Cuaderno Prac Taller IV

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UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE CHIAPASCENTRO DE BIOCIENCIASLICENCIATURA DE INGENIERO BIOTECNÓLOGO

UNIDADES DE HABILITACIÓN DE TALLER EXPERIMENTAL IV

PROFESOR RESPONSABLE:M. en B. Sonia Ruiz González

CONTENIDO

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Unidad de Habilitación

Título Página

Contexto: Licenciatura de Ingeniero Biotecnólogo ivIntroducción al Taller Experimental IV vNormas básicas para trabajar en el laboratorio viNormas de seguridad al manejar sustancias viii

1 Preparación y esterilización de medios de cultivo y ma-teriales usados en microbiología

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2 Aislamiento de bacterias y hongos de muestras de sue-lo

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3 Cuantificación, purificación y conservación de bacterias y hongos

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4 Morfología macroscópica y microscópica de bacterias y hongos

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5 Pruebas de diferenciación bioquímica en microorganis-mos

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6 Observación de la ruta anabólica fotosintética 227 Cuantificación de la concentración de CO2 consumido en

la fotosíntesis25

8 Aislamiento de DNA de bacterias del género Azospiri-llum

28

9 Electroforesis de DNA de Azospirillum en gel de agarosa 32

10 Amplificación de DNA mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

36

11 Estimación de la biodiversidad: simulación de comuni-dades para calcular índices de diversidad

41

12 Estimación de la riqueza y abundancia de especies ve-getales en un agroecosistema

48

13 Diseño completamente aleatorizado: Evaluación de dos fuentes de carbono en el crecimiento de Escherichia coli

51

14 Diseño factorial: Evaluación de fuentes de carbono y pH, a distintos niveles, en el crecimiento de Escherichia coli

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Contexto: Licenciatura de Ingeniero Biotecnólogo

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La Universidad Autónoma de Chiapas creó, en 1993, la Licenciatura de Ingeniero Biotecnólogo, cuyo plan de estudios ha ido evolucionando. La modificación de dicho plan, en 2002, instaló, entre otras innovaciones, la figura de los Talleres Experimentales.

La formación de recursos humanos de alto nivel en áreas científico – tecnológico, como la biotecnología, requiere de un espacio para el de-sarrollo de habilidades prácticas; entendidas estas no como la realiza-ción de actividades mecánicas basadas en instructivos establecidos, inflexibles y monodisciplinarios, sino como un espacio en el que se pro-mueva la capacidad del alumno de integrar el conocimiento adquirido en las aulas.

El Taller Experimental plantea lo anteriormente mencionado buscando que el alumno pueda utilizar el conocimiento en la resolución de pro-blemas puntuales con pensamiento holístico y aplicando lo aprendido en varias disciplinas. El Taller Experimental plantea al alumno integrar todos los conocimientos adquiridos en el semestre a través de la elabo-ración de un proyecto.

Por lo tanto, es el espacio donde, a través de la experimentación, el alumno integra el conocimiento que está adquiriendo en el ciclo escolar que le toca cursar. Además, es una base para generar el trabajo en grupo, tan necesario en nuestra sociedad.

Introducción al Taller Experimental IV

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El Taller Experimental IV plantea al alumno llevar a cabo un proyecto en el que ocupe elementos de Microbiología, Procesos Bioquímicos Ce-lulares, Diseño Experimental, Biodiversidad y Biología Molecular. Pre-viamente, el estudiante recibe una serie de Unidades de Habilitación que le proveen herramientas para la realización del proyecto.

OBJETIVO GENERAL.

El alumno integrará el conocimiento adquirido / construido en las asig-naturas básicas del cuarto semestre.

PROGRAMA.

La asignatura se desarrolla vía la realización de proyectos integrales por parte de los alumnos. El trabajo se realizará en equipos, guiados por el docente.

El contenido de los proyectos será definido previo a la apertura del cur-so por los Cuerpos Académicos del Centro de Biociencias y otros exper-tos en las materias; esto permitirá que la naturaleza del Taller Experi-mental IV sea, desde cualquier ángulo, flexible en su contenido, el cual necesariamente deberá cambiar curso a curso.

NORMAS BÁSICAS PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO

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1.- Toda persona que requiera trabajar en el laboratorio deberá UTILI-ZAR BATA y, en su caso, GUANTES Y CUBREBOCAS.

2.-Durante la estancia en el laboratorio, la persona deberá ABSTENER-SE DE INGRESAR E INGERIR ALIMENTOS Y BEBIDAS.

3.-La persona que trabaje en el laboratorio deberá AUXILIARSE del PRO-FESOR y/o LABORATORISTA, para el MANEJO DE EQUIPO.

4.- La persona que trabaje en el laboratorio TIENE la OBLIGACIÓN de anotarse en la BITÁCORA DE USO DEL EQUIPO, la fecha, hora y el para qué lo emplearon.

5.-La persona que trabaje en el laboratorio deberá MANTENER LIMPIA EL AREA ASIGNADA.

6.-La persona que trabaje en el laboratorio DEBERÁ observar las nor-mas básicas de seguridad al MANEJAR las SUSTANCIAS QUÍMICAS.

7.-La persona que trabaje en el laboratorio TIENE la OBLIGACIÓN de REPORTAR los DESPERFECTOS DE MATERIALES Y EQUIPOS.

8.-Por la naturaleza del trabajo de laboratorio, la persona que trabaje en dicha instalación deberá ABSTENERSE de JUGAR O BROMEAR.

9.-Por ser DISTRACTORES, el uso de la COMPUTADORA y de TELÉFONO CELULAR dentro del laboratorio, está RESTRINGIDO, a menos que el PROFESOR lo permita.

10.-Las personas que trabajen en el laboratorio DEBERÁN RESPETAR el horario ASIGNADO.11.-La SOLICITUD de material, equipo y reactivos deberá realizarse en el formato correspondiente y es RESPONSABILIDAD del solicitante su buen uso.

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12.-Es RESPONSABILIDAD de cada persona tener a la mano los imple-mentos individuales que el PROFESOR le solicite para el óptimo desa-rrollo de su labor y RESPETAR las PERTENENCIAS DE SUS COMPAÑEROS Y PROFESORES.

13.-Cuando una persona o grupo de personas NECESITE trabajar en el laboratorio en horario DIFERENTE al asignado, el PROFESOR correspon-diente deberá de ponerse de acuerdo con el LABORATORISTA. En este caso el PROFESOR es el responsable del comportamiento del alumno.

LAS REGLAS AQUÍ MENCIONADAS SON DE OBSERVANCIA GENERAL, LO QUE PERMITE EL ÓPTIMO EMPLEO DE LA INFRAESTRUCTURA, DE LOS MATERIALES Y DEL EQUIPO DEL CenBio, PERO SOBRE TODO POR EL BIENESTAR DE LOS USUARIOS.

Normas de seguridad al manejar sustancias

En las distintas Unidades de Habilitación que integran el presente Cuadernillo se utilizan sustancias químicas potencialmente peligrosas para los usuarios o el ambiente. A continuación se presenta uno de los códigos de riesgos más com-munes; es de suma importancia seguir las recomendaciones para cada caso.

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Sustancias explosivas. Peligro. Este símbolo señala sustancias que pueden explotar bajo determinadas condiciones. Ejemplo: dicromato de amonio. Pre-caución. Evitar choques, percusión, fricción, formación de chispas y contacto con el calor.

Sustancias oxidantes (comburentes). Peligro. Los compuestos comburen-tes pueden inflamar sustancias combustibles o favorecer la amplitud de incen-dios ya declarados, dificultando su extinción. Ejemplo: permanganato de pota-sio, peróxido de sodio. Precaución. Evitar cualquier contacto con sustancias combustibles.

Sustancias fácilmente inflamables.

a. Sustancias autoinflamables. Ejemplo: alquilos de aluminio, fósforo.Precaución. Evitar contacto con el aire.

b. Gases fácilmente inflamables. Ejemplo: butano, propano. Precaución. Evitar la formación de mezclas inflamables gas-aire y aislar de fuentes de ignición.

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c. Sustancias sensibles a la humedad. Productos químicos que desarrollan emanaciones de gas inflamable al contacto con el agua. Ejemplo: litio, borohidruro de sodio. Precauciones: evitar contacto con agua o con humedad.

d. Líquidos inflamables. Son aquellos líquidos que fácilmente pueden arder. El que un líquido arda con más o menos facilidad depende de su punto de llama.

Sustancias tóxicas. Peligro. Tras una inhalación, ingestión o absorción a tra-vés de la piel pueden presentarse, en general, trastornos orgánicos de carácter grave o incluso la muerte. Ejemplo: trióxido de arsénico, cloruro de mercurio(II). Precaución. Evitar cualquier contacto con el cuerpo y en caso de malestar acu-dir inmediatamente al médico.

Sustancias nocivas. Peligro. La incorporación de estas sustancias por el orga-nismo produce efectos nocivos de poca trascendencia. Ejemplo: tricloroetileno. Precaución. Evitar el contacto con el cuerpo humano así como la inhalación de vapores. En caso de malestar acudir al médico.

Sustancias corrosivas. Peligro. Por contacto con estas sustancias se destruye el tejido vivo y también otros materiales. Ejemplo: bromo, ácido sulfúrico.Precaución. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel, los ojos y la ropa.

Sustancias irritantes. Peligro. Este símbolo destaca en aquellas sustancias que pueden producir acción irritante sobre la piel, los ojos y sobre los órganos respiratorios. Ejemplo: amoníaco, cloruro de bencilo. Precaución. No inhalar los vapores y evitar el contacto con la piel y los ojos.

Sustancias peligrosas para el ambiente. En general, todas las sustancias que naturalmente no están en un ambiente dado son potencialmente dañinas para la flora, la fauna o los microorganismos. De las sustancias usadas en el Taller Experimental IV, el bromuro de etidio es un ejemplo de este tipo de sus-tancias.

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Unidad de Habilitación No. 1

Preparación y esterilización de medios de cultivo y materiales usados en microbiología

Introducción. La base del estudio de los microorganismos es el medio de cultivo, sobre el cual se hacen crecer de forma individual permitien-do su caracterización. El medio de cultivo debe estar completamente libre de otros microorganismos del ambiente, de manera que no haya interferencias con los microorganismos de interés. Se llama esteriliza-ción a los procedimientos que dejan al objeto o material tratado libre de toda forma de vida. La esterilización puede llevarse a cabo con dis-tintos tipos de agentes: físicos y químicos. Por otro lado, en microbiolo-gía, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se impida cualquier tipo de contaminación en el área de trabajo. Los procedimientos utilizados para conseguirlo se conocen con el nombre de técnica aséptica, y se citan a continuación:

- Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor.

- Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar. Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez desta-padas, y después de la inoculación.

- Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetán-dolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces.

- Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada para que el riesgo de contaminación sea mínimo.

- Las tapas de las placas Petri no deben colocarse sobre la mesa de trabajo.

Objetivo. Preparar y esterilizar medios de cultivo y materiales utiliza-dos en microbiología por medio de calor húmedo.

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Material y métodos.

2 matraces Erlenmeyer de 500 mL1 matraz Erlenmeyer de 250 mL1 espátula1 probeta de 250 mL1 piceta1 vaso de precipitados de 400 mL2 placas de Petri de vidrio20 placas de Petri desechables15 puntas para micropipeta de 1000 µL (azules)20 puntas para micropipeta de 200 µL (amarillas)10 tubos de ensayos de 16 x 150 mmPalitas triglásicas1 frasco de vidrio con tapa de rosca2 mecheros Fisher1 potenciómetro1 autoclave1 parrilla agitadora con magnetoPapel aluminioSoluciones buffer pH 7.0 y pH 4.0agar dextrosa papaagar nutritivoagar bacteriólogico

Procedimiento:Preparación y esterilización de medios de cultivo.1.- Prepare 250 mL de medio de cultivo de agar dextrosa papa (ADP) y agar nutritivo (AN), siguiendo las instrucciones del fabricante (lea la etiqueta del frasco).2.- Para tener una consistencia de los medios más firme, agregue 5 g de agar bacteriológico por cada litro de medio y ajuste el pH. Para bac-terias (AN) a un pH 7.0 y para hongos (ADP) a pH de 5.6.

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3.- Coloque los medios en matraces Erlenmeyer, agite bien, colóqueles tapones de algodón y gasa, y esterilícelos mediante calor húmedo (au-toclave). La esterilización en autoclave implica el calentamiento de los materiales a 121º C (1 atmósfera de presión) durante al menos 20 mi-nutos.4.-Mientras se esterilizan los materiales practique el vaciado en placa, utilizando agua con placas de Petri de vidrio.5.-Después de esterilizar, enfríe los matraces con medios de cultivo a 45º C para vaciarlos en las placas de Petri desechables; cada placa de 10 cm de diámetro deben recibir aproximadamente 20 mL de medio. Este procedimiento deberá realizarse en un área desinfectada, por ejemplo en una campana de flujo laminar; también puede utilizar una mesa limpia y libre de corrientes de aire, usando dos mecheros Fisher para mantener la esterilidad del área.6.- Espere a que el medio se gelifique, selle las placas con cinta de plástico autoadherible (KleenPack) y déjelas en un sitio seco y limpio durante 24 horas a temperatura ambiente para verificar la esterilidad. Después de este tiempo no deberá haber contaminación por bacterias u hongos en los medios. En caso de esterilidad, estarán listos para usarse en el aislamiento de microorganismos.

Preparación de materiales para aislamiento de microorganismos.1.- A cada uno de 10 tubos de ensayos de 16 x 150 mm agregue 9 mL de agua destilada o solución salina, colóqueles tapones de algodón/gasa y esterilícelos en autoclave.2.- Esterilice en autoclave un matraz Erlenmeyer de 250mL que tenga una marca en el volumen de 100 mL; para esto agregue 100 mL de agua con una probeta y marque el nivel alcanzado por el agua con una cinta adhesiva (masking tape). 3.- Coloque un agitador magnético en el interior del matraz, colóquele un tapón de algodón/gasa y esterilícelo en autoclave.4.- Esterilice en autoclave los siguientes materiales: puntas de micropi-peta amarillas y azules (colocadas en un frasco con tapa de rosca o en un portapuntillas); cuadros de papel aluminio de 5x5 cm; pipetas de vidrio de 10 mL y espátula (envueltos en papel estraza); 100 mL de agua destilada.

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5.- Todo el material será utilizado en la práctica de aislamiento de bac-terias y hongos.

Cuestionario que deberá responder y anexar al reporte:

1.- ¿Cuáles son los métodos de esterilización física que más se utilizan? Explique en que consiste cada uno de ellos.

2.- ¿Cuáles son los métodos de esterilización química más utilizados? Explíquelos.

BIBLIOGRAFIA:

Campbell, R., (1987). ECOLOGÍA MICROBIANA, edit. Limusa., pp. 11-23. México, D.F.

Madigan, M. T., Martínho, J. M., Parker, Jack. . Brock Microbiología de los microorganismos. 10ª. Edición. Person Prentice Hall. España.

Aquiahuatl, M. A. y Pérez M. L. (2004) Manual de Prácticas de Laborato-rio de Microbiología General. Depto. De Biotecnología. Universidad Au-tónoma Metropolitana.

Schlegel, Hans G. (1997). Microbiología General . 9ª. Edición. Barcelona , España. Pp. 654.


Aislamiento de bacterias y hongos de muestras de suelo

Introducción. En microbiología se trabaja con cultivos puros de mi-croorganismos. Un cultivo puro es aquél en que todas las células pro-

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vienen de una sola célula inicial. Una colonia de cualquier microorganis-mo es un cultivo puro, ya que todas sus células proceden de una inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar un microorganismo de una muestra cualquiera, es preciso ver colonias del mismo, lo que implica que el aislamiento ha de realizarse en medio sólido en placa.

Los medios de cultivo pueden ser líquidos, semisólidos o sólidos, aun-que para aislamiento se prefieren los dos últimos, ya sea en placa de Petri o en tubo de ensayos; éstos llevan en su composición agar como agente solidificante, en distintas proporciones, según se trate de me-dios sólidos o semisólidos. Cuando se usan los tubos, el medio puede estar inclinado, en cuyo caso la siembra se realiza en estría sobre la superficie, o sin inclinar, en cuyo caso la siembra se realiza con un asa de platino recta, picando el medio por la zona central. Según su composición se pueden dividir en medios mínimos o simples y medios complejos. Los medios definidos contienen los nutrientes ne-cesarios para la especie con la que se trabaja, pero todos y cada uno de ellos se añaden por separado, conociéndose exactamente la canti-dad de cada uno.

Los medios selectivos son los que contienen alguna sustancia que sólo permite el crecimiento de una especie o de un grupo de especies rela-cionadas; por ejemplo, el medio de MacConkey es selectivo para ente-robacterias por su contenido de sales biliares. Los medios diferenciales son los que permiten distinguir entre dos microorganismos, según el resultado del crecimiento en ese medio, por ejemplo el medio de Mac-Conkey es también diferencial porque permite distinguir, mediante un cambio de color, los microorganismos que utilizan la lactosa de los que no lo hacen y lo mismo ocurre con el Chapman con respecto al manitol.Independientemente del tipo de medio utilizado, para el aislamiento de microorganismos se requiere diluir lo suficiente una muestra, sembrarla en medio de cultivo y finalmente purificarla por resiembras consecuti-vas.

Objetivo. Aislar bacterias y hongos de una muestra de suelo.

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Material y Métodos.

Puntas para micropipeta de 1000 µL estérilesPuntas para micropipeta de 100 µL estériles1 frasco con tapa estéril10 tubos de 16x150 mm con 9 mL de agua estérilPalitas triglásicas estériles1 espátula estérilCuadros de papel aluminio de 5x5 cm estériles1 pipeta de 10 mL estéril1 matraz Erlenmeyer de 250 mL estéril con marca en 100 mLMicropipetas de 1000 µL y 200 µLPlacas con medio ADP y AN estérilesMuestra de suelo (50 g)Agua destilada estéril (100 mL)

Procedimiento:1.- Pese sobre un cuadro de papel alumnio 10 g de suelo y agréguelo al matraz Erlenmeyer, complete con agua estéril hasta la marca de 100 mL y agite vigorosamente por 5 minutos. Considere a esta mezcla como extracto diluído 10-1.2.- Realice las diluciones siguientes en tubos de 16x150 mm que con-tienen 9 mL de agua: 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y 10-8. Para esto tome 1mL del extracto diluído 10-1 (matraz E.M.), deposítelo en el pri-mer tubo y agite en vortex, ésta será la dilución 10-2. Proceda a hacer las demás diluciones consecutivamente en los demás tubos. Recuerde que todo debe hacerse en un área estéril.3.- Tome 100 µL de las muestras diluídas correspondientes a los tubos 10-6, 10-7 y 10-8, coloque el líquido sobre medio AN en placa de Petri y homogeneizar utilizando una palita triglásica. Estos serán los cultivos de bacterias.4.- Tome 100 µL de las muestras diluídas correspondientes a los tubos 10-3, 10-4 y 10-5, coloque el líquido sobre medio ADP en placa de Petri y

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homogeneizar utilizando una palita triglásica. Estos serán los cultivos de hongos.5.- No olvide agregar al frasco con tapa un poco de alcohol para esteri-lizar la palita triglásica al finalizar cada homogenización, flameando hasta quemar el alcohol.6.- Incube las placas en posición invertida en una estufa a 37º C o al medio ambiente.7.-Verifique el crecimiento a las 24 h para bacterias y a las 48 h para hongos.8.- Registre el número de colonias de microorganismos y sus caracte-rísticas más sobresalientes en cada caso.


1.- ¿Qué método se utiliza preferentemente en el aislamiento de mi-croorganismos?

2.- ¿Qué otros métodos existen para aislar microorganismos?

3.- ¿Qué factores se toman encuenta para aislar los microorganismos? Explique.

BIBLIOGRAFIA:



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Cuantificación, purificación y conservación de bacterias y hon-gos

Introducción. Existe gran variedad de métodos que implican el cultivo de microorganismos. Puede ser necesario diluir o concentrar la muestra

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para que se desarrolle un número suficiente de organismos en cada caja (caja de dilución) o en cada tubo de ensayo. La suposición básica es que cada propágulo en el medio dé origen a una colonia macroscópi-ca que se pueda contar. Obviamente, la suposición está abierta a la crítica; las células pueden estar en grupos o microcolonias. Esto puede conducir a cálculos incompletos y a que los conteos de cultivos repre-senten del 1% al 10% de los conteos directos en el suelo, y todavía menos en muestras de agua. Esto puede deberse en parte a que en el método directo se encuentran tanto células muertas como vivas. El otro problema con los métodos de cultivo es que con los hongos, y has-ta cierto grado con las algas, el número tiene en realidad poco signifi-cado. No hay una forma fácil de saber si la colonia macroscópica de hongos se originó a partir de una hifa o de una espora, y en caso de haberse originado de una hifa, que longitud tenía ésta.

Los métodos de cultivo permiten que se hagan conteos, pero hay tam-bién métodos que sólo proporcionan una guía aproximada a los núme-ros, o incluso sólo indican que está presente o ausente, estos son los métodos de enriquecimento.

El método de número más probable (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. El conteo de unidades formadoras de colonias en placa (UFC) es una técnica mu-cho más precisa que NMP para la cuantificación de bacterias y hongos.

En ocasiones es necesario mantener, de forma prolongada, cultivos puros. Usualmente cultivos en medios líquidos o sólidos pierden viabili-dad en un espacio de varias semanas a pocos meses. Por lo tanto, para el almacenaje de cultivos a largo plazo es necesario recurrir a otros métodos que permitan mantener estos cultivos viables. Esta tarea no es simple debido al hecho de que diferentes poblaciones poseen dife-rentes adaptaciones, y requerimientos nutricionales y ambientales. El almacenaje en glicerol y en suelo son dos estrategias eficientes para muchas especies de microorganismos.

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Objetivo. Practicar los métodos de conteo por UFC, de purificación y conservación de microorganismos.


4 tubos de ensayos de 16x150 mm2 botellas de Roux1 espátula1 vaso de precipitados de 400 mL1 potenciómetro1 piceta1 pipeta de 10 mL1 probeta de 50 mL10 placas de Petri desechables1 matraz Erlenmeyer de 500 mL4 tubos de 13 x 100 mmNaClKClCaCl2Agar nutritivoAgar dextrosa papa

Procedimiento:

1.- Cuantifique por el método de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) las colonias de microorganismos que se sembraron en la práctica anterior:

UFC: número de colonias por placa x 100 Dilución

2.- Prepare 10 placas de Petri con el medio en el que creció su microor-ganismo y purifique 2 cepas, en el caso de bacterias, sembrar por el método de estría cruzada.

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3.- Para la purificación de hongos sembrar por picadura.4.- Esperar su crecimiento durante 24 hrs y 48 hrs en el caso de los hongos. Si es necesario (en caso de que las colonias no estén puras) haga una resiembra adicional.5.- Posteriormente, cuando las bacterias y hongos se hayan purificado proceda a la conservación.6.- Las bacterias se conservarán en medios inclinados. En tubos de 16x150 mm agregue 8 mL de Agar Nutritivo (durante la preparación agregue 8 g de agar bacteriológico adicionales por cada litro de AN; caliente el medio antes de agregar a los tubos; esterilizar e inclinar los tubos cuando salgan del autoclave).6.- Los hongos se conservarán en botellas de Roux. Las botellas se pre-paran con aproximadamente 35 mL de medio Agar Dextrosa papa. Ca-liente el agar antes de agregar a las botellas, después de esterilizar dejar en forma horizontal. Conjuntamente esterilizar 2 tubos de 13x100 mm con 1 mL de agua destilada y agregarle 5 perlas de ebullición.7.- Conserve las bacterias tomando con un asa estéril una muestra de una colonia pura y siembre en los tubos por estría cruzada. Incube a temperatura ambiente.8.- Tome una muestra de la cepa pura de hongo y colóquela en el tubo de 13x100 mm con 1 mL de agua, agite en un vortex y agregue la mez-cla a una botella de Roux con medio de ADP. Esperar hasta 5 días a que el hongo esporule.9.- A dos tubos de 13x100 mm agregar 2 mL de solución Ringer y este-rilizar. Esta solución servirá para recolectar las esporas de hongos y conservarlas.

Preparación de la solución ringerNaCl 7 gKCl 0.25 gCaCl2 anhidro 0.30 gAgua destilada 500 mL


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1.- Investigue en que consiste el método del NMP y UFC.2.- ¿Qué métodos se utilizan para la purificación de microorganismos?3.- ¿Cuánto tiempo dura la conservación de bacterias en tubos inclina-dos?3.- ¿Por qué se conservan las esporas en solución Ringer y cuánto tiem-po tardan?4.-Conforme a sus resultados realice sus conclusiones, entregar los tubos inclinados con las cepas puras y los tubos con solución ringer con las esporas extraídas.

BIBLIOGRAFIA:





Morfología macroscópica y microscópica de bacterias y hongos

Introducción. Las bacterias son microorganismos procarióticos se en-cuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, habitan en el agua, en el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre, en simbiosis o como parásitos. Fisiológicamente este grupo presenta características varia-bles, hay bacterias móviles e inmóviles, fotosintéticas y quimiotrófas: se desarrollan en un amplio rango de temperatura, pH y condiciones gaseosas. En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celu-

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lar, forma de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y comporta-miento en medios líquidos y sólidos (forma, tamaño, elevación y color de las colonias).

Por su parte, los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tama-ño que las bacterias, se distinguen de los animales por ser inmóviles y de las plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos. Son de nutrición heterótrofa es decir dependen de nutrientes orgánicos que son solubili-zados por sistemas enzimáticos específicos y son absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática. Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multicelulares (filamentosos), sin embar-go, también existen hongos dimórficos principalmente patógenos que se presentan en las dos formas alternativamente, dependiendo de las condiciones ambientales, como la temperatura. EL cuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos (mohos) se deno-mina talo, generalmente constituido de hifas ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos. Aunque en el caso de los Zygomycetos las hifas no presentan estos septos y se les conocen como hifas cenocíticas.

El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual, por fragmentación de las hifas vegetativas o por la producción de abundan-tes esporas en conidióforos o esporangióforos formados en hifas aéreas llamadas hifas reproductivas. La descripción de las estructuras de re-producción sexual es el principal criterio de clasificación.

Objetivo: Observar diferentes formas macroscópicas y microscópicas de bacterias y hongos.

Material y Métodos:Cepas puras de bacterias y hongosportaobjetoscubreobjetos

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asa bacteriológica1 microscopio1 transiluminador de luz visible, con lupa1 aceite de inmersiónCinta adhesiva transparente azul de lactofenolReactivos para tinción de gram (Cristal violeta, Yodo lugol, Alcohol ce-tona y Safranina)

Procedimiento:Morfología colonial y microscópica de bacterias.1.- Observe las colonias de bacterias utilizando un transiluminador visi-ble (con lupa), para esto coloque las cajas de Petri donde están crecien-do las colonias en distintos ángulos, de manera que pueda observar su forma, elevación, bordes o márgenes, superficie, textura y color. Auxí-liese de la figura de abajo. 2.- Esquematice lo observado y describa macroscópicamente las cepas bacterianas.

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3.- Prepare un frotis de las bacterias tomando una porción de la colonia con un asa, colóquela sobre un portaobjetos, distribúyala homogénea-mente y seque con calor.4.- Proceda a realizar la tinción de Gram: Agregar al frotis una solu-ciónn de Azul Violeta hasta cubrirlo completamente, espere 1 minuto; lave abundantemente con agua, pero sin dañar el frotis; añada solución de Yodo-Lugol y espere 1 minuto; vuelva a lavar con agua suficiente; agregue solución de Alcohol-Cetona y espere exactamente 10 segun-dos; lave nuevamente; coloque solución de Safranina durante 1 minuto, lave y deje secar.5.- Observe al microscopio de campo claro a distintos aumentos y des-criba la forma, agrupación y tipo de reacción a la tinción Gram. Si las células se tiñen de color azul son Gram negativa, mientras que si se tiñen de color rojo se trata de una bacteria Gram positiva.

Morfología colonial y microscópica de hongos.1.- Observe las colonias puras de hongos filamentosos utilizando un transiluminador visible (con lupa), para esto coloque las cajas de Petri en distintos ángulos. Registre la forma, tamaño y tipo de colonia, así como las características del micelio (algodonoso, aterciopelado, vello-so, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color de las espo-ras y cambios en el medio de cultivo.

2.-Realizar un frotis tomando una muestra del borde de una colonia con una cinta adhesiva transparente. En la zona central de una colonia pue-de haber una excesiva concentración de esporas. Colocar una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjetos, colocar cuidadosamente la cinta adhesiva con el hongo sobre la gota de colorante y secar a la fla-ma de un cerillo. Limpie la parte inferior del portaobjetos con algodón y observe al microscopio de campo claro a distintos aumentos.3.- Esquematice y registre lo observado: micelio con o sin septos (ta-maño, estructuras de reproducción), tipo de esporas (tamaño), etc.

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1.- Investigue la clasificación de los hongos de acuerdo a su tipo de reproducción.2.- ¿Porqué algunas bacterias son gram positivas y otras gram negati-vas? Explique

BIBLIOGRAFIA:




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Pruebas de diferenciación bioquímica en microorganismos

Introducción. El metabolismo es toda la serie de reacciones que ocu-rren en los seres vivos. Estas reacciones incluyen procesos de obten-ción de energía como son: la descomposición de moléculas orgánicas en los quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los fotótrofos, así como también de síntesis de material celular a partir de nutrientes esenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabóli-cas son sintetizadas por enzimas, que en su mayoría funcionan dentro de las células por lo que se conocen como endoenzimas, hay también exoenzimas principalmente hidrolíticas que son liberadas por la célula para catalizar reacciones fuera de ésta.

En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de los microorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo,

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con sustratos que pueden utilizar como fuentes de energía, fuentes de carbono y otros nutrientes esenciales para su crecimiento.

La mayoría de microorganismos, utilizan como fuente de carbono y energía la glucosa. Al entrar a la célula, esta es oxidada en su forma incompleta (fermentación) o completa (respiración) dependiendo de la presencia de oxígeno y de las actividades enzimáticas celulares.

Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivo con indicadores de pH para detectar la producción de ácido o álcali; con inhibidores selectivos con bilis, cianuro, colorantes, sulfuros, etc., que facilitan la determinación de diferentes actividades metabólicas como son: la capacidad para fermentar carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa) catabolizar aminoácidos y urea, la producción de enzimas específicas de tipo endo o exo como oxidasas, reductasas, amilasas, lipasas, etc.

Objetivo. Realizar cultivos en medios con sustratos específicos que permitan demostrar actividades metabólicas de bacterias, hongos y actinomicetos.


2 placas con medio de cultivo Czapeck Dox con celulosa2 placas de Agar nutritivo con almidón2 placas de Agar con fosfato tricálcicoAsa bacteriológicaCepas puras de bacterias y hongos

Capacidad para hidrolizar celulosa1.- Se determinará la capacidad de hidrolizar celulosa a las cepas de microorganismos aislados en la Práctica No. 2. Cada una de las cepas de bacterias, hongos y actinomicetos se sembrarán por duplicado.

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2.- Prepare el medio Agar Czapeck Dox para cajas de Petri (20 mL de medio por placa), adicionalmente agregar 2% de celulosa, ajustar el pH a 7.3 y esterilizar.3.- Siembre los microorganismos utilizando el asa bacteriológica e incu-be durante 7 días a 28ºC.4.- Adicione a la superficie del medio con los microorganismos crecidos 10 mL de una solución acuosa (1:400) de Rojo Congo.5.- La mezcla se deja reaccionar por espacio de 10 minutos al término del cual el colorante se retira por decantación.6.- La superficie de hidrólisis alrededor de la colonia, incolora con res-pecto al resto del medio que permanece rojo intenso, será el indicador de una prueba positiva.

Capacidad para hidrolizar almidón1.- Se determinará la capacidad de hidrolizar almidón a las cepas de microorganismos aislados en la práctica 2.2.- Prepare agar nutritivo para cajas de Petri (20 mL de medio por pla-ca), adicionalmente agregue 1% de almidón, ajuste el pH a 7.0 y esteri-lice en autoclave.3.- Cada uno de los microorganismos sembrarán por duplicado. Des-pués de 48 horas de cultivo a 28ºC, se adicionará a la superficie del medio de crecimiento unas gotas de lugol hasta cubir la colonia y el medio. 4.- La mezcla se deja reaccionar por espacio de 10 minutos al término del cual el colorante se retira por decantación. 5.- Las colonias que no muestren reacción con el yodo, es decir, donde el medio permanezca color café claro, deben ser consideradas positivas para hidrólisis de almidón.

Capacidad para solubilizar fosfato1.- Prepare un medio selectivo a base de fosfato tricálcico.2.- En un litro agregar:

Ca2(PO4)3 2 gGlucosa 20 gExtracto de levadura 2 gAgar 15 g

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Agua c.b.p. 1 L3.- El medio deberá observarse color turbio-opaco en la placa de Petri.4.- Siembre las cepas de microorganismos y permita su crecimiento durante 48 h.5.- Las cepas que presenten un halo transparente deben ser considera-das positivas.

BIBLIOGRAFIA:

Díaz Zagoya Juan C. y Juárez Oropeza Marco Antonio. (2007). BIOQUIM-ICA. Edit. Mc Graw Hill. India, Delhi.


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Unidad de Habilitación No.6

Observación de la ruta anabólica fotosintética

Introducción. La fotosíntesis es probablemente la ruta anabólica (de fabricación de biomasa y almacenamiento de energía) más importante para la mayoría de los seres vivos del planeta, incluyendo desde luego al ser humano. Mediante este proceso las plantas y otras células foto-sintéticas aprovechan la energía luminosa para catalizar la conversión del carbono inorgánico del aire en enlaces carbono-carbono (orgáni-cos), es decir, energía química almacenable. Entre los factores que más influyen en la fotosíntesis se pueden citar a los del ambiente, tales como el pH, la luz, la concentración de CO2 y la temperatura.

La fotosíntesis puede ser fácilmente observada de manera indirecta, por ejemplo, cuando se estudian plantas acuáticas, a través de cam-bios en el pH del agua circundante. Cuando el contenido de CO2 en el agua es alto el pH es bajo por la formación de ácido carbónico disuelto, cuando las plantas fotosintetizando consumen el CO2 el pH se eleva. Estos cambios se pueden observar añadiendo indicadores coloridos de

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pH como el azul de bromotimol que adquiere un color amarillo a pH entre 4 y 6, y un color azul a pH arriba de 7.

Objetivo. Observar la influencia de la luz el proceso fotosintético a través de cambios en el pH del medio.


Tubos de ensayos de 16x150 mmRamitas de Elodea canadensisLámpara de 75 W de luz blanca fluorescenteGradilla para tubos de 16x150 mmPipeta PasteurPapel de aluminio o caja negraPapel indicador de pH de 0-14Solución de azul de bromotimol al 0.1% con goteroLápiz de cera o etiquetas

Procedimiento:1.- Llene tres tubos de ensayos con agua potable (en la que estén las plantas) hasta un tercio del borde.2.- Agregue gotas de azul de bromotimol, agitar hasta que adquiera color azul homogéneo.3.- A dos de los tubos burbujee con la boca aire expirado por medio de una pipeta Pasteur limpia hasta que el color pase de azul a amarillo; determine el pH con papel indicador.4.- Introduzca en cada uno de los tubos con la solución amarilla una ramita de Elodea canadensis que presente su extremo apical intacto. Envuelva uno de los tubos con papel aluminio o déjelo en la oscuridad (por ejemplo, dentro de una caja negra). Deje el otro tubo con planta y aquel sin planta (solución color azul) a la luz del sol o de una lámpara de 75 W.

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5.- Espere algunos minutos hasta que note algún cambio en el tubo con la planta expuesta a la luz. Observe el tubo que quedó en oscuridad y compare los tres tubos.6.- Determine nuevamente el pH en cada tubo con papel indicador.7.- Anote sus resultados en un cuadro como el siguiente:

Determinación indirecta de la ocurrencia de fotosíntesis en Elodea canadensisTratamiento Color de la solución pH de la solución

inicial final inicial finalPlanta en

luzPlanta en oscuridadControl sin

planta


1.- ¿Por qué la solución cambió de color en el tubo con planta expuesta a la luz?2.- ¿Qué está ocurriendo en el tubo con planta en oscuridad?3.-Explique los cambios de pH detectados. Recuerde que el azul de bro-motimol es un indicador de pH que va de 6.0 a 7.6 (azul y amarillo res-pectivamente).

BIBLIOGRAFIA:



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Cuantificación de la concentración de CO2 consumido en la fotosíntesis

Introducción. El incremento de gases de efecto invernadero en la at-mósfera, específicamente de CO2, derivado del consumo excesivo de combustibles fósiles está teniendo un impacto negativo sobre el clima global. Entre las distintas alternativas de solución que se han propuesto están la reducción del consumo energético y la promoción del proceso fotosintético mediante la reforestación de grandes áreas. La gran ven-taja de la fotosíntesis radica en que forma parte esencial del ciclo del carbono al fijarlo del aire en forma de CO2. Resulta de vital importancia la comprensión de este proceso, así como la estimación de la tasa de fijación del gas.

Cuando se estudian plantas acuáticas es relativamente fácil estimar la cantidad de carbono fijado; puesto que el CO2 forma reversiblemente ácido carbónico acidificando el agua, es posible medir mediante alcali-metría la cantidad de ácido y por lo tanto de CO2 en el agua antes y

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después del cultivo de una planta acuática. La disminución de la acidez al final es un indicador del carbono fijado.

Objetivo. Cuantificar el CO2 fijado por tejidos vegetales durante el pro-ceso de la fotosíntesis.


Ramas de Elodea canadensis colocadas en un recipiente con agua.Tubos de ensaye grandes o frascos de 50 mLVasos de precipitados de 50 mLBureta con soporte o jeringa hipodérmicaPipetasEmbudos pequeñosSolución de NaOH al 0.04%Solución de fenolftaleína al 0.5% con goteroLámpara de 75WPapel aluminio o caja negra.

Procedimiento:1.- Saque una alícuota de 10 mL de agua del recipiente donde se en-cuentran las plantas y colóquela en un vaso de precipitados de 50 mL, agregue unas gotas de fenolftaleína al 0.5% y titule gota a gota con el NaOH contenido en una bureta, agite bien el vaso después de cada gota.2.-Continúe así hasta la aparición de un color rosa, agregue otra gota más para permitir que el color rosa permanezca.3.-Anote el número de mL de álcali usados para llegar a este punto; ésta medición corresponde al control.4.- Llene dos tubos de ensayo con agua del recipiente de las plantas e incorpore en cada uno una ramita de Elodea de tamaño lo más pareci-do posible, deje uno en la luz y el otro en la oscuridad.

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5.- A las dos horas titule del mismo modo una alícuota del tubo en os-curidad y otra del tubo a la luz. Anote el número de mililitros gastados en cada caso.6.- Calcule el número de micromoles de CO2 de cada muestra multipli-cando por 10 el número de mililitros de NaOH gastados en la titulación, ya que cada mililitro de la solución de NaOH al 0.04% recién preparada puede combinarse con 10 micromoles de CO2.7.-Anote los valores de sus mediciones de titulación en el cuadro de abajo, teniendo en cuenta que el número de micromoles de CO2 en el control equivale a la cantidad inicial de este gas en el agua al comen-zar el experimento; la disminución equivale entonces a la cantidad usa-da en el proceso de la fotosíntesis.

Consumo de CO2 durante la fotosíntesis en ElodeaCondición Cantidad de CO2 inicial

(µM)Cantidad de CO2 usa-da en la fotosíntesis

(µM)Luz

Oscuridad

Cuestionario que deberá responder y anexar al reporte:1.- ¿Cómo se comportó la concentración de CO2 en el tubo con planta, pero en oscuridad?2.- ¿Porqué?

BIBLIOGRAFIA:


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Aislamiento de DNA de bacterias del género Azospirillum

Introducción. El DNA es el material genético donde están codificadas todas las características fenotípicas de los seres vivos. La estructura básica del DNA es idéntica en todos los organismos: está compuesta por dos cadenas de nucleótidos unidas por la complementariedad de las bases a través de puentes de hidrógeno, entre A y T o C y G en for-ma de doble hélice.

El aislamiento y purificación del DNA es el primer paso en cualquier análisis genético. La selección del método de extracción está determi-nada por la estructura celular de cada organismo y la aplicación que se requiere.

El género Azospirillum fue descubierto por Beijerinck, quien lo nombró como Spirillum lipoferum, en 1925, y fue caracterizado por Döbereiner y Day en la década de 1970. En 1978 fue reclasificado por Tarrand, Krieg y Döbereiner, quienes basados en estudios de homología del ADN describieron el nuevo género Azospirillum, con dos especies: A. lipofe-rum y A.brasilense. El género Azospirillum comprende bacilos gruesos,

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ligeramente curveados o rectos, y a menudo con extremos puntiagu-dos; Gram negativos en cultivos jóvenes, pudiendo ser Gram variables en cultivos envejecidos. En cuanto a características fisiológicas, Azospi-rillum posee la capacidad de fijar nitrógeno, pero solo bajo condiciones microaerofílicas, debido a que carece de mecanismos para proteger a la enzima nitrogenasa de la acción del oxígeno.

Las bacterias del género Azospirillum son de gran importancia en la agricultura, ya que actualmente están siendo usados como biofertili-zantes de nitrógeno.

Objetivo. Practicar el método de aislamiento de DNA utilizando una cepa de Azospirillum.

Materiales y Métodos.

Cepa de AzospirillumAcetato de Amonio 3MIsopropanol Etanol al 80%10mM Tris-HCl100mM NaCl1mM EDTASDS al 10%2 tubos de 13x1001 vaso de precipitado de 400 mL1 microcentrifuga1 termoblock (baño maría para tubos de microcentrifuga)1 termómetro1 micropipeta de 1000 µL1 micropipeta de 200 µL1 agitador de tubosHieloTubos de microcentrifuga de 2 mL

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Procedimiento:

Agregue 1 mL de un cultivo en crecimiento a un tubo de micro-centrifuga.

Centrifugue a 11 000 r.p.m. durante 5 minutos, remover el so-brenadante

Agregue 700µL de solución TES y SDS al 10% suavemente pipe-tear hasta que las células estén resuspendidas.

Incube a 80º C por 5 minutos para lisar las células. Entonces enfriar a temperatura ambiente durante 15 minutos

Agregue 200 µL de solución de acetato de amonio. Agitar vigo-rosamente a velocidades altas por 20 segundos

Incube la muestra en hielo por 5 minutos Centrifugue a 11 000 r.p.m. por 3 minutos Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de 1.5 mL que con-

tenga 800µL de isopropanol Centrifugue a 11 000 r.p.m. durante 5 minutos Deseche el sobrenadante y seque el tubo con papel absorbente.

El DNA queda en el fondo del tubo. Agregue 300 µL de etanol al 70% a temperatura ambiente y

suavemente invierta el tubo varias veces al lavar el pellet de DNA.

Centrifugue a 11 000 r.p.m. por 2 minutos, después cuidadosa-mente aspire el etanol.

Drene el tubo sobre un papel absorbente y permita que el pellet se seque al aire por 10-15 minutos

Agregue 100 µL de TE e incubar a 65º C por 1 hora. Periódica-mente mezclar la solución suavemente tapando el tubo.

Guarde el tubo en refrigeración para posteriores análisis.

Solución TES10mM Tris-HCl100mM NaCl1mM EDTApH 9

Solución de TETris 10 mMEDTA 1 mMpH 8.0, ajustar con HCl

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esterilizar en auto-clave


1.- ¿Para qué sirven las soluciones TES, SDS y acetato de amonio?2.- Al agregar isopropanol al sobrenadante ¿qué sucede?3.- ¿Cómo podría probar que lo aislado es efectivamente DNA?BIBLIOGRAFIA:

Junqueira, L. C. y Carneiro José (1997). BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECU-LAR. Edit. Mc. Graw-Hill. 6ª.Edición. Chile,

Lewin, Benjamin. (2000). GENES VII. Edit. Oxford University. Estados Unidos de América, Washinton.

Jiménez Cardoso, Enedina (2004). MANUAL DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR BÁSICA. Edit. Prado. México, D.F.

PROMEGA Technical Bulletin. (2005). Wizard® SV Genomic DNA Purifi-cation System. E.U.A. 16 pp.

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Electroforesis de DNA de Azospirillum en gel de agarosa

Introducción. La electroforesis se basa en la capacidad de las macro-moléculas cargadas para desplazarse en un campo eléctrico, con velo-cidad directamente proporcional a su carga e inversamente proporcio-nal a su tamaño. A pH alcalino las moléculas de DNA poseen una carga negativa uniforme por unidad de masa, lo que hace que su movilidad sea hacia el polo positivo y qué esté determinada por el tamaño de las moléculas (número de pares de bases).

La electroforesis es una herramienta de vital importancia en el análisis del DNA, por ejemplo, para separar fragmentos de distinto tamaño ob-tenidos por restricción o por PCR. Dependiendo de la concentración del polímero con que se fabrica el gel (agarosa, poliacrilamida o almidón) se puede tener una red de malla grande (para moléculas grandes) o pequeña (para fragmentos pequeños).

En particular la electroforesis en agarosa es de gran utilidad para verifi-car la integridad de una muestra de DNA extraído, es decir, que el DNA genómico no esté fragmentado. En ese caso, se debe observar una sola banda (no un barrido) con poca migración en el gel.

Objetivos. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para el corri-miento del DNA extraído de Azospirillum.

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Muestra de DNA de AzospirillumAgarosa para electroforesisBuffer TAE 1xBuffer de carga 10XBromuro de etidio 10mg/mLAgua destiladaMicropipeta de 200 µL con puntas estérilesMicropipeta de 10 µL con puntas estérilesMatraz Erlenmeyer de 500 mLProbeta 500 mLProbeta de 250 mLPapel enceradoEspátulaGuantes de látexCubrebocasBalanza analíticaCámara de electroforesis horizontal, con peine de 10 dientesFuente de poderTransiluminador UVAnteojos con protección para luz UV

Procedimiento:1.- Prepare una solución de agarosa al 1% en buffer TAE 1X; para esto primero mida con agua el volumen que se requiere para formar un gel de 0.8 cm de grosor. Por ejemplo: si el volumen es 100 mL, pese 1 g de agarosa en balanza analítica, coloque en un matraz E. M. de 500 mL y añada 100 mL de buffer TAE 1X con una probeta, disuelva la agarosa calentando hasta ebullición (opcionalmente puede utilizar un horno de microondas), deje enfriar a 50º C y agregue 3 µL de bromuro etidio (la concentración final será de 0.3 mg/L).2.- Cuando la agarosa esté a una temperatura de 40º C, vacíe en el molde para geles de la cámara, con el peine en su lugar.

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3.- Después de polimerizar, retire el peine y coloque el gel en la cámara de electroforesis que contenga 450 mL de buffer TAE 1X o un volumen tal que cubra completamente el gel. Vea al final la receta para preparar el buffer TAE.4.- Sobre un papel encerado mezcle 10 µL de la muestra de DNA más 3 µL de buffer de carga 10X, homogenice pipeteando varias veces y de-posite en uno de los pozos del gel.5.- Siguiendo el mismo procedimiento, otros equipos de personas debe-rán colocar sus muestras en los otros pozos o carriles del gel, procuran-do dejar un espacio libre entre muestras.6.- Corra la electroforesis a 100 voltios, durante 45 minutos o hasta que el colorante del buffer de carga esté a 1 cm de la orilla del gel.7.- Revele el DNA en un transiluminador con lámpara de luz UV.8.- Para observar los resultados utilice anteojos con filtro para UV.

Preparación del buffer TAE

Tris 20 mMAcetato de sodio 6mMÁcido tetracético etilendiamino disódica (EDTA NA) 1mMpH 7.8

Cuestionario que deberá responder y anexar al reporte:1.- ¿De qué depende la concentración de agarosa a utilizar en una elec-troforesis?2.- ¿Qué otros métodos se utilizan para revelar el DNA?3.- ¿Qué carga eléctrica tiene el DNA y cómo se aprovecha esta propie-dad en la electroforesis?

Esquematice los resultados observados y redacte sus conclusiones con base en estos. Compare con otros equipos.

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BIBLIOGRAFIA:




PROMEGA Technical Bulletin. (2005). Wizard® SV Genomic DNA Purifi-cation System. E.U.A. 16 pp.

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Amplificación de DNA mediante reacción en cadena de la poli-merasa (PCR)

Introducción. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un proceso bioquímico in vitro mediante el cual las cadenas individuales de DNA blanco o molde (el DNA que se desea amplificar) son duplica-das por la enzima DNA polimerasa a partir de moléculas de DNA de cadena sencilla denominados primers o iniciadores. La reacción de am-plificación se lleva a cabo en ciclos (generalmente entre 20-30). Los iniciadores son DNA cortos de 10 a 22 pb, de cadena sencilla capaces de unirse a una región del DNA adyacente a la secuencia blanco desea-da. Al final del ciclo, las cadenas nuevas vuelven a ser duplicadas por la misma enzima, lográndose una producción exponencial de millones de copias del gen o segmento de DNA específico sometido al proceso.

El procedimiento consta de tres etapas que se repiten en cada ciclo (ver Esquema):1.- Desnaturalización. Se lleva a cabo por calentamiento a 94º C del DNA blanco favoreciendo el rompimiento de puentes de hidrógeno en-tre las bases del DNA y separando las cadenas.2.- Alineamiento. Los iniciadores se unen al DNA molde a temperatura de 50 a 70º C, dependiendo de los iniciadores usados.3.- La amplificación con la enzima DNA Taq polimerasa a la temperatu-ra óptima de acción de la enzima (72º C).

Una de las grandes ventajas que proporcionó la PCR a los estudios de biología molecular es que permite obtener grandes cantidades de DNA a partir de muestras muy pequeñas. Se puede amplificar regiones de DNA puntuales utilizando primers específicos o bien hacer muestreos del genoma utilizando primers aleatorios, como los que fabrica la em-presa Operon Technologies.

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Objetivo. Amplificar una muestra de DNA a diferentes ciclos mediante la reacción en cadena de la polimerasa.


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DNA de Azospirillum aislado previamente y estandarizado a 50 ng/µLPrimer OPA-01 (de la compañía Operon Technologies, E.U.A.) diluído a 0.2 nM en buffer TEMezcla de nucleótidos dNTP’s (10 mM)Taq DNA polimerasaBuffer Taq 10XMgCl2 25 mMAgua mili-QTubos para PCR de 200 µLMicropipeta de 1 µL con puntas estérilesMicropipeta de 10 µL con puntas estérilesTermociclador con calentamiento en tapaEquipo y materiales para electroforesis de DNA en agarosa (ver Unidad de Habilitación No. 8 de este Cuadernillo)

Procedimiento:1.- El volumen de la mezcla de reacción será de 25 µL. Para esto, en un tubo para PCR coloque 4 µL de buffer Taq10X, 2 µL de MgCl2, 0.5 µL de dNTP’s, 1 µL de Taq DNA Polimerasa.

1. Agrega 5 volúmenes de agua otra vez y mezcla hasta que la pasta se pueda absorver a través de la pipeta.

2. Agrega 50 µL del macerado al tubo marcado (siempre utilice3. puntas limpias)4. Cierre el tubo y agite bien.5. Colocar el tubo marcado a un baño maría a 95º C durante 5 mi-

nutos6. Colocar el tubo en la microcentrifuga por 5 minutos a velocidad

máxima.1. Guarde el tubo en hielo para los pasos siguientes.2. Usando una punta nueva, agregue 20 µL del master mix y tape

el tubo.3. Usando una punta nueva, agregue 20 µL de DNA al tubo. 4. Colocar el tubo en el termociclador.5. Preparar un gel de agarosa al 3%.

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6. Colocar el buffer TAE 1X hasta cubrir el gel.7. Agregar 20 µL del marcador molecular para PCR y 20 µL de la

muestra en el gel.8. Correr el gel a 100V durante 30 minutos. No dejar que el colo-

rante naranja migre fuera del gel de agarosa.9. Posteriormente, saque el gel y colóquelo en una charola, teñir

con 1X fast Blast durante toda la noche o usar 100X fast blue durante 5 minutos.

10. Desteñir con agua caliente (40-55ºC) durante 10 segundos o hasta que el agua este clara.


1.- ¿Qué sucede con las muestras de los diferentes ciclos?2.- ¿Para qué se utiliza un marcador?

BIBLIOGRAFIA:




PROMEGA Technical Bulletin. (2005). Wizard® SV Genomic DNA Purifi-cation System. E.U.A. 16 pp. Manual de Biotechnology Explorer™ RESTRICTION DIGESTION AND ANALYSIS OF LAMBDA DNA. Catalog #166-0002-EDU. BIO-RAD.

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Estimación de la biodiversidad: simulación de comunidades para calcular índices de diversidad

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Introducción. La biodiversidad es la variabilidad de organismos vivos de cualquier fuente, incluidos, entre otras cosas, los ecosistemas te-rrestres y marinos y otros ecosistemas acuáticos y los complejos ecoló-gicos de los que forman parte; comprende la diversidad dentro de cada especie, entre las especies y de los ecosistemas. Otra definición es: “la totalidad de los genes, las especies y los ecosistemas de una región”.

Medir o estimar la biodiversidad de un sitio representa una tarea com-pleja para los investigadores; para ello existen varias herramientas es-tadísticas. Sin embargo, un primer acercamiento a conocer la biodiver-sidad consiste en la comparación de la diversidad de un sitio con res-pecto a otro u otros. Para esto se utilizan medidas estadísticas conoci-das como índices de diversidad, de los que se han publicado más de 50, aunque se pueden citar a los más conocidos: Índice de Shannon, Índice de Simpson, Índice Alfa, Índice Caswell, Índice de Hill, entre otros. Además de calcularlos manualmente, es posible hacerlo a través de programas de computadora, como el software Biodiversity Pro, el cual es un freeware o programa gratuito.

Objetivo. Calcular índices de diversidad utilizando un simulador.

Material y métodos.- Canicas de distintos colores, diseños y tamaños.- Libreta - Calculadora - Computadora Personal - Software BioDiversity Pro

Procedimiento:

Simulación de comunidades. Una comunidad está constituída por un conjunto de especies en un espacio determinado; la diversidad de una comunidad está determinada por la riqueza (número de especies) y la abundancia (número de individuos de cada especie). En trabajos de

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campo se realizan conteos de individuos por especie, utilizando alguna técnica de muestreo, por ejemplo, parcelas y transectos. Seguido de esto se estima el tamaño poblacional por área, es decir, el número de individuos por especie por hectárea o por kilómetro cuadrado.

En el caso de la presente práctica, se hará uso de un simulador en el que las especies estarán representadas por canicas; así, todas las canicas verdes, transparentes y de 1 cm de diámetro pertenecerán a una especie, nombrada, por ejemplo: “especie 1”. Canicas con otras características pertenecerán a otra especie.

Su profesor le entregará cuatro grupos de canicas con distinta composición; cada grupo representa una comunidad muestreada al azar. Clasifique por especies y llene la siguiente tabla anotando el número de individuos.

EspecieComunidad1 2 3 4

12345...n

Cálculo manual del índice de Shannon. Este índice se representa con el símbolo H’ y se calcula con la fórmula: H´ = - Σ pi Ln pi2 (es un índice estructural de equidad).

pi es la proporción del número de individuos de la especie i (ni) con respecto al número total de individuos de la comunidad (N) es decir:

pi= ni/N

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Cálculo manual del índice de Simpson. Éste índice se representa con la letra D o con el símbolo λ y se calcula con la fórmula: λ = Σ pi2

(es un índice estructural de dominancia). Debido a que da valores más bajos conforme aumenta la diversidad de especies, se prefiere usar el inverso (1/D) o el complemento (1-D) de Simpson. Calcule pi como en el primer caso.

Para ambos casos deberá llenar una tabla como la siguiente:

Comunidad 1Especie Número de

individuos (ni)

pi= (ni/N) pi2 Ln pi2

1234…nNúmero total de individuos (N):

Con los datos calcule los índices de Simpson, Shannon, Alfa.

Cálculo usando el software Biodiversity Pro. El primer paso con-siste en crear la base de datos, para esto siga los pasos:

1: En el menú File elija New Data, lo cual también puede hacer con el comando Control+N

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2: Aparecerá una ventana que le indicará el número de comunidades a comparar (Number of Samples) y el número de especies totales en-contradas en todas las comunidades (Number of Species). Llene las casillas según sus datos.

3: Aparecerá una hoja de cálculo. Dando doble click sobre los títulos podrá cambiar los nombres, por ejemplo, podrá poner Comunidad Selva Tropical en lugar de Sample 1. Llene la tabla; por ejemplo: si en la comunidad 1 encontró 4 individuos de la especie 1, 7 individuos de la especie 2, ninguno de la especie 3 y 9 individuos de la especie 4, en-tonces deberá llenar la tabla como en el ejemplo de abajo. Nota: Los valores de cero no se mostrarán. Guarde los cambios en un archivo con extensión *.bdp en la carpeta Mis Documentos.

Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Sample 5Species 1 4 0 0 0 0Species 2 7 0 0 0 0

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Species 3 0 0 0 0Species 4 9 0 0 0 0

4: En el menú Alpha seleccione Diversity Indices y a continuación el índice que quiere calcular.

5: Los resultados mostrarán una gráfica como la de abajo, puede co-piarla en el menú Edit o puede ir al menú Window y seleccionar 2 Shan-non Index Results para ver los resultados en números.

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Shannon Index Results

Sample 1

Sample 2

Sample 3

Sample 4

Sample 5

Va

lue

Sample

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 1 2 3 4 5

Resultados finales.

Llene la siguiente tabla de resultados.

Comunidad H’ λManual Software Manual Software

12345

Cuestionario que deberá responder y anexar al reporte:1. Explique las posibles diferencias entre el cálculo manual y con el

software.2. ¿Qué comunidades son más diversas y cuáles menos diversas?

¿Coinciden los resultados con ambos índices?

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3. ¿Qué índice preferiría Usted utilizar para un estudio de campo? ¿Porqué?

4. ¿Qué significa que un índice sea de dominancia y otro de equi-dad?

BIBLIOGRAFIA:

Ondarza, Raúl N., (2008). ECOLOGÍA El hombre y su ambiente. Edit. Trillas. 2ª. Edición. México, D. F.

McAleece, N., Lambshead, P.J.D., Paterson, G.L.J. y J.D. Gage. (1997).Biodiversity Pro; Free Statistics Software for Ecology. The Natural His-tory Museum (Londres)/Scottish Association for Marine Science (Esco-cia). En Línea: http://www.sams.ac.uk/research/software.

Unidad de Habilitación No.13

Estimación de la riqueza y abundancia de especies vegetales en un agroecosistema

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Introducción. En los últimos 10 000 años, la diversidad biológica ha sufrido, por la actividad del ser humano, un efecto devastador que ace-lera el índice de extinción de especies, sobre todo en islas y en ambien-tes altamente cerrados. Estos efectos se concentran sobre todo en los bosques tropicales húmedos donde se practica la tala y la quema. La magnitud del daño se acentúa si se toma en cuenta que cuando un bosque reduce 10% su área, se puede perder la mitad de su número de especies.

Puesto que resulta insuficiente la conservación de la biodiversidad en áreas naturales protegidas, cada vez se estudian más los agroecosiste-mas como reservorios de la diversidad animal, vegetal y microbiana. En particular, los agroecosistemas de café bajo sombra y de cacao tradi-cional se han descrito como sitios de alta biodiversidad en Centroamé-rica.

Objetivo. Estimar la riqueza y abundancia de una especie vegetal en un agroecosistema de café bajo sombra y correlacionarlas con la diver-sidad biológica general.


CuadernoBolígrafoCintas métricas de 25 mPrensa para muestras de herbarioComputadora personalProcedimiento:

1.- Se hará un viaje de campo a un agroecosistema de café bajo som-bra diversificada del Soconusco, Chiapas.2.- Se trazarán aleatoriamente 5 cuadros de 25 m x 25 m (725 m2).

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3.- En cada cuadro se observarán y registrarán las bromelias epífitas creciendo sobre plantas de café o sobre las demás plantas del agrosis-tema. Cuente las bromelias por especie.4.- Para identificar a nivel de especie prense ejemplares para herbario, los cuales serán enviados a diagnóstico.5.- La riqueza será determinada por el número de especies encontra-das.6.- La abundancia será estimada considerando cada cuadro como una repetición (previamente multiplique el dato de cada cuadro por 16 para tener el número de plantas por hectárea).7.- Utilice la media muestral como estimador y el valor de t al 90% como coeficiente de confiabilidad, como se muestra en la fórmula si-guiente:

μ± t (1−α /2 )( SD√n )Donde:

μ : Media del número de individuos de bromelias de una especie.

t : “t” de Student a un α de 0.10SD: Desviación estándar de la muestran: número de repeticiones (parcelas)

Cuestionario que deberá responder y anexar al reporte:1. Elabore un cuadro que sintetice los resultados de abundancia

por especie.2. Redacte un comentario de media cuartilla sobre la posible biodi-

versidad que contiene el agroecosistema que Ud. Estudió.

BIBLIOGRAFIA:

Ondarza, Raúl N., (2008). ECOLOGÍA El hombre y su ambiente. Edit. Trillas. 2ª. Edición. México, D. F.

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Unidad de Habilitación No.14Diseño completamente aleatorizado: Evaluación de dos

fuentes de carbono en el crecimiento de Escherichia coli

Introducción. Se llama diseño de experimentación completamente aleatorizado cuando los tratamientos de interés se asignan de manera

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totalmente aleatoria a los individuos u objetos en los que se han de realizar las determinaciones para medir la eficacia de los tratamientos.

Es posible asignar aleatoriamente individuos para el tratamiento como sigue. Suponga que tenemos 12 plantas en un experimento, en el que se pretende comparar tres diferentes tipos de hormonas (3 tratamien-tos). Se enumeran a los individuos del 1 al 12; después a partir de la tabla de los números aleatorios se seleccionan consecutivamente, sin repetir, los números del 1 al 12. En este ejemplo, cada tratamiento ten-drá cuatro repeticiones, aunque es importante decir que la cantidad de individuos en cada grupo no tiene que ser el mismo. La figura de abajo muestra el esquema de asignación aleatoria.

Plantas disponibles 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12

Números aleatorios

12 08 03 04 01 10 05 11 07 02 06 09Hormona 1 (T1) Hormona 2 (T2) Hormona 3 (T3)

Objetivo. Practicar el diseño experimental completamente aleatorio utilizando como modelo de estudio a la bacteria Escherichia coli.

Material y métodos:

Cepa de E. coli 15 Tubos de 13 x 100 mm1 matraz erlenmeyer de 125 mLCaldo nutritivo a distintos pHEspátulaMicropipeta de 1000 µL con puntasMicropipeta de 100 µL con puntas

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Celdas para espectrofotómetroAsa bacteriológica

Procedimiento:

1.- Se evaluarán 2 tratamientos (2 diferentes pH del medio para el cre-cimiento de E. coli: 4.0 y 6.8).2.- Prepare los dos medios de cultivo en tubos de ensayos de 13 x 100 mm. 5 tubos de cada pH. Un tubo será una repetición.3.- Inocule la cepa de E. coli con un asa y cultive la bacteria a tempera-tura ambiente con agitación orbital a 200 rpm.4.-Después de 24 horas, mida el crecimiento de la bacteria por turbidi-metría (transfiera 1 mL del cultivo a una celda de espectrofotómetro y lea la absorbacia a 540nm; calibre con caldo nutritivo sin bacteria).5.- Recuerde lavar bien la celda al cambiar de repetición. Su variable de respuesta es la absorbancia.6.- Determine si el pH tiene un efecto significativo sobre el crecimiento de E. coli, realizando un análisis de varianza y en caso de encontrar diferencias significativas realice una comparación de medias por el mé-todo de Tukey al 95% de confianza.7.- Utilice el software MENU (FAUANL), el cual es un freeware.

El primer paso consiste en seleccionar el diseño estadístico a usar: co-loque el No. 1 para seleccionar el diseño completamente al azar.

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Seleccione el No. 1 para ingresar los datos

El programa le pedirá que ingrese el número de tratamientos ylas repeticiones. En su caso son 2 tratamientos y 5 repeticiones.

En la siguiente pantalla se muestran los datos para ver si están correc-tos.

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Después aparecerá la pantalla de abajo, si hubiera un error en alguno de los datos al momento de ingresarlos, entonces seleccione el No.1 para corregirlo; si lo desea, grabe o simplemente continúe.

Posteriormente, el programa arroja el análisis de varianza

En el ícono C/ elija “seleccionar todo”, luego “copiar” para tranferir el cuadro de ANOVA a un procesador de textos. Si hay diferencias signifi-cativas entre sus tratamientos, aparecerá lo siguiente:

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Haga la comparación de medias.


1.- Anexe el cuadro de ANOVA y la comparación de medias.2.- Redacte un comentario de 15 líneas sobre el efecto del pH en el crecimiento de microorganismos en general: in vitro y en la naturaleza.3.- Describa ventajas y desventajas del Diseño Completamente al Azar.

BIBLIOGRAFIA:

Walpole Ronald E. y Myers, Raymond H., (1992). PROBABILIDAD Y ES-TADÍSTICA. Edit. Mc Graw Hill. 3ª. Edición. México, D.F.

Daniel, Wayne W. (2002). BIOESTADISTICA. Edit. Limusa Wiley. 4ª.edi-ción. México, D. F.


Diseño factorial: Evaluación de fuentes de carbono y pH, a dis-tintos niveles, en el crecimiento de Escherichia coli

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Introducción. Con frecuencia es necesario estudiar simultáneamente los efectos de dos o más variables en una investigación. Las variables de interés reciben el nombre de factores. El experimento en que se investigan dos o más factores en forma simultánea se llama experi-mento factorial.

Las diferentes categorías designadas de los factores se conocen como niveles. Por ejemplo, suponga que se analizan los efectos de tres dife-rentes sustratos en el crecimiento de un microorganismo. Se dice que el factor sustrato ocurre en tres niveles. Suponga que el segundo factor de interés es temperatura y se piensa que deben incluirse dos diferen-tes temperaturas. Por lo tanto, se dice que se tienen dos niveles para el factor temperatura. En general, se dice que el factor A ocurre en los niveles a y el factor B en los niveles b.

En un experimento factorial no sólo es posible estudiar los efectos de factores individuales, si no también, la interacción entre los factores.

Objetivo. Practicar el diseño factorial utilizando como modelo de estu-dio a la bacteria Escherichia coli.


Cepa de E. coli Tubos de 13 x 100 mm1 matraz erlenmeyer de 125 mLMedio mineralEspátulaMicropipeta de 1000 µL con puntasMicropipeta de 100 µL con puntasCeldas para espectrofotómetroAsa bacteriológica

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Procedimiento:

1.- Diseñe el arreglo factorial: se probarán 2 fuentes de carbono (gluco-sa y sacarosa) y 2 pH (4.0 y 6.8), solos y en combinación. USTED DEBE-RÁ REALIZAR UN CUADRO MOSTRANDO TODAS LAS POSIBLES COMBI-NACIONES Y POR LO TANTO LOS TRATAMIENTOS.2.- Utilice medio mineral, cuya receta será proporcionada por su ins-tructor.3.- Trabaje con 5 repeticiones. Una repetición será un tubo de ensayos. Revise la metodología de la Unidad de Habilitación No. 14 de este Cua-dernillo.4.- Evalúe el crecimiento por turbidimetría.5.- Para analizar los datos utilice el paquete estadístico MENU (Arreglo Factorial) que será proporcionado por el profesor.


1.- Elabore un comentario de media cuartilla sobre el efecto de la fuen-te de carbono, del pH y de la interacción de ambos en el crecimiento microbiano en general: in vitro y en la naturaleza.2.- Mencione las ventajas del diseño factorial.3.- Imprima los datos que resulten del programa y adhiera en su libre-ta.

Bibliografía:

Walpole Ronald E. y Myers, Raymond H., (1992). PROBABILIDAD Y ES-TADÍSTICA. Edit. Mc Graw Hill. 3ª. Edición. México, D.F.

Daniel, Wayne W. (2002). BIOESTADISTICA. Edit. Limusa Wiley. 4ª.edi-ción. México, D. F.

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DIRECTORIO

Dr. Ángel René Estrada ArévaloRECTOR

Mtro. Hugo Armando Aguilar AguilarSECRETARIO GENERAL

Dr. Pedro UrbanoSECRETARIO ACADÉMICO

C.P. Juan Guillermo GutiérrezSECRETARIO ADMINISTRATIVO

Dr. Roberto Villers AispuroDIRECTOR GENERAL DE PLANEACIÓN

Dr. Fernando Álvarez SimánDIRECTOR GENERAL DE EXTENSIÓN UNIVERSITARIA

Mtro. Lorenzo Franco Escamirosa MontalvoDIRECTOR GENERAL DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO

CENTRO DE BIOCIENCIASDr. Miguel Salvador Figueroa

DIRECTOR

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