de oxgeno, dado que es el aceptor final de electrones.

VY

1XQ

H

netagenerado=

2Ogenerado Q12,0Q =

Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa


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Configuraciones de refrigerantes en biorreactores: (a) camisa externa

(b) serpentn externo (c) serpentn interno helicoidal (d) serpentn

interno tipo deflector (e) intercambiador de calor externo


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ReactorReactorbatchbatchdede

escala laboratorioescala laboratorio


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ReactorReactorbatchbatchdede

escala industrialescala industrial

EstequiometrEstequiometraa del crecimiento microbiano y formacidel crecimiento microbiano y formacin den de


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EstequiometrEstequiometraadel crecimiento microbiano y formacidel crecimiento microbiano y formacin den de

productosproductos Procesos complejosreflejan el transcurso de milesde reacciones intracelulares.

Es importante poder comparar el rendimiento y la generacin de calor

que se obtiene empleando distintos sustratos la estequiometra de

conversin de sustratos a biomasa y a productos extracelulares sesuele representar por ecuaciones pseudoqumicas simples.

22

32nm COeOHdNOCHcNHbOaOCH ++++

CHmOn representa un mol del carbohidrato empleado como sustrato

CHON representa un mol del material celular

La composicin del material celular depende del tipo de

organismo. Un mol de material biolgico es aquel que

contiene un tomogramo de C

Por que una frmula mnima escrita como: CH ObNd ?


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Composicin elemental de la bacteriaEscherichia coli

Elemento % en masa seca

C 50

O 20

N 14

H 8

P 3

S 1K 1

Na 1

Ca 0.5

Mg 0.5

Cl 0.5

Fe 0.2

Otros 0.3

92% de la masa seca

total esta formado porC, O, N, H

Componentes minoritarios

no se tienen en cuenta en la

frmula mnima

Por que una frmula mnima escrita como: CHaObNd ?

Los coeficientes estequiomtricos y la frmula mnima se calculan


47/136

Balanceselementales:

22

32nmCOeOHdNOCHcNHbOaOCH ++++

=++=+ +=+

+=

c3b:N2edc2an:O 2dc3bm:H

ec1:C

Cociente respiratorio (RQ): moles de CO2producidos por mol de

O2 consumido provee una indicacin del estado metablico y puedeemplearse para controlar el proceso.

a

e

consumidosOmoles

generadosCOmolesRQ

2

2 ==

Los balances para H y O pueden no dar informacin correcta por la

gran masa de agua que tienen las clulasse requiere informacin

adicional.

planteando balances elementales, la informacin del cociente

respiratorio y un balance de electrones disponibles.


48/136

Para las reacciones mas complejas, con formacin de productosextracelulares, se agregan componentesFhay un coeficiente

estequiomtrico ms y se requiere mayor informacin.

Adems, los balances elementales no se relacionan con los

cambios de energa involucrados en la reaccin.

Fse desarroll el concepto degrado de reduccin, ,para poderplantear balances de electrones y protones en bioreacciones.

Balance de electrones disponibles:

Grado de reduccin: nmero de equivalentes de electrones

disponibles por tomo-gramo de C. Los electrones disponibles son

aquellos que se transfieren al O2 al formarse CO2 o H2O.

= productos,i iisustratos,i ii

reducciondegrados:;costriestequiome.coef: ii

CiCi ti d i i t i bi M d lti a d i i t i bia M d l s


49/136

CinCintica de crecimiento microbiano: Modelostica de crecimiento microbiano: Modelos

nXPXS ++ ( )

dt

dX

X

1k

dgneta

biomasade

cantidadmayorproductosbiomasaustrato ++aresextracelul

S

X: concentracin msica de clulas (g/L)

t: tiempo (h)

neta: Velocidad especfica neta de crecimiento (h-1)g: Velocidad especfica de crecimiento de biomasa (h-1)

kd: constante de muerte celular o disminucin de masa celular pormetabolismo endgeno (h-1)

CuantificaciCuantificacin de la cinn de la cintica de crecimiento: modelos cintica de crecimiento: modelos cinticosticos


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ff

Descripcin detallada Fdebera involucrar diferenciaciones en la

estructura de la clula y la segregacin del medio de cultivo en

unidades que pueden tener diferentes concentraciones y propiedades

fsico-qumicasFmodelos estructurados-segregados

Modelos Estructurados FTienden a representar la estructura de las

clulas. Pueden dividir la clula en sus componentes y considerar las

reacciones y cambio de metabolismo que tienen lugar en cada zona

de la clula, como respuesta a cambios en el medio.

Modelos Segregados FTienen en cuenta que el medio no es

homogneo, permiten variaciones de concentraciones de biomasa y

de nutrientes y diferencias en las propiedades fisicoqumicas del

medio (viscosidad, densidad, pH, T, etc.). Tambin permiten

considerar la posibilidad de agregacin de clulas.

AD


51/136

El grado de realismo y complejidad de un modelodepende deldepende del

objetivoobjetivo Fse debe elegir el modelo ms simple capaz de

representar en forma adecuada al sistema que nos interesa.

No estructurados

No segregados

Estructurados

No segregados

No estructurados

Segregados

Estructurados

Segregados

MAY

ORCOMPLEJIDA

MAYOR CAPACIDAD DE REPRESENTAR LA REALIDAD

Son ms

realistas, peroson complejos y

demandantes de

tiempo de

clculo.

Nos restringimos a los modelos No estructurados/No segregados


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Modelos No-Estructurados FSuponen una composicin fija de

la clula (equivalente a suponer crecimiento balanceado).

-Son estrictamente vlidos para la etapa de crecimiento

exponencial en batch

-No andan bien para transientes, salvo que la respuesta de la

clula sea rpida y/o las perturbaciones sean leves.

Modelos No-Segregados FConsideran un medio homogneo.

-Representan adecuadamente muchos casos.

Nos restringimos a los modelos No-estructurados/No-segregados

Modelos cinModelos cinticos de crecimiento: controlados por sustratoticos de crecimiento: controlados por sustrato


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S (M)

g(h-1

)

Modelos cinModelos cinticos de crecimiento: controlados por sustratoticos de crecimiento: controlados por sustrato

FSuponen que la cintica depende solamente de un nico sustratoesencial (por ej., glucosa). Los cambios en los otros sustratos no

afectan. Ms difundido FFModelo deModelo deMonodMonod

Supone que unSupone que un

nico sistemanico sistema

enzimenzimtico controla el consumo detico controla el consumo de

sustrato y que dicho sistemasustrato y que dicho sistema

determina la velocidad dedetermina la velocidad de

crecimiento de biomasacrecimiento de biomasa.

La premisa es generalmente falsa,

pero la ecuacin de Monod ajusta

una amplia gama de resultadosexperimentales y es la expresin

ms empleada para el diseo de

fermentadores.

SK

S

s

mg +

=


54/136

S (M)

g(h-1

)

SK

S

sm

g +=

m: mxima velocidad especficade crecimiento de biomasa

smgKScuando >>=

Ks: constante de saturacin o develocidad media

sm21

gKScuando ==

Monod da buenos resultados para cultivos con baja velocidad de

crecimiento y baja densidad de clulas.

Para cultivos concentrados se usan expresiones similares,modificando Ks:

SSK

S

0S

mg

0

+=

SSKK

So

0ss

mg

01 ++

=

Nociones de diseNociones de diseo de fermentadores oo de fermentadores obiorreactoresbiorreactores


55/136

La eleccin del tipo de reactor y de la estrategia de operacin define

la produccin a obtener y la pureza del producto (nmero y tipo de

impurezas, reactivos sin convertir). Tambin determina si se puede

lograr un producto de calidad constante y una operacin confiable.

En bioprocesos los reactores representan un gran % del capital.

Tipos de reactores comnmente empleados

Discontinuos o batch: una vez que se carga, el procesoocurre sin ingreso de sustrato ni salida de productos.

Continuos (quimiostato): hay alimentacion

continua de sustrato y retiro continuo de productosSemicontinuos (Fed-batch): hay ingreso

continuo o intermitente de sustratos, sin

retiro de productos.

Reactores discontinuos o batch


56/136

Produccin de biomasa o de un producto asociado a crecimiento

(metabolito primario):

En un batch se observan 4 etapas:1) Preparacin para la nueva operacin (limpieza, esterilizacin,

llenado del reactor)2) Sembrado y perodo de induccin

3) Perodo de crecimiento exponencial

4) Recuperacin del producto del reactor

La suma del tiempo involucrado en las etapas 1+2 y 4 es un tiempo

muerto, tm, a considerar en el diseo del reactor

vara con el tamao del reactor y con el tipo de fermentacin pero

generalmente es del orden de las horas (310 hs)tiempo total de operacin para llegar a una concentracin final de

biomasa Xf:

+=

0f

netamc X

X1tt ln

La concentracin final de biomasa, Xf, depende de la cantidad de


57/136

sustrato limitante del crecimiento y del rendimiento:

( )SSYXX0S/X0f

=

La mayora de las fermentaciones operan con una relacin Xf

/X0

de

aproximadamente 1020. La velocidad de produccin de biomasa

por operacin del reactor batch, rb , se calcula dividiendo la masa

total que podemos formar por el tiempo que lleva la operacin:

( ) ( )m0fneta

0SXb tXX1

SYr

+=

ln//

Una operacin en un quimiostato en condiciones ptimas conduce

a una produccin significativamente superior.De todos modos, laDe todos modos, la

mayormayora de las fermentaciones son procesos discontinuosa de las fermentaciones son procesos discontinuos..

sm

kg

3

3m

kg

Por qu?


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En muchos casos no interesa el producto asociado a crecimiento;

el crecimiento de las clulas puede incluso inhibir la produccindel producto deseado. En esos casos el producto deseado se genera

solo con velocidades de dilucin muy bajas, muy por debajo de la

que lleva a la ptima productividad de biomasa.ParaParaproducciproduccin de metabolitos secundarios, la productividadn de metabolitos secundarios, la productividad

en unen un batchbatchpuede superar significativamente a la de unpuede superar significativamente a la de un

quimiostatoquimiostato..

Otra razn importante para que se prefiera la operacin

discontinua es la inestabilidad gentica. Los microorganismos que

se emplean suelen ser especies que han sido manipuladas y tienen

menor velocidad de crecimiento que las originales.UnUn quimiostatoquimiostato impone una selecciimpone una seleccin severa cuando hayn severa cuando hay

mezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidadmezclas de cultivo, conduciendo a la cepa de mayor velocidad

de crecimiento.de crecimiento.

Por qu?


59/136

Otro factor a tener en cuenta es la operabilidad y la confiabilidad

de la operacin. Los reactores batch conducen a productos conmucha variabilidadgenera problemas en las etapas de

purificacin. Sin embargo en los sistemas continuos una falla

mecnica o de control de alguna variable de operacin o de laesterilizacin del proceso puede conducir a problemas severos.

Las consecuencias de una falla de operaciLas consecuencias de una falla de operacin son mas gravesn son mas graves

en un sistema continuo y las pen un sistema continuo y las prdidas mayores.rdidas mayores.

La economa de mercado influye en la seleccin del reactor. Un

sistema continuo es un sistema dedicado a un dado procesoun

nico producto.

Muchos productos de fermentaciones se requieren en pequeMuchos productos de fermentaciones se requieren en pequeasascantidades y su demanda es difcantidades y su demanda es difcil de proyectar. Los sistemascil de proyectar. Los sistemas

batchbatch son mson ms verss verstiles, el mismo reactor puede emplearsetiles, el mismo reactor puede emplearse

para distintos productos.para distintos productos.

Cultivos continuosCultivos continuos Fse agrega un medio con nutrientes frescos en

forma continua a un volumen de control que contiene las clulas


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forma continua, a un volumen de control que contiene las clulas.

Se retiran continuamente productos y parte de las clulas.-Cuando se alcanza el estado estacionario, X, S y P permanecen

constantes en un dado punto del reactor.

-Los cultivos continuos proveen un medio de cultivo constante para

el crecimiento de las clulas y para la formacin de productosFcalidadcalidad uniforme de los productosuniforme de los productos

-Pueden ser una herramienta importante para determinar como un

microorganismo responde al medio, y para generar un producto encondiciones ptimas.

Sistemas paralograr cultivos

continuos

Quimiostato

Turbidistato

Flujo Pistn Ideal (FPI):mezclado radialmezclado radial

perfecto y mezclado axial nuloperfecto y mezclado axial nulo; poco

empleado, salvo para inmovilizados

Sistemas conmezcladomezcladoperfectoperfecto: Tanques

continuos idealmenteagitados (TCIA)

Quimiostato: el crecimiento de biomasa suele estar controladopor n n triente esencial el resto se agrega en e ceso Las


61/136

por un nutriente esencial y el resto se agrega en exceso. Las

condiciones qumicas del medio son constantes.

Turbidistato: la concentracin de clulas en el reactor se mantieneconstante La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la


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constante. La alimentacin se regula mediante el monitoreo de la

densidad ptica del cultivo. Se alimenta medio fresco cuando laturbidez supera un lmite prefijado. El volumen se mantiene constante

retirando una cantidad de fluido equivalente a la que se agrega.

Se usa menos que el quimiostato porque es ms elaborado y porque el

medio cambia.

Puede ser muy til

para seleccionar

subpoblaciones quepuedan soportar

condiciones de

stress, porque la

concentracin de

clulas se mantiene

constante.

FPI (Flujo Pistn Ideal):


63/136

como no hay retromezclado,

los elementos de fluido con

clulas activas no pueden

inocular elementos de fluido

nuevos aguas arribase requiere el reciclo

continuo de clulas para

inoculacin continua del

medio fresco alimentado.

Un FPI es equivalente a un batch, en el cual la posicin en el

reactor equivale a un dado tiempo en el reactor batch.

Equipos con clulas inmovilizadas (trickling filters) se asemejan

a un FPI y no necesitan el reciclo, se usan extensamente en

tratamiento de efluentes.

L(+G,S)

L(+G,S)

Fotobiorreactor tubular helicoidal de1000 L (Murdoch University Australia)


64/136

1000 L (Murdoch University, Australia)

Recuperacin de microalgas a partirdel medio de cultivo por filtracinCyanotech Corporation

(www.cyanotech.com), Hawaii, USA.

Cultivos continuos: Quimiostato ideal

Es un tanque agitado que se opera con circulacin continua (TCIA)


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Es un tanque agitado que se opera con circulacin continua (TCIA)

del medio de cultivo. La mayora requiere control (pH, T y CO2).Se alimenta medio estril (X0= 0) a un tanque perfectamente

agitado (y aireado si es fermentacin aerbica). Se deja salir la

suspensin de clulas para mantener las concentraciones y el

volumen de lquido constante.

Burbujeo

de gas

Fv

S0, X0, P0

Fv

S, X, P

Volumen de lquido =

volumen de reactor = V

Las concentraciones a la

salida del reactor son

iguales a las del interior

por la hiptesis demezclado perfecto

Balances de masa FEcuaciones de diseoPlanteando balances de masa para los distintos componentes se


66/136

Planteando balances de masa para los distintos componentes, se

obtienen las ecuaciones de diseo.

=

+

V.C. deldentro

acumuladaMasa

V.C. deldentro

generadaMasa

V.C. deldentro

consumidaMasa

reactivos loscon

VCalentraqueMasa

productosloscon

VCdelsalequeMasa

Si el volumen de control V.C. es un QUIMIOSTATO

Un quimiostato opera en estado estacionario F se cancela el trmino

de acumulacin de masa:

+

=

+

V.C.deldentro

generadaMasa

reactivoslosconV.C.alentraqueMasa

V.C.deldentroconsumidaMasa

productoslosconV.C.delsalequeMasa

Quimiostato - ecuaciones de diseo

generadaMasa

V ClentraqueMasa

consumidaMasaV Cd l

salequeMasa


67/136

Gas

Fv

S0, X0, P0Fv

S, X, P

V

Balance de masa de clulas:

+

=

+

V.C.deldentro

generadaMasa

reactivoslos

conV.C.al

V.C.deldentro

consumidaMasa

productoslos

conV.C.del

XVXFXFneta0VV

+=

XkVXFXFdg0VV

+=

Definiendo el factor de dilucin como caudal/volumen: D = FV/V

XkDXDXdg0 += Si se alimenta medio estril (X0= 0) yel mecanismo endgeno es despreciable

XkDXDXdg0

+= g

D =

FV: caudal volumtrico de mediode cultivo agregado (L/h)

Importancia de este resultado: En un quimiostato enEE, alimentado con medio estril y en condicionesD =


68/136

, y

en las que el metabolismo endgeno es despreciable,la velocidad o factor de dilucin, D, iguala a lavelocidad de crecimiento de clulas

F se puede manipular la velocidad de crecimiento como un parmetroindependiente modificando las variables de operacin

F el quimiostato es una herramienta experimental poderosa

Si la velocidad de crecimiento sigue la expresin de Monod

SK

SD

s

m

g +==

S: concentracin de sustrato limitante

del crecimiento de biomasa en EE

Si se impone un factor de dilucin D > m , las clulas no se podrnreproducir lo suficientemente rpido para mantenerse F se lavan, o

se vaca el quimiostato (washout)

g

D =

BM sustrato en estas condiciones (EE y sin metabolismo endgeno):


69/136

FV: caudal volumtrico de medio de cultivo agregado (L/h)S: concentracin de sustrato limitante del crecimiento (g/L)

V: volumen del reactor (L)

g: velocidad especifica de crecimiento de biomasa (1/h)X: concentracin de biomasa (g/L)qP (gP/gclulas/h): velocidad especfica de productos extracelulares

YMX/S (g clulas/gS) : mximo rendimiento de biomasa a partir de S

YP/S (gP/gS) : rendimiento de producto extracelular a partir de S

0VS/P

PMS/X

gV SFY

1

XVqY

1

XVSF =++

+

=

+

V.C.deldentrogeneradaMasa

reactivoslosconV.C.al entraqueMasa

V.C.deldentroconsumidaMasa

productoslosconV.C.del salequeMasa

Formacin de biomasa Formacin de producto

Concentracin msica de clulas en estas condiciones (EE y sinmetabolismo endgeno):


70/136

g )

( ) YqXYXSSDS/P

PM

S/X

g0 +=

Como adems g = D , si la formacin deproductos extracelulares es despreciable: SSYX 0MS/X =Estrictamente, depende de la concentracin de sustrato y de la

velocidad de crecimiento, no es exactamente igual para cualquier S0

M

S/XY

La productividad en un fermentador continuo se

obtiene como el producto del factor de dilucin por laconcentracin de clulas, DX (g/Lh)

Productividad en un quimiostato, suponiendo vlida Monod(EE sinmetabolismo endgeno ni formacin de productos extracelulares): se obtiene del


71/136

producto del factor de dilucin por la concentracin de clulas, DX (g/Lh):

La velocidad de dilucin que maximiza la produccin de biomasa se obtienede derivar DX con respecto a D e igualar a cero:

+=

0s

s

m)X(op SK

K1D

Es muy difcil lograr una operacin estable para D m. Generalmente, seusa un valor de D algo menor que Dop(X) como solucin de compromiso

para mejorar la estabilidad con buena productividad.

Normalmente Ks


72/136

)

=

opm

sop

0op

M

S/Xop D

KDSDYDX

de biomasa DX:

Se obtiene la mxima productividad de biomasa que se puede alcanzar en

un quimiostato en EE, sin metabolismo endgeno y sin formacin de

productos extracelulares:

) ( )( )0sss0

0s

s

m

M

S/XopSKKKS

SK

K1YDX ++

+

=

Normalmente Ks


73/136

0.12 0.013 0.4340.24 0.033 0.417

0.31 0.04 0.438

0.43 0.064 0.422

0.53 0.102 0.427

0.6 0.122 0.434

0.66 0.153 0.422

0.69 0.17 0.43

0.71 0.221 0.39

0.73 0.21 0.352

0

0.1

0.2

0.3

0 0.2 0.4 0.6 0.8

DX

(kg/h.m3

)

D (h-1

)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 0.2 0.4 0.6 0.8

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

X (kg/m3)

S (kg/m3)

D (h-1)

0S

m

Algunas aplicaciones de lossistemas continuos:

- produccin de algunas protenas


74/136

p g p

- tratamiento de efluentes, en particular cuando se empleanmicroorganismos o enzimas inmovilizadas.

- produccin de etanol

- produccin de productos asociados a crecimiento,

especialmente en gran escala (por ejemplo, cido

lctico)

Modificaciones de los sistemas continuos para emplearse en

bioprocesos

Quimiostato con reciclo

La generacin de biomasa es autocataliticaF mayor

concentracion de biomasa lleva a mayor velocidad decrecimiento.

Para lograr en un quimiostato una concentracin de biomasa

mayor, se pueden reingresar al reactor las clulas que salen.

Quimiostato con reciclo: el reciclo de clulas incrementa la

productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado


75/136

productividad y tambin la estabilidad en algunos sistemas, dado

que minimiza las perturbaciones (ej.: en tratamiento de efluentes,

muy sujeto generalmente a las variaciones en la alimentacin).

Gas

Fv

S0,X0,P0

Fv

S1,X2,P1V

Fv(1+)S1,X1,P1

FvS1,cX1,P1

Separador de clulas: puede ser

por filtracin, centrifugacin o

sedimentacin

: relacin de reciclobasada en caudalesvolumtricos.

c: factor de concentracinrelacin de la

concentracin declulas en la corriente

de reciclo sobre la que

sale del reactor

Balances de biomasa :

MasaMasaMasaqueMasaqueMasa


76/136

=

+

V.C.deldentro

acumuladaMasa

V.C.deldentro

generadaMasa

V.C.deldentro

consumidaMasa

reactivosloscon

VCalentraqueMasa

productosloscon

VCdelsalequeMasa

Gas

Fv

S0,X0,P0

FvS1,X2,P1V

Fv(1+)S1,X1,P1

Fv

S1,cX1,P1

( ) 0XVcXFXFXF1 1neta1V0V1V =++ fresca reciclo

En EE: dX1/dt = 0y si se alimenta medio

estril X0=0

( ) 1V1V1neta cXFXF1XV +=( )c1D

neta+=

Fv

S0,X0,P0Fv(1+)

FvS1,cX1,P1

[ ])c1(1Dneta

+=


77/136

Gas

Fv

S1,X2,P1V

( )

S1,X1,P1

1 1 1

Como c > 1 (1-c) < 0

Dneta


78/136

( )1V0V

S/P

1PM

S/X

1g1VSFSF

Y1XVq

Y1XVSF1 +=+++

( ) ( ) 1V10VMS/X1g SF1SSFY

1

XV ++=

( )10

M

S/Xg

1

SSYD

X =

[ ])c1(1D0kSinetagd

+=== (

( )c-11

SSYX 10

M

S/X

1 +

=

La concentracin de clulas en un quimiostato en EE con reciclo se

incrementa por el factor 1/[1+(1-c)]

Si es vlida Monod

y para kd=0[ ] +==

+=

)c1(1D

SK

S

neta

s

m

g


79/136

( )[ ]( )[ ]Dc-11

Dc-11KS

m

s

++=

( )[ ]( )[ ]

( )[ ]

++

+=

Dc-11Dc-11KS

c-11

YX

m

s

0

MS/X

1

sin reciclo

con reciclo

X1,sr

Velocidad deVelocidad degeneracigeneracin den de

biomasabiomasa

c = 2 ; = 0.5

Gas

FvS0,X0,P0

Fv

S1,X2,P1

V

Fv(1+)S1,X1,P1

FvS1,cX1,P1X1,cr

Quimiostatos mltiples en cascada: en algunas fermentaciones,

particularmente para laproduccin de metabolitos secundarios (ej.:


80/136

un antibitico), conviene separar las etapas de crecimiento debiomasa y de formacin del producto deseado pues las condiciones

ptimas son diferentes

FF con mcon mltiplesltiples quimiostatosquimiostatos, se pueden fijar condiciones, se pueden fijar condiciones

distintas en cada uno:distintas en cada uno:pHpH, temperatura,, temperatura, concconc. de nutrientes. de nutrientes

por ejemplo, se pueden ajustar las condiciones para tener:

-Un primer tanque donde se promueva el crecimiento de biomasa-Un segundo tanque donde se promueva la formacin de producto(*)

(*) el crecimiento ser desbalanceado y un modelo no-estructurado

no es el ms apropiado. Los resultados sern aproximados.

Fv,S0,X0Quimiostatos mltiples en cascada:


81/136

V1 V2

X1S1

X2S2

Fv,X2,S2Fv,X1,S1Fv,S0,X0Primer quimiostato

en EE, vlido Monod y con metabolismo endgeno despreciable

1m

1s

1 D

DKS

=

10

M

S/X1SSYX =

Segundo quimiostato

BM de biomasa EEen0

dt

dXVXVXFXF 2

222,neta22V1V==+

( )

==

2

1

22,neta22,neta12

2

V

X

X1DXXX

V

F

Como X1 < X2 neta,2 < D2

Ejemplo de aplicacin de un sistema multietapa con agregado de una

corriente:cultivo de clulas modificadas por ingeniera gentica


82/136

En general se agregan promotores a los sistemas con clulas que

contienen ADN recombinante para inducir la produccin de la

protena de inters.

La presencia del promotor favorece la produccin de la protenapero reduce la velocidad de crecimiento de las clulas que contienen

plsmidos, respecto de las que lo han perdido.

un quimiostato de una nica etapa tendr problemas de

inestabilidad gentica.empleando un sistema de 2 etapas:

Primer quimiostato para produccin de clulas (sin promotor)

Segundo quimiostato para produccin de la protena (c/promotor):

Se logra mantener la estabilidad gentica por el continuo agregado

de clulas frescas.

Operacin con alimentacin semi-continua Fed-batch:

En este tipo de sistemas se agregan nutrientes frescos al fermentador


83/136

en forma continua o intermitente. Muy apropiado para mitigarproblemas de inhibicin por sustrato

V0

S0,X0,P0

X0,S0,P01)Carga

X,S,P

V

Fv,S0 (X0)

2)Realimentacin

Xf,Sf,Pf

Vf

Xf,Sf,Pf

3)Recuperacin

del producto

1) Desde la carga hasta el momento de la realimentacin peridica,

el sistema se comporta como un batch:

0

M

S/Xm

SYX =Xm es la mxima X a alcanzar con S0 , que se da

cuando S


84/136

nutrientes frescos con un caudal volumtricoFv y de una concentracin S0. La variacin de

volumen es:( ) tFvVVFv

dt

dV0

+==

Durante la realimentacin, el BM de biomasa

es:

Como el sustrato se consume casi todo dX/dt 0(condicin de estado cuasi-estacionario). Luego:

Dneta

X,S,P

V

Fv,S0 (X0)

2)Realimentacin

X,S,P

V

Fv,S0 (X0)

X,S,P

V

Fv,S0 (X0)

2)Realimentacin

( ) ( )DXdt

dXDXDX

dt

dV

V

XXX

V

F

dt

dXnetaneta0neta0

V +=+=

( )

dt

dVX

dt

dXV

dt

VXdXVXF

neta0V+==+

acumulasegeneraseentra =+

Como D porque V, neta va disminuyendo continuamente.


BM para el sustrato:XV


85/136

Si no consideramos la formacin de

productos y dado que la masa de sustrato

se mantiene siempre

baja y constante:

( )( ) ( ) tYSFVXXVYSFXV

dt

XVd MS/X0V00

MS/X0Vneta

+==

(es igual en ausencia de metabolismo endgeno)

Es decir, la masa de clulas generadas es linealmente proporcional

al tiempo, lo cual se observa experimentalmente en un fed-batch.

X,S,P

V

Fv,S0 (X0)

2)Realimentacin

X,S,P

V

Fv,S0 (X0)

X,S,P

V

Fv,S0 (X0)

2)Realimentacin

( )M

S/X

g

0VY

XVSF

=

( )dtVSd

YXVq

YSF

S/P

PM

S/X

g0V =

acumulaseonsumecseentra =


1000

V (mL) (h-1)


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Variacin de las

concentraciones de

biomasa, sustrato y

producto, y de lavelocidad de

crecimiento y volumen

del cultivo en funcin

del tiempo, para elprimer ciclo de un

reactor alimentado

(fed-batch):

0

200

400

600

800

0 0.5 1 1.5 2

0

0.2

0.4

0.6

V (mL)

X (g/L)

P (g/L)

X (g/L)P (g/L)

(h-1)

t h

Sistemas con microorganismos inmovilizados: la inmovilizacin

de microorganismos tiene aplicacin si los productos son

l l


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extracelulares

Ventajas sobre los cultivos con clulas en solucin:

Proveen una alta concentracin de clulas

Las clulas se usan en forma continua y se eliminan costosos

procesos de recuperacin y reciclo de clulas

Se eliminan el problema del washout a altas velocidades de

dilucin

Se pueden lograr altas productividades

Se puede lograr un medio local favorable que conduce a mayores

rendimientos y una mejor performance del biocatalizador

En algunos casos mejora la estabilidad gentica

En algunos casos disminuye el dao por abrasin de las clulas

Sistemas con microorganismos inmovilizados


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Desventajas respecto de los cultivos en solucin:

El problema ms grave es que no se pueden emplear para

productos que no sean excretados de las clulas

La inmovilizacin generalmente conduce a problemas de

limitaciones por transferencia de masa

El sistema se torna muy heterogneo por las limitaciones de

transporte y es difcil de controlar

Si las clulas estn vivas, el crecimiento y la evolucin de gases

ocasiona problemas y puede conducir a ruptura del soporte.

Los mtodos de inmovilizacin son similares a los que se utilizan

para enzimas. Se complica con las clulas vivas.

InmovilizacinActiva: captura o unin de clulas por

mtodos fsicos o qumicos


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Pasiva: formacin de biofilms, crecimiento

de mltiples capas de clulas sobre un

soporte slido

Tambin se pueden emplear reactores de membrana, generalmente

tubulares (la estructura se asemeja a un intercambiador de calor decarcasa y tubos). Los tubos son de una membrana semipermeable.

Las clulas se inoculan en la carcasa y el sustrato se bombea por los

tubos, a los cuales difunde el producto.

Un buen soporte debe ser rgido y qumicamente inerte; debe

contener a las clulas firmemente y tener alta capacidad.

Fermentadores: Equipos comnmente empleados

Tanques agitados

C l d b b j


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Esquema de una

columna de burbujeo

Columnas de burbujeo

Air-lift o reactor de arrastre

Lechos rellenos

Esquema de un tanque agitado

H/D~12

H/D~36

Tanques agitados de escala

l b i


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laboratorio

Tanques agitados de escala

laboratorio con clulas


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laboratorio con clulasinmobilizadas

Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2Fermentadores comerciales de escala laboratorio (V ~ 2--20 litros)20 litros)


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Global Medical Instrumentation http://www.gmi-inc.com

Fermentadores de escala bancoFermentadores de escala banco--piloto (V ~ 15piloto (V ~ 15--75 litros)75 litros)


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Fermentadores deFermentadores de

escala pilotoescala piloto

V ~ 100V ~ 100--1000 litros1000 litros


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V ~ 100V ~ 100--1000 litros1000 litros

Biorreactor del il


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Biorreactor deescala piloto

Planta piloto de bioprocesos


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Esquema de un tanqueEsquema de un tanque

agitado de mayor escalaagitado de mayor escala


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Variables que se controlan en unVariables que se controlan en unbiorreactorbiorreactor industrialindustrial


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Esquema de un fermentador

tipo tanque agitado de escala

industrial (100m3).


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( )

H ~ 15 m de alto

D ~ 4,2 m de dimetro

Tiene lneas de vapor

para realizar laesterilizacin in situ de

las vlvulas, caeras y

sellos. Se debe esterilizartambin el aire que

ingresa por filtracin o

por calentamiento.


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Biorreactor de

escala industrial


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Reactor tanque industrial-generalmente de acero inoxidable 316L SS, puede operar presurizado.-debe minimizar zonas muertas y permitir la insercin de sensores

-relacin de aspecto H/D=2.53.0 para crecimiento de bacterias porquemejora la transferencia de oxgeno Para clulas animales se usan tanques


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mejora la transferencia de oxgeno. Para clulas animales se usan tanquesde baja relacin de aspecto H/D=1.5 para facilitar el mezclado-se debe poder vaciar

totalmente-si tiene menos de500L pueden ser devidrio

Reactor tanque agitado: tipos de turbinas empleadas y efectos en la

agitacin que inducen


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Agitacin inducida por turbinas

radiales del tipo Rushton

Agitacin inducida por turbinas

axiales

Interior de un

tanque agitado


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Reactor tanque agitado: efecto de los baffles

Los baffles mejoran notablemente la turbulencia, rompen los vrtices

que se forman por la agitacin. Se los ubica levemente desplazadosde la pared para disminuir la formacin de zonas estancas


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de la pared para disminuir la formacin de zonas estancas.

Reactor tanque agitado: efecto de los baffles en un reactor de 2L

400rpm sin baffles 400rpm con baffles


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vrtice

Agitacin y distribucin de gas en reactores agitados

La determinacin de la velocidad de transferencia de oxgeno y elcalor liberado son claves para el diseo de los fermentadores.


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p

La velocidad de transferencia de O2 depende de la dispersin de gas,

que es funcin del tipo de reactor; ej: en tanques agitados, aumenta al

aumentar la velocidad de agitacin.

> RPM

Influencia de la velocidad de agitacin sobre la turbulencia y la

dispersin de gas inducida por agitacin mecnica en un reactorde laboratorio de 2L.


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de laboratorio de 2L.

300 rpm 450 rpm 750 rpm

Tomografa de una seccin del

reactor agitado.

Jets gaseosos de los inyectores de gas

Fraccin gaseosa (adimensional)


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Perfil de velocidades (cm/s) del lquido

en un reactor gas-lquido agitado. Seobserva la formacin del vrtice

caracterstico de las turbinas radiales.

Reactor agitado en

suspensin de escala

banco: 20cm dedimetro y de alto

(volumen ~ 8L)

Reactor tanque agitado:


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Problemas ocasionados por

la evolucin de espuma:

-peligro de contaminacin

-complica la circulacin de

gases

-complica el mezclado

-cambian las velocidades

de transferencia masa y decalor

vrtice

Columna de burbujeo de escala banco: V~10L

Configuraciones comunes de fermentadores: columnas de burbujeo


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Columnas de burbujeo

Regmenes de flujo en columnas de

burbujeo: depende del caudal de gas y del

distribuidor que se emplee


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distribuidor que se emplee

Columnas de burbujeo para el

cultivo de algas


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Configuraciones de recirculacin interna inducida por el flujo de

aire Air-lift

Configuraciones comunes de fermentadores


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Air-lift coninsercin de

aire en el

tubo central

Air-lift con insercinde aire en el anillo y

mezclado en el tubo

central

Air-lift con insercin de aire en

el tubo central y recirculacin

inducida

Reactor air-lift de

laboratorio con entrada deaire en el anillo circular


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Riser: zona donde se hace la

inyeccin de aire, el flujo esascendente y contiene burbujas

Downcomer: zona donde el lquido

desciende, a lo sumo tiene pequeasburbujas disueltas

Zona donde se produce laseparacin entre el gas que se

libera hacia el exterior delreactor y el lquido que recircula

Air-lift vertical con mezclado en el tubo central: perfiles

de velocidades, energa cintica y tensin de deformacin


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Shear Stress Kinetic Energy

Escalabanco

(0,2 x 2)m


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Reactor de tipo air-lift circulante

Airlifts de forma

triangular para elcultivo de algas

(planta piloto de


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(planta piloto de

cogeneracin de

energa del MIT)

Configuraciones comunes de fermentadores

Reactores de lecho fijo uso frecuente en tratamiento de efluentes y

en producciones dedicadasReactores trickle-beds o de lecho a goteo Columnas de burbujeo


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g

Cocorriente ContracorrienteColumnas de burbujeo

rellenas

Inmovilizacin pasiva (biofilms):

Los biofilms songrupos de clulas que crecen en multicapassobre soportes slidos.

El soporte puede ser inerte o biolgicamente activo.

La formacin de biofilms es comn en equipos de fermentacin


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La formacin de biofilms es comn en equipos de fermentacinindustriales (ej: tratamiento de efluentes y fermentaciones de hongos).

La interaccin entre las clulas y el soporte puede ser muy compleja.Los biofilms presentan ventajas y desventajas similares a las de lossistemas de microorganismos inmovilizados en forma activa.

Las condiciones dentro de un biofilm grueso varan con la posicin y

afectan la fisiologa de las clulas porque los nutrientes difundenhacia el interior del film y los productos hacia fuera.

El espesor del biofilm afecta la performance: biofilms muy finos vana dar baja velocidad de crecimiento por la baja concentracin de

biomasa y los muy gruesos tienen problemas difusionales, que puedenser o no un inconveniente, dependiendo de lo que se quiera lograr.

Normalmente existe un espesor de film optimo para el crecimiento debiomasa y otro para la formacin de productos.


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Estrategias de escalado:

-Multiplicacin

-Reglas de uso

-Anlisis del rgimen


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-Anlisis del rgimeny escalado hacia menor

tamao

Lamultiplicacin implica

replicar muchas veces el

resultado que se obtieneen un reactor de escala

relativamente pequea, en

lugar de llevar a cabo el

proceso en un reactor demayor tamao.


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Produccin de cido glucnico


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Produccin de gluconato de sodio conA. niger


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Produccin de antibit ico


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Produccin de lisina (10000 ton/ao)en 20 fermentadores de 250 m3


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Drogas medicinales

% de uso en la industria Criterio de escalado

Reglas de uso :basadas en anlisis dimensional y criterios de

similaridad de algunos parmetros


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30 Potencia/Volumen

30 kLaLG

20 Velocidad en la punta del agitador

20 Concentracin de oxgeno

Otras: velocidad (rpm) del agitador o impeler; dimetro delagitador; caudal desplazado por el impeler; caudal desplazado

por el impeler, por unidad de volumen; numero de Reynolds

La concentracin de

Anlisis del rgimen

y escalado hacia

menor tamao


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oxgeno es diferente en

distintas zonas delreactor. Se puede simular

considerando varios

reactores con distinta

alimentacin de oxgeno

Modelo del sistema que suponedos compartimientos con distintaconcentracin de oxigeno


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Documents

CTB Biorreactores