TEHNICI DE IZOLARE ŞI SORTARE CELULARĂ

IZOLAREA ŞI SORTAREA CELULARĂ

Majoritatea tehnicilor de analiză biochimică presupun izolarea celulelor din

contextul lor tisular. În acelaşi timp, pentru o analiză cantitativă şi calitativă coerentă,

este necesar un număr relativ mare de celule. Dacă pornim investigaţia de la un fragment

de ţesut, problema întâmpinată constă în faptul că acest fragment conţine un număr mare

de specii celulare amestecate. Este deci necesară extragerea diferitelor specii celulare

urmată de o sortare în funcţie de diferite criterii; dacă numărul de celule este satisfăcător,

se poate trece la destructurarea celulară în vederea analizei conţinutului; dacă numărul de

celule este insuficient, se poate proceda la multiplicarea acestora în cadrul unor culturi

celulare, din care vor fi prelevate mostre pentru o analiză ulterioară.

Izolarea celulară din ţesuturi Cele mai accesibile ţesuturi animale pentru izolare celulară sunt cele fetale sau

neonatale, în care dinamica şi multiplicarea celulară sunt accentuate iar stabilitatea

joncţiunilor intercelulare ca şi cantitatea de matrice extracelulară sunt reduse. Desigur,

celulele izolate trebuie să-şi păstreze viabilitatea fie că este vorba de o tentativă

exploratorie fie că vor fi supuse cultivării ulterioare.

Primul pas în vederea izolării celulare este reprezentat de denaturarea

conexiunilor intercelulare şi a liantului reprezentat de matricea extracelulară. Joncţiunile

intercelulare sunt dependente de prezenţa ionilor de Ca. Astfel, un chelator (agent de

îndepărtare) al calciului cum este EDTA (acid etilen-diamino-tetra-acetic) aplicat

fragmentului de ţesut de investigat, va determina desfacerea joncţiunilor menţionate, cu

eliberarea celulelor. Matricea extracelulară (incorect denumită anterior – substanţă

fundamentală) poate fi denaturată prin tratamentul fragmentului tisular cu enzime

proteolitice ca tripsina sau colagenazele (al căror rol este de a digera componentele ale

matricei extracelulare cum ar fi colagenul sau proteoglicanii). După tratarea unui

fragment tisular prin tripsinizare (cu tripsină) şi EDTA, de obicei este suficientă o uşoară

agitare a eşantionului pentru a disocia celulele viabile. În eprubeta de lucru se obţine o

mixtură celulară, formată din celule izolate, în suspensie.

Al doilea pas este separarea şi sortarea celulelor în suspensie, obţinute prin

izolarea din ţesuturi. Procedurile de separare implică metode fizice, cum ar fi

centrifugarea, care va fi descrisă la metodele de separare a organitelor celulare, pentru

care a fost iniţial concepută. Alte proceduri de separare se bazează pe capacitatea

celulelor de a adera mai mult sau mai puţin la diferite tipuri de suprafeţe (sticlă sau

plastic).

Una din cele mai interesante tehnici de sortare este bazată pe posibilitatea

utilizării anticorpilor specifici. Aceşti anticorpi (proteine specifice sintetizate de celulele

sistemului imun, ca răspuns la structuri non-self) pot fi ataşaţi la suprafaţa celulelor, în

mod diferenţial şi pot interacţiona adeziv cu diferite suporturi organice (colagen,

polizaharide, microsfere de plastic. Aceste suporturi organice formează o suprafaţă de

afinitate la care celulele marcate cu anticorpi vor adera. După aderare, celulele pot fi

desprinse fie prin agitare uşoară, tratament cu tripsină (tripsinizare) pentru a denatura

proteinele care au mediat fenomenele de adezivitate sau tratament cu enzime care

denaturează substratul de tip matriceal (colagenul pentru care utilizăm o colagenază).

Una din tehnicile cele mai avansate de sortare a celulelor utilizează cuplarea cu

anticorpi urmată de marcajul fluorescent al acestora. Celulele marcate astfel (cu anticorpi

marcaţi la rândul lor cu fluoroforul specific) sunt separate de un sistem de sortare prin

activarea fluorescenţei. Celulele marcate circulă prin acest sistem de sortare (fig. …) în

flux laminar iar fluorescenţa fiecărei celule este măsurată precis. Un subansamblu de

sonicare formează picături microscopice care conţin câte o celulă sau nu conţin de loc

celule. Aceste picături microscopice sunt încărcate pozitiv sau negativ în momentul

formării, în funcţie de pozitivitatea sau negativitatea fluorescenţei. Apoi, picăturile trec

printr-un câmp electric care le deviază traiectoria în funcţie de încărcarea electrică.

Astfel, picăturile cu încărcare pozitivă (şi care conţin celule marcate fluorescent) sunt

depozitate într-un recipient fiind separate de cele încărcate negativ. Particulele şi

picăturile neîncărcate îşi continuă parcursul în mod gravitaţional, ajungând în recipientul

de deşeuri. Astfel de sisteme de sortare au o capacitate de 5000 de celule pe secundă.

Celulele obţinute prin această metodă de sortare pot fi supuse direct analizelor

biochimice sau pot fi direcţionate spre alte metode de multiplicare celulară – culturi

tisulare şi stabilizarea de linii celulare.

Culturi tisulare şi celulare

Prin definiţie, culturile tisulare reprezintă totalitatea tehnicilor de menţinere şi în

unele situaţii de creştere şi multiplicare in vitro a unor mici fragmente tisulare extrase de

la plante sau animale. Culturile tisulare sau celulare sunt necesare pentru studiul efectelor

unor substanţe endogene sau exogene asupra sistemelor vii. Culturile de ţesut sunt

utilizate pentru a iniţia culturi celulare.

Istoric 1881 – Roux a demonstrat viabilitatea celulelor de la embrionul de găină într-o

soluţie salină şi în afara unui organism viu

1907 – Harrison rezolvă controversa „doctrinei neuronale” care susţinea că

extensiile neuronale se dezvoltă prin evoluţia corpului neuronal şi nu prin

fuziunea celulelor care înconjură aceste extensii. El a cultivat fragmente

de măduvă spinală de amfibian (ex. broască) pe cheag limfatic şi a

demonstrat că extensiile neuronale se dezvoltă pornind de la corpul

neuronal şi invadând suportul nutritiv.

1913 – Carrel demonstrează că unele celule pot creşte şi supravieţui pentru un

timp în cultură dacă sunt alimentate corespunzător şi menţinute într-un

mediu aseptic.

1948 – Earle şi colab. izolează celule din linia L şi determină formarea de clone

celulare în cultură de ţesuturi.

1952 – Gey şi colab. stabilizează prima linie celulară din carcinomul cervical

uman, linie cunoscută astăzi sub numele HeLa.

1961 – Hayflick şi Moorehead arată că numeroase fibroblaste mor după un număr

determinat de diviziuni în cultură.

1964 – Littlefield introduce mediul HAT în vederea creşterii selective a hibrizilor

de celule somatice. Odată cu punerea la punct a tehnicilor de hibridare a

celulelor a fost deschisă era manipulării genetice.

1965 – Ham şi colab., a definit un mediu de cultură fără ser pentru celule de la

mamifere. Au fost create primele celule hibrid umane-murine (Harris-

Watkins).

1975 – Kohler şi Milstein au produs prima dată anticorpi monoclonali din linii

celulare compuse din hibridoame.

1976 – Sato şi colab., arată că pentru creşterea celulelor în medii fără ser este

necesară prezenţa unor factori de creştere şi hormoni.

Terminologie.

Experimentele de cultivare pot avea loc in vitro (ad literam, pe sticlă) sau in vivo,

în cadrul unor organisme intacte. Există posibilitatea unor confuzii, mai ales în sens

biochimic, deoarece termenul in vitro se referă la reacţii biochimice care au loc în afara

celulelor iar termenul in vivo se referă la reacţii care au loc în interiorul unei celule vii.

Noţiunea de cultură celulară se referă la situaţia în care fragmentul de ţesut este

disociat în elementele celulare componente; aceste elemente celulare pot prolifera în

condiţii fizico-biochimice speciale prestabilite, prin aderarea la un substrat de plastic sau

sticlă sau în suspensie în mediul de cultură.

Noţiunea de cultură tisulară a unor fragmente mici este sinonimă cu cea de

explant. Menţinerea fragmentelor mici la o interfaţă lichid-solid prin ataşarea tisulară la

un substrat de plastic sau de sticlă permite creşterea celulelor pe substrat şi migrarea şi

proliferarea celulară ulterioară; poate fi astfel generată o linie celulară.

Noţiunea de cultură de organ presupune ca ţesutul să nu fie disociat ci menţinut la

interfaţa lichid-solid; tehnica permite menţinerea arhitecturii tisulare dar nu permite

propagarea liniilor celulare în volum.

Aplicaţii Culturile tisulare sunt utilizate pentru:

- studiul celulelor în micromedii reglate fizic şi fiziologic;

- caracterizarea şi validarea unui stoc de celule;

- minimizarea utilizării animalelor de experienţă;

- studii de transfecţie (introducerea ADN exogen în genomul unor celule izolate

şi caracterizate pentru investigarea comportamentului celular şi mutaţiilor);

- inginerie proteică – studiul mecanismelor de semnalizare şi de răspuns celular

citotoxic sau genotoxic, mecanisme sintetice de răspuns la stimuli externi;

Culturile tisulare nu reproduc cu acurateţe condiţiile in vivo datorită diferenţelor de

micromediu, absenţei enzimelor hepatice specifice şi dificultăţilor în reproducerea unui

fenotip celular complet diferenţiat in vitro. Liniile celulare rezultate din culturi sunt

genetic instabile şi heterogene din punct de vedere genotipic.

Clasificare

Culturile pot fi clasificare grosier în:

- culturi primare – derivate direct din fragmente de ţesut sau organ; culturile

rezultă fie din explant (fără o etapă iniţială de disociere tisulară) fie după

disociere enzimatică într-o suspensie celulară.

- culturi secundare (continue) - rezultate ca urmare a extracţiei celulelor din

cultura primară şi cultivări ulterioare; se pleacă de la un singur tip de celule

care se multiplică de un număr limitat de ori (de obicei 30 de ori) sau se pot

multiplica la infinit. Culturile continue finite constau în celule diploide, cu un

grad accentuat de diferenţiere (ex. fibroblaste care continuă să secrete

colagen) şi care suferă progresiv procese de senescenţă.

Menţiune: Culturile celulare care se permanentizează presupun o propagare celulară pe o

perioadă nedefinită şi, de obicei, se transform în celule tumorale. Celulele tumorale sunt

foarte uşor de cultivat şi se obţin fie direct din tumori clinice fie prin inducţie din celule

normale prin transfecţia unor oncogene virale sau prin tratamente chimice.

Morfologia celulelor în cultură este variabilă şi denotă de obicei tipul de ţesut din

care derivă: liniile celulare derivate din sânge tind să crească în suspensii în timp ce

celulele derivate din ţesuturi solide tind să crească în monostrat.

În funcţie de tipul de substrat utilizat, culturile pot fi:

- pe suport organic nutritiv

- pe suport organic nenutritiv

- pe suport anorganic (sticlă, plastic)

Particularităţi şi condiţii Culturile de celule sunt de obicei preparate într-un spaţiu de lucru steril, special

amenajat, izolat prin ecluze de exterior. Acest spaţiu include resurse de apă curentă, gaz

electricitate, toate în flux continuu.

Necesarul de bază într-un laborator de culturi de celule este reprezentat de:

- arie de lucru sterilă

- sticlărie, instrumentar specific, sterilizabil sau de unică utilizare (de preferat)

- sisteme de stocare şi congelare

- incubator, sistem de alimentare cu CO2, hotă de flux laminar (în care circulaţia

aerului se face numai în direcţie ascendentă

- microscop fotonic pentru controlul culturilor, agitator magnetic, sonicator,

balanţă analitică

- consumabile

Designul unui laborator de culturi de celule Este un deziderat a constitui un laborator de culturi de celule, pornind de la zero şi

respectând norme precise, nefiind recomandată adaptarea unui laborator utilizat pentru

alte scopuri.

Este de preferat ca sistemul de lucru să fie unitar şi toate manipulările să se

efectueze într-un singur spaţiu (unitatea de procesare tisulară şi celulară) care trebuie să

fie separat de zona de primire a materialului de studiu (zonă de carantină)

Spaţiul de lucru trebuie să fie steril, necesită o iluminare adecvată, un trafic aeric

redus, suprafeţe de lucru uşor lavabile, o hotă de flux laminar şi lămpi de ultraviolete

pentru sterilizare. Sticlăria trebuie să fie neutră, perfect transparentă, fără neregularităţi.

Este reprezentată de sticlărie specială pentru culturi şi sticlărie uzuală de laborator.

Aparatură şi instrumentar:

Hotă microbiologică: asigură un mediu de lucru curat pentru produsele biologice

şi protejează operatorul de aerosolii care pot conţine patogeni. Hota este dotată de obicei

cu filtre HEPA (high efficiency particulate air). Aerul este recirculat prin sisteme

complexe de filtre care respectă mediul extern. Controlul microbiologic al contaminării

se realizează cu ajutorul unor plăci speciale de agar care se amplasează în interiorul hotei

pentru cel puţin 4 ore. Dacă pe suprafaţa acestor plăci nu cultivă nici bacterii nici fungi,

înseamnă că mediul de lucru este propice din punct de vedere microbiologic. În funcţie

de tipul de cultură intenţionat, se iau masuri specifice de asepsie, inclusiv împotriva unei

eventuale contaminări virale.

Centrifuge: centrifugele sunt utilizate pentru tehnicile de rutină pentru subculturi

pentru izolarea liniilor celulare sau pentru crioprezervarea celulelor izolate. Centrifugele

produc în mod normal aerosoli; de aceea trebuie folosite tuburi de centrifugare sigilate,

cu capac transparent care permite examinarea stării conţinutului înainte de desigilare. Se

va verifica permanent echilibrarea centrifugii înainte de amorsare şi starea de coroziune;

centrifuga va fi amplasată într-un loc accesibil.

Incubatoare: culturile celulare au nevoie de locaţii speciale pentru supravieţuire.

Incubatoarele uzuale asigură condiţii de creştere constante, de temperatură, grad de

umiditate şi nivele de CO2 atent controlate. Temperaturile de lucru variază între 28°C

(celule de la insecte) - 37°C (celule de la mamifere), iar nivelul de CO2 variază între 5-

10%. La ora actuală există incubatoare cu nivele controlate de CO2 şi cu interior de Cu,

care inhibă dezvoltarea germenilor. Totuşi, singura măsură care trebuie aplicată constant

este igienizarea suprafeţelor şi volumelor de lucru.

Suprafaţa de lucru şi podelele: toate suprafeţele de lucru, podelele şi pereţii

trebuie să fie netede şi uşor de curăţat, rezistente la apă şi la diferiţi reactivi (soluţii

alcaline, acide, dezifectanţi). În zonele de congelare în azot lichid, podeaua trebuie să

reziste la spargere iar geamurile trebuie să se închidă ermetic.

Instrumentar: bisturie, lame sterile, pense fine foarfeci chirurgicali. Dispozitivele

de curăţare şi sterilizare includ: autoclave, un cuptor de sterilizare şi spălător de pipete.

Totuşi, un laborator modern şi dotat financiar foloseşte materiale de lucru de unică

utilizare, pentru reducerea la minim a posibilităţilor de contaminare.

Condiţii de cultură

Celulele de origine animală sunt destul de dificil de cultivat în raport cu cele

bacteriene (excepţie fac celulele embrionare sau tumorale, care cultivă uşor). Pentru a

permite supravieţuirea în condiţii de pseudonormalitate a celulelor sau fragmentelor de

ţesut recoltate sunt necesare câteva condiţii esenţiale:

- temperatura de 37°C pentru celulele mamifere

- pH 7,2-7,4 şi o tărie ionică adecvată

- acces la nutrienţi care să simuleze cât mai precis mediul intern al organismului

din care a fost extras fragmentul de ţesut

De obicei, celulele sau fragmentele de ţesut extrase sunt amplasate în vase speciale de

cultură cu un mediu de cultură specific. Culturile sunt menţinute în incubatoare cu

condiţiile menţionate mai sus şi controlate electronic.

Asepsia este una din condiţiile esenţiale pentru realizarea unei culturi tisulare sau

celulare. Regulile care guvernează un spaţiu aseptic sunt:

- acces limitat la camera de culturi celulare, de obicei prin zonă ecluză

- suprafeţele de lucru se decontaminează înainte şi după utilizare

- manipularea probelor biologice se face numai cu instrumentar steril, eventual

de unică utilizare şi semiautomatizat sau complet automatizat

- experimentatorul va purta echipament special şi mască de protecţie

- sterilitatea permanentă controlată a spaţiului de lucru

Mediile de cultură

Mediile de cultură trebuie să asigure:

- echilibrul ionic obţinut cu ajutorul soluţiilor izotone (menţinerea presiunii

osmotice);

- pH optim (7,2-7,4);

- temperatură optimă, conţinutul de O2 şi CO2 favorabile;

- elemente nutritive indispensabile metabolismului;

- evitarea contaminării cu germeni patogeni – se realizează prin adăugarea de

antibiotic la mediul de cultură;

Clasificarea mediilor de cultură:

În funcţie de:

- consistenţă:

o lichide

o semilichide (mediu nutritiv + agar sau coagulat de plasmă sangvină)

- compoziţie:

o naturale

o semisintetice

o sintetice

- după valoarea nutritivă:

o medii de creştere (permit o proliferare celulară abundentă)

o medii de menţinere (care nu încurajează proliferarea dar menţin

viabilitatea celulară

Compoziţia mediilor de cultură:

- serul – este un amestec complex de albumine, factori de creştere şi inhibitori

ai acestora. Este un element esenţial al mediilor de cultură pe bază de ser. Cel

mai folosit este serul fetal de viţel

- săruri anorganice: sunt necesare pentru menţinerea echilibrului osmotic şi

reglarea potenţialului de membrană

- sisteme tampon, care sunt necesare pentru menţinerea pH-ului (tampon fosfat,

tampon bicarbonat de sodiu şi CO2 – uşor de obţinut într-un incubator cu CO2,

ieftin şi netoxic); în mediu există şi un indicator al pH-ului (roşu fenol care

virează de la galben la roşu aprins şi apoi la violaceu);

- carbohidraţi: reprezintă sursa principală de energie pentru celule. Se utilizează

în special medii cu glucoză, galactoză dar şi cele cu maltoză sau fructoză;

- vitamine: sunt prezente fie în ser (pentru mediile pe bază de ser) sau sunt

adăugate în mediile artificiale. Cele mai importante vitamine pentru culturi

celulare sunt cele din grupul B, necesare pentru creştere şi proliferare,

riboflavina, tiamina şi biotina;

- proteinele şi peptidele sunt importante în mediile artificiale; includ albumina,

transferina, fibronectina;

- lipide şi acizi graşi: importante pentru mediile artificiale, includ colesterolul şi

steroizii;

- microelemente: Zn, Cu Se (pentru detoxifiere şi îndepărtarea radicalilor

liberi), acizi tricarboxilici şi intermediari

Culturile celulare pot fi conservate la temperaturi scăzute (-135°C), după o condiţionare

prealabilă şi tratare cu agenţi de crioprotecţie. Congelarea se face progresiv cu o rată de

(-1) – (-3)°C pe minut.

Principii de lucru Vom menţiona aici principiile de urmat şi de evitat în efectuarea şi manipularea

unor culturi celulare:

Principii de urmat:

- se foloseşte întotdeauna echipament individual de protecţie (halat, mănuşi,

ochelari); opţional se pot folosi mănuşi termoizolante, vizieră şi şorţ special

pentru manipularea azotului lichid;

- bonete speciale care să acopere părul strâns;

- echipament special pentru camera de culturi;

- ordinea şi curăţenia pe suprafaţa de lucru

- marcarea corectă a recipienţilor, mediilor, eprubetelor cu conţinutul şi data

preparării;

- manipularea unei singure linii celulare o dată. Nu se trece cu un vas pe

deasupra altora;

- între operaţiuni, se curăţă masa cu alcool 70% şi se lasă circa 15 minute între

manipularea succesivă a 2 linii celulare diferite;

- utilizarea de recipiente separate cu medii pentru diferitele linii celulare;

- examinarea zilnică a culturilor pentru posibile contaminări bacteriene sau

fungice;

- controlul de calitate al mediilor şi reactivilor înainte de utilizare (data

expirării, pH, contaminare)

- evitarea ambalării în carton a instrumentarului sau culturilor;

- aseptizarea hotei, filtrelor, incubatoarelor, microscoapelor;

- testarea celulelor pentru contaminarea cu Mycoplasma.

De evitat:

- utilizarea de antibiotice în mod continuu, deoarece se ajunge la selectarea unor

rezistenţe care fac liniile celulare inutilizabile din punct de vedere comercial;

- acumularea deşeurilor la nivelul zonei de lucru;

- aglomerarea personalului în laborator;

- manipularea celulelor din surse incerte în sistemul principal de lucru; acestea

se menţin în carantină până la efectuarea tuturor testelor specifice;

- menţinerea liniilor celulare în cultură continuă, fără recongelare;

- permiterea confluării complete a culturilor; de obicei gradul de confluare este

menţionat în protocolul de utilizare al culturii;

- expirarea mediului de cultură; de obicei mediul rezistă 6 săptămâni la 4°C

după adăugarea glutaminei şi serului;

- murdărirea băilor de apă;

- decalibrarea echipamentului.

Controlul de calitate Se vor urmări:

- calitatea reactivilor şi materialelor

o serul fetal bovin nu trebuie să fie infectat cu virusul diareei bovine

o tripsina porcină este sursă de Myocoplasma

o toate materialele trebuie să aibă certificate de calitate la zi; nu se

acceptă furnizori neautorizaţi;

- provenienţa şi integritatea liniilor celulare

o liniile celulare să nu fie contaminate

o originea liniilor şi profilul ADN complete

o instrucţiuni de utilizare detaliate

- evitarea contaminării microbiene – sunt posibile 3 tipuri de contaminări:

o bacteriană şi fungică: vizibile prin creşterea bruscă a turbidităţii

mediului, modificări de culoare şi pH. Este necesară examinarea

microscopică zilnică

o cu Mycoplasme (procariote autoreplicative), sub formă de coci sau

filamente; efectele contaminării cu Mycoplasma sunt mai insidioase:

reducerea ratei de creştere a celulelor

modificări morfologice

aberaţii cromosomiale

alterări ale metabolismului acizilor nucleici şi aminoacizilor

o virală: în special pentru serul bovin