Cultivo primário de células oriundas de carcinomas ... · and aldehyde dehydrogenase activity, however, all exhibited tumorigenic potential in vitro through tumorspheres formation

YONARA DE GOUVEIA CORDEIRO

Cultivo primário de células oriundas de carcinomas mamários de

cadelas e caracterização de possíveis populações de Células

Iniciadoras de Tumor

São Paulo

2015

YONARA DE GOUVEIA CORDEIRO

Cultivo primário de células oriundas de carcinomas mamários de

cadelas e caracterização de possíveis populações de Células

Iniciadoras de Tumor

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de Mestre em Ciências

Departamento: Patologia

Área de Concentração: Patologia Veterinária

Orientador: Prof. Dr. Heidge Fukumasu

São Paulo

2015

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.3110 Cordeiro, Yonara de Gouveia FMVZ Cultivo primário de células oriundas de carcinomas mamários de cadelas e

caracterização de possíveis populações de Células Iniciadoras de Tumor / Yonara de Gouveia Cordeiro. -- 2015.

130 f. :il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Patologia, São Paulo, 2015.

Programa de Pós-Graduação: Patologia Experimental e Comparada. Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada. Orientador: Prof. Dr. Heidge Fukumasu.

1. Cães. 2. Células iniciadoras de tumor. 3. Câncer de mama. 4. Oncologia comparada. I. Título.

ERRATA CORDEIRO, Y. G. Cultivo primário de células oriundas de carcinomas mamários de cadelas e caracterização de possíveis p opulações de Células Iniciadoras de Tumor. 2015. 130 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

Página Onde se lê Leia-se

Capa: Título Células Iniciadoras de Tumor células iniciadoras de tumor

Página de rosto Células Iniciadoras de Tumor células iniciadoras de tumor

Folha de Avaliação Células Iniciadoras de Tumor células iniciadoras de tumor

Ficha catalográfica Células Iniciadoras de Tumor células iniciadoras de tumor

RESUMO Células Iniciadoras de Tumor células iniciadoras de tumor

ABSTRACT Células Iniciadoras de Tumor células iniciadoras de tumor

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome: CORDEIRO, Yonara de Gouveia

Título: Cultivo primário de células oriundas de carcinomas mamários de cadelas e

caracterização de possíveis populações de Células Iniciadoras de Tumor

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Patologia Experimental e

Comparada da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade de

São Paulo para obtenção do título de Mestre

em Ciências

Data: ___/___/___

Banca Examinadora

Prof. Dr.: ____________________________________________________________

Instituição:______________________________________Julgamento:___________

Prof. Dr.: ____________________________________________________________


Prof. Dr.: ____________________________________________________________


À ela, meu exemplo de ser humano, meu exemplo de caráter e de coragem.

Meu porto seguro, minha conselheira, minha amiga, minha mãe.

Nada nessa minha humilde vida teria sentido sem você.

E tudo que eu conquistei, conquisto e conquistarei daqui pra frente,

foi, é e será, sempre graças à você.

Te amo muito, Ana Maria!

AGRADECIMENTOS

À Deus, sempre, por ter ouvido as minhas preces desesperadas quando já não tinha mais

pra onde correr. Por me fazer jamais perder a fé e a esperança. E por sempre me conduzir

ao caminho certo, na maioria das vezes não no momento em que pedi, mas no momento

que Ele sabia que era o certo;

À minha mãe Ana Maria, que sempre acreditou em mim. A pessoa a quem devo meu

caráter, minha força, minha independência. Obrigada por não ter desistido todas as vezes

em que eu pensei em desistir. Por ter me mantido aqui. Por ter me ensinado desde cedo

que quem faz nossa vida é a gente, basta corrermos atrás. Agradeço todos os dias por ter

vindo ao mundo através de você.

À minha família. Ao meu avô, meu exemplo de força e superação. Ao meu anjo da guarda,

minha avó, que de outro plano olha por mim em todos os momentos, e está ali me dando

proteção e acalmando meu coração. Às minhas tias, Iolanda, Nice e Tereza, pelos mimos,

carinhos e momentos de alegria. Aos tios, primos e primas, por me mostrarem o sentido da

palavra família. Nada me faz mais feliz do que voltar pra casa e sentir a alegria que é estar

com vocês.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Heidge Fukumasu, que me recebeu desde o primeiro dia de

estágio obrigatório, e me deu a oportunidade de estar aqui hoje, anos depois. Sem dúvidas

é um exemplo de inteligência e sucesso e que, de muitas formas, contribuiu para o meu

crescimento profissional e pessoal aqui dentro.

Ao Prof. Dr. Ricardo de Francisco Strefezzi, pela contribuição com este projeto, pela

transmissão de conhecimento, e por sempre estar disposto a ajudar, foi um professor e

tanto; e ao Prof. Dr. José Bento. S. Ferraz pelos conselhos, pelas histórias, pelo carinho;

Aos clínicos veterinários que cederam amostras para este trabalho. Alessandra, Marcus,

Mariney, Juliana, Milena, Sílvio, Tânia, Beatriz, Bruno, Paulo, Nilson, Valmir, Mariana, João

Paulo. Sem vocês não teria sido possível;

Às amigas, Pâmela (sobrevivemos amiga!), Camila e Thayla, que estão comigo desde

sempre. Não teria a menor graça sem vocês aqui. Obrigada por tudo, pela amizade, por

cada lembrança compartilhada, por dividir tristezas e alegrias;

À todos os colegas e a amigos do LOCT. Principalmente ao Pedro, pelo companheirismo e

por sempre ter me ajudado quando precisei, sou muito feliz por ter você trabalhando comigo

e mais ainda por te ter como amigo; Arina, por ter me iniciado nesta vida louca de cultivo de

células, lá nos primórdios do estágio, e por ainda me ajudar nos momentos de dificuldades,

além de, claro, pelos momentos de amizade e descontração; Lídia, pela amizade, pelos

ótimos momentos aqui e nas viagens malucas, pelos conselhos, pelas dicas e ajuda com

protocolos e dissertação; Francisco, que vai entrar junto nos agradecimentos do LOCT sim!

Obrigada por tantos bons momentos, e por ter aguentado as crises de desespero. Enfim, a

todos os colegas deste novo laboratório que eu me orgulho em fazer parte. Só quem estava

aqui no antes e agora está no depois, sabe como é gratificante a sensação de estarmos tão

longe;

Aos alunos de Iniciação Científica, Fábio, Lucas, Sirlene, Erika e Fernanda, que

contribuíram para minha formação profissional aqui dentro, sempre tive muito gosto de estar

com vocês. Além de pseudo-orientados, ganhei amigos;

À Mariane, Jean e Leonardo, queridos amigos de departamento. São Paulo foi muito mais

divertida com vocês. Não teria como começar o mestrado de forma mais agradável. O

diamante de Homer ficará para sempre na memória;

Ao Prof. Dr. Flávio Meirelles, por compartilhar o espaço físico para o desenvolvimento deste

trabalho. E por todos os amigos que ali fiz durante este período, que estiveram presentes

em muitos momentos de alegria. Ana Mançanares, obrigada pela amizade e disposição

sempre. E a todos os demais colegas do LMMD;

À todos os amigos, principalmente paranaenses, por compreenderem cada vez que não

pude estar presente. Me fizeram muita falta. Câmi, Tassi e Aninha, para sempre na minha

vida e no meu coração;

À Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, pelo acolhimento. À Faculdade de

Medicina Veterinária e Zootecnia, e ao Departamento de Patologia Experimental e

Comparada, por proporcionar a formação acadêmica; e à CAPES, FAPESP e CNPq pelo

financiamento deste trabalho;

E à Becca, minha fiel companheira, que me dirige aquele olhar de amor que só os cães tem,

mesmo nos piores momentos de frustração.

Muito obrigada.

“E até lá, vamos viver Temos muito ainda por fazer

Não olhe pra trás

O mundo começa agora Apenas começamos”

- Renato Russo

RESUMO

CORDEIRO, Y. G. Cultivo primário de células oriundas de carcinomas mamários de cadelas e caracterização de possíveis populações de Células Iniciadoras de Tumor. [Primary cell culture of canine mammary carcinoma and characterization of possible populations of Tumor Initiation Cells]. 2015. 130 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

Em animais, a prevalência do câncer tem aumentado de forma significativa com o

passar dos anos. As neoplasias mamárias representam o tipo mais frequente de

câncer em cadelas, chegando a 52% da população de fêmeas, e entre os animais

afetados, 50% das neoplasias se apresentam sob a forma maligna. O

desenvolvimento e caracterização de modelos animais para o estudo de neoplasias

humanas é de extrema relevância para a melhoria no diagnóstico e tratamento do

câncer. Os tumores sólidos apresentam uma hierarquia entre as células que

determina o desenvolvimento e o comportamento da neoplasia. Recentemente, tem-

se estudado um pequeno grupo de células que apresentam diversas características

das células-tronco normais encontradas nos tecidos. Estas células, denominadas

Células Iniciadoras de Tumor (CITs), são descritas como sendo as principais

responsáveis pelas falhas na quimioterapia e no aparecimento de recidivas tumorais,

devido ao grande potencial de renovação e diferenciação que elas possuem. Desta

maneira, nosso objetivo foi caracterizar linhagens celulares provenientes de

neoplasia de glândula mamária de cadelas que pudessem ser utilizadas futuramente

na pesquisa básica e aplicada em oncologia comparada. Além das alterações

citogenéticas e imunocitoquímicas, verificamos que os cultivos celulares

apresentaram quantidades distintas de populações positivas e negativas quanto à

expressão de CD24 e CD44 bem como da atividade de aldeído-desidrogenase,

porém, todos exibiram potencial tumorigênico in vitro através do ensaio de formação

de tumoresferas.

Palavras-chave: Cães. Células iniciadoras de tumor. Câncer de mama. Oncologia

comparada.

ABSTRACT

CORDEIRO, Y. G. Primary cell culture of canine mammary carcinoma and characterization of possible populations of Tumor Initiation Cells. [Cultivo primário de células oriundas de carcinomas mamários de cadelas e caracterização de possíveis populações de Células Iniciadoras de Tumor]. 2015. 130 f. Dissertação (Mestrado em Ciências) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2015.

The prevalence of cancer in animals has increased significantly over the years.

Mammary tumors are the most common cancer in dogs, reaching 52% of female

population, and among affected animals, 50% of tumors are presented in the

malignant form. The development and characterization of animal models for the

study of human cancers is extremely important for improving the diagnosis and

treatment of cancer. Solid tumors have a hierarchy of cells that determines the

development and behavior of cancer. Recently, there has been studied a small group

of cells with different characteristics from those normal stem cells found in tissues.

These cells, known as tumor initiating cells (TICs), are described as being primarily

responsible for the failures in chemotherapy and the appearance of recurrences,

because of their potential for renewal and differentiation. Thus, our objective was to

characterize cell lines derived from mammary gland neoplasia of dogs that could be

further used for basic and applied research in comparative oncology. In addition to

the cytogenetic and immunocytochemical changes, we found that cell cultures had

different amounts of positive and negative populations of CD24 and CD44 expression

and aldehyde dehydrogenase activity, however, all exhibited tumorigenic potential in

vitro through tumorspheres formation.

Keywords: Canine. Comparative oncology. Mammary cancer. Tumor initiating cell.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Incidência e mortalidade de câncer no âmbito mundial ....................... 21

Figura 2 - Representação das taxas brutas de incidência por 100 mil indivíduos, em homens e mulheres, estimadas para o ano de 2014 .................................................................................................... 24

Figura 3 - Taxas de incidência do câncer de mama em mulheres na população mundial .............................................................................. 26

Figura 4 - Taxas brutas de incidência, em 100 mil mulheres, de neoplasias malignas de mama estimadas para o ano de 2014 ........... 26

Figura 5 - Modelo de desenvolvimento de tumores sólidos a partir da expansão clonal proposta por Nowell. ................................................. 31

Figura 6 - Modelos de desenvolvimento neoplásico. ........................................... 33

Figura 7 - Transição epitélio-mesenquimal (EMT) e transição mesenquima-epitelial (MET) para formação de tumor secundário .......................................................................................... 36

Figura 8 - Células provenientes da dissociação de neoplasias mamárias de cadelas, em condições de aderência ............................................. 64

Figura 9 - Lâmina histológica da amostra 005/13 ................................................ 66

Figura 10 - Morfologia do cultivo celular, amostra 005/13 ..................................... 67


Figura 12 - Morfologia do cultivo primário, amostra 020/14 ................................... 69



Figura 15 - Lâmina histológica, amostra 028/14 .................................................... 73


Figura 17 - Avaliação do número de cromossomos por coloração convencional, amostra 005/13 ............................................................. 77




Figura 21 - Avaliação dos cromossomos por coloração convencional, amostra 028/14 ................................................................................... 81

Figura 22 - Avaliação dos cromossomos por coloração convencional, amostra 028/14 ................................................................................... 82

Figura 23 - Marcação imunocitoquímica, amostra 005/13 ..................................... 84




Figura 27 - Marcação imunocitoquímica para expressão de vimentina em diferentes passagens, amostra 020/14 ................................................ 88

Figura 28 - Marcação imunocitoquímica para expressão de vimentina em diferentes passagens, amostra 028/14 ................................................ 88

Figura 29 - Análise das populações de células com maior atividade de aldeído-desidrogenase ........................................................................ 90

Figura 30 - Formação de tumoresferas, amostra 020/14 ....................................... 97

Figura 31 - Agregados celulares formados a partir do sétimo dia, amostra 028/14 ................................................................................................. 97

Figura 32 - Formação de esferas em cultivo de baixa aderência após as separações por beads magnéticas .................................................... 102

Figura 33 - Aglomerado de células em proliferação, amostra 028/14 .................. 103

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 - Incidência registrada de câncer na população mundial, homens e mulheres - 2012 ................................................................................. 21

Gráfico 2 - Mortalidade registrada na população mundial, homens e mulheres - 2012 .................................................................................... 22

Gráfico 3 - Frequência de neoplasias mamárias em fêmeas e distribuição dos casos por idade .............................................................................. 44

Gráfico 4 - Distribuição dos casos nos trinta e cinco cães coletados no estudo, baseado no tecido de origem e número de lesões por animal ................................................................................................... 60

Gráfico 5 - Distribuição dos casos quanto à idade (anos) e raça ............................ 61

Gráfico 6 - Análise do número de cromossomos em vinte metáfases por cultura celular ........................................................................................ 76

Gráfico 7 - Ensaio de formação de esferas em cultivo de baixa aderência em populações ALDHlow e ALDHhi, amostra 005/13 .............................. 94




Gráfico 11 - Avaliação do crescimento de tumoresferas após a separação para os fenótipos CD24- e CD24+ ........................................................ 100

Gráfico 12 - Avaliação do crescimento de tumoresferas após a separação para os fenótipos CD44- e CD44+ ........................................................ 101

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Distribuição das lesões segundo classificação histopatológica ............. 61

Tabela 2 - Culturas primárias de neoplasias de glândula mamária em cães, selecionadas para caracterização celular .................................... 64

Tabela 3 - Tempo de duplicação celular das quatro amostras cultivadas. .............. 75

Tabela 4 - Porcentagens de células ALDH+ nas quatro amostras de carcinomas mamários caninos .............................................................. 89

Tabela 5 - Quantificação das populações CD24 e CD44 através da separação por beads magnéticas, em neoplasia mamária de cães ...................................................................................................... 98

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Incidência e mortalidade do câncer no mundo ...................................... 20

Quadro 2 - Estimativa dos dez tipos de câncer mais incidentes no Brasil, exceto pele não-melanoma - 2014 ........................................................ 23

Quadro 3 - Marcadores de células-tronco cancerosas em tumores sólidos ............. 39

Quadro 4 - Prospecção do isolamento de células-tronco de tumores mamários humanos de tecidos frescos dissociados .............................. 40

Quadro 5 - Principais características relacionadas ao estudo da espécie Canis familiaris na oncologia comparada. ............................................. 42

Quadro 6 - Clínicas parceiras que contribuíram com amostras para o presente estudo .................................................................................... 51

Quadro 7 - Anticorpos utilizados para avaliação imunocitoquímica ......................... 55

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ............................................................................................... 18

2 REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 19

2.1 CONCEITOS GERAIS SOBRE CÂNCER ...................................................... 19

2.2 NEOPLASIAS MAMÁRIAS ............................................................................. 24

2.3 MODELOS DE DESENVOLVIMENTO NEOPLÁSICO ................................... 29

2.3.1 Modelo estocástico ou expansão clonal .................................................... 29

2.3.2 Modelo hierárquico ou teoria das Células-tronco Cancerosas ................. 32

2.4 CÉLULAS-TRONCO CANCEROSAS NO CÂNCER DE MAMA ..................... 37

2.5 ONCOLOGIA COMPARADA .......................................................................... 40

2.5.1 Tumores espontâneos em cães – neoplasias mamárias ........................... 40

2.5.2 Células-tronco cancerosas em neoplasias mamárias em cães ................ 46

3. OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 49

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 50

5. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 51

5.1 MATERIAL UTILIZADO NO ESTUDO ............................................................ 51

5.2 CULTIVO PRIMÁRIO DE CÉLULAS ORIUNDAS DE NEOPLASIAS

MAMÁRIAS .................................................................................................... 52

4.3 TEMPO DE DUPLICAÇÃO CELULAR ........................................................... 53

5.4 AVALIAÇÃO CITOGENÉTICA POR CARIOTIPAGEM ................................... 54

5.5 IMUNOCITOQUÍMICA.................................................................................... 55

5.6 SEPARAÇÃO DE POPULAÇÕES CELULARES POR BEADS

MAGNÉTICAS ATRAVÉS DO PERFIL DE EXPRESSÃO DE CD24/CD44 .... 56

5.7 SEPARAÇÃO DE POPULAÇÕES POSITIVAS PARA A ATIVIDADE DE

ALDEÍDO-DESIDROGENASE (ALDH) ATRAVÉS DE CITOMETRIA DE

FLUXO ........................................................................................................... 57

5.8 CULTIVO CELULAR PARA FORMAÇÃO DE TUMORESFERAS .................. 58

5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 59

6. RESULTADOS............................................................................................... 60

6.1 DISTRIBUIÇÃO DOS CASOS CLÍNICOS ...................................................... 60

6.2 CARACTERIZAÇÃO DOS CULTIVOS CELULARES ..................................... 62

6.2.1 Dissociação e cultivo primário em monocamada ...................................... 62

6.2.2 Classificação histopatológica e morfologia da cultura primária .............. 65

6.2.3 Tempo de duplicação celular ...................................................................... 74

6.2.4 Cariotipagem ................................................................................................ 75

6.2.5 Imunocitoquímica ......................................................................................... 83

6.2.6 Separação de populações positivas para a atividade de aldeído-

desidrogenase (ALDH) através de citometria de fluxo .............................. 89

6.2.7 Separação de populações celulares por beads magnéticas através

do perfil de expressão de CD24/CD44 ........................................................ 98

7 DISCUSSÃO ................................................................................................ 104

8 CONCLUSÃO .............................................................................................. 116

9 REFERÊNCIAS............................................................................................ 117

18

1 INTRODUÇÃO

O câncer está entre as principais causas de morbidade e mortalidade no

mundo, sendo a segunda maior causa de morte, atrás apenas das doenças

cardiovasculares. Para 2030, estima-se que a carga global será de 21,4 milhões de

casos novos de câncer e 13,2 milhões de mortes por câncer, em consequência do

crescimento e do envelhecimento da população, bem como da redução na

mortalidade infantil e nas mortes por doenças infecciosas em países em

desenvolvimento. Durante décadas, a pesquisa minuciosa das bases moleculares do

câncer vem tentando esclarecer as causas da transformação oncogênica e o

aparecimento de neoplasias ainda não detectáveis.

Principalmente para tumores sólidos, como é o caso do câncer de mama, a

heterogeneidade e a complexidade molecular impõem muitos desafios para o

desenvolvimento de estratégias efetivas para a prevenção e a cura desta doença.

Neste contexto, há um grande investimento nas pesquisas que buscam entender e

desvendar a origem dos tumores, e entre elas, se encontra a teoria das células-

tronco cancerosas, onde apenas um grupo de células seria capaz de dar origem a

um novo tumor, além da mediação das vias de metástase e falhas na quimioterapia.

Se correta, pode fornecer informações valiosas que explicariam muitas das

limitações encontradas nos modelos atuais, sugerindo novas estratégias para o

controle das neoplasias mamárias. Por causa da estreita relação entre CITs com a

iniciação, progressão, metástase e resistência às terapias, técnicas de isolamento,

identificação e caracterização destas células para compreensão da biologia celular e

molecular, devem ser cada vez mais precisas para continuar os avanços na

pesquisa em câncer. Assim, temos de levar em conta os benefícios que a

investigação na oncologia comparada pode oferecer não só para a saúde animal,

mas também à medicina humana.

19

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CONCEITOS GERAIS SOBRE CÂNCER

O termo “câncer” pode ser considerado como um termo genérico, o qual

abrange um grupo de doenças de diferentes etiologias, características e implicações

que acometem qualquer parte do organismo. É definido pela proliferação

descontrolada de células que ultrapassam seus limites usuais e podem interferir não

só na arquitetura e função do próprio tecido de origem, mas também em tecidos

adjacentes a ele, seja por compressão física ou invasão de células tumorais

(KUMAR, 2011). Neste último processo, as células neoplásicas podem alcançar e

invadir vasos sanguíneos e linfáticos, disseminando-se para outras regiões e

implantando-se em um segundo tecido, dando origem a uma neoplasia secundária.

Esta evolução é conhecida como processo de invasão e formação de metástases.

Neste processo, segundo a Sociedade Americana do Câncer (ACS – American

Cancer Society), que é responsável por quase 90% das mortes pela doença no

mundo, as células do tumor primário adquirem algumas habilidades que permitem

com que estas células invadam a matriz extracelular. Para isso, é preciso que haja

uma ação concomitante entre estes dois componentes: as células primárias

necessitam selecionar as características vantajosas a elas, e a matriz extracelular

deve apresentar componentes que permitam a adaptação e acomodamento destas

células para que aconteça o desenvolvimento da nova formação (GUPTA;

MASSAGUÉ, 2006).

O câncer é uma das doenças que mais desafiam a medicina não só pela

complexidade no seu desenvolvimento, mas também pela dificuldade do tratamento,

raramente eficaz. Apesar dos grandes avanços realizados pela medicina quanto ao

diagnóstico e tratamento, seja na oncologia da pesquisa básica, ou na oncologia

clínica aplicada, ainda nos confrontamos com um alto índice de incidência e

mortalidade causado pelo câncer em todo o mundo, sendo que estes números

alarmantes não ficam restritos a uma determinada raça, idade, sexo ou condição

social. Segundo estatísticas da IARC (International Agency for Research on Cancer

– pertencente à Organização Mundial da Saúde), em 2012 foram registrados 14,1

20

milhões de novos casos, 8,2 milhões de mortes pela doença, e mais de 32 milhões

de pessoas vivendo com a doença no mundo (Quadro 1), (GLOBOCAN, 2012). Para

2025, a tendência é um aumento do número de casos: levando em consideração

somente as projeções das mudanças demográficas mundiais, estima-se que 19

milhões de casos sejam diagnosticados em homens e mulheres. As mudanças na

fertilidade e o aumento na expectativa de vida acabam por levar a uma rápida

expansão e envelhecimento da população mundial, atingindo uma escala

indesejável de problemas relacionados ao câncer, principalmente em países em

desenvolvimento (Figura 1) (ACS; IARC, 2014).

Quadro 1 - Incidência e mortalidade do câncer no mundo

Fonte: International Agency for Research on Cancer. Organização Mundial da Saúde Legenda: Em números, 57% dos casos novos, 65% das mortes pela doença e 48% casos prevalentes ocorreram em regiões menos desenvolvidas – 2012

É sabido que alguns órgãos são mais propensos a desenvolver uma

neoplasia do que outros, apresentando uma maior incidência e prevalência no

cenário atual. Dos 14 milhões de casos diagnosticados, a maior incidência é

neoplasias pulmonares, seguido de por neoplasias mamárias, colorretais, de

próstata, estômago e fígado. Este quadro não difere muito entre ambos os sexos.

Nas mulheres, a neoplasia responsável pelo maior número de mortes ainda é o

câncer de mama, seguido das neoplasias de pulmão, colorretal, cérvix, estômago e

fígado; em homens, o principal órgão é o pulmão, seguido de fígado, estômago,

câncer colorretal e câncer de próstata (Gráficos 1 e 2).

21

Figura 1 - Incidência e mortalidade de câncer no âmbito mundial

Fonte: International Agency for Research on Cancer. Organização Mundial da Saúde. Legenda: Para mortalidade há uma menor variabilidade regional, com o índice chegando a ser 15% maior nos homens, e 8% em mulheres em países desenvolvidos, do que nos subdesenvolvidos

Gráfico 1 - Incidência registrada de câncer na população mundial, homens e mulheres - 2012

Fonte: International Agency for Research on Cancer. Organização Mundial da Saúde

22

Gráfico 2 - Mortalidade registrada na população mundial, homens e mulheres - 2012

Fonte: International Agency for Research on Cancer. Organização Mundial da Saúde

No Brasil, também é evidente que o câncer é um problema grave de saúde

pública, onde falta assistência para o controle e prevenção da doença não só nas

regiões mais pobres, mas também abrangendo todos os níveis culturais e sociais da

população. O Brasil é um país em desenvolvimento, e deste modo também se

encontra na fase de mudanças quando se fala em perfil demográfico. Assim como

no resto do mundo, a melhora, mesmo que pequena e lenta, nas políticas de saúde

e outras políticas públicas, tem levado a um envelhecimento da população brasileira,

onde se tem como consequência uma diminuição na mortalidade por doenças

infectocontagiosas e um aumento na incidência e prevalência das doenças crônico-

degenerativas (Figura 2) (INCA, 2014).

Deste modo, adicionado ao fato de que o câncer se trata de uma doença

multifatorial e não só uma desordem causada por um agente específico, medidas

preventivas devem ser continuadas para tentar-se o controle e a redução dos casos

de câncer. Medidas tais como as estratégias para o controle do tabagismo, o

estímulo da alimentação e hábitos de vida mais saudáveis, a vacinação para

prevenção do câncer de útero pelo Papilomavírus humano (HPV), a diminuição no

consumo de álcool, conscientização sobre métodos de prevenção contra melanoma,

entre outros métodos, devem entrar na rotina das campanhas nacionais contra o

câncer. Estas medidas crescem em importância especialmente para nações como o

23

Brasil, que se encontram não só neste processo de transição demográfica, mas

também em uma condição de transição econômica, o que consequentemente leva

ao ônus global do câncer observado em países economicamente mais

desenvolvidos (INCA, 2014).

A distribuição das neoplasias por órgãos/sistemas e sexos no Brasil difere um

pouco quando comparada ao resto do mundo. Por exemplo, em homens, que nas

estatísticas mundiais têm como principal tipo de câncer o carcinoma pulmonar, no

Brasil, mais de 20% dos casos diagnosticados até 2014 foram de câncer de

próstata, e mais de 68 mil novos casos são estimados para 2015, sendo a neoplasia

mais incidente em todas as regiões do país. Logo depois, estão as neoplasias de

sistema respiratório (traqueia, brônquio e pulmão), cólon e reto, estômago, entre

outras. Nas mulheres, apesar do câncer de mama também liderar a lista de

incidência e mortalidade por câncer no país (20,8% dos casos) assim como nas

demais regiões do mundo, neoplasias de cólon e reto, colo do útero, tireóide e ovário

ganham espaço notável nas estatísticas brasileiras (Quadro 2) (INCA, 2014).

Quadro 2 - Estimativa dos dez tipos de câncer mais incidentes no Brasil, exceto pele não-melanoma - 2014

Fonte: Estimativa 2014: incidência de câncer no Brasil. Instituto Nacional do Câncer

24

Figura 2 - Representação das taxas brutas de incidência por 100 mil indivíduos, em homens e

mulheres, estimadas para o ano de 2014

Fonte: Estimativa 2014: incidência de câncer no Brasil. Instituto Nacional do Câncer Legenda: estão representadas as taxas por estados da Federação, de todas as neoplasias malignas exceto as de pele não-melanoma - 2014

Todos os dados de taxas de incidência e estimativas de novos casos de

câncer no Brasil para o biênio 2014/2015 foram retirados das publicações realizadas

pelo Instituto Nacional Do Câncer, Rio de Janeiro, Brasil. Sabe-se que estimativas e

projeções são importantes para a descrição e entendimento dos padrões atuais de

incidência de câncer, e, apesar das limitações, permitem o dimensionamento do

impacto desta doença no Brasil e no mundo, assessorando na tomada de decisões a

fim de reduzir cada vez mais os números dos próximos levantamentos.

2.2 NEOPLASIAS MAMÁRIAS

O diagnóstico, prognóstico e tratamento para o câncer de mama é uma das

áreas que mais progride em pesquisas e resultados na oncologia, principalmente

porque esta neoplasia apresenta a maior taxa de incidência e prevalência, e

representa a maior causa de mortalidade nas mulheres em todo o mundo. Segundo

a IARC, a estimativa para o ano de 2012 era de cerca de 1,67 milhões de novos

casos diagnosticados, representando 25% de todas as neoplasias (Figura 3)

25

(GLOBOCAN, 2012). No Brasil a situação não é diferente. Para 2014/2015, são

esperados 57.120 novos casos de câncer de mama, sendo o risco estimado de

56,09 casos a cada 100 mil mulheres, somando-se os dados de todos os estados

(Figura 4). As taxas de mortalidade são desiguais entre as regiões, sendo que as

áreas de melhor situação socioeconômica têm uma leve tendência à diminuição e

estabilidade, enquanto que aquelas com uma pior condição socioeconômica

apresentam uma maior probabilidade de aumento dos índices de mortalidade com o

passar do tempo. No entanto, a sobrevida de mulheres diagnosticadas com câncer

de mama no Brasil compara-se com a de países desenvolvidos, como a Inglaterra. A

sobrevida em um, cinco e vinte anos publicada para as britânicas é de 95%, 85% e

64%, respectivamente, enquanto que no Brasil, a sobrevida estimada é de

aproximadamente de 80% em cinco anos (INCA, 2014).

É a neoplasia mais comum tanto em países desenvolvidos quanto

subdesenvolvidos, com uma leve tendência a um aumento nos países de baixa e

média renda, novamente explicado pelo envelhecimento da população, urbanização,

hábitos de vida mais saudáveis e melhoria nas práticas de diagnóstico. Recursos

limitados com sistemas de saúde ineficientes, onde a incidência de câncer de mama

é relativamente baixa e a maioria das mulheres são diagnosticadas em estágios

avançados, têm a opção de implementar programas de diagnóstico precoce com

base no conhecimento dos sinais e sintomas pelas próprias mulheres, e

encaminhamento imediato para diagnóstico e tratamento. A detecção precoce, a fim

de melhorar os resultados do câncer de mama e de sobrevida após o diagnóstico

continua a ser a base do controle desta neoplasia.

26

Figura 3 - Taxas de incidência do câncer de mama em mulheres na população mundial


Nota: as taxas de incidência são ajustadas para uma taxa de idade padronizada (ASR, do inglês age-standardised rate), necessárias quando se faz a comparação entre grupos onde a idade é um fator

que influencia nos resultados. A ASR é uma média ponderada das taxas específicas por idade; os pesos são retirados da distribuição da população padrão.

Figura 4 - Taxas brutas de incidência, em 100 mil mulheres, de neoplasias malignas de mama estimadas para o ano de 2014


27

Já se sabe que alguns fatores são considerados de risco para o

desenvolvimento de um tumor mamário primário. Elementos como: mutações

genéticas herdáveis bem definidas, como nos genes BRCA1 e BRCA2 (KING;

MARKS; MANDELL, 2003; WALSH; KING, 2007); número de gestações e idade ao

primeiro parto (LORD et al., 2008); obesidade e o risco associado de câncer de

mama em mulheres na pós-menopausa (CLEARY; GROSSMANN, 2009), podem

estar relacionados com uma maior ou menor probabilidade de um indivíduo, no caso

uma mulher, vir a apresentar um nódulo em que se confirme o diagnóstico de

neoplasia mamária. Mas, mesmo com algumas vias destes elementos já bem

definidas pela ciência, ainda não podemos predizer com certeza quem um dia

desenvolverá um câncer, e quem nunca apresentará a doença.

A soma dos diversos fatores de risco, estes sujeitos a modificações e sem

considerar os fatores reprodutivos, foi avaliada por Danaei et.al. (2005). Depois de

correlacionar diversos tipos de câncer a nove fatores de risco diferentes, chegaram à

conclusão de que mais de 20% de todas as mortes causadas por neoplasias

mamárias no mundo estão relacionadas ao consumo excessivo de álcool e da

obesidade, consequência do excesso de peso, falta de atividades físicas, ou de

ambos os fatores associados (DANAEI et al., 2005). Isto demonstra que a redução

da exposição aos principais fatores de risco comportamentais e ambientais impediria

uma substancial proporção de mortes por câncer no mundo.

Clinicamente, é uma doença tipicamente heterogênea, que pode ser

categorizada de diversas formas. O que normalmente é feito, é a classificação

destas neoplasias de acordo com a apresentação histológica, e posteriormente,

através da expressão ou não de marcadores tumorais, divididos em três principais

grupos: o das neoplasias que apresentam receptores de estrógeno e/ou

progesterona positivos (ER/PR), sendo o grupo mais variado e numeroso; aqueles

que são positivos para receptores da proteína HER2, o qual representa o grupo de

maior sucesso terapêutico devido à eficácia da terapia direcionada a este gene; e o

grupo dos cânceres triplo-negativos (Triple-negative Breast Cancers – TNBCs), onde

a célula cancerosa não responde a nenhum dos três receptores anteriores, sendo

considerado o mais maligno pela ineficiência terapêutica quando tratados com

medicamentos utilizados no tratamento dos demais grupos (THE CANCER

GENOME ATLAS NETWORK, 2012). Este último subtipo compreende em torno de

28

20% dos tumores mamários, ressaltando a deficiência na compreensão das vias que

regem a progressão tumoral, desfavorecendo assim o prognóstico das pacientes

dada a propensão para recidivas e metástases. (HURVITZ; FINN, 2009).

Histologicamente, os dois tipos mais frequentes são o carcinoma ductal e o

carcinoma lobular, representando cerca de 75% e 15% de todas as neoplasias

mamárias em mulheres, respectivamente (LI; URIBE; DALING, 2005; KORHONEN

et al., 2013). Os carcinomas lobulares apresentam parâmetros mais favoráveis,

como a positividade de receptores hormonais, baixos graus histológicos, baixos

índices proliferativos, apesar de com frequência apresentarem mais negatividade

para receptores HER2 quando comparados com os carcinomas ductais (DIXON;

ANDERSON; PAGE, 1996; ARPINO et al., 2004; RAKHA et al., 2008). Há um

interesse especial no estudo dos carcinomas lobulares, pois mesmo mostrando

características mais brandas do que os ductais, dados americanos salientam para o

rápido aumento nas taxas de incidência deste tumor em um intervalo de tempo

relativamente pequeno: de 1987 a 1999, enquanto a incidência de carcinoma ductal

subiu apenas 3%, as taxas de carcinoma lobular tiveram um aumento de 65% no

mesmo período, provavelmente relacionado ao uso de hormônios para reposição

pós-menopausa, e às melhorias nas técnicas de diagnóstico (LI et al., 2003).

Vários estudos vêm se dedicando a entender a diferença epidemiológica e na

progressão entre estes, que consistem nos dois principais subtipos. Muito menos se

sabe sobre os tipos histológicos mais raros, que inclui os carcinomas tubulares,

mucinosos, comedos, inflamatório, medulares, e carcinomas papilíferos, que juntos

respondem a cerca de 10% de todos os casos (LI; URIBE; DALING, 2005). Mesmo

com tantos avanços científicos, ainda há muito que se entender sobre o

desenvolvimento e progressão dos tumores sólidos, principalmente mamários,

visando sempre a prevenção, diagnóstico precoce, eficiência no tratamento e

qualidade de vida das pacientes.

29

2.3. MODELOS DE DESENVOLVIMENTO NEOPLÁSICO

A origem e a organização do câncer vêm sendo muito discutida atualmente,

uma vez que os pesquisadores ainda não conseguiram explicar como se desenvolve

a heterogeneidade característica das neoplasias, principalmente em tumores

sólidos. Hoje, teorias demonstram que células progenitoras ou mesmo células-tronco

teciduais seriam passíveis de uma transformação genética, podendo assim dar início

ao desenvolvimento neoplásico (WANG, 2010). Na tentativa de entender como a

fase de iniciação do câncer acontece, e qual seria a forma com que estas células

evoluem até os primeiros indícios de malignidade, dois modelos de desenvolvimento

tumoral foram sugeridos: o primeiro, chamado de modelo estocástico ou modelo de

expansão clonal, diz que a origem do câncer seria a partir de mutações nas próprias

células somáticas, e o consequente descontrole na proliferação permitiria a

aquisição de clones que sofreriam transformações que levariam à malignidade; e o

segundo, o modelo hierárquico, onde o desenvolvimento de um tumor se daria

através da propagação de células menos diferenciadas, como as células-tronco, que

teriam a capacidade de se diferenciar em células neoplásicas mais especializadas,

bem como se utilizaria de mecanismos para manter este potencial sempre ativo,

evitando a senescência e escapando da morte celular (Figura 5). Há ainda modelos

recentes que englobam ambos tipos de desenvolvimento, onde novas mutações

somáticas poderiam gerar diversidade clonal, aumentando ainda mais a

heterogeneidade tumoral (GREAVES; MALEY, 2012; BECK; BLANPAIN, 2013)

2.3.1 Modelo estocástico de desenvolvimento neoplásico

O modelo de desenvolvimento estocástico (ou de expansão clonal) foi

proposto por Peter Nowell em 1976, e sugere uma teoria para a evolução das

populações de células tumorais, a qual teria como principal característica uma

variação genética por etapas, podendo ser válido para a maioria das neoplasias de

mamíferos. Assim, uma célula, ou um pequeno grupo de células normais sofreriam

30

uma transformação pela ação de um agente carcinogênico, promovendo uma

proliferação desregulada, e as células-filhas geradas acabariam por obter alguma

vantagem sobre as demais células adjacentes, dando origem a uma expansão clonal

(Figura 5). A intensa multiplicação causaria uma instabilidade genômica celular,

permitindo uma série de mutações e reestruturações nos cromossomos. Este

acúmulo de mutações, então, daria origem a um novo fenótipo de células, mais

resistente e mais apto à sobrevivência, enquanto que, aquelas que não adquiriram

estas características, morreriam pela ação da imunidade própria do organismo

hospedeiro ou alterações metabólicas que desfavoreceriam a sobrevivência das

mesmas (NOWELL, 1976). O modelo estocástico então, se baseia em etapas de

transformações celulares, onde em cada fase se tem uma população dominante

sobre as outras. Este conjunto de ideias se assemelha ao conceito de seleção

natural descrito por Charles Darwin, em que o sistema de evolução é a variabilidade

genética ao acaso dos indivíduos unidos por um ancestral comum, juntamente com

a seleção natural dos mais aptos (GREAVES; MALEY, 2012).

Vários indícios podem dar suporte à teoria da expansão clonal. O primeiro

deles está relacionado ao tempo que um tumor leva até o aumento visível de

tamanho, sugerindo que as células tumorais passariam por um período de estase.

Em cada estágio do desenvolvimento neoplásico, segundo o modelo estocástico,

haveriam fatores, principalmente envolvidos com o microambiente tumoral

(arquitetura, recursos, fatores de crescimento, etc) ou mesmo fatores externos como

a quimio e radioterapia, que limitariam o crescimento de todas as células em geral,

conduzindo a uma competição inerente ao ambiente que seleciona apenas as mais

resistentes para darem continuidade à progressão. Assim, muitas, se não a maioria,

das células tumorais morreriam antes mesmo de concluir a multiplicação. Este fato é

evidenciado pelas grandes taxas de lesões pré-malígnas como carcinomas in situ,

fase de dormência do câncer, aumento lento e gradativo no tamanho macroscópico

da lesão, e reconstituição genética das semelhanças entre os clones (MALAISE;

CHAVAUDRA; TUBIANA, 1973; AGUIRRE-GHISO, 2007; REID et al., 2010).

31

Figura 5 - Modelo de desenvolvimento de tumores sólidos a partir da expansão clonal proposta por Nowell.

Fonte: adaptado de Greaves & Maley. Nature Reviews. v. 481. 2012 Legenda: subpopulações de células neoplásicas são selecionadas pelos fatores extrínsecos e intrínsecos a elas, as mais aptas sobrevivem, as outras morrem ou continuam dormentes. Os quadros em cinza representam os ecossistemas, enquanto que as linhas demonstram o momento da pressão seletiva.

Um exemplo prático seria a progressão que ocorre de forma comum em

neoplasias mamárias: uma neoplasia benigna, bem diferenciada, provavelmente

causada por um reduzido número de mutações, com o tempo começa a apresentar

um fenótipo mais maligno, como os carcinomas in situ, que apesar de menos

diferenciados ainda são de baixo grau invasivo; e por fim, as células tumorais

invadem tecidos adjacentes e vasos, causando a metástase - progressão de

hiperplasia glandular, para adenoma, carcinoma e invasividade. Mais do que simples

mutações e transformações genéticas a cada estágio da evolução clonal, as

populações celulares que estariam no controle do desenvolvimento tumoral estão

sujeitas a alterações fenotípicas desencadeadas por mudanças epigenéticas

(GREAVES; MALEY, 2012). Estas mudanças incluem alterações globais, como

PRESSÃO SELETIVA

Ecossistema 1 Ecossistema 2

Ecossistema 3

Metástase

Recidiva

Tratamento

Subclones – ‘driver mutation’

32

hipometilações do DNA e hipoacetilações da cromatina levando a uma instabilidade

genômica e a desregulação gênica do retinoblastoma e p16, por exemplo, bem

como mudanças mais específicas, assim como hipometilação e hipermetilação de

oncogenes e genes supressores tumorais, respectivamente (HODGSON et al., 2003;

FEINBERG; OHLSSON; HENIKOFF, 2006; JONES; BAYLIN, 2007).

Desde modo, propõe-se que a maioria dos neoplasmas surgem a partir de

uma única célula de origem, e os resultados de progressão tumoral e a variabilidade

genética adquirida dentro do clone original permite a seleção sequencial de

subclones mais agressivos. Populações de células tumorais são, aparentemente,

geneticamente mais instáveis do que as células normais, talvez pela ativação de um

loci específico na neoplasia, pela presença contínua do carcinógeno, ou mesmo

deficiências de recursos intratumoral.

2.3.2 Modelo hierárquico ou teoria das Células-tronco Cancerosas

Por outro lado, o modelo hierárquico sustenta a hipótese que o câncer se

desenvolve a partir de uma única subpopulação presente na massa tumoral. A teoria

das células-tronco cancerosas (CSCs, do inglês Cancer Stem Cells) propõe um

grupo de células contidas nos tumores sólidos as quais compartilham de algumas

similaridades com as células-tronco encontradas nos tecidos embrionários e tecidos

adultos saudáveis, como por exemplo, o potencial de auto-renovação, e a

capacidade de diferenciação em células mais especializadas, contribuindo para a

manutenção da neoplasia (Figura 6) (BECK; BLANPAIN, 2013). É preciso esclarecer

que o termo “célula-tronco cancerosa”, ainda gera confusão, uma vez que muitos

interpretam o termo no sentido de que tais células derivam das células-tronco do

tecido correspondente. As células-tronco no câncer podem, de fato, surgirem a partir

de células-tronco normais através de mutações em genes que tornariam as células-

tronco cancerosas, mas isto pode não ser o caso em todos os tumores. Por isso,

adotou-se também a expressão Células Iniciadoras de Tumor (CITs), que seriam

populações celulares capazes de dar início a uma nova neoplasia, mas não é

necessariamente uma célula-tronco.

33

Figura 6 - Modelos de desenvolvimento neoplásico.

Fonte: adaptado de Dick. Stem cell concepts renew cancer research. Blood, v. 112. 2008 Legenda: O tumor é composto por grupos distintos de células, biologicamente e funcionalmente. No modelo estocástico, as populações mais resistentes sobreviveriam à pressão seletiva, mas células de fenótipos variados poderiam dar origem a um novo tumor. Ao contrário, no modelo hierárquico, apenas um grupo de células teria a capacidade de se auto-renovar e dar origem aos demais grupos, e esta população poderia ser selecionada através de um fenótipo único.

O primeiro relato de isolamento destas células foi realizado na década de 90

em casos de leucemia mielóide aguda, onde Dominique Bonnet e John Dick

identificaram células-tronco normais e cancerosas, e caracterizaram ambos os

grupos quanto ao fenótipo e à capacidade de cada um deles no crescimento

neoplásico em camundongos imunodeficientes (BONNET; DICK, 1997). Neste

trabalho, os autores notaram que as leucemias mielóides poderiam responder ao

modelo hierárquico, onde uma única subpopulação celular, no caso as células-

tronco leucêmicas, se encontra no topo desta hierarquia. Quando transplantadas, as

células-tronco tumorais seriam biologicamente distintas, e se manteriam por si só,

gerando clones que se diferenciam ou geram progênies que irão adquirir fenótipo e

34

propriedades parecidas com as de células-tronco normais levando a progressão do

tumor (DICK, 2008).

A origem das CSCs depende da localização em que irá desenvolver o tumor

inicial. Assim como em tecidos normais, as CSCs estão dispostas em nichos, que

são localizações anatômicas específicas responsáveis pela proteção, manutenção

dentro do microambiente tumoral e sustentação das condições ideais para que elas

mantenham suas características (LI; XIE, 2005; SCADDEN, 2006). Acredita-se

também que as CSCs seriam as responsáveis não só por conduzir o crescimento do

tumor, mas também por sua capacidade superior de invasão, através de um

mecanismo já definido chamado de transição epitélio-mesenquimal (EMT), além de

proporcionar uma maior resistência contra a quimioterapia (HUNTLY; GILLILAND,

2005; FILLMORE; KUPERWASSER, 2008; VISVADER; LINDEMAN, 2008).

As células tumorais associam-se a mecanismos fisiológicos para se proteger

de agentes tóxicos, o que corresponde a uma significativa barreira na realização de

um tratamento quimioterápico efetivo (GOTTESMAN, 2002). Este mecanismo é

mediado principalmente por uma família de proteínas transportadoras ATP-

dependentes conhecida como transportadores ABC (ATP-binding Cassette), que

formam um sistema de efluxo de substâncias altamente eficientes, conhecido como

mecanismo de resistência a múltiplas drogas, ou MDR – do inglês Multi-drug

Resistance. O avanço da biologia molecular levou à identificação dos principais

genes MDRs, através da suspeita de que esta resistência estaria associada a

produtos de genes capazes de alterar a membrana plasmática (RONINSON et al.,

1984). E descobriu-se que os principais genes, e por consequência, as principais

proteínas responsáveis pelo efluxo de substâncias quimioterápicas para o meio

extracelular eram a ABCB1 e ABCG2, membros de uma família de 48 proteínas

conhecidas, responsáveis por uma série de processos essenciais para a

sobrevivência da célula tumoral (TWENTYMAN; FOX; BLEEHEN, 1986; DOYLE et

al., 1998; DONNENBERG; DONNENBERG, 2005).

Tanto o ABCB1 quanto o ABCG2 também são expressos em células-tronco,

não só auxiliando no efluxo de agentes tóxicos, mas também protegendo o tecido

contra a morte celular independentemente da administração de qualquer tipo de

agente externo (SIMS-MOURTADA et al., 2007). O conhecimento do papel central

35

de que os transportadores MDR atuam na proteção das células-tronco normais nos

permite refinar a hipótese das células-tronco cancerosas, e adicionar novos pontos

de vista que podem ser relevantes para explicar o fracasso dos tratamentos

quimioterápicos, recidivas tardias, metástases, e as diferentes respostas que os

tipos histológicos apresentam na apresentação geral do câncer. Tal conhecimento

também é de grande valia para a projeção de terapias inovadoras, que levem em

conta as semelhanças e diferenças entre o câncer e as células-tronco normais

(DONNENBERG; DONNENBERG, 2005).

Do mesmo modo, a transição epitélio-mesenquimal é fundamental para o

sucesso das neoplasias invasivas e malignas. Consiste na remodelação do

citoesqueleto celular, passando de uma estrutura epitelial e estável para um fenótipo

mesenquimal e de alta motilidade, capaz de passar por entre a matriz extracelular e

chegar até os vasos sanguíneos e linfáticos. Uma vez nos vasos, as células

invasoras alcançam um sítio metastático, onde novamente ultrapassam a barreira de

células endoteliais, e se instalam no tecido-alvo, retornando à forma epitelial e dando

origem a um tumor secundário (Figura 7). Entre todos os eventos de EMT

associados com metástases, um dos mais importantes é a perda de proteínas

responsáveis pela adesão célula-célula, como por exemplo, a E-caderina e

citoqueratina, e o aumento da expressão de vimentina e N-caderina. A E-caderina e

N-caderina são proteínas que desempenham um papel importante no

estabelecimento e manutenção da arquitetura celular, polaridade celular e

diferenciação (VAN ROY; BERX, 2008), enquanto que a citoqueratina, assim como a

vimentina, compõe um dos filamentos intermediários estruturais que mantêm a

morfologia da célula (BERNAL; STAHEL; BAYLIN, 1985). Nos seres humanos,

estudos já demonstraram que a perda de E-caderina e citoqueratina desencadeia

uma disseminação metastática em diversos tipos de tumores, bem como um

aumento do crescimento, invasão e resistência a drogas de células de câncer

colorretal com metástases hepáticas associadas (ONDER et al., 2008). Estudos

recentes também indicam que a EMT está fortemente associada à MDR (JIANG et

al., 2015), portanto, o aumento da motilidade celular permitiria a resistência a

agentes citotóxicos, senescência, bem como o escape do sistema imunológico e

fármacos quimioterápicos, desenvolvendo e induzindo metástases (KAJIYAMA et al.,

2007; ZHANG; MA, 2012).

36

Figura 7 - Transição epitélio-mesenquimal (EMT) e transição mesenquima-epitelial (MET) para formação de tumor secundário

Fonte: adaptado de Thompson & Haviv.The social aspects of EMT-MET plasticity. Nature Medicine, v 11. 2011.

Legenda: transição epitélio-mesenquimal (EMT) seguida de extravasamento e transição mesenquima-epitelial (MET) para formação de tumor secundário em tecido distante

Embora as células-tronco dos vários tecidos vivos apresentem propriedades

fundamentais de auto-renovação e diferenciação, o local de origem pode influenciar

a atividade de cada uma (CLARKE et al., 2006). Por isso, marcadores celulares que

são úteis na caracterização de células iniciadoras em um determinado tipo de tumor,

podem não ter a mesma eficiência em outro. Além disso, poucos marcadores que

são utilizados para o isolamento de células-tronco cancerosas são expressos

exclusivamente por elas. Por exemplo, o marcador de membrana CD133+ é

amplamente usado para isolar populações enriquecidas com CSCs em tumores

cerebrais, hepáticos, prostáticos, pancreáticos e colorretais (SINGH et al., 2003;

COLLINS et al., 2005; SUETSUGU et al., 2006; HERMANN et al., 2007; O’BRIEN et

al., 2007), mas também está presente no cérebro saudável e em células

diferenciadas de diversos tecidos do corpo. Também, já foi verificado que tanto

37

populações CD133+ quanto CD133- foram capazes de gerar tumores em

camundongos imunodeficientes (SHMELKOV et al., 2008).

O mesmo acontece com marcadores comumente utilizados no câncer de

mama, como o CD44 e o CD24. O primeiro é uma glicoproteína transmembrana

expressa em diversos tipos celulares, e está envolvido nas interações célula-célula

bem como em uma série de interações com a matriz extracelular em diversos

tecidos. O segundo, também é um marcador de membrana expresso em neutrófilos,

pré-linfócitos B e em alguns tipos de células tumorais (FOGEL et. al., 1999). O

fenótipo mais utilizado para o isolamento de populações enriquecidas com CSCs em

neoplasias mamárias corresponde ao grupo CD24-/low/CD44+, mas alguns trabalhos

já demonstraram que apenas estes dois marcadores podem não ser suficientes para

a separação desta população (AL-HAJJ et al., 2003; FILLMORE; KUPERWASSER,

2008). Além disso, em tumores altamente agressivos, como é o caso do

comedocarcinoma mamário, o fenótipo CD24+/CD44+ também foi caracterizado

como tumorigênico (AL-HAJJ; CLARKE, 2004). Isso mostra a dificuldade na

caracterização de uma molécula que seja expressa de forma semelhante e possa

ser utilizada fielmente em todos os tipos de neoplasias. Então, considerando que as

CSCs seriam as únicas células capazes de metastatizar e colonizar tecidos

distantes, e que, também são as células que apresentam uma maior resistência a

fármacos e um alto metabolismo detoxificante, o desenvolvimento de terapias-alvo

de inibidores de EMT pode proporcionar novas estratégias para a prevenção,

diagnóstico e tratamento de câncer.

2.4 CÉLULAS-TRONCO CANCEROSAS NO CÂNCER DE MAMA

Uma grande variedade de células compõe o tecido glandular mamário, como

as células epiteliais, estromais, hematopoiéticas e endoteliais. Também, a mama

representa um importante nicho de células-tronco sadias, que estão presentes em

um número constante (DONTU et al., 2003). Além do potencial de auto-renovação,

elas têm a capacidade de gerar os três grupos celulares que compõe a estrutura

lóbulo-alveolar de um tecido mamário adulto: células mioepiteliais que formam o

38

estrato basal dos ductos e alvéolos; células epiteliais ductais, que limitam o lúmen

dos ductos; e células epiteliais alveolares que sintetizam as proteínas do leite (LI;

XIE, 2005). Apresentam-se quiescentes no tecido a menos que haja algum estímulo,

como por exemplo, a chegada da puberdade ou a ocorrência da gravidez. Ao

contrário dessas alterações, que são breves e pontuais, o ciclo reprodutivo feminino

está presente em boa parte da vida destes indivíduos, expondo a mulher a uma

constante taxa de hormônios que por sua vez possuem uma grande influência na

glândula mamária, alterando a homeostasia das células-tronco mamárias (MaSC) e

consequentemente aumentando a predisposição a incidência de neoplasias

malignas (SHACKLETON et al., 2006).

Em 2003, baseando-se nos métodos utilizados nos estudos envolvendo

leucemias murinas, o grupo de Michael Clarke demonstrou a existência de uma

população celular tumorigênica peculiar no câncer de mama, que apresentaria uma

marcação similar às células-tronco teciduais normais (fenótipo CD44+/CD24low/-/Lin-).

Esta subpopulação exibia propriedades semelhantes às células-tronco encontradas

nos tecidos saudáveis: teriam potencial de auto-renovação, levariam à

tumorigenicidade, recidivas e metástases, além de apresentarem a capacidade de

se diferenciar em outros tecidos, embora aberrantes, dando origem à heterogênea

população de células tumorais (AL-HAJJ et al., 2003). Outros trabalhos alcançaram

resultados semelhantes desde então, se utilizando de diversas ferramentas e

marcadores para separação das populações (Quadro 3), mostrando que a grande

parte das células que constituem a massa tumoral, não seriam tumorigênicas devido

a falta da capacidade de auto-renovação e limitado potencial de proliferação

(Quadro 4) (PONTI et al., 2005; FILLMORE; KUPERWASSER, 2008). Além de

marcadores de membrana, outros métodos descrevem potenciais formas de

isolamento das populações de CSCs. A ALDH por exemplo, é uma enzima

responsável pela conversão de aldeídos em ácidos carboxílicos. É necessária na

produção de ácidos retinóicos e pode desempenhar um papel na regulação da

diferenciação de células-tronco hematopoiéticas, neurais e mamárias e, em seres

humanos, o elevado nível de atividade de ALDH é uma característica comum de

CSCs em tumores de mama, pulmão e pâncreas (CHUTE et al., 2006; GINESTIER

et al., 2007; JIANG et al., 2009; RASHEED et al., 2010).

39

Quadro 3 - Marcadores de células-tronco cancerosas em tumores sólidos

ABCG2 Membro da família ATP, envolvida no transporte de esteróides e outros lipídeos. ABCG2 (também conhecida como proteína de resistência do câncer de mama) é um transportador de múltiplas drogas (ver abaixo Hoechst SP). ABCG5 confere resistência à doxorrubicina.

ALDH1 A aldeído desidrogenase (ALDH) de família de enzimas catalisam a oxidação de aldeídos alifáticos e aromáticos de ácidos carboxílicos. ALDH1 tem um papel na conversão de retinol para o ácido retinóico, que é importante para a proliferação, diferenciação e sobrevivência.

CD24 (HSA) Molécula de adesão glicosilfosfatidilinositol pesadamente glicosilada, que tem um papel co-estimulador nas células B e T. O único ligante conhecido para a P-selectina. Embora não seja um marcador específico de células-tronco cancerosas, níveis baixos podem caracterizar células iniciadoras de tumor na mama

CD44 (PGP1) Molécula de adesão com múltiplas isoformas que tem papéis pleiotrópicos em sinalização, migração e homing. A forma CD44H padrão exibe uma elevada afinidade para o hialuronato; CD44V confere propriedades metastáticas.

CD133 (prominin 1) Glicoproteína de domínio transmembranar com um papel na organização da topologia da membrana plasmática. Expressa em células-tronco e progenitoras CD34+ no fígado fetal, precursores endoteliais, células-tronco neuronais fetais e do desenvolvimento de epitélio, CD133 foi detectada pelo epítopo glicosilado na maioria dos estudos. Assim, pode ser um marcador de células-tronco cancerosas mais confiável

EpCAM (molécula de adesão das células epiteliais; ESA, TROP1) Molécula de adesão celular homofílica Ca2+ independente expressa nas superfícies basolaterais da maioria das células epiteliais

Side Population (SP) Fenótipo devido ao efluxo de Hoechst33342 por bombas presentes na membrana plasmática em diferentes tipos de células. Atividade é conferida pelo transportador ABCG2. Inibida por verapamil. Fonte: adaptado de Visvader & Lindeman. Nature Review, v 8. 2008

40

Quadro 4 - Prospecção do isolamento de células-tronco de tumores mamários humanos de tecidos frescos dissociados

Tumor

Marcador

Células tumorais

expressando o marcador (%)

Mín. de células expressando o marcador para

tumorigênese in vivo

Ref.

Câncer de mama

CD44+/CD24–/low 11-35 200 (AL-HAJJ et al., 2003)

Câncer de mama

CD44+/CD24– ND 2000 (YU et al., 2007)

Câncer de mama

ALDH1 3-10 500 (GINESTIER et al., 2007)

Fonte: adaptado de Visvader & Lindeman. Nature Review, v 8. 2008

Embora a existência de células-tronco cancerosas em tumores sólidos ser

amplamente aceita, não está claro se linhagens celulares derivadas contêm células

semelhantes. O estudo de células iniciadoras de tumor em neoplasias mamárias,

principalmente em cultivos celulares, oferece a possibilidade de gerar novos alvos

que poderiam superar os problemas de resistência aos medicamentos, melhorar a

eficácia terapêutica e aprimorar o entendimento do desenvolvimento complexo da

doença como um todo.

2.5 ONCOLOGIA COMPARADA

2.5.1 Tumores espontâneos em cães – neoplasias mamárias

A oncologia comparada é uma área de estudo que tem ganhado espaço no

cenário da pesquisa, tendo como o principal foco desta especialidade a possibilidade

de utilizar modelos animais de neoplasias espontâneas, tais como em cães e gatos,

no estudo da iniciação, promoção e progressão de diversos tipos de câncer, bem

como no desenvolvimento e aprimoramento de terapias. Diversas espécies de

animais já contribuíram para o avanço da medicina, como cavalos, gatos, cães e até

41

animais menos comuns, como os ferrets (KLEIN et al., 1986; ANTINOFF; HAHN,

2004; SELTENHAMMER et al., 2004; HERSHEY; DUBIELZIG, 2005; SMITH et al.,

2014).

O uso de animais de laboratório para identificar o potencial carcinogênico de

diversos produtos químicos e outros agentes ligados à iniciação e desenvolvimento

de neoplasias teve início há muitas décadas. Dentre as principais vantagens de se

ter camundongos, ratos e hamsters como principais meios de estudo in vivo em

oncologia, estão: semelhanças com os humanos nas respostas a alguns agentes

carcinogênicos em diversos aspectos; menores custos de manutenção do biotério,

visto que um pequeno espaço físico pode alojar um grande número de animais,

aumentando assim a amostragem de cada estudo; o controle do ambiente em que

eles vivem, diminuindo a interferência de fatores externos nos resultados de uma

avaliação; a possibilidade da criação de linhagens isogênicas, manipulando

geneticamente o alvo do estudo para determinadas características biológicas e

moleculares, e também diminuindo a variabilidade genética entre indivíduos,

minimizando ou até mesmo excluindo os riscos de efeitos não desejáveis em uma

determinada experimentação; e o limitado ciclo de vida destes animais, ideal para

estudos que exigem resultados rápidos e onde a idade não é um fator determinante,

ou muito determinante, nas características e na eficácia do experimento (FRESE;

TUVESON, 2007).

Mas apesar disso, muito ainda se discute sobre a extrapolação dos dados

obtidos em roedores para o que acontece com os humanos. Há um crescente grupo

de evidências experimentais indicando diferenças importantes (genéticas,

metabólicas, ontogenéticas, entre outras) entre as espécies de mamíferos na

maneira em que o câncer se desenvolve (ANISIMOV; UKRAINTSEVA; YASHIN,

2005). As células murinas requerem menos alterações genéticas e/ou epigenéticas

para que haja um descontrole na proliferação que resulte em neoplasias. Então, por

necessidade, a progressão tumoral, que em humanos necessita de várias etapas,

em roedores acaba sendo muito mais simples, onde estas diferenças na

organização das vias regulatórias celulares ditam fortemente diferentes cursos de

um tumor (RANGARAJAN; WEINBERG, 2003). Este maior número de vias

necessárias para a transformação das células humanas, ou mecanismos de

proteção contra a transformação, provavelmente deve ter sido desenvolvido, ou

42

aperfeiçoado, durante a evolução das espécies. Mas vale lembrar que, apesar de

todas as divergências entre iniciação e progressão tumoral, não se pode diminuir a

importância da modelagem em roedores para o estudo do câncer em seres

humanos; no entanto, os resultados exigem uma interpretação mais cuidadosa antes

de confirmar qualquer hipótese.

O cão recebe um destaque especial quando o assunto é a oncologia

comparada. Sabe-se que são próximos geneticamente dos seres humanos, fato

cientificamente comprovado pela publicação do genoma canino, em 2005

(LINDBLAD-TOH et al., 2005), e ocupa um espaço importante na genômica atual. A

posição do cão dentro da árvore evolutiva dos mamíferos faz com que o animal se

torne um guia importante para a análise comparativa do genoma humano, gerando

uma grande oportunidade de explorar os efeitos da genética quanto à suscetibilidade

a doenças, incluindo o câncer, como demonstrado no quadro 5 (LINDBLAD-TOH et

al., 2005). Um exemplo da evolução e organização da oncologia comparada foi a

criação do Canine Comparative Oncology e Genomics Consortium. O grupo foi

lançado por pesquisadores clínicos e científicos para proporcionar um ambiente de

discussão sobre o desenvolvimento de novas tecnologias, que permitiria o estudo

adequado dos casos de câncer canino na biologia e na terapia do câncer humano

(KHANNA et al., 2006).

Quadro 5 - Principais características relacionadas ao estudo da espécie Canis familiaris na oncologia comparada.

(Continua)

Cada vez mais os proprietários de cães se preocupam com os cuidados veterinários direcionados aos animais de estimação. Segundo a Associação Americana de Medicina Veterinária (AVMA – American Veterinary Medical Association), em 2007, o gasto em saúde com cães nos EUA foi de aproximadamente 20 bilhões de dólares. Em 2012, os números chegaram a 26 bilhões (AMERICAN VETERINARY MEDICAL ASSOCIATION, 2012). Nos últimos anos, há um interesse maior por parte dos proprietários na participação de seus animais em trials, estudos clínicos e laboratoriais, quando o sucesso do tratamento convencional não é alcançado, fortalecendo a pesquisa em oncologia veterinária comparada e translacional e dando uma nova chance ao animal de estimação.

43

(Conclusão)

• Raças de cães são semelhantes às populações humanas geograficamente isoladas, como os da

Finlândia, na Islândia, exceto que o isolamento é mais extremo. Isto oferece uma grande

vantagem na busca de genes associados a doenças complexas, que, em teoria, pode ser mais

facilmente mapeados utilizando famílias de cães do que famílias humanas (SUTTER; OSTRANDER,

2004).

• Um exemplo do sucesso do mapeamento genético do cão trazendo benefícios à saúde humana,

foi o descobrimento de uma mutação pontual causadora da RCND (sigla em inglês para

Cistoadenocarcinoma Renal e Dermatofibrose Nodular), um câncer hereditário bem definido em

Pastores Alemães, e com forte semelhança a uma desordem multissistêmica em humanos,

chamada BHD. O grupo de Lingaas et. al. constatou que o mesmo gene pode ser responsável

tanto pela doença canina quanto humana, provendo agora um modelo animal de ocorrência

natural para o estudo de uma desordem humana rara (LINGAAS et al., 2003).

• Os cães apresentam uma vida útil mais curta que os humanos, porém bem mais longa que os

roedores, sendo que a intervenção clínica pode ser estudada ao longo de um período

condensado. As taxas de sobrevida em cães são avaliadas em um ano, ao invés de cinco como na

oncologia humana. Com isso é possível obter resultados relativamente rápidos na realização de

ensaios clínicos e no monitoramento da progressão da doença.

• O estudo epidemiológico dos fatores de risco relacionados a doenças complexas humanas, como

o câncer, pode também ser acessado através do estudo com cães, uma vez que eles

compartilham do mesmo ambiente que seus proprietários e estão expostos a boa parte dos

mesmos carcinógenos (KIMURA et al., 2013; SCHALIE et al., 1999). Também, apresentam os

mesmos fatores de risco do desenvolvimento de neoplasias, por exemplo, as mamárias, que

estão associadas a fatores hormonais, obesidade, dieta, entre outros (LINDBLAD-TOH et al.,

2005).

• Semelhanças entre as características clínicas e bases moleculares análogas às doenças humanas

e caninas, permitem um teste eficaz de novos tratamentos e aprimoramento dos já existentes

para doenças humanas, em cães.

Legenda: com o avanço das pesquisas, muitas vantagens são adicionadas nesta área, aumentando os benefícios gerados na saúde humana através dos resultados obtidos principalmente pela genômica e transcriptômica do câncer.

Assim como em seres humanos, os cães desenvolvem tumores de forma

espontânea e imprevisível, ganhando destaque na oncologia comparada não só

pelas semelhanças anatomofisiológicas com os seres humanos, mas também pelas

altas taxas de incidência de câncer nesta espécie: nos Estados Unidos, são

estimados mais de um milhão de casos de neoplasias em cães de companhia por

ano (PAOLONI; KHANNA, 2008). Dentre os tipos de neoplasia, os tumores

mamários são a segunda maior causa de morte, ficando atrás apenas das

neoplasias de pele. Em 2012, Gupta e colaboradores compilaram diversas

publicações, de 1965 a 2010, em um estudo epidemiológico de neoplasias de mama

44

em cadelas. Os resultados mostram que a taxa de incidência chega a mais de 45%,

e a população canina mais acometida são fêmeas não-castradas de 6 a 14 anos de

idade (Gráfico 3) (GUPTA; SOOD; UPPAL, 2012).

Gráfico 3 - Frequência de neoplasias mamárias em fêmeas e distribuição dos casos por idade

Fonte: Gupta et al. IOSR Journal of Pharmacy, 2012.

Tumores espontâneos em cães e humanos compartilham uma variedade de

recursos, incluindo a aparência histológica, alterações genômicas, alvos

moleculares, comportamento biológico e resposta às terapias convencionais

(PAOLONI; KHANNA, 2008). Histologicamente, alterações de glândula mamária em

cães podem exibir apresentações fortemente heterogêneas, tanto em um único

nódulo, quanto entre nódulos diferentes em um mesmo animal. Não é incomum

encontrarmos um cão com múltiplos nódulos primários, cada um com uma estrutura

histológica distinta (HELLMÉN, 2005). Em 2010, Goldschimidt e seus colaboradores

propuseram uma nova classificação para disfunções de glândula mamária em

cadelas. Neste trabalho, os autores apresentam mais de 40 possíveis classificações

histológicas, variando de uma simples hiperplasia celular, até carcinomas

anaplásicos altamente malignos e invasivos, demonstrando o quão complexo este

tipo de neoplasia é no seu desenvolvimento e progressão (GOLDSCHMIDT et al.,

2011), apresentando uma morfologia complexa na formação de neoplasias epiteliais,

mesenquimais e formações mistas (MISDORP et al., 1999). A distribuição entre

tumores benignos e malignos é muito semelhante, sendo 50% de neoplasias

benignas, com os adenomas complexos, fibroadenomas e tumores mistos benignos,

os mais comuns; e 50% de neoplasias malignas, com os carcinomas mistos,

45

carcinomas complexos e carcinomas anaplásicos no topo da lista dos mais

incidentes (HELLMÉN, 2005). A maioria dos tumores mamários mistos são

caracterizados por uma mistura complexa de células epiteliais e mioepiteliais, com

presença ocasional de metaplasias cartilaginosas, ósseas, ou metaplasias

escamosas, e a análise histológica dessas neoplasias geralmente deve incluir

também um componente de células fusiformes (CASSALI et al., 2007).

Características como tamanho dos nódulos, tipo histológico, graduação

histológica e análise de linfonodos são reconhecidos como fatores prognósticos

confiáveis (MISDORP et al., 1999; KARAYANNOPOULOU et al., 2005). Mas, apesar

das neoplasias mamárias malignas representarem metade dos casos

diagnosticados, poucos marcadores prognósticos a nível molecular foram

caracterizados de forma eficiente e adicionados na rotina clínica e cirúrgica em

medicina veterinária, ao contrário do que acontece na oncologia humana. A

identificação de fatores prognósticos de confiança é essencial, a fim de estimar o

risco individual de uma evolução clínica desfavorável. Na literatura, encontramos um

número crescente de investigações em busca de marcadores adequados para o

câncer de mama canino, incluindo receptores hormonais, marcadores de

proliferação, receptor de fator de crescimento epidérmico humano (HER2), p53,

entre outros (MILL et al., 2003 LEE et al., 2004; ART, 2005). Em um trabalho de

avaliação imunohistoquímica em 102 casos de neoplasias malignas, os autores

encontraram fenótipos moleculares distintos, assim como em humanos. Foi

identificado um subtipo de carcinoma basal-like, que representou cerca de 30% dos

casos, significantemente associado com um comportamento clínico mais agressivo

(GAMA; ALVES; SCHMITT, 2008). No entanto, a experiência clínica ainda é muito

limitada, e resultados fidedignos em estudos prospectivos nem sempre estão

disponíveis.

Como comentado anteriormente, não é só na análise histopatológica que a

oncologia comparada se baseia. Estudos moleculares, principalmente ligados à

genômica, transcriptômica e proteômica, também têm sido de grande valia na

pesquisa básica em câncer de mama entre cães e humanos. Um estudo realizado

por Uva e colegas (2009), fez uma análise comparativa da expressão gênica de vias

moleculares em tecidos saudáveis e neoplásicos, de caninos e humanos, através da

técnica de microarranjo. Os resultados mostram que um número significativo de

46

genes diferencialmente expressos em neoplasias de glândula mamária em

humanos, em comparação com amostras de humanos normais, também foi

encontrado desregulado no modelo canino, incluindo as vias PI3K/AKT, RAS, PTEN,

WNT-β catenina e também a cascata MAPK (UVA et al., 2009). Em outro estudo

com carcinomas caninos, pesquisadores identificaram 21 proteínas expressas de

maneira diferente em neoplasias metastáticas e não-metastáticas. A maioria,

envolvidas em funções celulares relevantes para a propagação metastática como a

adesão celular, a modulação da matriz extracelular e a resistência à hipóxia.

Curiosamente, 19 entre as 21 proteínas já haviam sido descritas anteriormente na

medicina, sendo a expressão associada à malignidade do câncer de mama e outros

tipos de câncer humanos (KLOPFLEISCH et al., 2010).

Mas assim como em roedores, deve-se ter cuidado na interpretação dos

dados obtidos em modelos caninos quando da extrapolação para o que acontece no

câncer humano. Mesmo com diversos estudos mostrando que o cão pode ser útil

para o entendimento de neoplasias humanas, ainda pouco se sabe sobre de que

forma os tumores em cães se desenvolvem, e qual o comportamento das vias

regulatórias que regem a progressão tumoral na espécie. O entendimento das bases

biológicas e moleculares da evolução neoplásica em cães deve ser prioridade antes

da aplicação na medicina comparada e translacional.

2.5.2 Células-tronco cancerosas em neoplasias mamárias em cães

Há um grande interesse dos pesquisadores do isolamento e caracterização

de CSCs em neoplasias espontâneas de cães e gatos, por razões já comentadas

anteriormente. Em cães, são poucos os trabalhos que descrevem informações

referentes às CSCs em tumores mamários, e todos até o momento trabalharam com

cultivos de células. As linhagens celulares sem dúvidas fornecem um recurso valioso

para a investigação das características associadas, mesmo que transitoriamente, à

expressão de fenótipos. No entanto, é importante avaliar esses dados com

parcimônia, a fim de evitar uma interpretação errônea, inferindo uma característica

47

de “células-tronco tumorais” onde razões biológicas mais simples poderiam explicar

as observações.

O primeiro relato de isolamento de MaSC (Mammary Stem Cell, ou Célula-

tronco mamária) e CSCs em tumores de glândula mamária em cão foi realizado por

Cocola et al., que investigou a propagação de ambos os grupos, mamoesferas e

tumoresferas, durante cinco passagens em culturas de baixa aderência. Estas

células exibiram propriedades de auto-renovação, potencial de diferenciação em

múltiplas linhagens, formaram estruturas tubulares in vitro e tumores in vivo em

camundongos não-obesos e imunocomprometidos NOD/SCID (COCOLA et al.,

2009). A partir daí, alguns trabalhos já foram publicados, demonstrando que as

características mais eficientes para a separação de populações enriquecidas com

células que talvez correspondessem às CSCs, assim como em seres humanos,

poderiam estar ligadas principalmente à expressão dos fenótipos CD44, CD24,

CD49f, CD133, p21, CK14 (COCOLA et al., 2009; BLACKING; WATERFALL;

ARGYLE, 2011; MICHISHITA et al., 2011), e também à maior atividade de enzimas

responsáveis pelo metabolismo intracelular. Nesta, os principais métodos de

isolamento incluem a atividade intracelular de aldeído-desidrogenase (ALDH), e o

método Side Population (SP), que consiste na avaliação da célula quanto ao efluxo

de Hoechst 33342, ambos através da separação por citometria de fluxo.

Em cães, a alta expressão de aldeído-desidrogenase foi detectada em quatro

linhagens de carcinomas mamários caninos, e estas células se mostraram

enriquecidas pelo fenótipo CD44+/CD24-, mais uma vez apresentando a capacidade

de auto-renovação e tumorigenicidade em animais imunodeficientes (MICHISHITA et

al., 2012), indicando que a atividade de ALDH pode ser um marcador para CSCs em

neoplasias mamárias caninas. Já a técnica SP tem sido questionada não só devido

à variação nos resultados (SMALLEY; CLARKE, 2005), mas também por talvez

afetar a diferenciação celular (ADAMSKI et al., 2007). No entanto, afirma-se que o

perfil transcricional de células SP positivas em tumores de mama tem um

enriquecimento de expressão em genes da regulação do ciclo celular e pontos de

controle, transportadores MDRs, organogênese e vasculogênese (BEHBOD et al.,

2006), podendo ser uma análise importante no isolamento e caracterização das

populações superiores na cadeia hierárquica dos tumores sólidos.

48

Finalmente, no que diz respeito à investigação do câncer de mama e do papel

das células-tronco mamárias no desenvolvimento de neoplasias, o modelo de tumor

espontâneo canino ainda é um recurso subutilizado. No entanto, vários grupos de

pesquisa já foram capazes de isolar e caracterizar possíveis CSCs com sucesso

nesta espécie, usando protocolos semelhantes àqueles utilizados nos modelos

humanos e de roedores, indicando o potencial promissor dessas células na pesquisa

básica, bem como pesquisa oncológica translacional.

49

3 OBJETIVO GERAL

Caracterização de cultivos de células neoplásicas oriundas de carcinomas mamários

de cadelas e avaliação do potencial tumorigênico de populações celulares

selecionadas pelos marcadores ALDH, CD44 e CD24.

50

4 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Padronização e caracterização do cultivo de células neoplásicas de

carcinomas mamários de cadelas quanto à morfologia, proliferação celular,

citogenética e expressão de marcadores de células epiteliais e

mesenquimais;

Avaliação e quantificação da presença de populações CD24-, CD44+ e ALDHhi

em culturas primárias de células neoplásicas oriundas de carcinomas

mamários de cadelas;

Validação do potencial tumorigênico das populações acima descritas em

ensaios in vitro.

51

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1 MATERIAL UTILIZADO NO ESTUDO

Todas as amostras de tecidos neoplásicos foram coletadas a partir de

mastectomias unilaterais ou bilaterais realizadas no Hospital Veterinário da

Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos/USP, bem como em clínicas

veterinárias particulares localizadas em São Paulo/SP, Pirassununga/SP e região,

que concordaram em colaborar com o presente projeto (Quadro 6). Ao todo, foram

coletadas amostras de tecido de trinta e cinco (35) cães, todas avaliadas e

classificadas pela análise histopatológica. Aquelas que tinham origem em glândula

mamária foram categorizadas seguindo a classificação de Goldschmidt

(GOLDSCHMIDT et al., 2011).

Quadro 6 - Clínicas parceiras que contribuíram com amostras para o presente estudo

CLÍNICA

MÉDICO VETERINÁRIO

CIDADE

Cia do bicho Alessandra Pirassununga/SP

CEPAC é o bicho Marcus Vazan Pirassununga/SP

Pet’s Stop Mariney Pirassununga/SP

- Juliana Casals Pirassununga/SP

Clínica Santa Rita Milena Adami Leme/SP

Hamvet Sílvio Ramos e Tânia Ávila Leme/SP

- Beatriz Martins São João da Boa Vista/SP

PetVip Bruno Monteiro São João da Boa Vista/SP

Animal Planet Paulo Côrte Neto Araras/SP

Central Nilson J. Bianchim Araras/SP

LinVet Valmir B. do Nascimento Araras/SP

- Mariana V. dos Santos Osasco/SP

- João Paulo Boccia São Paulo/SP

52

Logo após a excisão cirúrgica de cada amostra, foram removidas todas as áreas

de tecido adiposo, e possíveis áreas de necrose. O restante do material foi então

dividido em três fragmentos: o primeiro, colocado em formol tamponado a 10% para

avaliação histopatológica; o segundo, transportado em solução de RNA-later e

posteriormente conservado à temperatura de -80°C; e por fim, do terceiro fragmento

foi retirada toda a pele e tecido subcutâneo adjacente, sendo então lavado em PBS

a 5% de antibiótico e antimicótico (PenStep, Gibco®) e colocado em meio de

transporte estéril, composto por meio de cultivo DMEM-F12 (Life Technologies®) a

5% de antibiótico, à 4°C, até a chegada ao laboratório.

5.2 CULTIVO PRIMÁRIO DE CÉLULAS ORIUNDAS DE NEOPLASIAS MAMÁRIAS

O material coletado para o estabelecimento do cultivo primário foi picado

manualmente com o uso de tesoura, pinça e lâminas estéreis, em fragmentos de 1 a

2 mm3. Posteriormente, foram dissociados enzimaticamente em rotação constante

de 100 rpm por duas horas a 37°C, em meio DMEM-F12 suplementado com 200

U/mL de Colagenase tipo I (Sigma Aldrich®), 100 U/ml de Hialuronidase (Sigma

Aldrich®) e 2% de antibiótico, até que houvesse dissociação do tecido tumoral.

Depois, adicionou-se 1 mL de tripsina/EDTA, e o tubo foi levado ao shaker por mais

uma hora. O material foi passado primeiramente em um cell Strainer de 100 µm, e

logo depois filtrado em 40 µm a fim de remover grumos de células. O meio foi então

centrifugado a 350G durante 5 minutos, o sobrenadante descartado, e o pellet

ressuspendido em PBS previamente aquecido em banho-maria a 37ºC. As células

foram lavadas em PBS até que o pellet se apresentasse limpo, sendo ressuspendido

finalmente em meio de cultivo suplementado.

Após a etapa de dissociação do tecido neoplásico, as células foram avaliadas

quanto à viabilidade celular pelo método de exclusão por azul de Trypan, onde 10 μL

de meio contendo células foram adicionados a 10μL de azul de Trypan, e contados

em câmara de Neubauer. O meio contendo as células dissociadas foi levado ao

cultivo celular em garrafas estéreis de 25cm3 a 37ºC e saturação de 5% de CO₂, em

meio de cultivo DMEM-F12 suplementado com 1% de Mammary Epithelial Growth

53

Supplement (MEGS, Gibco®, Life Technologies), 5% de Soro Fetal Bovino e

adicionado de 1% de antibiótico/antimicótico.

A evolução foi acompanhada diariamente através de microscopia óptica.

Foram adicionados 2 mL de meio de cultivo novo em cada garrafa, a cada 48 horas,

para manutenção da cultura. Quando atingiam 70% de confluência, todas as

garrafas foram submetidas à atividade de Tripsina/EDTA diluída para 0,25%

(Gibco®, Life Technologies), e então subdivididas em novas garrafas estéreis para

multiplicação das colônias celulares. Brevemente, após o descarte do meio de

cultura adicionou-se 5 mL de PBS à 37ºC em cada garrafa, para remoção de debris

celulares e demais contaminantes que pudessem estar presentes à cultura. O PBS

foi prontamente descartado para a adição de 2 mL de solução Tripsina/EDTA 0,25%.

O material permaneceu em estufa à 37ºC até que todas as células fossem soltas das

garrafas, e formassem uma suspensão celular. Para inativação da enzima, usou-se

10 mL de meio de cultivo a 10% de Soro Fetal Bovino. A suspensão foi centrifugada

a 1200 rpm por cinco minutos, o sobrenadante descartado, e o pellet ressuspendido

em DMEM-F12 completo. O volume foi divido igualmente, e completado para 10 mL

por garrafa de 75cm3.

4.3 TEMPO DE DUPLICAÇÃO CELULAR

Para avaliação da velocidade de duplicação celular de cada amostra, foram

cultivadas 5 x 104 células por poço, em placa de 6 poços, com meio de cultivo

suplementado conforme descrito anteriormente. O número de células foi contado em

câmara de Neubauer em intervalos de 24 horas, por um período total de 120 horas.

Todas as amostras foram contadas no mesmo horário, e da mesma forma durante

todo o experimento. Os resultados foram avaliados através do programa Doubling-

Time (disponível em (14/01/2015): http://doubling-time.com/compute.php). O tempo

de duplicação foi realizado em dois momentos: o primeiro, antes da 10ª passagem, e

o segundo, quando todos os cultivos ultrapassaram a 20ª passagem.

http://doubling-time.com/compute.php

54

5.4. AVALIAÇÃO CITOGENÉTICA POR CARIOTIPAGEM

A contagem do número de cromossomos foi realizada pelo método de

coloração de Giemsa. Brevemente, as células foram cultivadas em placas de Petri

durante o tempo necessário para alcançarem a fase M do ciclo celular, com base

nos resultados obtidos pelo tempo de duplicação. Decorrido o tempo da cultura

celular, adicionou-se 50 μL de solução de Colchicina (16mg/mL) para suspensão do

ciclo celular em metáfase, e a placa incubada em estufa a 37ºC durante 3 horas. O

meio de cultivo então foi coletado em um tubo Falcon de 15mL, e as células

aderidas passaram pelo processo de tripsinização para retirada do material de

cultivo, sendo colocadas juntamente com o meio armazenado na etapa anterior. O

tubo foi centrifugado a 1200 rpm durante 10 minutos, o sobrenadante descartado

cuidadosamente com uma pipeta, e o pellet ressuspendido em 5 mL de solução

hipotônica (KCl 0,075M) a 37ºC. O material foi incubado por 30 minutos a 37ºC,

sendo homogeneizado suavemente com uma pipeta em intervalos de 5 minutos.

Logo depois, adicionou-se 2 mL de fixador gelado (metanol/ácido acético 3:1) e a

solução homogeneizada novamente durante 1 minuto. O tubo foi levado a

centrifugação em 1200 rpm por 10 minutos, o sobrenadante descartado

cuidadosamente com uma pipeta, e o pellet ressuspendido em 0,5-1 mL de fixador

gelado, acertando a diluição dependendo do volume de células.

As lâminas foram lavadas e secas com papel macio para receber a

preparação, e permaneceram durante 24 horas imersas em etanol 70%, a -20ºC.

Para a confecção das lâminas, foram retiradas do etanol e secas novamente com

papel limpo e macio. Então, duas a quatro gotas da suspensão de células foram

dispensadas da pipeta a uma altura superior a 30 cm, para possibilitar o rompimento

das células e permitir o espalhamento dos cromossomos. As lâminas foram secas ao

ar, e então coradas com solução de Giemsa durante 10 minutos, em temperatura

ambiente. Depois deste processo, foram lavadas com água destilada, secas ao ar, e

montadas com lamínulas limpas e secas. Os cromossomos foram fotografados em

microscópio óptico, em imersão, no aumento de 1000x. Foram contadas vinte

metáfases por amostra.

55

5.5. IMUNOCITOQUÍMICA

As quatro amostras selecionadas para caracterização do cultivo primário

foram submetidas à técnica imunocitoquímica para avaliação da expressão dos

filamentos intermediários de citoesqueleto: citoqueratina, vimentina e α-actina de

músculo liso (detalhes descritos no quadro 7). Cerca de 105 células foram cultivadas

em lamínulas esterilizadas, em placas de 6 poços, até atingirem confluência

suficiente para a realização do experimento. Os poços foram lavados por três vezes,

com PBS, para então serem fixados através da adição de 2 mL de metanol absoluto

em cada poço, durante 10 minutos, em temperatura ambiente. As células foram

lavadas por mais duas vezes e armazenadas em PBS a 4ºC até o momento do

teste.

Quadro 7 - Anticorpos utilizados para avaliação imunocitoquímica

Anticorpo Diluição Incubação Clone Marca

Anti-citoqueratina 1:100 1 h A1/A3 Dako, Carpinteria, CA Anti-vimentina 1:100 1 h V9 Dako, Carpinteria, CA

Anti-α-sma 1:100 1 h HHF35 Dako, Carpinteria, CA

Para a marcação imunocitoquímica, as lamínulas foram lavadas previamente

por duas vezes de cinco minutos com PBS/Triton x100, para uma melhor distribuição

dos reagentes. Então, foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena, através da

incubação com solução de peróxido de hidrogênio a 20% diluída em metanol

absoluto durante uma hora. As lamínulas foram lavadas com PBS/Triton por mais

três vezes de cinco minutos, e adicionadas de solução de leite em pó desnatado a

5%, e incubadas em estufa aquecida a 60ºC, durante uma hora, para bloqueio de

possíveis marcações inespecíficas. O anticorpo primário foi diluído em PBS/Triton

adicionado de BSA a 0,1% para todas as marcações realizadas, sendo preparados

50 μL de solução para cada lamínula cultivada. As células foram incubadas com o

anticorpo primário durante 1 hora em temperatura ambiente e então lavadas por

56

mais três vezes com PBS/Triton. Depois, utilizou-se o kit LSAB+ System-HRP (Dako,

Carpinteria, CA), sendo que o anticorpo secundário foi incubado durante 20 minutos

em temperatura ambiente, e a Streptavidina incubada por mais 20 minutos, também

em temperatura ambiente.

A marcação foi visualizada através da revelação por DAB, as lamínulas

posteriormente contracoradas com hematoxilina e montadas em lâminas para serem

observadas e fotografadas em microscópio óptico.

5.6 SEPARAÇÃO DE POPULAÇÕES CELULARES POR BEADS MAGNÉTICAS

ATRAVÉS DO PERFIL DE EXPRESSÃO DE CD24/CD44

Depois de estabilizado o cultivo celular em monocamada, ou seja, com todas

as colônias de células em condições de aderência e em proliferação, as amostras

oriundas da dissociação tumoral da glândula mamária foram submetidas à

tripsinização semelhante ao procedimento adotado para o repique convencional.

Após a centrifugação realizada posterior à inativação enzimática da Tripsina, a

suspensão celular foi avaliada quanto à viabilidade, e o número de células ajustado

para uma concentração aproximada de 2x106 células. O método escolhido para

separação das populações positivas e negativas quanto à expressão destas

proteínas foi a marcação com anticorpos biotinilados específicos para CD24 e CD44,

conjugação com as beads magnéticas (CELLection Kit, Life Technologies®) e

posterior isolamento da população positiva através do auxílio de atração magnética

promovida por um imã, conforme protocolo descrito a seguir.

Antes da realização do procedimento, se fez necessário a lavagem e

purificação das beads magnéticas antes de serem conjugadas com o anticorpo

desejado. Sendo assim, 25 μL da solução de beads foram adicionados a 1 mL de

PBS a 0,1% de Soro Fetal Bovino (consistindo do Buffer 1, CELLection Kit), e o tubo

colocado no imã durante 1 minuto. O sobrenadante foi descartado, e as beads então

estariam prontas para a realização das técnicas de separação. Tanto a técnica de

forma direta quanto a de forma indireta foram testadas para marcação de CD44:

57

● Técnica direta: em tubo estéril, 1 μg de anticorpo específico para CD44 (BD

PharmygenTM, biotin rat anti-mouse CD44) e CD24 (BD PharmygenTM, biotin rat anti-

mouse CD24) foi conjugado às beads magnéticas em temperatura ambiente durante

30 minutos. Após este período, o tubo foi colocado no imã por 1 minuto, o

sobrenadante descartado, e este procedimento repetido por mais três vezes para

remoção de anticorpos que porventura não foram conjugados. Então, as beads

ligadas ao respectivo anticorpo foram adicionadas à amostra de células em

suspensão, na concentração desejada. O material foi incubado em temperatura de

4ºC por 20 minutos, quando então foi recolocado no imã para separação da

população positiva, que no caso, ficariam aderidas na parede do tubo por força da

atração magnética promovida pelo imã. O conjunto beads/anticorpo/células foi

ressuspendido em Buffer 1 e recolocado no imã por mais duas vezes, sendo que o

sobrenadante de todas as lavagens foi retirado e colocado em tubo estéril para

verificação de células não-marcadas. Para interrupção da ligação entre as beads

magnéticas e as células, utilizou-se 4 μL de Release Buffer (solução de DNAse I) por

um período de 15 minutos em incubação e agitação leve à temperatura ambiente.

Após a liberação das células das beads magnéticas, a população marcada para

CD44 foi avaliada pelo método de exclusão de azul de Trypan e posteriormente

levada ao cultivo celular.

5.7 SEPARAÇÃO DE POPULAÇÕES POSITIVAS PARA A ATIVIDADE DE

ALDEÍDO-DESIDROGENASE (ALDH) ATRAVÉS DE CITOMETRIA DE FLUXO

A atividade celular de aldeído-desidrogenase (ALDH) foi analisada com o

auxílio do kit Aldefluor® (StemCell Technologies, EUA) conforme instruções do

fabricante. Foram preparados dois tubos para cada amostra, sendo um tubo teste e

um tubo controle. Brevemente, 106 células/mL foram ressuspendidas em 1,5 mL de

tampão e dispensadas em um tubo estéril, para então serem adicionadas de 5

µL/mL de reagente ativado Aldefluor®. Rapidamente, 500 µL desta suspensão foram

transferidas a outro tubo (controle da reação) contendo 5 µL de DEAB (inibidor da

reação entre a enzima e o reagente). As amostras foram incubadas por 40 minutos a

58

37°C, e então centrifugadas a 4°C a uma velocidade de 1000 rpm durante 5 minutos.

O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspendido em 0,5 mL do tampão

específico do kit. Os tubos foram mantidos no gelo até a análise. Para exclusão de

células mortas utilizou-se Hoechst (Hoechst 33342, Life Technologies ®, USA) cinco

minutos antes da análise.

5.8 CULTIVO CELULAR PARA FORMAÇÃO DE TUMORESFERAS

A capacidade de formação de colônias em condições de baixa aderência das

células avaliadas quanto ao fenótipo CD24, CD44 e atividade de ALDH foi realizada

através da cultura em condições de baixa aderência, com meio de cultivo livre de

soro fetal bovino suplementado para permitir a multiplicação celular, método este já

bem definido quanto à caracterização de Células Iniciadoras de Tumor e o potencial

de auto-renovação e formação de esferas que apresentam.

Para tal, o número de células em cada população foi ajustado para uma

concentração aproximada de 750 células/mL, no volume de 0,5 mL/poço a fim de

evitar a adesão das células e possível diferenciação celular. As amostras foram

plaqueadas em placas de baixa aderência (24-well low-adherent plates, Corning®,

USA) em meio DMEM-F12 suplementado com 20 ng/mL de EGF (PrepoTech, USA),

10 ng/mL de FGF (PrepoTech, USA), 5 μL/mL de insulina bovina (Sigma Aldrich®,

MO, USA) e 1% de antibiótico/antimicótico (PenStep, Gibco, Life Technologies®,

USA). Para manutenção do cultivo celular, 50 µL/poço de meio fresco foi adicionado

a cada 48 horas, e diariamente a placa era avaliada através de microscopia óptica. A

cultura foi analisada por 14 dias consecutivos.

59

5.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

A análise estatística utilizada para avaliação de significância na validação do

ensaio de tumorigênese in vitro para os grupos ALDHlow e ALDHhi, foi a análise de

variância (ANOVA) em uma via para verificação das diferenças amostrais entre os

fenótipos, seguida do pos-hoc Bonferroni. Para análise estatística quanto ao número

de esferas formadas a partir da separação dos fenótipos CD24 e CD44, foi adotado

o teste t de Student. As análises foram geradas pelo programa GraphPad Prism®

5.0, San Diego, CA, USA).

60

6 RESULTADOS

6.1 DISTRIBUIÇÃO DOS CASOS CLÍNICOS

Ao todo, trinta e cinco animais contribuíram neste trabalho. Todas as lesões

foram coletadas por excisão cirúrgica através de mastectomia eletiva, e todas foram

submetidas à avaliação anatomopatológica para definição do tecido de origem. Vinte

e nove animais (82,9%) foram considerados no presente estudo, pois apresentavam

lesão neoplásica em glândula mamária; outros dois (5,7%) foram diagnosticados

com cistos de queratina ou lesões papilomatosas, e em quatro (11,4%), o material

era insuficiente para estabelecer o diagnóstico, devido à qualidade e integridade do

tecido fixado (Gráfico 4). Portanto, estes seis animais foram excluídos das demais

análises.

Gráfico 4 - Distribuição dos casos nos trinta e cinco cães coletados no estudo, baseado no tecido de origem e número de lesões por animal

Legenda: à esquerda, distribuição dos casos segundo origem da lesão, nos trinta e cinco animais submetidos à mastectomia eletiva. À direita, número de lesões distribuídas nos vinte e nove animais com alteração em glândula mamária

A maioria dos casos (19/29) apresentava múltiplas lesões, enquanto que dez

casos tinham um único nódulo (34,5%) (Gráfico 4). Quanto à idade dos animais no

momento da cirurgia, onze (37,9%) tinham de 6 a 10 anos de idade, doze (41,4%)

61

apresentavam-se entre 11 a 15 anos de idade, três (10,3%) tinham mais de 16 anos

e em três casos (10,3%), o proprietário ou veterinário não sabiam informar a idade

do paciente (Gráfico 5). Das vinte e nove fêmeas diagnosticadas com neoplasia

mamária, um animal era da raça Daschund (3,4%), um Collie (3,4%), um Yorkshire

Terrier (3,4%), um American Pitbull Terrier (3,4%), um Cocker Spaniel Inglês (3,4%),

dois Beagles (6,9%), três Pinscher miniatura (10,3%) e sete Poodles (24,1%), sendo

que os dois Beagles apresentavam grau de parentesco: mãe e filha. Porém, a maior

parcela foi representada pelos animais sem raça definida, em número de doze,

somando 41,4% do total (Gráfico 5). Em alguns casos, as múltiplas nodulações

exibiam apresentações histopatológicas distintas. A distribuição das trinta e cinco

lesões de acordo com a classificação histopatológica está descrita na tabela 1.

Gráfico 5 - Distribuição dos casos quanto à idade (anos) e raça

Tabela 1 – Distribuição das lesões segundo classificação histopatológica

(Continua)

Nº de lesões %

Carcinoma Complexo 8 22,9

Carcinoma Misto 5 14,3

Carcinoma Sólido 4 11,4

Tumor Misto Benigno 3 8,6

Comedocarcinoma 2 5,7

Hiperplasia Lobular 2 5,7 Carcinoma de Células Escamosas Neoplasia de Células Fusiformes

2 1

5,7 2,9

Carcinoma Tubulopapilífero 1 2,9

Carcinoma Anaplásico 1 2,9

62

(Conclusão)

Carcinoma adenoescamoso 1 2,9

Fibrossarcoma 1 2,9

Adenoma Basalóide 1 2,9

Carcinoma Tubular 1 2,9

Adenoma Tubular Simples 1 2,9

Carcinoma Ductal 1 2,9

Total 35 100%

Apenas uma das vinte e nove fêmeas era castrada antes do desenvolvimento

tumoral, porém, foi castrada aos nove anos de idade por conta de piometra. Nenhum

animal recebeu tratamento hormonal exógeno para controle do ciclo estral, ou

apresentou outro tipo de neoplasia anterior ao tumor mamário. Com exceção da

Beagle citada anteriormente, cuja mãe também apresentava câncer em glândula

mamária, não eram conhecidos os ascendentes das demais fêmeas. Não houve

informações suficientes sobre número de acasalamentos, número de gestações ou

abortos para a compilação dos dados, provavelmente dado ao desconhecimento

pelo proprietário ou clínico veterinário.

6.2. CARACTERIZAÇÃO DOS CULTIVOS CELULARES

6.2.1. Dissociação e cultivo primário em monocamada

Das trinta e cinco amostras de glândula mamária, vinte e seis foram

encaminhadas para o cultivo primário, de acordo com o descrito em material e

métodos. Foi definido um protocolo padrão para a dissociação e para o cultivo

primário das células obtidas a partir da excisão cirúrgica de neoplasias da glândula

mamária em cães. Após a dissociação e incubação, dezesseis apresentaram

quantidade considerável de células grandes, bem delimitadas, que em cerca de uma

semana já estavam completamente aderidas, formando grandes populações

63

celulares ao longo de toda a extensão da garrafa. Em todas as garrafas cultivadas,

as amostras apresentaram células bem conservadas e vivas, visualizadas através

de diluição em Azul de Trypan. Também, notou-se a presença de dois grupos

distintos de células aderidos à garrafa, que variavam em morfologia. O primeiro, com

características morfológicas de células mesenquimais, em formato fusiforme, núcleo

e nucléolos bem definidos. Algumas se apresentaram binucleadas ou

multinucleadas; já o segundo grupo, apresentava morfologia de células ovaladas ou

triangulares, com citoplasma extenso, muitas apresentando dois ou mais núcleos

(também bem definidos), dispostas em monocamada pavimentosa de formato

poligonal (Figura 8). Este protocolo permitiu o sucesso no cultivo de dezesseis das

vinte e seis amostras colocadas em cultivo, possibilitando a escolha de quatro

culturas para a caracterização quanto à origem tumoral das células que proliferaram

in vitro (Tabela 2).

64

Figura 8 - Células provenientes da dissociação de neoplasias mamárias de cadelas, em condições de aderência

Legenda: células com aproximadamente dez dias de cultivo sob condições controladas, antes da primeira passagem. Observam-se populações distintas tanto no aspecto morfológico individual quanto na disposição das colônias quando em confluência. Aumento de 200x.

Tabela 2 - Culturas primárias de neoplasias de glândula mamária em cães, selecionadas para caracterização celular

ANIMAL

RAÇA

IDADE

DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO

005/13

Branca

SRD

13 anos

Comedocarcinoma

020/14 Cacau Daschund 9 anos Carcinoma Misto

025/14 Lessie Collie 13 anos Carcinoma Misto

028/14 Laica Beagle 13 anos Carcinoma Misto

65

As quatro amostras foram selecionadas para caracterização quanto a: morfologia

celular do cultivo em monocamada; expressão imunocitoquímica de citoqueratina,

vimentina e alfa-actina muscular; avaliação citogenética por cariotipagem; avaliação

do tempo de duplicação celular; quantificação das populações positivas e negativas

quanto ao fenótipo CD24/CD44; e avaliação das populações quanto à expressão de

aldeído-desidrogenase.

6.2.2. Classificação histopatológica e morfologia da cultura primária

O material fixado em formol foi processado para obtenção de lâminas

histológicas, e estas coradas com hematoxilina e eosina (HE) para avaliação e

classificação histopatológica das lesões que foram encaminhadas ao cultivo de

células. Do mesmo modo, as culturas primárias foram cultivadas em lamínulas,

fixadas e coradas em HE para caracterização quanto à morfologia celular.

Amostra 005/13: Macroscopicamente, anterior à mastectomia, a lesão se

apresentava de forma inflamatória, parcialmente ulcerada, com eritema, perda de

pelos e pústulas na região abdominal. A formação neoplásica era extensa no

comprimento longitudinal, chegando a 10 cm de extensão. Histologicamente, foi

diagnosticada como comedocarcinoma, com a lâmina histológica caracterizada pela

presença de áreas necróticas em meio a agregados celulares neoplásicos em

consequência de células apoptóticas e cariorréxis subsequente. Nas áreas de

necrose, presença de grande quantidade de material eosinofílico, amorfo,

entremeado com debris celulares, neutrófilos e alguns macrófagos. O tecido

adjacente aos focos de necrose consiste em agregados celulares organizados de

maneira sólida, tubulares e em cordões, apoiados por estroma fibrovascular (Figura

9). Na cultura primária, as células aderidas em monocamada se apresentaram em

formato alongado, com tamanho variado apesar de ter em sua maioria células

pequenas, e algumas células binucleadas. Em relação ao núcleo, formato oval,

presença de anisocariose, nucléolos evidentes e múltiplos em muitas células, alguns

em formato angular. Quando em grande confluência, as células tendem a formar

redes, deixando áreas livres entre os grupos celulares. No início, era comum o

66

crescimento de agregados de células em formato esferoide, característica que

diminuiu com o aumento das passagens (Figura 10). Não houve alteração

perceptível de morfologia celular em nenhum momento da cultura.

Figura 9 - Lâmina histológica da amostra 005/13

Fonte: LOCT/USP Legenda: presença de áreas necróticas em meio a agregados celulares neoplásicos. O tecido adjacente aos focos de necrose mostra agregados celulares organizados de maneira sólida, tubulares e em cordões, apoiados por estroma fibrovascular. Aumento 40x.

67

Figura 10 - Morfologia do cultivo celular, amostra 005/13

Fonte: LOCT/USP Legenda: (A) organização do crescimento celular quando em confluência superior a 60%. Hematoxilina/eosina. Aumento 100x. (B) morfologia das células aderidas em cultivo, exibindo anisocariose, nucléolos únicos ou múltiplos, às vezes angulares. Hematoxilina/eosina. Aumento 400x. (C, D) crescimento celular em formato esferoide, em garrafas de cultura (C) e lamínula (D). Hematoxilina/eosina (D). Aumento 200x (C) e 400x (D).

Amostra 020/14: Antes da ressecção, a neoplasia se apresentava de

maneira sólida, medindo cerca de 9 cm de diâmetro, bastante calcificada no interior

do nódulo. Histologicamente, a amostra era composta por massa neoplásica mista,

apresentando componente epitelial de arranjo tubular predominante, com uma a três

camadas de células em seu revestimento, cúbicas, mostrando núcleos com discreta

a moderada anisocariose, nucléolo único e evidente, mas sem hipercromasia e as

figuras de mitose são raras. Apesar disso, havia focos onde as células ultrapassam

os limites glandulares, invadindo o estroma adjacente. Inseridas da matriz mixoide,

encontram-se células alongadas, com núcleos ovais ou alongados, sendo esta

68

abundante em algumas regiões. Também foram visualizados focos de tecido

cartilaginoso, caracterizando um carcinoma misto (Figura 11). No cultivo, desde a

primeira passagem as células apresentavam morfologia epitelial, formando um

tapete de células cuboides, muitas delas multinucleadas, com nucléolos evidentes e

cromatina pontilhada. Entremeadas, encontram-se células grandes, com citoplasma

amplo, apresentando cinco ou mais núcleos e/ou núcleos aberrantes, nucléolos bem

definidos, múltiplos e por vezes angulares. Algumas células apresentam vacúolos

numerosos. A morfologia da amostra 020/14 apresentou pouca variação durante o

tempo de cultivo, estabilizando após a 20ª passagem (Figura 12).


Fonte: LOCT/USP Legenda: tecido de arranjo tubular predominante, com uma a três camadas de células em seu revestimento, em meio ao estroma composto por células alongadas e matriz mixoide. Aumento 40x;

69

Figura 12 – Morfologia do cultivo primário, amostra 020/14

Fonte: LOCT/USP Legenda: células apresentando morfologia epitelial, exibindo células grandes, com citoplasma amplo, apresentando cinco ou mais núcleos e/ou núcleos aberrantes, nucléolos bem definidos, múltiplos e por vezes angulares. (A) distribuição em monocamada. Aumento 40x. (B, C, D) Células gigantes, com um ou mais núcleos. Aumento 100x (B). Aumento 400x (C); Aumento 1000x (D).

Amostra 025/14: o animal foi encaminhado à mastectomia apresentando

vários nódulos em região mamária, todos de consistência firme, variando entre 0,5 a

3 cm de diâmetro. Dos oito nódulos encaminhados para histologia, cinco

apresentavam características histopatológicas distintas, sendo duas malignas e três

benignas. O maior nódulo foi levado ao cultivo de células, e tratava-se de um

carcinoma misto. A lâmina histológica exibiu amostra composta por massa

neoplásica mista, sendo o componente epitelial o tipo predominante com múltiplas

camadas de células em seu revestimento. Há focos onde as células ultrapassam os

limites glandulares, invadindo o estroma adjacente. Entremeadas, encontram-se

70

células alongadas, com núcleos ovais ou alongados, em meio a matriz mixoide.

Também são visualizados focos de tecido cartilaginoso (Figura 13). Em cultivo, a

amostra 025/14 apresentou células alongadas, crescendo de maneira

desorganizada e tendendo a formar redes e grupos densos de células quando em

alta confluência, indicando perda de inibição por contato. Comum a presença de

células bi e multinucleadas, com núcleos redondos ou ovais e cromatina pontilhada.

A morfologia também se manteve durante todo o cultivo, mesmo após a 35ª

passagem (Figura 14).


Fonte: LOCT/USP Legenda: carcinoma misto, exibindo amostra composta por massa neoplásica mista, sendo o componente epitelial o tipo predominante. Aumento 40x.

71


Fonte: LOCT/USP Legenda: (A, B) organização do crescimento celular quando em confluência superior a 60%. Hematoxilina/eosina. Aumento 100x. (C) Presença de célula binucleada, nucléolo único, evidente e com formato angular. Hematoxilina/eosina. Aumento 400x (D) Célula multinucleada, mitose irregular com consequente deformação nuclear. Hematoxilina/eosina. Aumento 400x.

Amostra 028/14: macroscopicamente, a lesão era de consistência firme, com

cerca de 5 cm de diâmetro. Diagnosticado como carcinoma misto, histologicamente

composto por amostra de tecido mamário contendo proliferação mista de células

epiteliais cúbicas distribuídas em túbulos e população de células fusiformes em meio

a matriz mixóide. Também estão presentes focos de tecido cartilaginoso. As células

epiteliais se distribuem predominantemente em túbulos, mas perdem esta definição

em pelo menos um terço do corte histológico, em que são encontradas de forma

isolada ou em cordões em meio ao estroma. Há moderada anisocariose, os núcleos

72

contém cromatina pontilhada e com nucléolo evidente na maioria das células. Há

figuras de mitose típicas em pequeno número (Figura 15). Na cultura primária, a

amostra 028/14 foi a que mais apresentou mudança no fenótipo com o aumento das

passagens. Inicialmente, a monocamada era composta por células de formato mais

alongado, com citoplasma amplo, um ou dois núcleos com nucléolo evidente,

geralmente único, redondo ou angular. Entre a 15ª e 16ª passagens, o cultivo in vitro

apresentou ilhas de células epiteliais pequenas e cúbicas cercadas por células de

aspecto mesenquimal simulando estroma tecidual, formando populações bem

definidas nas garrafas de cultura. Porém, devido a proliferação mais rápida das

células com morfologia epitelial, nas passagens seguintes elas acabaram por

dominar o cultivo primário, e a cultura estabilizou a partir da 18ª passagem. As

células se apresentam com relação núcleo/citoplasma diminuída, muitas células

multinucleadas, grande vacuolização do citoplasma, e perda evidente da inibição do

crescimento por contato, sendo possível a visualização de células sobrepostas. Os

núcleos são grandes, com nucléolos aumentados, múltiplos, muitas vezes

angulares, cromatina densa e irregular. Mitoses aberrantes também são comuns

(Figura 16).

73

Figura 15 - Lâmina histológica, amostra 028/14

Fonte: LOCT/USP Legenda: tecido neoplásico apresentando foco de tecido cartilaginoso, formações tubulares e cordões de células epiteliais em meio à matriz mixoide e células estromais. Formações tubulares com perda de definição pela proliferação exacerbada. Aumento 40x.

74


Fonte: LOCT/USP Legenda: (A) organização do crescimento celular quando em confluência superior a 90%. Nota-se agregados celulares, de células que perderam inibição por contato e cresceram em camadas. Hematoxilina/eosina. Aumento 100x. (B) Células multinucleadas, nucléolos grandes e desuniformes, células em divisão; perda da relação núcleo/citoplasma. Hematoxilina/eosina. Aumento 400x (C) Célula em mitose, cromatina desorganizada. Hematoxilina/eosina. Aumento 1000x (D) Células multinucleadas, mitose irregular com consequente deformação nuclear. Hematoxilina/eosina. Aumento 1000x.

6.2.3 Tempo de duplicação celular

As culturas foram avaliadas quanto à velocidade de proliferação celular em

dois momentos, respeitando um intervalo de no mínimo dez passagens entre os

testes. No geral, todas exibiram um tempo de duplicação superior a 20 e inferior a 48

horas. As amostras 020/14 e 028/14 não diferiram de maneira notável entre as

avaliações, exibindo uma variação de aproximadamente 2,5 horas, enquanto que, na

amostra 025/14, houve um aumento considerável de cerca de 15 horas no tempo de

75

duplicação, levando a um ciclo celular de 43,8 horas. Ao contrário, na amostra

005/13 houve uma diminuição no tempo de duplicação, ou seja, as células

apresentaram um ciclo celular mais curto e maior velocidade de proliferação (Tabela

3).

Tabela 3 - Tempo de duplicação celular das quatro amostras cultivadas.

Amostra Passagem Tempo (h) Variação (h)

005/13 8

18

32,76

26,04

- 6,72

020/14 18

38

25,35

22,65

- 2,7

025/14 23

33

28,39

43,8

+ 15,41

028/14 8

20

24,75

21,93

- 2,82

Legenda: as contagens foram realizadas em câmara de Neubauer, em intervalos regulares de 24 horas, em um total de 120 horas.

6.2.4. Cariotipagem

A avaliação do número de cromossomos de cada cultivo foi realizado em apenas

um momento da cultura primária, correspondendo às passagens de número 10, 35,

10 e 26 para as amostras 005/13, 020/14, 025/14 e 028/14, respectivamente. A

análise citogenética revelou aneuploidia em cerca de 50% das células cancerosas

de cada animal utilizado no estudo. Os resultados demonstraram uma variação

ampla no número de cromossomos em um mesmo grupo de células, quando

comparado ao número encontrado em células normais (2n = 78) (Gráfico 6). A

amostra 005/13 foi a que menos variou em relação ao normal, sendo que 30% das

76

metáfases apresentaram alteração numérica, e assim como a 025/14, a maioria das

células demonstrou o valor diploide habitual para a espécie canina (Figura 17). Já

na amostra 020/14, não foi possível a visualização de células apresentando 2n=78.

Das vinte metáfases avaliadas, 90% delas apresentaram ganho cromossômico, e a

maioria (45%) exibiu um número de 90 cromossomos. A amostra 028/14 foi a que

apresentou a maior discrepância em relação à quantidade normal de cromossomos,

apesar da baixa variação da ploidia entre as células, sendo que 80% das metáfases

exibiram um valor de 56 ou 58 cromossomos.

Gráfico 6 - Análise do número de cromossomos em vinte metáfases por cultura celular

Legenda: distribuição do número de cromossomos avaliados em vinte metáfases por amostra. Estão representadas todas as metáfases, comparadas com o número diploide 2n=78 para a espécie canina. Nota-se que todas as amostras apresentaram variação no número de cromossomos, com células hipodiploides e hiperdiploides.

Apesar da técnica de coloração utilizada não possibilitar a análise de alterações

estruturais, alguns achados citogenéticos puderam ser visualizados. Por exemplo,

uma célula presente na amostra 025/14 que, além da aneuploidia pelos 74

cromossomos, apresentou monossomia do cromossomo X (Figura 19). Também,

observou-se mitoses aberrantes características de células neoplásicas,

principalmente de células malignas. Na amostra 005/13, pudemos verificar a

77

presença de uma metáfase com mais de 150 cromossomos em uma mesma célula,

apesar de não ter sido possível a contagem exata do número devido à sobreposição

de cromossomos (Figura 18). Outro achado interessante foi quanto à estrutura dos

cromossomos na amostra 028/14. A espécie canina possui 76 cromossomos

autossômicos acrocêntricos, mais o par sexual, que são os únicos cromossomos

submetacêntrico em cães. Porém, as células da amostra 028/14 apresentaram

vários pares de cromossomos submetacêntricos na análise das metáfases,

provavelmente dado a modificações estruturais, como por exemplo, as fusões

cêntricas (Figura 21 e 22).

Figura 17 - Avaliação do número de cromossomos por coloração convencional, amostra 005/13

Fonte: LOCT/USP

Legenda: célula apresentando metáfase com contagem de 76 cromossomos autossômicos mais o par sexual (setas), totalizando 2n=78. Observa-se a estrutura acrocêntrica dos autossômicos, e submetacêntrica dos sexuais. Aumento 1000x

78

Figura 18 - Avaliação do número de cromossomos por coloração convencional, amostra 005/13

Fonte: LOCT/USP

Legenda: célula apresentando mitose aberrante com número superior a 150 cromossomos. Não foi possível a contagem total devido a sobreposição dos cromossomos. Aumento 1000x.

79

Figura 19 – Avaliação do número de cromossomos por coloração convencional, amostra 025/14

Fonte: LOCT/USP

Legenda: célula neoplásica com metáfase de 73 cromossomos, apresentando monossomia do cromossomo X (seta). Aumento 1000x.

80

Figura 20 – Avaliação do número de cromossomos por coloração convencional, amostra 025/14

Fonte: LOCT/USP

Legenda: célula de neoplasia mamária com apresentação hipodiplóide, com um total de 66 cromossomos. Aumento 1000x.

81

Figura 21 - Avaliação dos cromossomos por coloração convencional, amostra 028/14

Fonte: LOCT/USP

Legenda: célula neoplásica apresentando metáfase com 56 cromossomos, sendo grande parte de cromossomos submetacêntricos. Não foi possível a identificação dos cromossomos sexuais. Aumento 1000x

82

Figura 22 - Avaliação dos cromossomos por coloração convencional, amostra 028/14

Fonte: LOCT/USP

Legenda: célula apresentando metáfase com cromossomos metacêntricos. Nota-se o alongamento dos braços de alguns cromossomos. Não foi possível a contagem do número total. Aumento 1000x.

Esta variação é coerente com a instabilidade genômica característica de células

neoplásicas, e os dados obtidos corroboram com a literatura, onde já foram descritos

diversos casos de alteração numérica e estrutural em cromossomos de células

tumorais em cães. A coloração utilizada na análise das amostras não permitiu a

visualização de alterações estruturais adicionais.

83

6.2.5. Imunocitoquímica

Uma das principais formas de caracterização de células em cultivo primário é

a avaliação quanto à expressão de marcadores próprios de filamentos intermediários

(FI), que podem sugerir a origem tecidual, ou a morfologia que estas células

adquiriram quando colocadas em crescimento in vitro. As marcações comumente

utilizadas nestes casos são feitas pela expressão de: citoqueratina, filamentos

característicos de células de origem epitelial; vimentina, expressa por células de

origem mesenquimal; e α-actina de músculo liso, marcador de células mioepiteliais.

Neste trabalho, foi realizada a marcação imunocitoquímica para avaliação da

expressão dos três interfilamentos estruturais nas quatro amostras selecionadas

para a caracterização, bem como em fibroblastos embrionários utilizados como

controle negativo quando da marcação de citoqueratina, e controle positivo quando

da marcação de vimentina. Os resultados mostraram a expressão de citoqueratina

em todas as amostras avaliadas, sendo este FI expresso de forma heterogênea nas

amostras 005/13 e 025/14, e de maneira homogênea nas células do cultivo 020/14 e

028/14, sempre apresentando um uma marcação intensa nas células positivas.

Quanto a vimentina, foi expressa de maneira intensa em todas as células das

amostras 005/13 e 025/14, e sem mudanças no perfil de marcação entre as

diferentes passagens analisadas (Figuras 23 a 26). Já para as amostras 020/14 e

028/14, que exibiam morfologia celular mais característica de células epiteliais ao

final do experimento, a expressão de vimentina ocorreu de forma heterogênea para

as células do cultivo 028/14, e negativa para a amostra 020/14; curiosamente, o

padrão de marcação destas amostras variou com o aumento das passagens; nos

dois casos, a expressão de vimentina era positiva e de maneira homogênea em

passagens mais baixas (Figuras 27 e 28). Assim que o cultivo modificou levemente o

fenótipo e assumiu a morfologia cúbica característica de camadas epiteliais, houve

uma diminuição na expressão deste interfilamento, até chegar ao ponto de não ser

expressa, no caso da amostra 020/14. Por último, a α-actina de músculo liso foi

expressa de forma heterogênea nas amostras 005/13 e 025/14, semelhante à

citoqueratina; no cultivo 028/14, apenas algumas células isoladas expressaram este

FI, e de maneira discreta; já para a amostra 020/14, não houve marcação em

nenhuma célula avaliada (Figuras 23 a 26).

84

Figura 23 - Marcação imunocitoquímica, amostra 005/13

Fonte: LOCT/USP

Legenda: avaliação da expressão de filamentos intermediários, em aumento de 100x (coluna esquerda) e 400x (coluna direita). Nota-se uma expressão heterogênea para a expressão de alfa actina muscular (A, B) e citoqueratina (C, D), e expressão homogênea para a expressão de vimentina (E, F)

85


Fonte: LOCT/USP

Legenda: avaliação da expressão de filamentos intermediários, em aumento de 100x (coluna esquerda) e 400x (coluna direita). Nota-se a expressão negativa para a marcação de alfa actina muscular (A, B) e positiva de forma homogênea para citoqueratina (C, D). Marcação leve e pontual para a expressão de vimentina (E, F)

86


Fonte: LOCT/USP

Legenda: avaliação da expressão de filamentos intermediários, em aumento de 100x (coluna esquerda) e 400x (coluna direita). Nota-se a expressão heterogênea para a marcação de alfa actina muscular (A, B) e citoqueratina (C, D). Marcação homogênea quanto à expressão de vimentina (E, F)

87


Fonte: LOCT/USP

Legenda: avaliação da expressão de filamentos intermediários, em aumento de 100x (coluna esquerda) e 400x (coluna direita). Nota-se a pouca expressão para a marcação de alfa actina muscular, sendo expressa somente em algumas células (A, B) e expressão positiva e homogênea para citoqueratina (C, D). Marcação heterogênea também quanto à expressão de vimentina (E, F)

88

Figura 27 - Marcação imunocitoquímica para expressão de vimentina em diferentes passagens, amostra 020/14

Fonte: LOCT/USP

Legenda: expressão de vimentina na passagem 14 (A) e passagem 34 (B). Nota-se uma diminuição significativa deste interfilamento com o aumento do tempo de cultivo celular. Aumento 200x (A) e 400x (B)

Figura 28 - Marcação imunocitoquímica para expressão de vimentina em diferentes passagens, amostra 028/14

Fonte: LOCT/USP

Legenda: expressão de vimentina na passagem 8 (A) e passagem 18 (B). Nota-se uma diminuição significativa deste interfilamento com o aumento do tempo de cultivo celular, e uma modificação no aspecto morfológico, antes com características mais alongadas, e depois, assumindo morfologia epitelioide. Aumento 200x (A) e 400x (B)

89

Nossos dados não permitem a confirmação da origem luminal ou basal das

células obtidas no cultivo primário, uma vez que o clone utilizado para a marcação

de citoqueratina reage tanto para aquelas expressas na camada basal quanto

luminal (CK 5 e 14; e CK 7, 8, 18 e 19, respectivamente). Apenas a expressão

associada de α-sma auxilia na sugestão de que estas células teriam uma origem

basal. Também não foi possível a avaliação da coexpressão de dois ou mais

marcadores em uma mesma célula, uma vez que a técnica utilizada não permite a

dupla marcação. No entanto, pela morfologia de cada cultivo, pressupõe-se que não

se trata de populações distintas em uma mesma cultura, e sim, de uma

heterogeneidade quanto à expressão dos interfilamentos estudados em um mesmo

tipo de população celular.

6.2.6. Separação de populações positivas para a atividade de aldeído-

desidrogenase (ALDH) através de citometria de fluxo

A análise da atividade de ALDH baseada na intensidade de fluorescência de

cada célula exibiu um resultado semelhante entre três das quatro amostras

avaliadas (Figura 29). As populações que apresentaram uma maior atividade de

aldeído-desidrogenase corresponderam a 1,0%, 0,23% e 1,5% para as amostras

005/13, 025/14 e 028/14, respectivamente. Apenas a amostra 020/14 mostrou uma

maior quantidade de células ALDHhi, que corresponderam a 7,2% do total de células

analisadas (Tabela 4).

Tabela 4 - Porcentagens de células ALDH+ nas quatro amostras de carcinomas mamários caninos

005/13 020/14 025/14 028/14

Nº eventos 10000 10000 10000 10000

ALDH+ 102 723 23 148

% total 1,0 7,2 0,23 1,5

90

Figura 29 - Análise das populações de células com maior atividade de aldeído-desidrogenase

(Continua)

91

(Continuação)

92

(Continuação)

93

(Conclusão)

Fonte: LOCT/USP Legenda: a atividade de ALDH baseada na intensidade de fluorescência de cada célula exibiu um resultado semelhante entre as amostras 005/13, 025/14 e 028/14, que apresentaram porcentagens pequenas de células com maior atividade de aldeído-desidrogenase. Apenas a amostra 020/14 mostrou uma maior quantidade de células ALDH

hi.

94

Quanto ao potencial de auto-renovação pela formação de tumoresferas em

condições de baixa aderência, três das quatro amostras apresentaram diferença

significativa para atividade de ALDH e número de esferas formadas após sete e

quatorze dias de cultivo. Nas amostras 005/13 e 020/14, a população ALDHhi

demonstrou maior capacidade de formação de esferas in vitro, sendo que a amostra

005/13 foi a que apresentou um número mais alto de tumoresferas após os quatorze

dias de experimento (Gráfico 7). As células tumorais do cultivo 020/14 também

geraram esferas principalmente no grupo ALDHhi, porém em menor quantidade, e

em ambas as contagens (Gráfico 8). Ao contrário, na amostra 025/14, a população

em que houve uma maior formação de tumoresferas foi aquela com menor

expressão de aldeído-desidrogenase, tanto para a primeira contagem (dia 7) quanto

na segunda contagem (dia 14) (Gráfico 9). Não houve diferença estatística para a

amostra 028/14 em nenhum dos tempos analisados. Também não houve formação

de tumoresferas no 14º dia de experimento (Gráfico 10).

Gráfico 7 - Ensaio de formação de esferas em cultivo de baixa aderência em populações ALDHlow

e ALDH

hi, amostra 005/13

Fonte: LOCT/USP Legenda: nota-se diferença significativa (*p<0,05) na formação de tumoresferas da população ALDH

hi

na amostra 005/13, na segunda semana de experimento. Avaliação através de análise de variância (ANOVA) seguida por pós-teste Bonferroni.

95


e ALDH

hi, amostra 020/14

Fonte: LOCT/USP Legenda: nota-se diferença significativa (*p<0,05) na formação de tumoresferas da população ALDH

hi

na amostra 020/14, após 7 dias de experimento. Avaliação através de análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Bonferroni. Gráfico 9 - Ensaio de formação de esferas em cultivo de baixa aderência em populações ALDH

low e

ALDHhi, amostra 025/14

Fonte: LOCT/USP Legenda: nota-se diferença significativa (*p<0,05) na formação de tumoresferas em ambos os tempos de experimento da população ALDH

low na amostra 025/14. Avaliação através de análise de variância

em duas vias (ANOVA) seguida pelo post-hoc de Bonferroni.

96


e ALDH

hi, amostra 028/14

Fonte: LOCT/USP Legenda: formação de tumoresferas no 7º dia de experimento. Não foi possível a análise estatística, pois os valores do grupo são idênticos. Nenhuma esfera foi formada nas condições de baixa aderência no 14º dia de experimento.

97

Figura 30 - Formação de tumoresferas, amostra 020/14

Fonte: LOCT/USP Legenda: formação de esferas em condições de baixa aderência para os grupos ALDH

low (-) e ALDH

hi

(+) aos sete e quatorze dias de experimento. Aumento 100x. Escala = 100μm. Figura 31 - Agregados celulares formados a partir do sétimo dia, amostra 028/14

Fonte: LOCT/USP Legenda: amostra 028/14 exibindo aglomerados de células formados nas mesmas condições de crescimento de tumoresferas. Estes grupos não entraram na contagem de esferas ou análise estatística. Aumento 100x. Escala = 100μm

98

A análise da validação para potencial de auto-renovação e formação de

tumoresferas in vitro foi realizada somente pela contagem do número de esferas nos

poços destinados a cultura de cada população, ALDHlow e ALDHhi. Não foram

considerados o tamanho das esferas formadas.

6.2.7. Separação de populações celulares por beads magnéticas através do

perfil de expressão de CD24/CD44

Depois de estabilizado o cultivo celular em monocamada, ou seja, todas as

colônias de células em condições de aderência e em proliferação, as quatro

amostras de carcinomas mamários oriundas da dissociação tumoral foram

submetidas à separação de populações quanto à expressão dos marcadores de

membrana CD24 e CD44. A técnica demonstrou ser eficaz na separação entre

células marcadas e não marcadas para o anticorpo proposto. Todos os testes feitos

obtiveram resultados satisfatórios: porcentagem reduzida de células mortas, e,

aquelas que foram separadas positivamente, permaneceram viáveis quando

colocadas em cultivo novamente. Os resultados mostram que, as quatro amostras

analisadas apresentaram um maior número de células positivas para CD44 quando

comparado à população CD24+. A média de células CD24+ variou entre 0,04 e

0,35% enquanto que as células CD44+ variaram entre 1,75 a 8,56% do total

analisado, correspondendo a mais de seis vezes o número de CD24+. Os dados

estão representados na tabela 5.

Tabela 5 - Quantificação das populações CD24 e CD44 através da separação por beads magnéticas, em neoplasia mamária de cães

(Continua)

CD24 CD44

+ - + -

005/13

Média

0,11

99,88

1,75

98,25

99

(Conclusão)

D.P. 0,07 0,07 1,02 1,02

020/14

Média

0,35

99,65

8,56

91,44

D.P. 0,06 0,06 4,73 4,73

025/14

Média

0,12

99,87

2,42

97,58

D.P. 0,10 0,10 1,60 1,60

028/14

Média

0,04

99,96

2,03

97,97

D.P. 0,04 0,04 1,40 1,40

Fonte: LOCT/USP Legenda: na tabela estão representados a média e o desvio padrão (D.P.) das replicatas analisadas na separação de populações enriquecidas para os fenótipos CD24 e CD44. Os valores apresentados foram ajustados conforme a população de células viáveis.

Ainda, as células separadas após cada experimento foram levadas ao cultivo

celular, para validação quanto à formação de tumoresferas em condições de baixa

aderência (Figura 32). O número de esferas utilizado para análise estatística foi

aquele obtido apenas na contagem realizada no sétimo dia desde o início do

experimento, uma vez que a variação no tempo entre as contagens não teve valor

significativo entre os grupos, portanto, não considerado na presente avaliação.

A análise estatística apresentou uma diferença significativa no crescimento de

tumoresferas para o marcador CD44 nas amostras 020/14 e 025/14, onde a

população CD44+ exibiu um maior número de esferoides no cultivo de baixa

aderência. Para a amostra 005/13, o grupo CD44- foi o que mostrou mais

tumoresferas ao sétimo dia de experimento (Gráfico 12). Também, houve variação

significativa nas populações positivas e negativas para a marcação de CD24, em

que o fenótipo CD24- exibiu maior crescimento de tumoresferas nas amostras

005/13 e 025/14, e o fenótipo CD24+ apresentou crescimento considerável no cultivo

028/14 (Gráfico 11). Não houve diferença estatística entre o número de esferas nas

populações CD24 positiva e negativa para a amostra 020/14, e CD44 positiva e

negativa para a amostra 028/14. Nesta última, o fenótipo CD44+ exibiu um aumento

no crescimento de esferas em uma das replicatas do experimento.

100

Gráfico 11 – Avaliação do crescimento de tumoresferas após a separação para os fenótipos CD24- e

CD24+

Legenda: comparação entre as populações CD24 positiva e negativa quanto ao número de esferas formadas após sete dias de experimento. Os resultados mostram maior crescimento de esferoides no fenótipo CD24

- em duas das quatro amostras analisadas, amostra 005/13 e 025/14. Aumento

observado também no fenótipo CD24+ para a amostra 028/14. Não houve diferença estatística entre

as populações positivas e negativas para CD24 no cultivo 020/14. Teste t de Student (*p<0,05).

101

Gráfico 12 - Avaliação do crescimento de tumoresferas após a separação para os fenótipos CD44- e

CD44+

Legenda: comparação entre as populações CD44 positiva e negativa quanto ao número de esferas formadas após sete dias de experimento. Os resultados mostram maior crescimento de esferoides no fenótipo CD44

+ em duas das quatro amostras analisadas, amostra 020/14 e 025/14. Aumento

observado também no fenótipo CD44- para a amostra 005/14. Não houve diferença estatística entre

as populações positivas e negativas para CD44 no cultivo 028/14. Teste t de Student (*p<0,05).

102

Figura 32 - Formação de esferas em cultivo de baixa aderência após as separações por beads magnéticas

Fonte: LOCT/USP Legenda: tumoresferas formadas no cultivo de baixa aderência após o sorting magnético para separação de fenótipos CD24 e CD44 positivos e negativos. Não estão especificados os grupos em cada foto, uma vez que todos apresentaram um crescimento semelhante. Não foram considerados os tamanhos das esferas formadas em cada grupo. Aumento 100x. Escala = 100μm

103

Figura 33 - Aglomerado de células em proliferação, amostra 028/14

Fonte: LOCT/USP

Legenda: nota-se um grande agrupamento de células, possivelmente se tratando de células isoladas, e não de um crescimento em esfera propriamente dito. Estes agrupamentos não foram considerados na contagem, e foram observados somente na amostra 028/14. Aumento 100x. Escala = 100μm.

A comparação entre os tamanhos das esferas formadas durante os dias de

experimento não foi realizada na presente análise. Os cultivos foram mantidos

durante quatorze dias ao total, mas a variação entre o número de esferas formadas

entre a primeira (dia 7) e última (dia 14) contagem não foi significativa.

104

7 DISCUSSÃO

As neoplasias mamárias em cadelas ainda é um problema emergente em

países como o Brasil, onde a carência no tratamento, e principalmente, na

prevenção da doença faz com que os índices de incidência e mortalidade ainda

sejam números surpreendentes, ano após ano. Neste estudo, verificamos que as

neoplasias malignas mamárias, em especial os carcinomas, foram as mais

frequentes entre os animais com amostras coletadas no presente trabalho. Assim

como em mulheres, os níveis hormonais exercem grande influência na iniciação,

promoção e progressão tumoral de neoplasias mamárias em cadelas, principalmente

em neoplasias de origem epitelial, onde quase 80% destes tumores são responsivos

ao estrógeno (SORENMO; SHOFER; GOLDSCHMIDT, 2000). Deste modo, animais

de meia idade a idosos, não castrados, e/ou que receberam algum tipo de hormônio

exógeno para controle reprodutivo, são candidatos em potencial ao diagnóstico de

câncer de mama. Baseado neste fato, a castração em animais jovens é considerada

o método mais eficaz para evitar o desenvolvimento deste tipo de neoplasia: se

castrados até o primeiro cio, o risco destas fêmeas virem a desenvolver a doença é

de apenas 0,5%. Porém, se a cirurgia for realizada tardiamente (após o 2º cio), as

chances aumentam para 26% (SCHNEIDER; DORN; TAYLOR, 1969), evidenciando

a necessidade da implementação de programas de conscientização voltados aos

proprietários de fêmeas para a castração precoce de seus animais.

Sendo assim, este acúmulo de fatores de risco durante a vida de cada animal,

não só por fatores hormonais, mas também dieta, meio ambiente, predisposição

genética e acúmulos de mutações, faz com que raramente sejam diagnosticados

tumores de glândula mamária em cães abaixo de 2 anos de idade. A curva de

incidência torna-se ascendente a partir dos 5 anos, atingindo picos entre os 8 a 12

anos de idade, para então entrar em declínio, como evidenciado em estudos

epidemiológicos realizados nos últimos 40 anos (MULLIGAN, 1975; ZATLOUKAL;

KOHOUT; REPUBLIC, 2005; MERLO et al., 2008; FILHO et al., 2010). Resultados

que são congruentes com os verificados neste trabalho. Com relação à

predisposição racial, ainda não se pode afirmar que determinadas raças sejam mais

propensas a desenvolver tumores mamários do que outras, uma vez que este índice

105

pode estar relacionado com a preferência e distribuição racial de cada região

geográfica; porém, há relatos de tendência do aumento de casos de neoplasias de

glândula mamária em raças como Poodle, Pinscher, Cocker Spaniel e Daschund,

frequentes em trabalhos realizados tanto no Brasil como no exterior (SORENMO,

2003; FILHO et al., 2010). Neste estudo, os animais sem raça definida (SRD) foram

os mais acometidos, o que pode ser explicado pelo predomínio de cães mestiços da

região onde foram coletadas as amostras. Estes resultados estão de acordo com

outros estudos brasileiros, que também apresentaram SRDs como a população

dominante dos casos avaliados (FONSECA, 1999; HATAKA, 2004; FILHO et al.,

2010).

Neste estudo, a maior parte dos animais apresentava mais de um nódulo no

momento da cirurgia, corroborando com a literatura, que mostra que fêmeas caninas

podem apresentar múltiplas nodulações, e em alguns casos, estas nodulações

pertencem a tipos histológicos distintos (MOULTON, 1990). A maioria dos casos se

tratava de carcinomas, sendo que os tipos histológicos mais frequentes foram os

carcinomas complexos, mistos e sólidos. Também, a procedência dos cultivos

utilizados no trabalho teve quase que a totalidade de carcinomas mistos, exceto por

um comedocarcinoma, correspondente a amostra 005/13. Os carcinomas mistos

caracterizam-se pela presença de três ou mais populações (epitelial, mioepitelial e

metaplasias cartilaginosas ou ósseas) de células suportadas por um estroma

fibrovascular. Histologicamente, ainda há uma controvérsia sobre a origem do tecido

cartilaginoso e/ou ósseo formado durante o desenvolvimento dos tumores mistos: se

este seria proveniente do componente epitelial (ALLEN, 1940), da metaplasia do

tecido conectivo (PALMER; MONLUX, 1979), ou ainda, das células mioepiteliais que

compõe a camada basal da glândula mamária (TATEYAMA; COTCHIN, 1978).

Porém, evidências reforçam o papel das células mioepiteliais nas metaplasias

mesenquimais, que por algum mecanismo desconhecido, promoveriam a

transformação em cartilagem e osso, resultando numa aparência histológica

heterogênea (GÄRTNER et al., 1999). Já os comedocarcinomas, são neoplasias

extremamente agressivas, que apresentam focos de necrose em meio ao tecido

tumoral e estroma adjacente (GOLDSCHMIDT et al., 2011). Estes focos de necrose

nos tecidos tumorais podem caracterizar uma grande taxa de proliferação das

células neoplásicas, significando clinicamente tumores menos diferenciados e com

106

maior potencial de metastatização, apresentando um pior prognóstico (FRANCO,

1997).

A análise citogenética dos tumores é importante para o diagnóstico,

prognóstico e tratamento de neoplasias humanas e veterinárias (HAHN et al., 1994;

FRIEDLANDER; HEDLEY; TAYLOR, 2006; GRIMWADE et al., 2015). No presente

estudo, as quatro amostras selecionadas para caracterização do cultivo celular in

vitro apresentaram aspectos diferentes quanto ao perfil citogenético, relacionado à

variação do número e aparência dos cromossomos das células avaliadas. O

cariótipo da espécie Canis lupus familiaris é considerado um dos mais complexos e

difíceis de serem estudados, principalmente devido ao tamanho e estrutura de todos

os cromossomos autossômicos, que consistem em 76 cromossomos acrocêntricos

muito semelhantes em comprimento, com exceção do primeiro par, que apresenta

um comprimento parecido com o cromossomo X, sendo facilmente identificado

(REIMANN et al., 1999). Somente em 1996 chegou-se a um consenso sobre a

nomenclatura dos cromossomos caninos, entretanto, as recomendações exatas

sobre o uso de uma nomenclatura específica para a descrição de aberrações

cromossômicas no cariótipo canino ainda não foram alcançadas (REIMANN et al.,

1996).

Alterações numéricas em células tumorais já foram relatadas na espécie

canina. Mayr et. al. realizaram estudos citogenéticos em uma série de neoplasias em

cães. Em hemangiopericitoma, hemangiotelioma e sarcoma espinocelular,

encontraram aneuploidia em grande parte das metáfases analisadas, em

consequência de polissomias, no caso de células hiperdiploides, e fusões cêntricas

ou isocromossomos, reduzindo o número final de cromossomos em células

hipodiploides (MAYR et al., 1994). As fusões cêntricas consistem na união dos

centrômeros de dois cromossomos acrocêntricos distintos dando origem a um

metacêntrico único, levando a uma diminuição de cromossomos no número final da

célula. Mas, apesar disso, indivíduos que apresentam fusões cêntricas geralmente

têm genoma completo e fenótipo normal. Já os isocromossomos, menos frequentes,

surgem a partir de um rompimento longitudinal do centrômero e paralelo às

cromátides, fazendo com que os dois braços idênticos se liguem a um mesmo

centrômero, de modo que cada braço contenha a mesma ordem de genes

(NICHOLAS, 2012). Em um estudo com osteossarcomas, a fusão cêntrica foi um

107

achado comum entre todos os animais estudados, e nenhuma célula apresentou

metáfase com 2n=78. No mesmo trabalho, a alteração do número de cromossomos

entre os pacientes diagnosticados com o mesmo tipo de tumor foi diferente, onde um

animal exibiu células hiperdiploides, e no outro, as células eram todas hipodiploides

(MAYR et al., 1991a). Achados semelhantes foram encontrados em melanomas

orofaríngeos e em um caso de melanoma cutâneo canino. Todos apresentaram

aneuploidias com alterações estruturais características de fusões cêntricas e um

isocromossomo isolado i(12), estando de acordo com os dados também descritos

para melanomas em humanos (MAYR; SCHLEGER; LOUPALT, 1992; HÖRSTING

et al., 1999).

Em neoplasias de glândula mamária em cães, nossos dados mostraram

resultados semelhantes àqueles publicados em literatura. Todas as amostras

analisadas por coloração convencional (Giemsa) exibiram aneuploidas, mas sem um

padrão definido. Com exceção da amostra 028/14, todas apresentaram células

hipodiploides e hiperdiploides, sendo que, na 005/13 e 025/14 a maior parte

correspondia ao valor diploide normal (2n=78). Em relação a alterações estruturais,

a amostra 028/14 foi a que apresentou modificações muito evidentes, como diversos

pares de cromossomos metacêntricos e uma consequente redução no número total

de cromossomos em todas as metáfases analisadas. Os resultados corroboram com

os de Mayr et.al. em sarcomas e adenocarcinomas mamários caninos, realizados

em tumores recém-dissociados e cultivos primários. Entre os achados, estão a fusão

cêntrica ou isocromossomo no par 13, resultando em cromossomos metacêntricos e

simétricos; monossomia dos pares 4 e 6; trissomia no par 3; monossomia do

cromossomo X, entre outros (MAYR et al., 1991b, 1994; MAYR; SCHLEGER;

LOUPALT, 1992). Talvez, o cariótipo do cão suporte a perda de cromossomos

durante o processo de transformação e progressão tumoral sem a perda da

viabilidade celular com mais frequência do que o cariótipo no homem. Segundo

Rutteman et. al., que realizaram análise de ploidia em neoplasias mamárias em

cadelas, os genes que codificam para as funções celulares vitais em cães são

distribuídos em um maior número de cromossomos, permitindo assim que as células

caninas superem a perda cromossômica de uma forma menos significativa

(RUTTEMAN et al., 1988). Mesmo assim, esta perda de cromossomos é um fator

108

importante para a geração de um fenótipo maligno de células, uma vez que podem

implicar a perda de genes supressores de tumor e reparadores de danos no DNA.

Uma vez iniciado, o desenvolvimento e a progressão do tumor mamário será

influenciado por diversos fatores, especialmente de qual local e a que grupo

pertencem as células que deram origem à neoplasia. Normalmente, se originam a

partir de lesões benignas, sendo muito comum um carcinoma ou um sarcoma se

desenvolverem a partir de um tumor misto benigno ou mesmo de lesões pré-

neoplásicas, como as hiperplasias ductais ou lobulares. A possibilidade de se

estabelecer um diagnóstico específico, ou mesmo um marcador prognóstico que

seja expresso nesta fase de transição, seria extremamente bem vinda, visto que

cerca de 70% dos sarcomas e 30% dos carcinomas dão origem a metástases e

formação de tumores secundários (HELLMÉN, 2005).

Os filamentos intermediários (FI) representam um dos três principais

polímeros fibrosos da célula e atuam como suportes do citoesqueleto no núcleo e no

citoplasma (ALBERTS, 2002). São expressos nas células em maior ou menor

quantidade, dependendo do tecido de origem. Até pouco tempo atrás, acreditava-se

que um tumor expressava apenas um tipo de FI; os carcinomas expressariam

apenas citoqueratinas, enquanto que neoplasias mesenquimais teriam a expressão

somente de vimentina. Entretanto, apesar deste padrão de expressão ainda ser uma

tendência, atualmente se sabe que um mesmo tumor pode coexpressar dois ou mais

tipos de filamentos intermediários ao mesmo tempo. Frequentemente, quando há

coexpressão de FIs, a vimentina está presente na maioria dos casos (BROERS et

al., 1988). Neste estudo, verificamos diferentes padrões de expressão dos três

principais FIs utilizados na caracterização de células tumorais: citoqueratinas (CK)

de diferentes pesos moleculares, identificados pelo mesmo clone A1/A3

(especificamente CKs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 15, 16 e 19); vimentina; e por fim,

actina de músculo liso, representada pela α-sma. Desde o início, as amostras 005/13

e 025/14, com células de morfologia mais alongada, apresentaram coexpressão de

citoqueratina e vimentina no cultivo celular, sendo a vimentina expressa em todas as

células homogeneamente, enquanto que a citoqueratina expressava de forma

heterogênea. Também, notamos a marcação para α-sma, da mesma forma que a

citoqueratina: distribuição heterogênea. No caso das amostras 020/14 e 028,

verificamos uma diminuição na expressão de vimentina com o aumento das

109

passagens, sendo que nas células da amostra 020/14, assim que o cultivo assumiu

uma morfologia epitelial, não apresentou marcação para este interfilamento. Esta

diminuição na marcação de vimentina pode ser consequência da seleção de uma

população celular durante o cultivo de células, ou do decréscimo da expressão do

interfilamento sem mudanças na natureza do cultivo celular.

As queratinas são uma família de filamentos intermediários expressos

diferencialmente no epitélio, e fornecem marcadores únicos e específicos para

estudos sobre diferenciação epitelial. As células basais e luminais dentro epitélio

mamário expressam queratinas bem definidas, em fenótipos in vitro e in vivo

(TAYLOR; LANE, 1981; O’HARE et al., 1991). A vimentina é um marcador estável de

células mesenquimais, como os fibroblastos, e também já foi descrita como presente

nas células mioepiteliais, que formam a camada basal do epitélio glandular. Além da

vimentina, a expressão de α-actina de músculo liso e a miosina já foram

caracterizadas na expressão de células mioepiteliais tanto em tecido mamário

adulto, como no infantil (GUSTERSON et al., 1982; GUELSTEIN et al., 1988;

GOULD et al., 1990; ANBAZHAGAN et al., 1991). Em humanos, a expressão de FI

na glândula mamária está associada com uma variedade de aspectos, no

desenvolvimento fetal da mama, diferenciação celular pela interferência hormonal, e

a progressão de uma neoplasia (ANBAZHAGAN et al., 1991; OSIN et al., 1998).

Nos últimos anos, tem-se relacionado a coexpressão de vimentina e

citoqueratina em carcinomas mamários com uma maior malignidade tumoral,

principalmente pela associação com a transição epitélio-mesenquimal (EMT)

responsável pela invasão do tecido adjacente e disseminação das células

neoplásicas. O subtipo tumoral que corresponderia a este grau de agressividade

devido às altas taxas de invasão e metástase seria aquele referido como triplo-

negativo, ou basal-like. Desde modo, a EMT a nível celular nestes tumores seria

caracterizada pela perda de adesão intercelular (E-caderina e ocludinas); baixa

regulação dos marcadores epiteliais (citoqueratinas); aumento da regulação de

marcadores mesenquimais (vimentina e α-actina de músculo liso); aquisição de uma

morfologia celular fusiforme, semelhantes a fibroblastos, através da reorganização

do citoesqueleto; e aumento da mobilidade, invasão e capacidade metastática das

células. Boa parte destas características foram verificadas nos estudos

imunocitoquímicos realizados nos cultivos primários deste trabalho, mesmo para

110

aquelas amostras que perderam a expressão de vimentina após o aumento no

número de passagens, como foi o caso da amostra 020/14. Em 2008, Sarrió et. al.

em um estudo com a linhagem celular MCF10, apresentou dados que corroboram

com a hipótese de que as modificações EMT-like acontecem preferencialmente no

subtipo basal do câncer de mama (SARRIÓ et al., 2008). Entretanto, nossos dados

não permitiram a confirmação da origem luminal ou basal das células obtidas no

cultivo primário pela marcação da citoqueratina específica de cada subtipo celular.

Apenas a expressão de alfa-actina muscular presente nas amostras 005/13 e 025/14

sugere que pertençam à camada basal do epitélio.

Grande parte dos estudos que envolvem associação da expressão de IF em

neoplasias mamárias são realizados através de análise imunohistoquímica. Uma vez

em cultivo, as células tendem a modificações no citoesqueleto em resposta às

condições do meio, e de confluência nas placas de cultura. Portanto, os modelos in

vitro que são utilizados para o estudo de EMT sofrem de várias limitações. Em

alguns modelos, a EMT é realizada de forma incompleta ou lenta, levando vários

dias para a conclusão. Poucos tipos celulares de carcinoma com um fenótipo

epitelial bem definido podem realizar a EMT in vitro, talvez porque o processo de

transição seja muito sensível às condições de cultura, incluindo os substratos do

meio e a presença ou ausência de soro fetal bovino (THIERY, 2002). Mesmo assim,

o cultivo de células que apresentam características semelhantes às descritas no

processo de transição epitélio-mesenquimal, naturalmente ou de forma induzida,

ainda é um método de extrema importância para o entendimento de como este

processo estaria envolvido na invasão e metástase de neoplasias agressivas, uma

vez que somente com estudos histológicos não é possível avaliar o comportamento

tumoral acessado através das células vivas, e as modificações as quais estas

células são submetidas, mimetizando a progressão do tumor in vivo.

A heterogeneidade e a complexidade biológica e molecular do câncer,

principalmente de tumores sólidos, como o câncer de mama, apresentam muitos

desafios para o desenvolvimento de estratégias eficazes para prevenir e tratar esta

doença. Por este motivo, estudos vêm dando cada vez mais crédito para a hipótese

das células-tronco cancerosas (CSCs), que, se estiver correta, fornecerá uma

explicação para muitos fatores ainda limitantes no conhecimento do

desenvolvimento e progressão tumoral. O modelo de desenvolvimento baseado em

111

CSCs consiste fundamentalmente na ideia de que o câncer seria originado a partir

de uma desregulação nas vias de auto-renovação de células-tronco e/ou

progenitoras no tecido normal (REYA et al., 2001). Como consequência, as

neoplasias teriam um componente celular chave, que manteria as suas propriedades

de células-tronco, incluindo a auto-renovação, dando início e conduzindo a

carcinogênese e diferenciação, embora aberrante, contribuindo assim para a

heterogeneidade tumoral (GUPTA; CHAFFER; WEINBERG, 2009). A principal

dificuldade encontrada no estudo e caracterização das CSCs, admitindo que esta

teoria seja de fato a origem do câncer, é a identificação de um marcador único e

exclusivo desta população tumoral que permita o isolamento somente das CSCs.

Até hoje, nenhum marcador utilizado para o isolamento das células-tronco normais e

neoplásicas de diversos tecidos são expressos somente pelas células-tronco; isto é

válido não só para marcadores de membrana, conhecidos como CDs (do inglês

Cluster of Differentiation), mas também para ensaios de funcionalidade, como os

níveis de metabolismo de enzimas ou transportadores envolvidos no processo de

detoxificação, como é o caso do ensaio Aldefluor® e Side Population.

O ensaio de formação de esferas, uma técnica in vitro onde a proliferação

celular resulta em um produto de arquitetura esferoide, juntamente com a avaliação

de tumorigênese in vivo é um dos principais métodos de validação da presença de

CSCs em cultivo primário ou linhagens estabelecidas. É muito utilizado em trabalhos

realizados com diversos tipos de tumores sólidos, para a validação de marcadores,

testes de quimioresistência, estudo das vias de transição epitélio-mesenquimal,

entre outros (SINGH et al., 2003; FILLMORE; PONTI et al., 2005; KUPERWASSER,

2008; TROPEPE et al., 2000; WELLNER et al., 2009). No caso de neoplasias

mamárias, as células normais ou tumorais que iniciam as tumoresferas quando

colocadas em condições independentes de ancoragem, têm propriedades de

células-tronco e são capazes de auto-renovação in vitro, bem como de se diferenciar

em todos os subtipos celulares encontrados na glândula mamária (PONTI et al.,

2005; FILLMORE; KUPERWASSER, 2008; KAKARALA; WICHA, 2008;).

No presente estudo, as quatro amostras de células obtidas a partir do cultivo

primário de carcinomas mamários em cães apresentaram formações em

tumoresferas no cultivo de baixa aderência. Existem poucos trabalhos publicados na

literatura que descrevem o isolamento e caracterização de CSCs em tumores

112

mamários caninos, sendo a maior parte realizada em linhagens pré-estabelecidas e

não em cultivos primários, sendo que o primeiro deles a isolar esta subpopulação foi

realizado em 2009. Neste trabalho, Cocola et. al. demonstraram que tanto as células

dissociadas de tecidos tumorais quanto saudáveis foram capazes de gerar esferas

sob as condições adequadas, sem observar diferença morfológica entre os dois

grupos (COCOLA et al., 2009). A definição de um marcador que otimize a separação

da população de CSCs em neoplasias mamárias em cães, entretanto, ainda

permanece indefinida. Mesmo para aqueles marcadores que já foram bem

documentados em estudos humanos, como é o caso do fenótipo CD24-

/low/CD44+/high, a marcação CD133+, a maior expressão de aldeído-desidrogenase e o

isolamento pelo método Side Population (AL-HAJJ et al., 2003; PATRAWALA et al.,

2005; PONTI et al., 2005; GINESTIER et al., 2007; CHARAFE-JAUFFRET et al.,

2009), nos tumores caninos, apresentou uma diferença nos resultados não só

quando comparados à literatura humana, mas também entre os animais de um

mesmo estudo.

Por exemplo, nossos dados mostram que, duas em quatro amostras

apresentaram um maior crescimento de esferas no grupo ALDHhi, como foi o caso

das amostras 005/13 e 020/14; já no cultivo 025/14, a maior expressão de aldeído-

desidrogenase não foi um fator determinante no ensaio em baixa aderência. Estes

resultados corroboram com o estudo de Michishita et. al. realizado em 2012, que

avaliaram o potencial de auto-renovação em linhagens de carcinomas mamários

caninos. Três das quatro amostras analisadas apresentaram uma maior formação de

esferas na população ALDHhi, enquanto que uma linhagem não apresentou

diferenças significativas entre os grupos ALDHlow e ALDHhi. Também, não houve

alteração na expressão gênica de ALDH1A1 entre a população positiva e negativa

da linhagem que apresentou uma maior porcentagem de expressão no ensaio

Aldefluor® (MICHISHITA et al., 2012). Em outro estudo, realizado em linhagens de

melanoma humano isoladas de sítios metastáticos, com elevado grau de

agressividade, a maior atividade de ALDH foi encontrada em quase 90% das células

avaliadas, porém sem diferenças na tumorigenicidade entre as populações ALDHlow

e ALDHhi quando da injeção em camundongos nude (PRASMICKAITE et al., 2010).

Em 2006, um Workshop realizado pela American Association of Cancer

Research, e publicado por Michael Clarke et. al. sobre o tema “Cancer Stem Cells —

113

Perspectives on Current Status and Future Directions” afirmava que nesta teoria de

desenvolvimento tumoral, as CSCs seriam uma subpopulação muito pequena,

apenas um reservatório de células que teriam como função a manutenção do tumor

(CLARKE et al., 2006). No entanto, demonstrou-se através dos resultados obtidos

nos experimentos publicados até 2009 sobre as CSCs, que a proporção de CSCs

pode diferir entre os vários tipos de tumores (GUPTA; CHAFFER; WEINBERG,

2009). Esta variação também pôde ser encontrada na comparação entre os

resultados do presente trabalho, e o estudo de Michishita et. al. comentado

anteriormente. Nossos dados apresentaram uma variação na expressão de ALDH

partindo de 0,23%, na amostra 025/14, a 7,2% na amostra 020/14, enquanto que

nos resultados publicados na literatura, a porcentagem de células com alta

expressão de ALDH variou de 5,1% a 49,1% entre as amostras analisadas

(MICHISHITA et al., 2012).

Além da expressão de ALDH, a maioria dos estudos atuais tem enfatizado a

identificação de subpopulações de células-tronco cancerosas em câncer de mama a

partir da expressão de marcadores de membrana como CD44 e CD24. O primeiro

relato de isolamento de uma subpopulação com alto potencial tumorigênico verificou

que células com expressão do fenótipo CD24- ou CD44+ apresentavam um maior

crescimento de tumores em camundongos NOD/SCID do que aquelas CD24+ e

CD24-. Ainda, quando associadas as duas marcações, o grupo CD24-/CD44+ era

capaz de formar nódulos com uma menor quantidade de células injetadas, do que

quando avaliados de forma isolada (AL-HAJJ et al., 2003). A partir de então, vários

trabalhos em humanos e cães se basearam na expressão destes marcadores na

caracterização desta subpopulação como possíveis células-tronco cancerosas

mamárias (DONTU et al., 2003; PONTI et al., 2005; FILLMORE; KUPERWASSER,

2008; FERLETTA; GRAWÉ; HELLMÉN, 2011). No presente estudo, procuramos

avaliar a capacidade na formação de tumoresferas em células de cultivo primário de

carcinomas mamários caninos, não só através da atividade de ALDH, mas também a

fim de verificar se a expressão de CD24 ou CD44 poderia selecionar subpopulações

enriquecidas com CSCs no ensaio in vitro. O método escolhido foi a separação

através de beads magnéticas, que apesar de menos frequente para este tipo de

estudo, já foi utilizado em literatura no isolamento de populações CD24 e CD44

114

positivas e negativas a partir de células tumorais para análises de CSCs e

invasividade (LEELAWAT et al., 2013; SHEN et al., 2013).

Assim como os resultados obtidos a partir da expressão de ALDH, o

crescimento de esferas no cultivo de baixa aderência diferiu entre os fenótipos

avaliados. Duas em quatro amostras apresentaram crescimento significativo na

população CD44+ quando comparada às demais, e, na amostra 025/14, o grupo

CD24- também exibiu maior número de tumoresferas no cultivo de baixa aderência,

conforme o esperado. A expressão de CD44 em células tumorais caninas talvez

esteja intimamente associada à proliferação celular em cultura, sendo que essa

expressão transitória e flutuante pode interferir na sua utilidade como um marcador

de CSCs (BLACKING; WATERFALL; ARGYLE, 2011). Esta discrepância na

expressão e potencial de formação de colônias in vitro foi relatada em linhagens

tumorais de neoplasias mamárias em humanos, bem como na avaliação da

expressão de marcadores comuns de CSCs em células dissociadas a partir de

tumores primários. Verificou-se que a expressão de CD44, CD24, ALDH, ESA,

CD133, CXCR4 e PROCR tanto em in vivo quanto in vitro, diferiu substancialmente

entre as linhagens de células pré-estabelecidas de câncer de mama, bem como nos

tumores primários, sugerindo que os marcadores previamente reconhecidos para as

células-tronco do câncer de mama podem não ser os marcadores ideais ou

universais para a identificação de populações de células-tronco do câncer nos

diversos tipos histológicos reconhecidos (HWANG-VERSLUES et al., 2009).

Uma questão fundamental é se os diferentes subtipos histológicos do câncer

de mama são derivados de uma mesma origem, ou de origens distintas. Células-

tronco cancerosas com características distintas em cada subtipo poderiam explicar

porque eles diferem não só morfologicamente, mas também em graus de invasão e

metástase, bem como no prognóstico e resposta ao tratamento de cada neoplasia. A

expressão de ALDH, por exemplo, já foi relacionada a um alto grau de agressividade

do tumor, sem necessariamente implicar em um maior crescimento de tumoresferas

no grupo ALDHhi para todos os tipos de neoplasias (PRASMICKAITE et al., 2010),

provavelmente devido à função específica de cada isoforma resultante da expressão

do gene ALDH. No câncer de mama humano, já foram descritos 19 isoformas

diferentes de ALDH, em que a progressão tumoral em diferentes subtipos tumorais

era influenciada não só por uma isoforma específica; e cada uma delas teria um

115

potencial diferente para promover um aumento na atividade do teste Aldefluor®, se

expressas em níveis suficientes (MARCATO et al., 2011). Associando o fato de que

a maior atividade de ALDH teria uma grande influência principalmente em subtipos

mais agressivos, e de que diferentes isoformas agem de maneiras distintas na

progressão de cada subtipo tumoral, a literatura daria suporte aos dados

encontrados neste trabalho; a amostra 005/13, que apresentou um maior número de

tumoresferas no grupo ALDHhi, pertence a um subtipo tumoral mais agressivo, o dos

comedocarcinomas. Assim, mesmo sem expressar uma grande porcentagem de

células com alta atividade de ALDH, aquelas que de fato expressavam, promoveram

um crescimento significativo de esferas quando colocadas em condições

específicas. Ainda, sabe-se que uma das funções da enzima aldeído-desidrogenase

é a conversão do retinol em ácido retinóico, que tem papel importante na

diferenciação celular de células-tronco neurais e hematopoiéticas (MARCATO et al.,

2011). Portanto, uma baixa atividade de ALDH, seja fisiológica ou induzida, levaria a

uma diminuição nos níveis de ácido retinóico e um consequente aumento de células

indiferenciadas, tais como as células-tronco. Esta função permitiu o desenvolvimento

de um fármaco eficaz em casos de leucemia aguda, o all-trans-retinoic-acid (ATRA),

que promove diferenciação das células tumorais e induz apoptose. Em câncer de

mama, Ginestier et. al. demonstraram que a adição de ATRA em cultivos de células

tumorais mamárias leva a uma diferenciação celular in vitro, observada através da

diminuição na formação de tumoresferas (GINESTIER et al., 2009).

A variação encontrada no crescimento de esferas em populações separadas

a partir de marcadores comuns de células-tronco cancerosas mamárias em

humanos nos permite pensar que a comparação entre CSCs e não-CSCs talvez não

seja a melhor forma de finalmente caracterizarmos esta população como sendo uma

população única; talvez, estejamos diante não só de diferentes populações de

células tumorais mamárias. Mas também, de diferentes grupos de células iniciadoras

tumorais, que levariam a diferentes subtipos de câncer de mama, e que estas

células poderiam às vezes até coexistir dentro de um mesmo tumor. Neste estudo

verificamos que neoplasias de uma mesma classificação histológica, no caso três

adenocarcinomas mistos, diferiram nas características morfológicas e citogenéticas

avaliadas, bem como na expressão de marcadores normalmente utilizados no

isolamento de CSCs em câncer de mama, apesar de todos os cultivos terem sido

116

mantidos sob as mesmas condições de meio de cultura e processamento de

dissociação primária. Assim, populações celulares diferentes seriam responsáveis

pela formação e desenvolvimento dos tumores sólidos. A definição da forma com

que acontece a progressão neoplásica permitiria o aprimoramento de terapias e

estratégias de prevenção da doença.

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam a possibilidade do uso

da oncologia comparada na pesquisa em oncologia básica, em busca da

compreensão da origem, desenvolvimento e organização dos tumores sólidos,

especialmente em neoplasias mamárias. O câncer de mama em cães, que

apresenta uma grande variedade e complexidade assim como em humanos, se

apresenta como uma ferramenta em potencial para o estudo das vias hierárquicas

do desenvolvimento tumoral, uma vez que é uma neoplasia espontânea e

biologicamente semelhante àquelas diagnosticadas em mulheres.

117

8 CONCLUSÃO

. A partir da caracterização citogenética e imunocitoquímica, bem como das

observações realizadas pelos ensaios de formação de esferas, conclui-se que:

• Cultivos de células tumorais provenientes de neoplasias mamárias em cadelas

podem ser padronizados in vitro, em cultivos de longo prazo, sendo excelentes

métodos para o estudo citogenético envolvendo alterações a nível

cromossômico, e também, para a análise da expressão de filamentos

intermediários in vitro;

• Cultivos celulares diferentes apresentam quantidades distintas de populações

positivas e negativas quanto à expressão de marcadores comuns de células-

tronco cancerosas em câncer de mama;

• Apesar de apresentarem respostas diferentes, todos os cultivos celulares

exibiram potencial tumorigênico através da análise in vitro.

118

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Cultivo primário de células oriundas de carcinomas ... · and aldehyde dehydrogenase activity, however, all exhibited tumorigenic potential in vitro through tumorspheres formation