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MB. MARICELA TOLEDO GARCACULTIVO DE CLULAS

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MB. MARICELA TOLEDO GARCACRECIMIENTO MICROBIANO

Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. Esto es, no el crecimiento de un nico microorganismo que denominaremos ciclo celular, sino al demogrfico de una poblacin.

Ciclo celular es el proceso de desarrollo de un microorganismo aislado. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicacin del material gentico, la sntesis de componentes celulares, la elongacin de la bacteria para alcanzar un tamao doble del inicial y su divisin por biparticin para dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo de generacin y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este.

El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin

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MB. MARICELA TOLEDO GARCALos cultivos de microorganismos por lo general son asincrnicos puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular.

En un cultivo sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase del crecimiento celular.

Los cultivos sincrnicos son muy difciles de mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a los estudios bsicos debiologa microbiana.

Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como sincrnicas.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCACRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO LQUIDO

Si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de clulas libres.

En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano:

1.- Fase lag o de adaptacin Los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. 2.- Fase exponencial o logartmica: La velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCA 3.- Fase estacionaria: No se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial.

Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano.

La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales. 4.- Fase de muerte: Se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCACRECIMIENTO MICROBIANO EN MEDIO SLIDO

Las fases, parmetros y cintica de crecimiento discutidas para el caso de loscultivos lquidos se presentan tambin en cultivos slidos. La cintica de crecimiento, en este caso, se puede estudiar siguiendo la evolucin del nmerode clulas viables por unidad de superficie o por unidad de masa.

Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia.

Por consiguiente, se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones desubstrato y ambientales adecuadas da lugar a la produccin de una colonia enun breve lapso de tiempo.

Si el nmero inicial de bacterias por unidad de superficie es muy alto, la confluencia de las colonias da lugar a lo que se llama un csped cuando se realizan los cultivos en placas de laboratorio.

En el caso de microorganismos mviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que tienen un crecimiento trfico no se producen colonias aisladas sino formaciones ms difusas o miceliares.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCACONCEPTO DE MUERTE DE UN MICROORGANISMODesde el punto de vista microbiolgico, un microorganismo muerecuando pierde de forma irreversible la capacidad de dividirse.

Como consecuencia de esta prdida, no se produce aumento en el nmero de microorganismos y, por tanto, no hay crecimiento.

Sin embargo, un microorganismo puede estar muerto desde el punto de vista microbiolgico y continuar desarrollando una actividad metablica que se traduzca, por ejemplo, en liberacin de toxinas.Por otra parte, hay que considerar que la capacidad de multiplicacin(crecimiento) de un microorganismo puede verse transitoriamente afectada por lesiones o por las condiciones fsicas o qumicas del entorno. En estos casos, podramos considerar como muertos microorganismos que pueden reanudar su crecimiento si las condiciones son de nuevo favorables.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAMEDIDA DEL CRECIMIENTO Y CONTEO DE MICROORGANISMOS

Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Los principales, se enumeran a continuacin:

1.- Recuento directo: consiste en la observacin al microscopio de volmenes muy pequeos de suspensiones de bacterias. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cmaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de clulas sea del orden de 105 por ml.2.- Medida de la masa de clulas: el sistema se basa en que las clulas en suspensin dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensin y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parmetro de medida ms fcil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de clulas debe serdel orden de 105 por ml.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCA3.- Recuento de viables: consiste en sembrar un volumen determinado de cultivo o muestra sobre el medio de cultivo slido adecuado para estimar el nmero de viables contando el nmero de colonias que se forman puesto que cada una de estas deriva de una clula aislada.

Para que la medida sea correcta desde el punto de vista estadstico, es necesario contar ms de 300 UFC.

En ciertas ocasiones en las que la densidad de microorganismos es demasiado baja, stos se pueden recolectar por filtracin a travs de una membrana (de 0.2 m de tamao de poro) y posterior colocacin de la membrana en un medio de cultivo adecuado para que se formen las colonias.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCA4.- Medida del nmero de partculas usando contadores electrnicos de partculas. Estos sistemas no nos indican si las partculas corresponden a clulas vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamao de las partculas.

5.- Medida de parmetros bioqumicos tales como la cantidad de ADN, ARN, protenas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen de cultivo.

6.- Medida de actividad metablica de las bacterias que respiran producen una disminucin del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxgeno (utilizacin de colorantes sensibles a oxidacin-reduccin tales como el azul de metileno).

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MB. MARICELA TOLEDO GARCACINTICA DE CRECIMIENTO DE UN CULTIVO DISCONTINUO

En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de microorganismos que crecen aislados que no forman ningn tipo de estructura. Esta es la forma de crecimiento de la levadura y de las bacterias.

Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos para predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir consumindose el substrato y cmo se van a ir acumulando los productos del cultivo.

Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el crecimiento, cmo se va a acumular el producto, etc.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCALas clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico.

El tiempo que tarda una clula en hacer todo lo anterior es lo que conocemos como tiempo de generacin () y puede variar desde unos 20 minutos en condiciones ptimas hasta varios meses en condiciones del suelo. Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCATRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO COMO PROGRESIN GEOMTRICA

Las bacterias crecen siguiendo una progresin geomtrica en la que el nmero de individuos se duplica al cabo de un tiempo determinado denominado tiempo de generacin ().

De esta forma, podemos calcular el nmero de bacterias (N) al cabo de un nmero de generaciones (n) usando la ecuacin siguiente: N = N0 2n (ecuacin 1)

siendo N0 el nmero de clulas en el momento actual. El nmero de generaciones se puede calcular de la siguiente forma:

n = t / (ecuacin 2)

donde t es el tiempo transcurrido. Por consiguiente, combinando las ecuaciones 1 y 2:

N = N0 2t/ (ecuacin 3)

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MB. MARICELA TOLEDO GARCALos tiempos de generacin de bacterias creciendo en ambientes favorables pueden ser muy cortos (valores de de 20 min).

Esto lleva a que una nica clula (N0=1) creciendo con un = 20 min, llegue a poder producir 4.7 x 1021 clulas en 24 horas.

Para transformar una ecuacin exponencial en una recta,

ln N = ln N0 + (t/) ln 2 (ecuacin 4)

Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn de una constante igual a ln 2/.

Si el tiempo de generacin es muy grande, el crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si es pequeo el crecimiento ser rpido.

En un crecimiento equilibrado, todos los parmetros de crecimiento (nmero de clulas, biomasa de cultivo, acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc.) evolucionan en paralelo. Por tanto, en la ecuacin anterior N puede representar cualquiera de estos factores.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCATRATAMIENTO DEL CRECIMIENTO EN FUNCIN DE LA TASA DE CRECIMIENTO

Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt).

En este caso, la ecuacin que describe la cintica es la siguiente: dN/dt = N (ecuacin 5)

esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N).

A la constante de proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento.

Integrando la ecuacin anterior durante el tiempo de cultivo, N = N0 et (ecuacin 6)

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAtomando logaritmos rinde lo siguiente:

ln N = ln N0 + t (ecuacin 7)

esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad .Comparando (7) con (4), podemos concluir que = ln2/

y, por consiguiente, que = ln2/.

Es decir, que hay una correlacin inversa entre el valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin ().

Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento en el nmero de clulas, biomasa, etc.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCARENDIMIENTO DE LOS CULTIVOS.El grfico siguiente representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un cultivo a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un substrato cuya concentracin decrece de forma proporcional al crecimiento de la biomasa.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCADefiniremos el rendimiento de utilizacin del substrato (Ys) al valor que representa la cantidad de biomasa producida por unidad de substrato consumido:

Ys = dN/dS (ecuacin 8)

El rendimiento de utilizacin de diferentes substratos puede ser diferente, vara entre diferentes microorganismos (hay m.o. que "engordan" ms que otras comiendo lo mismo) y vara tambin enfuncin de otras condiciones ambientales o fisiolgicas (no engorda lo mismo uno al comer algo si est sano o enfermo o si est en verano o en invierno).

Tambin vara el rendimiento en funcin de que el metabolismo sea oxidativo o fermentativo

Podemos calcular el rendimiento de la utilizacin del sustrato en funcin de la cantidad de sustrato aadido al cultivo, o en funcin de la cantidad de carbono presente en ese sustrato (por ejemplo).

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAAsimismo, podemos calcular la cantidad de biomasa total (g de clulas, por ejemplo) o de carbono presente en las clulas (aproximadamente el 50% de la masa celular corresponde a carbono).

Haciendo las transformaciones que se indican a continuacin sobre la frmula que relaciona la variacin de biomasa con la de sustrato (8), llegamos a la definicin de un nuevo concepto qs denominado tasa especfica de consumo de substrato por el organismo.

Ys = dN/dS (ecuacin 8)

dN/dt = Ys (dS/dt) (ecuacin 9)

(dN/dt)/N = Ys (dS/dt)/N (ecuacin 10)

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAde acuerdo con la ecuacin (5), = (dN/dt)/N,

= Ys qs (ecuacin 11)

Esto es, la tasa especfica de consumo de substrato (qs) la podemos considerar la "velocidad" con la que el organismo consume el sustrato. Evidentemente, cuanto mayor sea la tasa de consumo mayor ser la tasa de crecimiento ().

qs = Ys/ (ecuacin 12)

Asimismo, cuanto mayor sea el rendimiento del substrato consumido, tambin mayor ser la tasa de crecimiento.

Sin embargo, hay una cierta compensacin entre la tasa de consumo del sustrato y el rendimiento de forma que los microorganismos que tienen altas tasas de consumo de sustrato tienen rendimiento ms bajos (o cuando se dan las condiciones para una alta tasa, el rendimiento disminuye). A esta relacin inversa se le conoce con el nombre de efecto Pasteur.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAPor ltimo, nos falta relacionar la tasa de crecimiento () con la concentracin de sustrato (S).

En condiciones de sustrato abundante, la concentracin de este no afecta al valor de ; pero cuando el sustrato se hace limitante, s existe ese efecto.

La expresin matemtica que relaciona ambos parmetros se conocecon el nombre de ecuacin de Monod y es la siguiente: = max [S/(Ks+S)] (ecuacin 13)

En esta ecuacin la tasa de crecimiento () depende de la mxima que puede alcanzar el microorganismo (max), de la (S) y de un valor constante, Ks, que representa la concentracin de sustrato a la que se alcanza una tasa de crecimiento igual a la mitad de la mxima.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCA [ = ] velocidad de crecimiento especfica (h-1)S [ = ] concentracin de sustrato (g/L)mx [ = ] velocidad de crecimiento mximoKs [ = ] constante de Monod (g/L); afinidad de los organismos por el sustrato

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La relacin cintica entre crecimiento y formacin de producto depende del papel del producto en el metabolismo microbiano. a) Formacin de producto asociada al crecimiento (clase 1)b) Formacin de producto parcialmente asociada al crecimiento, cintica mixta (clase 2, situacin intermedia entre 1 y 3)c) Formacin de producto no asociada al crecimiento (clase 3).

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAModelos cinticos Permiten predecir comportamientos y simular el efecto de variar las condiciones de operacin dentro de su rango de validez.La formulacin de un modelo puede ser experimental, terica o mixta. Modelos ms simples idealizan a la poblacin celular como: No estructurada No segregada Estado de crecimiento balanceado: la composicin celular media no se afecta por la proliferacin Representan comportamiento promedio de las poblaciones de clulas a travs de la cuantificacin de propiedades del cultivo (tales como X, S, P, , qS, qP).

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAModelos de crecimiento celularModelos segregadosModelos no segregadosModelos estructuradosModelos no estructurados

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAModelos cinticos para el crecimiento El modelo cintico ms difundido es el propuesto por Monod (1942). Establece una relacin funcional entre y la concentracin de un nico nutriente esencial limitante. Es un modelo sencillo de dos parmetros. Se aplica bsicamente para el cultivo de un microorganismo que crece formando clulas aisladas (separadas) sobre un substrato simple y cuando no hay inhibidores del crecimiento. Modelo flexible, ha mostrado predeciradecuadamente el crecimiento de cultivos que no cumplen totalmente los requisitos anteriores. Si bien se basa en la forma de las isotermas de adsorcin de Langmuir y en la cintica enzimtica de Michaelis & Menten, es un modelo de base esencialmente emprica.

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m:es la velocidad especfica de crecimiento mxima.KS:constante de saturacin, tambin llamada constante del modelo de Monod. = m/2 para S = KS Generalmente S >> KS y m, ( es constante).El modelo de Monod se aplica bsicamente para la fase de crecimiento exponencial. Existen modificaciones del modelo de Monod para extender su aplicacin a otros casos: inhibicin, crecimiento diuxico (varios substratos), substrato complejos no definidos, cultivos mixtos, etc.

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MB. MARICELA TOLEDO GARCATabla 1. Valores tpicos de la constante de saturacin (KS) del modelo cintico de MonodSubstratoOrganismo (gnero)KS (mg/L)GlucosaEscherichia0,07 2,0GlucosaAspergillus5,0GlucosaSaccharomyces25LactosaEscherichia20GlicerolCandida4,5OxgenoCandida0,04 0,5MetanolPseudomonas0.7FosfatoEscherichia1,6Mg2+Klebsiella0,6TriptofanoEscherichia0,0005 0,001ArgininaAspergillus0,5

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MB. MARICELA TOLEDO GARCA El resultado exitoso de un bioproceso implica optimizar el binomio microorganismo - ambiente. Los factores ambientales inciden en la cintica y por lo tanto en los parmetros cinticos. Los principales factores ambientales son: Formulacin del medio de cultivo Tipo de nutrientes (simples, complejos, naturaleza qumica) Solubilidad de los nutrientes, Concentracin de nutrientes y otros componentes Tipo de medio (complejo, definido, mnimo) pH Temperatura Concentracin de oxgeno disuelto Actividad de aguaRelacin entre el ambiente y el crecimiento microbiano

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MB. MARICELA TOLEDO GARCAMedio de cultivo (h-1)Glucosa y caldo nutriente 1,2Glucosa y sales minerales0,82Acetato y sales minerales0,52Succinato y sales minerales0,14

Velocidad especfica de crecimiento de Escherichia coli sobre diferentes tipos de medios de cultivo

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MB. MARICELA TOLEDO GARCALa ecuacin de Monod tendr mucha importancia al tratar de cultivos continuos. Para que se cumpla esta ecuacin el rendimiento debe serindependiente de la concentracin de sustrato.

En la prctica, los valores de Ks suelen ser muy bajos, lo que indica que los microorganismos crecen con tasas () muy prximas a las mximas (max) a concentraciones de sustrato bajas y slo cuando estas son extremadamente bajas, la velocidad de crecimiento se reduce.

Esto es debido a que los sistemas de transporte de nutrientes suelen tener valores de Km considerablemente reducidos (La Km indica la concentracin de sustrato a la que la velocidad de transporte es la mitad de la mxima)

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Discontinuo (batch).CaractersticasTiempos cortos de procesos lo que permite trabajar en condiciones aspticas, sobre todo cuando se trata de medios de cultivos ricos en nutrientes.Perodos muertos: lavado, esterilizado, etc.Opera a baja densidad celular.Las concentracin de los distintos componentes vara a lo largo del proceso.