Cultivare, factori fizici

7/23/2019 Cultivare, factori fizici

1/5

4. METODE DE CULTIVARE A BACTERIILOR

Cunoasterea necesitatilor nutritive ale bacteriilor este foarte importanta n bacteriologiamedicala, deoarece sta la baza prepararii mediilor de culturadestinate izolarii diverselor specii

bacteriene din produsele biologice sau patologice.La nceputurile dezvoltarii bacteriologiei, prepararea mediilor a fost artizanala, numerosi

bacteriologi intrnd n istoria microbiologiei prin mediile pe care le-au preparat si care le poartasiastazi numele. Astfel, amintim, de exemplu, mediul Loeffler pentru cultivarea bacilului difteric,mediul Lwenstein-ensen pentru bacilul lui !oc", mediul selectiv #ilson-$lair pentru salmonelesi multe altele.

%rin cercetarea necesitatilor nutritive ale diferitelor specii s-au realizat medii adecvatepentru aproape toate bacteriile de interes medical, speciile necultivabile fiind foarte pu tine, ca, depilda, Mycobacterium lepraesi unele spiroc"ete printre care Treponema pallidum.

Cultivarea bacteriilor n scop diagnostic pune n esentadouaprobleme&

' alegerea unui mediu de culturaoptim, care sapermitaizolarea tuturor bacteriilor carear putea fi prezente n produsul de examinat si

' obtinerea bacteriilor n culturi pure, pentru a putea fi identificate.

4.1. Conditii generale pentru cultivarea acteriilor

(n mediu de cultura uzual trebuie sa contina apa, substante organice, minerale,oligoelemente si factori de crestere. %entru satisfacea acestor necesitati se ultilizeaza diferitesubstraturi biologice nutritive complexe care au n compozitia lor aceste ingredinente. Astfel&

- peptonele, care se obtin prin "idroliza enzimatica sau acida a proteinelor de origineanimala)de exemplu fainade oase*. +le nu au o compozitie c"imicafoarte bine definita, iar princontinutul n peptide si aminoacizi constituie o sursauniversalade azot, pentru toate bacteriilecultivabile, fiind folosite practic n prepararea tuturor mediilor de cultura,

- extractul de carne,ce se obtine prin des"idratarea decoctului de carne de vita. Acestacontine cantitati importante de creatina, xantina, "ipoxantina, acid uric, acid adenilic, glicocol,uree, glutaminaca sursade azot precum si glicogen, "exozofosfati, acid lactic etc. ca sursadecarbon,

- extractul de drojdie,care se obtine prin cultivarea controlataa drodiilor si care continenumeroase vitamine, mai ales cele din grupul $,

n afarade ingredientele mai sus mentionate mai amintim&

- clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale ntr-o concentratie de ,/0. %entrucultivarea bacteriilor "alofile concentratie poate creste pnala 10,

- mono sau polizaharidele, unii alcooli )glicerina, manitol* pot nmbogati mediile,deoarece constituie surse de carbon usor accesibile multor bacterii,

Cultivarea acteriilor pe !edii lic"ide. 2ediile lic"ide se folosesc cel mai adesea pentrunmultirea unor microbi care se gasesc n numar mic ntr-un anumit produs. Cel mai simplumediu folosit n laboratorul de bacteriologie este bulionul care se preparadin decoct de carne devaca, peptona si clorurade sodiu. Cultivarea unui produs pe medii lic"ide are dezavantaul canu permite nsaobtinerea unei culturi pure.

Caracterele culturale ale microbilor pe medii lic"ide difera. Astfel, bacteriile apartinnd familiei+nterobacteriaceae tulburauniform mediul, altele, ca de pildabacteriile strict aerobe )Pseudomonas, Nocardia)formeazapelicule la suprafata mediului. Altele formeazaagregate care se dezvoltasub formade gruni ce se

1


2/5

depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului )Streptococcus*. (nele bacterii secretan mediu pigmentidifuzibili ca de exemplu bacilul piocianic )Ps.aeruginosa*.

Cultivarea acteriilor pe !edii #olide.3ntroducerea mediilor de culturasolide a nsemnatun progres urias n te"nicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distinctaa microbilor,sub formade colonii izolate. 4 colonie bacterianaeste o micropopulatie ce rezultadin nmultireaunui singur microb pe un mediu, vizibilan general cu oc"iul liber.

Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a uneisubstantagelificabile, care de regulaeste geloza, un poliza"arid obtinut din alga marinaagar-agar. La aceast mediu simplu se pot adauga diferite ingrediente )snge de oaie, ser, ascita,extract de drodie etc.* pentru a putea cultiva bacteriile pretentioase.

Caracterele culturale sunt foarte importante n identificarea microbilor. +le se apreciaza fiecu oc"iul liber, fie cu autorul unei lupe. +lementele ce se descriu, n general, sunt dimensiunea,forma, pigmentul, consistenta, aderenta la mediu, activitatea "emolitica si unele modificari pecare microorganismele le produc n mediul respectiv.

Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen n serfiziologic se numesc colonii de tip 5 )smoot"*, pe cnd coloniile aceleiasi specii, cu suprafatarugoasa, relief si margini neregulate si care aglutineazasponatan n ser fiziologic - colonii de tip6 )roug"*. n general, cu unele exceptii, coloniile 5 apartin tupinilor virulente, pe cnd cele 6 sunt

nevirulente.Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni ntr-

un anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece n multe infectii criteriul deimplicare etiologic este numarul bacteriilor n produsul de examinat )infectii urinare*.

Medii #peciale. +xistasituatii n care izolarea unui microb necesitamedii deosebite care safavorizeze selectarea lui din produse intens contaminate.

Mediile de mbogatire sunt medii lic"ide care permit nmultirea preferentialaa unui microbdintr-un amestec. Astfel sunt mediile cu continut mare de clorurade sodiu )1-10* n care se potdezvolta numai bacterii "alofile ca, de exemplu, stafilococul )mediul C"apmann lic"id* sienterococul. (nele medii de mbogatire au ca factor electiv anumite substante, ca, de exemplu,selenitul acid de sodiu, care permite dezvoltarea salmonelelor din materiile fecale. Alte medii sebazeazape propietatea unor germeni de a se dezvolta la un p7 mai acid sau mai alcalin dectmaoritatea speciilor bacteriene de interes medical. Astfel, vibrionul "oleric se dezvoltala unp7alcalin )/* iar brucelele la la un p7 acid )8*.

Medii selective. 9acaun mediu de mbogatire se solidifica, rezultaun mediu selectiv careare avantaul obtinerii microbilor sub formade colonii izolate. 9atoritaacestor medii, izolarea siidentificarea bacteriilor este astazi mult simplificata. 2ediile selective, care se bazeaza peparticularitatile metabolice ale unor specii microbiene sau mai ales pe rezisten ta naturala aacestora la antibiotice, sunt utilizate n mod curent n laboratoarele de bacteriologie, deoarecepermit, practic, izolarea dintr-un amestec de microbi, a oricarui microb n culturapura.

Mediile de diagnosticsunt medii de culturacare evidentiazaanumite proprietati fiziologicesi caractere bioc"imice ale tulpinilor bacteriene pe baza carora acestea pot fi identificate. Astfel,de exemplu, numeroase specii bacteriene se recunosc pe baza za"arurilor pe care lefermenteaza. 2ediile de diagnostic cu za"aruri contin za"arul de cercetat si un indicator dep7.

n cazul n care bacteria nsamntatan acest mediu va fermenta za"arul, culoarea mediului seva sc"imba dupacteva ore datoritascaderiip7-ului.

$. I%&LUE%TA &ACTORILOR &I'ICI A(U)RA

2


3/5

BACTERIILOR

$.1. Te!peratura

:emperarura optimade dezvoltare a bacteriilor este cea a "abitatului lor natural. n func tie

de aceastatemperatura, bacteriile se mpart n psi"rofile, care se nmultesc optim la ;


4/5

(nele bacterii modifica prin procesele metabolicep7-ul mediului. Aceastamodificare poateopri nmultirea lor sau c"iar distruge cultura. 9in acest motiv, multe medii au n compozitia lorsolutii tampon care mentinp7-ul n limite convenabile.

2odificarea de catre o bacterie a p7-lui unui mediu poate avea valoare deosebita nidentificarea unui microb si poate fi sesizataprin adaugarea n mediu a unui indicator de p7.Foarte multe bacterii se identificabioc"imic prin proprietatea lor de a fermenta diferite za"aruri.

Aceastacapacitate se evidentiazaatocmai prin nsamntarea unei bacterii pe mai multe mediice contin fiecare alt za"ar si un indicator dep7. n cazul fermentarii, acidifierea va determinasc"imbarea culorii mediului.

$./ Ultra#unetele

(ltrasunetele cu o frecventa peste ;. de cicliGs sunt bactericide. $acteriile si virusurilesunt distruse de ultrasunete ntr-un interval de o ora. (ltrasonarea microorganismelor sefoloseste mai putin pentru sterilizare, ct pentru a obtine diferite componente bacteriene sauvirale, cum sunt& enzime, pereti celulari, acizi nucleici bacterieni n scopul cercetarii acestora.

$.4. )re#iunea "idro#taticaa

$acteriile obisnuite sunt rezistente la presiunea atmosferica. Formele vegetative suferaalterari la E de atm si sunt omorte la 8 de atmosfere, presiune ntlnita n oceane la oadncime de 8m. Cultivarea bacteriilor la presiuni mari induce cresterea lor filamentoasascazndu-le capacitatea de diviziune. :otusi unele bacteria gram-pozitive pot rezista pana laE de atmosfere cu conditia ca variatiile de presiune sa fie lente si da permita adaptareabacteriilor. Hariatiile bruste de presiune duc la spargerea peretelui bacterian

$.$. )re#iunea o#!otica

$acteriile se nmultesc optim pe medii izotonice, rezistenta lor la variatiile presiuniiosmotice fiind incomparabil mai mare dect cea a celulelor organismelor superioare. Aceastaa

rezistentase datoreazaa peretelui celular. $acteriile din genul Mollicutes, lipsite de actiuneaprotectoare a peretelui celular, sunt foarte sensibile la variatii mici ale presiunii osmotice.

ntr-un mediu puternic "iperton, bacteriile vor pierde apa din citoplasma si vor muri. Acestfenomen se numeste deplasmolizaa.

9aca presiunea osmoticaa mediului este foarte scazutaa, apa va patrunde n celula, carese va umfla devenind turgescenta. 2oartea bacteriei se produce prinplasmoptizaa.

Cresterea presiunii osmotice a unui mediu prin adaus de BaCl sau za"aruri st a la bazaconservarii unor alimente.

+xista nsabacterii osmofile, dintre care cele "alo+ilesunt capabile sase nmulteasca nsolutii "ipersaline )bacteriile din genul Stapylococcus si Enterococcus). %e baza acesteiproprietati se prepara unele medii de mbogatire si selective asa cum este mediul "ipercloruratC"apmann pentru stafilococi. Acesta contine ,>0 BaCl spre deosebire de mediile obisnuite care

contin doar ,> 0. 9intre bacteriile osmofile mentionam si pe cele *a"aro+ile0care sunt capabilesase nmulteascape medii cu continut mare de glucide )8g0*. Acest aspect este importantpentru unele medicamente, ca de pilda, siropurile care, n ciuda continutului ridicat de za"aroza,se pot altera n urma contaminarii cu aceste bacterii.

$.. Radiatiile

!.".#. $azele neionizante

4


5/5

$azele ultraviolete. %uterea bactericidaa razelor luminoase devine perceptibilala o lungimede undade EEnm, crescnd pe masurascaderii lungimii de undaa luminii (H. :impul necesardistrugerii microorganismelor depinde de intensitatea luminii, distanta de sursa de emisie simediul n care se gasesc microorganismele. 2ecanismul bactericid al razelor (H consta ninducerea formarii n celula bacterianaa unor dimeri de timinacare interfereazareplicarea 9BA.

Alterarile altor elemente structurale bacteriene sunt negliabile.

%otoreactivarea. 2odificarile induse n celulele bacteriene prin razele (H sunt reversibile,eficienta sterilizarii prin aceste raze nefiind prea performanta. Astfel, dacase expune o culturabacterianacare a fost iradiatacu raze (H la luminavizibila, o parte din dimerii de timinase vordisocia si bacteriile aparent omorte si reiau activitatea metabolicasi nmultirea. Aceasta poatedepasi de sute de ori activitatea initialaa culturii neiradiate.

n scop practic lampile cu vapori de mercur se folosesc pentru a reduce num arul de bacteriiexistente n aer n salile de operatie, n laboratoare, n ncaperi n care sunt adapostite animalede exprientaaetc.

+fectul bactericid al razelor solarese datoreaza continutului n raze (H )E-=nm*. nconditii naturale efectul bactericid al luminii solare este mai mare n tarile sudice unde continutul

n raze (H este mare. 5emple si Ireig au aratat n 3ndia )1//* cabacilii tifici expusi pe leneriealbaala soare sunt distrusi n douaore, pe cnd la ntuneric si pastreazaviabiliatea peste 8 zile.

5-a observat nsa

ca

expunerea la lumina puternica

solara

poate omor bacteriile c"iarcnd radiatiile (H sunt ecranate, datorita sensibilitatii la lumina a unor substante necesaremetabolismului bacterian cum sunt riboflavina si porfiriniele. Astfel, expunerea la lumina solaraafiolelor n care se afla $CI1 va avea ca urmare pierderea viabilitatii si deci a eficienteivaccinului.

Sensibilizarea &otodinamica. 6azele luminoase vizibile au o actiune bactericidaslaba, carepoate nsa fi crescuta pna la nivelul actiunii razelor (H daca sunt trecute prin colorantifluorescenti ca, de pilda, eozina, rosu bengal etc.

!.".'. $adiatiile ionizante

2ecanismul bactericid al acestor raze consta n formarea n celula a unor radicali cu viatatascurta ssi protoni. Acesti produsi vor altera bazele azotate si legaturile dintre ele. +fectul

bactericid al razelor ionizante depinde de cantitatea de energie absorbita, temperatura, presiueapartialaa oxigenului, continutul n substante organice, prezenta unor substante protectoare caalcoolii alifatici sau substante bogate n grupari sulf"idrilice, specia microorganismului sicontinutul n apa. 5porii sunt n general mai rezistenti dect formele vegetative ale bacteriilor,exceptie fiind o bacterie nesporulata, Micrococcus radiodurans, care este cel mai rezistentmicroorganism la radiatii. +l rezistala doze de ; de ori mai mari dect restul bacteriilor datoritafaptului caeste ec"ipat cu mecanisme deosebit de eficiente de reparare a alterarilor acizilornucleici.

5

Documents

Cultivare, factori fizici