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Cuantificacion de DNA Circulante en Plasma (cfDNA) y su Utilidad para el Estudio de (cfDNA) y su Utilidad para el Estudio de
Mutaciones Oncogénicas en una Población de Candidatos a Ensayos Clínicos Tempranos Candidatos a Ensayos Clínicos Tempranos
Joaquin Mateo 1,2, Michael Ong1,2, Jesús Corral1*, Lorna Pope2, q , g , , p ,Amy Cassidy2, Rhoda Molife1, Udai Banerji1, Stan B. Kaye1,
David Olmos1** & Johann S. De Bono1,2
1. DRUG DEVELOPMENT UNIT, THE ROYAL MARSDEN NHS FOUNDATION TRUST2. BIOMARKERS TEAM, THE INSTITUTE OF CANCER RESEARCH
* Actualmente, HOSPITAL VIRGEN DEL ROCÍO, ESPAÑA** Actualmente, PROGRAMA DE INVESTIGACIÓN CLÍNICA, CNIO - ESPAÑA
INTRODUCCIÓN
• Desarrollo de nuevas drogas: costoso y poco eficienteDesarrollo de nuevas drogas: costoso y poco eficiente• Estrategias de seleccion de pacientes según “relevancia biológica”• Biomarcadores predictivos y de prueba de concepto
• Acceso a tejido tumoral: • Acceso a tejido tumoral: • Invasivo• A veces no es factible• Muestras secuenciales
• Cuestiones logisticas: pacientes derivados de otros centros.g p
Contexto: cfDNA
• cfDNA en plasma: resultado de procesos deapoptosis y estrés celular (diferentesapoptosis y estrés celular (diferentestamaños)
• Evidencia niveles altos cfDNA anteenfermedades (inflamatorias autoinmunesenfermedades (inflamatorias, autoinmunes,infecciosas) o estrés (ejercicio)
• Aplicaciones al diagnóstico prenatalAt i k t l
Posibles aplicaciones en oncología:
Atamaniuk et al. Eur J Appl Physiol 2008
Posibles aplicaciones en oncología:
•Diagnóstico ?•Pronóstico ?•Pronóstico ?•Respuesta a tratamiento ?
Schwarzenbach et al,Mol ByoSyst 2011
OBJETIVOS
• Identificar mutaciones oncogénicas en cfDNA y su Identificar mutaciones oncogénicas en cfDNA y su correlación con el análisis de tejido tumoral
• Genotipado de DNA tumoral rápido y no invasivo
• Aplicar los resultados a una selección racional de pacientes para ensayos fase I
• Optimizar el desarrollo / selección de nuevas drogasdrogas
MÉTODOS
Valoración en la Unidad Ensayos fase I:Consentimiento informado
24 ml sangre – 2ml plasma Revisión tejido tumoral (primario o met)
“A” l ( 104 + 20 V)Extracción cfDNA Extracción DNA tumoral
mue
stra
s
“A” manual (n 104 + 20 V)“B” robotizado (n 176 + 21
V)
ras
Cuantificación de DNA (Picogreen)
Análisis de mutaciones: plataforma Multiplex 9
5% m
% m
uest
r
Análisis de mutaciones: plataforma MultiplexSequenom OncoCarta v1.0 Panel (238 mut en 19 oncogenes)
med
iana
);
69%
Detección de mutación SI/NO
7 dí
as (m Análisis resultados: MALDI‐TOF ‐MassArray Typer Analyzer
software 4.0.4.20 – revisión humana (ciega)
Detección de mutación SI/NOEN PLASMA Y/O EN TEJIDO TUMORAL
Selección de pacientes para ensayos fase I (participaron 160, 57%)
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
19 Genes;238 mutaciones n=265
[cfDNA] < V
[cfDNA] > V238 mutaciones
puntuales:
KRAS, HRAS, NRAS
rango V rango V
Mutacion en cfDNA
19 (33.3%) 38 (66.7%)
No mutaciónKRAS, HRAS, NRASPIK3CAAKT 1,2B-RAF
No mutación cfDNA
118 (56.7%) 90 (43.3%)
Pearson Chi cuadrada p=0.002
T t l 63 t i 57 i tMETEGFR
KIT
Total: 63 mutaciones en 57 pacientes
ABCB1ERBB2CDK4
Matched cfDNA mutation
Healthy Volunteers
NS
FGFR 1,3FLT3JAK-2
PDGFA
4 8 16 32 64 128
256
5
No cfDNA mutation
[cfDNA] in ng/ml (E pansion phase)PDGFA
RET(Expansion phase)
RESULTADOS
n=181 muestras pareadas ( l )
RAS PIK3CA MET AKT RAF (plasma y tumor)
RAS PIK3CA MET AKT RAF
Mutación en cfDNA 20 10 9 3 7Mutación en cfDNA 20 10 9 3 7
Coincidencia tumor (%) 16 (80%) 8 (80%) 6 (67%) 3(100%) 5 (71%) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )
RESULTADOS Analisis de mutaciones en 181 muestras pareadasTumor primario Mutations RAS PIK3CA MET AKT RAF Otros
Mama Coincidencia ++ 4 4 1Mama Coincidencia ++ 4 4 1
15/46 pts (32.6%) Sólo tumor + 2 3 1 2
con mutaciones Sólo cfDNA + 1 110 1 1 2Colorectal Coincidencia ++ 10 1 1 2
25/35 pts (71.4%) Sólo tumor + 7 1 1 1
con mutaciones Sólo cfDNA + 1 2 2
Ovario Coincidencia ++ 1
5/28 pts (17.9%) Sólo tumor + 3 2 1
con mutaciones Sólo cfDNA + 1con mutaciones Sólo cfDNA + 1
Próstata Coincidencia ++ 1 1
6/13 pts (46.2%) Sólo tumor + 1 3
con mutaciones Sólo cfDNA + 1
Melanoma Coincidencia ++ 2 1 3
9/12 pts (75.0%) Sólo tumor + 1 2/ p ( )con mutaciones Sólo cfDNA + 1
Other Sites Coincidencia ++ 4 2
19/47 pts (40 4%) Sólo tumor + 2 2 219/47 pts (40.4%) Sólo tumor + 2 2 2
con mutaciones Sólo cfDNA + 2 2 1 2
79/181 pts (43.6%) 36 18 10 5 9 14
CONCLUSIONES
• Estudio no invasivo a partir de plasma
• Cuantificación de cfDNA tiene valor pronóstico
• Rápida disponibilidad de información. Resultado cualitativo
• Información sobre la evolución tumoral, repetible
• Alta fiabilidad cuando una mutación se identifica en plasma
• Falta correlación plena para resultados negativos.
Posibles motivos: hetereogenidad tumoral? Evolución? Técnica?
• Correlación variable según tipo tumoral y gen: estrategias de
personalización del screening molecular
• Multiplex vs next-gen sequencing
AGRADECIMIENTOS
• A los pacientes que participaron y sus familiaresA t d l i ti d h t b j d l t • A todos los investigadores que han trabajado en el proyecto T. Yap, G. Perkins, G. Attard, I. Judson,…….
• A investigadores de otros grupos que han colaboradoM. O’Brien, S. Johnston
PROYECTO FINANCIADO POR
• Fundación SEOM
PROYECTO FINANCIADO POR:
Experimental Cancer Medicine CentreMedicine Centre