Curs Biocel 16.10.2013

Functionarea membranei celulareca sistem integrat

Cum sa fntelegem cooperarea componentelormoleculare In func[ionarea membrane/or

Privire asupra functiilor metaboliceale membranelor

1. Schimbul de substante• Transportul membranar

2. Schimbul de intormatie• Semnalizarea transmembranara, sausemnalizarea celulara

I

ur. mtrcea ueaou - / ransportut memorunar uconogruju: curs)

lntrebari asupra transportuluimembranar

• Ce este transportul?• Ce se transports?• In ce directii?• Pe ce trasee?• Cu ce ritmicitate?• In ce cantitatl?• Cand?• De ce?• Unde?• Cat costa?• Cu ce irnplicatii?

Definltla notiunii transport)ictionary comar t:.or\Cd• Co"""torerwna1ve ~_·_t\4!r'!_!Wi._llfiii....·.·...·~•-·

transportation ..•Definitions (2)

1. Any device used to move an item from one location toanother. Common forms of transportation include planes,trains, automobiles, and other two-wheel devices such as

bikes or·motorcycles.2. The process of shipping or moving an item from point A

to point~-2

Dr. Mircea Leabu - Transportul membranar (iconograjie curs)

Transportul membranar

• Transport prin rnernbranapentru ioni !?imolecule mici (~<10A,M<800D)

• Transport cu mernbranapentru molecule mari, macromolecule !?iparticule

Transportul prin rnernbrana

difiztesimpla(pasiva)

DIFUZIE FACILITATA TRANSPORT ACTIV

• Pasiv (entropic, disipativ)-fara consum (concomitent) de energie(transport la vale - "downhill")- prin bistrat, (printre lipide)- molecule nepolare,molecule polare mici

(<1000)- difuzie sirnpla- prin proteine - ioni, molecule polare mari (100-800Da)- difuzie facilitata

- transportori- canale (ionice)

• Activ (antientropic) - cu consum de energie (transport la deal -"uphill")- primar (consumconcomitentde energie)- secundar (consumanterior de energie)

3

Dr. Mircea Leabu - Transportul membranar (iconografie curs)

Difuzia pasivaMOLECULENEPOLARE

(HIDROFOBE)

MOLECULEPOLARE

MICI

H20etanoluree

glicerol

MOLECULEPOLAREMARI

glucozasucroza

IONIH'.Nao· lHCOj, K•ca2•. er ,Mg2• I

L.__Jbistratlipidicsintetic

Difuzia facllltata

bistratlipidic

UNIPORT/\ /\•

1 SIMPORT ANTIPORT1co-transport

1. Transport uniport - un(o) singur(a) lontrnolecula) transportatta);

2. Transport cuplat (co-transport) - mai multi(multe) ioni(mulecule)transportati(transportate) simultan

- simport- toti(toate) ionii(moleculele) In aceiasi directie

- antiport- eel putin un(o) lontmolecula) in directie opusa

4

Dr. Mircea Leabu - Transportul membranar (iconografle curs)

GLUT1,exemplu de transportor uniport

Prezent In membrana eritrocitelor !?ia celor mai multecelule animale

in eritrocit: -45 kD, 12 a-helixuri cu aa hidrofobi,dar !?icu Ser, Thr, Asn, Gin

glucoza tegatala transporter

situs internde leqare

gradientulconcentratiet

glucozei

plasmatema

2

Glut 5 (transportorul de qlucoza din enterocite)exemplu de transport simport

spanul extracelular

gradientul

de Na' 4 ~~ fr&t r.-~r, ~44!\ =-l> •, =i>plasmalelma

citosol gradientulde glucoza •.,

5

Dr. Mircea Leabu - Transportul membranar [iconografie curs)

Canale ionice(i) fara poarta - canlul pentru scurgerea potasiului

(ii) cu poarta:- controlate (operate) electric;- controlate (operate) chimic (prin liganzi)- controlate mecanic

spatlul extracelular

con1rolelectnc

inch is

desch;s

control prin ligand control(ligand extracelular) mecanic.,. control prin ligand

~

\ I (ligand inracelular)., L--' c

~ ..I I !

''s r-c''' E·~L ...J

Controlul activitaff canalelor-

f1wt M Thrte Ohysol models for 1ti111 operung Ind dos11t1•-Ubmoon'omtr...- ••h:O-l:".r'@I_

IA,..-..a~Slrut:-"".al --""gloce.it'Sl'~:"lt~fto'.,. ...~tJ.-;-frwtioe~m:iM'ldoutof:.t~:

'""6

Dr. Mircea Leabu - Transponul membrunar (iconografie curs)

Ciclul activitatli canalelor cu poarta>'!T'4< •+ + J

membranapolarizata

bistratlipidic

..inch is \

Jmembranadepolarizata

/

inactivat deschis

bistratlipidic

.:neocupat~iinchis

ocupat~iinchis

ocupat~ideschis

Cooperarea canalelor la niveluljonctiunii neuro-musculare

JONCTIUNE NEURO-MUSCULARAIN REPAUS JONCTIUNE NEURO-MUSCULARAACTIVATA

canal de ca2•controlatelectric<,

....:- terrnmafieaxonalliI veziculecu

,~acetilcolina

irnpulsnerves

canalde Na•controlatdeacetilcolina~

canal de Na• ---controlatelectr~

canalde ca2•conlrolatelectric/

plasmalemasarcoplasmic celulei

musculare

canalde Ca2•

7


Transportul apei prin membranacelulara

• Osrnoza (nimic despre mecanism)• Apa singura suostanta ce trece prin membrane pedoua cai (dublu mecanism): difuziune simpla +difuziune facilitate (aquaporine)

• Sernnificajia clinica- Hipertonic - mai multe substante dizolvate, mai putina apa

- Hipotonic - mai putine substante dizolvate, mai rnulta apa

- lzotonic - substante dizolvate in concentratii egale, apa inconcentratie egala

L _I --

Aquaporine• Apa trece rapid dintr-o parte in alta a membranelor (in

ambele sensuri, functie de presiunea coloidosrnotica)Premiul Nobel pentru chimie in 2003: "for discoveries concerning channels in cell membranes"

Peter AgreJohn Hopkins

"for the discovery of water channels"

Roderick MacKinnonRockefeller

"for structural and mechanisticstudies of ion channels"

8


Na+/K+ATPaza (pompa de Na+~iK+)exemplu de transport activ

. ozaharid=-~:f....(\

ATP ADP+P,2 K' ~

spa\ilJextraeekJlar

plasmacm~

------<-. -- citosolK"

situsun extemc situsun extemepenlru Na" pentru K •

(mtcaafinitate) (mareafirntate)

'ingOa.satte I..t t .•

I 1E21I I II L I

'*-" ·~e \ "situspennu ATPsitusuri de

JegareNa" legareK•(mare afirntate) (nuca afonitate) 2. Legare ATP si

1. Legarea a 3 Na• fosforilare la aspartat

El E2

3. Schimbareaconformatiei siexpulzare'a N3+

ATP ADP

''Et

4. Disocierea Na• 5. Hidroliza 6. Schimbarea 7. Disocierea K+i;i legarea K• aspartilfosfatului conforma\iei ~i

internalizarea K+

~-------------------------~~·

Transportorii ABCABC de laATP-Binding Casette

Clasificare:-sisteme importatoare

•mici•mari

-sisteme exportatoare

M1.cw~Elemente ale organizarii:-domenii transmembranare (TMD)-domenii legare nucleotide (NBD)-domenii legare solut (SBD)

9


Cooperarea proteinelor de transportprin mernbrana, la nivelul enterocitelor

mlcrovildindomeniul apical

simportNa'/glucoza

jonctiunestrarls:t

(g1ueose) ~/I\I II II I

I 10I I\.' !

epitehuintestinalmembrana lateralai

(domeniu lateral}

transporterde glucoza(difuzie facililata)

L

MICA

MIC.ll.

Transport cu mernbrana

• Endocitoza:- Faqocitoza (material particulat)- Pinocitoza (material solubilizat)

» Costitutiva» Mediata de receptori» Potocitoza

• Exocitoza• Transcitoza

JO


Fagocitoza

lizosomi

bacterie

Forma materialuluiendocitat

particulat (insolubil)rnembranacelulara

Destinatia materialului

Pinocitoza constitutiva/potocitozaMaterialul endocitat:macromolecule solubilizate

L.~3•••• -,-a•.,.. r- --- .- - JtR - t•he~: • -~. ...,I . . . .1;i:o< .••.. l"IQ" -~·-=R,...-dlii.t·'1mtT.ouc:,,,,...f™·™"""""''•..!!i""""(WWfttm·.,• Desnnana matenalulu1

preluat prin pinocitoza -lizosom

0.2µmDestinatia materialului internalizat prin potocitoza:

•Citosol - acid folic (transport pasiv din caveola)•Alte locatii intracelulare (transport direct catre RE)-Transcitoza (albumina serica in celule endoteliale)•Reciclare la acelasi domeniu membranar

II


Endocitoza medlata de receptori

Materialul endocitat:macromolecule solubilizate cureceptori pe suprafata celulara

•LDL-transferina•unii factori de crestere (EGF)

Destinatia materialului internalizat:•LDL - lizosom; receptorul reciclat la suprafata celulei•Transferina (apotransferina) cu receptorul - reciclare•EGF cu receptorul - lizosom•Unii liganzi - transcitati (dimer de lgA in hepatocite)

Structura Jnvellsului de clatrinaClatrina orqanizeaza structuri denumite "trischelioni"Trischelionul confine trei lanturi polipeptidice mari ~i trei miciTrischelioanele se asarnbleeaza intr-o retea in CO§, ca o CU§CaCusca ajuta la invaginarea membranei ~i desprinderea veziculei

heavy chain

I.,..,,.1

~~ IIII

l 'f I<.\ ....,.,,,"-· _._,,,

!Bl so nm12


Rezumat

• Membrana celulara - sistem integrat (colaborare intrecomponentele moleculare) - schimb de substanta cumediul

• Schimbul de substanta - fenomene de transportmembranar- Transport prin membrane- Transport cu mernbrana (transport vezicular)

Rezumat• Transport prin rnembrana

- Transport pasiv (disiparea unui gradient de concentratie)• Difuziune sirnpla (molecule nepolare, molecule polare mici)• Difuziune facilitata (ions, large polar molecules)

- Transport activ (impotriva unui gradient de concentrate, consum deenergie)• Primar (consum concomitent de energie)• Secundar (consum anterior de energie)

• Transport cu rnembrana (transport vezicular)- Endocitoza (macromolecule solubilizate ~i material particulat)

• Fagocitoza (material particulat)• Pinocitoza• Potocitoza• Endocitoza mediata de receptori

- Exocitoza- Transcitoza

13

Dr. Mircea Leabu - Functionarea membrane/or ca sistem integral. Transportul membranar

FUNCTIONAREA MEMBRANELOR CA SISTEM INTEGRAT

. Complexitatea din organizarea moleculara a membranelor nu complica, ci eficientizeazafunctionarea acestor ultrastructuri celulare. Ceea ce se complica este calea noastra de a elucidamecanismele prin care membranele i~i indeplinesc menirea.

Toate componentele membranare coopereaza in asigurarea functiei acesteia, iar aceastacolaborare asigura o combinatorie larga, ce permite celulei cai dintre cele mai diverse de acomunica intre ele, sau cu mediul extracelular. Complexitatea moleculara a membranelor serasfange intr-o complexitate functionala care asigura, pe de o parte, investigarea a tot ceea ce se aflaimprejurul celulei si, pe de alta parte, declansarea raspunsurilor celulare adecvate adaptarii lamediul inconjurator. in toata aceasta actiune, caracteristicile organizarii moleculare a membranei(eterogenitate, asimetrie, comportament de fluid bidimensional) capata o deosebita importanta,Departe de a fi doar o structura surnativa, eterogena, continand o multitudine de tipuri delipide/glicolipide ~iproteine/glicoproteine, membrana celulara se constituie ca un sistem biologic ceintegreaza marea diversitate de biomolecule exploatand-o in scopul rezolvarii problemelor pe carele impune existenta celulei si supravetuirea ei in conditiile impuse de mediu. Asadar, prin toatadiscutia referitoare la functionarea membranei ca sistem integrat, cunostintele referitoare laorganizarea moleculara a acestei ultrastructuri vor sta la baza lntelegerii fenomenelor. Cum menireamembranei este aceea de a separa, dar a si uni celula cu mediul, acestea implica asigurarea unuischimb de substanta si/sau informatie cu exteriorul, riguros controlate.

Pentru o sistematizare a proceselor vom include ceea ce tine de schimbul de substante dintrecelula si mediu intr-un subcapitol intitulat "Transportul membranar", iar ceea ce tine de schimbulde informatie sub titlul "Semnalizarea celulara". Trebuie subliniat faptul ca in realitate nu se poateface, de fapt, o separatie intre cele doua tipuri de fenomene, ele coexistand ~i cooperand inrealizarea eficienta a functiilor membranelor. Mai concret spus, transportul membranar estedependent (controlat si modulat) de fenomene de semnalizare celulara, iar sernnalizarea celularaimplica adesea fenomene de transport membranar.

Asadar, nimic din ceea ce se intarnpla la nivelul membranei, nu poate fi scos din context, cade altfel tot ce se inramplii In celula, in ansamblul sau. Membrana asigura celulei informatiilenecesare pentru supravietuire si actiune in functie de ce se intarnpla in jurul sau. Astfel, simultancelula primeste informatii pe multiple cai, pe care pe prelucreaza si, tinand cont de toate, raspundeapoi printr-un comportament adecvat. Aceasta capacitate a celulei de a primi ~i analiza informatiimultiple, culese prin diverse surse poate fi denumit in rornaneste diafonie (termenul in engleza,folosit pentru a denumi aceste fenomene este .cross-talk"). Un exemplu de diafonie este eel cedetermina motilitatea celulara, care se desfasoara sub actiunea sernnalelor primite prin factori decrestere, citokine sau chemokine, sernnale care influenteaza activitatea integrinelor. Astfel, pentru adecide sa migreze dintr-un loc in altul in tesuturi, celulele utilizeaza informatiile primite prinreceptori la diversi factori chemotactici ca si prin integrine a caror interactiune cu substratul dinmatricea extracelulara ~i distributie membranara le moduleaza ~i le adapteaza pentru a favorizacomplexele procese ce insotesc miscarea celulei. Analiza sernnalelor ce vin de Ja receptori siintegrine conduce Ja declansarea unor reorganizari ale citoscheletului (vezi Ja capitolul,,Citoschelet") cu efecte asupra morfologiei celulare si fortelor necesare deplasarii.

in cele ce urmeaza vom detalia aspecte legate de transportul membranar.

Transportul membranarin functie de felul in care substantele anorganice sau organice, ori unele materiale pariculate

patrund in interiorul celulei, transportul membranar poate fi clasificat in doua categorii:

Dr. Mircea leabu - Funefionarea membrane/or ca sistem integral Transportul membranar

1. Transport prin membranii, atunci cand substantele strabat membrana (din exterior spreinterior, sau invers) fie direct printre lipidele bistratului, fie prin biostructuri specializateorganizate de proteinele transmembranare;

2. Transport cu membranii (transport vezicular), atunci cand substantele sunt introduse in, saueliminate din celula prin intermediul unor vezicule delimitate de (endo)membrane care sedesprind de, sau fuzioneaza cu membrana celulara.

Transportul prin membrana este specific ionilor ~i moleculelor mici (~ < 1OA; M < 800Daltoni - Da). Transportul cu membrana realizeaza schimbul de molecule mari (~ > 10A; M >800Da), marcomulecule, respectiv particule. Indiferent de sensul in care are loc schimbul (dinexterior in celula sau din celula catre exterior), aceasta selectare ramane valabila intre cele douatipuri de transport. De remarcat ca parametrii referitori la gabaritul compusilor transportati suntvalori mediate si ar fi absolut valabile pentru structuri sferice. In realitate, procesul de transport almoleculelor mici prin membrana depinde si de geometria acestora, molecule alungite, care depasesc800Da, putand fi transportate prin aceste mecanisme (spre exemplu prin jonctiunile comunicante;vezi acolo).

Transportul prin membranii . . .Fenomenele de transport prin rnembrana sunt de o mare diversitate, ceea ce unpune, pentru

0 mai usoara abordare si intelegere, sistematizari pe mai multe niveluri. Cal~a cea mai utila pentrusistematizare e reprezentata de clasificarea pe criterii din ce in ce mai de detahu. .

In functie de necesarul de energie care se consuma pentru desfasurarea sa, transportul prmmembrana se clasifica in urmatoarele doua mari categorii:

I. Transport pasiv, care nu necesita consum energetic concomitent pentru trecerea de substantaprin mernbrana;

2. Transport activ, care necesita consum de energie in momentul trecerii prin membrana asubstantei transportate.

Transportul pasivTransportul pasiv mai este denumit ~i transport disipativ, deoarece difuziunea retrezinta

miscarea de substanta de la concentratie mare la concentratie mica, 'in contextul discutiei noastredisipand gradiente de concentratie aflate de o parte sau de alta a barierei pe care membranele oreprezinta; tocmai de aceea transportul pasiv nu necesita energie. Cum trebuie inteles acest transport~icum in putem sistematiza prin clasificari?

Unele molecule mici (in limita de gabarit specificata mai sus) pot strabate membranastrecurandu-se printre lipidele membranare. Acest lucru este usor de inteles daca ne gandim calipidele, asezate in bistrat, au miscari de o mare diversitate ~i nu organizeaza o structura cu ocompactitate rigida, lasand in permanenta intre ele spatii de dimensiuni ~i geometrii variabile. inaceste spatii o serie de molecule mici se pot insinua (daca dimensiunile le permit ~i in felul acestapot trece mai repede sau mai lncet dintr-o parte in cealalta a membranei. Acest tip de trecere se facerara a necesita consum concomitent de energie si este, de aceea, transport pasiv. Calea transportuluipasiv printre moleculele lipidelor membranare poate fi urmata de moleculele nepolare, sauhidrofobe (spre exemplu: 02, N2, C02, NO, CO, eter etilic, benzen si asemanatoare), dar ~i demoleculele polare mici (cu masa moleculara sub lOODa; de exemplu: H20, etanolul, ureea,glicerina), care se pot strecura in si prin spatiile dintre lipide. Acest transport, care se desfasoaraprin trecerea substantelor printre lipidele membranare, este numit ~idifuzie simplii.

Pentru moleculele polare mari (cu greutatea moleculara intre 100 si 800Da) cat si pentru ionitransportul prin membrana se face numai prin implicarea proteinelor transmembranare organizate instructuri specifice. Aceste structuri poarta denumirea de transportori (pentru molecule polare mari:glucoza, aminoacizi, nucleotide) sau canale ionice (fireste pentru ioni: H+,Na+, HC03-, K+, Ca2+,er, Mg2+). Transportorii si canalele ionice efectueaza tot un transport pasiv (rara consum

2

Dr. Mircea Leabu - Functionarea membrane/or ca sistem integral Transportul membranar

concomitent de energie). Transportul pasiv prin transportori sau prin canale ionice se numeste ~idifuzie fuciliuuii.

In functie de numarul tipurilor de substanta transportate simultan, difuzia facilitata poate ficlasificata in: (i) transport singular numit si transport uniport, cand este transportata o singuraentitate chimica (ion sau molecula), sau (ii) transport cup/at, numit ~i co-transport, cand sunttransportate simultan (adica intr-un singur ciclu) doua sau mai multe entitati chimice (ioni, moleculesau ioni ~imolecule).

La randul sau, transportul cuplat se poate clasifica in doua tipuri in functie ~e sensul !n caresunt transportate diferitele substante, Cand toate substantel.e sunt ~ansportate m acelasi sens,transportul cuplat este numit transport simport. Daca eel putm una dmtr~ substantele transportateeste purtata in sens opus celorlalte, co-transportul .es~enumit transport antiport. w •

Ca exemplu de transportor uniport, amintim transportorul de glucoza ~dm membr~~aeritrocitara (GLUTl) [l]. Este o proteina multipas cu masa moleculara ~45kDa, avand 12 trecen ma-helix prin planul membranei, la nivelul carora alaturi de aminoacizi hidrofobi gasim ~iSer, Thr,Asn si Gin implicate in interactiunea cu molecula de glucoza In timpuJ procesului de transport.Ambele capete terminale ale lantului polipeptidic sunt expuse in citosol. In membrana eritrocitaraexista peste 200 000 de molecule de transportor GLUTl pentru o celula. GLUTl face parte dintr-ofamilie de transportori de glucoza cu 14 membri (GLUTl-14) toti cu cate 12 treceri in a-helix prinplanul membranei ~i cu capetele N- ~i C-terminale in endodomeniu. Transportorii GLUT suntintiilniti ~i in membranele altar tipuri de celule animale, nu numai in eritrocite sau in liniahematopoietica eritroida [2-5]. in conditii bazale, in celulele musculare ~iin adipocite GLUT4sufera un proces continuu, dar cu dinamica scazuta de reciclare intre membrana si catevacompartimente intracelulare, cu numai 5% din totalitatea moleculelor expuse in membrana celulara.Dupa stimulare cu insulina, In 2-3 minute, celulele rnodifica echilibrul intre cantitatea de GLUT4aflata in compartimente intracelulare ~i cea expusa in membrana, care creste la 50% [5]. Acesteobservatii sustin afirmatia facuta mai sus cum ca transportul ~i semnalizarea sunt procesemembranare ce se influenteaza reciproc.

Ca transportor simport, merita amintit co-transportorul de sodiu/glucoza (SGLTl) dinmembrana apicala a enterocitelor (celulele absorbante din intestin) [6, 7]. De remarcat faptul caacest transportor foloseste disiparea gradientului de Na+, pentru a transporta glucoza din lumenulintestinal in citosolul enterocitelor impotriva gradientului de concentratie a glucidului. Un asemeneatransport mai este numit si transport activ secundar, deoarece se bazeaza practic pe energiaconsumata anterior de celula pentru mentinerea gradientului de Na+ (12mM in celula, 145mM inexterior). Asta inseamna ca glucoza este eficient absorbita din lumenul intestinal catre spatiul desub epiteliu de unde este preluata in circulatia sanguina. SGLTl este proteins transmembranaramultipas cu 14 treceri in a-helix prin planul membranei, dintre care trecerile 10-14 au fost dovediteca structurand calea de trecere a glucozei. Ambele capete ale lantului polipeptidic sunt Inectodomeniu. in bucla hidrofila Nsterminala SOLTl este glicozilat, dar structurile glucidice nu suntnecesare activitatii biologice. Lantul polipeptidic al SOLTl are 664 de aminoacizi ~i o masamoleculara de ~73kDa. Un ciclu al mecanismului de transport co-transporta 2 ioni de sodiu ~i omolecula de glucoza. In membranele latero-bazale ale enterocitelor se gaseste un transportoruniport de glucoza (GLUT2) prin care glucoza introdusa in celula de SGLTl este transportata inspatiul subepitelial [7]. SGLTl face parte dintr-o familie de co-transportori sodiu/glucoza cecontine peste 220 de membri in celulele eucariote si procariote, iar la om 11 membri [6]. Genele cecodifica cei 11 membri due predictibil la proteine cu greutati moleculare intre 60 si 80kDa,continand 580 la 718 arninoacizi. Cu exceptia a doi dontre membri, ceilalti realizeaza 14 treceri ina-helix prin planul membranei.

Ca exemplu de transport antiport, readucem In atentie canalul de schimb anionic HC03-/Cl din membrana eritrocitara [8, 9], cunoscut sub denumirea simbolica banda 3, abreviatie AEI(vezi detalii structurale la subcapitolul ,,Proteine membranare", sectiunea ,,Exemple de proteinemembranare"). Schimbul anionic (I: I) poate fi reversat In functie de concentratiile bicarbonatuluiIn celula, respectiv mediul extracelular. Proteine sirnilare se intalnesc ~i in alte tipuri de celule, iar

3

Dr. Mircea Leabu - Functionarea membrane/or ca sistem integral. Transportu/ mem/Jranar

familia acestora poarta denumirea de schimbatori anionici (prescurtat AE, de la sintagmaenglezeasca Anion Exchanger). In celulele noneritroide au fost identificate AE2 ~i AE3 [10, 11).Alaturi de controlul homeostaziei eritrocitare ~i tisulare a C02, prin schimbul HC03-;cr, acestecanale actioneaza si in controlul ~i reglarea pH-ului celular ~ial sangelui [11]. Aceasta activitate dereglare a pH-ului singelui (respectiv urinei) se manifesta ~i la nivelul nefrocitelor, unde Ja schimbulpasiv HC03-/Cr se adauga activitatile unui canal uniport de er, necesar mentinerii homeostazieiintracelulare a anionului si unei pompe protonice, necesara pentru eliminarea H+ rezultat dinhidroliza acidului carbonic, obtinut prin hidratarea C02•

Un alt antiport, prezent 'in membrana celor mai multe celule excitabile sau secretoare [12),este schimbatorul de Ca2+/Na+, care efectueaza tot un transport activ secundar, eliminand unionCa2+ prin introducerea a 3 ioni Na+. (De fapt sunt raportate valori diferite de ioni Na+ schimbati cuun ion Ca2+, astfel tncat mai circumspect ar fi sa spunem ca stoichiometria antiportului este maimult de 2 Na+, pentru 1 Ca2+ [13]). Familia de proteine transmembranare cu aceasta functie estenotata prescurtat cu NCX (de la Natrium-Calcium eXchanger), fiind identificati la mamifere treimembri: NCXI, NCX2 si NCX3. NCXI se afla in aproape toate tesuturile, dar este exprimata maiabundent in inima, creier si rinichi [14). NCXI are 938 aminoacizi (l IOkDa, masa deductibila dinsecventa de aminoacizi) ~i are 9 domenii transmembranare in a-helix [15). Capatul amino terminalal lantului polipeptidic se afla la suprafata membranei, asadar NCXl este proteina transrnembranaratip I, iar intre segmentele transmembranare 5 ~i 6 se structureaza o bucla citosolica (adica pe fatainterna a membranei) de 550 de aminoacizi (mai mult de jumatate din lungimea lantuluipolipeptidic) esentiala pentru reglarea activitatii canalului. Activitatea schimbatorului Na+/Ca2+estedependenta de concentratiile extracelulara, respectiv citosolica ale cationilor schimbati, dar ~i deconcentratia W, a ATP ~i a fosfoinozitidelor dis-fosforilate [13). in functie de potentialul demembrana ~i de concentratiile de o parte sau de cealalta a membranei ale cationilor transportati,schimbul poate fi reversat. De remarcat este faptul ca, in celula musculara cardiaca, undecontributia de calciu citosolic necesar contractiei se datoreaza masiv (-70%) eliberarii din reticululsarcoplasmic, iar numai in mica masura (-30%) invaziei de calciu extracelular, eliminareaprocentelor de Ca2+venite din afara celulei, necesara procesului de relaxare se face in principal prinNCX si nu prin pompa de calciu sarcolemala (adica pompa de calciu din membrana celuleimusculare). in cazul reintroducerii Ca2+ 'in reticulul sarcoplasmic, contributia revine in exclusivitatepompei de calciu din membrana reticulului [16). De regula NCX transporta de 10, 15 ori mai multCa2+ in afara celulei, decat pompa mernbranara de calciu [14).

Transportul pasiv oricum s-ar desfasura, se petrece in sensul de diminuare a gradientului deconcentratie al componentei transportate. De aceea se mai numeste si transport disipativ, transportentropic, sau transport la vale (de la concentratie mare la concentratie mica). Acest tip de transportse poate desfasura, teoretic, pana cand concentratia componentei transportate se egalizeaza de celedoua parti ale membranei prin care se desfasoara.

Asupra canalelor ionice membranare se pot face comentarii suplimentare. Ele nu suntpermanent deschise, iar celula poate controla functionarea !or. in functie de mecanismul prin careeste controlat regimul de deschidere a lor, canalele ionice se pot imparti in trei categorii:

1. Canale ionice controlate (operate) electric (prin voltaj), adica prin modificarea potentialuluide membrana, Acestea sunt inchise atunci cand potentialul membranei este eel normal (adica50- 70mV, cu minus pe partea citosolica). Canalele controlate electric se deschid atunci candpotentialul de repaus al membranei se modifica,

2. Canale ionice controlate (operate) chimic (prin liganzi), adica se deschid atunci cand leagaun compus chimic (ligandul) care schimba conformatia proteinei. Ligandul se poate lega inectodomeniul proteinei care sutructureaza canalul (sau a unei subunitati daca este multimer)fiind ligand extracelular sau, pentru alte tipuri de canale, la endodomeniu (ligand intracelular,sau citosolic ).

3. Canale ionice controlate mecanic, adica a caror stare deschisa/inchisa este dependenta deexercitarea unor tensiuni mecanice asupra membranei.

4

Dr. Mircea Leabu - Functionarea membrane/or ca sistem integral. Transnorlul memhranar

. . Trebuie mentionat ~~. activarea canal~lor respe~tii un mecanism ciclic. Acesta asiguramactivarea lor chiar 111 conditiile care au determinat deschiderea, deoarece pot prezenta trei stari:

- starea lnchisa, de repaus, in absenta stimulului (modificarea potentialulu], legarea liganduluisau tensiunea rnecanica);

- starea deschisa, care permite trecerea ionilor, dupa aparitia stimulului;- starea inactiva, inchisa la prezenta prelungita a stimulului (conformatie inchisa sub potential

de rnembrana modificat, alta decat cea inchisa de repaus; ocupat de ligand dar inchis; inch is illprezenta tensiunii mecanice care a determinat deschiderea).

Aceasta trecere intr-o stare refractara a canalelor ionice asigura mentinerea homeostazieiionice intracelulare in conditiile de persistenta a semnalelor, refacerea potentialului membranar,desprinderea ligandului si, eventual, metabolizarea sa, cu revenirea celulei la starea bazala, adicastarea de neexcitatie, astfel incat sii devina sensibil la o noua stimulare.

Dintre cele trei tipuri de canale ionice cele controlate mecanic au fost ultimile descoperite sisunt ~icele mai dificil de investigat, incepand chiar cu stabilirea faptului ca sunt controlate mecanic.Dificultatile se datoreaza urmatoarelo aspecte [17]:

(i) celulele mecanosenzitive nu sunt numeroase in organism si sunt imprastiate printre multealte tipuri celulare, spre deosebire de celulele care contin canale din celelalte tipuri;

(ii) numarul de canale controlate mecanic in membranele celulelor mecano-senzitive este decateva ordine de marime mai scazut decat al celor comandate electric sau chimic (deexemplu, eritrocitele l,2x106 molecule de banda 3, membrana celulelor cu bastonase contineaproximativ 4xl07 molecule de rodopsina, celulele olfactive in jur de 1,7x107 receptoriolfactivi, in timp ce celulele paroase din organul lui Corti au 50 la 100 canaJe controlatemecanic);

(iii) dovedirea proprietatilor mecano-senzitive ale eventualilor candidati este dificila cu tehnicileclasice.

in ciuda acestor dificultati interesul pentru studiul canalelor controlate mecanic este deosebitde actual, atata timp cat dorim sa cunoastern mecanismele celulare si moleculare ale receptarii,controlarii ~i reglarii presiunii sanguine, ale senzatiilor tactile, ale perceptiei sunetelor gravitatiei ~iacceleratiei. Din ceea ce se cunoaste pana in prezent, canalele controlate mecanic sunt impartite inpatru tipuri (17]: degenerine/canale epiteliale de sodiu (abreviere DEG/ENaC, de laDEGenerin!Epitelial Natrum Channel), canale receptor tranzient de potential (prescurtat canaleTRP, de la Transient Receptor Potential), canale de potasiu cu doi pori (notate K2P) ~i canalemecanosenzitive de conductanta mica (abreviat MscS, de la Mechanosensitive channel of Smallconductance). 0 trasatura comuna a acestor canale controlate mecanic este aceea ca genereazasernnale electrice foarte rapide, cu o latenta de sub 1ms.

Pentru intelegerea faptului ca evenimentele celulare nu se petrec individual ci intr-opermanenta cooperare ~i completare si ca celulele se cornporta adecvat situatiilor in care sunt pusenumai datorita acestei conlucrari a componentelor lor, inclusiv a componentelor mebranare, putemexemplifica prin ceea ce se petrece la nivelul jonctiunilor neuro-musculare in momentul stirnulariicelulei musculare pentru contractie.

Jonctiunea neuro-musculara, nurnita ~isinapsa neuro-musculara, reprezinta o apozitie dintremembrana butonului terminal al unui axon ~i un microdomeniu al membranei celulei musculare.Tntrecele doua membrane aflate in apozitie la nivelul sinapsei, in spatiul numit fanta sinaptica, secreeaza un microclimat favorabil transmiterii de semnale lntre celula nervoasa ~i celula musculara,Ce se lntarnpla la acest nivel, cand un semnal nervos ajunge la butonul terminal al axonului?Propagarea semnalului nervos de-a lungul axonului se materializeaza prin depolarizarea membraneiaxonale secvential de-a lungul acestuia. Cand semnalul, deci depolarizarea membranei axonale,ajunge la butonul terminal, are Joe deschiderea µnor canale de Ca2+ operate electric. Deschidereaacestor canale permite ionilor de calciu din spatiul extracelular (unde concentratia este mare, deordinul l0-3M) sa intre in citosolul de la nivelul butonului axonal (unde concentratia este mica, deordinul 1o-7M). Cresterea concentratiei de Ca2+ in butonul axonal induce secretia de acetilcolina

5

6

Dr. Mircea Leabu - Funefionarea membrane/or ca sistem integral Transeortul membranar

(depozitata In vezicule de secretie de la nivelul butonului axonal) In fanta sinaptica. Acetilcolinasecretata In fanta sinaptica se leaga de canalele de sodiu controlate chimic prezente In membranasinaptica a celulei musculare pe care le deschide. Ionii Na+ patrund in celula rnuscularadepolarizand membrana acesteia la nivelul jonctiunii neuro-musculare. Depolarizarea membranei lanivelul sinapsei duce la deschiderea unor alte canale de Na+ comandate electric, extinzanddepolarizarea membranei celulei musculare. Aceasta depolarizare extinsa duce la deschiderea unorcanale de Ca2+ operate electric din membrana celulei musculare, ca ~i a unor canale de calciu dinmembrana reticulului sarcoplasmic. Patrunderea Ca2+ (atat din exteriorul celulei, cat ~i din reticululsarcoplasmic) In citosolul celulei musculare determina contractia celulei. Relaxarea celuleimusculare presupune eliminarea ionilor de Ca2+ din citosol, prin actiunea unor pompe de Ca2+.Dupa transmiterea semnalului, la nivelul fantei sinaptice acetilcolina este fie matabolizata la colinasi acid acetic de o colinesteraza, fie reintrodusa In vezicule de sectretie, In butonul axonal prinendocitoza, Scaderea concentratiei de acetilcolina In fanta sinaptica, alaturi de relaxarea celuleimusculare prin scaderea concentratiei citosolice de Ca2+ asigura reluarea ciclului. Este evident,celulele fac toate aceste lucruri mult, mult mai repede decat descriem noi In cuvinte. (Din fericire!)

Transportul apei prin membrana celularaNu putem incheia aspectele legate de transportul pasiv prin membrane rara sa vorbim despretransportul apei, solventul fiziologic, transport de care depinde echi librarea presiunilorcoloidosmotice ~i supravieuirea celulelor. Trecerea apei printr-o mernbrana poarta denumirea deosmoza. Acesta este un termen util In biofizica, unde mecanismele care se ascund in spatele acesteitreceri nu conteaza. In biologia celulara, insa, unde vrem sa deslusim mecanismele care se petrec Incelula sau la nivelul diferitelor componente celulare (cum este acum membrana celulara) In toatadiversitatea si complexitatea lor, termenul osmoza (chiar daca nu trebuie ignorat) nu este deosebitde util. Ei bine, prin membrana celulara apa trece atat prin difuzie sirnpla (adica printre lipidelebistratului), cat ~i prin difuziune facilitata, deoarece multe celule si-au produs complexe proteicetransmembranare destinate transportului pasiv al apei. Aceste complexe proteice transmembranare,destinate transportului facilitat al apei prin membranele celulare, poarta denumirea de aquaporine.1Rolul tor este acela de a eficientiza trecerea apei prin membrane, astfel incat, pe de o parte,fenomenele fiziologice sa se petreaca dupa o dinamica adecvata si, pe de alta parte, la aparitia unordezechilibre osmotice accidentale homeostazia celulara sa nu sufere dramatic ~i sa puna In pericolsupravietiurea,Aquaporinele sunt proteine identificate In toate organismele (de la bacterii, la mamifere ~iIn plante)~i sunt ubicuitare In organismele multicelulare, fiind exprimate in diferite grade in toate tipurile decelule [18, 19]. La om au fost identificate eel putin 13 membrii ai familiei proteice a aquaporinelor[19], desernnate abreviat prin AQPx (cu x incepand de la 0, AQPO fiind aquaporina din cristalin,numita initial proteina integrala majora), ldentitatea moleculara a primei aquaporine (AQPI) a facutobiectul articolului publicat de echipa lui Peter Agree in 1992, care microinjectand ovocite deXenopus laevis cu ARNm al proteinei CHIP28, abundent exprimata In membrana erotricitara, auconstatat o crestere semnificativa a permeabilitatii osmotice a apei [20]. Aquaporinele sunt proteinetransmembranare cu masa moleculara de -30kDa (masa rnoleculara predictibila a monomerilor deaquaporine se aseaza intre 26 ~i 34kDa), au sase treceri In a-helix prin bistratul Iipidic ~idouasegmente scurte, tot helicoidale, care strajuiesc vestibulele citoplasmatic, respectiv extracelular alecanalului arganizat de cele sase domenii transmembranare [20, 21]. Capetele amino- ~i carboxiterminale ale lantului polipeptidic se afla pe fata citosolica. in membrane, monomerii astfelorganizati transmembranar se asociaza cate patru formand homotetrameri. Pentru AQP4homotetramerii se asociaza la un nivel superior In retele octogonale prin interactiuni ale unor

1 Proteinele care structureazli aquaporine au fost identificate In membrana eritrocitara, iar roul !or intuit pentru primadata de rornanul Gheorghe Benga. Studii consecvente referitoare la acesti transportori ai apei prin membrane au fostefectuate ulterior de grupul lui Peter Agree, acesta primind, In 2003, premiul Nobel pentru chimie cu urmatoareamotivatie ajuriului: "for the discovery of water channels".


motive (secvente mici de aminoacizi) specifice din regiunea capetelor amino-terminale alemonomerilor.Apa poate trece prin canalele aquaporinelor 'in arnbele sensuri, depinzand de presiunilecoloidosmotice existente de cele doua parti ale membranei. Exprimarea adecvata a aquaporinelor incelule este importanta pentru multe fenomene fiziologice: adsorbtia adecvata la nivelul cailorurinare pentru formarea urinei, semnalizare neuronala prin modularea transportului prin caneleionice, motilitate celulara prin asigurarea dinamicii lamelipodiilor, hidratare pielii, proliferarecelulara, metabolismul lipidic (implicarea aquagliceroporinelor, aquaporine cu transport dualpentru apa ~i glicerina) [19]. Mai mutt, deficiente in exprimarea aquaporinelor pot induce sau insotidiverse patologii: cataracta, diabet insipid, edem cerebral, obezitate [18].

Transportul activPana aici am detaliat aspecte legate de transportul in sensul diminuarii concentratiei

componentei/componentelor transportate, adica transportul pasiv, sau entropic. Celulele au insanevoie de transport de molecule mici si/sau ioni ~i impotriva gradientelor de concentratie existentela un moment dat, sau existente permanent la nivelul membranelor. Pentru rezolvarea acestor nevoi,in membrane sunt organizate biostructuri proteice capabile sa transporte molecule mici si ioniimpotriva gradientului de concentratie al acestora, prin consum de energie provenita din scindareaunor molecule macroergice (de regula ATP). Aceste structuri proteice membranare poartadenumirea de pompe. Transportul efectuat de ele se numeste transport activ, transport antientropic, sau transport la deal.

Ca exemplu de transport activ vom aborda pompa de Na+/IC, numita ~iNa+/K+-ATP-azii2.Pompa este o structura complexa din punct de vedere biochimic [22] organizata ca un tetramerformat din doua subunitati mari a (care formeaza unitatea catalitica ~i transportoare ), ~i douasubunitati mici f3 (glicoproteice, reglatoare, neimplicate direct in pomparea ionilor, dar necesarepentru impachetarea conformationala corecta a subunitatilor a in reticulul endoplasmic, inmomentul biosintezei, asamblarii in membrana si maturarii). in unele organe la aceasta organizarese alatura o a treia subunitate y (un polipeptid foarte mic, capabil sa modeleze afinitatea pentru ioniitransportati, si pentru ATP). Toate cele trei tipuri de subunitati sunt proteine transmembranare.

Subunitatile a sunt neglicozilate, au o masa rnoleculara de -1 lOkDa (1014-1028 deaminoacizi), I0 treceri 'in a-helix prin bistratul lipidic membranar (notate Ml - MIO) si ambelecapete amino- ~i carboxi-terminale ale lantului polipeptidic in endodomeniu [22]. Exista patruizoforme de subunitati a: al, care are un lant polipeptidic format din 1024 aminoacizi, a2, cu 1021aminoacizi, a3, cu doar 1014 aminoacizi ~ia4, cu eel mai lung Iant polipeptidic, continand 1028 deaminoacizi [22, 23]. Domeniul extracelular este minor si format din doua bucle mici intre domeniiletransmembranare Ml,M2 (cam 12 aminoacizi, responsabila de interactiunea cu ouabaina, careinhiba activitatea pompei) ~iM7,M8 (in jur de 39 de aminoacizi). Domeniul citosolic este abundent,fiind format din portiunea Nvterrninala (primii 90-97 de aminoacizi ai lantului polipeptidic), o buclamica intre domeniile transmembranare M2 si M3 (forrnata din -143 de aminoacizi), o bucla mareintre M4 si M5 (continand in jur de 439 de aminoacizi, unde se afla acidul aspartic ce sefosforileaza in ciclul de activitate a pompei, ca ~i situ! de legare a ATP), alte doua buclesemnificativ mai mici intre M6, M7 (28 de aminoacizi) si M8, M9 (27 de aminoacizi) ~i capatul Cterminal mic (format din ultimii 21 de aminoacizi ai lantului polipeptidic) [24].

Subunitatea f3 este glicoproteina transmembranara unipas, tip II cu un endodomeniu micformat dintr-o protiune scurta a capatului N-terminal ~i un ectodomeniu mare format din mai multde jumatate din lantul polipeptidic cu capatul C-terminal. Exista trei izoforme de subunitati f3:131care are 304 arninoacizi si trei situri de posibila N-glicozilare, f32cu 290 de aminoacizi in structura~i 4 Ja 9 situri de glicozilare, depinzand de specie (4 la pasare, 7 la sobolan, 8 la om, 9 Ja soarece) ~i

2Pompa de sodiu a fost descoperita In 1950 de chimistul danez Jens Christian Skou, care peste 47 de ani (in 1997) a

fost distins cu Premiul Nobel In chimie cu urrnatoarea motivatie a juriului: "for the first discovery of an ion-transportingenzyme, Na 1,K+-ATPase".

7


133avand 279 de aminoacizi [22]. Nu se cunoaste daca toate aceste posibile situri de glicozilare suntutilizate ca atare, dar toate izoformele sunt, cu certitudine, mai putemic sau mai slab glicozilate.Desi inhibarea glicozilarii cu tunicamicina nu blocheaza activitatea pompei ~i nici sensibilitateaacesteia la ouabaina, este totusi dovedita, pentru subunitatile 13neglicozilate, afectarea echilibruluide asamblare a.13. Aceste rezultate experimentale sugereaza rolul subunitatii 13 in corectaimpachetare a subunitatii a In timpul biosintezei, la nivelul reticulului endoplasmic ~i fromareaeficienta a complexelor proteice ale pompei [22]. 0 alta caracteristica structurala importanta asubunitatii 13este aceea de a forma trei punti disulfidice In ectodomeniu. La sobolan aceste punti, ceasigura lm~achetarea corecta a subunitatii 131, se formeaza intre Cys125-Cys148, Cys158-Cys174 siCys212-Cys 75. Chiar daca pozitiile relative ale cisteinelor implicate In formarea puntilor nu suntconservate la izoformele 132sau 133,puntile sunt prezente, ceea ce sugereaza importanta lor pentruformarea unei structuri corecte, functionale. Desfacerea celor trei punti disulfidice cu agentireducatori duce la pierderea functiei pompei, iar o singura mutatie punctiforma care elirnina numaiuna dintre cisteinele in discutie irnpiedica asamblarea corecta a heteromerilor al3 [25].

Subunitatea y este o proteina transmembranara unipas tip I ~i au fost identificate 7 izoforme,cu mase moleculare intre 8 ~i 14kDa [22, 26]. Toate aceste izoforme au fost dovedite a se asocia cupompele de Na+/K+ [26] moduland activitatea acestora, se exprima in special la nivelul rinichiuluiavand rol ~iIn adaptarea, respectiv supravietuirea celulelor in conditii hipertone [29].

Referitor la asarnblarea complexelor proteice ale Na+,K+-ATPazei se cunoaste casubunitatile 13au domeniul transmembranar In apropierea celor M7 ~iMIO ale subunitatii a ~i cainteractioneaza cu bucla dintre M7 si M8 a ectodomeniului subunitatii catalitice [26]. Cat privesteasamblarea in complex a subunitatii y, domeniul transmembranar al acesteia se localizeaza intr-unsant dintre M2, M6 ~i M9 al subunitatii a, dar interactioneaza si cu subunitatea 13 la nivelulectodomeniului, respectiv cu endodomeniul subunitatii a la nivelul buclelor dintre domeniiletransmembranare M6,M7 ~i M8/M9 [26-28]. Toate aceste interactiuni ce sunt nuantate prinasocierile diferite dintre cele 4 izoforme de subunitati a, trei izofonne de subunitati 13 ~i sapteizoforme de subunitati y asigura modulari de mare finete ale functiei pompei In diverse tipuricelulare [22, 26].

Ce se cunoaste asupra mecanismului de actiune al Na+,K+-ATPazei? Ciclul de pompare are7 etape ~i duce la expulzarea a 3 ioni de Na+ ~i introducerea a 2 ioni de K+ In celula, pe baza unorrnodificari de conformatie intre doua forme: El cu acidul aspartic din situ! catalitic nefosforilat siE2 cu acidul aspartic fosforilat [30]. Etapele ciclului de pompare sunt:

1. Legarea a trei ioni Na+pe versantul citosolic (endodomeniul) subunitatii a a pompei;2. Legarea ATP pe endodomeniul subunitatii a;3. Fosforilarea unui radical aspartat prin scindarea ATP la ADP (consumul energetic necesar

activitatii pompei) ~i schimbarea conformatiei proteinei care duce la expunerea celor trei ioniNa+pe ectodomeniul subunitatii a;

4. Disocierea ~iexpulzarea In exterior a ionilor Na+ si legarea pe ectodomeniul subunitatii a a doiioni de K+;

5. Hidrolizarea aspartilfosfatului si schimbarea conformatiei subunitatii a;6. lnternalizarea si expunerea ionilor K+pe endodomeniul subunitatii a;7. Disocierea ionilor K+si eliberarea lor In citosol cu inchiderea unui ciclu de pompare.

Pompa de Na+/K+este electrogenica, adica prin eliminarea a 3 ioni de Na+ si introducerea anurnai 2 ioni K+,contribuie la realizarea si/sau mentinerea potentialului membranar. Se intalneste inmembranele tuturor celulelor animale. Irnportanta prezentei si activitatii sale poate ft probata si defaptul ca adesea ea consuma jumatate din cantitatea celulara de ATP. Inhibarea activitatii ei prinouabaina, duce la incapacitatea celulara de a-si mentine echilibrul Na+/K+,cu afectarea potentialuluimembranar ~icomplicatii asupra fiziologiei celulare ce rezulta din asta.

8


Pompa discutata mai sus face parte din tipul Pde A'I'Paze, alaturi de pompa protonica (WA'Tl'aza), pompa WIK+ (H+,K+-ATPaza) ~i de pompa de calciu (Ca2+-ATPaza). P-ATPazeJe auaceeasi structura catalitica si mecanisme asemanatoare celui descris pentru pompa de Na+IK+.

La nivelul endomembranelor a fost evidentiat ~i tipul V de A'IPaze (ATPaze de tipvacuolar) care pornpeaza protoni in endosomi sau lizosomi. Organizarea acestora este mult maielaborata, avand nevoie de eel putin 11 subunitati ca sa i~i indeplineasca functia, ceea ce duce laformarea unor complexe proteice de ~lOOOkDa[31].

In sfarsit, mentionam ca la nivelul celulelor eucariote mai exista tipul F de A Tl'aze, caresintetizeaza ATP folosind energia rezultatta din disiparea unui gradient protonic existent la nivelulmembranei in care sunt organizate ~i tipul Ede A'I'Paze care sunt enzime ale suprafetei celulare curot in hidroliza diversilor nucleozidtrifosfati (inclusiv ATP) extracelulari, cu rol in diferitefenomene de semnalizare ~i nu in transportul activ. V-ATPazele si F-ATPazele au similitudini deorganizare (complexe proteice cu numar mare de subunitati) ~i reprezinta, pe baza mecanismului defunctionare, ceea ce numim motoare moleculare [31, 32].

Pentru completarea imaginii cooperarilor dintre diversitatea de componente functionale alemembranei celulare revenim la prezentarea unor fenomene care se completeaza reciproc in interesulbunei functionari a celulei, exernplificand colaborarea dintre diversi transportori la nivelul celulelorabsorbante intestinale, enterocitele. Enterocitele sunt celulele responsabile de preluarea din hranadigerata a compusilor biochimici utili rezultati, intre altii glucoza. Enterocitele sunt celulepolarizate, adica celule ale carer membrane au organizare moleculara (eel putin ca tipuri deproteine) diferita la nivelul lumenului intestinal (pol apical, unde suprafata membranei este multsporita prin structurarea unor digitatii numite microvili) fata de zonele dinspre tesuturi (pol laterobazal). La nivelul membranei apicale se afla transportorul simport SGLTI, care introduce glucozaIn citosolul enterocitului, alaturi de 2 ioni Na+ prin mecanismul de transport activ secundar,prezentat mai sus. Acest proces de transport are o parte buna (preluarea glucozei si Na+ dinalimente), dar ~i una periculoasa (introducerea de Na+ in exces in citosolul enterocitelor cu afectareapotentialului membranar). Glucoza este mai departe expulzata in spatiul subepitelial detransportorul uniport GLUT2 aflat in membrana Iatero-bazala, pentru a fi preluata de circulatiasanguina si transportata acolo unde organismul are nevoie de ea. De excesul de Na+ se ocupa pompade Na+/K+aflata tot in membrana latero-bazala a enterocitului, care eliminand 3 ioni de Na+ dinenterieit si introducand 2 ioni K+ in celula asigura rnentinerea homeostaziei ionice intracelulare aacesteia si potentialul membranar in limite normale. Prin aceste cooperari ale transportorilor dinmembranele apicala, respectiv latero-bazala ale enterocitului se asigura prelularea glucozei dinintestin chiar impotriva gradientului de concentratie, ceea ce conduce la cresterea concentratiei deglucoza in citosolul enterocitului, crestere care asigura functionarea transportorului pasiv GLUT2,deoarece concentratia glucozei in interstitiul peretelui intestinal este mai mica decat in enterocit, darasigura si mentinerea homeostaziei Na+ in enterocit deoarece ceea ce introduce simportul SGLTleste compensat de expulzarea efectuata de pompa Na+/K+.

incheiem discutiile referitoare la transportul activ prin mernbrana, amintind de o clasa detransportori cu deosebita semnificatie fiziologica si, mai larg, medicala, transportorii ABC (cuABC de la ATP-Binding Casette). Semnificatia fiziologica ~i medicala a lor rezida din faptul caacesti transportori induc rezistenta multipla la medicamente (,,multidrug-resistance") fiind capabilisa elimine medicamentele din celula. Se gasesc atat la procariote cat ~i la eucariote permitandprimelor adaptare si rezistenta la antibiotice, iar celulelor canceroase rezistenta la tratamente [33,34]. Transportorii ABC sunt de o mare diversitate ~i au capacitatea de a transporta o mare varietatede substante plecand de la ioni, glucide, aminoacizi, vitamine, lipide, antibiotice si medicamente(inclusiv xenobiotice) ~i ajungand pana la oligozaharide, oligopeptide, sau chiar proteine de masamoleculara mare [33-37]. in ciuda acestei mari diversitati de tipuri se pastreaza cateva reguli inorganizarea acestor structuri proteice transmembranare. in functie de modul in care sunt respectateaceste reguli transportorii ABC se pot imparti in: (i) sisteme importatoare mici, la care fiecareelement de organizare structurala este asigurat de un alt polipeptid; (ii) sisteme importatoare mari,la care organizarea implica doua subunitati proteice identice (homodimeri), sau diferite(heterodimeri); (iii) sisteme exportatoare organizate ca dimeri (numite si hemi-transportori, half-

9


transporter in engleza), sau monomeri (numite si transportori intregi, full-lenght transporter) [3l,34]. La om sunt identificate aproape 50 de tipuri de transportori ABC [37].

in incercarea de a intelege cum functioneaza transportorii ABC sa revenim la modul cumsunt ei structurati. Toate cele trei tipuri de sisteme de transportori ABC contin domeniitransmembranare (notate abreviat cu TMD, de la TransMembrane Domains) care realizeazacanalul prin care trece substanta transportata ~i domenii de legare a nucleotide/or (abreviat NBD,de laNucleotide-Binding Domains), pe fata citosolica a membranei, cu rol In legarea ~i hidrolizareacatalitica a ATP. Alaturi de aceste domenii sistemele importatoare mai contin domenii de legare asolutilor transportati (abreviat SBD, de la Solute-Binding Domains), pe fata externa a membranei,cu rol in preluarea si transferarea substantei transportate catre TMD [31]. Complexele proteicefunctionale contin doua TMD miez, a carer asociere sub forma unui V rasturnat (adica avanddeschiderea catre citosol) determina formarea canalului de transport a solutului ~i doua NBD careleaga doua molecule de ATP si le pozitioneaza antiparalel [31, 34]. De regula sistemeleimportatoare mici au fiecare dintre domeniile mentionate formate din polipeptide independente cese asociata ca homodimeri sau heterodomeri conducand la formarea complexului functional [31,34]. Sistemele importatoare mari ~i sistemele exportatoare sunt formate fie din doua subunitati(formand complexe homo- sau hetero-dimerice la hemi-transportori), fie dintr-o singura proteina (latransportorii intregi). La hemi-transportori cele doua subunitati structureaza pe baza aceluiasi lantpolipeptidic atat un TMD cat si un NBD, iar la transportorii intregi se structureaza In primajurnatate a lantului polipeptidic un TMD ~i un NBD, iar in cea de-a doua jumatate a lantului a douapereche TMD, NBD. TMD miez respecta regula organizarii cu 6 segmente transmembranare In ahelix, desi exista ~i sisteme care au TMD format din numai 5 segmente transmembranare, sau altelecare au 10 segmente transmembranare pentru fiecare TMD [31]. La transportorii cu mai mult de 6segmente transmembranare pe TMD exista dovezi experimentale care sugereaza rolul acestora inreglarea ~imodularea functiei.

Cum functioneaza aceste complexe transmembranare In procesul de transport? Mecanismulde actiune presupune modificari ciclice ale conformatiei ~i pozitiei relative a celor doua TMDdatorate hidrolizei ATP legat la nivelul NBD [31, 34]. Etapele ciclului de transport pentru sistemeleimportatoare sunt:

I. Legarea ~iacostarea la nivelul complexului transportor a solutului, prin SBD;2. Legarea ATP la NBD ~i adoptarea conformatiei acestor domenii care sa plaseze In pozitie

antiparalela cele doua molecule de nucleotid;3. Modificarea pozitiei TMD ~i inversarea deschiderii V catre suprafata membranei, datorita

interactiunilor de la nivelul NBD ocupate de ATP;4. Avansarea solutului in profunzimea deschiderii Va celor doua TMD;5. Hidrolizarea ATP cu eliberarea de pe NBD a ADP rezultat si inversarea deschiderii Va TMD

cu eliberarea solutului in citosol, ceea ce readuce conformatia complexului Ia cea initiala,capabila sa intre intr-un ciclu nou.

Pentru ciclul de actiune a sistemelor exportatoare, numarul de etape este mai mic:1. Intrarea solutului in adancitura Va TMD;2. Legarea ATP Ja NBD ~i interactiunea dintre cele doua NBD pentru asezarea antiparalela a

moleculelor de nucleotid;3. Modificarea pozitiei TMD cu inversarea deschiderii V ~i eliberarea solutului in spatiul

extracelular;4. Hidroliza ATP si inversarea deschiderii V, cu formarea conformatiei initiale a complexului

transportor.

in cele mai bine de trei decenii de cand au fast identificati, transportorii ABC au reprezentatbiostructuri membranare pentru care interesul stiintific a fast In permanenta crestere. Suntemdeparte de a cunoaste suficiente detalii legate de functionarea acestora, care sii ne permita sa iiexploatam eficient in medicina, Transportorii ABC raman mai departe structuri ale membranei

10

Dr. Mircea Leabu - Functionarea membrane/or ca sistem integrat. Transportul membranar

celulare de mare ~i acut interes pentru ceea ce numim medicina translationala, adica acele cercetaridin bio-rnedicina care sa duca la o cat mai eficienta aplicare a rezultatelor In clinica.

Transportul cu membranii.Transportul cu membrana este dependent fie de capacitatea unor microdomenii membranare

de a se invagina sub forma unor vezicule, urmata de desprinderea (fisionarea) membranei lor de ceala nivelul careia se formaeaza si introducerea substantelor captate In volumul veziculei In celula, fiede capacitatea endomembranelor veziculelor/vacuolelor de secretie de a fuziona cu membranacelulara ~i eliberarea in spatiul extracelular a substantelor din interior. Transportul cu mernbranapermite celulelor sa faca schimb de substanta cu exteriorul, ca ~i transportul prin membrana detaliatIn subcapitolul anterior, dar folosid mecanisme diferite, care irnplica nu doar proteinelemembranare, ci microdomenii membranare (adica portiuni de mernbrana ce solidarizeaza structuralsi functional anumite lipide/glicolipide si anumite proteine/glico-proteine cu scopul de a le facilitafunctionarea impreuna).

in functie de sensul In care se efectueaza, transportul cu membrana se irnparte in trei tipuri:1. Endocitozii, atunci cand componentele transportate sunt preluate din exterior ~i introduse in

celula;2. Exocitozii, prin care se elimina componente din interiorul celulelor In afara lor;3. Transcitozd, care este specifica celulelor ce organizeaza epitelii unistratificate ~i presupune

preluarea de substante din exteriorul celulei pe una din fetele epiteliului (la polul apical, adicadin lumenul delimitat de epiteliu, sau la polul Iatero-bazal, adica din spatiul interstitialsubepitelial), transportarea !or dintr-o parte in celalta a celulei epiteliale ~i eliminareamaterialului transportat trans-epitelial in exteriorul celulei, pe cealalta fata a epiteliului.

EndocitozaProcesele de preluare de substanta de catre celula din spatiul extracelular se pot clasifica in

functie de caracteristicile fizico-chimice ale materialelor endocitate, sau in functie de mecanismeleprin care se desfasoara.

In functie de caracteristicile materialelor preluate de celula endocitoza se imparte in douacategorii:

1. Fagocitoza (de la termenii grecesti quiyro - a manca + kyTo~- vas, recipient, celula + ro<ft.;sufix pentru proces, fenomen), atunci cand sunt endocitate materiale particulate (de exemplubacterii, fragmente celulare, virusuri), adica celula mananca.

2. Pinocitozd (de la termenii grecesti 1tivro - a bea + kyTo~ - vas, recipient, celula + ©<ft.; -sufix pentru proces, fenomen), cand sunt endocitate substante solubilizate In fluidulextracelular, adica celula bea.

Diferenta intre cele doua tipuri de endcitoza nu consta numai In tipul de material transportat Incelula ci si in mecanismul prin care acestea se desfasoara, chiar daca nu acesta este criteriul pentruclasificare.

Fagocitoza a fost descrisa cu mai bine de un secol in urma de Ilia Ilich Mechnikov' in 1882,iar denumirea ei a aparut pentru prima data intr-un articol al acestuia din 1884. O scurta istorie aevolutiei cunostintelor despre fagocitoza este prezentata intr-un recent articol de sinteza (38].Fagocitoza presupune extinderea de pseudopode (prelungiri citoplasmatice delimitate de domeniide membrana ale carer dinamica este controlata de rearanjari ale citoscheletului actinic) de-a lungulparticulei care urmeaza sa fie endocitata. In acest proces rolul filamentelor de actina este acela de aantrena, din interiorul celulei, membrana pentru formarea prelungirilor care Invaluie particula deendocitat. La nivelul membranei sunt implicati receptorii fagocitotici care se atasaza de componentede pe suprafata particulei care urmeaza a fi endocitate, cornponente care se numesc opsonine. Deregula aceste componente sunt anticorpi care recunosc proteine ale suprafetei structurii fagocitate.

3 Jlya Ilyich Mechnikov este laureat al Premiului Nobel 'in fiziologie sau medicina in 1908, premuil fiind impartit cuPaul Erlich. Motivatiajuriului a fost: ,,in recognition of their work on immunity".

11

--------- -·--·-~· -- ~-~-~··- •.•.•..._bi,-•• _..I ~IC»t'~IC.-C. llC<;llCLllUlf.UT

Aceasta decorare a particulelor fagocitate cu anticorpi poarta denumirea de opsonizare. inmomentul in care particula fagocitata este complet imbracata de prelunigirile celulei carefogociteaza, membrana fuzioneaza si particula este inclusa intr-o vacuola, in interiorul citoplasmeicelulei fagocitante. Vacuola poarta denumirea de endosom, in general, sau fagosom In cazulparticular al fagocitozei. Fagosomul fuzioneaza ulterior cu lizosomul, iar componenta fagocitataeste digerata,

Fagocitoza este un fenomen specific unor anumite tipuri de celule din organism cum suntmacrofagele, dar si plimorfo-nuclearelor, numite si microfage. De mentionat ca la moarteaprograrnata, corpii apoptotici care se formeaza ~ecl.an~azap;ocesul fago¥citoticla celul~le d~njur,tara ca acestea sa fie neaparat macrofage profesioniste, ducand la o curatare a tesutului, fara a seproduce inflamatii [39, 40]. . . . ¥

Pinocitoza este mai diversa din punctul de vedere al mecamsmelor pnn care se reahzeaza.De aceea se definesc mai multe tipuri de pinocitoza, pe baza acestor mecanisme. A •

o prima forma este pinocitoza constiuaivii. Aceasta. presupune pre.l~area 1~ vezicule deendocitoza a unor volume de lichid extracelular, cu tot ce contme acesta solubth~at, prmtr-u~ proce.sce se desfasoara de la sine, continuu, asemenea unui act reflex, cum ~r fi respiratia org~msmulm.Evident, printr-un asemenea proces, cantitatile de substante end?cttate .sunt proport1onale cuconcentratiile in acre acestea se afla in mediul extracelular. Refentor la mtens1ta~eacu car: ~edesfasoara pinocitoza constitutiva, putem sa g~ndi~ ca aceasta poate¥fi mod~lata d~ celula ~conformitate cu nevoile ei concrete, rara a exista m momentul de fata dovezi expenmenta.le maceasta directie si rara sa se schimbe caracterul ei constitutiv, daca acesta modulare a frecventei s-arintampla. . . ¥ • • ~ • ~

O a doua forma este pinocitoza mediatii de receptori, numita mar uzual endocitozii mediatiide receptori. Termenul a fost introdus in 1976 de Joseph L. Goldstein ~i Michael S. Brown"preocupati de metabolizarea LDL (lipoproteinelor de densitate joasa; prescurtarea vine de latermenul englezesc Low Density Lipoprotein) ~i rolul acestuia in controlul ~i modulareacolesterolemiei ~i in ateroscleroza [41]. Ei au descris preluarea LDL prin endocitoza mediata derepeptor de catre fibroblaste [42, 43]. Prin acest proces sunt internalizate de catre celula proteine(liganzi) care mai intai sunt recunoscute si legate de receptori specifici de pe suprafata celulei. Dupace receptorul interactioneaza cu ligandul, complexele receptor-ligand sunt adunate in adincituri alemembranei tapetate pe fata interna cu un complex de endoproteine a carui componenta de baza esteclatrina [44]. Aceste microdomenii adancite ale membranei invelite cu clatrina sunt denumitestructuri cu invelis (In engleza, ,,coatedpits"). Acestea se formeaza permanent aglomerand fiereceptorii in asteptarea liganzilor, fie complexele ligand-receptor, dupa formare. Pe masura cereceptorii expusi la suprafata celulelor sau complexele receptor-ligand se aglomereaza inmicrodomeniul corespunzator al membranei, iar invelisul de clatrina se formeaza adancituramembranei creste pana la definitivarea formei sale sferice ~i desprinderea de membrana la nivelulcareia s-a format, sub forma unei vezicule cu tnvelis. Rolul clatrinei este acela de a aglomeracomplexele ligand-receptor in zona membranara destinata endocitarii (pentru unii dintre receptori)si de a controla adancirea microdomeniului membranar, care devine structura cu invelis ~i formareaveziculei cu invelis. Acest rot are Ja baza capacitatea clatrinei de a se asambla in trimeri numititrischelioni [45], care mai departe pot forma ochiuri hexagonale ~i pentagonale intr-o geometrieasemanatoare peticelor mingii de fotbal, care due la formarea veziculei. Trimerizarea clatrinei Iatrischelioni si inretelarea acestora se realizeaza prin participarea unor molecule proteice ajutatoare,numite proteine adaptor, prescurtat AP (de la numele englezesc Adaptor Protein). inveli~ul declatrina al veziculelor de endocitoza mediata de receptor se dezasambleaza imediat dupadesprinderea veziculei de membrana celulara devenind endosom. Endosomul se transforma adeseaIn lizosom prin fuzionarea cu organitul preexistent in celula, Analizand dinamica procesului deendocitoza mediata de receptori, deducem ca acest tip de transport cu rnembrana este unulconcentrativ, ceea ce o deosebeste de pinocitoza constitutiva. Ligandul este introdus In celula la o

4Joseph L. Goldstein si Michael S. Brown sunt laureati ai PremiuJui Nobel pentru fiziologie sau medicina In 1985, iar

motivatia juriului a fost: ,,for their discoveries concerning the regulation of cholesterol metabolism"12

Dr. Mircea Leabu - Func(ionarea membrane/or ca sistem integrat. Transportul membranar

13

concentratie mai mare decat cea in care el se afla In mediu. Aceasta caracteristica se datoreazafaptului ca, inainte de a fi endocitat, ligandul este acumulat si concentrat la nivelul structurii deinvelis prin complexele receptor-ligand. Endocitoza mediata de .~ecepto~i a fost descrisa p_enn:uunele lipoproteine plasmatice, pentru transferina, sau pentru unn facton de crestere. Destinatiamaterialului endocitat prin medierea receptorilor este diferita. LDL se elibereaza in endozom, subactiunea pH-ului acid ~i este directionat catre lizosomi,. in timp c~ r_ecept?rul_est~ reciclat lasuprafata celulei pentru un nou ciclu de endocitoza. Sub actiunea aceluiasi mediu acid din endosom,transferina pierde fierul, iar eliberarea ionului metalic 0 face sa ramana atasata de receptor, caapotransferina, este reciclata la suprafata celulei, unde, la pH neutru, se desprinde de receptor pentrua reintra intr-un noi ciclu de transport de tier. Reciclarea receptorului la LDL ~i a complexuluireceptor-transferina se face prin intrarea lor in apendice tubulare ale endosomilor timpurii.Procesele de aglomerare ~i sortare din endocitoza mediata de receptori sunt inalt reglate de celula,in aceste fenoimene de reglare participa si ubiquitina care conjuga receptorii prin ceea ce senurneste monoubiquitinilare sau multiubiquitinilare, acestea fiind diferite de fenomenul depoliubiquitinilare a proteinelor citosolice care urmeaza sa fie degradate in proteasomi (vezi la cursuldespre organite nedelimitate de endomembrane).

Relativ recent a fost evidentiata ~io a treia forma de pinocitoza, tot mediata de receptori, darpentru molecule mici. Acest proces de transport membranar a fost denumit potocitozii (de latermenii grecesti 1tO'TO- a bea + kyToi; - vas, recipient, celula + roaii; - sufix pentru proces,fenomen). Ca si pinocitoza constitutiva, potocitoza se efectueaza prin intermediul caveolelor.Potocitoza a fost evidentiata prima data pentru acidul folic ~idenumita astfel in 1992 de Richard G.W. Anderson [46, 47]. Procesul de potocitoza, dupa legarea moleculelor mici, astfel transportate, dereceptori (ectoproteine cu ancora glicofosfatifdilinozitolica [48]) ~i sechestrarea lor in caveole,permite trecerea acestora direct in citoplasrna prin anumite canale din membrana caveolara. Acestecanale se deschid In momentul in care caveolele l~i inchid comunicarea cu exteriorul. in momentulde fata Anderson ~i alti cercetatori care studiaza functiile caveolelor incearca sa extinda procesul depotocitoza la toate fenomenele de transport care sunt efectuate de caveole prin evitarea caii catrelizosom [49].

Exista In prezent o preocupare sustinuta pentru intelegerea la nivel molecular a diverselorforme de pinocitoza ceea ce a condus la o clasificare a lor In endocitoza dependenta de clatrina ~iendocitoza independents de clatrina (ceea ce Inseamna o diferentiere la nivelul mecanismelor ceerau incluse in pinocitoza constitutiva) [50, 51]. La randul ei endocitoza independenta de clatrinapoate fi endocitoza dependenta de caveolina, sau endocitoza independenta de caveolina, dardependenta de alte tipuri de proteine care sa asigure invaginarea si fisiunea veziculelor cudesprinderea lor de membrana. Daca majoritatea tipurilor de endocitoza sunt efectuate de structuriveziculare, au fost evidentiate procese de endocitoza ce implica invaginari membranare sub formade structuri tubulare [50, 51].

Departe de a fi pentru celula doar o cale de a prelua materie din spatiu extracelular,endocitoza este un fenomen care permite celulei sa controleze functiile membranei, prin modulareacomponentelor acesteia [52, 53]. Prin endocitoza, celula poate ascunde componente ale organizariimembranei permitand reciclarea acestora in functie de nevoile celulei, sau le poate elimina temporardegradandu-le, pentru a le biosintetiza din nou ~i expune la suprafata celulei atunci cand este cazul[54]. A~a se intampla cu o mare parte dintre componentele implicate in semnalizarea celulara (vezimai jos) iar aceasta realitate este un alt exemplu de cooperare intre fenomenele ce definesc celedoua mai roluri ale membranei: schimbul de substanta (transportul membranar) si schimbul deinformatie (semnalizarea celulara). Endosomii care se formeaza dupa desprinderea de rnernbrana astructurilor de endocitoza asigura sortari ale componentelor endocitate si chiar sunt irnplicati incontinuarea proceselor de semnalizare [55].

ExocitozaProcesul prin care celula elimina substante produse In diverse procese celulare (inclusiv

biosinteze de cornpusi destinati secretiei) ~i acumulate temporar in structuri delimitate deendomembrane numite vezicule sau vacuole de secretie poarta numele de exocitoza. Exocitoza este


ultimul pas al unui proces celular complex, care implica in cascada mai multe organite (ribosomi,reticul endolasmatic, aparat Golgi, sistem endosomal) proces numit secretie celulara. Din punct devedere al mecanismelor prin care este controlata, exocitoza poate fi constitutiva, sau semnalizata.Aceasta inseamna ca unele produse destinate secretiei sunt eliminate din celula pe masura ce seformeaza veziculele secretorii si acestea ajung la membrana celulara unde are loc fuzionarearnernbranelor si secretia, prin procese constitutive, care se desfasoara de la sine. Pe de alta parte,anumite componente produse in celula sunt acumulate ~i stocate in zone juxtamembranare panacand celula primeste un semnal care comanda secretia lor. Aceasta exocitoza semnalizata estedependenta de cresterea concentratiei de Ca2+ din citoplasma in zona de stocare a veziculelor desecretie [56]. Mecanismul exocitozei presupune urmatoarele etape [57, 58]:

1. Transportul veziculelor (in engleza ,,vesicle trafficking") de secretie din locul de formare inlocul de stocare din apropierea membranei Ja nivelul careia se face secretia. Acest transporteste efectuat de asa-numitele motoare moleculare (izoforme de miozina pentru transportul pecalea filamentelor de actina, sau dyneina ori kinesina pentru transportul pe caleamicrotubulilor);

2. Ancorarea veziculelor (in engleza .vesicle tethering") prin factori de ancorare de naturaproteica la o distanta de ~25nm de membrana celulara;

3. Acostarea veziculelor (In engleza .vesicle docking") la membrana celulara, adica aducereaacestora la o distanta de 5 - 1Onm (cat grosimea unei membrane) intre cele doua membrane(celulara, respectiv veziculara);

4. Initierea vezicu~~l~r (in engleza ,,vesicle p;tming"d+care pres~pune ~ s~r.ie de evenimentelegate de rearanjarile dependente de ATP ~1 de Ca ale proteinelor ~1 lipidelor membraneiveziculare, rearanjari necesare efectuarii ultimei etape. (In exocitoza constitutiva aceasta etapanu exista);

5. Fuzfonarea vezicule~or ~[59] c~ membrana celulara si expulzarea produsilor de secretie.Fuz1onare~ ~ste rea!t~ata de ruste proteine numite abreviat SNARE (de Ja "Soluble Nethylmaleimide-sensitive Attachment protein REceptor") care sunt v-SNARE (in membranavez_iculelor)si t-S~~ (in m~mb~anatinta, cu t de la englezescul target= tinta). Se pare cafuzionarea (~elyutm m u~ele tipuri de celule) se face la nivelul unor structuri preexistente inmembran_a tmta, structun care favorizeaza deschiderea veziculelor si au fost denumiteporosomt [60, 61].

TranscitozaDesi privita simplist ar parea o insumare a endocitozei si exocitozei, lucrurile nu sunt asa.

Transcitoza este un proces al carui mecanism, chiar daca neelucidat in momentul de fata, estedeparte de a insemna o endocitoza urmata de o exocitoza. Termenul a fost introdus de NicolaeSimionescu in 1979 (62] privitor la trecerea prin celulele endoteliale de macromolecule dinspreplasma catre tesut ~i invers, prin structuri delimitate de membrane, nurnite la inceput, pentrucelulele endoteliale vezicule plasmalemale, ulterior fiind numite caveole in cazul tuturor tipurilorcelulare. Transcitoza este un proces specific celulelor epiteliale ale epiteliilor simple (monostratificate ). Celulele endoteliale de la nivelul capilarelor sunt exemplul clasic de celule care efectueazatranscitoza. Procesul se petrece insa ~ila nivelul altor epitelii cum ar fi epiteliul absorbant intestinal.Hepatocitele efectueaza si ele transcitoza pentru dimeri de JgA de la polul sanguin la polul biliar.lgA astfel eliminat in bila ajunge in tubul digestiv unde au Joe prime activitati de aparare imunalegate de alimentatie. Exemplul transportului trans-hepatocit al dimerilor de lgA reprezinta dupatoate evidentele o transcitoza mediata de receptor (63].De altfel transportul prin transcitoza al unor polimeri imunoglobulinici pare a fi o proprietate atuturor epiteliilor simple ce captusesc organe cavitare, cu rol In initierea apararii imune inca dinaceste spatii echivalente topologic cu exteriorul organismului. Spre exemplu, acest tip de transcitozaa fost dovedit ~ipentru epiteliul uterin [66].Celor interesati de noutatile referitoare la transcitoza sub aspectul diversitatii epiteli_ilorla niv~lulcarora se petrece si asupra mecanismelor prin care se produce, le recomandam eel mat recent articol

14


de sinteza scris de Pamela Tuma ~iAnn Hubard, de la John Hopkins University, Baltimore [65]. inacest articol se va vedea ca, desi transcitoza a fost definita ca proces specific celulelor epitelialesimple, ea se petrece si in sisteme neepiteliale.

Bibliografie specifica1. Montel-Hagen A, Sitbon M, Taylor N. (2009) Erythroid glucose transporters. Curr Opin Hemato/. 16: 165-

172.2. Uldry M, Thorens B. (2004) The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters. Pjlugers Arch.

447: 480-489.3. Hou JC, Pessin JE. (2007) lns (endocytosis) and outs (exocytosis) ofGLUT4 trafficking. Curr Opin Cell Biol.

19: 446-473.4. Cheeseman C. (2008) GLUT7: a new intestinal facilitated hexose transporter. Am J Physio/ Endocrinol Metab.

295: E238-E24 I.5. Mavros Y, Simar D, Singh MA. (2009) Glucose Tranporter-4 expression in monocytes: a systematic review.

Diabetes Res C/in Pract. 84: 123-131.6. Wright EM, Turk E. (2004) The sodium/glucose cotransport family SLC5. Pjlugers Arch. 447: 510-518.7. Wright EM, Hirayama BA, Loo DF. (2007) Active sugar transport in health and disease. J Intern Med. 261:

32-43.8. Williamson RC, Toye AM. (2008) Glycophorin A: Band 3 aid. Blood Cells Mo/ Dis. 41: 35-43.9. Satchwell TJ, Shoemark DK, Sessions RB, Toye AM. (2009) Protein 4.2: a complex linker. Blood Cells Mo/

Dis. 42: 201-210.10. Alper SL. (1991) The band 3-related anion exchanger (AE) gene family. Annu Rev Physiol. 53: 549-564.11. Jay DG. (1996) Role of band 3 in homeostasis and cell shape. Cell. 86: 853-854.12. Barzilai A, Rahamimoff H. (1987) Stoichiometry of the sodium-calcium exchanger in nerve terminals.

Biochemistry. 26: 6113-6118.13. DiPolo R, Beauge L. (2006) Sodium/calcium exchanger: influence of metabolic regulation on ion carrier

interactions. Physiol Rev. 86, 155-203.14. Yang YC, Fann MJ, Chang WH, Tai LH, Jiang JH, Kao LS. (2010) Regulation of sodium-calcium exchanger

activity by creatine kinase under energy-compromised conditions. J Biol Chem. Jun 24. [Epub ahead of print].15. Ren X, Nicoll DA, Philipson KO. (2006) Helix packing of the cardiac Na+-Ca2+ exchanger: proximity of

transmembrane segments 1, 2, and 6. J Biol Chem. 281: 22808-22814.16. Bers DM. (2000) Calcium fluxes involved in control of cardiac myocyte contraction. Circ Res. 87: 275-281.17. Arnad6ttir J, Chalfie M. (2010)Eukaryotic mechanosensitive channels. Annu Rev Biophys. 39: 111-137.18. Zeidel ML. (2012) Water homeostasis: evolutionary medicine. Trans Am Clin Climatol Assoc. 123: 93-105.19. Verkman AS. (2011) Aquaporins at a glance. J Cell Sci. 124: 2107-2112.20. Preston GM, Carroll TP, Guggino WB, Agre P. (1992) Appearance of water channels in Xenopus oocytes

expressing red cell CHlP28 protein. Science. 256(5055): 385-387.21. Verkman AS, Mitra AK. (2000) Structure and function of aquaporin water channels. Arn J Physiol Renal

Physiol. 278(1): Fl3-28.22. Blanco G, Mercer RW. (1998) Isozymes of the Na-K-ATPase: heterogeneity in structure, diversity in function.

Am JPhysiol. 275(5 Pt 2): F633-F650.23. Blanco G. (2005)Na,K-ATPase subunit heterogeneity as a mechanism for tissue-specific ion regulation. Semin

Nephrol. 25: 292-303.24. Axelsen KB, Palmgren MG. (1998) Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily. J

Mo/ Evol. 46: 84-101.25. Beggah AT, Jaunin P, Geering K. (1997) Role of glycosylation and disulfide bond formation in the b subunit

in the folding and functional expression ofNa,K-ATPase. JBiol Chem. 272: 10318-10326.26. Geering K. (2008) Functional roles ofNa,K-ATPase subunits. Curr Opin Nephrol Hypertens. 17: 526-532.27. FUzesi M, Gottschalk KE, Lindzen M, Shainskaya A, Kuster B, Garty H, Karlish SJ. (2005) Covalent cross

links between the gamma subunit (FXYD2) and alpha and beta subunits ofNa,K-ATPase: modeling the alphagamma interaction. J Biol Chem. 280: 18291-18301.

28. Lindzen M, Gottschalk KE, Filzesi M, Garty H, Karlish SJ. (2006) Structural interactions between FXYDproteins and Na+,K +-ATPase: alpha/beta/FXYD subunit stoichiometry and cross-linking. J Biol Chem. 281:5947-5955.

29. Berl T. (2009) How do kidney cells adapt to survive in hypertonic inner medulla? Trans Am Clin Climato/Assoc. 120: 389-401.

30. Faller LD. (2008) Mechanistic studies of sodium pump. Arch Biochem Biophys. 476: 12-21.31. Nelson N, Perzov N, Cohen A, Hagai K, Padler V, Nelson H. (2000) The cellular biology of proton-motive

force generation by V-ATPases. J Exp Biol. 203(Pt 1): 89-95.32. Nakanishi-Matsui M, Sekiya M, Nakamoto RK, Futai M. (2010) The mechanism of rotating proton pumping

ATPases. Biochim Biophys Acta. 1797: 1343-1352.

15


33. Biemans-Oldehinkel E, Doeven MK, Poolman B. (2006) ABC transporter architecture and regulatory roles ofaccessory domains. FEBS Lett. 580: 1023-1035.

34. Oldham ML, Davidson AL, Chen J. (2008) Structural insights into ABC transporter mechanism. Curr OpinStruct Biol. 18: 726-733.

35. Huang Y, Sadee W. (2006) Membrane transporters and channels in chemoresistance and -sensitivity of tumorcells. Cancer Lett. 239: l 68-182.

36. Oostendorp RL, Beijnen JH, Schellens JH. (2009) The biological and clinical role of drug transporters at theintestinal barrier. Cancer Treat Rev. 35: 137-147.

37. Nagao K, Kimura Y, Mastuo M, Ueda K. (2010) Lipid outward translocation by ABC proteins. FEBS Lett.584: 2717-23.

38. Tissieres P, Pugin J. (2009) The role of MD-2 in the opsonophagocytosis of Gram-negative bacteria. CurrOpin Infect Dis. 22: 286-291.

39. de Almeida CJ, Linden R. (2005) Phagocytosis of apoptotic cells: a matter of balance. Cell Mo/ Life Sci. 62:1532-1546.

40. Elliott MR, Ravichandran KS. (2010) Clearance of apoptotic cells: implications in health and disease. J CellBiol. 189: 1059-1070.

41. Goldstein JL, Basu SK, Brunschede GY, Brown MS. (1976) Release of low density lipoprotein from its cellsurface receptor by sulfated glycosaminoglycans. Cell. 7: 85-95.

42. Goldstein JL, Brown MS. (1976) The LDL pathway in human fibroblasts: a receptor-mediated mechanism forthe regulation of cholesterol metabolism. Curr Top Cell Regul. 11: 147-181.

43. Brown MS, Ho YK, Goldstein JL. (1976) The low-density lipoprotein pathway in human fibroblasts: relationbetween cell surface receptor binding and endocytosis of low-density lipoprotein. Ann NY Acad Sci. 275: 244-257.

44. Pearse BM. (1976) Clathrin: a unique protein associated with intracellular transfer of membrane by coatedvesicles. Proc Natl Acad Sci US A. 73: 1255-1259.

45. Ungewickell E. (1983) Biochemical and immunological studies on clathrin light chains and their binding siteson clathrin triskelions. EMBO J. 2: 1401-1408.

46. Anderson RG, Kamen BA, Rothberg KG, Lacey SW. (1992) Potocytosis: sequestration and transport of smallmolecules by caveolae. Science. 255: 410-411.

47. Matsue H, Rothberg KG, Takashima A, Kamen BA, Anderson RG, Lacey SW. (1992) Folate receptor allowscells to grow in low concentrations of 5-methyltetrahydrofolate. Proc Natl Acad Sci US A. 89: 6006-6009.

48. Anderson RGW. (1998) The caveolae membrane system. Ann Rev Biochem. 67: 199-225.49. Mineo C, Anderson RG. (2001) Potocytosis. Robert Feulgen Lecture. Histochem Cell Biol. 116: 109-118.50. Doherty GJ, McMahon HT. (2009) Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78: 857-902.51. Hansen CG, Nichols BJ. (2009) Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122(Pt

11): 1713-1721.52. Grant BO, Donaldson JG. (2009) Pathways and mechanisms of endocytic recycling. Nat Rev Mo/ Cell Biol.

10: 597-608.53. Doherty GJ, McMahon HT. (2009) Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78: 857-902.54. Masilamani M, Peruzzi G, Borrego F, Coligan JE. (2009) Endocytosis and intracellular trafficking of human

natural killer cell receptors. Traffic. 10: 1735-1744.55. Murphy JE, Padilla BE, Hasdemir B, Cottrell GS, Bunnett NW. (2009) Endosomes: a legitimate platform for

the signaling train. Proc Natl Acad Sci US A. 106: 17615-1722.56. Barclay JW, Morgan A, Burgoyne RD. (2005) Calcium-dependent regulation of exocytosis. Cell Calcium. 38;

343-353.57. Mayer A. (2002) Membrane fusion in eukarzotic cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 18; 289-314.58. Verhage M, Sorensen JB. (2008) Vesicle docking in regulated exocytosis. Traffic. 9: 1414-1424.59. Leabu M. (2006) Membrane fusion in cells: molecular machinery and mechanisms. J Cell Mo/ Med. 10; 423-

427.60. Jena BP. (2004) Discovery of the Porosome: revealing the molecular mechanism of secretion and membrane

fusion in cells. J Cell Mo/ Med. 8: 1-21.61. Jena BP. (2008) Porosome: the universal molecular machinery for cell secretion. Mo/ Cells. 26: 517-529.62. Simionescu N. (1979) The microvascular endothelium. Segmental diferentiation, transcytosis: selective

distribution of anionic sites .. In ,,Advances in Inflammation Research". Editata de Gerald Weissmann, BengtSamuelsson ~iRodolfo Paoletti. Raven Press, New York, 1979, vol. I, pp. 61-70.

63. Geuze HJ, Slot JW, Strous GJ, Peppard J, von Figura K, Hasilik A, Schwartz AL. (1984) Intracellular receptorsorting during endocytosis: comparative irnmunoelectron microscopy of multiple receptors in rat liver. Cell.37: 195-204.

64. Richardso~ !M, Ka.ushic ~' Wira CR. (1995) Polymeric immunoglobin (lg) receptor production and JgAtranscytosis m polanzed primary cultures of mature rat uterine epithelial cells. Biol Reprod. 53: 488-498.

65. Tuma PL, Hubbard AL. (2003) Transcytosis: crossing cellular barriers. Physiol Rev. 83: 871-932

16

Documents

Curs Biocel 16.10.2013