BIOCOMPATIBILITATE

LP 2

Scopul testelor de biocompatibilitate • Scopul testelor de biocompatibilitate este de a determina capacitatea de

utilizare a unui dispozitiv pentru uz uman, și pentru a vedea dacă utilizarea dispozitivului respectiv poate sau nu avea un potențial efect fiziologic nedorit.

• Conform Organizației Internaționale de Standarde: ”scopul principal al ISO 10993 este de a proteja oamenii de potențiale riscuri biologice ce pot provenii de la utilizarea dispozitivelor medicale”.

procesul de determinare a biocompatibilității

unui dispozitiv medical

1. achiziționarea de date cu privire la materialele din care sunt realizate dispozitivele medicale

2. evaluare prin teste in vitro (de cele mai multe ori se realizează doar pe

anumite părți componente ale unui dispozitiv

medicale, și nu pe întreg dispozitivul medical),

3. confirmare din partea studiilor realizate in vivo

care vor fi realizate pe întreg dispozitivul.

http://www.pacificbiolabs.com

Pregatirea probelor

•

•CULTURI DE CELULE ANIMALE SI UMANE

Tehnica cultivarii celulelor - proces complex in care celulele cresc in afara

• tesutului (in vitro) in conditii de laborator strict controlate: asepsie, sterilitate,

• temperatura, gaze si presiune optimizate. Exista culturi de celule umane, din animale, plante, fungi si microbi, incluzand - virusuri, bacterii si protista (grupa diversa de microorganisme eucariote).. Limite: • este necesara o expertiza speciala, • poate avea loc contaminarea

– chimica,

– biologica,

– cross-contaminare,

– echipamente si reactivi scumpi,

–plastice de unica folosinta

Introducere

•

Introducere

Avantaje:

• diminueaza sacrificarea animalelor,

• permite optimizarea cresterii in conditiile controlului mediului extracelular,

Dezavantaje:

• dispar interactiile cu mediul in vivo, poate avea loc productia :

– proteine nedorite datorita de-diferentierii celulelor

Scopul:

• tehnologie indispensabila,

• studiul reglarii proliferarii celulare, diferentierii

• si formarii unor produsi in conditii controlate, disecarea cailor de semnalizare care regleaza expresia genica

Termeni

Generatie (numarul de/timpul de): numarul de dedublari pe care le

sufera o populatie celulara/ timpul in care o celula parentala se divide in 2

celule fiice – Proliferare: cresterea numarului de celule de acelasi tip

– Celula nediferentiata: celula imatura, primitiva, ce nu a dobandit o structura si o functie

speciala

– Diferentiere: proces prin care dintr-o celula generica se dezvolta un tip celular specific ca

raspuns la semnale specifice

– De-diferentiere: proces celular in care o celula diferentiata pierde forma si functia ei

speciala si revine la un stadiu de dezvoltare anterior

•Cultura de organ: cultivarea unui tesut nativ pentru a retine

majoritatea caracteristicilor histologice in vivo

•Cultura histolitica: cultivarea celulelor in vederea reagregarii lor pentru a

forma o structura similara unui tesut

•Cultura organotipica: recombinarea unor tipuri celulare diferite pentru a

forma un tesut mai bine definit sau un organ

•

•In secolul 19, fiziologul englez Sydney Ringer a preparat solutii saline ce contin cloruri de Na, K, Ca si Mg ce mentin in stare viabila cordul unui animal izolat din corp.

•In 1885 Wilhelm Roux a indeparat o portiune din placa medulara a unui embrion de pui de gaina si a mentinut-o in stare viabila cateva zile intr-o solutie salina calda punand bazele culturii de tesut.

•Ross Granville Harrison care a lucrat la Johns Hopkins Medical School si apoi la Yale University a publicat rezultatele experimentelor lui din anii 1907- 1910 punand bazele metodologiei culturii de tesuturi.

•Tehnicile culturii celulare au avansat semnificativ in anii 1940 - 1950 pentru a suporta cercetarile de virologie. Virusurile crescute in culturi de celule permit fabricarea de vaccinuri. Polio-vaccinul injectabil - primul vaccin produs in masa utilizand tehnicile culturii celulare (1952).

•Acest vaccin a stimulat cercetarile lui John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller si Frederick Chapman Robbins care au primit premiul Nobel (1954) pentru dezvoltarea unor metode de crestere a virusurilor in culturi de celule renale de maimuta.

ISTORIC

Izolarea celulelor

Celulele pot fi izolate din tesuturi pentru a se obtine culturi ex vivo prin mai multe metode.

Din tesuturile moi se pot obtine culturi celulare prin doua metode: – digestie enzimatica – si tehnica explantului.

In prima metoda celulele pot fi eliberate din tesuturile moi prin digestia ECM cu enzime: colagenaza, tripsina sau pronaza.

In a doua metoda, piese de tesut sunt plasate in mediul de crestere, cand celulele ies din tesut si cresc in mediul de cultura.

Tehnica explantului

Un numar mare de tipuri celulare, plasate intr-un vas de cultura si intr-un mediu adecvat, adera la peretii interiori ai vasului creand o cultura de celule aderente.

Majoritatea celulelor derivate din tesuturi solide sunt aderente si cresc in culturi bi-dimensionale (in monostrat).

•Culturi de celule aderente sau in suspensie

•Culturi celulare in suspensie culturile derivate din sange (ex.

limfocitele) cresc in suspensie multe celule canceroase -linii

celulare ( accesibile comercial) - adaptate sa creasca in

pentru a se obtine suspensie concentratii mai mari de celule. -

culturile de celule de insecte necesita agitare pentru

omogenizarea mediului

•Caracteristici

O cultura primara reprezinta o populatie heterogena de celule;

• in conditiile concrete de cultivare unele celule vor muri,

• altele vor creste lent,

• iar altele vor creste rapid constituind tipul dominant de celule.

In timp, celulele vor creste pana cand vor umple suprafata disponibila (stare de confluenta) cand apare inhibitia de contact. In acel moment incepe pasarea culturii prin care se va realiza purificarea celulelor din cultura.

Celulele culturilor primare au o viata limitata (exceptie culturi de celule derivate de la tumori). Dupa un numar de dedublari a populatiei celulare (limita Hayflick), celulele sufera un proces de senescenta, diviziunea inceteaza, iar celulele mai ramin vii o perioada de timp.

Exista celule (macrofagele si neuronii) care nu se divid in vitro si pot exista numai ca niste culturi primare

Culturile de celule izolate direct dintr-un tesut

Cultura primara

•

Celulele sunt mentinute in cultura intr-un incubator care pastreaza constanta temperatura, umiditatea, amestecul gazos (comun, 37oC, 5% CO2, celule mamaliene).

Conditiile de cultivare variaza mult de la un tip celular la altul, in functie de fenotipul exprimat.

Celulele sunt mentinute in stare viabila intr-un mediu de crestere a carui compozitie variaza cu tipul celular. De regula un mediu de crestere contine substante nutritive, glucoza, factori de crestere, un anumit pH. Cea mai comuna sursa de factori de crestere este serul fetal de vitel.

Celulele cresc in recipiente speciale, sterilizate: flascuri, placi Petri, placi multi-well de diferite dimensiuni si volume.

Plating density PD (nr celule/volum mediu cultura) joaca un rol critic in evolutia culturii. – Fenotip – orice caracteristica observabila la un organism (morfologica, biochimica...)

– Factor de crestere – o substanta naturala capabila de a stimula cresterea, proliferarea si

diferentierea celulara (de regula un hormon)

Mentinerea celulelor in cultura

Celulele aderente necesita o suprafata pe care sa se ancoreze in vitro (sticla,

plastic, metale).

•Recipientele de sticla – slide-uri, tuburi, flascuri, usor de spalat si sterilizat,

permit observarea microscopica a culturii; sticla fabricata de

aluminoborosilicat (Pyrex) este preferata sticlei obisnuite care elibereaza ioni

alcalini in mediu.

Recipientele de plastic (polistiren,

polietilena, policarbonat policlorura de

vinil, teflon, etc) nu sunt autoclavabile

(unica folosinta).

In scopul imbunatatirii performantelor in atasarea

celulara, formarea unor suprafete biomimetice,

suprafetele interne ale flascurilor de cultura au fost

acoperite cu proteine : componente ale ECM (colagen,

laminina si fibronectina), mucopolizaharide (heparin sulfat,

hialuronat, condroitin sulfat) sau polimeri sintetici bazici ca

poli-D-lizina

•Suporturi cu suprafete biomimetice

•

•10/23/2012 •10/23/2012

Mediul de cultura si schimbarea lui

Sute de medii de cultura . . .

•Ex. – Mediul bazal EMEM (Eagle's minimal essential medium) este un mediu pentru

multe tipuri celulare – Mediul DMEM (Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium) contine

aminoacizi (in special glutamina), vitamine, glucoza, sisteme tampon pH, indicator de pH (Phenol red), etc – permite cresterea multor tipuri de celule conjunctive, poate fi suplimentat specific cu hormoni, factori de crestere (ser) – viata limitata, filtrat steril, diluat steril – firme producatoare de medii de cultura.

•In cazul culturilor aderente, mediul trebuie schimbat: indeparat direct prin aspirare si inlocuit cu mediu proaspat

Culturile celulare sunt

inspectate zilnic la un microscop

in contrast de faza la care este

adaptat un aparat de fotografiat

•10/23/2012

•Curba de crestere a celulelor in cultura.

1. Faza lag - prima faza a cresterii dupa insamantarea celulelor, de crestere lenta cand celulele se adapteaza la mediul de cultura.

2. Faza log (logaritmica) in care celulele prolifereaza exponential si consuma substantele nutritive din mediul de crestere.

3. Faza platou (stationara) – componentele nutritive au fost epuizate sau celulele au ocupat toata suprafata accesibila (strat monocelular) celulele intra in ultima faza, cand proliferarea este redusa sau inceteaza

Variatia densitatii celulare cu timpul cultivarii are un aspect semi-logaritmic.

•10/23/2012

•Manipularea culturilor de celule

Deoarece celulele continua sa se divida in cultura, ele

cresc si umplu toata suprafata (volumul) accesibila

(celulele ajung la confluenta)

In cursul acestui proces au loc:

– - diminuarea nivelului substantelor nutritive din mediu (scade pH mediului, indicator de pH):

– contactele celula-celula stopeaza ciclul celular– inhibitie de contact; pot apare procese de diferentiere, senescenta acumularea de celule apoptotice/ necrotice.

•Printre cele mai comune manipulari: schimbarea mediului, pasarea celulelor si transfectia lor – toate realizate in conditii sterile, pentru a evita contaminarea

•Pentru realizarea conditiilor sterile: Introducerea de antibiotice (penicilina, streptomicina) si antifungice (amphotericin B) – in mediul de cultura

•-

•monostrat confluenta

•

•Hota cu flux laminar

•Pasarea celulelor

Subcultivarea celulelor din cultura primara permite celulelor sa traiasca in cultura

pentru perioade mai lungi de timp, evitandu-se senescenta

Exemplu: Pasajul incepe cu un flasc care contine un volum de 12 ml mediu care contine celule la 80-90 % confluenta (sunt aderate pe peretele bazal al flascului.

Celulele sunt desprinse de pe peretele flascului de regula prin tratament cu un amestec tripsina-EDTA

Suspensia celulara este repartizata in volume egale in alte 3 flascuri de cultura/placi Petri si se aduce la volumul de 12 ml cu mediu proaspat. Cele trei flascuri noi sunt plasate in incubatorul de celule (37oC, 80 % umiditate, 5 % CO2) si incubate pana cand celulele ajung din nou la confluenta

Cultura secundara

o cultura care deriva dintr-o cultura primara, ce a suferit cel putin un pasaj

Majoritatea celulelor din culturi secundare se divid de un numar finit de ori, dupa care mor.

Pe masura ce purificarea tipului celular determinant, dar apar si modificari morfologice si functionale caretrebuie sa fie monitorizate pentru succesul unui experiment de inginerie tisulara .

Senescenta celulara este caracterizata in primul rand prin scaderea capacitatii proliferative a celulelor.

Ex. culturile de fibroblaste din derma umana .

Dupa un numar limitat de diviziuni celulare (30-50 cicluri, daca celulele sunt izolate din pielea unui adult tanar) scade treptat viteza cresterii si proliferarii celulare .

Activitatea chemotactica a fibro - blastelor scade progresiv dupa pasajul 25. Culturile de fibroblaste destinate vinde - carii ulcerelor venoase nu dau randamente bune daca sunt folosite la pasaje prea mari (> 5).

Celulele canceroase (si celulele transformate):

• cresc mai usor si intr-un mediu mai simplu decat celulele normale;

• nu prezinta inhibitie de contact; odata ce suprafata discului este acoperita, celulele continua sa se divide si sa formeze structuri multistratificate;

• prolifereaza nedefinit (nemuritoare).

•Ex. Celulele HeLa – cea mai veche linie celulara, separata in 1951 dintr-o tumora canceroasa (carcinom cervical) a colului uterin, de la o femeie Henrietta Lacks de 31 ani, utilizata si astazi in toate tarile lumii.

•Culturi de celule canceroase

Celulele HeLa sunt aderente si nu prezinta inhibitie de contact

introducere deliberata a acizilor nucleici (DNA si RNA) in celule, in scopul exprimarii unei proteine de interes – tehnica presupune deschiderea temporara a unor pori in membrana celulelor prin diferite metode, pentru asimilarea materialului genetic.

•

Un organism transgenic – modficat cu materialul genetic al altei specii, modificarea este transmisa generatiilor viitoare

Transfectia

-o tehnica este si lipofectia care utilizeaza lipozomi

ce poarta DNA, fuzioneaza cu membrana

celulelor şi permite

transformarea celulei.

Aplicatii: biosinteza unor anumite proteine (ex.

productia de insulina), strategii de terapie

genica, generarea de organisme transgenice,

etc.

•Culturile celulare pot fi finite sau continuui.

•O cultura celulara finita este capabila de un numar limitat de dublari ale populatiei dupa care proliferarea celulara inceteaza.

•O cultura celulara continua are celule capabile de un numar nelimitat de dublari ale populatiei, deci este o cultura de celule imortalizate.

•Liniile celulare formeaza culturi celulare continuui, care nu prezinta inhibitia de contact, prolifereaza nedefinit si devin imortalizate, se formeaza din culturi primare prin procedee complicate.

•Unele specii, ca rozatoarele dau nastere usor unor linii celulare, in timp ce altele dau nastere greu (tesuturile umane) sau deloc (tesuturile aviane) unor linii celulare.

•liniile celulare umane sunt controversate din punct de vedere bioetic, este necesar acordul pacientilor de la care se recolteaza piese din corpul lor pentru cercetari stiintifice

Linii celulare

DSMZ realizeaza urmatoarele activitati:

• achizitia de linii celulare

• controlul identitatii si calitatii

• expansiunea celulelor

• caracterizarea celulelor

• conservarea prin congelare in azot lichid

• stocarea celulelor in vials

• colectarea datelor relevante in banci de date

• distributia liniilor celulare la cerere

• cercetari

•Firme producatoare de linii celulare stabilizate

•American Type Culture Collection (ATCC), •European Collection of Cell Cultures (ECACC), •German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) etc

Culturile 2-D pot fi insamantate pe/ in suporturi 3-D poroase si pot forma culturi 3-D.

Ex.hidrogelurile sunt geluri sintetice 3-D ce pot fi utilizate in culturi 3-D pentru a mima

structura ECM, cu aplicatii deosebite in ingineria tisulara..

Culturile celulare aderente, primare si secundare, sunt culturi bi- dimensionale care cresc intr-un monostrat de celule.

Culturi celulare 2-D si 3-D

Prevenirea contaminarii

Contaminare chimica (medii, ser) cu ioni metalici, endotoxine; impuritati din gazele incubatoarelor cu CO2, reziduri (germicide, pesticide) de la dezinfectarea echipamentelor, detergenti de la spalarea sticlariei, etc

Contaminarea biologica: bacterii, fungi, drojdii. Mycoplasma

Preventie tehnici aseptice , facilitati de

spalare si sterilizare , arii sterile,

antibiotice , apa sterila , etc personal

instruit si autorizat

•Sterile work area

•

•Facilitati de sterilizare

•Sistem de purificare a •apei si de obtinere a apei ultrapure Millie-Q

•Distilare, osmoza inversa, nanofiltrare

•

•Crioconservarea culturilor celulare

•Camera frigorifica Deep-freezer

•Congelate pentru stocare in faza de crestere in mediu + dimetilsulfoxid

• Cross contaminarea – co-prezenta unui alt tip celular, problema deosebite pentru acuratetea cercetarii in fdomeniu

• Problema a fost detectata la liniile celulare utilizate curent in studii de screening a unor medicamente.

• Companiile trebuie sa prezinte la livrare buletine de analiza a cross- contaminarii. In momentul de fata ATCC utilizeaza tehnica short tandem repeat (STR) DNA fingerprinting pentru autentificarea liniilor celulare.

• Mai mult, verificarea unei linii celulare trebuie realizata si in laboratoarele de cercetare dupa dezghetarea stocurilor de linii celulare, la fiecare doua luni in timpul tehnologiei de cultivare si inainte de publicare a datelor experimentale.

• Alte metode de analiza a cross-contaminarii: tiparea HLA (human lymphocyte antigen), analiza cromozomiala, kariotiparea, etc

Cross- contaminarea liniilor celulare

•Evaluarea cantitativa a celulelor in cultura

•Metodele directe: evaluarea numarului celulelor

•Lama de numarare, microscop in contrast de faza •Counter electronic Coulter

•Metode indirecte: evaluarea continutului in DNA, proteine

•Determinarea viabilitatii celulare

•Eliberarea LDH in mediu

Aplicatii

1. Sisteme model:studii fundamentale privind inter-relatiile dintre celule si boli, efectele unor medicamente, procesul de imbatranire

2. Cercetarea cancerului: studiul diferentelor dintre o celula normala si o celula canceroasa, transformarea unei celule normale utilizand radiatii, substante chimice si virusuri, mecanisme care conduc la tranformarea maligna, medicamente care distrug celulele canceroase, etc

3. Virologie: culturile de celule animale sunt utilizate pentru a replica virusurile pentru productia de vaccinuri, pentru a detecta si izola virusuri, pentru a studia cresterea si ciclul de dezvoltare a virusurilor, studiul mecanismelor de infectie, etc

4. Testarea toxicitatii: studiul efectelor noilor medicamente, cosmetice asupra supravietuirii, cresterii unor tipuri celulare, dozarea cantitatii maxime permise Productia de vaccinuri: polio, rabie, varicela, pojar, hepatita B Productia de proteine prin inginerie genetica: anticorpi monoclonali, insulina si alti hormoni

Aplicatii

5.Inlocuiri de tesuturi sau organe: piele artificiala pentru vindecarea ulcerelor metabolice si a arsurilor

6.Consiliere genetica: cultura de celule fetale extrase de la o femeie gravida permite evidentierea unor anomalii cromozomiale, detectarea timpurie a unor maladii fetale

7.Inginerie genetica: culturile de celulele animale pot fi utilizate pentru introducerea unui nou material genetic in celule si studiul expresiei noilor genesi efectul lor asupra sanatatii celulei

8.Terapie genica: culturile de celule animale pot fi modificate genetic pt a fi utilizate in terapia genica. Sunt indepartate celule de la un pacient caruia ii lipseste o gena functionala. In celula se corecteaza defectul genetic, noile celule se cultiva si sunt transplantate la pacient.

9.Screening si dezvoltare de medicamente:studiul citotoxicitatii unor noi medicamente

•

•Cultura si ingineria tisulara

•Culturile de celule – componenta fundamentala a ingineriei tisulare •– “intelegerea principiilor cresterii tesuturilor si aplicarea lor pentru ameliorarea

•sau inlocuirea unor tesuturi” •Aplicatii: ficat bioartificial (hepatocitele viabile), pancreas artificial

•(celule insulare care produc si regleaza productia de insulina la diabetici, vezi-

•ca biliara artificiala , tesut cartilagi -

•nos •( reparare cartilaj genunchi ),

•piele •artificiala ( celule din pielea

•umana •crescute in gel de cola -

•gen), •maduva osoasa artificiala

•Alogenice: organismele donor si receptor apartin aceleasi specii

Xenogenice : celule izolate de la organisme donor din alte specii decat organismul receptor

•celule stem

•celule

Singenice sau isogenice: organismele donor si receptor sunt genetic identice

•Autoloage: organismul donor este acelasi cu cel acceptor

•Strategii in terapia unor defecte tisulare:

1. celule singure;

2. scaffold singur;

3. Culturi celulare 3-D in scaffold – in prezenta •unor factori de crestere

•Probleme majore

•Sursa celulara: celule mature, progenitor celule stem – din tesuturi umane

•Studiul efectelor unor factori de mediu si a conditiilor de cultivare asupra cresterii si diferentierii celulare

•Dezvoltarea de noi biomateriale 3-D cu diferite arhitecturi si compozitii bazate pe compusi sin-tetici sau naturali ce permit atasarea, cresterea si diferentierea celulelor

•Indepartarea gradata a biomaterialului si inlocuirea lui cu tesutul regenerat, functional

•

•Culturi de celule stem

•Celulele stem pot fi cultivate intr-un mediu artificial si transformate (diferentiate) la tipul celular dorit

In stroma BM – 2-5 celule stem MSC la 1 milion de celule nucleate – cu rol crucial in

formarea si regenerarea stromei BM

Materialul start – alicote de BM obtinute de la donori sanatosi ce sufera aspirarea

BM pentru transplantul maduvei alogenice (donor similar genetic, dar nu identic)

hMSCs pot fi izolate dintr-un monostrat dupa separarea BM prin centrifugare

in gradient de densitate. Dupa insamantare, la mica densitate, intr-un mediu bazal

suplimentat cu 10 % ser fetal bovin (FBS), populatia celulara aderata la plastic

reprezinta sursa ex vivo primara de MSC

Analiza la microscopul optic sau in contrast de faza arata o populatie de celule

MSC relativ omogena cu un fenotip tip fibroblastic

Dupa subcultivare, MSC manifesta un inalt potential expansiv si variabil.

Unele preparate MSC sufera peste 15 dedublari celulare, altele isi inceteaza

replicarea dupa maximum 4 dedublari – diferente datorate numarului mic de

MSC in BM, varsta, alte particularitati ale donorului

Izolarea MSC

•ISCT (International Society for Cellular Therapy) recomanda utilizarea termenului de Multipotent mesenchymal stromal cells pentru acronimul MSC daca celulele respective indeplinesc urmatoarele criterii:

1. Adera pe vase de plastic in conditii de cultura standard

3. Potential de diferentiere multipotent in vitro in osteoblaste, adipocite, condrocite

•2. Exprima specific antigene pe suprafata celulei

•Pozitiv > 95 % Negativ < 2 %

•CD105, CD73, CD90

•CD79sau CD19, HLA-DR

•CD45, CD34, CD14 sau CD11b

MSC – human multipotent mesenchymal stromal cells

substante capabile, in conditii adecvate, de a induce un raspuns imun specific si de a

reactiona cu produsii acestui raspuns, anticorpii

determinant antigenic - portiunea din moleculele proteice sau polizaharidice care se combina cu anticorpul

Antigenele CD (Cluster of Differentiation), exprimate de leucocite, markeri de pe suprafata celulelor, utilizati in distingerea unor linii celulare (cell lineages), a stadiilor de dezvoltare, identificati cu anti-corpi monoclonali specifici

Antigenele CD pot fi receptori, glicani, molecule de adeziune, enzime legate la membrana

Antigene

Criterii pentru demonstrarea MSC umane

(Dominici et al., 2006)

1. MSC trebuie sa fie celule care adera la plastic cand sunt mentinute in

conditii de cultura standard (numai un subset de MSC isi mentin aceasta

proprietate)

2. > 95 % din populatia MSC trebuie sa exprime CD105 (endoglin,

recunoscut initial de MAb SH2), CD73 (ecto 5’-nucleotidaza recunoscuta initial de

MAb SH3 si SH4) si CD90 (numit si Thy-1) evaluate prin flow citometrie; in

contrast cu celulele stem hematopoietice MSC trebuie sa piarda expresia

unor antigene hematopoietice CD45, CD34, CD14 (CD11b), CD79(CD19) si

HLA clasa II (< 2 % pozitive)

3. Celulele se pot diferentia in osteoblaste, adipocite si condroblaste in

conditii standard de diferentiere in vitro (formarea osteoblastelor –

demonstrata prin colorare cu Alizarin Red sau von Kossa; diferentierea

adipocitelor – colorare cu Oil Red O; diferentierea condroblastelor – colorare cu

Alcian blue sau imunohisto pentru colagen tip II

•Detectia fluorescentei la un flow-citometru dupa

sortarea celulelor

•Flow ctometria permite studiul unei singure celule, sortata pe baza unor caracteristice fizice, biochimice si antigenice, prin masuratori de fluorerscenta

•Identificarea mai multor markeri prezenti pe suprafata celulei

demonstreaza existenta unui tip celular stem si permite chiar izolarea lui

dintr- o populatie celulara heterogena

•Se observa diferente in expresia antigenelor de pe suprafata celulara Intre celulele umane si celulele unor specii animale

Intre tipurile de tesuturi la aceeasi specie (om) cu metoda de izolare si cultivare pe

parcursul pasajelor initiale in schitele de expresie in vitro si in vivo

•Fenotiparea celulelor pe baza studiului unui numar mare de markeri de

suprafata - garantia rezultatelor unei cercetari pe MSCs

•Celulele MSC au fost identificate si in alte tesuturi ale organismului adult: sangele periferic, periost, tesuturi muscular, adipos si cartilaginos, in plamani, sistemul nervos centrral, ficat, splina, timus, pulpa dentara, placenta, etc, s-a demonstrat capacitatea acestor celule de a se diferentia in alte linii celulare decat cele mezenchimale (hepatocite, celule renale, astrocite) ceea ce ridica probleme de nomenclatura.

•Izolarea si utilizarea acestror probleme nu ridica probleme etice sau de tumorigenicitate ca CS embrionare, dand sperante utilizarii lor in terapia unor maladii

•Celulele stem pot parasi tesutul de origine (niche) si pot circula in fluxul sangvin, unde gasim atat MSC cat si HSC

•In tesuturile fetale frecventa MSC este mai mare decat in tesuturile adulte, izolate din in primul trimestru (sangele, ficatul, BM fetala) si din plamani in al doilea trimestru

•Fluidul amniotic (al 2-lea trimestru) - o sursa bogata in MSCs fetale ce manifesta un fenotip si un potential de diferentiere similar cu cel al MSC izolate postnatal din BM utilizate terapeutic.

Alte surse de MSC

•Diferentierea in vitro a MSCs

Metoda clasica de diferentiere a MSCs in osteoblaste - incubarea unui

monostrat confluent de MSCs cu acid ascorbic, β-glicerofosfat si

dexametasone timp de 2–3 saptamani. MSCs formeaza noduli de

tesut osos ( colorati cu Alizarin Red si prin tehnica von Kossa ),

are loc cresterea expresiei fosfatazei alcaline (FA) si a acumularii

de calciu – indici ai osteogenezei. Investigarea BMP (bone

morphogenic proteins) – indice al osteogenezei.

A) RT-PCR pentru osteo-c a lc i na s i

f os f a t aza alcalina (FA);

B) Colorarea cu Alizarin Red a depo-zitelor

de fosfat de Ca produse de osteoblastele

diferentiate;

C) colorarea pentru FA in culturi deMSC

si respectiv osteoblaste

Metoda clasica de diferentiere a MSCs in adipocite consta in incubarea culturilor de

MSC cu dexametasona, insulina, isobutil metil xantina si indometacin.

Acumularea de vacuole pline cu lipide se monitorizeaza fie la microscopul optic, fie

prin colorare cu Oil Red

Metoda clasica de diferentiere a MSCs in condrocite consta in centrifugarea MSCs,

cultivarea micromasei sedimentate in prezenta TGF-β (transforming growth factor-β).

Peletul celular se dezvolta intr-o forma multistratificata, bogata in matrice, motiv

pentru care diferentierea este monitorizata histologic prin colorare cu toluidine blue

sau Safranin-O, care indica abundenta glicozaminoglicanilor in matricea extracerlulara si

productia colagenului tip II, tipic cartilajului articular (imunocolorare).

Diferentierea hMSCs in vitro: condro • genica (A) - colorare imuno pt colagen

• II; osteogenica (B) colorare Kossa;

• adipogenica (C-H) colorare Red Oil

•

•Proprietatile diferite ale sistemelor hematopoietic si stromal

•Sistemul hematopoietic •Sistemul stromal din BM

•Celule stem

•(nu se reinoiesc continuu in mod necesar)

•Se formeaza la anumite perioade de timp

•Faza solida

•Viata lunga

•Structuri complexe

•(multicelulara , legate la matrice)

•Fenotip plastic

•Celulele stem ce se reinoiesc

•continuu

•Se formeaza continuu

•Faza fluida

•Viata scurta

•Structuri simple

•( unicelulare , fara matrice)

•Fenotip inflexibil

•BM – bone marrow

•10/23/2012 •10/23/2012

•APLICATII

•10/23/2012

•Utilizarea MSC in terapia umana

•10/23/2012

•Tratamentul chirurgical post-traumatic sau a defectelor osoase

•neoplazice - problema majora a practicii ortopedice. Succesul aplicatiei depinde de

co-prezenta unor factori osteoinductivi ( induc osteogeneza) si

osteoconductivi (permit migrarea, atasarea si proliferarea celulelor, diferentierea

celulelor osteoprogenitor)

•Defecte extinse la nivelul tesuturilor moi dupa arsuri profunde, rezectii de tumori

sau traume sunt probleme inca nerezolvate in chirurgia plastica si reparatorie

deoarece nu sunt accesibile inca materiale implant ce pot corec ta cu succes

aceste defecte.

•O solutie promitatoare utilizarea celule precursor adipogenice, imature,

numite preadipocite, implantate pe biomateriale 3D

•Leziunile traumatice si maladiile degenerative ale T cartilaginos, corelate cu varsta -

problema majora de sanatate a populatiei umane, nerezolvata dat orita

capacitatii limitate de auto-regenerare a TC (nevascularizat si neinervat), la care

mecanismele normale de reparare tisulara si recrutarea celulelor

stem/progenitor la situsul leziunii nu functioneaza. Mai mult densitatea

celulara mica din TC reduce probabilitatea participarii condrocitelor locale la

auto-regenerare

•Tratamentul major al sterilitatii

De regula sunt creati mai multi embrioni, sunt pastrati numai cei “ sanatosi”, cei cu defecte sunt distrusi. Se implanteaza 2-4 embrioni pentru a creste sansa... Embrionii care nu sunt folositi pot fi congelati pentru a fi utilizati in viitor . La dezghetare 50 % din embrioni mor. Zeci de mii de embrioni sunt distrusi in cursul terapiei unui cuplu , pana la final

•

Clonarea terapeutica - Somatic cell nuclear transfer (SCNT)

1. De la o persoana cu defect tisular – se preleveaza tesut (piele) din care se separa celule de la care prin soc electric se izoleaza materialul nuclear

2. De la un ovul uman se indeparteaza nucleul

3. In ovulul denucleat se introduce materialul nuclear de la 1 rezultand o celula totipotenta ce contine informatia intregului organism

Celulele stem rezultate pot fi diferentiate la celule specializate ce pot fi utile in tratamentul unor maladii severe.

•10/23/2012

•1996 – Primul mamifer clonat din celule adulte – oaia Dolly

•2001 – Primul embrion uman creat (are 6 celule) de Advanced Cell Technology (USA)