Microorganisme - surse de proteine

Curs 2

Ipoteze de plecare

• World Watch Institute (1993): productia de grâne a scazut din 1984 cu 8 % din cauza micsorarii suprafetelor de pamânt arabil, a apei si a fertilizatorilor.

• Similar: productia de carne si peste, in timp ce populatia creste cu o rata de 100 milioane pe an. Pentru anul 2030 se prevede o populatie de 5.5 miliarde iar pentru 2050, 9 miliarde.

• nevoia de a utiliza resursele existente cât mai eficient si de a crea altele noi.

• Resursele insuficiente de proteine în alimentatia mondiala - au stimulat productia acestora pe cale de biosinteza , folosind culturi de drojdii si bacterii. Proteinele astfel obtinute , functie de compozitie, continut de saruri minerale, vitamine, incarcare microbiana, insusiri senzoriale si alte caracteristici, sunt de tip furajer sau alimentar.

Cultivarea de microorganisme, pe scara larga, pentru obtinerea proteinelor microbiene cu valoare nutritiva - solutie a penuriei alimentare din Germania, in timpul primului razboi mondial.

La Berlin s-au pus la punct primele procedee de cultivare pe scara larga a drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae), care era incorporata, mai ales, in supe si cârnati.

• Unele levuri - Candida arborea si C. utilis –proteine in Germania in timpul celui de-al 2-lea razboi mondial.

• In cursul anilor ‘60, - “proteine din organisme monocelulare” (POU), sau single-cell proteins (SCP), era utilizata pentru produsii de origine microbiana, = biomasa de levuri sau de bacterii, destinata alimentatiei umane sau animale.

Culturile mai des folosite pentru obtinerea de proteine din organisme monocelulare sunt drojdiile din genul Candida,speciile C. utilis, C. lipolytica si C. maltosa;

Pe medii de metanol si gaz metan se folosesc culturi de Hansenula polymorpha, Pseudomonas methanicus;

Pe mediile din deseuri celulozice - culturile mixte de Cellulomonas si Alcaligenes.

Pentru proteinele din alge se folosesc culturi de Spirulina maxima si Scenedesmus acutus.

Folosirea microorganismelor la producerea de proteina ofera numeroase avantaje:

- continut ridicat de proteina de buna calitate;- suprafete mici de productie;- usurinta în controlul calitatii produsului finit;- posibilitatea selectarii de tulpini inalt producatoare;- utilizarea ca sursa organica de carbon a reziduurilor si

subproduselor din industria alimentara.

• Microorganismele utilizate ca sursa de proteina sunt bacteriile, drojdiile , mucegaiurile si algele.

• Se cunoaste un mare numar de microorganisme monocelulare aerobe (bacterii, drojdii, unii fungi), denumite chimiorganotrofe , capabile sa metabolizeze hidrocarburi, alcooli, derivati celulozici, zaharuri, deseuri alimentare prin care sa se obtina concentrate proteino - vitaminice. Au fost testate peste 2000 de varietati de microorganisme, dar numai o mica parte a putut fi aplicata în culturi la scara industriala.

Tabel 1. Tipuri de microorganisme utilizate pentru biosinteza proteinelor din

hidrocarburi

Bacterii Arthrobacter reseoparaffineaus Micrococcus cerificans

Arthrobacter paraffineus Micrococcus paraffinolactus Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa

Corynebacterium hydrocarbocastus Bacillus megaterium etc. Levuri (Drojdii)

Candida lipolytica Candida arborea Candida dulcherina Candida tropicalis etc.

Candida utilis Hansenula anamola Candida pelliculosa .

Fungi Aspergilius niger Penicillium notatum Aspergillus glacus Penicillium griesofulvum etc. Aspergillus oryzae

• Procesele tehnologice pentru fabricarea de proteine din organismele monocelulare = asemanatoare cu cele practicate la producerea de drojdie comprimata, ultimele faze constând din plasmoliza si uscarea biomasei (de cele mai multe ori prin pulverizare).

• Se folosesc plamezi din productiile curente sau ameliorate (uneori sterilizate), precum si tehnici de multiplicare a biomasei în trepte, în conditii puternic aerobe.

• Capacitatile zilnice de productie au ajuns la 50 t produs finit cu 10 % s.u., cu tendinta de crestere la 200 t.

• Culturile de microorganisme pentru produse alimentare se obtin din specii de Saccharomyces cerevisiae si Kluyveromyces fragilis, Candida lipolytica, C.tropicalis si C. utilis si Endomycopsis fibuligera .

• drojdiile au fost cele mai studiate în vederea obtinerii de biomasa, respectiv proteina, deoarece lipsa lor de toxicitate pentru organismul uman si animal a fost deja verificata si confirmata în timp.

• Drojdiile - continut de proteina de 46-56 %.Când este folosita biomasa ca atare, drojdiile furnizeaza vitamine din grupul B, ergosterol si alte substante biologic active.

• Sunt utilizate drojdiile din genurile: Candida (cea mai importanta - Candida utilis), Hansenula, Torulopsis, Pichia.

• Spre deosebire de bacterii, drojdiile au avantajele unei separari mai usoare de mediu, datorita dimensiunilor celulare mai mari si acela de a avea un continut mai redus de acizi nucleici .

• La baza procedeului producerii de biomasa de catre drojdii sta fenomenul cunoscut sub numele de efect Pasteur = adica inhibarea fermentatiei prin respiratie.

• Pentru aceasta, drojdia se cultiva în conditii de aerare intensa, concentratia de zahar din mediu fiind mentinuta la un nivel scazut, pentru evitarea formarii de alcool, în favoarea producerii de biomasa.

• la producerea drojdiei comprimate cu S. cerevisiae sta acelasi principiu care sta si în prezent la baza procedeelor folosite în fabricile de drojdie furajera si alimentara, care folosesc glucide ca sursa de carbon.

• De asemenea, drojdiile au un continut ridicat de vitamine din grupa B, remarcându-se, în mod deosebit, genul Candida

Continutul în vitamine din grupa B a unor drojdii alimentare (în mg/ 100 g substanta

uscata)

Vitamine Candida arboreea Candida tropicalis Candida utilis Pe borhot de

melasa Pe borhot de melasa Borhot Borhot + 33 %

melasa Tiamina B1 2.32 - 2.96 3.77 - 9.43 2.75 – 7.79 1.76 - 3.65 Riboflavina 5.10 - 9.64 4.67 - 6.45 2.89 – 7.10 6.86 - 13.0

Niacina 53.51 - 59.1 46.6 - 51.13 45.57 – 60.88 67.23 - 84.15

Tehnologia obtinerii drojdiei pe produse petroliere s-a dezvoltat în doua directii:

- cultivarea drojdiilor pe petrolul brut, conform procedeului de la Lavera, care realizeaza, în acelasi timp, deparafinarea petrolului si,

- dezvoltarea drojdiilor pe n-parafine purificate, dupa procedeul laboratorului Grangemouth (Scotia).

Principalele etape de obtinere a concentratului de proteine-vitamine, reprezentat de drojdia furajera si alimentara, sunt

urmatoarele:

1. Pregatirea inoculului : se pleaca de la o cultura pura de drojdie (C. utilis sau alta specie de Candida) obtinuta pe malt-agar sau pe geloza glucozata cu adaos de extract de drojdie.

2. Producerea biomasei de drojdie care cuprinde trei faze: - faza initiala - drojdia trece din starea latenta în starea de inmugurire;- faza acumularii biomasei de drojdie - cresterea biomasei, se

realizeaza prin aparitia continua de generatii noi de celule, care se inmultesc prin inmugurire;

- faza finala - maturarea celulelor de drojdie.3. Separarea biomasei de mediul de cultura .4. Purificarea.5. Prelucrarea biomasei.

Drojdia furajera si alimentara

• un praf uscat, galbui-brun;• gust si miros caracteristic;• umiditate de 7-8 %;• 50% proteine, 25-35% glucide, 6% acizi nucleici,

6-8 % substante minerale, 2-3 % lipide, precum si vitamine din grupul B.

• Continutul de acizi nucleici este destul de ridicat si, de aceea, pentru reducerea lui, dupa ruperea peretilor celulari, se aplica diferite procedee: tratare cu amestec de NaCl si acetat de sodiu sau cu amestec de metanol, sau etanol si HCl; tratare cu amoniac apos; tratament termic combinat cu RNA-aza pancreatica.

• Continutul ridicat de proteine si vitamine din complexul B recomandã utilizarea de drojdii alimentare în:

- agenti nutritivi pentru suplimentarea aportului de proteine valoroase din alimentatie;

- în diete cu uz terapeutic;- în cure de slãbire (înlocuind hidratii de carbon

din alimentatie);- întãrire a aromelor si ameliorare a gustului, de

tip, hidrolizate proteice. S-au izolat tulpini de microorganisme capabile a

mãri continutul de grãsimi sau al anumitor aminoacizi (metioninã si cistinã) si, în special, de vitamine. Prin iradierea cu radiatii UV, ergosterolul din drojdie este convertit în calciferol, respectiv în vitamina D2

Adaugarea a 5 % drojdie uscata in paine amelioreaza cu 30-40%valoarea biologica a acesteia.

Saccharomyces cerevisiae si Kluyveromyces fragilis influenteaza proprietatile de panificatie ale fainii.

Saccharomyces cerevisiae prin tripeptidul glutation provoaca inmuierea aluatului.

Productiile mondiale de drojdii uscate inactive sunt de circa 187 mii tone/ an.

Continutul de proteine al drojdiilor alimentare:- variazã între 45% (din drojdie de bere dezamãrâtã) si 54% (din

zer); - Proteinele se compun din 80% aminoacizi, 12% acizi nucleici si

8% derivati de amoniu;- s-a testat Candida tropicalis pentru obtinerea de biomasa

proteica, utilizând ca substraturi amidonul de porumb sau pudra de cassava, fara ca acestea sa fie hidrolizate în prealabil.

- C.tropicalis contine α-amilaza necesara hidrolizarii amidonului. Amestecul de biomasa si porumb sau cassava reziduale contine 20% proteine, care poate constitui o sursa de echilibrare a balantei proteice.

Datorita vitezei mari de multiplicare, bacteriile se preteaza foarte bine pentru obtinerea, cu randament ridicat, a proteinelor prin biosinteza.

Cele mai folosite materii prime sunt: 1. deseurile celulozice (Cellulomonas sp.);2. n-parafinele din petrol;3. metanul si metanolul.Proteina comerciala PRUTEEN, produsa de

Imperial Chemical Industries (Anglia), este obtinuta din metanol cu bacteria obligat metilotrofa Methylophilus methylotrophus.

Ca si la drojdii, si la bacterii se pune problema reducerii continutului de acizi nucleici celulari.

• Se constata ca proteina bruta este prezenta în celulele microorganismelor în cantitati mai mari decat în produsele conventionale.

• Referitor la continutul în aminoacizi esentiali se retine aportul important de lizina , adus în special de drojdii. Proteinele din bacterii contin mai putina lizina.

• O importanta practica deosebita o prezinta Cyanobacteriile din genurile Nostoc, Oscillatoria, Spirulina.

• Speciile de Spirulina platensis, prezinta niste avantaje certe pentru obtinerea de proteina.

• Bacteriile au un continut mare de proteina de buna calitate cu un continut ridicat de lizina, metionina si triptofan.

• Cele mai utilizate sunt:- bacteriile aerobe din genurile: Pseudomonas , Micrococcus,

Corynebacterium, Klebsiella, Arthrobacter, Brevibacterium, Methylomonas, Methylophilus, Metylococcus;

- bacteriile celulozolitice din genul Cellulomonas; - bacteriile albastre-verzi din genurile: Nostoc, Oscillatoria,

Spirulina.• Pentru producerea de L-lizina se utilizeaza culturi din tulpini

de Enterobacter aerogenes sau Escherichia coli, iar în ultimul timp, un mutant de Corynebacterium glutamicus pe mediu de melasa.

• Bacteriile prezinta dezavantajul de a contine o cantitate mare de acizi nucleici (10-20 %) care pot produce perturbari in metabolismul acidului uric in organismul animal, precum si costul ridicat al separarii celulelor din mediu, din cauza dimensiunilor celulare mici.

Mucegaiurile contin 20- 40 % proteine si vitamine din grupul B. Cele mai folosite pentru obtinerea de proteine sunt genurile Rhizopus, Penicillium, Fusarium.

• Folosirea mucegaiurilor ca sursa de proteine este avantajoasa, deoarece permite o usoara separare de mediu, si continutul lor in acizi nucleici este mai mic decât in cazul drojdiilor si bacteriilor.

• Proteinele din ciupercile cultivate submers au valoare biologica asemanatoare cu a proteinelor din drojdii, aminoacizii limitanti fiind cisteina si metionina.

• Miceliul de ciuperci poate fi folosit în alimentatia umana, deoarece reprezinta un aliment traditional.

• Bazele stiintifice ale culturii în masa a microalgelorau fost puse la Stanford (S.U.A.), la Essen (Germania), dupa anii 1948. Rezultatele practice ale acestor cercetari au permis obtinerea culturilor de Chlorella în conditii pilot cu fabricarea unei faini de alge, acceptata de consumatorii japonezi.

• In India, Peru si Tailanda - fabricare a masei de alge pe baza de Scenedesmus acutus (S.oblicus).

• În Mexic se dezvolta productia de faina de Spirulinala o capacitate de 2 tone pe zi.

• continutul ridicat de acizi nucleici al microalgelor, poate ajunge la 4%.

• Studiile pe oameni efectuate cu faina de Scenedesmus administrata în cantitate de 15 g/zi (echivalent la 0.6 acizi nucleici) au demonstrat ca aceasta este bine acceptata, fara complicatii în hiperuricemii.

Hidrolizate enzimatice (autolizate, extracte) obtinute din proteine microbiene.

Pentru diete, in cazul unor malfunctii ale sistemul ui digestiv sau pentru unele diete postoperatorii, sunt necesare al imente care pot fi usor absorbite de catre organism, ce co ntin substante nutritive cu masa moleculara mica: aminoa cizi liberi, glucide simple, vitamine, saruri minerale s i cantitati reduse de lipide.

Prin hidrolizarea proteinelor - aminoacizi - folositi în imbogatirea alimentelor. In fluxul tehnologic de obtinere a pro teinelor hidrolizate este necesara inlaturarea peptidelor cu gust amar , si anume a celor care au in compozitia lor aminoac izi hidrofobici.

Exemple: - concentratul proteic din peste obtinut cu ajutorul alcalazei

din Bacillus licheniformis;- concentratul proteic din soia si ou prin tratarea a lbuminei cu

proteinaza din Aspergillus oryzae - se utilizeaza pentru imbunatatirea volumului blaturilor de tort .

• Se pot obtine proteine cu proprietati functionale superioare si din pasta de carne, printr-o hidroliza partiala a proteinelor miofibrilare cu o proteaza acida din Aspergillus niger (Milezyme AFP 2000).

• Hidroliza proteinelor se poate face chimic sau enzimatic.

Hidroliza chimica

= necontrolabila si conduce la produse cu compozitie si proprietati variabile.

- acida - utilizeaza de regula HCl. Neutralizarea HCl se face cu Na2CO3, care conduce la formarea de NaCl. Concentratia NaCl în produsul finit depaseste 25 %.

- alcalina – dezavantaje: - racemizari ale aminoacizilor (metionina, lizina); - distrugerea unor aminoacizi (lizina, cisteina, serina,

treonina;- scindarea legaturilor peptidice (hidroliza proteinelor); - formarea unor noi aminoacizi prin reactii de ß -

eliminare si condensare.

Hidroliza enzimatica

= se limiteaza tendinta de a forma produse cu caracteristici nedorite, obtinându-se produse de inalta calitate în instalatii mai simple si mai putin costisitoare.

• cele mai cunoscute hidrolizate proteice s-au obtinut prin hidroliza acida a proteinelor vegetale si sunt utilizate ca potentiatori de arome.

• Alte exemple: soia modificata enzimatic si cazeineleutilizate in producerea spumantilor si emulsionantilor.

• Gradul de hidroliza poate fi masurat prin cantitatea relativa de azot aminic prezent in hidrolizat raportat la azotul total prezent in substrat, AN/ TN, azotul fiind determinat prin titrarea cu formaldehida (AN) si prin metoda Kjeldahl (TN). O hidroliza inalta va avea un raport AN/ TN egal sau mai mare de 50 %.

• O alta metoda consta în determinarea gradelor de hidroliza sau DH = procentul de legaturi peptidice hidrolizate functie de totalul legaturilor peptidice. Legaturile peptidice sunt determinate prin numarul aminoacizilor evidentiati prin osmometrie pe scala 0-100 .

• Caracteristicile hidrolizatelor proteice depind de:- compozitia in aminoacizi;- distributia greutatii moleculare;- proteina reziduala.

• Parametrii ce caracterizeaza hidrolizatele proteice sunt: indicele de solubilitate, (% psi); dezvoltarea culorii; dezvoltarea gustului; dezvoltarea amarelii; lungimea lantului redus, lungimea lantului peptidic; proprietatile emulsifiante; proprietatile spumante.

Hidrolizate proteice – rol:- fortifierea fãinii;- echilibrarea în aminoacizi;- imbunatatirea insusirilor tehnologice ale fainii;- potentiatori de aroma;- agenti antispumanti sau cu rol in imbunatatirea texturii

produsului alimentar. • Pentru a obtine hidrolizatele proteice dorite, se stabilesc

conditii referitoare la: - selectarea si pretratarea materiilor prime;- selectarea enzimelor si a conditiilor procesarii; - selectarea acidului pentru inactivarea enzimelor; - separarea, cum ar fi de exemplu precipitarea selectiva izoelectrica; - tratamentul final.

• Pentru obtinerea hidrolizatelor proteice se parcurg urmatoarele etape: selectarea si eliminarea peptidelor amare, prin absorbtie (realizata cu carbon activ) sau extractie (utilizand solventi azeotropici, cum ar fi butanol si apa).

• Reactia de plasteinizare.• Mascarea gustului amar.• Utilizarea exopeptidazelor.

Cele mai utilizate

• În industria alimentara - autolizatele si extractele de drojdie, datorita gustului imbunatatit, al digestibilitatii ameliorate si a eliminarii compusilor celulozici pot inlocui extractul de carne la prepararea supelor si pot fi utilizate pentru imbunatatirea gustului a o serie de preparate alimentare.

• În S.U.A. se folosesc în clinici si gradinite de copii extracte de drojdii, în doze de pâna la 40 g/zi.

• Rolul extractului de drojdie este similar cu cel al glutamatului de sodiu (MSG) sau chiar mai mare. Functionalitatea extractului de drojdie este data de compozitia in proteine, carbohidrati si ARN. Sub autoliza controlata drojdia elibereaza acid glutamic si acizii 5-GMP (guanozinmonofosfat) si 5-IMP (inozinmonofosfat), cunoscuti ca potentiatori de aroma. În autolizatul de drojdie se gasesc, de asemenea, aminoacizi, peptide si lanturi proteice scurte

Folosind drojdiile de panificatie drept substrat si sursa de enzime, se obtin hidrolizate cu o mare valoare biologica.

• In celula de drojdie viabila:- azotul aminoacizilor liberi = 10% din azotul total;- azotul insolubil in acid tricloracetic = 75% (nu este cuprins

azotul purinic si pirimidinic). Aceasta inseamna ca din cei 30-60 % constituienti azotati ai

drojdiei, exprimati ca proteine (NX6.25), aproape 3/4 sunt hidrolizabili de catre proteaze. Dupa 48 ore de autoliza, circa 60% din azotul total al celulei se gaseste in mediul extern sub forma de azot solubil, nivel ce poate fi ridicat pâna la 80-90 %. Compozitia finala a constituentilor depinde de durata autolizei si de pH-ul autolizatului (la pH acid produsii finali sunt sub forma dezaminata, iar la pH neutru sunt sub forma aminata).

• Autolizatul de drojdie contine:- proteine solubile in apa;- produsi de degradare ale acestora, inclusiv aminoacizi

liberi, nucleotide, nucleozide (adenozina, citidina, uridina, guanozina), baze libere (adenina, citozina, uracil, hipoxantina).

• Proteinele din drojdii sunt o sursa buna de lizinaAminoacizii limitanti sunt cei cu sulf (cisteina,metionina).

Valoarea biologica si NPU (net protein utilization) sunt relativ scazute, fiind în mod semnificativ imbunatatite prin adaos de metionina în proportie de 0.3 %.

Digestibilitatea proteinelor microbiene, în special din drojdii, este, în general, buna, insa, la utilizarea în alimentatia umana a biomasei, se pun probleme de toxicitate acuta si cronica, diaree rebela, vomizari cauzate, în special, de continutul ridicat de pereti celulari si acizi nucleici.

• Peretii celulari = circa 15 % fata de substanta uscata, formata din: 30-40 % manani, 30-60 % glucani, 5-10 % proteine si 1 % chitina.

• Continutul în acizi nucleici din drojdii este de 8-25 g/ 100 g celule, majoritatea fiind acid ribonucleic. În tesuturile animale continutul de acid nucleic este mult mai scazut: 4 g/100 g proteine în ficat, 2.2 g/100 g proteina în sardine.

• Componentele acizilor nucleici, guanina si adenina, sunt metabolizate în acid uric, ceea ce ridica probleme fiziologice la unii indivizi. Deoarece la om lipseste enzima uricaza, care oxideaza acidul uric la metabolitul solubil si excretabil alantoina, acest acid se acumuleaza în sânge si urina. Daca acidul uric din sânge este ridicat, exista pericolul ca acesta sa precipite în tesuturi si articulatii, ajungându-se la guta. Daca continutul de acid uric din urina este ridicat exista pericolul formarii calculilor renali.

• În consecinta, pentru folosirea proteinelor din biomasa în alimentatia umana, se recomanda ca nivelul de acizi nucleici sa fie redus la 2 g/ zi .