Mihail Semenovici Tsvett (1872-1919)

În 1906 Tswett a publicat un

articol, în revista de specialitate

Berichte der deutschen botanischen

Gesellschaft în care descrie

separarea unor pigmenţi vegetali pe

un tub îngust de sticlă, umplut cu

carbonat de calciu. Pigmenţii de

diferite culori au fost astfel separaţi

de pe carbonat prin eluţie cu eter de

petrol.

• Plinius cel Bătrân (23-79 după Cristos) în

Historia Naturalis, descrie un proces

egiptean (ca. 500 înainte de Cristos) de

separare a unor pigmenţi prin depunerea

soluţiei lor pe un material celulozic,

precum papirusul. Această tehnică poate fi

considerată a fi foarte aproape de

cromatografia pe hârtie.

Istoric

• În 1855 chimistul german F. F. Runge descrie cromatografia pe hârtie şi include

ilustraţii ale cromatogramelor în lucrarea sa, Der Bildunystrieb der Stoffe.

• Richard Kuhn şi Edgar Lederer (1931, separarea a două componente din

carotenul cristalizat, privit până în acel moment drept un singur compus chimic,

prin cromatografie de adsorbţie.

• Martin şi Synge ( 1941, publicarea teoriei cromatografiei de partiţie)

• Consden, Gordon, şi Martin (descrierea cromatografiei pe hârtie).

• 1950 dezvoltarea cromatografiei gaz-lichide (GLC), prin care se separă

compuşi gazoşi sau volatili pe o coloană îngustă umplută cu un adsorbent.

• Cromatografia în strat subţire (thin-layer chromatography, TLC), prin care se

separă compuşi prin trecerea unui solvent printr-un strat subţire de o grosime

submilimetrică, întins pe un suport precum placa de sticlă a fost dezvoltată în

anii „60.

• Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (high performance liquid

chromatography, HPLC), tehnică care se separă compuşi prin introducerea

probei într-o coloană îngustă încărcată cu adsorbent şi forţarea eluţiei sale prin

presiune a fost dezvoltată în deceniul al şaptelea.

• Cromatografia pe hârtie şi mai ales cea în strat subţire sunt încă utilizate, fiind

deseori preferate cromatografiei gaz-lichid şi cromatografiei lichide de înaltă

performanţă din cauza marii lor puteri în separarea efectivă, cu echipamente

ieftine şi costuri scăzute.

• Principala aplicaţie a cromatografiei este cea de separare a unor amestecuri de

compuşi în scopuri analitice sau preparative.

• Procesul de cromatografie poate de asemenea servi la identificarea, izolarea,

purificarea şi cuantificarea unor compuşi individual separaţi.

• În plus, aceste procese cromatografice pot fi aplicate în determinarea omogenităţii

unor substanţe chimice, determinarea structurii moleculare, determinarea

produşilor de reacţie şi a proceselor care le însoţesc.

• Cromatografia cuprinde un grup important şi diversificat de metode care permit

cercetătorului separarea unor componenţi foarte apropiaţi (înrudiţi) dintr-un amestec

complex de substanţe (de componente), multe dintre aceste separări nefiind posibile

prin alte tehnici.

• În toate separările cromatografice proba este transportată într-o fază mobilă, care

poate fi un gaz, un lichid sau un fluid în stare supercritică. Aceasta fază mobilă

este forţată să traverseze o fază nemiscibilă, fază staţionară, care se găseşte într-o

coloană sau pe o suprafaţă solidă. Cele două faze sunt alese în aşa fel încât proba

să se distribuie între faza mobilă şi cea staţionară în proporţii diferite. Componentele

care sunt mai puternic reţinute de către faza staţionară se vor mişca şi vor curge mai

lent cu faza mobilă. Din contră, componentele uşor legate de către faza staţionară

vor traversa această fază mai rapid. Drept consecinţă a acestor diferenţe în

mobilitate, componentele probei se vor separa în benzi ori zone discrete, care

pot fi analizate calitativ şi/sau cantitativ.

• Termenul de migrare utilizat în cromatografie reprezintă o descriere generică a

mişcării moleculelor în cromatografie şi el nu trebuie confundat cu migrarea unei

specii ionice sub acţiunea unui câmp electric.

• Metodele cromatografice pot fi clasificate ţinând cont de două

criterii.

– Prima clasificare este bazată pe metoda fizică prin care fazele

mobilă şi staţionară vin în contact.

• Astfel, în cromatografia pe coloană, faza staţionară este

reţinută într-un tub îngust, prin care faza mobilă este forţată

să treacă.

• În cromatografia planară, faza staţionară este depusă pe un

suport, în interstiţiile unui material poros (de tipul hârtiei de

filtru, ca exemplu). În acest caz, faza mobilă se mişcă prin

faza staţionară datorită forţei capilare, sub influenţa forţei

gravitaţionale.

Se poate remarca că echilibrele care apar în cazul celor

două tipuri de cromatografii au baze teoretice apropiate,

teoriile dezvoltate în cazul uneia dintre cele două metode

putând fi formalizate asemănător şi uşor adaptate la cealaltă

tehnică cromatografică.

Clasificarea metodelor de cromatografie pe coloană

O clasificare mult mai fundamentată a metodelor cromatografice se bazează pe

tipul fazelor mobile şi staţionare şi tipul de echilibru stabilit în transferul soluturilor

între cele două faze.

ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE ELUŢIE PE COLOANĂ

• Prezentarea schematică a

modului prin care două

substanţe, notate A şi B

sunt separate prin

cromatografie de eluţie pe

o coloană, cu fază mobilă

lichidă. Eluţia implică

spălarea, trecerea speciilor

(substanţelor A şi B, în

speţă) prin coloană, la

adăugarea continuă de

solvent (fază mobilă)

proaspăt (a).

o porţiune unică de probă este

introdusă la capătul superior al coloanei

(timpul to), după care componentele probei

se distribuie independent, între cele două

faze.

(b) Semnalul înregistrat de către un detector în funcţie de

evoluţia eluţiei prin coloana prezentată în (a).

Introducerea unui volum adiţional de fază mobilă (de

eluent) forţează volumul de solvent care conţine o

parte a probei să coboare prin coloană, unde, se

stabileşte o nouă partiţie între faza mobilă şi cea

staţionară (timpul t1). Simultan cu aceasta se

stabileşte un nou echilibru și o nouă partiţie între

solventul proaspăt (faza mobilă nou adăugată) şi faza

staţionară la locul iniţial de adăugare a probei.

Adăugarea unor noi volume de solvent va avea ca

efect coborârea moleculelor de solut spre capătul de

jos al coloanei printr-o serie continuă de transferuri

între faza mobilă şi cea staţionară. Cum mişcarea

solutului se poate realiza numai prin intermediul fazei

mobile, viteza medie cu care zona (banda) solutului

migrează în josul coloanei depinde de fracţia de timp

în care solutul este reţinut de către această fază.

Această fracţie este mică pentru componenta mai

puternic reţinută de către faza staţionară (compusul B,

din figură) şi este mare în cazul în care retenţia în faza

mobilă este mai adecvată (componenta A). În mod

ideal, diferenţele rezultate în vitezele diferite conduc la

separarea componentelor dintr-un amestec în benzi

sau zone localizate de-a lungul coloanei (timpul t3 din

figură). Izolarea şi deci separarea speciilor A şi B este

urmarea trecerii unei cantităţi suficiente de fază mobilă

prin coloană şi care conduce la o separare individuală

de zone clar distribuite ce pot fi colectate ori detectate

(timpii t3 şi t4 din figură).

DILUŢIA ANALITULUI

• Figura ilustrează o caracteristică

importantă a procesului de separare,

denumită diluţia analitului fenomen care

însoţeşte aproape întotdeauna separările

cromatografice. Astfel, mărimea zonei

originale care conţine analiţii din figură

este notabil mai mică decât cele două

zone care conţin componentele A şi B şi

care ajung în zona detectorului. Acest

fenomen semnificativ de diluare se

manifestă odată cu separarea

componentelor şi din această cauză,

detectorii utilizaţi pentru separarea

analiţilor trebuie adesea să prezinte o

sensibilitate mai mare decât cea care

ar fi dorită dacă procesul de separare

nu ar fi necesar.

CROMATOGRAMELE

• Dacă un detector care răspunde la o

modificare de concentraţie a solutului este

plasat la capătul terminal al coloanei iar

semnalul său este reprezentat grafic în

funcţie de timp (sau de volumul de fază

mobilă adăugat) se obţin o serie de peak-uri,

prezentate în figură (b). Asemenea

reprezentări grafice poartă numele de

cromatograme, care sunt utilizate atât în

cromatografia analitică cât şi în cea

preparativă. Poziţia peak-urilor pe axa

timpului poate servi la identificarea

componentelor din probă, aria fiecăruia

conducând la determinarea cantitativă a

fiecărui component.

EFECTELE VITEZELOR DE MIGRARE ŞI A LĂŢIMII ZONEI ASUPRA

REZOLUŢIEI CROMATOGRAFICE

• Figura alăturată prezintă

profilurile concentraţiilor

soluţilor A şi B la două etape

diferite de eluţie: o etapă timpurie

(momentul t1) şi o etapă spre final

(momentul t2).

Se poate spune ca specia B este mai puternic reţinută şi din această

cauză componentul B întârzie mai mult pe coloană pe parcursul migrării.

Această întârziere în coborâre conduce la creşterea distanţei dintre cele două

zone. La acelaşi interval de timp, are loc aceeaşi lărgire a zonelor celor două

componente, fenomen ce scade eficienţa coloanei cromatografice. Cum

lărgirea zonei este inevitabilă, se pot alege condiţiile în aşa fel ca acest

fenomen să se manifeste cât mai lent odată cu separarea benzilor. Astfel, o

separare completă şi de aici o rezoluţie bună, se realizează adesea în

condiţiile în care lungimea coloanei este suficient de mare.

două metode de îmbunătăţire a separării în cazul unui amestec ipotetic

de două componente (figură, panel a).

• În figura alăturată (b)

condiţiile au fost modificate

astfel încât primul component

se deplasează mai repede în

josul coloanei cu viteză mai

mare în timp ce al doilea se

deplasează mai încet.

(a) cromatograma originală cu cele

două peak-uri suprapuse;

îmbunătăţirea separării prin (b)

creşterea separării benzilor

cromatografice şi (c) prin scăderea

împrăştierii benzii cromatografice.

(c) : vitezele de împrăştiere a celor două

zone au fost micşorate. Ambele metode

conduc la o separare mai distinctă a celor

două componente

Ambele metode conduc la o separare mai

distinctă a celor două componente

Viteza de migrare a soluţÌlor

• Eficienţa unei coloane cromatografice

în separarea a doi soluţi depinde, în parte,

de vitezele relative cu care cei doi

compuşi sunt eluaţi. Aceste viteze sunt

determinate de magnitudinea

constantelor de echilibru ale procesului

prin care soluţii se distribuie independent

între faza mobilă şi cea staţionară.

CONSTANTELE DE DISTRIBUŢIE

Adeseori, echilibrele de distribuţie implicate în cromatografie sunt descrise prin

ecuaţii care implică transferul unui analit între fazele mobilă şi staţionară. Astfel,

pentru speciile A de solut se poate scrie următorul echilibru al procesului de

adsorbţie-desorbţie:

Constanta de echilibru, K, pentru această reacţie este numită constantă de distribuţie, raport

de partiţie sau coeficient de partiţie Comisia de Nomenclatură Analitică a IUPAC pentru

cromatografie recomandă utilizarea termenului de constantă de distribuţie, Kc în loc de vechiul

termen în loc de vechiul termen de coeficient de partiţie sau raport de partiţie, K. Totuși, în literatura

de specialitate ambii termeni sunt încă utilizaţi. Constanta K este definită conform formulei:

CS reprezintă concentraţia molară a solutului din faza staţionară iar CM este

concentraţia molară din faza mobilă; în mod ideal, K este constantă în tot

domeniul de concentraţii a solutului, iar CS este proporţională cu CM.

Tipul de cromatografie în care se aplică ecuaţia poartă denumirea de

cromatografie lineară iar rezultanta ei este caracterizată printr-o simetrie de

tip Gauss a peak-urilor şi a timpilor de retenţie, parametrii care sunt

independenţi de cantitatea de analit supusă analizei. În general, studiile

teoretice se limitează la o astfel de cromatografie lineară.

TIMPUL DE RETENŢIE

Figura alăturată reprezintă

generic o cromatogramă pentru o

probă ce conţine un singur analit.

Timpul necesar probei de a

parcurge distanţa dintre

momentul inoculării până la

detecţia semnalului său de

detector este numit timp de

retenţie, fiind simbolizat prin

tR. Peak-ul prezentat în partea

din stânga cromatogramei este

dat de speciile care nu sunt

reţinute de către coloană.

Adesea, proba sau faza mobilă

conţine specii ce nu sunt reţinute

pe parcursul migrării pe coloană.

Astfel de specii care nu

interacţionează cu faza

staţionară sunt de real folos în

identificarea peak-ului analitului

de interes.

Peak-ul mic din stânga reprezintă o specie care nu este reţinută pe

coloană şi a cărei semnal apare la detector aproape imediat după ce

eluţia a fost începută. Astfel, timpul său de eluţie (tM) este

aproximativ egal cu timpul necesar fazei mobile să treacă prin

coloană.

Timpul necesar speciilor nereţinute să ajungă la

detector se notează cu tM şi se numeşte timp mort.

Viteza de migrare a speciilor nereţinute este în acelaşi

domeniu cu viteza de mişcare a moleculelor fazei

mobile.

• Viteza lineară medie de migrare a solutului

(ν ) este dată de relaţia:

•unde L este lungimea coloanei

împachetate.

În mod similar, viteza medie lineară de

mişcare a unei molecule de fază mobilă (u)

este dată de relaţia:

unde tM reprezintă timpul mort, timpul necesar pentru ca o moleculă

medie de fază mobilă să treacă prin coloană.

• De exemplu, dacă o coloană are un volum total de 100 ml iar faza

staţionară ocupă 40 ml, rezultă că faza mobilă ocupă un volum de 60 ml.

Dacă faza mobilă curge cu o viteză de 5 ml/min, se poate calcula că sunt

necesare 12 minute pentru ca faza mobilă să traverseze coloana, de la

injector la detectorul situat la capătul terminal al coloanei.

• Uneori, tM poate fi determinat prin identificarea unui mic peak la începutul

cromatogramei, rezultat dintr-o uşoară diferenţă dată de solventul care

provine din faza mobilă ce conţine proba adăugată.

• De asemenea tM poate fi determinat prin măsurarea timpului de eluţie a unei

probe care nu este reţinută absolut de loc de către faza staţionară. În cazul

unei răşini schimbătoare de ioni cationice, pentru a se determina tM, se

poate utiliza o proteină cu sarcină negativă.

• Se notabil de arătat că există şi alţi factori

precum lungimea şi diametrul tubului care

conectează injectorul şi detectorul la coloană

care pot afecta valorile tM.

• Practic, considerând o coloană împachetată de

25 cm lungime, cu un diametru interior de 1 cm,

volumul total al coloanei este de 19,6 ml (V= •r2

•L = 3,14 •0,52 •25cm). Dacă faza mobilă

ocupă 60% din volumul coloanei, volumul

spaţiului gol, care defineşte «timpul mort» este

egal cu 11,8 ml. El reprezintă volumul spaţiului

gol, denumit „void volume” = V0

RELAŢIA DINTRE TIMPUL DE RETENŢIE ŞI CONSTANTA DE

DISTRIBUŢIE

În scopul prezentării relaţiei dintre timpul de retenţie al

solutului şi constanta sa de distribuţie, se poate exprima

viteza de migrare drept o fracţie a vitezei fazei mobile:

Această fracţie este egală cu numărul mediu de moli de solut din

faza mobilă, la un moment dat, raportat la numărul de moli totali de solut

din coloană, conform următoarei relaţii:

Numărul total de moli de solut din faza mobilă este egal cu

concentraţia molară a solutului din faza mobilă, cM, multiplicată cu

volumul acestei faze, VM.

În mod similar, numărul de moli de solut din faza staţionară este

dat de produsul concentraţiei cS de solut din faza staţionară, multiplicat

cu volumul său din aceeaşi fază, VS.

Astfel se poate scrie:

Prin substituirea ecuaţiei constantei

de distribuție în această ecuaţie se obţine

viteza de migrare a solutului ca funcţie de

constanta de distribuţie şi ca funcţie de

volumele fazelor staţionare şi mobile:

Cele două volume pot fi estimate prin metode specifice fiecărui tip de cromatografie.

VITEZA DE MIGRARE A SOLUTULUI: FACTORUL DE RETENŢIE

Factorul de retenţie, sau factorul de capacitate reprezintă un

parametru important care este general utilizat în descrierea vitezelor

de migrare a soluturilor pe coloană. Pentru un solut A, factorul de

retenţie k’A este definit ca:

unde KA reprezintă constanta de distribuţie a speciei A.

Comisia IUPAC de Nomenclatură Analitică recomandă denumirea de

factor de retenţie k', însă denumirea de factor de capacitate este încă

utilizat în literatura de specialitate.

Prin substituţia ecuaţiei 5 în ecuaţia 4 rezultă:

=Lt

R

(2) (3)tL

=uM

În scopul de a defini modalitatea prin care se poate determina k’A dintr-o

cromatogramă, se vor substitui ecuaţiile 2 şi 3 în ecuaţia 6,

ceea ce conduce la:

rearanjarea acestei ecuaţii

După cum se observă în figură, tR şi

tM sunt uşor de obţinut dintr-o

cromatogramă. În condiţiile unui factor de

retenţie pentru un solut mult mai mic

decât unitatea, eluţia se realizează mai

rapid şi din această este dificil a se

determina timpii de retenţie cu acurateţe.

În condiţiile în care factorul de retenţie

este de ordinul zecilor (de exemplu 20

sau 30), timpii de eluţie devin anormal de

mari. Ideal, separarea se efectuează în

condiţiile unor factori de retenţie cuprinşi

între 2 şi 10.

VITEZELE RELATIVE DE MIGRARE. FACTORUL DE

SELECTIVITATE

Factorul de selectivitate

al unei coloane () pentru

două specii, A şi B este

definit prin formula:

unde KB reprezintă constanta de distribuţie

a speciei B, mai puternic reţinută pe

coloană, în timp ce KA reprezintă

constanta de distribuţie a speciei A, mai

puţin reţinută pe coloană, şi mai rapid

eluată de pe aceasta. Prin definiţie, este

întotdeauna mai mare decât unitatea.

(9)

• Prin substituirea ecuaţiei 5 şi a

ecuaţiei analoage pentru

solutul B în ecuaţia 9 se

obţine, după la rearanjare,

relaţia de legătură între factorul

de selectivitate pentru cei doi

soluţi şi factorii lor de retenţie:

(10)

unde k'B şi k'A reprezintă factorii de retenţie

ai solutului B, respectiv A.

Substituţia în ecuaţia 8 pentru cei doi soluţi din ecuaţia 10 conduce la o expresie ce

permite determinarea experimentală lui dintr-o cromatogramă:

factorii de selectivitate şi retenţie se utilizează, la

rezolvarea problemelor referitoare la caracterizarea

unei coloane cromatografice

Împrăştierea zonei şi eficienţa

coloanei• Teoria dinamică, sau teoria cinetică a cromatografiei

explică cu succes în termeni cantitativi formele peak-

urilor cromatografice şi efectele diverselor variabile

implicate în lăţirea acestor peak-uri. O discuţie

detailată a acestei teorii se bazează pe mecanismul de

repartiţie aleatorie, putându-se da o imagine calitativă

a zonelor cromatografice şi care conduce la analiza

modului de împrăştiere a zonelor în condiţiile deplasării

moleculelor de solut de-a lungul unei coloane.

Înţelegerea acestor fenomene au ca rezultat

identificarea variabilelor ce conduc la creşterea

eficienţei coloanei şi la reducerea împrăştierii zonelor

cromatografice.

FORMA PEAK-URILOR CROMATOGRAFICE

Figura 1

Figura 4

Figura 2

• Examinarea peak-urilor dintr-o cromatogramă sau a benzilor pe

coloană (figurile de mai jos) relevă o similaritate a erorilor normale,

repartiţia realizându-se după un profil Gaussian, care sunt obţinute

în condiţiile reprezentării grafice a valorilor determinate funcţie de

frecvenţa repartiţiei a acestora.

În unele cazuri, peak-urile cromatografice nu sunt lineare, manifestând o

coadă (trenă) sau un front.

În primul caz, trena peak-ului care apare în dreapta cromatogramei

este prelungă, în timp ce frontul acestuia este abrupt.

În cel de-al doilea caz, forma cromatogramei este inversată, adică

frontul este prelung în timp ce trena este extrem de scurtă. Cauza comună a

apariţiei frontului sau a trenei o reprezintă existenţa unei constante de

distribuţie neliniare. Frontul apare de asemenea în cazul eluării unei

cantităţi mari de probă pe coloană. Distorsiunile de acest fel sunt nedorite

deoarece conduc la separări de proastă calitate şi la timpi de eluţie cu

reproductibilitate scăzută. În abordarea teoretică se consideră ca fenomenul

de front sau coadă cromatografică este absent sau minim.

• După cum se cunoaşte, curbele de erori normale pot fi

raţionalizate prin asumarea faptului că incertitudinea

asociată cu orice măsurătoare singulară reprezintă

însumarea unui număr mult mai mare de erori mici,

individuale nedetectabile şi de repartiţii întâmplătoare,

fiecare dintre acesta având o probabilitate egală, pozitivă

sau negativă. Cea mai comună manifestare a acestor

incertitudini este reprezentată de anularea uneia de către

cealaltă, ceea ce conduce la o valoare medie. Cu o mică

probabilitate, însumarea poate conduce la un rezultat mai

mare sau mai mic decât media. Drept consecinţă,

distribuţia valorilor este simetrică, în jurul valorii medii. În

mod similar, forma Gaussiană a unei zone

cromatografice ideale poate fi atribuită combinării aditive

a mişcărilor întâmplătoare a moleculelor de solut în zona

cromatografică.

Să considerăm comportamentul unei molecule de solut, care în timpul

migrării, trece prin mii de transferuri între faza staţionară şi cea mobilă. Timpul

petrecut în fiecare fază de transfer este deosebit de neuniform, depinzând de

câştigul accidental de energie termică din mediul înconjurător pentru a realiza

un transfer reversibil, în cealaltă fază. Astfel, în unele cazuri, timpul de şedere

într-o fază dată, poate fi tranzitoriu, în timp ce în alte faze perioada poate fi

relativ mai lungă. Cum molecula este eluată numai în timpul şederii sale în faza

mobilă, are ca rezultat, migrarea sa total neuniformă în josul coloanei. Din

cauza timpilor variabili de şedere, viteza medie cu care moleculele individuale

se mişcă relativ în faza mobilă variază în mod considerabil. Anumite particule

individuale traversează mai rapid în virtutea includerii lor accidentale în faza

mobilă, majoritatea timpului de eluţie. Altele, din contră, pot prezenta întârzieri

datorită includerii lor în faza staţionară, timp mai îndelungat decât timpul mediu

de eluţie. Consecinţa acestor procese aleatoare este o împrăştiere simetrică a

vitezelor în jurul valorii medii, iar acesta reprezintă comportamentul mediu al

moleculei.

Lăţimea benzii componentului separat creşte odată cu coborârea lui de-

a lungul coloanei, datorită faptului că o creştere a timpului de eluţie permite

manifestarea unei mai mari împrăştieri. Astfel, lăţimea zonei este în relaţie

directă cu timpul de şedere în coloană şi în relaţie inversă cu viteza de curgere

a fazei mobile.

În măsurarea cantitativă a

eficienţei unei coloane

cromatografice în general

sunt utilizaţi doi termeni

înrudiţi:

(1) înălţimea talerului

teoretic, H şi

(2) numărul de talere

teoretice, N. Cei doi

parametrii sunt asociaţi

prin ecuaţia:

N = L/H (1.12)L, lungimea coloanei împachetate

(dată de obicei în centimetrii)

METODE DE DESCRIERE A EFICIENŢEI COLOANEI

Eficienţa coloanelor cromatografice creşte

cu numărul de talere teoretice: cu cât

numărul de talere teoretice este mai mare

şi înălţimea talerului teoretic devine mai

mică. Sunt întâlnite diferenţe enorme în

eficienţa unei coloane, datorită diferenţelor

dintre tipul de coloană şi fazele mobilă,

respectiv staţionară, utilizate. În mod

curent, eficienţa unei coloane în termen de

număr de talere teoretice, poate varia între

câteva sute până la mii, iar domeniul

înălţimii talerelor variind între zecimi până

la miimi de centimetrii sau mai mici.

• Introducerea termenilor de înălţime a talerului şi a numărului de

talere este datorată studiilor teoretice ale lui Martin şi Synge care

au tratat coloana cromatografică similar coloanei de distilare, unde

au loc o multitudine de procese discrete dar continue, în straturi

înguste, denumite talere teoretice. S-a considerat că la nivelul

fiecărui taler, are loc un echilibru între faza mobilă şi cea staţionară.

Mişcarea solutului în josul coloanei a fost apoi tratată ca o treaptă

de transfer între faza mobilă în echilibru şi următorul taler situat mai

jos.

Teoria talerului teoretic a fost aplicată cu succes la forma Gaussiană a peak-urilor

cromatografice şi la viteza de migrare a solutului de-a lungul coloanei cromatografice.

Ea a fost în final abandonată totuşi, deoarece nu a reuşit sa răspundă la explicarea

modului de împrăştiere a zonei. Cu toate acestea, termenii originali utilizaţi la

descrierea eficienţei unei coloane au fost păstraţi în teoria vitezei de migrare. Această

nomenclatură este uneori neadecvată din cauza tendinţei de a perpetua mitul

prezenţei unor talere în coloana cromatografică, la nivelul cărora se realizează

echilibrul între faze. De fapt, starea de echilibru, nu se realizează niciodată

deoarece faza mobilă este într-o permanentă şi constantă mişcare.

DEFINIŢIA ÎNALŢIMII

TALERULUIDupă cum se cunoaşte, lăţimea curbei Gaussiene este într-o

relaţie directă cu varianţa 2, sau cu deviaţia standard , a unei

măsurători. Cum benzile cromatografice sunt în general

considerate a avea astfel de formă, este convenabil să definim

eficienţa unei coloane în termen de varianţă pe unitate de

lungime a coloanei. Astfel, înălţimea talerului, H, este dată de

relaţia:

DEFINIŢIA ÎNĂLŢIMII TALERULUI

Definiţia talerului teoretic. H = 2/ L

EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A LUI H ŞI A LUI N

Determinarea deviaţiei standard din peak-ul cromatografic: W = 4.

Această definiţie a înălţimii talerului este ilustrată în figura de mai jos. După

cum se observă, coloana este împachetată pe o distanţă de L centimetrii, în

lungime (panelul a).

Reprezentarea

grafică a definiţiei

talerului teoretic.

H = 2/ L

În partea superioară a figurii (panelul b) este reprezentată schematic,

distribuţia moleculelor de-a lungul colanei cromatografice împachetate, în

momentul în care analitul părăseşte coloana (acesta este din punct de

vedere al timpului, timpul de retenţie, tR). Modelul curbei este Gaussian,

iar localizările parametrilor L-l şi L + l sunt indicate prin linie punctată

verticală.

Înălţimea talerului poate fi

gândită ca o porţiune de

coloană, situată la capătul

terminal care conţine fracţia de

analit situată între L-l şi L.

Cum aria, în domeniul normal

de eroare a curbei este limitată

de ±, fiind de aproximativ

68% din aria totală, înălţimea

talerului prin definiţie conţine

aproximativ 34% din analit.

De notat faptul că L este dat

în centimetrii, iar varianţa, 2, este

explicitată în centimetrii pătraţi; H

reprezintă o distanţă lineară,

exprimată în centimetrii (ecuaţia

din slide-ul anterior).

Evaluarea experimentală a lui H şi N

Determinarea deviaţiei standard, ,

din peak-ul cromatografic: W = 4.

N = L/H (1.12)

Figura alăturată reprezintă

o cromatogramă obișnuită în

funcţie de timp. Varianţa peak-ului

de solut poate fi obţinută printr-un

procedeu grafic simplu, şi are ca

unitate de măsură secunde la pătrat,

fiind în mod uzual notată cu 2,

pentru a o distinge de 2, care are ca

unitate de măsură centimetrii pătraţi.

Cele două deviaţii standard, şi

sunt legate prin relaţia:

unde L/tR reprezintă viteza lineară medie a

solutului, exprimată în centimetrii pe

secundă

Figura ilustrează modul simplu de

aproximare al lui şi dintr-o

cromatogramă obţinută experimental.

Tangentele punctelor de inflexiune de pe

cele două părţi ale peak-ului

cromatografic sunt prelungite până la

intersectarea lor şi se formează astfel un

triunghi cu baza pe axa timpului a

cromatogramei. Aria acestui triunghi

reprezintă aproximativ 96% din aria

totală a peak-ului.

În evaluarea statistică, se consideră că aproximativ

96% din aria peak-ului Gaussian este inclusă în interiorul

suprafeţei cu o aproximaţie de plus sau minus două deviaţii

standard (±2) din valoarea sa maximă. Astfel, intercepţiile

arătate în figură se manifestă la aproximativ ±2 din

maximum, iar W = 4, unde W este mărimea bazei

triunghiului. Substituind această relaţie în ecuaţia 1.14 şi

rearanjând termenii, rezultă:

Substituţia acestei ecuaţii de deviaţie

standard () în ecuaţia înălţimii talerului

(ecuaţia 1.13 ) conduce la:

formula de calcul al numărului

de talere teoretice, N:Prin substituţia formulei 1.16 în formula 1.12 urmată de rearanjarea termenilor,

se obţine formula de calcul al numărului de talere teoretice, N:

N = L/H (1.12)

În continuare, N

poate fi calculat din

măsurarea, la două

momente de timp, tR şi W;

iar pentru a obţine H,

lungimea coloanei

împachetate trebuie să fie

de asemenea cunoscută.

O altă metodă de aproximare a lui N, şi care este

considerată de către unii practicieni mai sigură,

necesită determinarea a W1/2 (jumătate din lăţimea

bazei peak-ului), Iar numărul de talere este dat de

formula:

Numărul de talere şi înălţimea talerului sunt general

utilizate în literatură şi în caracterizarea unor coloane

produse de către firmele de specialitate, ca măsură a

performanţei acestora. Din cauza faptului că aceşti

parametrii sunt semnificativi în compararea a două coloane,

este esenţial ca ei să fie determinaţi pentru acelaşi compus.

VARIABILELE CINETICE CARE AFECTEAZĂ ÎMPRĂŞTIEREA ZONEI

CROMATOGRAFICE

Tabelul prezintă parametrii cei mai importanţi care concură la rezoluţia cromatografică.

împrăştierea zonei cromatografice este consecinţa unei rate finite

de procese de transfer de masă care se produc în timpul migrării

solutului, de-a lungul unei coloane cromatografice. O parte dintre

aceste viteze sunt controlabile, prin ajustarea unor variabile

experimentale, care permit astfel creşterea calităţii separării.

EFECTUL VITEZEI DE CURGERE A FAZEI

MOBILE

Magnitudinea efectelor cinetice asupra eficienţei coloanei

depinde în mod clar de lungimea timpului în care faza mobilă este

în contact cu faza staţionară, care, la rândul ei, este depinde de

viteza de curgere a fazei mobile. Din această cauză, studiile

referitoare la eficienţa unor coloane sunt în general axate pe

determinarea lui H ca funcţie de viteza fazei mobile, u. Aceste date

sunt exemplificate de cele două curbe din figura următoare, una

caracterizând cromatografia de lichide, în timp ce a doua este

reprezentativă cromatografiei de gaze.

Ambele curbe prezintă un minim al înălţimii talerului teoretic, H

(ceea ce semnifică o eficienţă maximă) la viteze mici de curgere.

Această valoare minimă din cromatografia lichidă se manifestă în

general la viteze de curgere care sunt asemănătoare celei de

cromatografie de gaze şi deseori sunt atât de mici încât nu sunt

sesizabile în condiţiile normale de operare.

Efectul vitezei de curgere a fazei mobile asupra înălţimii

talerului teoretic în cazul

(a) cromatografiei de lichide şi (b) gaz cromatografiei.

Teoria vitezei de împrăştiere a zonei cromatografice

descrie cu acurateţe şi predicţionează forma diagramei H

în funcţie de u, grafic denumit adesea diagrama van

Deemter după numele descoperitorului ei. După cum se

observă în figura alăturată, vitezele de curgere pentru

cromatografia lichidă sunt semnificativ mai mici decât

cele utilizate în cazul celei gazoase.

Din această cauză, separările în gaz cromatografie

sunt mai rapide decât cele de cromatografie lichidă. Mai

mult, după cum arată figura, înălţimea talerului teoretic a

unei coloane de cromatografie lichidă are un alt ordin de

magnitudine fiind mult mai mică faţă de cel întâlnit în

cazul coloanelor utilizate în cromatografia de gaze. Din

această cauză, nu este practic a se utiliza coloane de

cromatografie lichidă care sunt mai lungi de 25-50 cm

(datorată presiunii picăturilor), în timp ce coloanele de

gaz cromatografie pot fi de 50 de metrii sau mai lungi.

În consecinţă, numărul total de talere şi astfel

eficienţa totală a coloanei sunt în general superioare în

cazul coloanelor de gaz cromatografie. În acest fel, o

primă comparaţie între gaz cromatografie şi cea lichidă

arată că prima metodă este capabilă de separări mai

rapide şi de mai mare eficienţă.

RELAŢIA DINTRE ÎNĂLŢIMEA TALERULUI ŞI VARIABILELE

COLOANEI

• În cursul ultimilor 40 de ani, au fost elaborate nenumărate studii

teoretice şi experimentale având ca scop dezvoltarea relaţiilor

cantitative care descriu efectul variabilelor prezentate în tabel,

asupra înălţimii talerului pe diverse tipuri de coloane. Au fost astfel

elaborate o serie de expresii matematice referitoare la relaţia dintre

înălţimea talerului şi parametrii variabili ai coloanei care, aplicate

practic, au avut grade diferite de succes. Aparent nici una dintre ele

nu a rezolvat în totalitate şi nu au putut să explice interacţiile fizice

complexe care conduc la lăţirea zonei cromatografice. O serie dintre

aceste teorii, cu toată imperfecţiunile lor au fost des utilizate şi au

condus la creşterea performanţei coloanelor cromatografice.

• O astfel aproximare matematică a comportamentului coloanelor

cromatografice este ecuaţia van Deemter, care poate fi scrisă în

forma:

H = A + B/u + Cu = A + B/u + (CS + CM)u (1. 19)

• unde H este înălţimea talerului dată în centimetrii, u este viteza lineară a fazei

mobile dată în centimetrii pe secundă, în timp ce A, B, şi C sunt coeficienţi referitori

la fenomenele de curgere pe multiple căi, difuzie longitudinală şi transfer de masă

între faze. După cum se observă în ecuaţia 1.19, coeficientul C poate fi desfăcut în

doi coeficienţi: unul (CS), în relaţie cu faza staţionară, iar celălalt, (CM), relativ la

faza mobilă.

• Studii teoretice ulterioare au arătat că ecuaţia van Deemter este destul de exactă

în explicarea eficienţei coloanei cromatografice. Ecuaţia van Deemter conţine

termeni direct şi invers proporţionali precum şi termeni independenţi faţă de viteza

fazei mobile.

TERMENUL (A)

Împrăştierea zonei se manifestă

în parte datorită multitudinii de căi de

curgere pe care moleculele (sau ionii)

le pot găsi şi urma prin coloana

împachetată. După cum se observă

în figura alăturată, lungimea acestor

căi pot diferi semnificativ, astfel,

timpul de rezidenţă în coloană pentru

moleculele aceleaşi specii este de

asemenea variabil. Moleculele de

solut pot astfel atinge capătul colanei

într-un interval de timp care conduce

la împrăştierea zonei. Acest efect,

denumit în acelaşi timp difuzie în

vârtej este direct proporţional cu

diametrul particulelor cu care se

împachetează coloana

cromatografică şi este prezentat în

coloana a treia din tabelul de mai

sus.

Modalitatea de eluţie a două molecule printr-o

coloană cromatografică.

Se poate nota că distanţa parcursă de molecula 2 este

mai mare decât cea parcursă de către molecula 1.

Astfel, molecula 2 va ajunge la punctul B mai târziu

decât molecula 1.

Împrăştierea prin curgere pe canale multiple poate fi

parţial compensată de difuziunea ordinară, care rezultă în

condiţiile în care moleculele sunt transferate printr-un curent

ce urmează o cale sau alta. Dacă viteza de curgere este

foarte mică, un număr mare de asemenea transferuri se

realizează iar fiecare moleculă în mişcarea sa în josul

coloanei urmează o altă cale de curgere, pierzând timpi

diferiţi pe fiecare direcţie de curgere.

Drept consecinţă, viteza cu care fiecare dintre molecule

se mişcă în josul coloanei tinde sa se apropie de medie. Se

poate spune că, la viteze mici ale fazei mobile moleculele nu

sunt semnificativ dispersate prin natura căilor multiple a

împachetării.

La viteze moderate sau mari, totuşi, nu este timp suficient

necesar pentru ca difuzia medie sa să realizeze iar împrăştierea

zonei se manifestă datorită lungimilor diferite ale căilor de curgere.

TERMENUL DE DIFUZIE LONGITUDINALĂ (B/u)

Difuzia longitudinală în cromatografia pe coloană este un proces de

împrăştiere a benzii în care soluţii difuzează dintr-un centru de concentrare spre

zone mai diluate, în faţa şi în spatele zonei cromatografice, unde se manifestă în

sensul şi în contra direcţiei de curgere a fazei mobile. După cum se observă în a

doua ecuaţie din tabelul 1.3, termenul de difuzie longitudinală este direct

proporţional cu coeficientul fazei mobile DM, constantă egală cu viteza de migrare

sub un gradient egal cu o unitate. Constanta este denumită factor obstructiv fiind

în relaţie cu împiedicarea difuziei longitudinale de către modul de împachetare al

coloanei. Astfel, în cazul coloanelor împachetate valoarea aceste constante este de

aproximativ 0,6 în timp ce pentru coloane neîmpachetate valoarea sa este egală cu

unitatea.

Contribuţia difuziei longitudinale este invers proporţională cu viteza fazei

mobile. Această relaţie nu este surprinzătoare dacă avem în vedere că analitul este

în coloană pentru o perioadă mai mică la viteze de curgere înalte. În cazul unor

viteze mari de curgere, difuzia de la centru bandei spre margini se manifestă mai

redus cu cât timpul de staţionare este mai mic. Pantele negative la viteze de curgere

scăzute prezentate în cele două grafice din figura alăturată şi sunt consecinţe ale

difuziei longitudinale. Se poate nota că efectul este mai puţin pronunţat în

cromatografia de lichide din cauza faptului că aceşti coeficienţi de difuzie în lichide

au ordine de magnitudine mai mici decât cei găsiţi în cazul gazelor. De fapt, pentru

cele mai multe lichide, factorul B/u se apropie de zero în relaţie cu ceilalţi termeni

din ecuaţia 1.19. Astfel, minimul arătat în figura alăturată nu este uneori observat.

Necesitatea celor doi coeficienţi de transfer de masă CS şi CM din ecuaţia 1.19 apare

datorită faptului că echilibrul dintre fazele mobilă şi staţionară se stabileşte deosebit de lent

în coloana cromatografică deoarece ea operează întotdeauna în condiţii de neechilibru. În

consecinţă, moleculele de analit aflate în partea frontală a benzii cromatografice sunt

preluate în faţă, înainte de a avea timp pentru a se echilibra în faza staţionară şi astfel să fie

reţinute de această fază. În mod similar echilibrul nu se stabileşte la marginea situată la

trena benzii iar moleculele de analit sunt părăsite îndărătul fazei staţionare, datorită mişcării

rapide a fazei mobile.

Împrăştierea benzii din cauza efectelor de transfer de masa se manifestă din cauza

faptului că o multitudine de curenţi de curgere ai fazei mobile din coloană şi stratul care

înconjoară faza staţionară au dimensiuni finite. În consecinţă, este necesar un timp pentru ca

moleculele de solut aflate la interfaţă să difuzeze dintr-o fază în interiorul celelalte faze.

Acest timp „de lag” rezultă din persistenţa condiţiilor de neechilibru de-a lungul coloanei

cromatografice. De altfel, dacă vitezele de transfer de masă dintre cele două faze ar fi

infinite, fenomenul de împrăştiere a zonelor cromatografice nu s-ar manifesta.

Se poate nota că extensia benzii cromatografice produsă atât de împrăştierea

longitudinală cât şi de transferul de masă depinde de viteza de difuzie a moleculelor de

analitul în timp ce direcţia difuziei în cele două cazuri este diferită. Împrăştierea longitudinală

apare din tendinţa moleculelor de a se îndrepta într-o direcţie paralelă curgerii, în timp ce

împrăştierea datorată transferului de masă se manifestă din tendinţa moleculelor de a difuza

într-un plan perpendicular cu direcţia de curgere. Drept consecinţă, gradul de împrăştiere

longitudinală este în relaţie inversă cu viteza de curgere. Pentru împrăştierea datorată

transferului de masă, din contră, cu cât faza mobilă se mişcă mai repede, cu atât timpul

necesar ajungerii la echilibru este mai redus. Astfel, după cum arată ultimii doi termeni ai

ecuaţiei 1.19, efectul transferului de masă asupra înălţimii talerului este direct proporţional

cu viteza lineară, u, de mişcare a fazei mobile.

COEFICIENŢII DE TRANSFER DE MASĂ (CS şi CM).

•TERMENUL DE TRANSFER DE MASĂ ÎN FAZA STAŢIONARĂ (CSU).

Ecuaţia a treia din tabelul 1.3, arată că în condiţiile în care faza staţionară este un lichid imobilizat,

coeficientul de transfer de masă este proporţional cu o funcţie complexă, fs(k') a factorului de retenţie k', este

direct proporţională cu pătratul grosimii filmului de pe particulele suport df şi este invers proporţională cu

coeficientul de difuzie, DS a solutului în film. Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin imaginarea modului prin

care aceşti factori influenţează frecvenţa medie prin care moleculele de analit care ajung la interfaţă sunt

transferate în faza mobilă. De exemplu, în funcţie de grosimea filmelor, moleculele trebuie să traverseze în medie

o distanţă mai mare sau mai mică pentru a atinge suprafaţa; în cazul coeficienţilor de difuzie mai mici, ele vor

traversa mai încet. Consecinţa ambilor factori este o viteză scăzută de transfer de masă şi o creştere a înălţimii

talerului.

Efectele acestei relaţii pot fi înţelese prin imaginarea modului prin care aceşti

factori influenţează frecvenţa medie prin care moleculele de analit care ajung la

interfaţă sunt transferate în faza mobilă. De exemplu, în funcţie de grosimea

filmelor, moleculele trebuie să traverseze în medie o distanţă mai mare sau mai

mică pentru a atinge suprafaţa; în cazul coeficienţilor de difuzie mai mici, ele vor

traversa mai încet. Consecinţa ambilor factori este o viteză scăzută de transfer de

masă şi o creştere a înălţimii talerului.

Termenul de transfer de masă în faza mobilă (CMu).

După cum arată ecuaţia a patra din tabelul 1.3,

coeficientul de transfer din faza mobilă CM este o

funcţie complexă, f(k') a factorilor de retenţie k', fiind

proporţional cu pătratul diametrului particulelor din

coloana împachetată dp şi invers proporţional cu

coeficientul de difuzie din faza mobilă, DM.

EFECTUL VITEZEI FAZEI MOBILE ASUPRA TERMENILOR ECUAŢIEI

VAN DEEMTER

În figura alăturată este înfăţişat modul de

reprezentare a ecuaţiei van Deemter în cazul unui

set de date experimentale. În acest experiment,

analitul eluat a fost reprezentat de acetatul de

benzil aflat într-o soluţie de hexan, care conţine

acetat de etil. Punctele situate pe curba de

deasupra reprezintă valorile experimentale în timp

ce curba cu linie continuă este reprezentarea

grafică a ecuaţiei van Deemter.

Diagrama van Deemter pentru o coloană de

cromatografie lichidă, împachetată. Punctele de

pe curba superioară sunt date experimentale.

Contribuţiile diverşilor termeni de viteze sunt

arătaţi pe curbele situate mai jos: A, efectul

datorat căilor multicanal de curgere; B/u,

difuzia longitudinală; Cu, transferul de masă

dintre cele două faze.

Curbele de sub această reprezentare arată contribuţia

efectului de curgere prin canale multiple, difuzia longitudinală şi

efectele combinate ale transferului de masă.

METODE DE REDUCERE A ÎMPRĂŞTIERII ZONEI CROMATOGRAFICE

Diametrul particulelor care compun coloana şi

diametrul coloanei reprezintă două variabile

importante controlabile care afectează eficienţa

unei coloane cromatografice. Efectul diametrului

particulelor este demonstrat prin datele

experimentale prezentate în figura alăturată în

timp ce pentru a beneficia de avantajul datorat

diametrului coloanei, în ultimii ani au fost introduse

în practica cromatografică coloane din ce în ce mai

înguste.

În condiţiile în care faza mobilă este gazoasă,

viteza de difuziune laterală poate fi redusă

apreciabil prin scăderea temperaturii şi astfel a

coeficientului de difuzie DM. În consecinţă,

scăderea înălţimii talerului este dependentă de

temperaturi joase. Acest efect este în general

nesemnificativ în cazul cromatografiei lichide din

cauza faptului că difuzia este lentă, astfel că

termenul de difuzie longitudinală are un efect mic

asupra înălţimii talerului.

La fazele staţionare lichide, grosimea stratului de

lichid adsorbit poate fi minimalizată deoarece CS din

ecuaţia 1.19 este proporţional cu pătratul acestei

variabile, df (ecuaţia a treia din tabelul 1.3).

OPTIMIZAREA PERFORMANŢELOR COLOANEI CROMATOGRAFICE

O coloană cromatografică este optimizată prin variaţia experimentală a

condiţiilor, până când componentele amestecului sunt separate în mod clar,

într-un timp minim. Optimizarea experimentelor are ca scop (1) reducerea

împrăştierii zonei cromatografice ori (2) alterarea vitezelor de migrare ale

componentelor din amestecul de separat. După cum s-a arătat, împrăştierea

zonei este crescută prin aceleaşi variabile cinetice care conduc la creşterea

înălţimii talerelor coloanei cromatografice. Pe de altă parte, vitezele de

migrare, pot fi modificate prin schimbarea acelor variabile care afectează

factorii de retenţie şi selectivitate ai soluţilor.

1. REZOLUŢIA COLOANEI

Rezoluţia, RS a unei coloane

cromatografice conduce la

măsurarea cantitativă a abilităţii

sale în separarea a doi analiţi.

Semnificaţia acestui termen este

ilustrat în figura alăturată, care

prezintă cromatogramele a două

specii moleculare, A şi B, pe trei

coloane ce posedă rezoluţii

diferite. Rezoluţia unei coloane

este definită ca:

o rezoluţie de 1,5 conduce la o

separare practic completă a

celor două componente, în timp

ce o rezoluţie de 0,75 nu. La o

rezoluţie de 1, zona A conţine

aproximativ 4% din specia B,

iar zona B conţine o cantitate

similară din solutul A. La o

rezoluţie de 1,5, suprapunerea

este de aproximativ 0,3%.

Rezoluţia pentru o fază

staţionară dată poate fi crescută

prin lungirea coloanei, astfel

crescând numărul de talere.

Consecinţa nefavorabilă la

adăugarea de talere o

reprezintă creşterea timpului

necesar separării

cromatografice.

Efectul factorilor de retenţie şi selectivitate asupra rezoluţiei cromatografice

Este foarte util a se dezvolta o relaţie matematică între rezoluţia unei coloane şi

factorii de retenţie, k’A şi k’B, a factorului de selectivitate , şi numărul de talere, N,

care alcătuiesc o coloană cromatografică în cazul a doi soluţi.

Considerând că cei doi soluţi, A şi B au timpi de retenţie apropiaţi unul de celălalt,

se poate aproxima că:WA = WB W

ecuaţia 1.20 poate fi

scrisă sub forma:

Ecuaţia 1.17 permite

exprimarea lui W în termeni de

(tR)B şi N, care pot astfel

substituiţi în ecuaţia anterioară,

rezultând:

Substituind ecuaţia 1.8 şi rearanjând-o, se obţine exprimarea lui RS în termeni de factori de

retenţie pentru A şi B, după cum urmează:

În continuare prin eliminarea k’A din această ecuaţie prin

substituţia ecuaţiei 1.10, rezultă:

Adesea este necesar a se calcula numărul de talere teoretice necesare pentru a

atinge o rezoluţie dorită. O exprimare a acestei cantităţi este obţinută prin

rearanjarea ecuaţiei 1.21 ceea ce conduce la:

Formele simplificate ale ecuaţiilor 1.21 şi 1.22 sunt uneori întâlnite în

condiţiile în care acestea se aplică unor perechi de soluţi ale căror constante

de distribuţie sunt aproape similare

unde k' reprezintă media dintre k‟A şi k‟B.

Înainte de a considera în detaliu semnificaţia ecuaţiilor derivate mai sus, este util să

se dezvolte o ecuaţie care să prezinte caracteristicile de performanţă a unei coloane,

adică timpul necesar pentru o completă separare a solutului A de solutul B.

În mod clar, ceea ce este dorit în cromatografie este o rezoluţie posibilă înaltă în cel

mai scurt timp posibil. Din nefericire, aceste două proprietăţi nu pot fi maximalizate în

aceleaşi condiţii, motiv pentru care totdeauna trebuie găsit un compromis.

Efectul rezoluţiei asupra timpului de retenţie

Timpul pentru desăvârşirea separării este determnat de viteza vB

a solutului care se mişcă mai lent este dată de ecuaţia 2.

Aceasta este:

Combinând această expresie cu ecuaţiile

1.6 şi 1.12, rezultă, după rearanjare:

unde (tR)B este timpul necesar pentru a aduce peak-

ul B la capătul coloanei în condiţiile în care viteza

fazei mobile este u.

În cazul în care ecuaţia de mai sus este

combinată cu ecuaţia 1.22 şi rearanjând termenii,

rezultă:

Variabilele care afectează performanţele unei coloane cromatografice

Ecuaţiile alăturate sunt semnificative deoarece

servesc drept ghid în alegerea condiţiilor care

sunt potrivite pentru a fi urmate de utilizatorul

cromatografiei pentru a atinge într-un timp

determinat scopul propus cu rezultate clare.

În cercetarea condiţiilor optime pentru o separare dorită trebuie avut în vedere că

parametrii fundamentali, , k' şi N (sau H) pot fi ajustaţi mai mult sau mai puţin

independent. Astfel, parametrii şi k' pot fi variaţi mai simplu prin varierea temperaturii

sau a compoziţiei fazei mobile. Utilizarea unui alt tip de împachetare a coloanei reprezintă

o modalitate mai puţin convenabilă. După cum s-a arătat, este posibil a se modifica N prin

schimbarea lungimii coloanei ori de a modifica H prin modificarea vitezei de curgere a

fazei mobile, a mărimii dimensiunilor particulelor de împachetare, a vâscozităţii fazei

mobile (prin modificarea DM sau DS), şi a grosimii filmului de lichid adsorbit conţinut în

faza staţionară .

Variaţia în numărul de talere, N

O cale evidentă de creştere a rezoluţiei o reprezintă creşterea numărului de talere din

coloană (ecuaţia 1.21). Totuși urmând această cale, metoda este mai puţin economică din

punct de vedere al timpului necesar pentru a finaliza separarea în afara cazului în care

creşterea în N este realizată mai degrabă prin reducerea în H decât prin lungirea coloanei.

Variaţia în înălţimea talerului, H

O îmbunătăţire semnificativă a rezoluţiei poate fi realizată fără nici un cost de timp suplimentar

dacă înălţimea talerului se reduce.

Se poate nota că scăderea mărimii particulelor de împachetare a coloanei conduce la o

îmbunătăţire marcantă a lui H.

Pentru faze mobile lichide, unde B/u este neglijabil, reducerea înălţimii talerului poate fi de

asemenea realizată prin reducerea vâscozităţii solventului, mărindu-se astfel coeficientul fazei

mobile.Variaţia în factorul de retenţie

Adesea, o separare poate fi îmbunătăţită semnificativ prin manipularea factorului de retenţie,

k‟B. Creşterea lui k‟B creşte în general rezoluţia (crescând însă timpul de eluţie). Pentru a determina

domeniul optim al valorilor pentru k‟B, este necesar a scrie ecuaţiile 1.21 și

în forma:

unde Q şi Q' conţin restul de termeni ai celor două ecuaţii.

Figura alăturată este o

reprezentare grafică RS/Q ori

(tR)B/Q' în funcţie de k’B,

considerând că Q şi Q' rămân

aproximativ constante. Se

vede clar că valorile lui k’Bmai mari de 10 nu trebuie

alese deoarece ele conduc la

o mică creştere în rezoluţie

dar cu o creştere marcantă a

timpului necesar separării.

Valoarea minimă a timpului

de eluţie se manifestă la o

valoare a k’B de aproximativ

2. Astfel, în multe cazuri,

valoarea optimă a k’B se

stabileşte luând în calcul atât

rezoluţia cât şi timpul necesar

separării, adică într-un

domeniu cuprins între 1 până

la 5.

Efectul factorului de retenție k’B asupra rezoluţiei

RS şi a timpului de eluţie (tR)B. Se consideră că Q

şi Q’ rămân constante la variaţia factorului k’B.

În mod uzual, cea mai simplă cale de creştere a rezoluţiei de separare o reprezintă

optimizarea lui k'. Pentru faze mobile gazoase, k' poate deseori crescut prin creşterea

temperaturii.

Pentru fazele mobile lichide, schimbarea compoziţiei solventului permite deseori

manipularea lui k' obţinându-se astfel separări superioare. Efectele dramatice produse

prin schimbarea solventului sunt ilustrate prin exemplul prezentat în figura de mai jos.

Efectul variaţiei solventului

asupra separării cromatografice.

Analiţi: (1) 9,10-antraquinonă; (2)

2-metil-9,10-antraquinonă; (3) 2-

etil-9,10-antraquinonă; (4) 1,4-

dimetil-9,10-antraquinonă; (5) 2-

t-butil-9,10-antraquinonă.

Se observă că o mică modificare a rapoartelor metanol/apă

conduce de la separări cromatografice nesatisfăcătoare (a şi b) la

separări unde fiecare peak al oricărui component este bine separat

(c şi d). În multe scopuri, Cromatograma arătată în (c) pare a fi cea

mai bună după cum arată raportul dintre rezoluţia adecvată în

intervalul de timp.

Variaţia în factorul de selectivitate

În condiţiile în care atinge unitatea, optimizarea lui k' şi creşterea lui N nu sunt suficiente pentru a produce o separare

satisfăcătoare a doi soluţi, într-un timp rezonabil. Sub aceste circumstanţe, trebuie identificată o posibilitate de creştere a

factorului de selectivitate , cu menţinerea lui k' într-un domeniu optim de 1-10. În acest context sunt posibile o serie de

opţiuni de lucru. Astfel, scăderea oportunităţii în perspectiva şi avantajul (comodităţii) aceste opţiuni includ: (1) schimbarea

compoziţiei fazei mobile, inclusiv schimbarea pH-ului; (2) schimbarea temperaturii coloanei; (3) schimbarea

compoziţiei fazei staţionare; (4) utilizarea unor efecte specifice, chimice.

Un exemplu de utilizare a opţiunii (1) a fost raportat în cazul separării anisolului (C6H5OCH3), de benzen. Cu o fază

mobilă conţinând un amestec metanol:apă 50%, k' pentru cei doi soluţi a fost raportată de 4,5 şi respectiv 4,7, în timp ce a

fost egal cu numai 1,04. Înlocuirea fazei apoase cu una care ca conţinut 37% tetrahidrofuran a condus la k' de 3,9 şi 4,7 şi la o

valoare de 1,20. Dacă suprapunerea celor două peak-uri a fost semnificativă în primul caz, în cel de al doilea caz

suprapunerea a fost neglijabilă.

Pentru separări care implică acizi sau baze ionizabile, modificarea pH-ului fazei mobile conduce deseori la

manipularea valorilor fără a schimbare majoră în k' ceea ce conduce la separări mai eficiente.

O metodă mai puţin convenabilă dar deseori foarte eficientă în creşterea simultan cu o menţinere aproape

constantă a valorilor lui k' în domeniul optim este cea de alterare a compoziţiei chimice a fazei staţionare. Pentru

aceasta, cele mai multe laboratoare care realizează separări cromatografice frecvente posedă mai multe coloane care pot fi

interschimbabile cu un minim de efort.

O creştere a temperaturii generează deseori o creştere în k' dar această operaţiune are un efect mic asupra valorilor

lui în cazul cromatografiei lichid-lichid ori cromatografiei lichid-solid. În opoziţie, în cazul cromatografiei de schimb

ionic, efectul temperaturii poate fi suficientă în cazul explorării acestei opţiuni, înainte de schimbarea împachetării coloanei.

În fine, o altă metodă de creştere a rezoluţiei este încorporarea în faza staţionară a unor specii care complexează sau

interacţionează cu unul sau mai mulţi componenţi aflaţi în proba de separat. Un exemplu de utilizare a acestei opţiuni o

reprezintă impregnarea cu săruri de argint a suportului adsorbent care conduce la o îmbunătăţire a separării olefinelor ca o

consecinţă a formării unor complexe între ionii de argint şi compuşii organici nesaturaţi.

Trena cromatografică

Formarea trenelor cromatografice reprezintă o problemă reală şi inevitabilă la majoritatea separărilor în

cromatografia lichidă. Cercetătorii din domeniu au depus eforturi în dezvoltarea unor noi materiale (suporturi

cromatografice) şi deşi acestea reduc formarea trenelor, rareori s-a putut elimina acest fenomen. Procesul de

formare a trenei cromatografice poate cauza atât probleme cantitative cât şi calitative în procedurile de

cromatografie lichidă, fiind importantă o monitorizare a formării lor astfel încât să nu se compromită rezultatul

analizei.

Analizând în detaliu o cromatogramă se poate observa că aproape toate peak-urile cromatografice au o

oarecare trenă mai mult sau mai puţin lungă. Deşi multe dintre coloanele de cromatografie lichidă actuale sunt

mai puţin problematice decât predecesoarele lor, totuşi aceasta problemă nu a fost încă eliminată.

Se consideră că un peak are trena sau ca este asimetric atunci când forma sa deviază de la cea ideala,

Gaussiană. A doua jumătate eluată a peak-ului este mai largă decât prima, iar lăţimea sa tinde sa se expandeze

spre baza. Deşi pot apărea cozi ale peak-urilor si in jumătatea frontala a acestora, acestea sunt totuşi rare in

comparaţie cu trenele. Deoarece trenele peak-urilor pot influenta calitatea separării este bine ca panta trenei sa

fie cuantificata. Exista doua mecanisme de măsurare universale a peak-urilor. Lucrătorii din industria farmaceutica

folosesc factorul de trenare, USP Tf (Unided State Pharmacopeea Tail factor), conform formulei 1.26.

unde a si b reprezintă lăţimea jumătăţii frontale si respectiv jumătăţii

posterioare măsurate la 5% din înălţimea peak-ului (figura alăturată).

Majoritatea celorlalţi practicieni folosesc factorul de asimetrie (As).

unde “a” si “b” sunt măsurate la 10% din înălţimea peak-ului cromatografic din figura alăturată.

Pentru valori mai mici de 2, As şi USP Tf sunt aproximativ aceleaşi, precum se poate

observa şi in tabelul de mai jos. ce reprezintă măsurătorile factorului de asimetrie şi ale

factorului de trenare USP pentru acelaşi peak, în cazul figurii de mai jos.

Peak-ul din figura alăturată

Valoarea măsurată

As Tf

1,0 1,0 1,0

1,2 1,3 1,2

1,5 1,7 1,4

2,0 2,5 1,9

3,0 3,8 2,9

4,0 5,5 3,5

Exemple de peak-uri asimetrice şi

factorul de asimetrie calculat pentru

fiecare.

Măsurătorile factorului de asimetrie (As)

şi ale factorului de trenare USP (Tf) pentru

acelaşi peak.

În condiţiile în care coloana cromatografică este nouă, majoritatea

producătorilor prezintă criterii de trenare (factorul As) cuprinse între

valorile 0,9 (puţin frontal) şi 1,2 (puţin trenat). Majoritatea utilizatorilor

care folosesc probe reale încearcă să obţină un factor de asimetrie, nu

mai mare de 1,5- 2. În general, când As este mai mare decât 2, există

probleme de separare, şi se cercetează cauza acestora.

Figura alăturată ne furnizează o serie de indicii asupra

potenţialelor probleme create de trena peak-urilor, prin comparaţia

unui peak ce are As = 1 cu un altul ce posedă As = 4. Astfel,

comparând aria peak-urilor, se observă o diferenţă elocventă; deşi ea

este aceeaşi înălţimea peak-ului cu As = 4 este de trei ori mai mică

comparativ cu înălţimea primului peak. În condiţiile analizelor de urme,

înălţimea peak-ului devine un factor critic în determinarea limitei

minime de cuantificare, iar trenarea peak-ului conduce la rezultate clar

inferioare.

Formarea trenelor este de asemenea problematică în cazul in

care peak-urile minore se ascund în cele majore. Acest fenomen este

nedorit în condiţiile analizei unor metaboliţi ori în identificarea unor

impurităţi.

Modelele de cromatografe lichide folosite pentru analizele de

rutină, trebuie de obicei să asigure o bună rezoluţie a liniei de bază a

tuturor peak-urilor iar timpul de rulare să fie cât mai mic posibil. Figura

alăturată arată că rezoluţia liniei de baza a peak-urilor cu trenă

necesită un timp mai lung de rulare comparativ cu peak-urile ce nu au

trenă sau care au o trenă scurtă. Aşadar, peak-urile cu trenă nu doar

reduc calitatea cromatogramei, dar ele reduc de asemenea abilitatea

de a cuantifica componente prezente în probă.

Cauzele apariţiei trenei cromatografice se datorează mai ales

faptului existenţei mai multor mecanisme de separare, unul dintre

acestea fiind supra-implicat. O serie dintre practicieni au tendinţa de a

considera separările în fază inversă, pe coloane C18, de exemplu

drept procese pure de retenţie hidrofobă. Această consideraţie poate fi

adevărată dacă faza staţionară ar fi constituită numai din grupări C18.

totuşi, aproximativ jumătate din suprafaţa de silice este nelegată ceea

ce conduce la permisiunea de expunere a grupărilor silanol (Si–OH)

care pot interacţiona cu proba.

Particulele de silice care formează suportul solid sunt realizate din polimer de siliciu

şi oxigen. Ca şi carbonul, siliciul este tetravalent, deci structura internă a lui cuprinde patru

atomi de oxigen ataşaţi la fiecare atom de siliciu în structura polimerului tridimensional. La

suprafaţă, polimerul se termină cu grupări de silanol Figura de mai jos prezintă diferitele

configuraţii posibile ale grupărilor silanolice.

Interacţii posibile la suprafaţa suportului de silice

Practicienii descriu în mod curent suprafaţa ca posedând grupări libere silanolice (a)

dar sunt de altfel prezenţi atomi de siliciu cu două grupări hidroxil în configuraţie geminală

(b). Dacă grupările silanolice sunt poziţionate una, alături de alta, se pot realiza legături de

hidrogen cu o grupare adiacentă (c). Grupările libere de silanol sunt mai acide decât

grupările geminale ori asociate ele interacţionând mai puternic cu soluţi bazici având ca

rezultat formarea unei trene deseori asociată cu separarea unor soluţi bazici. În alte cazuri,

urme de metale (deseori fier ori aluminiu) pot fi prezente in matrixul de silicagel (d). Ionii

metalici pot acţiona ca situsuri schimbătoare de ioni sau, când grupările silanol libere sunt

adiacente, ei pot atrage electroni, care fac ca silanolul sa fie şi mai acid (e).

In trecut, coloanele împachetate cu silice tip A conţineau toate aceste forme de silanol

prezentate în figură, totuşi, în ultimii ani s-a pus la punct tehnologii de obţinere de suporturi de

silice de puritate înaltă (silicea de tip B), ce conţine un număr redus de grupări silanol libere la

suprafaţă şi sunt lipsite de urme de metale, fiind astfel mai puţin acide. Astfel de coloane ce conţin

silice de tip B au o tendinţă mult mai mică de a genera peak-uri cu trenă.

Reducerea formării trenelor în coloane de tip.A, înseamnă de obicei modificarea fazei mobile

pentru a include componente ce concură la suprimarea trenei. Adăugarea de trietilamină în faza

mobilă reprezintă o metodă curentă în reducerea formării trenelor cromatografice. Folosită la o

concentraţie de 20mM sau mai mare în faza mobilă, trietilamina poate reduce semnificativ trenarea

picurilor în coloane de tip A. În cazul utilizării de silice de tip B trenarea peak-urilor reprezintă o

problemă mult mai rară. În condiţiile utilizării exclusiv de coloane de tip B, rareori se adaugă

trietilamină la faza mobilă. Ca regulă generală, pH-ul scăzut al fazei mobile (pH < 3) acţionează de

asemenea ca un supresor al ionizării silanolului, care mai departe conduce la reducerea formării

trenelor cromatografice.

Problema generală a eluţiei

Figura alăturată ilustrează o

cromatogramă ipotetică a unui amestec de

şase componenţi separaţi teoretic în trei

perechi de componente care au constante de

distribuţie şi factori de retenţie net diferiţi. În

cromatograma (a), condiţiile au fost ajustate

astfel încât factorii de retenţie pentru

componentele 1 şi 2 (k'1 şi k'2 ) sunt în

domeniul optim, de cuprins între 2 şi 5.

Factorii corespunzători pentru ai celorlalte

componente sunt, totuşi, departe de valorile

optime. Astfel, pentru peak-urile 5 şi 6 care

apar numai după un interval de timp extrem

de mare şi de asemenea care sunt difuzate,

este dificil de a fi identificate cu certitudine.

După cum se observă în cromatograma (b), schimbarea condiţiilor pentru optimizarea

separării componentelor 5 şi 6, îngrămădesc peak-urile primelor patru componente în zone

cu o rezoluţie nesatisfăcătoare. Totuşi, în acest caz timpul de eluţie este ideal.

În cromatograma (c) este prezentat un al treilea set de condiţii în care valorile lui k'

pentru componentele 3 şi 4 au valori optime. Separarea celorlalte două perechi, din nou, nu

este complet satisfăcătoare.

Fenomenul ilustrat în figură este întâlnit

aproape permanent, din acest motiv s-a denumit

problema generală a eluţiei. O soluţie comună în

rezolvarea acestei probleme este cea de schimbare a

valorilor ale k' după cum a fost prezentat mai înainte.

Aceste modificări pot fi realizate într-o manieră în trepte ori continuă. Astfel, pentru

amestecul prezentat în figură, condiţiile de la început pot fi cele care conduc la

cromatograma (a). Imediat după eluţia componentelor 1 şi 2, este necesară schimbarea

condiţiilor astfel încât să se ajungă la cele optime pentru separarea compuşilor 3 şi 4 (după

cum se observă în cromatograma c). Odată cu apariţia peak-urilor acestor compuşi, eluţia

poate fi realizată în condiţiile utilizate în cazul cromatogramei (b). Deseori, astfel de

proceduri conduc la rezolvarea satisfăcătoare a peak-urilor tuturor componenţilor din

amestec într-un interval minim de timp.

În cazul cromatografiei lichide, variaţiile în k' sunt produse prin variaţia în compoziţie a

fazei mobile în timpul eluţiei (eluţie în gradient sau programarea solventului).

Pentru gaz cromatografie, creşterea temperaturii (programarea temperaturii) serveşte

la atingerea condiţiilor optime necesare separării.

relaţii de legătură (1)

relaţii de legătură (2)

APLICAŢIILE CROMATOGRAFIEI

Cromatografia a reprezentat şi reprezintă o primă metodă de separare intim

legată de specii moleculare înrudite chimic, ce poate fi utilizată în identificări calitative

şi determinări cantitative ale speciilor separate. În continuare vor fi prezentate

caracteristicile generale ale cromatografiei, ca metodă de realizare a unei analize.

Analize calitative

O cromatogramă furnizează numai o singură parte de informaţie cantitativă despre

fiecare specie din probă, adică timpul său de retenţie ori poziţia pe faza staţionară după o

anumită perioadă de eluţie. În plus, datele pot de asemenea să fie derivate din cromatograme

proces implicând faze mobile şi staţionare diferite ori diverse temperaturi de eluţie. Până

acum cantitatea de informaţii oferite de prin cromatografie sunt mici comparativ cu cea

obţinută prin tehnici precum IR, RMN sau spectrometria de masă. În plus, datele spectrale,

lungime de undă sau de frecvenţă pot fi mult mai înalt specifice care pot reprezenta un

omolog al cromatografiei (tR).Cele mai sus prezentate nu trebuiesc interpretate în sensul că

metodele cromatografice îşi pierd din importanţă în cazul aplicaţiilor calitative.

Într-adevăr, cromatografia este o metodă deseori utilizată în recunoaşterea prezenţei sau absenţei unor componente

din amestecuri care conţin un număr limitat de specii posibile a căror identitate este cunoscută. De exemplu, 30 sau mai mulţi

aminoacizi dintr-un hidrolizat proteic pot fi detectate cu un mare grad de certitudine prin metoda cromatografică. Totuşi pentru

a confirma identitatea este necesară o investigaţie chimică sau spectroscopică a compuşilor izolaţi. Se poate nota că totuşi, o

identificare pozitivă spectroscopică a speciei prezente într-un complex de compuşi ar fi imposibilă fără o separare

cromatografică anterioară. Astfel, cromatografia este deseori o metodă precursoare în analizele spectroscopice calitative.

Este important a se nota însă că o cromatogramă nu poate conduce la o identificare pozitivă a speciilor prezente în

probe, dar poate da indicaţii sigure asupra absenţei unei serii de compuşi din respectivul analit. Astfel dacă proba nu produce

un peak cu un timp de retenţie asemănător unui standard analizat în aceleaşi condiţii se poate spune că acel compus luat în

analiză este absent (sau este prezent la concentraţii sub limita de detecţie a metodei).

Analize cantitative

Cromatografia îşi datorează în principal dezvoltarea din

ultimii ani, în parte, vitezei sale, simplicităţii şi preţului său

relativ scăzut, aplicabilităţii aproape generalizate ca o metodă

de separare. Nu se poate totuşi afirma că ea va deveni

generală decât în condiţiile în care ar fi utilizată la obţinerea

de informaţii utile cantitative asupra speciilor separate. Este

important totuşi a se discuta despre o serie de aspecte

cantitative care se aplică la toate tipurile de cromatografie.

Cromatografia cantitativă pe coloană se bazează pe

compararea înălţimii sau ariei peak-ului de analit şi prin

compararea acestuia cu unul sau mai multe standarde. În

cazul cromatografiei planare, aria acoperită de speciile

separate serveşte ca şi un parametru analitic. Dacă condiţiile

sunt corect controlate, aceşti parametrii vor varia linear cu

concentraţia.

Analize bazate pe înălţimea peak-ului

Înălţimea peak-ului cromatografic este obţinută prin măsurarea liniei de

bază pe de o parte şi a perpendicularei peak-ului, coborâtă prin vârf. Acest tip

de măsurare se realizează,într-un timp rezonabil şi cu o precizie de măsurare

bună. Este important a se nota că,totuşi înălţimile peak-urilor sunt invers

proporţionale cu lăţimile lor. Astfel, acurateţea rezultatelor obţinute din

măsurarea înălţimii este obţinută numai dacă nu apar variaţii în condiţiile de

eluţie a coloanei, care să nu altereze lăţimea peak-ului în perioada de eluţie a

probei şi a standardelor. Variabilele care trebuiesc urmărite cu grijă sunt

temperatura coloanei, viteza de curgere a eluentului prin coloană şi viteza de

încărcare (injecţie) a probei. În plus, trebuie avut grijă să se evite a

supraîncărcarea coloanei. Efectul injecţiei probei este în mod particular critic

în cazul primelor peak-uri ale cromatogramei. Injecţia neadecvată a probei

conduce la erorile relative de 5% până la 10%.

Analize bazate pe aria peak-ului

Ariile peak-urilor sunt independente de efectele de împrăştiere date de

variabilele menţionate mai sus. Din acest punct de vedere, totuşi, valorile

ariilor sunt variabile analitice mult mai satisfăcătoare comparativ cu înălţimile

peak-urilor. Pe de altă parte, înălţimile peak-urilor sunt mult mai uşor de

măsurat în cazul peak-urilor înguste.

Majoritatea instrumentelor moderne sunt echipate cu integratoare

electronice digitale care permit estimarea cu precizie a ariei peak-ului

cromatografic. Dacă asemenea instrumente nu sunt disponibile, se poate

apela la metoda manuală, metodă simplă care permite o bună estimare a

peak-urilor simetrice. Aceasta implică calcularea ariei prin înmulţirea înălţimii

peak-ului cu valoarea lăţimii determinată la jumătate din înălţimea lui. Alte

metode implică utilizarea unui planimetru sau decuparea peak-ului

cromatografic şi cântărirea lui, determinând astfel greutatea lui în relaţie cu o

arie cunoscută de hârtie de înregistrare. În general, tehnicile de integrare

manuală conduc la erori de 2-5%, pe când integrările digitale sunt de un ordin

de magnitudine mai precise.

Calibrări şi standarde

Cea mai sigură metodă de analiză cromatografică cantitativă implică prepararea unei

serii de standarde prin diluţia unei soluţii stoc ce posedă o compoziţie aproximativ

asemănătoare cu cea a probei necunoscute. Cromatogramele pentru standarde obţinute

astfel sunt apoi reprezentate în funcţie de concentraţia lor. Curba rezultată care obligatoriu

trece prin origine este utilizată la determinările de concentraţie a compusului care se

dozează. În mod frecvent se recurge la restandardizare pentru a obţine rezultate cu o mai

mare acurateţe.

Cea mai importantă sursă de erori în analize efectuate prin metoda mai sus

menţionată este dată de incertitudinea legată de volumul probei; uneori, viteza de injecţie,

reprezintă de asemenea un factor de eroare. În mod curent probele sunt mici (de

aproximativ 1 µl), iar incertitudinile legate de injectarea în condiţii reproductive a unui volum

cu o seringă de aceleaşi mărime poate conduce la scăderea cu procente semnificative a

erorilor. Această situaţie este des-întâlnită în cromatografia gaz-lichid, unde proba trebuie

sa fie injectată într-un dispozitiv special încălzit, unde fenomenul de evaporare care apare

la nivelul acului seringii poate fi deosebit de crescut, conducând astfel la variaţii mari ale

volumului injectat. Erorile volumului de probă pot fi reduse, cu probabil 1-2% din medie, prin

utilizarea unei valve rotative.

Metoda cu standard intern

Precizia cea mai mare în cromatografia cantitativă este obţinută prin utilizarea

standardelor interne deoarece incertitudinile introduse prin injectarea probei sunt evitate.

În această procedură, se măsoară cu atenţie o substanţă, denumită standard intern,

care este introdusă în fiecare standard sau probă, raportul dintre ariile (ori înălţimea)

peak-urilor analitului şi a standardului intern servind drept parametru analitic. Pentru ca

această metodă sa aibă succes, este ca peak-ul standardului intern să fie bine separat

de peak-urile celorlalte componente din probă (Rs > 1,25); peak-ul standard trebuie, pe

de altă parte, sa apară în apropierea peak-ului analitului. Cu un standard intern adecvat,

se poate creşte precizia faţă de alte metode, utilizate frecvent.

Metoda de normalizare a ariei

O altă abordare care conduce la scăderea incertitudinilor legate de injectarea probei

este metoda de normalizare a ariei. În acest caz, este necesară eluţia completă a tuturor

componentelor probei. În metoda de normalizare, ariile tuturor peak-urilor sunt calculate,

după corecţia tuturor acestor arii cu diferenţele dintre răspunsul detectorului la tipurile

diferite de compuşi, în timp de concentraţia analitului este determinată din raportul

acestor arii la aria totală a tuturor peak-urilor.

Din nefericire, adesea nu este practic a aranja condiţiile în aşa fel ca toţi compuşii

din amestec să fie eluaţi din coloană într-o perioadă de timp rezonabilă, motiv pentru

care metoda de normalizare are aplicaţii limitate.

CROMATOGRAFIA DE

PARTIŢIE

Dintre toate tipurile de procedee cromatografice lichide, cromatografia de partiţie este cea mai

utilizată tehnică de separare. Dacă în trecut cele mai multe aplicaţii se adresau compuşilor neionici,

celor polari cu masă moleculară moderată (de obicei mai mică de 3000) astăzi dezvoltarea unor

metode (procedee de derivatizare ori de tehnicile bazate pe perechi de ioni) au extins separările

prin partiţie şi la compuşi ionici.

Cromatografia de partiţie poate fi subdivizată în cromatografie lichid-lichid şi cromatografie cu

fază legată. Diferenţa între cele două tehnici constau în metoda prin care faza staţionară intră în

interacţie cu particulele suport, împachetate. În cromatografia lichid-lichid, faza lichidă staţionară

este reţinută pe suprafaţa particulelor împachetate prin adsorbţie fizică. În schimb, în cazul

cromatografiei de fază legată, faza staţionară este legată chimic la suprafaţa particulelor de suport.

Primele tipuri de cromatografie de partiţie au fost exclusiv de tip lichid-lichid; acum totuşi metoda cu

fază legată a devenit predominantă datorită multor dezavantaje ale sistemelor lichid-lichid. Unul

dintre aceste dezavantaje îl reprezintă pierderea fazei staţionare prin disoluţia ei î faza mobilă, care

astfel necesită reacoperirea periodică a particulelor suport. În plus, problemele de solubilitate ale

fazei staţionare interzic utilizarea fazei lichide împachetate în cazul eluţiei în gradient.

Cromatografia de partiţie cu

fază legată

Suporturile pentru majoritatea tehnicilor de cromatografie de

partiţie cu fază legată sunt preparate din silice rigidă ori au o

compoziţie pe bază de silice. Aceste solide sunt formate din particule

uniforme, poroase, cu consistenţă mecanică de gel, cu diametru de 3,

5, ori 10 μm. Suprafaţa acestora este formată din silice total

hidrolizată (proces realizat prin fierberea silicei în HCl, 0,1 M timp de

una-două zile, proces prin care rezultă grupări silanol, chimic

reactive, de forma:

Si

OOH OH

O

Si Si

OHOHO

Si

Structura suprafeţei de silice.

În mod caracteristic, suprafeţele de silice activată, conţin aproximativ 8

μmoli/m2 de grupări hidroxilice. O structură mult utilizată în cromatografia cu

fază legată o reprezintă siloxanii, compuşi rezultaţi prin reacţia dintre suprafaţa

hidroxilată cu un organoclorosilan, după reacţia:

Modalitatea de sinteză a unui siloxan;

R reprezintă o grupare alchil ori o

grupare alchil-substituită.

Din cauza efectelor sterice suprafaţa acoperită prin silanizare este

limitată la cel mult 4 μmoli/m2 după cum se observă în figura de mai jos.

Structura tridimensională a unui derivat

siloxanic.

Grupările Si-OH nereacţionate conduc din păcate la o polarizare nedorită a

suprafeţei, care are ca efect apariţia trenei peak-ului cromatografic, mai ales în cazul

soluţilor bazici. Scăderea acestui efect se realizează prin dezactivare cu clortrimetilsilan,

care, având o masă moleculară mai mică, se poate lega la grupările libere hidroxilice ale

silanolului.

TIPURI DE SUPORTURI UTILIZATE ÎN CROMATOGRAFIA CU FAZĂ LEGATĂ

În funcţie de polaritatea relativă a fazelor mobilă şi staţionară, se pot distinge două

tipuri de cromatografii cu fază legată. Primele lucrări de cromatografie lichidă s-au bazat

pe faze staţionare puternic polare precum apa ori trietilenglicolul, legate de particule de

silice ori de alumină; în continuare, un solvent relativ nepolar precum hexanul ori iso-

propil eterul, servesc apoi drept fază mobilă. Fiind raportată prima, această tehnică

cromatografică de partiţie a fost denumită cromatografie cu fază normală. În

cromatografia cu fază inversă, faza staţionară este nepolară, deseori o hidrocarbură, în

timp ce faza mobilă este relativ polară (apă, metanol, acetonitril, etc.).

Relaţiile dintre polaritate şi timpii de

eluţie în cazul cromatografiei cu fază

normală (a, b) şi cea cu fază inversă (c,

d) în cazul a trei componenţi. a)

polaritate scăzută a fazei mobile; b)

polaritate medie fazei mobile; c)

polaritate înaltă a fazei mobile; d)

polaritate medie fazei mobile.

În cromatografia cu fază normală, componentul cel mai puţin polar este eluat

primul, deoarece, în sens relativ, este cel mai solubil în faza mobilă; creşterea

polarităţii fazei mobile va avea ca efect scăderea timpului de eluţie. În opoziţie, în

metoda cu fază inversă, componentul cel mai polar apare primul, iar creşterea

polarităţii fazei mobile creşte timpul de eluţie. Aceste relaţii sunt ilustrate în de mai

sus.

Suporturile cromatografice cu fază

legată sunt clasificate drept cu fază

inversă dacă structura de suprafaţă a

suportului are un caracter nepolar, şi

drept cu fază normală în condiţiile în

care suportul conţine grupări funcţionale

polare. În cromatografia de înaltă

presiune cel puţin trei sferturi din

experimente se realizează pe coloane

împachetate cu fază inversă.

Structura grupărilor organice silil

ale fazei staţionare diferă prin mărime,

rigiditate planaritate şi grad de

nesaturare după cum se observă în

figura alăturată.

Structura chimică a grupărilor organice

silil prezente în structura fazelor

staţionare, utilizate în cromatografia

planară cu fază legată. Simbolurile sunt

explicitate mai jos.

Acestea includ trimetilsilil (C1), n-octildimetilsilil (C8), n-octadecildimethilsilil

(C18), 2-ciclohexiletildimetilsilil (CHE), 2-(3-ciclohexenl)etildimetilsilil (CHNE),

fenildimetilsilil (Ph), 2-feniletildimetilsilil (PE), 2-(2-naftil)etildimetilsilil (NE) şi 2-(3-

pirenil)etildimetilsilil (PYE). Cele mai comune grupări radicalice care îmbracă

suportul de siloxan este catena C8 (n-octil) ori catena C18 (n-octildecil).

DEVELOPAREA ÎN CROMATOGRAFIA DE PARTIŢIE

Procesul de eluţie a componentelor probei de pe suportul

cromatografic de către faza mobilă (solvent) este denumit developare.

Această metodă tinde a fi mai complexă în cromatografia lichidă decât în

cea gazoasă deoarece în faza mobilă lichidă componentele

interacţionează atât cu faza staţionară, cât şi cu cea mobilă, în contrast

cu gaz cromatografia unde faza mobilă se comportă ca şi un gaz ideal,

necontribuind în procesul de separare; ea serveşte numai transportului

componentelor probei prin faza staţionară. În acest fel, în gaz-

cromatografie, separările nu sunt semnificativ afectate de către faza

mobilă, indiferent dacă aceasta este reprezentată de heliu, azot, ori

hidrogen. În contrast evident cu fenomenul întâlnit în cazul gaz-

cromatografiei, succesul unei separări prin partiţie lichidă este adesea

profund dependent de compoziţia fazei mobile.

SELECŢIA COLOANEI ÎN SEPARĂRILE PRIN CROMATOGRAFIE DE PARTIŢIE

Succesul cromatografiei cu fază mobilă interactivă, necesită o balanţă optimă a forţelor

intermoleculare care implică cei trei participanţi activi în procesul de separare: faza mobilă, faza

staţionară şi solutul. Aceste forţe intermoleculare sunt descrise calitativ în termeni de polaritate

relativă a fiecăruia dintre cei trei reactanţi. Polarităţile diverselor grupe funcţionale cresc în

ordinea: hidrocarburi < eteri < esteri < cetone < aldehide < amide < amine < alcooli. Apa este

cel mai polar compus dintre toţi compuşii care conţin grupările funcţionale prezentate mai

sus.

Deseori, în alegerea unei coloane pentru separări cromatografice de partiţie, polaritatea fazei

staţionare este aproximativ aleasă, în concordanţă cu cea a analitului, în timp ce faza mobilă

aleasă pentru eluţie prezintă o diferenţă considerabilă din punct de vedere al polarităţii. Această

abordare este în general mai de succes decât cea în care polarităţile solutului şi a fazei mobile sunt

alese diferit de faza staţionară. În acest caz, faza staţionară deseori nu poate competiţiona eficient

pentru componentele probei, timpii de retenţie devenind prea scurţi în aplicaţiile practice. O altă

extremă o reprezintă situaţia în care polarităţile solutului şi a fazei staţionare sunt prea similare şi

total diferite de cea a fazei mobile. În această situaţie timpii de eluţie devin deosebit de mari.

Se poate concluziona că polarităţile solutului, fazei mobile şi fazei staţionare trebuiesc

cunoscute şi selectate cu grijă pentru a conduce la o separare de partiţie eficientă, într-un interval

de timp rezonabil. Din nefericire, teoriile interacţiilor dintre faza mobilă şi cea staţionară pentru

oricare component sunt i imperfecte motiv pentru care acestea pot doar ghida analistul în alegerea

fazei staţionare pentru un tip general, după care, este necesar a se realiza o serie de experimente

preliminarii, de identificare a fazei optime până la obţinerea unei separări satisfăcătoare. Dacă se

constată că rezoluţia tuturor componentelor ale amestecului este imposibilă, se alege un alt tip de

coloană.

Selecţia fazei mobile în cromatografia de partiţie

În prezentarea teoretică au fost descrise trei metode de creştere a rezoluţiei de

separare în cromatografia pe coloană, fiecare fiind bazată pe varierea unuia dintre cei

trei parametrii (N, k', şi α) prezentaţi în ecuaţia 1.21. În cromatografia lichidă, factorul

de retenţie, k', este experimental, cel mai uşor de manipulat dintre toţi aceşti trei

factori deoarece există o dependenţă puternică între a acestei constante funcţie de

compoziţia fazei mobile. Performanţele optime ale factorului de retenţie, k', trebuie să

fie cuprinse într-un domeniu ideal cuprins între 2 şi 5, totuşi, pentru amestecuri

complexe acest domeniu este extins la 0,5 - 20 în scopul de a furniza timp suficient

oricărui component din amestec să fie eluat.

Uneori, ajustarea lui k' singură, nu este suficientă pentru a produce o separare

clară a peak-urilor, fără suprapunere; în acest caz trebuie să se recurgă la variaţia

factorilor de selectivitate α. În acest caz modul cel mai simplu de modificare a

factorului de selectivitate α îl reprezintă alterarea cu grijă a compoziţiei fazei mobile,

pentru a păstra factorul de retenţie, k' într-un domeniu rezonabil. Un alt mod alternativ

de schimbare a factorului de selectivitate α îl reprezintă alegerea unui suport

cromatografic diferit.

EFECTUL TĂRIEI SOLVENTULUI ASUPRA FACTORILOR DE RETENŢIE

Solvenţii care interacţionează puternic cu soluţii sunt deseori numiţi solvenţi

„tari” ori solvenţi polari. În scopul descrierii cantitative a polarităţii solvenţilor au

fost introduşi o serie de indecşi.

Dintre aceştia, cel mai utilizat index în cromatografia de partiţie îl reprezintă

P', indexul de polaritate, introdus de către Snyder în 1978. Parametrul P' se

bazează pe măsurători de solubilitate a substanţei de interes în trei solvenţi:

dioxan (un dipol proton acceptor slab), nitrometan (un dipol proton acceptor tare)

şi alcool etilic (un dipol proton donor foarte tare). Indexul de polaritate este o

măsură numerică a polarităţii relative a unui număr divers de solvenţi. Tabelul 2.1

prezintă o listă de indecşi de polaritate, alături de alte proprietăţi fizico-chimice

pentru un număr de solvenţi care sunt utilizaţi în cromatografia de partiţie.

Se poate nota că acest index poate varia de la 10,2 pentru solventul cel mai

polar, apa, la -2 pentru compuşii înalt nepolari de tipul fluoroalcanilor. Orice alt

index de polaritate dorit se va încadra între aceste limite, fiind realizat prin

amestecul a doi solvenţi adecvaţi. În acest fel se obţine indexul de polaritate P'AB

a amestecului format din solvenţii A şi B. Acesta este dat de relaţia:

P'AB = ΦAP'A +ΦB P'B

unde P'A şi P'B reprezintă indecşii de polaritate ai celor doi solvenţi, iar Φ, fracţia volumetrică a

fiecărui solvent.

SolventIndex de

refracţie aVâscozitate [cP] b

Punct de

fierbere [oC]

Index de polaritate,

P'Tăria eluentului c, [εo]

Fluoroalcani 1,27-1,29 0,4-2,6 50-174 <-2 -0,25

Ciclohexan 1,423 0,90 81 0,04 -0,2

n-Hexan 1,372 0,30 69 0,1 0,01

1-Clorbutan 1,400 0,42 78 1,0 0,26

Tetraclorură de carbon 1,457 0,90 77 1,6 0,18

Eter i-propilic 1,365 0,38 68 2,4 0,28

Toluen 1,494 0,55 110 2,4 0,29

Eter etilic 1,350 0,24 35 2,8 0,38

Tetrahdrofuran 1,405 0,46 66 4,0 0,57

Cloroform 1,443 0,53 61 4,1 0,40

Etanol 1,359 1,08 78 4,3 0,88

Acetat de etil 1,370 0,43 77 4,4 0,58

Dioxan 1,420 1,2 101 4,8 0,56

Metanol 1,326 0,54 65 5,1 0,95

Acetonitril 1,341 0,34 82 5,8 0,65

Nitrometan 1,380 0,61 101 6,0 0,64

Etilenglicol 1,431 16,5 182 6,9 1,11

Apă 1,333 0,89 100 10,2 mare

Proprietăţile celor mai utilizate faze mobile cromatografice.

a valoarea este calculată la o temperatură de 25oCb centipoid-ul este unitatea de măsură, comună, a vâscozităţii în sistem internaţional, 1 cP = 1 mN·· s ··m-2.c valorile tăriei solventului sunt calculate pe suport de alumină, Al203; pentru silice, SiO2 valoarea εo se multiplică

cu un factor de 0.8.

S-a arătat anterior că cea mai simplă cale de creştere a rezoluţiei cromatografice a

două specii o reprezintă manipularea factorului de retenţie k', care poate fi variat prin

schimbarea indexului de polaritate a solventului. În cazul prezentat mai sus, ajustarea lui

P' este realizată prin utilizarea unei faze mobile ce conţine un amestec format din doi

solvenţi. De obicei, o schimbare grosieră cu două unităţi a indexului de polaritate P'

conduce la o creştere de zece ori a factorului de retenţie k'. În cazul separării prin

cromatografie de fază normală se poate scrie relaţia:

unde k'2 şi k'1 reprezintă valorile iniţiale şi finale pentru un solut, în timp ce P'1 şi P'2 sunt valorile corespunzătoare ale lui P'.

În cazul coloanelor cromatografice cu fază inversă relaţia este:

Se poate accentua că deși aceste ecuaţii sunt aproximative, ele pot fi

utilizate cu succes.

. APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE PARTIŢIE

Abordarea sistematică a separării a şase steroizi. (a) şi (b) utilizarea apei pentru a ajusta

valoarea factorului de retenţie k'. Efectele variaţiei factorul de selectivitate α sunt arătate în

(b), (c), (d), şi (e). Coloană: 0,4 x 150 mm împachetată cu suport C8, particule de fază inversă,

5 μm. Temperatura: 50°C. Viteza de curgere: 3.0 cm3/min. Detector: UV 254 nm. Compuşi: (1)

prednisonă, (2) cortizonă (3) hidrocortizonă, (4) dexametazonă, (5) corticosteronă; (6)

cortoexolonă.

Suporturile cu fază inversă când se utilizează în conjuncţie cu solvenţii foarte polari (deseori apoşi), se

apropie de sistemul ideal, universal, pentru cromatografia lichidă. Datorită aplicabilităţii mari, avantajoase şi

uşoare, în condiţiile în care factorul de retenţie k' poate fi alterat prin modificarea fazelor apoase mobile, ele sunt

frecvent aplicate înaintea altor separări exploratorii în cazul utilizării unor noi tipuri de probe.

Figura de mai jos ilustrează două dintre miile de aplicaţii ale cromatografiei cu fază legată.

Două aplicaţii ale

cromatografiei de partiţie cu

fază legată. a) Analiza unor

aditivi într-o băutură

nealcoolică. Coloană cu suport

polar legat (nitril). Eluţie

izocratică. b) Analiza unor

insecticide organofosforice.

Coloană cu fază legată C8,

eluţie în gradient. Detecţie UV,

254 nm.

Formarea unor derivaţi ai probei

Cromatograma derivaţilor ortoftalaldehidici ai 30 de aminoacizi de importanţă fiziologică. Coloană:

C18, 5 m de fază inversă. Solvent A: Na2HP04, 0,05 M, pH 7,4, CH30H/Tetrahidrofuran/H20.

Detector de fluorescenţă: excitaţie 334 nm; emisie 425 nm.

În unele cazuri este util a se converti componenţii probei în derivaţi înaintea sau

uneori când se întreprinde o separare cromatografică. Acest tratament este de dorit în

condiţiile în care se doreşte (1) reducerea polarităţii speciilor astfel că se poate utiliza mai

degrabă cromatografia de partiţie decât cea de adsorbţie ori de schimb ionic, (2) creşterea

răspunsului detectorului şi astfel creşterea sensibilităţii pentru toate ori pentru o serie de

componente ale probei şi (3) intensificarea selectivă a răspunsului la detector pentru o

serie de componente ale probei.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

Cromatografia de excluziune sterică, denumită de asemenea cromatografie de gel premeaţie sau gel

filtrare reprezintă o tehnică de separare de real folos în laborator, fiind aplicată în particular la separarea

speciilor cu masă moleculară mare. Suportul cromatografic împachetat utilizat în cromatografia de excluziune

sterică este alcătuit din particule mici, de aproximativ 10 μm de silicat ori particule de polimeri care conţin reţele

de pori uniformi într-un solut şi molecule de solvent difuzate în interiorul acestor pori. În interiorul porilor

moleculele sunt efectiv blocate, fiind mişcate prin curgerea fazei mobile. Domeniul de timp de rezidenţă în

interiorul porilor depinde de mărimea efectivă a moleculelor de analit. Moleculele care sunt mai mari decât

media mărimii porilor suportului cromatografic sunt excluse şi astfel ele nu vor fi reţinute, aceste specii fiind

primele eluate. Moleculele care au un diametru semnificativ mai mic decât dimensiunile porilor pot penetra

(permea) în labirintul de pori din interiorul suportului cromatografic, fiind astfel captate, pentru un timp mult mai

îndelungat, fiind ultimele eluate. Între cele două extreme sunt moleculele intermediare a căror domeniu de

permeare în pori depinde de diametrele lor. Faţă de acest grup de molecule are loc fracţionarea, fenomen direct

legat de diametrul lor şi în unele cazuri de forma moleculară a lor. Se poate spune că separările prin gel

permeaţie, de excluziune pe baza masei moleculare diferă de alte procese de separare prin considerentul că nu

există interacţii fizice sau chimice între analit şi faza staţionară. Din această cauză, este necesară eliminarea

oricărei interacţii deoarece acestea conduc la scăderea eficienţei cromatografice. De asemenea trebuie notat că

în cazul acestui proces de separare există o limită superioară a timpului de retenţie din cauza faptului că nici o

specie de analit nu se reţine mai mult decât cel care permează total faza staţionară. De reţinut că în cazul

separării biomoleculelor în sisteme apoase, cromatografia de excluziune de denumeşte cromatografie de gel

filtrare, în timp ce separarea compuşilor în sisteme neapoase este denumită cromatografie de gel permeaţie.

Metoda cromatografică de excluziune din gel (numită de asemenea cromatografie de sitare moleculară)

exploatează masa moleculară ca proprietatea fizică în scopul realizării separării. Astfel pot fi separate molecule

din domeniul a 100 până la cele de mai multe milioane de daltoni. Este clar că o tehnică prin care se separă

molecule cu masă moleculară cuprinsă între 10000 şi 100000 este deosebit de populară printre cercetătorii

biochimişti. Gel cromatografia a avut şi are o importanţă majoră în purificarea a miilor de proteine, acizi nucleici,

enzime, polizaharide ori a altor biomolecule. În plus, tehnica poate fi aplicată la determinări de mase moleculare

ori la analize cantitative ale interacţiilor moleculare.

Suporturi în cromatografia de gel filtrare

Faza staţionară este constituită din particule inerte care conţin pori mici cu dimensiuni

controlate. Examinarea microscopică a acestor particule arată un interior spongios. O soluţie care

conţine molecule cu diferite mase moleculare este trecută prin coloană sub influenţa unui solvent în

continuă curgere. Moleculele de solut care sunt mai mari decât porii nu vor putea pătrunde în

interiorul sferelor de gel din cauza împiedicărilor sterice datorate dimensiunii acestora în

comparaţie cu spaţiul din interiorul sferelor. Volumul coloanei care este accesibil moleculelor foarte

mari este astfel semnificativ redus. Ca rezultat, ele nu vor fi încetinite în curgerea lor prin coloană şi

vor fi eluate astfel ca o singură bandă (zonă). Moleculele mici sunt capabile să difuzeze în şi în

afara sferelor de gel, fiind necesare volume mai mari de solvent pentru a fi eluate, astfel ele

staţionând un timp îndelungat în interiorul sferelor, în consecinţă fiind întârziată eluţia lor din

coloană. Moleculele cu dimensiuni intermediare migrează prin coloană cu viteză cuprinsă între cea

a moleculelor mari şi cele mici. Astfel, ordinea de eluţie a diverselor molecule de solut este

oarecum în relaţie directă cu dimensiunile lor moleculare.

Au fost elaborate două tipuri de suporturi pentru cromatografia de excluziune pe baza

mărimii moleculelor: microsfere de polimer şi particule ce au la bază silice, ambele având

diametre cuprinse între 5 şi 10 μm. Ultimele au avantajul unei rigidităţi crescute ceea ce

conduce la o împachetare mai uşoară, permiţând utilizarea lor la presiuni crescute, stabilitate

deosebit de mare, care permite utilizarea lor împreună cu un mare număr de solvenţi, inclusiv

cu apa, o echilibrare mai rapidă într-un nou solvent şi o stabilitate înaltă la temperaturi ridicate.

Cele mai timpurii separări efectuate prin tehnica de cromatografie de excluziune moleculară s-

au realizat pe copolimer reticulat de stiren-divinil benzen, similar în structură cu copolimerii sulfonici

ai acestor copolimeri. Mărimea porilor acestor polimeri e controlată prin cantitatea de agent de

reticulare, în speţă de cantitatea de divinilbenzen utilizată în reacţia de polimerizare. Drept

consecinţă, au fot creaţi o serie de copolimeri cu diferite domenii ale porilor, sub formă comercială.

Dacă la început gelurile de stiren-divinilbenzen erau hidrofobe, şi astfel neutilizabile în prezenţa

unei faze mobile apoase, astăzi sunt disponibile geluri hidrofile, ceea ce face posibilă utilizarea lor

în solvenţi apoşi pentru separarea unor molecule mari, hidrosolubile precum zaharurile. Aceste

geluri hidrofile sunt derivaţi sulfonaţi ai divinibenzenului ori sunt poliacrilamidice.

În acest moment sunt disponibile comercial suporturi de sticlă poroasă ori particulele de silice

ce au domeniu de mărime al porilor cuprins între 40 şi 2500 Å. În scopul reducerii absorbţiei

nespecifice, suprafeţele acestor particule sunt deseori modificate prin reacţii cu substituenţi

organici. De exemplu, suprafaţa unui suport hidrofil prezintă structura următoare:

Structura unui suport hidrofil, pe bază de silice

Tipul de suport cromatografic Mărimea pariculei,

μm

Domeniul de limită al

porilor, Å

Limita de excluziune a masei

moleculare

polistiren-divinilbenzen 10 102 700

103 (de la 0,1 la 20) x 104

104 (de la 1 la 20) x 104

105 (de la 1 la 20) x 105

106 (de la 5 >20) x 106

Silice 10 125 (de la 0,2 la 5) x 104

300 (de la 0,03 la 1) x 105

500 (de la 0,05 la 5) x 105

1000 (de la 5 la 20) x 105

Proprietăţile unor matrix-uri pe bază de polistiren-divinilbenzen şi silice utilizate în

cromatografia de excluziune pe baza mărimii masei moleculare. Limita de excluziune a

masei moleculare se referă la domeniul la care nu se manifestă nici o reţinere.

În practica biochimică sunt utilizate cu preponderenţă geluri bazate pe

patru tipuri de bază: dextran, poliacrilamidă, agaroză şi amestecuri de

poliacrilamidă cu dextran.

Primele geluri dezvoltate au fost pe bază de dextran, un polizaharid natural reticulat cu

epiclorhidrină, comercializat sub denumirea de Sephadex

Dextranul este un polizaharid compus din resturi de glucoză legate prin legături (α-1 -6) şi

legături α-1,3 care conferă legături ramificate. El este biosintetizat de către o enzimă produsă de

către bacteria Leuconostoc mesenteroides, tulpina B-512F. Dextranul este reticulat la multiplele

sale extremităţi printr-o reacţie cu epiclorhidrină, ceea ce conduce la obţinerea unor sfere de gel cu

porozităţi diferite.

Numărul dat fiecărui tip de gel se referă la capacitatea de îmbibare cu soluţie apoasă (water

regain) multiplicată cu 10. Sephadex-ul este oferit în diverse mărimi ale particulelor denumite

coarse, medium, fine şi superfine. Gelurile pe bază de dextran nu pot fi preparate decât pentru

limite de excluziune mai mici de 600000 daltoni, deoarece mica reticulare existentă în structura lor

nu este suficientă pentru a preveni colapsul particulelor. În schimb, prin reticularea dextranului cu

NN'- metilen bisacrilamidă, este posibilă utilizarea acestor geluri la fracţionări cu domenii mai mari.

Aceste geluri sunt denumite Sephacryl.

Gelurile pe bază de poliacrilamidă sunt produse prin copolimerizarea acrilamidei cu NN'-

metilen bisacrilamidă, ultimul fiind şi agent de reticulare. Denumirea comercială a acestor geluri

este Bio-Gel P. Mediile pe bază de Bio-Gel sunt media sunt disponibile în 10 limite de excluziune,

în domeniul 1800 la 400000 daltoni.

Gelurile pe bază de agaroză prezintă avantajul unor deosebit de mari limite de excluziune.

Agaroza, componentul polizaharidic neutru al agarului, este compusă din unităţi alternative de

galactoză şi anhidro-galactoză (Figura următoare).

Agaroza este un material gelificant a căror mărime a porilor este mai mare

decât cei ai dextranului reticulat ori ai poliacrilamidei. Agaroza este un polizaharid

neutru, fracţie de agar.

Ea este compusă din polimer linear de D-galactopiranoză legate β-1→4 la 3,6

anhidro-L-galactopiranoză, care este legată α -1→3. În condiţiile în care

polizaharidul este dizolvat prin fierbere şi apoi este răcit, el formează legături de

hidrogen inter- şi intramoleculare. Mărimea porilor este controlată prin

concentraţia de agaroză. Structura gelului este stabilizată mai mult prin legături de

hidrogen decât prin legături încrucişate covalente.

Gelurile pe bază de agaroză sunt furnizate sub denumirea comercială de Bio-Gel A şi Sepharose

ori Superose. Sepharose CL este o Sepharose reticulată prin reacţia dextranului cu 2,3-

dibromopropanol în condiţii alcaline, ceea ce conduce la obţinerea unui gel de agaroză cu o stabilitate

termică şi chimică crescută.

Un pas înainte în tehnologia de gel filtrare s-a realizat în momentul introducerii gelurilor

compozite, prin grefarea unui polimer secundar pe un suport de gel preformat, precum de

exemplu Sephacryl (figura de mai jos), unde reticularea se realizează între alil dextran şi N,N'-

metilen bisacrilamidă ori mai recent, Superdex.

Structura probabilă a polimerului Sephacryl HR

Structura Superdex-ului

Gelurile combinate de poliacrilamidă şi agaroză sunt furnizate sub denumirea

comercială de Ultragel. Acestea sunt compuse din poliacrilamidă reticulată în ochiurile

căreia se află agaroză. Ca şi în cazul Superdex, gelul de poliacrilamidă conferă un

grad înalt de separare în timp ce agaroza menţine rigiditatea gelului ceea ce conduce

la marele avantaj al creşterii vitezelor de curgere.

În definirea performanţelor unui gel şi a comportamentului unui solut este necesară

cunoaşterea unor proprietăţi fizice ale acestora.

Limita de excluziune. Ea este definită ca masa moleculară a celei mai mici molecule care

nu poate difuza în interiorul volumului de matrix de gel. Toate moleculele mai mari decât

această masă vor fi eluate rapid, într-o singură zonă. Limita de excluziune a unui gel tipic,

Sephadex G-50, este de 30000 Da. Toate moleculele din solut care posedă mase moleculare

mai mari de această valoare vor trece prin coloană direct, fără a fi reţinute în porii sferelor de

gel.

Domeniul de fracţionare. În cazul Sephadex G-50 domeniul de fracţionare este cuprins

între 1500 şi 30000 Da. Moleculele de solut din acest domeniu, se vor separa oarecum într-o

relaţie lineară, în funcţie de masa lor moleculară.

Capacitatea de îmbibare (water regain şi bed volume). Mediile de gel cromatografie sunt

oferite cel mai adesea în formă deshidratate fiind umflate apoi în solvent, de obicei apă,

înainte de utilizare. Cantitatea de apă necesară obţinerii unui gram de gel este cunoscută sub

denumirea de water regain. În cazul Sephadex G-50, această valoare este de 5 pentru 0,3 g.

Această valoare nu include apa din jurul particulelor de gel şi astfel nu poate fi utilizată la o

estimare exactă a volumului final al coloanei împachetate de gel. Cele mai multe companii

care comercializează astfel de produse furnizează, în plus la water regain, valoarea volumului

particulelor, bed volume. Această valoare reprezintă volumul final de gel în condiţiile umflării

(îmbibării) a unui gram de gel uscat în apă. Pentru Sephadex G-50, bed volume-ul este de 9

până la 11 ml/g gel uscat. În seria Sephadex-ului, denumită seria G, numerele G se referă la

cantitatea de apă care este necesară pentru înmuierea gelului, având grade diferite de

reticulare, deci diferite mărimi ale porilor. Sephadex G-10, cel mai reticulat dextran, posedă un

water regain de aproximativ 1 ml/g de gel uscat în timp ce Sephadex G-200, cel mai ieftin

dextran reticulat are un water regain de aproximativ 20 ml/g de gel uscat.

Forma şi mărimea particulei de gel. În condiţii ideale, particulele de gel sunt sferice,

pentru a furniza un strat uniform de gel, cu o mare densitate a porilor. Mărimea particulelor

este definită prin mărimea ochiurilor acesteia (mesh) ori prin diametrul sferei particulei.

Gradul de rezolţie oferit de viteza de curgere prin coloană depinde de dimensiunile

particulelor de gel. Particulele cele mai mari (50 la100 mesh, 100 la 300 μm) oferă viteze de

curgere înalte dar o separare cromatografică cu rezoluţie scăzută. În caz opus se află

particulele de gel cu dimensiuni foarte mici ("superfine," 400 mesh, 10 la 40 μm). Cele mai

utilizate mărimi de particule reprezintă un compromis între rezoluţie şi viteză de curgere

fiind de 100 la 200 mesh (50 la 150 μm).

Volumul spaţiului gol (void volume). Acesta reprezintă spaţiul total din jurul particulelor

de gel într-o coloană împachetată. Valoarea volumului spaţiului gol se determină prin

măsurarea volumului de solvent necesar eluării unui solut care este complet exclus din

matricea gelului. Cele mai multe coloane pot fi calibrate în scopul determinării acestui

parametru prin eluţia a unui colorant, blue dextran 2000, care are o masă moleculară medie

de 2000000 daltoni.

Volumul de eluţie. Acest volum reprezintă volumul de tampon de eluţie necesar

îndepărtării unui anumit solut, particular, dintr-o coloană împachetată.

Astfel, după împachetarea coloanei cu mediu

suport ce este alcătuit din particule sferice de gel [1],

proba este aplicată pe coloană [2].

Tamponul (faza mobilă) şi proba se mişcă de-a

lungul coloanei [3]. Moleculele difuzează în şi în

afara porilor matrix-ului (fenomen descris de

asemenea drept partiţia probei între faza mobilă şi

cea staţionară). Moleculele mai mici se vor dispersa

mai mult in interiorul porilor matrix-ului şi vor rămâne

un timp mai îndelungat pe coloană. Cum tamponul

trece continuu prin coloană, moleculele mai mari

decât porii matrix-ului sunt incapabile să difuzeze în

interiorul acestora, trecând astfel prin coloană, fără a

fi reţinute. Moleculele mai mici difuzează în interiorul

porilor şi sunt astfel întârziate în trecerea lor de-a

lungul coloanei [4]. Moleculele mai mari părăsesc

primele coloana, urmate de moleculele mai mici, în

ordinea mărimii lor [5]. Întregul proces de separare

are loc la un volum total al tamponului care trece prin

coloană (echivalent cu volumul de suport

împachetat).

Ilustrarea fenomenului de separare prin gel filtrare.

ASPECTE TEORETICE ALE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

În abordarea teoretică a procesului de cromatografie se ia în considerare faptul că solutul

trece printr-un strat cromatografic prin intermediul fazei mobile. Faza staţionară acţionează în

sensul întârzierii deplasării solutului prin strat. Soluţi diferiţi sunt întârziaţi cu timpi diferiţi. În

cromatografia de partiţie, această întârziere este datorată partiţionării solutului între faza mobilă şi

cea staţionară.

Viteza cu care solutul traversează stratul cromatografic este proporţională cu o fracţie de timp,

calculată pe bază statistică, în care moleculele sunt reţinute în faza mobilă. Această fracţie de timp

pierdut în faza mobilă este determinată ca raportul volumelor de fază mobilă respectiv staţionară,

alături de un coeficient de partiţie. Acest coeficient de partiţie a solutului între faza mobilă şi cea

staţionară guvernează comportamentul cromatografic al solutului, prin ecuaţia fundamentală a

cromatografiei de partiţie. O multitudine de teorii au fost emise în încercarea de caracterizare a

acestui coeficient de partiţie în cazul gel filtrării.

Prima abordare teoretică a comportării gelurilor în cromatografie este cea realizată, în anul

1961 de către P. Flodin (1961). El consideră partiţia moleculelor de solut între particulele de gel şi

lichidul interstiţial ca un întreg efect steric şi punctează că în mediul înconjurător imediat apropiat

de catene reticulate de gel suport matrix-ul de gel ocupă cea mai mare parte a spaţiului. În aceste

condiţii, moleculele mari nu pot penetra în aceste regiuni, în timp ce moleculele mici pot trece

bariera reticulată şi astfel se pot apropia mult mai intim. Aceste restricţii sterice, după Flodin, împart

gelul în regiuni permise şi regiuni interzise moleculelor de solut. Cu cât moleculele de solut sunt

mai mari în dimensiuni, cu atât numărul de regiuni interzise din reţeaua matrix-ului este mai mare.

În regiunile permise, concentraţia de solut este considerată a fi identică cu cea din lichidul

interstiţial. Această teorie conduce la definirea constantei K drept un volum disponibil la o specie

moleculară dată.

Pentru a realiza o separare prin gel filtrare mediul suportul (mediul) este împachetat într-o

coloană sub formă de perle în strat împachetat (packed bed). Mediul este reprezentat de un matrix

poros în formă de particule sferice care trebuie a fi alese în funcţie de stabilitatea lor chimică şi

fizică ori pe baza proprietăţii de a fi inerte (prin pierderea proprietăţilor de reactivitate sau

adsorptivitate). Coloana împachetată este echilibrată cu tampon cu rolul de a se distribui în porii

matrix-ului şi în spaţiul dintre particule. Lichidul situat în interiorul porilor este uneori definit drept

fază staţionară care se află în echilibru cu lichidul din afara particulelor denumit fază mobilă. Se

poate nota că probele se eluează în condiţii isocratice, nefiind necesară utilizarea tampoanelor

diferite în timpul separării. În mod normal, o treaptă de spălare se realizează prin trecerea unui

tampon la sfârşitul oricărei separări pentru a facilita îndepărtarea oricărei molecule care ar fi putut fi

reţinute pe coloană şi pentru a pregăti coloana pentru o nouă separare. Figura de mai jos prezintă

cei mai utilizaţi termeni utilizaţi în descrierea unei separări cromatografice prin gel filtrare.

Termeni uzuali utilizaţi în gel filtrare.

Ilustrarea termenilor utilizaţi în gel filtrare

• Volumul relativ de eluţie, , unde Vo reprezintă volumul spaţiului gol

(denumit şi volumul mort), reprezintă volumul de eluţie pentru o substanţă

care este complet exclusă din gel Vo este identic cu volumul lichidului

interstiţial dintre sferele de suport cromatografic. În unele cazuri inversul

volumului relativ de eluţie, R, constanta de retenţie este de asemenea

utilizată în caracterizarea unei substanţe. Constanta de retenţie, R este un

parametru interesant, deoarece ea este apropiată de viteza relativă de

migrare utilizată în cromatografia pe strat subţire.

Pentru a caracteriza comportamentul unui solut fără a avea o referinţă la

dimensiunile geometrice ale coloanei sunt utilizate frecvent o serie de variabile.

Vo

Ve

Măsurarea volumului de eluţie, Ve.

• Valoarea este uşor de calculat. Ea este oarecum

dependentă de modul de împachetare al coloanei. O

operare la presiune înaltă care conduce la un void

volume mic poate să crească uneori valoarea acestui

parametru. Această variaţie are totuşi o importanţă

minoră.

• Raportul (unde Vt reprezintă volumul total al patului de

gel), este de asemenea uşor de determinat.

Măsurătoarea volumului total a patului de gel se

realizează, prin umplerea tubului până la nivelul original

al stratului de gel împachetat cu apă, determinându-se

astfel acest volum. Se poate adăuga că, în comparaţie

cu raportul , variaţia raportului este mai mică.

Vo

Ve

Vt

Ve

Vo

VeVt

Ve

CURBELE DE SELECTIVITATE

Utilizarea domeniului de masă moleculară

pentru împachetare în cazul cromatografiei de

excluziune moleculară este convenţional

reprezentată în figura alăturată, unde în panelul (a)

e prezentată o curbă de calibrare.

În acest caz, masa moleculară, care este

într-o relaţie directă cu mărimea moleculelor de

solut, este plotată (reprezentată) în funcţie de

volumul de retenţie VR, unde VR este produsul

dintre timpul de retenţie şi viteza de curgere

volumetrică. Se poate nota că scara este

logaritmică. Limita de excluziune defineşte masa

moleculară a speciilor care depăşesc domeniul de

retenţie şi la care nu se manifestă nici o reţinere

pe coloana cromatografică. Toate speciile care au

o masă moleculară mai mare decât limita de

excluziune nu sunt reţinute de suport şi vor fi

eluate împreună, rezultând astfel un peak comun,

peak-ul A, din panelul (b). limita de permeaţie

reprezintă astfel masa moleculară sub care

moleculele de solut pot penetra complet în

interiorul porilor de gel. Totalitatea moleculelor sub

această masă moleculară sunt atât de mici încât

ele vor fi eluate ca o singură bandă, D, din panelul

(b).

Odată cu scăderea masei moleculare comparativ cu

limita de excluziune, moleculele de solut vor staţiona din

ce în ce mai mult, în medie, în interiorul porilor şi apoi se

vor deplasa mai lent. Această situaţie se manifestă în

regiunea de permeaţie selectivă, unde are loc fracţionarea

solutului, ceea ce conduce la separarea pe benzi

individuale a componentelor acestuia. Acest caz este

prezentat în panelul (b), peak-urile B şi C.

Curbele de selectivitate pentru Superdex 30 prep grade, Superdex 75 prep grade

şi Superdex 200 prep grade.

REZOLUŢIA DE SEPARARE ÎN CROMATOGRAFIA DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

Succesul unei separări prin cromatografie de excluziune sterică depinde în primul

rând de alegerea condiţiilor care conduc la o selectivitate suficientă şi la o contracarare a

lăţirii peak-ului, fenomen ce se manifestă în timpul separării. După selecţia mediului de gel

filtrare cu o selectivitate corectă, volumul probei şi dimensiunile coloanei devin parametrii

critici ce afectează rezoluţia de separare.

Rezoluţia finală, gradul de separare între peak-uri este influenţată de o multitudine de

factori: raportul dintre volumul probei şi volumul coloanei, viteza de curgere, dimensiunile

coloanei, mărimea particulelor suportului cromatografic, distribuţia mărimii particulelor,

densitatea de împachetare, porozitatea particulelor şi vâscozitatea fazei mobile. Succesul

undi separări prin cromatografie de excluziune moleculară depinde în cea mai mare

măsură de alegerea condiţiilor care să conducă la o selectivitate suficientă alături de

contracararea efectelor de împrăştiere a peak-ului în timpul separării.

Rezoluţia este funcţie de selectivitatea mediului

suport cromatografic şi de eficienţa acestuia în

producerea unor peak-uri cât mai înguste (cu o

împrăştiere minimă a peak-ului) după cum este ilustrat

în figura alăturată.

Eficienţa unei coloane împachetate este definită

drept capacitatea acesteia de a produce peak-uri

înguste şi simetrice în timpul eluţiei. Eficienţa este un

parametru deosebit de important în mod particular în

cromatografia de excluziune moleculară deoarece

separarea are loc numai într-un volum de tampon egal

cu volumul coloanei, tampon ce traversează coloana.

VOLUMUL PROBEI ŞI DIMENSIUNILE COLOANEI

Volumul probei este exprimat ca procente din volumul total al coloanei

împachetate. Utilizarea unor probe cât mai mici conduce la evitarea

suprapunerii dacă peak-urile sunt prea apropiate. Figura de mai jos arată cum

influenţează volumul probei în cazul fracţionării de rezoluţie înaltă

Pentru fracţionări cu mare rezoluţie a probei este recomandat un volum

de probă egal cu 0,5–4% din volumul total al coloanei, acesta depinzând de

tipul de mediu utilizat. Pentru cele mai multe aplicaţii, este preferabil ca

volumul probei să nu depăşească 2% pentru a avea o rezoluţie maximă.

Funcţie specificitatea probei este posibil să se introducă un volum mai mare

de probă, în particular când peak-urile de interes sunt bine rezolvate. Din

această cauză, volumul probei poate fi determinat numai pe cale

experimentală.

În cazul separărilor analitice ori în cazul separării unor probe complexe

este avantajos a se începe cu un volum egal cu 0,5% din volumul total al

coloanei. Un volum al probei mai mic de 0.5% nu creşte în mod normal

rezoluţia. Pentru a creşte capacitatea de separare prin gel filtrare, proba poate

fi concentrată. Este preferabil a nu utiliza probe cu o concentraţie mai mare de

70 mg/ml proteină, datorită efectelor de vâscozitate care astfel să conducă la

interferenţe în separare. Diluţia probei este inevitabilă datorită fenomenului de

diluţie care se manifestă la trecerea probei prin coloană. În scopul de a

minimaliza diluţia probei, este preferabil a utiliza maximul volum al acesteia

pentru a obţine rezoluţia maximă necesară între peak-urile de interes.

Înălţimea patului cromatografic, împachetat în coloană afectează atât

rezoluţia cât şi timpul necesar eluţiei. Rezoluţia în gel filtrare creşte cu

pătratul rădăcinii înălţimii patului cromatografic. O dublare a înălţimii stratului

cromatografic conduce la o creştere a rezoluţiei cu un echivalent de =

1,4 (40%). În cazul fracţionărilor de înaltă rezoluţie, sunt de preferat

coloanele lungi care vor da cele mai bune rezultate în timp ce o înălţime a

patului de gel cuprinsă între 30–60 cm va conduce la rezoluţii satisfăcătoare.

O înălţime suficientă a stratului de gel alături de o viteză scăzută de curgere

dau suficient timp tuturor moleculelor intermediare să difuzeze în şi în afara

porilor matrix-ului cromatografic conducând astfel la rezoluţii bune. Dacă este

necesară o coloana este foarte lungă, înălţimea efectivă a patului de gel

poate fi crescută prin utilizarea mai multor coloane care conţin aceleaşi

suport cromatografic, cuplate în serie.

2

SELECŢIA SUPORTULUI CROMATOGRAFIC

Selecţia corectă a gelului suport reprezintă o etapă critică în succesul unei separări gel

cromatografice. Cele mai multe experimente de excluziune moleculară pot fi clasificate în separări de grup

şi în fracţionări de înaltă rezoluţie.

Separările de grup pot fi divizate, funcţie de solut, în două grupe: fracţionări se soluţi cu masă

moleculară relativ mică şi fracţionări se soluţi cu masă moleculară relativ mare. Exemplele specifice ale

acestora sunt desalifierea soluţiilor de proteine sau îndepărtarea unor molecule mici de contaminanţi din

extracte de proteine sau acizi nucleici. Pentru separările de grup, gelul trebuie ales astfel încât sî conducă

la o excluziune completă a moleculelor cu masă moleculară mare în void volume. În acest scop sunt

recomandate Sephadex G-25, Bio-Gel P-6, şi Sephacryl S-100HR pentru cele mai multe separări de grup.

Mărimea recomandată a particulelor este de 100 - 200 mesh ori particule cu un diametru de 50 - 150 μm.

Fracţionarea implică separarea gupelor de soluţi cu mase moleculare similare dintr-un amestec

multicomponent. În acest caz, gel trebuie ales astfel ca domeniul de fracţionare să includă masele

moleculare dorite a se separa din solut. Dacă amestecul de solut conţine macromolecule cu mase

moleculare de până la 120000, cele mai potrivite suporturi cromatografice sunt Bio-Gel P- 150, Sephacryl

S-200 HR ori Sephadex G-150. În cazul utilizării Bio-Gel P-100, Sephadex G- 100 sau Sephacryl S- 100

HR o serie de proteine din probă cu masă moleculară mai mare vor elua în void volume. Pe de altă parte,

dacă se utilizează dacă se utilizează Bio-Gel P-200, Bio-Gel P-300 ori Sephadex G-200 acestea vor

scădea atât rezoluţia cât şi viteza de curgere. În cazul în care domeniul de masă moleculară a amestecului

de solut este necunoscut, este necesară o selecţie empirică a suportului cromatografic. În cazul celor mai

multe fracţionări se recomandă utilizarea suporturilor cromatografice de 100-200 ori 200-400 mesh (20-80

μm ori 10-40 μm). În cazul gelurile celor mai fine este recomandabil a se selecta o viteză de curgere

optimă. Pentru separări critice, gradele superfine oferă cea mai bună rezoluţie dar vitezele de curgere sunt

foarte scăzute.

APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE EXCLUZIUNE MOLECULARĂ

Cromatografia de excluziune moleculară este subdivizată în gel filtrare şi în

cromatografie de gel permeaţie. Prima utilizează solvenţi apoşi suporturi cromatografice

hidrofile. Cel de al doilea tip de cromatografie este bazat pe solvenţi organici neapoşi şi

suporturi cromatografice hidrofobe. Aceste metode sunt complementare în sensul că una

este aplicabilă pentru probe solubile în apă, în timp ce a doua este aplicabilă substanţelor

solubile în solvenţi mai puţin polari.

Una dintre cele mai utilizate aplicaţii ale excluziune pe baza mesei moleculare este

separarea unor molecule cu masă moleculară mare, produşi naturali, de speciile de

molecule cu masă moleculară mică ori de separarea lor de săruri.

De exemplu, un gel cu o limită de excluziune de câteva mii, poate separa clar,

proteine de aminoacizi şi de peptide cu masă moleculară mică.

O altă aplicaţie a cromatografiei de gel permeaţie o reprezintă separarea unor

omologi ori a unor oligomeri. Această aplicaţie este ilustrată în figura de mai jos, unde este

prezentată separarea unor acizilor graşi din domeniul de masă moleculară 116 - 344 pe un

suport pe bază de polistiren, împachetat, cu o limită de excluziune de 1000.

Sephadex-ul poate fi utilizat de asemenea în cromatografia de

excluziune moleculară pentru separare în prezenţa unor solvenţi

organici precum dimetilformamida, în cazul Sephadex G-10 ori a unor

amestecuri de apă cu alcooli cu catenă scurtă, în cazul Sephadex G-

10, G-25 şi G-50.

Sephadex LH-20 este un suport special conceput pentru

separările compuşilor naturali care necesită prezenţa unor solvenţi

organici pentru a le menţine solubilitatea. El este utilizat de asemenea

la separarea unor molecule precum sterolii, terpenoidele, lipidele şi

peptidele cu masă moleculară mică (până la 35 resturi de aminoacizi).

Toţi aceşti compuşi sunt uzual separaţi prin cromatografie de partiţie

lichid-lichid sau prin cromatografie de absorbţie. Funcţie de solvenţii

aleşi, acest mediu suport poate separa de asemenea componente prin

partiţie între faza staţionară şi faza mobilă.

Sephadex LH-20 poate prezenta o selectivitate înaltă pentru

compuşi aromatici într-o serie de solvenţi şi poate fi utilizat atât în

scopuri analitice cât şi în cele industriale. El este utilizat atât în scopuri

analitice cât şi în cele industriale, la separarea unor specii moleculare

înrudite. Datorită proprietăţilor sale unice acest mediu suport poate fi

utilizat atât în timpul purificării iniţiale cât şi în faza finală de finalizare a

purificării, de exemplu la separarea diastereomerilor. Funcţie de

solvenţii aleşi, Sephadex LH-20 poate de asemenea separa

componente prin partiţie între matrix şi solvent organic. Sephadex LH-

20 manifestă atât proprietăţi hidrofilie cât şi hidrofobe, ceea ce-i oferă

selectivitate specială şi astfel are cu o multitudine de aplicaţii.

Separările de grup: componentele probei sunt separate în două grupuri majore, funcţie de

domeniul mărimii lor. O separare de grup poate fi utilizată la îndepărtarea contaminanţilor cu

masă moleculară mare sau mică (cum ar fi îndepărtarea roşului de fenol din fluidele, mediile,

de cultură, desalifiere sau la schimbare a tampoanelor de lucru.

Fracţionarea de înaltă rezoluţie a biomoleculelor: componentele probei sunt separate ân

funcţie de diferenţele în masă moleculară. Fracţionarea de înaltă rezoluţie poate fi utilizată în

izolarea unuia sau mai multor componente, la separarea monomerilor din agregate, la

determinarea masei moleculare ori la realizarea analizelor de distribuţie a masei. Gel filtrarea

poate fi de asemenea utilizată la facilitarea reîmpachetării proteinelor denaturate prin controlul

intim (atent) în schimbarea condiţiilor de tamponare.

O cromatogramă care ilustrează

separarea de grup. Proba: ● =

hemoglobină, x = NaCl. Volumul

probei: a) = 10 ml, b) = 400 ml.

Hemoglobina este elutată în void

volumul coloanei (de exemplu, 370 ml)

în timp ce clorura de sodiu este eluată

cu un volum total de lichid (860 ml).

Aproape tot volumul de pori este utilizat

în desalifiere. Coloana de 85 X 4 cm

diametru interior este împachetată cu

Sephadex G-25 Medium.

FRACŢIONAREA CU REZOLUŢIE ÎNALTĂ A

MACROMOLECULELOR

DETERMINAREA MASEI MOLECULARE PRIN

ANALIZE DE DISTRIBUŢIE

Curbă de calibrare pentru determinarea masei moleculare a

proteinelor prin cromatografie de excludere sterică.

Suportul cromatografic este Sephadex G-100.

CROMATOGRAFIA PLANARĂ LICHID-LICHID

Principial, în cromatografia de partiţie lichid-lichid sunt utilizate două faze lichide, o fază legată

la un suport inert, denumită fază staţionară şi o altă fază lichidă, denumită fază mobilă care

traversează faza staţionară şi care distribuie componente solutului, între aceste două faze.

Componentele solutului prezintă solubilitate în cele faze. Procesul care se produce este deseori

complicat de apariţia unor fenomene de adsorbţie a substanţelor şi a fazei mobile de către suportul

inert. Cromatografia de partiţie se poate realiza pe coloane de pudră de celuloză, dar cele mai

comune şi utilizate metode sunt cele care utilizează ca suport hârtia (cromatografia pe hârtie) ori un

strat subţire de silicagel sau alumină depus pe un suport solid de tipul sticlei, foliei de aluminiu sau

din material plastic (cromatografia pe strat subţire, thin-layer chromatography, TLC). Celuloza, ca şi

alţi polimeri naturali ori sintetici, poate lega o cantitate mare de apă. Astfel procesul de separare

cromatografică va implica partiţia componenţilor probei între apa (solventul apos) legată de suportul

inert (faza staţionară) şi solventul de developare (faza mobilă). Frecvent, unul din componentele de

developare îl reprezintă apa. În condiţiile în care între apă şi componentul organic există fenomenul

de nemiscibilitate, este adăugat un al treilea component (solvent) care este capabil să se amestece

atât cu apa cât şi cu primul component organic, pentru a se crea o singură fază organică de

solvent. Este cazul etanolului din sistemul apă:etanol:nitrometan, unde etanolul este capabil să se

dizolve atât în apă cât şi în solventul organic, de exemplu.

Metodele de cromatografie planară includ cromatografia pe strat subţire, cromatografia pe

hârtie şi electrocromatografia. Oricare dintre acestea se realizează utilizează un strat subţire relativ

plat care reprezintă el însuşi suportul cromatografic (de exemplu, hârtia) ori pe suprafaţa căruia se

află depus acest suport. Faza mobilă se deplasează prin faza staţionară sub acţiunea forţei de

capilaritate, a forţei gravitaţionale ori sub un gradient de potenţial. Cromatografia planară este

uneori denumită cromatografie bidimensională deşi această definiţie nu este strict corectă deoarece

faza staţionară posedă o înălţime finită.

Cromatografia pe strat subţire

Din punct de vedere teoretic al tipurilor de fază mobilă şi staţionară utilizate în

cromatografia pe strat subţire, există o similare deosebită cu cromatografia lichidă pe coloană.

O caracteristică importantă a cromatografiei pe strat subţire (thin layer chromatography, TLC) o

reprezintă faptul că ea serveşte drept ghid în dezvoltarea condiţiilor optime de realizare a

separării prin cromatografie lichidă pe coloană. Avantajele utilizării acestui procedeu îl reprezintă

viteza şi preţul scăzut ale experimentelor exploratorii pe strat subţire. O serie de

experimentatori, de fapt, efectuând experimente de cromatografie pe strat subţire îşi formează o

opinie în efectuarea experimentelor următoare pe coloană. În plus, la utilizarea acestei metode

la dezvoltarea metodelor cromatografice pe coloană, TLC a devenit o metodă comună în

industria medicamentului, pentru determinarea purităţii produselor. Tabelul 2.10 arată domeniile

curente de utilizare ale cromatografiei pe strat subţire.

Ea este răspândită în laboratoarele clinice şi reprezintă baza multor studii biochimice şi

biologice. În plus, metoda este larg utilizată în laboratoarele industriale. Drept consecinţă a

acestei largi arii de aplicare, s-a estimat că numărul de analize efectuate prin cromatografie pe

strat subţire este cel puţin egal cu cel realizat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă.

În mod clasic separările prin cromatografie pe strat subţire sunt realizate pe suporturi din

sticlă, folie de aluminiu ori plastic care sunt acoperite cu un strat subţire şi aderent de de

particule fine; acest strat reprezintă suportul inert.

Particulele sunt similare celor utilizate în cromatografia de adsorbţie, partiţie normală sau

inversă, cromatografie de excluziune moleculară. Fazele mobile sunt similare celor utilizate în

cromatografia lichidă de presiune înaltă.

Domenii de aplicare Tipul de analize

Aplicaţii clinice Lipide

Studii metabolice

Screening-ul unor medicamente

Control antidrog (antidopping)

Aplicaţii industriale Dezvoltarea proceselor şi optimizarea lor

Monitorizarea unor procese

Validarea unor procese

Industrie alimentară Controlul calităţii

Aditivi (de exemplu, vitamine)

Pesticide

Teste de stabilitate (expirare)

Medicină legală Detectarea unor documente false

Investigaţii în otrăviri

Analize de vopsele

Aplicaţii farmaceutice Teste de control al uniformităţii

Analiza identităţii sau purităţii

Teste de stabilitate

Analize de mediu Apă

Sol

Analize de reziduuri

Domeniile actuale de aplicare ale cromatografiei pe strat subţire

SUPORTURI CROMATOGRAFICE

Suporturile utilizate în cromatografia pe strat subţire sunt comercializate în două

forme, pentru cromatografie pe strat subţire convenţională şi cromatografie pe strat subţire

de înaltă performanţă. Primele posedă un strat subţire de 200-250 μm înălţime cu care

conţine particule cu o dimensiune de 20 μm sau mai mari. Suporturile de înaltă performanţă

posedă un suport cromatografic de 100 μm înălţime cu diametrul particulelor de 5 μm sau

mai mici. Suporturile de înaltă performanţă, după denumire, conduc la separări precise, în

interval de timp scurt. Astfel suporturile cromatografice convenţionale posedă 2000 de

talere teoretice pe o distanţă de 12 cm, într-un timp de developare ce cca. 25 minute.

Suporturile cromatografice de înaltă performanţă prezintă 4000 de talere teoretice pe o

distanţă de 3 cm. care necesită circa 10 minute pentru dezvoltare. Suporturile de înaltă

performanţă au însă dezavantajul unei capacităţi reduse în ceea ce priveşte volumul probei

adăugate.

În mod diferit de cromatografia lichidă de presiune înaltă şi de gaz cromatografie unde faza

mobilă reprezintă un parametru ce poate fi uşor menţinut la o viteză specificată, în cromatografia

pe strat subţire viteza fazei mobile nu poate fi în general controlată în afară de cazul în care se

utilizează tehnica de developare cu curgere forţată. Viteza de curgere este afectată de natura

suportului cromatografic (porozitate, împachetare, mărimea particulelor, etc.) cât şi de proprietăţile

fazei mobile (vâscozitate, tensiune de suprafaţă, presiunile de vapori ale solvenţilor, etc.). În

general viteza scade în timpul dezvoltării plăcii cromatografice (figura de mai jos).

Datorită fenomenului de creştere a rezistenţei fazei staţionare faţă de curgerea fazei mobile, în

condiţiile utilizării unor suporturi de cromatografie pe strat subţire de performanţă înaltă, se pot

obţine rezultate superioare numai în cazul unor distanţe scurte de developare.

În condiţiile menţinerii altor parametrii constanţi, rezoluţia Rs a doi compuşi este mai

dependentă de poziţia lor relativă pe cromatogramă (RF) decât de distanţa de migrare a frontului

(distanţa de developare).

Relaţia dintre distanţa de

developare şi timpul de

developare în condiţiile utilizării

unui suport de silicagel HPTLC

silicagel 60. Faza mobilă:

toluen/acetat de etil (1) şi acetat

de etil/metanol/apă/acid formic (2).

PERFORMANŢELE SUPORTURILOR DE

CROMATOGRAFIE PE STRAT SUBŢIRE

Majoritatea termenilor şi relaţiilor care caracterizează cromatografia pe coloană, pot

fi adaptaţi, uşor, cu mici modificări, cromatografiei pe strat subţire. Un termen nou,

factorul de retardare, RF este necesar a se prezenta în contextul cromatografiei pe strat

subţire.

Cromatografia pe strat subţire pentru un singur

solut este prezentată în formă de cromatogramă

figura de mai jos. Factorul de retardare pentru un

singur solut este dat de relaţia:

RF =

unde dR şi dM reprezintă distanţele lineare

măsurate de la linia de start până la

mijlocul spotului respectiv până la frontul

de solvent. Valorile pentru RF pot varia de

la 1 pentru soluţii care nu sunt întârziaţi şi

care migrează odată cu frontul până la o

valoare apropiată de 0, pentru soluţii care

nu interacţionează cu faza mobilă. Trebuie

notat că dacă spoturile nu sunt simetrice,

cum de altfel se întâmplă frecvent,

măsurarea dR se efectuează de la linia de

start până în punctul de maximă intensitate

al spotului.

Variabilele care influenţează factorul de retenţie

Pentru a obţine cele mai corecte valori ale RF, este nevoie de o precizie mare şi o mare

reproductibilitate. Cei mai importanţi factori de care depinde exactitatea (determinare magnitudinii

RF), includ grosimea stratului de suport, deci a fazei staţionare, contaminarea (conţinutul în umiditate)

a fazelor mobilă şi staţionară, temperatura, gradul de saturaţie a camerei de developare cu vapori de

fază mobilă ori mărimea probei. Un control complet al acestor factori variabili nu sunt în general

controlabili în condiţii practice. Ameliorarea parţială a acestor efecte poate fi deseori realizată totuşi

prin substituirea cu un factor relativ de retenţie RX a factorului de retardare, RF care reprezintă

raportul dintre distanţa parcursă de analit şi distanţa parcursă de o substanţă standard.

Aplicaţii ale cromatografiei pe strat subţire

Datele obţinute dintr-o singură cromatogramă de obicei nu furnizează informaţii suficiente

pentru a permite identificarea diverselor specii prezente într-un amestec din cauza variabilităţii

valorilor RF cu mărimea probei, stratul subţire cromatografic şi condiţiile existente în timpul

cromatografierii. În plus, întotdeauna există posibilitatea ca doi soluţi diferiţi să manifeste

proprietăţi cromatografice asemănătoare, cu valori RF identice sau foarte apropiate în condiţiile

de separare date.

Autentificarea unei substanţe prin utilizarea unei standard.

O metodă care deseori furnizează date importante în tentativa identificării

unor componente din probă este cea de aplicare pe placa cromatografică a

unui spot cu conţine un compus din specia căutată purificată ce este probabil

prezentă în cea necunoscută. Se compară apoi valorile RF între spotul

substanţei necunoscute cu cel al standardului. Valorile identice ale celor două

RF furnizează o dovadă solidă a identităţii celor două componente ale probei

(figura de mai jos). Totuşi, confirmarea este întotdeauna necesară. Un test uşor

de confirmare este de a repeta experimentul cu faze mobile şi staţionare

diferite cât şi cu reactivi de vizualizare diferiţi.

Separarea unor derivaţi xantinici pe un

suport de cromatografie pe strat subţire

tip C-18 de fază inversă. Faza mobilă:

metanol/ K2HPO4, 0,l M (55:45 v/v).

Detecţie: vapori de iod. Timpul de separare

cromatografică: 1 oră, valorile RF:

teobromină, 0,68; teofilină, 0,56; cafeină,

0,44; 3-izobutil-1-metil xantină, 0,21.

Cromatografia planară bidimensională

Figura de mai jos ilustrează separarea unor aminoacizi dintr-un amestec prin

cromatografiere în două dimensiuni. Proba se plasează în colţul unei plăci cromatografice de

formă pătrată. Cromatografierea se realizează în direcţie ascendentă, în solventul A. Acest

solvent este apoi îndepărtat prin evaporare iar placa cromatografică este rotită cu 90o, după

care se cromatografiază ascendent cu solventul B.

Cromatogramă bidimensională pe strat subţire

(silica gel) a unor aminoacizi. Solventul A:

toluen/2-clor etanol/piridină. Solvent B:

cloroform/alcool benzilic/acid acetic.

Aminoacizi: (1) acid aspartic, (2) acid

glutamic, (3) serină, (4) β-alanină, (5) glicine,

(6) alanină, (7) metionină, (8) valine, (9)

izoleucină şi (10) cisteină.

Analize cantitative

O estimare semicantitativă a cantităţii de component prezent

poate fi obţinută prin compararea ariilor spoturilor cu cea a

standardelor. Date mai exacte pot fi obţinute prin răzuirea

spotului de pe placa cromatografică, urmată de extracţia sa de

pe aceasta după care se recurge la măsurarea printr-o analiză

fizico-chimică convenabilă. A treia metodă este cea care se

realizează prin scanarea cu ajutorul unui densitometru şi care se

pretează la determinări ale radiaţiei emise de spot, prin

fluorescenţă ori prin reflecţie

Cromatografia planară în laboratorul clinic

AMINOACIZI

În laboratoarele clinice, estimarea acizilor

liberi în fluidele biologice şi ţesuturi prin

cromatografiei în strat subţire conduce la

punerea unor diagnostice în maladii

congenitale ale metabolismului

aminoacizilor, cistinuria clasică, cistinuria

heterozigotă, aminoacidopatii, sindrom

Alport,.etc.

ACIZI BILIARI

În scopuri clinice, măsurarea acizilor biliari

din specimene biologice (bilă, ser, conţinut

duodenal şi extracte fecale proaspete)

conduce la punerea unui diagnostic în

cazul unor maladii hepatice şi intestinale

CARBOHIDRAŢIMulte maladii sunt însoţite de intensificarea eliminării unor diverse

zaharuri în probele biologice. Detecţia şi identificarea lor constituie o

etapă importantă în stabilirea diagnosticului.

LIPIDE

profilurile lipidice se modifică în diverse patologii, ceea ce conduce la

interesul crescut în determinarea lor în diagnosticul clinic.

Investigarea lipidelor serice, în special a esterilor de colesterol reprezintă

o valoare mare în diagnosticul unor maladii hepato-funcţionale ori în maladiile

legate de metabolismul lipidic. În maladiile legate de stocarea lipidelor,

acumularea de colesterol se manifestă la nivelul sângelui şi a ţesuturilor. O

hiperlipidemie este corelată cu factorii de risc în maladiile cardiovasculare.

Analiza lipidelor serice este de asemenea importantă în maladiile pielii.

FOSFOLIPIDE

Fosfolipidele sunt lipide polare şi includ fosfogliceridele şi

sfingolipidele. Acestea sunt constituenţi amfipatici ai membranei,

jucând un rol esenţial în sinteza lipoproteinelor plasmatice.

Determinarea fosfolipidelor este deosebit de importantă în

biomedicină. Fosfolipidele de suprafaţă au o influenţă importantă în

comportamentul mecanic al plămânilor. Studiile clinice la sarcinilor de

risc crescut apelează deseori la determinarea satusului de maturitate a

plămânului fetal. Măsurarea fosfolipidelor din fluidul amniotic precum a

raportului lecitină/sfingomielină se realizează prin analize de

cromatografie pe strat subţire, predicţionând astfel maturitatea

plămânului fetal.

PORFIRINE

Porfirinele sunt derivaţi tetrapirolici cu o structură porfinică,

fiind intermediari chimici în sinteza hemoglobinei, mioglobinei ori

a altor pigmenţi respiratori, precum citocromii. Detecţia şi

identificarea porfirinelor şi ai precursorilor acestora în probele

biologice sunt de o importanţă terapeutică uriaşă. Ele sunt

analizate în chimia clinică în scopul diagnosticării unui grup de

maladii denumite porfirinemii, rezultate ale alterării biosintezei

hemului. Acumularea şi supraproducţia a acestor produşi

intermediari în ţesuturi, sânge, urină ori în fecale indică blocarea

metabolică în sinteza hemului. Aceste maladii sunt asociate cu

manifestări acute şi/sau cutanate.

PROSTAGLANDINE

Prostaglandine reprezintă una dintre cele mai biologic active

familii de compuşi. Ele sunt acizi graşi C20 nesaturaţi cu un inel

ciclopentan. Derivaţii care conţin această structură

(prostaglandine, prostacicline şi tromboxani) sunt cunoscuţi sub

denumirea comună de prostanoizi. Prostaglandine se manifestă

la concentraţii de ordinul nanogramelor până la cel al

picogramelor, în ţesutul uman şi în fluidele corporale. Ele au

diverse acţiuni biologice iar rolul lor fiziologic complet nu este încă

bine cunoscut.

HORMONI STEROIZI

Hormonii steroizi joacă un rol vital în organismul uman, fiind

definiţi prin funcţia lor biologică. Nivelurile hormonilor steroizi

activi ser şi produşii lor de eliminare din urină sunt de mare

semnificaţie clinică. Hormonii glucocorticoizi contribuie la

activitatea adipogenică în serul uman. Maladia Addisons este

cauzată de deficienţă glucocorticoidică în timp ce în sindromul

Cushings se constată o secreţie masivă. Concentraţiile de

steroizi estrogenici din urina umană sunt importante în timpul

sarcinii.. Progesterona este de asemenea implicată în

pregătirea şi menţinerea sarcinii. Niveluri crescute ale pregnan-

3α, 20α-diol şi allopregnan-3α, 20α-diol urinare au fost

observate în sarcinile timpurii. Creşterea 6β-hidroxicortizolului

urinar este observată în timpul sarcinii ori în cazuri de

hiperadrenocorticism. Aldosterona urinară este analizată în

scopul identificării pacienţilor suferinzi de hiperaldosteronism.

Excreţia urinară de metaboliţi andro- şi glucocorticoizi este

studiată la pacienţi suferinzi de cancer gastric în timp ce

excreţia de dehidroepiandresteronă, şi în particular

eticolanolonă reprezintă un marker în cancerul de sân.

ALŢI COMPUŞI DE INTERES CLINIC

Gangliozidele reprezintă un grup variat de glicosfingolipide compuse dintr-o catenă

lungă de bază şi acid gras, care împreună formează partea ceramidică (N-

acilsfingozina). Aceasta este legată de un carbohidrat. Gangliozidele sunt caracterizate

de prezenţa uneia sau mai multor unităţi de acid sialic în catena oligozaharidică.

Compuşii de bază sunt acidul N-acetilneuraminic (Neu5Ac) şi acidul N-glicolilneuraminic

(Neu5Gc), despre care se cunoaşte că joacă roluri cruciale în diverse funcţii biologice.

Gangliozidele sunt localizate pe partea externă a membranei plasmatice, reprezentând

un mic procent din lipidele totale. Ele au fost de asemenea identificate în asociere cu

organitele celulare. Gangliozidele au un rol important în recunoaşterea celulă-celulă,

adeziune celulară, modularea proliferării şi difernţierii celulare, fiind expresate la niveluri

înalte pe suprafaţa celulelor umane, cel mai adesea în ţesuturile nervoase.

STUDII DE BIODISPONIBILITATE

Există o experienţă deosebită în utilizarea cromatografiei pe stat subţire în analiza

medicamentelor ori a drogurilor din probe biologice din medicină, toxicologie, farmacologie,

medicină legală, etc. Analizele de medicamente ori droguri se realizează în probe biologice diverse:

sânge, urină, salivă, conţinut gastric, ţesuturi, etc. iar tipul şi cantitatea de probă luată în analiză

este funcţie de substanţa care se doreşte a fi determinată. De exemplu, în screening-ul abuzului de

medicamente se utilizează urina deoarece modalitatea de achiziţie a specimenului este non-

invazivă iar cele mai multe medicamente pot fi detectate chiar după o durată rezonabilă de timp de

la ingestie.

Analiza drogurilor în laboratoare clinice se realizează prin numeroase tehnici precum

imunoanaliza, metode cromatografice ori de spectrometrie de masă; alegerea optimă de analiză

depinde de cost, efort uman ori tipul de medicament. Dintre tehnicile cromatografice, cromatografia

pe strat subţire cu suport de silicagel este deosebit de utilizată în cazul programelor de screening

pentru medicamente. Toate probele care se analizează, sunt supuse unei trepte de pre-purificare,

înaintea trimiterii lor la analizele cromatografice. S-a dezvoltat o metodă computerizată de

identificare a post cromatografică a tipurilor de compuşi, procesul fiind utilizat la studiile de

screening a unor noi medicamente. Programul computerizat prelucrează datele cromatografice

obţinute experimental cu cele obţinute pentru medicamente ori droguri cunoscute ori a metaboliţilor

acestora regăsiţi în ser, urină, ori alte specimene.

Cromatografia pe strat subţire rămâne cea mai utilizată tehnică în studiile de

toxicologie şi în programele de screening de abuz de drog/medicament.

Sistemele de eluţie recomandate sunt: acetat de etil/metanol/hidroxid de

amoniu pentru opioizi şi droguri de bază, cloroform/acetonă pentru

barbiturice şi alte droguri acide, heptan/eter etilic/acid acetic şi

cloroform/metanol/hidroxid de amoniu pentru canabinoizi.

APLICAŢII MODERNE ALE CROMATOGRAFIEI PLANARE

Cromatografia pe strat subţire reprezintă metoda cea mai utilizată

metodă de detecţie, separare şi monitorizare a fosfolipidelor şi a

glicosfingolipidelor precum şi a unor compuşi de sinteză ori a unor metaboliţi

ai acestora. În particular, procedeul cromatografic pe strat subţire acoperit

cu anticorpi monoclonali a contribuit la dezvoltarea analizelor structurale a

glicosfingolipidelor. Există o serie de dificultăţi în extracţia lipidelor prin

utilizarea suporturilor cromatografice pe strat subţire de performanţă înaltă

deoarece contaminarea silicagelului şi datorită scurgerii stratului subţire de

silicagel în timpul tratamentului. Dacă glicosfingolipidele sunt transferate de

pe placa HPTLC pe o membrană de plastic cu proprietăţi hidrofobe, această

dificultate este surmontată.

Folosind avantajul unei bune separări a lipidelor pe un suport HPTLC şi

de imobilizare a acestora pe o membrană s-a dovedit că transferul optim se

realizează pe membrane de difluorură de poliviniliden (PVDF), comparativ

cu membranele de nitroceluloză, utilizate iniţial care s-au dovedit a avea o

eficienţă de transfer scăzută, fără reproductibilitate. Membranele de PVDF

sunt foarte stabile la încălzire şi la diferiţi solvenţi organici iar în plus reţin

lipidele cu o eficienţă deosebită.

Reprezentarea schematică a metodei de transfer

de pe suportul cromatografic pe o membrană

sintetică, TLC blotting

Această metodă a fost de numită tehnica de transfer de pe suportul

cromatografic, pe membrane sintetice, TLC blotting. Procedeul este

utilizat în studiul complexelor lipidice şi este aplicabil în cercetarea

biochimică a lipidelor. Printre utilizările procedeului amintim:

Purificări de laborator a complexelor lipidice;

Analize de spectrometrie de masă a complexelor lipidice, pe

membrane PVDF;

Analize de legare a microorganismelor pe membrane cu un lipid

imobilizat;

STUDIUL INTERACŢIILOR LIPID–PROTEINĂ PE MEMBRANE, CU UN LIPID

IMOBILIZAT.

IMUNOCOLORAREA MEMBRANELOR DE DIFLUORURĂ DE POLIVINILIDEN.

Antigenii lipidici pot fi imunocoloraţi, direct pe membrană. După transfer,

membranele de difluorură de poliviniliden sunt imersate într-o soluţie de albumină

serică bovină pentru a bloca legarea nespacifică a proteinelor după care se

incubează peste noapte în soluţia anticorpului primar. Legarea primului anticorp la

antigenul lipidic se detectează prin reacţia cu un al doilea anticorp (de obicei IgM

anti-şoarece) ce este cuplat cu peroxidază. Tratamentul cu substrat al acestei

enzime conduce la produşi coloraţi care se vor evidenţia specific la locul de legare

al primului anticorp. Limita inferioară de detecţie pe membrane de PVDF este de

aproximativ 1/5 din antigen, din cea de detectare pe placa cromatografică ceea ce

indică faptul că glicosfingolipidul este concentrat numai pe o parte a membranei

alături de faptul că nu se manifestă nici un fenomen de natură chimică în timpul

procesului de transfer.

TLC BLOTTING ÎN PURIFICAREA COMPLEXELOR LIPIDIC

A fost dezvoltată o tehnică de purificare a glicosfingolipidelor şi a

fosfolipidelor, care utilizează tehnica de TLC blotting de pe plăcile de

cromatografie pe strat subţire de performanţă înaltă. Astfel, glicosfingopidele

sau fosfolipidele separate pe plăci HPTLC sunt evidenţiate cu un reactiv pe

bază de primuline (C21H14N3NaO3S3, alte denumiri comerciale Direct Yellow 59,

Primuline Yellow, etc.) care permite detecţia cu mare sensibilitate a

componentelor lipidice (figura de mai jos.). Primulinele sunt derivaţi de

dehidrotiotoluidină, formaţi printr-o reacţie de fuziune cu para toluidină şi sulf, la

temperatură înaltă.

ANALIZE TLC BLOTTING/SPECTROMETRIE DE MASĂ

ANALIZE DE LEGARE A MICROORGANISMELOR PE MEMBRANE CU LIPID

IMOBILIZAT

STUDII ALE INTERACŢIEI LIPID-PROTEINĂ PE MEMBRANE, CU LIPID

IMOBILIZAT

Gel-filtrarea pe strat subţire

Caracterizarea structurală a părţii carbohidrat a unei glicoproteine implică

determinarea a mărimii unităţii zacharidice. Acest parameteru este uzual calculat din

compoziţia şi masa moleculară a glicopeptidelor care sunt obţinute după degradarea

proteolitică a glicoproteinei intacte. Masa moleculară este în mod obişnuit estimată prin

metode precum echilibrul de sedimentare prin ultracentrifugare şi cromatografia de gel

filtrare.

Tehnica de gel filtrare pe strat subţire a devenit o alternativă atractibilă de

determinare a maselor moleculare a glicopeptidelor datorită vitezei, adaptabilităţii la

cantităţi mici de probă, marii puteri de rezoolvare, posibilităţii de utilizare a unor solvenţi

denaturanţi, şi a utilizării unei aparaturi ieftine. Această tehnică a fost dezvoltată pentru

estimarea masei moleculare a unor proteine (> 12.000 daltoni) utilizând solvenţi

nedenaturanţi ori denaturanţi.

CROMATOGRAFIA CU FAZĂ INVERSĂ PE COLOANĂ A PROTEINELOR

Cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă reprezintă o tehnică bine stabilită de izolare,

analiză şi de elucidare a structurii peptidelor şi proteinelor. Utilizarea sa în izolarea unei proteine ori

de purificare a prezentat un maximum de interes în purificarea unor proteine până în momentul

dezvoltării unor suporturi de cromatografie de schimb ionic ori de interacţie hidrofobă de înaltă

eficienţă, care în momentul de faţă sunt apte a realiza nivele de rezoluţie echivalente cu cele

obţinute prin cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă, fără a prezenta riscul de denaturare

a probei şi astfel de pierdere a activităţii biologice. Cu toate acestea există o multitudine de aplicaţii

în care denaturarea poate fi neglijată ori pot fi tolerate concentraţii crescute de modificator organic

(este cazul analizelor de puritate, studii structurale ori purificări micropreparative înaintea

microsecvenţierii). Tehnica este deseori utilizată în biotehnologie în monitorizarea unor procese,

studii de puritate sau de determinări ale stabilităţii.

Aplicarea unui gradient de solvent este în mare superioară eluţiei izocratice deoarece se

realizează într-un cadru de timp rezonabil iar împrăştierea peak-ului este redusă, ceea ce creşte

sensibilitatea metodei. În eluţia în gradient în cazul cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază

inversă, proteinele sunt reţinute esenţial pe baza caracterului lor hidrofob. Mecanismul de retenţie

poate fi considerat atât un fenomen de adsorbţie a solutului la suprafaţa fazei staţionare hidrofobe

cât şi un proces de partiţie între faza mobilă şi cea staţionă.

În primul caz, retenţia este legată de suprafaţa totală interfacială a suportului împachetat de

fază inversă, fiind exprimat prin coeficientul de adsorbţie, KA. Retenţia se bazează pe asocierea

hidrofobă între solut şi liganzii hidrofobi de pe suprafaţă. Prin creşterea tăriei solventului a fazei

mobile, forţele de atracţie sunt din ce în ce mai reduse proces ce conduce la eluţia solutului.

Procesul poate fi privit ca fiind condus în mod entropic şi endotermic, de exemplu, atât ΔS cât şi ΔH

sunt pozitive. Prin relaţia dintre factorul de capacitate a solutului k‟ şi proprietăţile fazelor mobilă şi

staţionară, teoria solvofobică permite predicţia efectulului modificatorului organic a fazei mobile,

tăria ionică, reactivul de împerechere a ionului, tipul de ligand al suportului împachetat precum şi

alte variabile ce implică retenţia cromatografică a proteinelor.

În al doilea caz se consideră o partiţionare a solutului între fazele mobilă şi staţionară, ultima

fiind văzută ca o fază încărcată hidrofob. Acest sistem se aseamănă cu un sistem bifazic n-

octanol/apă a cărui selectivitate este exprimată prin coeficintul de partiţie P a solutului. În esenţă,

procesul efectiv este în mare parte dependent de organizarea moleculară a catenei n-alchil a

catenei legate în structura suportului de fază inversă în stare solvatată, de mărimea şi conformaţia

solutului.

Principiul separării în cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază

inversă

Retenţia proteinei în cazul cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă

este guvernată în principal de suprafaţa proteinei şi nu de chimia suprafeţei

suport. Deşi o serie de proteine prezintă o pierdere a activităţii în timpul

cromatografiei de înaltă rezoluţie cu fază inversă, altele îşi menţin total

activitatea biologică. Astfel, forţele hidrofobe necesare legării de faza inversă

competiţionează cu cele necesare menţinerii structurii secundare şi terţiare a

proteinei. Prin constrângeri sterice, hidrofobe şi ionice aceste proprietăţi

structurale definesc o suprafaţă cromatografică sau o „amprentă” a proteinei

care la rândul ei defineşte legarea de faza inversă. Acest concept al ataşării

multipunctuale a proteinei la suprafeţele de adsorbent este consecventă cu o

amprentă cromatografică relativ mare pentru o proteină comparativ cu cea a unei

molecule mici.

Componentul organic al fazei mobile

Cei mai populari solvenţi organici sunt acetonitrilul, 1-propanolul şi 2-propanolul (alcoolul

izopropilic). Propanolii sunt mult mai vâscoși decât acetonitrilul, ceea ce conduce la o mai mare

presiune pe coloană însă acest fenomen nu este important în condiţiile în care se utilizează viteze

de curgere mici şi coloane cromatografice scurte. Concentraţia de acetonitril necesară eluţiei unei

proteine este considerabil mai mare decât concentraţia echivalentă de 2-propanol, aproximativ

jumătate faţă de primul solvent. S-a evidenţiat de asemenea că acetonitrilul este în mod intrinsec

mult mai denaturant decât alcoolii, procesul de recuperare fiind deseori mai mare când se utilizează

faze mobile care conţin propanol, în special în cazul în care se separă o serie de proteine precum

ovalbumina. Acetonitrilul şi 2-propanolul pot fi îngheţaţi în amestecuri gheaţă carbonică/amestecuri

de alcooli şi astfel proba poate fi liofilizată. Toţi solvenţii trebuie să fie de cea mai înaltă caltate

posibilă.

Aditivi minori la faza mobilă

Componenţii minori cei mai utilizaţi în cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă sunt

acizii perfluoroalcanoic (acid trifluoroacetic - TFA şi acidul heptafluorobutiric, de exemplu). Aceştia

par a disocia - solubiliza proteinele în majoritatea solvenţilor organici utilizaţi în mod curent. TFA

este preferat în comparaţie cu alţi acizi disociatori deoarece este complet volatil şi nu va coroda

coloana de oţel. TFA acţionează de asemenea ca un agent de împerechere de ioni, slab hidrofob.

Cele mai multe coloane utilizate în cromatografia de înaltă rezoluţie cu fază inversă sunt pe bază

de silice şi pe lângă supresia ionizării silanolului în condiţii acide (şi în consecinţă eliminarea

interacţiilor ionice) ele sunt mult mai stabile la valori scăzute de pH. Totuşi, trebuie avut în vedere

că multe polipeptide îşi vor pierde structura terţiară la aceste pH-uri.

Cromatografia cu fază inversă oferă două capabilităţi importante în purificarea şi izolarea unor

proteine sau peptide pentru analizele de proteomică, după cum urmează:

• Înaltă rezoluţie.

• Compatibilitate cu spectroscopia de masă.

Proteinele şi peptidele ce diferă printrun singur rest de aminoacid pot fi deseori separate prin

cromatografie de înaltă performanţă cu fază inversă (RP-HPLC), după cum se observă în figura de

mai jos.

Literatura ştiinţifică conţine multe exemple de separare a unor polipetide similare precum

separarea factorului insulin-like de creştere ce diferă printr-o metionină oxidată de analogul

neoxidat ori a interleukin-2 muteinelor ce diferă printr-o substituţie la un singur aminoacid. În alt

caz, s-au separat variante de insulină care posedă uşoare diferenţe în secvenţa de aminoacizi.

Separarea variantelor de insulină (în ordinea

de eluţie: pui, bovină, ovină, de iepure, de om,

porcină, de şobolan tip I şi de şobolan tip II).

Insulina de iepure conţine o reonină, iar cea

de om o serină, o diferenţă de o grupare metil

într-o proteină de 5300 daltoni. Condiţii de

separare prin RP-HPLC: coloană C4, separare

în gradient de acetonitril cuprins între 27% şi

30% acetonilitril in H2O, în prezenţa a 0,1%

TFA, viteză de curgere 1,5 ml/min.

Mecanismul separării polipeptidelor prin cromatografie cu fază inversă

Cromatografia cu fază inversă separă polipeptide printr-un mecanism de adsorbţie,

cu toate că în cazul moleculelor mici, acestea sunt separate printr-un mecanism de

echilibru care distribuie moleculele între fazele staţionară şi mobilă în timpul trecerii

lor prin coloană, în timp ce polipeptidele mici fiind prea mari pentru a pătrunde în

faza staţionară hidrofobă, sunt adsorbite de suprafaţă şi desorbite odată cu

creşterea concentraţiilor de fază mobilă (figura de mai jos).

Mecanismul retenţiei de proteine prin RPC. Proteinele pătrund în coloană şi sunt adsorbite la

suprafaţa hidrofobă. Datorită mărimii lor, numai o porţiune a acestor proteine „braţul

hidrofob” se leagă la adsorbent. La adăugarea unor concentraţii precise de solvent organic

proteinele sunt eliberate şi părăsesc suprafaţa coborând de-a lungul colonei.

În momentul injectării pe coloană, polipeptidele se leagă la suprafaţa

adsorbentului şi se desorb numai când solventul organic atinge o concentraţie

specifică şi unică. Odată desorbite, ele vor interacţiona foarte slab cu suprafaţa

adsorbentului fiind astfel eluate le-a lungul coloanei. Polipeptidele pot fi

imaginate ca o „aluviune” pe faza staţionară, cu cea mai mare parte a moleculei

expusă la faza mobilă şi numai o parte a moleculei, denumită picior hidrofob, în

contact cu suprafaţa de fază inversă.

Diferenţele în „braţul hidrofob” al polipeptidelor rezultă din secvenţa de

amioacizi şi din diferenţele de conformaţie (fenomen discutat în cazul

hidrofobicităţii proteinelor). Desorbţia are loc într-o fereastră îngustă de

concentraţie al unui modificator organic. Astfel, retenţia polipeptidelor este

completă până la atingerea unei concentraţii critice de modificator organic când

acestea sunt rapid desorbite. Sensibilitatea desorbţiei unui polipeptid la o

concentraţie precisă de modificator organic conduce la selectivitatea RPC în

separarea polipeptidelor, în peak-uri în general înguste. Peptidele mici se

desorb mai rapid odată cu schimbarea concentraţiei de modificator organic

decât moleculele mici, totuşi, ele se desorb mai gradual decît proteinele ceea

ce sugerează un mecanism hibrid de separare.

CROMATOGRAFIA CU PERECHI DE IONI

Cromatografia cu perechi de ioni este un tip de cromatografie de fază inversă

utilizată la separarea şi determinarea unor specii ionice. Faza mobilă în cromatografia

cu perechi de ioni este constituită din tampoane apoase care conţin un solvent

organic precum metanolul ori acetonitrilul şi un compus ionic care conţine un

contraion cu sarcină opusă analitului. Contraionul este un ion care se combină cu ionii

analitului pentru a forma o pereche de ioni, neutră, specie care se reţine pe un suport

de fază inversă.

Proba Faza mobilă ContraionTipul fazei

staţionare

Amine HClO4, 0,1 M /H2O/acetonitril

H2O/CH3OH/H2SO4

CIO4-

C12H25SO3-

FLa

FL

Acizi carboxilici pH 7,4

pH 7,4

(C4H9)4N+

(C4H9)4N+

FL

Lb

Acizi sulfonici H20/C3H7OH

pH 7,4

pH 3,8

(C16H33)(CH3)3N+

(C4H9)4N+

Bis-(2-etilhexil)fosfat

FL

Lb

Lc

Coloranţi pH 2-4;H20/CH3OH (C4H9)4N+ FL

Sisteme cromatografice cu fază inversă pentru perechi de ioni.

CROMATOGRAFIA DE ADSORBȚIE

Cromatografia de adsorbţie, ori cromatografia lichid-solid, reprezintă forma clasică a

cromatografiei lichide, care a fost introdusă, pentru prima dată, de către Tswett, la începutul

secolului douăzeci. În ultimii ani ea a fost adaptată, devenind o metodă importantă în cromatografia

lichidă de înaltă presiune (HPLC).

În cromatografia de adsorbţie compuşii ce se doresc separaţi sunt adsorbiţi pe suprafaţa unui

material solid, fiind apoi desorbiţi din solidul adsorbent prin eluţie cu un solvent. Separarea

compuşilor depinde de balanţa relativă dintre afinitatea compuşilor pentru adsorbent şi solubilitatea

lor în solventul utilizat. Afinităţile relative ale compuşilor ce se doresc separaţi sunt funcţie de natura

chimică a substanţei, de natura solventului şi de natura adsorbentului. Studiile de cromatografie au

arătat că adsorbenţii cei mai utilizaţi sunt silicagelul, cărbunele, celuloza, amidonul, gelurile de

fosfat de calciu, hidroxilapatita şi sucroza. Cei mai utilizaţi solvenţi sunt: hexanul, benzenul, eterul

de petrol, eterul etilic, cloroformul, clorura de metilen, diverşi alcooli (alcoolii etilic, propilic, n-butilic

şi t-butilic), diverse tampoane apoase ori soluţii de săruri, unele în combinaţii cu solvenţi organici.

Cromatografia de adsorbţie: A = adsorbent, S = probă,

ES = solvent de eluţie. (1) aplicarea probei la capătul

superior al coloane cromatografice; (2) adsorbţia

probei pe suportul adsorbent. (3) adăugarea de solvent

de eluţie;. (4) şi (5) fracţionarea parţială a

componentelor 2 si 3; (6) fracţionarea completă a

probei; (7) şi (8) Separarea tuturor celor trei

componente la diverse stadii de eluţie; (9) eluţia

primului component de pe coloană.

Adsorbenţii solizi utilizaţi în mod obişnuit sunt alumina, silicagelul, cărbunele,

celuloza, amidonul, gelurile de fosfat de calciu, hidroxilapatita şi sucroza. În

cromatografia modernă fazelele staţionare cel mai mult utilizate în sunt silicea şi

alumina, ultima dintre acestea fiind cea mai preferată în cele mai multe aplicaţii

datorită capacităţii sale înalte de încărcare cu probă şi datorită domeniului larg de

forme utilizabile. Solvenţii obişnuit utilizaţi sunt: hexanul, benzenul, eterul de

petrol, dietil eterul, cloroformul, clorura de metilen, diverşi alcooli (etil, propil, n-

butil şi t-butil alcooli), alături de diferite tampoane apoase şi săruri, unele în

combinaţie cu solvenţii organici.

Cu puţine excepţii, caracteristicile de adsorpţie a două substanţe se pot

compara, ordinea timpilor de retenţie fiind: olefine < hidrocarburi aromatice <

halide, sulfuri <eteri < nitro-compuşi < esteri ≈ aldehide ≈ cetone < alcooli ≈ amine

< sulfone < suloxizi <amide <acizi carboxilici (suprafeţele de silice şi alumină sunt

înalt polare, eluţiile efectuându-se în mod obişnuit cu faze mobile oarecum mai

puţin polare. Astfel, o serie de cercetători tratează cromatografia de adsorpţie

drept un tip de cromatografie de fază normală.

APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI DE ADSORBŢIE

Tehnica cromatografie de adsorbţie este cea mai fezabilă pentru compuşi nepolari

care posedă mase moleculare mai mici de 5000.

Cu toate că există o suprapunere între cromatografia de adsorbţie şi cea de

partiţie, metodele tind a fi complementare.

O aplicaţie caracteristică a

cromatografiei de adsorbţie în

separarea cis- şi trans-pirazolinelor.

Coloană: 100 x 0.3 cm, suport silice

peliculară. Fază mobilă: clorură de

metilen/izooctan 50%. Temperatura:

ambiantă. Viteză de curgere: 0,225

mL/min. Detector: UV, 254 nm.

CROMATOGRAFIA PE HIDROXIAPATITĂ

O condiţie necesară în oricare strategie de purificare a proteinelor o reprezintă

combinarea tehnicilor care exploatează diferite principii de separare în

scopul atingerii purificării celei mai înalte utilizând un număr cât mai redus

de trepte de purificare. În general, combinări ale unor tehnici precum

cromatografia de schimb ionic, cromatografia de interacţie hidrofobă, cromatografia

de afinitate, cromatografia de afinitate cu metal chelat, cromatografia de excluziune

moleculară şi cromatografia de fază inversă oferă cele mai versatile abordări în

design-ul unui protocol de purificare a proteinelor. Aceasta este datorată faptului că

metodele de separare au la bază principii bine caracterizate şi predictibile. Pentru o

multitudine de raţiuni, cromatografia pe hidroxilapatită (HAP) a căpătat numai o

popularitate marginală ca metodă de purificare a proteinelor. Ea prezintă

comportament cromatografic nepredictibil, o capacitate relativă mică de încărcare a

probei şi proprietăţi de manipulare relativ dificile. Pentru aceste raţiuni, HAP este

deseori considerată drept ultima alegere in metodologia de separare a proteinelor.

Pe de altă parte, cum procesele de adsorbţie-desorbţie a proteinelor diferă

semnificativ de alte tehnici precum de exemplu cromatografia de schimb ionic,

uneori este posibil de a obţine fracţionări a căror calitate nu poate fi realizată prin

alte tehnici cromatografice, unde deseori tehnicile cromatografice convenţionale pot

fi de nefolosit.

Fosfatul de calciu a fost deseori utilizat în purificarea proteinelor şi a enzimelor cu succese

diferite încă de la începutul cercetării ştiinţifice în domeniu, de către Brucke (1861) în purificarea

pepsinei. În anul 1956, Tiselius şi colaboratorii (1956) au arătat că un suport cromatografic mai

adsorbent de proteine este realizat prin conversia brushitei, Ca3(PO4)2, la hidroxiapatită,

Ca5(PO4)3OH, (Ca10(PO4)6(OH)2) prin fierbere într-o soluţie de NaOH 1% timp de 1 oră. În

continuare, cristalele fine de hidroxiapatită pot fi separate prin decantare înainte de

împachetarea coloanei. Hidroxiapatita leagă mai puternic proteinele native, dar capacitatea de

retenţie scade semnificativ în cazul proteinelor supuse procesului de denaturare. Retenţia

proteinelor pe suportul de hidroxiapatită nu este uşor predictibil, precizabil. Deşi hidroxiapatita

leagă atât proteine acide cât şi pe cele bazice nu se poate vorbi de un mecanism simplu

de cromatografie prin schimb ionic în comportamentul cromatografic observat. Structura

de suprafaţă a cristalelor de hidroxiapatită este reprezentată de un mozaic de situsuri de

adsorbţie pozitive (ionii de calciu) şi negative (ionii fosfat). Adsorbţia unor componenţi

anionic se realizează la domeniul de sarcini pozitive reprezentat de ionii de calciu (situs C), în

timp ce domeniile de sarcini negative ce cuprind ionii fosfat (situsurile P) pot fi considerate drept

schimbătoare de cationi. Se poate considera astfel HAP drept o tehnică cromatografică de

"pseudo-afinitate" sau drept o metodă de cromatografie de schimb ionic de tip "mixt". La valori de

pH neutre şi alcaline, suprafaţa de hidroxiapatită este încărcată negativ datorită grupărilor fosfat.

MECANISMUL LEGĂRII PROTEINELOR LA HIDROXIAPATITĂ

Mecanismul legării proteinelor la hidroxiapatită şi de eluţie de pe aceasta a fost

explicitat de către Gorbunoff. El se manifestă prin:

(1) complexarea specifică a grupărilor carboxil proteice cu locii de calciu ale cristalelor

de hidroxiapatită (de exemplu complexe, [HACa-OOC - proteină]) şi prin

(2) atracţia nespecifică dintre grupările amino încărcate pozitiv ale proteinelor şi

sarcinile negative ale hidroxiapatitei (complexe de tipul [HAPO3---H3+N-proteină]).

Astfel, suprafaţa cristalelor de hidroxiapatită prezintă un mozaic de situsuri pozitive (de

calciu) şi negative (de fosfat), suprafaţa coloanei de hidroxiapatită poate fi văzută ca

negativă la un pH egal cu 6.8, la care coloanele de HAP se manipulează în general,

datorită neutralizării parţiale a locilor pozitivi de calciu de către ionii fosfat (figura de mai

jos).

Legarea proteinei la hidroxiapatită. A reprezintă o

proteină bazică în timp ce B este o proteină acidă.

Parantezele duble indicată fenomenul de repulsie în

timp ce liniile punctate sunt legăturile ionice. Săgeata

triunghiulară indică legăturile coordinati

În general, HAP este realizată prin eluţie în gradient linear (deseori creat în

domeniul 10 până la 400 mM) tampon fosfat, la un de pH 6,8, alcătuit din

amestecuri echimoleculare de fosfaţi sodiu ori potasiu mono şi dibazici.

Deoarece hidroxiapatita este stabilă numai la valori ale pH-ului mai mari de 5,

tampoanele de eluţie cu pH acid nu trebuiesc să fie utilizate.

În aceste condiţii, eluţia de pe coloană poate fi afectată atât ca rezultat

al interacţiilor nespecifice ionice de (de tipul Debye-Huckel) ori ca rezultat

al dezlocuirii specifice ale grupărilor proteice de pe situsul C al

hidroxiapatitei cu care au fost complexate. Din aceste consideraţii rezultă

că:

Proteinele bazice pot fi eluate de pe mediile de hidroxiapatită cu soluţii

cu molarităţi foarte scăzute (de exemplu 0,005M) de săruri de Ca2+ şi de

Mg2+,

Proteinele cu valori ale pI cuprinse între 5 şi 8, cu soluţii de MgCl2 1,0

M, şi,

Proteinele acide cu soluţii fosfat 0,3 M.

APLICAŢII ALE CROMATOGRAFIEI PE HIDROXIAPATITĂ

În tehnicile de cromatografie pe hidroxiapatită, coloana este de obicei echilibrată, în timp ce

proba este aplicată la o concentraţie mică de tampon fosfat la un pH de 6,8. Proba de pe coloană

este apoi developată cu un gradient de concentraţie de tampon fosfat. În funcţie de aplicaţie, în

unele cazuri, un foarte îngust gradient (de exemplu între 0,02 la 0,05 M fosfat) conduce la rezultate

excelente, în timp ce în alte situaţii este necesar un gradient mare, cuprins de exemplu între 0,02 şi

0,35 M fosfat pentru a separare optimă. Figura următoare. ilustrează tehnica de purificare a

ovomucoidului comercial prin cromatografie pe coloană de HAP.

Purificarea ovomucoidului

comercial pe o coloană de

hidroxiapatită. Treapta I conţine

material inactiv cu un maximum de

absorbţie la 260 nm; pe parcursul

treptei a II a se separă ovomucoidul

în formă activă; volumul III conţine

lizozim; ulima treaptă - IV conduce

la separarea unor impurităţi, de

tipul tripsinei şi chimotripsinei.

Ovomucoidul comercial conţine o multitudine de impurităţi precum

lizozim, ovoinhibitor, conalbumină şi ovalbumină. Profilul cromatografic din

figură arată că la aplicarea a două probe de ovomucoid la o coloană de

HAP echilibrată cu 0,001 M NaCl, spălarea coloanei cu NaCl 0,001 M,

urmată de eluţia în trepte cu 0.01 M PO4, pH 6,8 (pentru a elua

ovomucoidul, o glicoproteină cu o structură deschisă), 0;5 M NaCl (pentru a

elua proteinele bazice precum lizozimul şi ovoinhibitororul) şi 0,5 M PO4

(pentru a epuiza coloana de alte proteine acide) conduce la obţinerea

ovomucoidului într-o formă înalt purificată.

ghid de utilizare a HAP în cromatografie

În cazul amestecurilor de proteine în mare parte bazice sau dacă se doreşte reţinerea

proteinelor bazice fără o pierdere a proteinelor acide, coloanele se echilibrează cu fosfat,

0,001 M, pH 6.8.

În scopul separării unor amestecuri de proteine în general acide în special în cazul

glicoproteinelor (sau dacă una din proteinele pe care dorim a se reţine este acidă, în timp ce

este posibilă pierderea unor proteine neutre şi acide, se utilizează coloane echilibrate cu NaCl

(NaCl 0,001 M netamponat).

Se utilizează coloane echilibrate cu MgCl2 sau CaCl2 (MgCl2 0,001 M sau CaCl2netamponate) numai pentru proteinele acide care nu se leagă la coloane echilibrate cu NaCl.

Dacă proba a fost încărcată, coloana trebuie să se spele utilizând acelaşi tampon care a

fost utilizat la echilibrarea coloanei. În general în procedurile de eluţie este necesar a se

urmări separarea proteinelor în ordinea: proteinele bazice se eluează întâi, apoi proteinele

neutre şi în final cele acide.

:

Dacă se urmăreşte purificarea unor proteine individuale se utilizează în general

sistemul de tampon fosfat, la o concentraţie potrivită (cu sau fără prezenţa unei alte

săruri). Deoarece NaCl nu reuşeşte de multe ori să elueze multe proteine neutre ori

acide, este necesar deseori a se crea un gradient de NaCl, de obicei cuprins între 0,01 -

0,5 M NaCl, în cazul purificării proteinelor bazice de pe HAP.

În unele cazuri, deoarece atât NaCl cât şi sulfatul de amoniu nu afectează eluţie

proteinelor neutre sau acide pe HAP, o probă proteică provenită de pe o coloană de

schimb ionic developată cu un gradient de NaCl poate fi încărcată direct pe o coloană

de HAP. În acest context se poate exemplifica purificarea proteazelor din

microorganisme halofile prin cromatografie pe HAP în prezenţa unei soluţii de NaCl de o

concentraţie de 3,4 M. Alte exemple de purificare a proteinelor pe coloană de HAP sunt

reprezentate de izoformele ceruloplasminei umane, anticorpi monoclonali, tubulină,

histone din cromatină, fumarazele citosolice şi mitocondriene din drojdia de bere, etc.

Hidroxiapatita a fost utilizată cu succes în prezenţa detergenţilor neionici (de

exemplu, Triton X-100) pentru purificarea proteinelor membranare precum şi a proteinei

transportoare ADP/ATP, proteinei transportoare a ionului fosfat, a ubiquinol:citocrom c

reductaza ori a citocrom c oxidaza.

CROMATOGRAFIA DE INTERACŢIE HIDROFOBĂ.

Adsorbţia proteinelor prin cromatografie de interacţie hidrofobă (Hydrophobic Interaction

chromatography, HIC) este favorizată de concentraţii înalte de săruri care structurează apa. În mod

echivalent, contribuţia sărurilor a fost aplicată şi altor clase de adsorbenţi amfifilici ce nu sunt

analogi direcţi HIC.

În 1990, Porath a introdus termenul de cromatografia de adsorbţie promovată de condiţiile

saline (salt-promoted adsorption chromatography, SPAC) pentru a regrupa aceste tehnici

cromatografice ce necesită concentraţii înalte de săruri pentru a determina adsorbţia unei proteine.

Cromatografia de adsorbţie tiofilică (thiophilic adsorption chromatog-raphy, TAC),

cromatografia donor–acceptor de electron (electron donor–acceptor chromatography, EDAC) şi

cromatografia de interacţie hidrofobă (HIC) au fost aşadar incluse în această familie. Efectul sării

asupra adsorbţiei proteinei a fost explicat ca fiind rezultatul unor creşteri nefavorabile ale energiei

libere, ΔG, pentru proteinele nelegate în prezenţa unor concentraţii înalte de săruri. Consecinţa

termodinamică a acesteia o reprezintă favorizarea legării proteinei la un ligand din cauza unei arii

de suprafaţă mai mică a complexului expus solventului şi a cosolventului, altfel spus, forma legată a

proteinei este termodinamic mai stabilă. Eluţia proteinei de pe matrice este apoi realizată simplu,

prin suprimarea sării din tamponul de adsorbţie. În HIC, interacţiile hidrofobe se manifestă între

zone hidrofobe aflate pe suprafaţa proteinei şi liganzii hidrofobi, legaţi la suport.

Primele geluri cu aplicaţii practice pentru HIC au prezentat un caracter mixt, hidrofob.

Adsorbenţii neutrii (alchil şi aril eteri) au fost apoi preparaţi, ultimii conducând la introducerea

suporturilor octil- şi fenil- activate, curent utilizate în acest moment.

Porath şi colaboratorii au descoperit adsorbţia tiofilică pe suporturi

mercaptoetanol–divinil sulfon agaroză (geluri T). Mecanismul de adsorbţie a fost

interpretat ca implicând ataşarea proteinei în două puncte, la β-mercaptoetanol şi la

braţul de spaţiere divinlsulfonic, posibil printr-o interacţie electron donor–acceptor tiofilic.

Studii ulterioare au demonstrat caracteristici similare de adsorbţie la geluri activate cu

epiclorhidrină la care s-a cuplat 2-mercaptopiridină. S-a mai arătat că adsorbţia

promovată de condiţiile saline a fost eficientă în favorizarea adsorbţiei proteinelor pe un

gel cyanocarbon substitut, tricyanoaminopropen–divinil hidroxipropilsulfon agaroză

(DVS–TCP gel) prin intermediul unor interacţii electron donor–acceptor.

Toate gelurile sus-menţionate necesită concentraţii mari de săruri structurale de apă

pentru a favoriza legarea proteinelor, cu toate că mecanismele de interacţie sunt diferite:

adsorbţie specifică hidrofobă, interacţie tiofilică, respectiv interacţie electron donor–

acceptor.

Cromatografia de interacţie hidrofobă posedă avantajul că hidrofobicitatea

proteinelor conduce la separarea lor pe baza interacţiilor hidrofobe dintre liganzi

hidrofobi imobilizaţi şi regiunile nepolare de pe suprafaţa proteinelor. Adsorbţia

creşte odată cu creşterea concentraţiei de sare în faza mobilă iar eluţia se

realizează prin scăderea concentraţiei de sare a eluentului. Din acest motiv, se

poate utiliza şi termenul de „adsorbţie dependentă de sare” pentru acest tip de

cromatografie.

Diferitele tipuri de eluţie pot fi utilizate pentru purificarea amestecurilor complexe de proteine

care ar fi dificil de separat utilizând alte tehnici cromatografice. De fapt, HIC a fost utilizată cu

succes în scopuri de separare pe baza existenţei unor caracteristici complementare de legare faţă

de alte tehnici de cromatografiere a proteinelor. Van Oss şi colaboratorii au arătat că forţele van der

Waals sunt factorii majori ce contribuie la interacţiile hidrofobe („forţe interfaciale”) în ciuda

mecanismului complex implicat. Astfel, alterarea structurală a biomoleculelor este minimă şi

activitatea lor biologică este menţinută prin utilizarea HIC, dată interacţiei mai slabe decât

cea regăsită în cazul interacţiei afine, schimbului de ioni sau a cromatografiei de fază

inversă (RPC). HIC reprezintă o cale alternativă de exploatare a proprietăţilor hidrofobe a

proteinelor, realizată într-un mediu mai polar şi mai puţin denaturant decât RPC, după cum această

tehnică necesită utilizarea unor solvenţi nepolari pentru eluţia proteinelor datorită legării puternice la

adsorbent.

Cromatografia de interacţie hidrofobă a fost descrisă pentru prima dată de către Tiselius în

1948, care a notat faptul că o serie de compuşi precum coloranţii pot fi reţinuţi de către hârtia de

filtru în prezenţa unor soluţii de sulfat ori de fosfat, fenomen denumit cu expresia de cromatografie

de extracţie cu ajutorul sărurilor (salting-out chromatography). După cum şi numele o sugerează,

HIC este o tehnică de separare bazată pe interacţiile dintre proteine şi o fază staţionară

insolubilă, nepolară imobilizată. HIC este complementară cromatografiei de schimb ionic şi

cromatografiei de excludere moleculară, iar împreună cu tehnicile de separare mai sus

enumerate reprezintă cele trei mecanisme distincte şi generale de retenţie disponibile unui

biochimist pentru purificarea proteinelor în aplicaţiile proteomice. Cromatografia lichidă de

înaltă performanţă cu fază inversă (RPC) poate fi aplicată serial la fracţiile colectate după HIC şi

cromatografia de schimb ionic pentru purificarea ulterioară sau de îndepărtare a sărurilor.

Cu toate că atât HIC cât şi cromatografia cu fază inversă sunt metode de separare bazate pe

interacţia proteinelor cu grupările hidrofobe ale fazei staţionare sunt bine de cunoscut diferenţele

fundamentale ce există între ele. În HIC, interacţiile slabe hidrofobe dintre proteine şi faza nepolară

staţionară sunt mediate prin concentraţii mari de săruri antichaotrope (Figura de mai jos) în timp

ce în cromatografia de fază inversă (RPC) aceste interacţii sunt mediate prin intermediul

modificatorilor organici.

Reprezentarea schematică a principiului de

separare prin HIC. După cum sărurile neutre conduc la

precipitarea proteinelor, concentraţiile mari de săruri

conduc la apariţia unor interacţii între zonele

hidrofobe de pe suprafaţa proteinelor ceea ce are ca

rezultat precipitarea acestora din soluţiile apoase.

Totuşi, prin creşterea concentraţiei de săruri chiar

până la punctul de precipitare, prin utilizarea unor

concentraţii mai diluate de proteină şi prin expunerea

soluţiei proteice la o matrice slab hidrofobă

imobilizată, proteinele se leagă la matricea de pe

coloană mai uşor decât să precipite. Sub aceste

condiţii proteinele îşi menţin conformaţia nativă (de

exemplu proprietatea biologică). Aceasta este o

consideraţie importantă în condiţiile purificării unor

enzime, eficienţa separării putând fi realizată prin

monitorizarea activităţii lor.

Mai puţin probabil în cazul RPC, unde fazele mobile şi organice au tendinţa

de a deplia (dezmembra, denatura) proteinele, faza staţionară împachetată şi

condiţiile de operare ale HIC sunt alese astfel încât menţin proteinele în

conformaţiile lor native, biologic active. În HIC, liganzii slab hidrofobi (comparativ

cu împachetările din RPC), cum ar fi grupările nepolare cu catenă scurtă fenil ori

octil, sunt ataşate chimic la matrice hidrofile, când se manifestă interacţii distincte

între proteine şi suprafaţa fazei staţionare, prin utilizarea unei faze mobile ce

conţine săruri antichaotrope de tărie ionică mare. Contrar RPC, în cazul HIC sunt

utilizate densităţi scăzute de ligand pe matricea împachetată (deseori o zecime

faţă de suporturile utilizate în RPC).

În decursul ultimilor ani, HIC a fost dezvoltată de către mulţi cercetători iar

astăzi reprezintă o tehnică bine stabilită şi deosebit de utilă în tehnicile de

separare cromatografică din laborator sau în procesele industriale de purificare a

proteinelor. Dezvoltarea unui număr mare de faze staţionare diferite a condus la o

creştere a aplicaţiilor HIC în purificarea unor biomolecule, precum proteine serice,

proteine nucleare, hormoni, proteine recombinante şi enzime.

CROMATOGRAFIA DE ADSORBŢIE TIOFILICĂ

Importanţa atomilor de sulf pentru în cromatografia de adsorbţie prin intermediul

unui ligand a fost recunoscută acum 40 de ani. Adsorbţia aromatică a fost atunci un

fenomen studiat şi s-a descoperit că ea este mediată prin imobilizarea de grupări 2,4-

dinitrofenil în timp ce un efect sinergistic de adsorbţie a fost evidenţiat în condiţiile în

care ligantul a conţinut un atom de sulf în locul unuia de oxigen, aflat în apropierea

inelului aromatic. Aceasta a fost una dintre primele indicaţii că atomul de sulf, ca parte a

ligandului are un efect de adsorbţie a solutului. Tăria acestei interacţii a apărut

dependentă de substituenţii electrofili şi nucleofili ai inelului aromatic; în fapt, s-a dovedit

că adsorbţia are la bază formarea de complexe electron donor–acceptor.

Asocierea dintre sorbenţii tiofili şi separarea imunoglobulinelor s-a realizat odată cu

demonstrarea acestei proprietăţi de către Porath şi colaboratorii (1985) şi a făcut

posibilă fracţionarea proteinelor plasmatice prin cromatografie pe sorbenţi, derivaţi din

agaroză, realizaţi în urma reacţiei dintre divinilsulfonă şi 2-mercaptoetanol. După

aceasta, acest mod de separare a fost deseori aplicat în purificarea anticorpilor

deoarece sorbentul prezintă specificitate clară pentru acest tip de proteine. Această

descoperire a reprezentat o etapă importantă în dezvoltarea metodelor de separare a

anticorpilor implicând, drept liganzi cromatografici, o mare varietate de structuri chimice

care conţin atomi de sulf şi de azot, având diferite nivele de selectivitate.

Structural, cei mai obişnuiţi sorbenţi pentru cromatografia de adsorbţie tiofilică derivă din

aşa-numitul gel B; care conţine liganzi lineari, cu doi atomi de sulf. Aceşti derivaţi au fost găsiţi

destul de buni în legarea selectivă a imunoglobulinelor, în prezenţa unor concentraţii mari de

săruri formatoare de structură a apei, denumite de altfel „săruri liotrope”, de tipul sulfatului de

amoniu sau sulfatului de sodiu. Din punct de vedere al acestei trăsături, cromatografia de

adsorbţie tiofilică se aseamănă cu cromatografia de interacţie hidrofobă: adsorbţia este

favorizată de concentraţii mari de săruri, eluţia realizându-se în condiţiile în care concentraţia lor

este redusă. Totuşi, în cazul cromatografiei de adsorbţie tiofilică nu se pot manifesta asocieri

hidrofobe sau interacţii ionice cu sorbenţii tiofilici deoarece structurile tio-etilsulfonice nu posedă

o hidrofobicitate pronunţată, pe de o parte şi nu conţin sarcini electrice, pe de altă parte.

Cromatografia de adsorbţie tiofilică, descrisă de către Porath, s-a arătat a fi de real folos în

purificarea anticorpilor monoclonali şi în general în fracţionarea proteinelor.

Matricele tiofilice de afinitate sunt cuplate cu ajutorul unor liganzi cu următoarea

structură chimică:

(M)atrice-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-X-Y

unde M reprezintă matricea de agaroză iar X reprezintă S, N ori O, iar Y este un rest

mic, alifatic, sau un heteroatom

Principiul operaţional care stă la baza cromatografiei de adsorbţie tiofilică se

aseamănă cu cel al cromatografiei de interacţie hidrofobă. Astfel, proteinele sunt legate

la tării ionice mari şi eliberate în urma scăderii tăriei ionice. Faţă de matricele tradiţionale

hidrofobe precum fenil-Sepharose sau octil-Sepharose, matricele tiofilice conduc la

randamente înalte de separare cât şi la separări în zone înguste, având drept

caracteristică o afinitate înaltă faţă de imunoglobulinee şi scăzută faţă de

albumine.

Cromatografia de adsorbţie tiofilică este descrisă ca o metodă de purificare a

anticorpilor monoclonali murini din supernatantul unor culturi celulare. În acest caz se

utilizează sulfat de potasiu în concentraţie de 0,5M în tamponul de legare, obţinându-

se imunoglobuline de înaltă puritate. Totuşi datorită concentraţiei tipice scăzute

anticorpilor monoclonali din supernatantul unor culturi celulare, capacitatea matrix-ului

este în consecinţă, de asemenea scăzută. Capacitatea de legare a anticorpilor

monoclonali diluaţi poate fi crescută cu un factor de 10 sau mai mult prin schimbarea

sării liotrope din tamponul de legare, adică prin utilizarea sulfatului de amoniu şi în

acelaşi timp prin creşterea concentraţiei sale până la 1,0-1,2M

Purificarea anticorpilor monoclonali prin cromatografie de adsorbţie tiofilică. Se ilustrarează

legărea, spălarea şi eluţia. Etape: I Legarea la concentraţie mare de (NH4)2SO4, de exemplu,

1,2M (NH4)2SO4 II eluţia la o concentraţie scăzută de (NH4)2SO4, de exemplu 0,8M (eluţia

impurităţilor). III eluţia anticorpului monoclonal purificat realizată cu TRIS/HCI 0,05M, pH 9,0.

CROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic (ion-exchange chromatography, IEC), denumită uneori şi

cromatografie ionică (IC), se referă la metodele moderne şi eficiente de separare şi determinare

a speciilor ionice, pe răşini schimbătoare de ioni. Cromatografia de schimb ionic a fost iniţial

dezvoltată la miljocul anilor „70 când s-a arătat că un amestec de anion ori de cationi poate fi rapid

rezolvat pe coloane de cromatografie ori de înaltă performaţă, împachetate cu un suport alcătuit

dintr-o răşină schimbătoare de ioni, anioni ori cationi. În acel moment, detecţia se realiza în general

prin măsurători conductometrice. Astăzi, sunt disponibile diverse detectoare utilizate în

cromatografia de schimb ionic.

Schimbul ionic este probabil cea mai frecvent utilizată tehnică cromatografică pentru

separarea şi purificarea proteinelor, polipeptidelor, acizilor nucleici, polinucleotidelor, a altor

biomolecule încărcate electric. Raţiuniunea pentru succesul cromatografiei de schimb ionic este

reprezentată de generala sa aplicabilitate, puterea sa matre de rezoluţie şi marii sale capacităţi, a

simplicităţii, reproductibilităţii şi controlabilităţii ei.

Cromatografia de schimb ionic reprezintă o variantă a cromatografiei de adsorbţie în

care adsorbentul solid posedă grupări chimice încărcate electric legate covalent la un

suport solid, inert. Ionii sunt legaţi electrostatic la grupările încărcate electric; aceşti ioni

pot fi schimbaţi cu ionii aflaţi într-o soluţie apoasă. Schimbătorii de ioni sunt cel mai

frecvent utilizaţi în coloane, pentru a separa moleculele funcţie de sarcină; deoarece

moleculele încărcate electric se leagă la schimbătorul de ioni reversibil şi astfel ele pot fi

legate ori eluate prin schimbarea tăriei ionice sau a pH-ului solventului de eluţie.

Două tipuri de schimbători de ioni sunt disponibile: unii care posedă grupări funcţionale legate

chimic, cu sarcini electrice negative denumiţi schimbători cationici şi alţii care posedă grupări

funcţionale cu sarcini electrice pozitive denumiţi schimbători anionici. Sarcinile de pe schimbători

sunt balansate de către contraioni de tipul ionilor clorură în cazul schimbătorilor anionici şi de ioni

metalici în cazul schimbătorilor cationici. Moleculele din soluţie, care vor fi adsorbite pe schimbători

au de asemenea sarcini nete care sunt şi ele balansate de către contraioni. De exemplu, dacă se

analizează un proces de schimb ionic şi se consideră că moleculele din soluţie au sarcini negative

(X-), acestea sunt contrabalansate de ionii de sodiu (Na+). Astfel de molecule încărcate electric

negativ pot fi cromatografiate pe un schimbător anionic (A+), care posedă ioni de clorură drept

contraioni pentru a se neutraliza şi a produce A+Cl-. Când moleculele (Na+X-) din soluţie

interacţionează cu un schimbător de ioni, X- dislocuie ionul clorură, Cl-, de pe schimbător şi se

leagă electrostatic, formându-se A+X-, simultan cu eliberarea ionilor de sodiu. Acest proces de

schimb ionic este ilustrat în figura de mai jos. Un proces similar, dar opus, se va produce pentru

molecule încărcate pozitiv (Y+CI-), care se vor cromatografia pe un suport cu sarcini electrice

negative. Acesta este cazul schimbătorilor cationici (C-Na+), unde schimbătorii cationici vor lega

moleculele încărcate pozitiv din soluţie.

Schema unui proces de schimb ionic:

moleculele (Na+X-) din soluţie

interacţionează cu un schimbător de

ioni, X- dislocuie ionul clorură, Cl-, de pe

schimbător şi se leagă electrostatic,

formându-se A+X-, simultan cu

eliberarea ionilor de sodiu.

ECHILIBRUL DE SCHIMB IONIC

Procesele de schimb ionic se bazează pe un echilibru de schimb dintre ionii din soluţie

şi ionii de acelaşi semn de pe suprafaţa unui suport insolubil, cu masă moleculară mare.

Schimbătorii naturali de ioni precum cleiurile şi zeoliţii au fost recunoscuţi şi utilizaţi de

multă vreme. Răşinile schimbătoare de ioni sintetice au fost produse pentru prima dată

la mijlocul anilor 1930 pentru dedurizarea şi deionizarea apei ori pentru purificarea unor

soluţii. Cele mai comune situsuri active ale unor rășini schimbătoare de cationiţi sunt

grupările sulfonil acide - SO3H+, puternic acidă şi carboxil acid, -COO-H

+, slab acidă.

Schimbătorii anioniţi conţin grupări amino terţiare -N(CH3)3OH-, puternic bazică, ori

grupări amino primare -NH3OH-, slab bazică.

În cazul în care un schimbător de ioni de tipul acid sulfonic este adus în contact cu un solvent

apos care conţine un cation, Mx+, se produce un echilibru de schimb ce poate fi descris prin reacţia:

xRSO-3 H

++ M

x+(RSO

-3) x M

x++ xH

+

solid solutie solutiesolid

unde RSO-3H

+ reprezintă una din multitudinea

de grupări sulfonice ataşate pe o

macromoleculă polimerică.

În mod similar, un schimbător bazic puternic interacţionează cu un anion Ax- după reacţia:

xRN(CH3)OH + Ax-

[RH(CH3)+

3]x Ax-

+ xOH

solid solutiesolutiesolid

Ca un exemplu de aplicare a legii masei la un echilibru de schimb ionic, se consideră pe

coloană are loc o reacţie între un ion monovalent, B+ cu o grupare acid-sulfonică prezentă pe

suportul cromatografic. Din considerente de neutralizare, retenţia iniţială a ionilor B+ se realizează

la capătul superior al coloanei după reacţia:

unde (s) şi (aq) delimitează faptul că sistemul conţine o fază solidă, respectiv apoasă. Eluţia

cu o soluţie diluată de acid clorhidric, de exemplu, modifică echilibrul din ecuaţia 1 în partea

stângă, ceea ce conduce la transferul parţial a ionilor B+ din faza staţionară în faza mobilă. Aceşti

ioni coboară apoi de-a lungul coloanei printr-o serie de transferuri între fazele staţionară şi mobilă.

Constanta de echilibru Kex, pentru reacţia de schimb prezentată în ecuaţia 1 ia forma:

După rearanjare rezultă:

În timpul eluţiei, concentraţia ionilor de hidrogen din faza apoasă este mult mai mare decât

concentraţia ionilor de compus B, monovalent din faza mobilă. Pe lângă aceasta, schimbătorul

posedă un număr enorm de situsuri de schimb ionic comparativ cu numărul de ioni B+ ce pot fi

reţinuţi. Astfel, concentraţia totală a ionilor, [H+]aq şi [RSO-3H

+]s nu este afectată de schimburile din

ecuaţia 1 ce descrie reacţia globală. Pentru acest motiv, în condiţiile în care [RSO-3H

+]s >> [B+]aq

termenii din dreapta ecuaţiei 3 sunt în mod substanţial constanţi şi astfel se poate scrie:

unde K reprezintă constanta ce corespunde

constantei de distribuţie descrisă anterior. Astfel,

toate ecuaţiile descrise în tratarea teoretică din

primul capitol pot fi aplicate cu succes.

unde [RSO3B+]s şi [RSO3H

+]s

reprezintă concentraţiile (strict sub

formă de activităţi) ale ionilor B+ şi H+

în faza solidă.

Se poate nota că Kex din ecuaţia 2 reprezintă afinitatea răşinii pentru ionul B+ comparativ cu un

alt ion (în cazul de faţă, H+). În condiţiile în care Kex este mare, se poate spune că există o

puternică tendinţă a fazei solide de a reţine B+; în cazul în care Kex este mică, efectul este diametral

opus. Prin selecţia unui ion comun de referinţă precum H+, se pot compara experimental rapoartele

de distribuţie pentru diverşi ioni pe un tip dat de răşină schimbătoare de ioni. Experimentele relevă

că ionii polivalenţi sunt mai puternic legaţi decât speciile cu o singură sarcină electrică. Pentru un

număr de sarcini date, totuşi, apar diferenţe care sunt legate de mărimea ionului hidratat precum şi

de alte proprietăţi. Astfel, pentru o răşină schimbătoare de ioni sulfonată, clasică, obişnuită, valorile

Kex scad în ordinea: Tl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+. Pentru cationii divalenţi,

ordinea este: Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+.

În cazul anionilor, Kex pentru o răşină bazică scade în ordinea: SO42-> C2O4- > I- > NO3

- > Br- >

Cl- > HCO2- > CH3COO- > OH- > F-. Această serie este oarecum dependentă de tipul de răşină şi

de condiţiile de reacţie, putând fi considerată numai aproximativă.

Separarea prin cromatografie de schimb ionic depinde de adsorbţia reversibilă a

moleculelor de solut încărcate electric la grupările de semn contrar imobilizate pe

schimbătorul de ioni. Cele mai multe experimente sunt realizate în cinci etape

importante, ilustrate în figura următoare.

Principiul comatografiei de schimb

ionic realizată prin eluţie în gradient de

sare (salin)

Prima etapă o reprezintă echilibrarea în care schimbătorul de ioni este adus în starea de start

în termeni de pH şi tărie ionică, stare ce va permite legarea moleculelor de solut. Grupările

schimbătoare de ioni sunt asociate în acest moment cu contraionii de schimb (uzual anioni ori

cationi simplii, precum ionii clorură sau de sodiu).

Cea de a doua etapă o reprezintă aplicarea şi adsorbţia probei, în care moleculele de solut

care posedă sarcini corespunzătoare, ajung şi dislocuie contraionul, legându-se reversibil la suport.

Substanţele nelegate vor fi eluate de pe schimbător utilizând acelaşi tampon de start.

În etapa a treia, substanţele sunt îndepărtate de pe coloană prin schimbarea condiţiilor de

eluţie nefavorabile pentru legarea ionică a moleculelor de solut.

Această eluţie implică în mod normal creşterea tăriei ionice a tamponului de eluţie sau

schimbarea pH-ului acestuia. În figura de mai sus, desorbţia se realizează prin introducerea unui

gradient crescător de sare, ceea ce conduce la eliberarea moleculelor de solut de pe coloană în

ordinea tăriei legării lor, substanţele cele mai slab legate eluând primele.

Etapele a patra şi a cincea sunt cele de îndepărtare de pe coloană a substanţelor care nu au

fost eluate în condiţiile experimentale anterioare şi de reechilibrare a coloanei pentru un nou proces

de purificare.

Separarea este astfel obţinută datorită diferenţelor

de interacții dintre un schimbător de ion cu molecule cu

densităţi diferite de sarcină şi de distribuţie a acestora pe

suprafaţa lor. Figura alăturată prezintă schematic modul

de legare a unor molecule cu sarcini diferite. Aceste

interacţii pot fi controlate prin variaţia condiţiilor precum

tăria ionică ori a pH-ului. Diferenţele în proprietăţilor

electrice ale compuşilor biologici sunt deseori

considerabile, din această cauză cromatografia de

schimb ionic este capabilă să separe specii cu foarte

mici diferenţe în proprietăţi, de exemplu două proteine

care diferă numai printr-un aminoacid ionizabil, motiv

pentru care această tehnică este deosebit de importantă

în analiza biochimică.

Reprezentarea schematică a diferenţei de legare şi

de eluţie ale unor molecule cu densităţi diferite de

sarcină precum şi de distribuţie a sarcinilor pe

suprafaţa lor.

FACTORUL DE CAPACITATE A L UNUI SCHIMBĂTOR DE IONI

Factorul de capacitate sau de retenţie, k, este o măsură a retenţiei unui component netrebuind

a fi confundat cu capacitatea de încărcare (mg probă/ml) ori cu capacitatea ionică (mmol/ml).

O cromatogramă posibilă pe baza

căreia se poate calcula factorul de

capacitate k, a unui peak

cromatografic. Legendă: V0 = void

volume, VR1 = volumul de eluţie a

peak-ului 1, VR2 = volumul de eluţie a

peak-ului 2, Vt = volumul total, wR1 =

lăţimea peak-ului 1, wR2 = lăţimea

peak-ului 2.

Factorul de capacitate se calculează pentru fiecare peak individual. De exemplu, factorul

de capacitate k pentru peak-ul 1 din figura alăturată este derivat din ecuaţia:

Tehnica de adsorbţie precum cea de cromatografie de schimb ionic oferă factori mari de

capacitate după cum condiţiile experimentale pot fi alese astfel încât să conducă la volume de

retenţie a peak-ului mari în exces a Vt, opus tehnicii de gel filtrare unde capacitatea este limitată

deoarece toate peak-urile trebuiesc eluate cu un volum egal cu (Vt - V0).

Capacitatea unui schimbător de ioni este o măsură cantitativă a abilităţii sale de a

îmbunătăţi schimbul de contraioni, din această cauză fiind un parametru deosebit de important.

Capacitatea poate fi exprimată ca şi capacitate ionică totală, capacitate disponibilă sau capacitate

dinamică.

Capacitatea ionică totală reprezintă numărul de grupări încărcate electric substituite per gram

de schimbător uscat ori per gram de schimbător îmbibat. Capacitatea ionică totală poate fi

măsurată prin titrare cu un acid sau o bază puternică.

Cantitatea totală de proteină care poate fi legată la un schimbător de ioni, în condiţii

experimentale definite, determină capacitatea disponibilă pentru gel. Dacă condiţiile definite includ

şi viteza de curgere la care gelul operează, cantitatea legată se referă la capacitatea dinamică

pentru schimbătorul de ioni. Capacitatea disponibilă şi cea dinamică depind de:

proprietăţile proteinei;

proprietăţile schimbătorului de ioni;

condiţiile experimentale alese;

Proprietăţile proteinei care determină disponibilitatea sau capacitatea sa dinamică pe o

matrice schimbătoare de ioni particulară sunt mărimea sa şi raportul dintre sarcina sa/pH.

Proprietăţile matricei schimbătoare de ioni care determină capacitatea lui de disponibilitate

pentru o proteină aleasă sunt limita de excluziune, tipul şi numărul de grupări funcţionale de schimb

ionice substituite. O capactitate înaltă de disponibilitate este obţinută în condiţiile unei matrice care

estre macroporoasă şi înalt substituită cu grupări ionice care îşi menţin sarcina îndr-un domeniu

larg de condiţii experimentale. Matrix-urile neporoase au o capacitate considerabil de mică

comparativ cu matrix-urile poroase, dar şi o mare eficienţă datorită distanţelor mai mici de

difuziune.

Condiţiile experimentale care afectează capacitatea observabilă sunt pH-ul, tăria ionică a

tamponului, natura contraionului, viteza de curgere şi temperatura.

GRUPĂRI SCHIMBĂTOARE DE IONI

Prezenţa grupărilor schimbătoare de ioni este o proprietate fundamentală a oricărui

schimbător de ioni. Tipul de grupare determină tipul şi tăria schimbătorului de ioni, numărul

total al acestora şi disponibilitatea determinând capacitatea de schimb. Există o varietate de

grupări care au fost selectate pentru a fi utilizate în procesul de schimb ionic, o serie dintre

aceştia fiind prezentaţi în tabelul de mai jos.

Grupările sulfonice şi amino-cuaternare sunt utilizate pentru a forma schimbători de ioni

puternici, celelalte grupe funcţionale formând schimbătorii de ioni slabi. Termenele de

puternic şi slab se referă la măsura variaţiei de ionizare cu pH-ul şi nu la tăria legării.

Schimbătorii de ioni puternici sunt complet ionizaţi pe un domeniu mare de pH, în timp ce la

schimbătorii de ioni slabi gradul de disociere şi astfel capacitatea de schimb variază mai puţin

marcant cu pH-ul.

Grupări funcţionale existente

pe schimbătorii de ioni.

Schimbători anionici Grupare funcţională

Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Aminoetil cuaternar (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Ammoniu cuaternar (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-

N+(CH3)3

Schimbători cationici Grupare funcţională

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO-

Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Metil sulfonat (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-

CH2SO3-

Schimbători de ioni pe bază de dextran

Schimbătorii de ioni pe bază de dextran sunt produşi prin introducerea unor grupări

funcţionale pe scheletul acestuia, o matrice de detran, reticulată. Aceste grupări sunt ataşate

la unităţile de glucoză din structura matricei prin legături eterice, stabile.

Domeniul complet al schimbătorilor de ioni pe bază de Sephadex este prezentat în

tabelul de mai jos. Schimbătorii de ioni anionici şi cationici sunt desemnaţi ca A-25 ori A-50 şi

C-25 ori C-50, respectiv, depinzând de porozitatea matrix-ului.

Schimbători de ioni pe bază de Sephadex

Tipuri Descriere Grupare funcţională Contraion

DEAE Sephadex

A-25 Schimbător de ioni slab bazic

Dietilaminoetil- ClorurăA-50

QAE Sephadex

A-25 Schimbător de ioni bazic tareDietil-(2-hidroxi-

propil)aminoetil-Clorură

A-50

CM Sephadex

C-25 Schimbător de ioni slab acid

Carboximetil- SodiuC-50

SP Sephadex

C-25 Schimbător de ioni acid tare

Sulfopropil- SodiuC-50

Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex sunt insolubili în orice solvent. Ei sunt stabili în apă, soluţii saline,

solvenţi organici, soluţii slabe acide şi alcaline. În soluţii puternic acide se pot manifesta procese de hidroliză a

legăturilor glicozidice din care cauză valori ale pH-ului mai mici de 2 trebuiesc ocolite, în particular la temperaturi

crescute. Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex pot fi de asemenea utilizaţi în prezenţa solvenţilor denaturanţi

proces ce poate fi important în condiţiile separării unor substanţe numai pe baza proprietăţilor lor electrostatice. În

timpul regenerării schimbătorul de ioni poate fi expus pentru timp scăzut la o soluţie de NaOH, 0,2 M, fără o

hidroliză apreciabilă. Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex sunt susceptibili la atacul unor dextranaze, motiv

pentru care este nevoie ca în condiţiile de stocare să fie prezent şi un agent antimicrobian. Proprietăţile fizice ale

acestor schimbători sunt prezentate în tabelul următor:

Stabilitatea fizicăSchimbătorii de ioni pe bază de Sephadex pot fi sterilizaţi prin autoclavare, (121°C), până la 30 minute, la

unpH neutru, ăn formă de sare. În timpul autoclavării totuşi, se eliberează o cantitate de carbohidraţi.

Capacitatea de umflare

Proprietăţile de umflare ale schimbătorilor de ioni pe bază de Sephadex sunt asemănătoare cu cele ale

Sephadex-urilor de tip G de la care provin. În plus, Schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex de tip 50 se

umflă mai puternic decît cei de tip 25. datorită prezenţei grupărilor ionice de schimb, pe matrice, umflarea

(îmbibarea) variază cu tăria ionică şi cu pH-ul.

Dependenţa de tăria ionică

La tării ionice scăzute, repulsia dintre grupările ce poartă aceeaşi sarcină pe matrice sunt maxime, din această

cauză umflarea gelului în aceste condiţii, este mare. Gradul de umflare scade cu creşterea tăriei ionice. Se

poate nota că schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex nu trebuie umflaţi în apă distilată deoarece, datorită

puternicelor interacţii ionice care e manifestă în aceste condiţi, structura perlată se distruge.

Dependenţa de pH

Gradul de disociere şi de aici extensia cu care un schimbător de ioni este încărcat electric este dependentă de

pH. Repulsia dintre grupările schimbătoare de ioni este maximă la valori ale pH-ului la care grupările

schimbătoare de ioni sunt total disociate, scăzând la valori de pH apropiate de pK ale grupărilor schimbătoare

de ioni. Se poate nota că schimbători tari precum QAE Sephadex şi SP Sephadex au proprietăţi de umflare

practic independente de pH deoarece sunt încărcaţi electric pe un mare domeniu de pH.

Capacitatea

Datorită diferenţelor în caracteristicile de umflare, schimbătorii de ioni pe bază de Sephadex G-25 au o

capacitate ionică mai mare have per ml gel decât cei pe bază de Sephadex G-50. Astfel, pentru biomolecule

mai mici (masa moleculară < 30 000) schimbătorii de ion de tip A-25 şi C-25 au o capacitate de

disponibilitate mai mare. În domeniul de mase moleculare cuprins între 30 000 şi 100 000 totuşi, schimbătorii

de ion de tip A-50 şi C-50 posedă o capacitate de disponibilitate mai mare datorită existenţei unor pori mai

mari. În condiţiile lucrului cu macromolecule mai mari de 100 000, s-a observat frecvent o mai mare

capacitate de disponibilitate la tipurile A-25 şi C-25 deşi, la aceste mase moleculare, legarea se realizează

numai pe suprafaţa perlei de schimbător de ioni.

Celuloza este utilizată ca matrice, după introducerea unor grupări schimbătoare de ioni,

de tipul dietilaminoetil (DEAE) ori carboximetil (CM), ceea ce conduce la obţinerea unor

schimbători de ioni anionici respectiv cationici.

DEAE celuloza comercializată sub denumirea de DEAE Sephacel este macroporoasă şi are o

limită de excluziune a proteinelor cu masă moleculară de aproximativ 1 x 106. Interacţia ionică a

macromoleculelor cu masă moleculară mult mai mare de 1 x 106 este restiricţionată doar la

sarcinile electrice situate pe suprafaţa perlelor de schimbător.

DEAE şi CM Sepharose CL-6B sunt disponibile sub formă preînmuiată, putând fii

utilizate imdeiat pentru încărcare (împachetare) pe coloană. În privinţa capacitatăţii, se

poate spune că deoarece DEAE şi CM Sepharose CL-6B sunt schimbători de ioni slabi,

numărul de grupări ionice legate care sunt schimbate şi deci capacitatea pentru

macromolecule este dependentă de pH. Această dependenţă se ilustrează cu ajutorul

curbelor de titrare. Domeniul de pH la care se lucrează cu DEAE Sepharose CL-6B este de

2-9 în timp ce pentru CM Sepharose CL-6B este de 6-10.

SELECŢIA GRUPĂRII SCHIMBĂTOARE DE IONI

În selecţia suportului cromatografic trebuie avut în vedere că nu există un singur schimbător de ioni perfect

pentru oricare separare. Alegerea matrix-ului şi a grupării ionice substituite depinde de:

• necesităţile specifice aplicaţiei;

• mărimea moleculară a componentelor probei;

• punctul izoelectric al componentelor probei.

Substanţele se leagă la schimbătorul de ioni în momentul în care posedă o sarcină opusă celei prezentate

de suportul cromatografic. Această legare este electrostatică şi reversibilă.

În cazul în care substanţele ce doresc a fi separate posedă numai un tip de sarcini electrice, alegerea

schimbătorului este clară. În condiţiile separării unor substanţe cu încărcătură mixtă, ce prezintă sarcini atât

pozitive cât şi negative, substanţe denumite amfotere, sarcina netă va depinde de pH. În consecinţă la o anumită

valoare a pH-ului, o substanţă amfoteră va avea o sarcină netă egală cu zero. Această valoare este denumită

punct izoelectric (pI) şi în acel punct substanţele nu se vor lega nici de schimbătorul anionic nici de cel cationic,

după cum se observă schematizat în figura de mai jos.

Curbă de titrare. Sarcina netă a unei

proteine ca funcţie de pH

Astfel, pH-ul unui tampon determină sarcina unor molecule amfotere în timpul unui

experiment. Din acest motiv, în principiu, se poate utiliza atât un schimbător anionic ori unul cationic

pentru a lega substanţa amfoteră, prin selectarea unui pH optim. În practică totuşi, alegerea este

bazată pe un tip de schimbător şi un anumit pH, care conduc la cea mai bună separare a

moleculelor de interes, fără constrângeri referitoare la stabilitatea lor la acel pH.

O multitudine de macromolecule biologice se denaturează ori şi pierd din activitate în afara

unei domeniu bine stabilit al pH-ului şi astfel, alegerea schimbătorului de ioni poate fi limitată de

stabilitatea probei. Sub valoarea punctului său izoelectric o proteină are o sarcină netă pozitivă,

schimbul şi astfel adsobţia realizându-se pe un schimbător cationic. Deasupra pI-ului său proteina

are o sarcină netă negativă, putându-se adsorbi pe schimbători de ioni anionici. Totuşi, ea este

stabilă numai în domeniul de pH cuprins între 5 şi 8, astfel se va utiliza un schimbător de ioni

anionic.

Se pot trage următoarele concluzii:

• Dacă componentele probei sunt mult mai stabile mai mici decât valoarea pI, trebuie utilizat un

schimbător cationic.

• Dacă ele sunt mai stabile în jurul valorilor pI, trebuie utilizat un schimbător anionic.

• Dacă stabilitatea componentelor este mare pe tot domeniul de pH, pe ambele laturi ale pI, se

poate utiliza oricare schimbător de ioni.

Metode de testare în tub a condiţiilor de selecţie a schimbătorului de ioni

CROMATOGRAFIA DE AFINITATE

Conform Uniunii Internaţionale de Chimie Pură şi Aplicată (IUPAC), cromatografia de afinitate

este definită ca o tehnică cromatografică lichidă care se bazează pe “o interacţie biologică” pentru

separarea şi analiza unui analit specific dintr-o probă. Exemple ale acestor interacţii includ legarea

unei enzime la un inhibitor sau al unui anticorp la un antigen. Astfel, cromatografia de afinitate

presupune, în primă fază obţinerea unui agent de legare cunoscut sub termenul de ligand afin, care

interacţionează selectiv cu analitul dorit, acesta fiind apoi plasat pe un suport solid într-o coloană

cromatografică. Odată preparat ligandul imobilizat el poate fi utilizat la izolarea ori la cuantificarea

unui analit.

Ligandul imobilizat este factorul cheie care determină succesul oricărei metodă de

cromatografie afină. După definiţia dată anterior în cromatografia de afinitate cei mai mulţi liganzi

au origine biologică, totuşi termenul de cromatografie afină este de asemenea utilizat de multă

vreme pentru a descrie o serie de coloane care conţin drept liganzi selectivi cu origine nebiologică.

Exemple ale acestor liganzi nebiologici sunt boronaţii, complexe de ioni de ioni metalici imobilizaţi,

coloranţi sintetici. Termeni precum „cromatografie de bioafinitate” şi de „adsorbţie biospecifică” sunt

utilizaţi ocazional pentru a specifica dacă ligand afin estre un compus biologic real. În ceea ce

priveşte originea ligandului, utilizat pentru a divide tehnicile afine de cromatografie se pot menţiona

diverse subcategorii precum cromatografia cu lectine imobilizate, cromatografia de imunoafinitate,

cromatografia cu ligand colorant de sinteză, ori cromatografia de afinitate cu ion metalic imobilizat.

Aceste tehnici afine vor fi examinate în continuare.

Un alt factor utilizat pentru a se face distincţie între o metodă afină de alta este tipul de suport

utilizat în coloană. În „cromatografia de afinitate cu performanţă scăzută (sau pe coloană)”, în mod

uzual, suportul utilizat are un diametru mare iar gelul nu estre rigid. Este cazul suportului de

agaroză, dextran, ori celuloză.

Ca mecanism de separare cromatografia de afinitate separă proteinele pe baza unor interacţii

reversibile dintre o proteină (ori un grup de proteine) şi un ligand specific cuplat la o matrice

cromatografică.

Tehnica este ideală în capturarea (extracţia) sau ca treaptă intermediară într-un protocol de

purificare şi poate fi utilizată oriunde este disponibil un ligand potrivit pentru proteina (proteinele) de

interes. Cu o selectivitate înaltă şi de aici o rezoluţie mare, o mare capacitate pentru proteina

(proteinele) de interes treptele de purificare realizează mari factori de recuperare, de ordinul a

sutelor şi chiar miilor de ori. Proteina (proteinele) ţintă sunt colectate într-o formă purificată,

concentrată.

Interacţiile biologice dintre ligand şi molecula ţintă pot fi rezultatul unor interacţii electrostatice

sau hidrofobe, a unor forţe van der Waals' şi/sau legături de hidrogen. Pentru a elua molecula ţintă

de pe mediul afin interacţia poate fi reversată atât prin metode specifice, de utilizare a unui ligand

competitiv cât şi nespecific prin schimbarea pH-ului, a tăriei ionice sau a polarităţii. Astfel, într-o

singură etapă, purificarea prin cromatografie de afinitate poate oferi un imens avantaj din punct de

vedere a timpului de realizare comparativ cu procedurile de separare în etape multiple. Efectul de

concentrare conduce la posibilitatea procesării unui volum mare de probă, şi în final, proteina

(proteinele) ţintă putând fi capturată dintr-un amestec biologic complex; formele native de pot fi

separate de formele sale denaturate, putând fi purificate din volume mici de material biologic, cu un

nivel înalt de îndepărtare a substanţelor contaminante.

Succesul purificării prin cromatografie de afinitate presupune existenţa unui ligand biospecific

care poate fi ataşat covalent la matricea cromatografică, ligandul cuplat trebuind să reţină prin

legare specifică afină şi reversibilă molecula ţintă şi astfel, să permită moleculei ţintă să fie eluate în

forma sa activă. Orice component poate fi utilizat ca şi ligand pentru purificarea partenerului său

respectiv de legare.

Enzimă Substrat analog, inhibitor, cofactor

Anticorp Antigen, virus, celulă.

LectinăPolizaharide, glicoproteine, receptor celular de suprafaţă,

celulă.

Acid nucleicSecvenţa de baze complementară, histone, polimeraza acidului

nucleic, proteina de legare a acidului nucleic.

Hormon,

vitaminăReceptor, proteină transportoare (carrier)

Glutation Glutation-S-transferază ori proteine de fuziune GST

Ioni metaliciProteine de fuziune poli (His), proteine native cu histidină,

cisteină şi/sau resturi de triptofan pe suprafaţa lor.

Interacţii biologice utilizate în selectarea ligandului respectiv a moleculei ţintă,

utilizate în cromatografia de afinitate

O reprezentare schematică a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate

Reprezentarea schematică a unui proces de separare prin cromatografie de afinitate. a) mediul

afin este echilibrat cu tamponul de legare; b) proba este aplicată în condiţii care favorizează

legarea specifică a moleculei (moleculelor) ţintă la substanţa complementară de legare (ligandul).

Substanţele ţintă se leagă specific, dar reversibil, la ligand, în timp ce componentele care nu

prezintă afinitate pentru ligand sunt îndepărtate prin eluţie (spălare) de pe coloana afină; c)

proteina ţintă este recuperată prin schimbarea condiţiilor ce au favorizat legarea la ligandul

imobilizat. Eluţia se realizează specific, prin utilizarea unui ligand competitiv ori nespecific prin

schimbarea pH-ului, a tăriei ionice ori a polarităţii. Proteina ţintă este astfel colectată într-o formă

purificată şi concentrată; d) mediul afin este reechilibrat cu tampon de legare

Reprezentarea schematică a procesului de cromatografie afină.

Etapele a), b), c), şi d) sunt prezentate în figura prezentată mai sus.

Condiţii de eluţie în cromatografia de afinitate

Metode de eluţie: Metoda 1, cel mai simplu caz: o schimbare în compoziţia

tamponului conduce la eluarea substanţei legate, fără a o altera şi fără a

denatura ligandul. Metoda 2. Se utilizează pH-uri extreme ori concentraţii

mari de agenţi chaotropi pentru eluţie, însă acest procedeu poate conduce la

alterarea temporară ori permanentă a moleculei ţintă ori a ligandului.

Metodele 3 şi 4. Se realizează o eluţie specifică prin adăugarea unei

substanţe care competiţionează la legarea de ligand. Aceste metode pot

creşte specificitatea mediilor care utilizează liganzi specifici de grup.

ALEGEREA MATRICEI CROMATOGRAFICE

Alegerea matricei optime reprezintă o etapă foarte importantă în orice proces

cromatografic. O matrice bună pentru a fi utilizată în cromatografia de afinitate trebuie sa

posede următoarele proprietăţi:

1. Hidrofilicitate: să posede proprietăţi specifica care să-i confere interacţii nespecifice

reduse.

2. Pori mari: să permită tuturor spaţiilor matricei să fie disponibile la cele mai multe

molecule din amestecul de separat. O serie de matrici permit legarea numai la suprafaţa

externă, fiind utilizate mai ales în separarea unor molecule foarte mari, a unor celule sau a

unor viruşi.

3. Rigiditate: matricea trebuie să reziste la presiunile de împachetare şi de curgere a

solventului în timpul eluţiei sau a spălării.

4. Inerţie: matrice nu trebuie să contribuie la procesul de separare cromatografică.

5. Stabilitate chimică: matricea trebuie să fie stabilă la toţi solvenţii utilizaţi în

separarea cromatografică.

O matrice optimă trebuie să posede o structură macroporoasă cu o mare stabilitate

chimică şi fizică, cu o cât mai mică adsorbţie nespecifică, care să faciliteze o capacitate

înaltă de legare şi de recuperare a probei, alături de o rezistenţă mare faţă de eluţiile în

condiţii dure sau condiţiile de spălare.

CROMATOGRAFIA DE AFINITATE CU ION DE METAL IMOBILIZAT

La mijlocul anilor „70, echipa de cercetători condusă de Porath a introdus un nou tip de

cromatografie ce a fost atunci denumită iniţial “cromatografie cu metal chelat”, după care s-a

redenumit “cromatografie de afinitate (adsorbţie) cu metal (ion) imobilizat” (immobilized metal

affinity chromatography, IMAC). Tehnica se bazează pe diferenţele de afinitate ale proteinelor

faţă de ioni metalici legaţi de substanţe ce au proprietăţi chelatoare, care sunt imobilizate pe

un suport (răşină) cromatografic.

Cu toate că bazele acestei metode nu au fost noi, Porath şi colaboratorii s-au focusat pe

utilizarea acestei noi tehnici în separarea proteinelor. Această caracteristică de “bio-afinitate”

a captat atenţia biochimiştilor, chimiştilor şi biologilor care au utilizat IMAC şi au descoperit

noi valenţe în aplicații particulare a metodei.

Cea mai cunoscută îmbunătăţire o reprezintă aplicaţiile ce utilizează o “coadă” (tag) de

poli-histidină la separarea polipeptidelor recombinante care consistă din inserţia unei

secvenţe terminale de resturi histidinice atât la capătul N- ori la cel C-terminal al proteinei ori

al peptidei. Utilizarea unor astfel de histidine sau a altor secvenţe ce posedă afinitate pentru

metale în IMAC a dovedit a reprezenta o metodă deosebit de utilă în recuperarea proteinelor,

în special în condiţiile în care se urmăreşte o producţie mare şi a unui randament crescut de

proteine. În consecinţă, IMAC a apărut drept o metodă majoră utilizată în purificarea

proteinelor, pornind din faza de laborator până la cea de pilot ori industrială.

Au fost publicate o multitudine de studii referitoare la IMAC, unele dintre ele prezentând

noi aplicaţii ale metodei ori de introducere a unor noi posibile arii de utilizare, în care această

tehnică poate fi exploatată.

Interacţiile dintre

resturile învecinate ale

secvenţei hexa-

histidinice şi matricea

Ni-NitriloTetraAcetat.

Utilizarea diferenţelor de afinitate în interacţia proteină – ion metalic

Legarea proteinelor (ori a peptidelor) la ionii metalici se bazează pe interacţiile

dintre grupările donoare de electroni prezente pe suprafaţa proteinelor şi un ion

metalic care prezintă unul sau mai multe situsuri de coordinare, mai mult sau mai

puţin accesibile, expuse. IMAC se realizează între un sorbent, ori un matrix, la care

se ataşează covalent grupări metalice, chelatoare (Figura de mai jos).

Reprezentarea schematică a

mecanismelor implicate în

adsorbția şi desorbția

proteinelor în cromatografia

de afinitate cu metal (ion)

imobilizat (IMAC). Se prezintă

interacţiile specifice ce se

stabilesc între ionul de metal

chelator, suportul chelator şi

secvenţa polihistidinică.

În condiţiile în care ionii metalici sunt adăugaţi (încărcaţi), chelatorii multidentaţi şi ionii metalici

formează complexe în care ionii metalici sunt fixaţi pentru interacţia următoare cu compuşii ce

trebuie să fie rezolvaţi. La sfârşitul acestei etape, ionii metalici aflaţi în complexe trebuie să posede

situsuri de coordinaţie libere la care se vor lega solventul ori moleculele de solut după interacţia

dintre proteine şi ionii metalici, proteinele legate pot fi eliberate prin utilizarea unui dezlocuitor

(precum imidazolul).

Tăria legăturii metal–proteină variază de la o proteină la alta ceea ce

conduce în majoritatea cazurilor la o diferenţiere între proteine,

proces ce poate fi exploatat efectiv în randamente mari de separare

ori în izolarea unor proteine specifice.

Ioni metalici utilizaţi în mod comun în IMAC

Diferenţele în afinităţi ale proteinelor pentru un metal pot fi explicate, cel puţin în parte, pe

baza principiului acizilor ori bazelor tari sau slabe, descrise de către Pearson. În această teorie

se statuează că dacă doi atomi formează o legătură, un atom acţionează ca un acid Lewis iar

cel de al doilea atom ca o bază Lewis. Tăria legăturii este guvernată de valorile intrinseci “tari”

ori “slabe” ai atomilor implicaţi. Teoria acizilor tari sau slabi ori a bazelor tari şi slabe dictează că

legăturile dintre atomi cu o poziţie similară, de exemplu un acid tare combinat cu o bază tare

sunt cele mai puternice. Urmând conceptul de mai sus, ionii metalici precum K+, Ca+2, Mg+2 şi

Fe +3 sunt clasificaţi drept acizi Lewis tari, în timp ce ionii monovalenţi ai metalelor precum Ag+ şi

Cu+ sunt categorisiţi drept acizi Lewis slabi. Ionii metalelor tranziţionale de tipul, Co+2, Zn+2, Cu+2

şi Ni+2, sunt consideraţi acizi “de limită”. Aceşti ioni metalici sunt cel mai adesea utilizaţi în

IMAC, în particular Ni(II), care conferă la un număr de coordinaţie egal cu şase, posedă o

stabilitate electrochimică în condiţii cromatografice, o polarizabilitate limită şi o

stabilitate redox. Ionii metalici chelatori manifestă variaţii în afinitate faţă de proteine, care

poate fi precizată prin utilizarea teoriei descrise de Pearson.

Această teorie a acizilor şi bazelor tari şi slabi postulează că există trei tipuri majori de

liganzi. Acei liganzi care conţin oxigen (de exemplu carboxilat), azot alifatic (precum asparagina

şi glutamina) şi fosfor (de exemplu aminoacizi fosforilaţi) sunt clasificaţi drept baze Lewis tari.

Liganzii care conţin sulf (de exemplu cisteina) sunt clasificaţi drept baze slabe, acei care conţin

azot aromatic (de exemplu histidina şi triptofanul) sunt consideraţi baze de limită. Acizii aflaţi la

limită şi care conţin Co+2, Zn+2, Cu+2 şi Ni+2, coordinează în mod favorabil cu atomii de azot

aromatici (baze la limită) şi de asemenea cu atomii de sulf (baze slabe).

În interacţiile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizaţi şi resturile de

aminoacizi de pe suprafaţa proteinei, grupările funcţionale imidazolil, tiol şi indolil sunt

principalele ţinte pentru ionii metalici. Grupările funcţionale carboxil şi fosfat sunt

principalele ţinte pentru ionii metalici tari precum Fe(III) şi Mg(II). Un concept acceptat

este acela al distribuţiei spaţiale a resturilor de histidină pe întreaga suprafaţă a unei

proteine în timp ce accesibilitatea acestora va influenţa caracteristicile de retenţie ale

moleculei proteice. Au fost descrise în literatura de specialitate o serie de peptide cu

mare afinitate pentru metal după cum s-au prezentat motife din structura proteică de

legare a metalului neînvecinate precum cele găsite în prolactină sau în hormonul de

creştere. Este de remarcat că existenţa unui motif de legare al metalului nu este

întotdeauna garanţia pentru succesul IMAC, după cum există un număr de enzime cu

afinitate pentru metal care se leagă la matrix-ul chelator prin intermediul unui situs care

nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie de secţiuni de legare a metalului la

proteină, chiar dacă sunt expuse, pot contribui foarte puţin la tăria netă a retenţiei a

proteinei în IMAC.

Chelatori de metale şi matrix-uri polimerice de chelare

Majoritatea grupărilor chelatoare utilizate în IMAC sunt compuşi chelatori multidentaţi ce

furnizează tăria complexului format de către proteină, ion metalic şi gruparea chelatoare. Aceste

substanţe chelatoare sunt ataşate pe o suprafaţă de sorbent prin intermediul unor grupări de legare

(braţe, spacere) care pot varia în lungime ori în compoziţie. Structura finală formată după ce ionul

metalic este chelatat de către gruparea chelatoare trebuie să permită o oarecare libertate situsurilor

de coordinaţie în ion metalic pentru adsorbţia ori legarea proteinelor și a moleculelor de solvent.

Diferenţele în numărul de situsuri de coordinaţie libere poate explica în parte de ce o serie de

substanţe chelatoare (acidul iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezintă

selectivităţi diferite şi activităţi de adsorbţie faţă de proteina ţintă, dată. În tridentatul IDA, metalul se

va lega la atomul de azot şi de doi atomi de oxigen din grupările carboxilat, lăsând trei situsuri

libere pentru molecula de proteină ori solvent (în condiţiile utilizării Ni+2 ca metal chelator, acesta

putând da o tărie metal-chelatoare superioară, dar pe de altă parte, o slăbire a puterii de reţinere a

proteinei. O altă însuşire a chelatorului ar fi reprezentată de o scădere a riscului de scurgere

(pierdere) a metalului chelat. Figura de mai jos arată un model al celor mai comuni şi utilizaţi

chelatori, IDA şi NTA legaţi la atomii de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune răşini chelatoare

încărcate cu ioni de Ni(II): Ni(II)– acid iminodiacetic, Ni(II)–

IDA (a) şi Ni(II)– acid nitrilotriacetic, Ni(II)– NTA (b) precum şi

o comparaţie a interacţiilor dintre matricele chelatoare cu

ionii de nichel (c, d).

Compoziţia tamponului de eluent folosit variază în mare măsură

în condiţiile identificării condiţiilor optime pentru o separarea unei

proteine date şi în multe cazuri, reprezintă factorul principal al

specificităţii atinse într-un protocol de purificare prin IMAC.

Acidul iminodiacetic, IDA, reprezintă standardul, cel

mai comun agent ligand chelator de metal pentru

imobilizarea ionilor metalici în suporturile IMAC. Mulţi alţi

chelatori (adsorbenţi) utilizaţi în IMAC au fost proiectaţi în

ultimele decade, fiecare având propriile lor avantaje şi

limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate

precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic

carboximetilat (CM-ASP). Un alt chelator foarte utilizat în

IMAC este NTA, mai recent dezvoltat.

Dezvoltarea unor agenţi chelatori potenţiali noi cu

afinitate pentru metal nu este limitată la o grupare

funcţională ceea ce va conduce la apariţia unor noi clase

de compuşi cu proprietăţi de ancorare a metalului utilizate

în IMAC. O serie de compuşi, neînrudiţi structural cu

aminele carboximetilate, sunt relativ utilizaţi în prezent.

Factorii care contribuie la legătura proteină–metal

O multitudine de studii indică histidina drept aminoacidul care posedă cea mai puternică

afinitate pentru ionii metalici. Este general acceptat că histidina, asemeni resturilor de triptofan şi

cisteină ca rezultat al interacţiilor puternice cu ionii metalici sunt compuşii cheie în legarea

proteinelor în IMAC. Aceşti trei aminoacizi au cele mai mari retenţii, comparativ de exemplu, cu

resturile glutamat şi aspartat, care esenţial nu prezintă nici o retenţie. Studiile efectuate au corelat

retenţiile unui mare număr de peptide sintetice ori biologic active pe Ni(II), Zn(II) şi Cu(II) chelaţi pe

IDA, cu profilurile lor în aminoacizi în scopul de a evalua proprietăţile de adsorbţie ale aminoacizilor

implicaţi în retenţia peptidelor. Alte investigaţii au relevat că proprietatea de retenţie a unor proteine

este în mare parte guvernată de resturile de histidină expuse pe suprafaţa proteinei.

Cisteina prezintă de asemenea o afinitate puternică faţă de metal, deşi oarecum mai scăzută decât

histidina. Afinitatea pentru metal a acestor doi aminoacizi poate fi atribuită în general grupărilor lor

funcţionale, în particular a grupărilor imidazol şi tiol, ale histidinei respectiv cisteinei. În cazul

histidinei, alte grupări funcţionale precum grupările carboxil şi amino, joacă de asemenea un rol în

procesul de legare la metal. Alţi aminoacizi care pot să posede o afinitate substanţială faţă de metal sunt

triptofanul, fenilalanina şi tirozina care acţionează direct prin intermediul catenelor lor aromatice, în timp

ce arginina, lizina, asparagina, glutamina şi metionina, acţionează indirect prin efecte individuale sau

combinate pe accesibilitatea histidinei. Cu toate că retenţia proteinelor ori a peptidelor este în mod primar

(cauzal) dată de afinitatea faţă de metal a aminoacizilor constituenţi, alţi factori pot contribui profund

alături de afinitatea faţă de metal, factori ce includ secvenţa în aminoacizi (poziţia aminoacizilor în

catenă, structura primară), plierea proteinei ori proprietăţile suprafeţei acestora. Se poate spune faptul

că aceste caracteristici de retenţie ale proteinelor în IMAC nu este uşor de precizat.

În interacţiile dintre ionii de Cu(II), Ni(II), Co(II) ori Zn(II) imobilizaţi şi

resturile de aminoacizi de pe suprafaţa proteinei, grupările funcţionale

imidazolil, tiol şi indolil sunt principalele ţinte pentru ionii metalici. Grupările

funcţionale carboxil şi fosfat sunt principalele ţinte pentru ionii metalici tari

precum Fe(III) şi Mg(II).

Un concept acceptat este acela al distribuţiei spaţiale a resturilor de

histidină pe întreaga suprafaţă a unei proteine în timp ce accesibilitatea

acestora va influenţa caracteristicile de retenţie ale moleculei proteice. Au

fost descrise în literatura de specialitate o serie de peptide cu mare afinitate

pentru metal după cum s-au prezentat motife din structura proteică de legare

a metalului neînvecinate precum cele găsite în prolactină sau în hormonul de

creştere. Este de remarcat că existenţa unui motif de legare a metalului nu

este întotdeauna garanţia pentru succesul IMAC, după cum există un număr

de enzime cu afinitate pentru metal care se leagă la matrix-ul chelator prin

intermediul unui situs care nu este cel catalitic de legare a metalului. O serie

de secţiuni de legare a metalului la proteină, chiar dacă sunt expuse, pot

contribui foarte puţin la tăria netă a retenţiei a proteinei în IMAC.

Chelatori de metale şi matrix-uri polimerice de chelare

Majoritatea grupărilor chelatoare utilizate în IMAC sunt compuşi chelatori multidentaţi ce

furnizează tăria complexului format de către proteină, ion metalic şi gruparea chelatoare.

Compoziţia tamponului de eluent folosit variază în mare măsură de condiţiile optime identificate

pentru separarea unei proteine date şi în multe cazuri, reprezintă factorul principal al specificităţii

atinse într-un protocol de purificare prin IMAC. Aceste substanţe chelatoare sunt ataşate pe o

suprafaţă de sorbent prin intermediul unor grupări de legare (braţe, spacere) care pot varia în

lungime ori în compoziţie. Structura finală formată după ce ionul metalic este chelatat de către

gruparea chelatoare trebuie să permită o oarecare libertate situsurilor de coordinaţie în ion metalic

pentru adsorbţia ori legarea proteinelor ori a moleculelor de solvent. Diferenţele în numărul de

situsuri de coordinaţie libere poate explica în parte de ce o serie de substanţe chelatoare (acidul

iminodiacetic, IDA; acidul nitrilotriacetic, NTA, etc.) prezintă selectivităţi diferite şi activităţi de

adsorbţie faţă de proteina ţintă, dată. În tridentatul IDA, metalul se va lega la atomul de azot şi de

doi atomi de oxigen din grupările carboxilat, lăsând trei situsuri libere pentru molecula de proteină

ori solvent (în condiţiile utilizării Ni+2). În acelaşi mod, tetradentatul NTA este considerat a lega ionul

meztalic cu un oxigen extra carboxilat, acesta putând da o tărie metal chelatoare superioară, dar pe

de altă parte, o slăbire a puterii de reţinere a proteinei. O altă însuşire a chelatorului tetradentat ar fi

reprezentată de o scădere a riscului de scurgere (pierdere) a metalului chelat.

Figura arată un model al celor mai comuni şi utilizaţi chelatori, IDA şi NTA legaţi la atomii

de Ni.

Structurile a doi dintre cei mai comune

răşini chelatoare încărcate cu ioni de

Ni(II): Ni(II)– acid iminodiacetic, Ni(II)–

IDA (a) şi Ni(II)– acid nitrilotriacetic,

Ni(II)– NTA (b) precum şi o comparaţie a

interacţiilor dintre matricele chelatoare

cu ionii de nichel (c, d) .

Acidul iminodiacetic, IDA, reprezintă standardul, cel mai comun agent ligand

chelator de metal pentru imobilizarea ionilor metalici în suporturile IMAC. Mulţi alţi

chelatori (adsorbenţi) utilizaţi în IMAC au fost proiectaţi în ultimele decade, fiecare

având propriile lor avantaje şi limite. Ei sunt predominant amine carboximetilate

precum tetraetilenpentamina (TEPA) ori acidul aspartic carboximetilat (CM-ASP). Un

alt chelator foarte utilizat în IMAC ar fi NTA, mai recent dezvoltat. Dezvoltarea unor

agenţi chelatori potenţiali noi cu afinitate pentru metal nu este limitată la o grupare

funcţională ceea ce va conduce la apariţia unor noi clase de compuşi cu proprietăţi

de ancorare a metalului utilizate în IMAC. O serie de compuşi, neînrudiţi structural cu

aminele carboximetilate, sunt relativ utilizaţi în prezent.

De exemplu dye-resistant yellow 2KT, O-fosfoserina (OPS) şi 8-hidroxiquinolina (8-HQ).

Selectarea unei combinaţii optime de chelator şi de ion de metal este importantă după cum şi

răşina chelatoare poate avea efecte adverse în retenţia proteinei. S-a observat că diferit de

metalul utilizat, răşina chelatoare poate avea un efect important în retenţia proteinei,

sugerându-se că, prin utilizarea unei răşini diferite, retenţia proteinei poate fi alterată ca

rezultat al interacţiilor dintre complexul proteină–metal şi răşina chelatoare utilizată.

Structuri ale unor noi grupări

chelatoare utilizate în IMAC

Suportul polimeric utilizat trebuie să îndeplinească o serie de caracteristici fizico-chimici

în scopul de a fi corespunzător procesului IMAC. Astfel un suport ideal trebuie să fie:

uşor de derivatizat;

să nu manifeste adsorbţie nespecifică;

să prezinte proprietăţi fizice, mecanice bune şi o bună stabilitate chimică;

să posede o porozitate înaltă care să conducă la o accesibilitate uşoară a ligandului;

să poată fi utilizat la viteze mari de curgere;

să fie stabil la eluenţi, inclusiv, în ultimă instanţă la compuşi denaturanţi;

să permită regenerarea coloanei fără o degenerare a matrix-ului;

să furnizeze geluri stabile care să nu-şi modifice volumul prin deshidratare ori umflare în

timpul procesului cromatografic.

Factorii care guvernează adsorbţia şi desorbţia

proteinelor

numărul de legături dintre ionul de metal şi un un chelator de metal imobilizat guvernează

afinitatea totală a complexului chelator–ion de metal pentru proteine ori peptide. Chelatorul trebuie

să aibă o puternică afinitate pentru ionul de metal (pentru a preveni, de exemplu, efectul

transferului de ion de metal), dar trebuie să lase de asemenea o serie de situsuri de coordinare

libere pentru a fi capabile să lege proteina la ionul de metal. Se pare că stabilitatea structurii

chelator–ion de metal depinde de tipul de ion de metal şi de compoziţia tamponului eluent utilizat.

Un număr de caracteristici ale chelatului pot să influenţeze selectivitatea legării metal–proteină:

geometri de coordinare a complexului, sarcina, volumul steric şi chiralitatea.

FAZA MOBILĂ: pH-ul, TĂRIA IONICĂ ŞI CAPACITATEA DE TAMPONARE

Selectivitatea unei IMAC pentru o proteină poate de asemenea să depindă de

compoziţia fazei mobile. Creşterea tăriei ionice a tampoanelor poate să conducă

la o supresie a interacţiilor secundare, electrostatice nedorite cu o creştere a

legării proteinei la complexul chetator după cum o scădere a concentraţiei saline

poate conduce uneori la o mai slabă adsorbţie a acesteia. Clorura de sodiu (la

concentraţii de 0,1–1,0 M) este în mod constant inclusă în tampoanele IMAC

pentru a suprima interacţiile ionice dintre probă şi matrix, ca şi cele dintre proteine.

Utilizarea valorilor crescute de pH (7 ori 8) şi a unei tării ionice mari conduce la particularizarea

IMAC faţă de alte tehnici cromatografice, precum cea de schimb ionic. IMAC se aseamănă cel mai

bine cu cromatografia de interacţie hidrofobă (HIC) deoarece se realizează cu tampoane ce conţin

concentraţii crescute de săruri.

Adsorbţia unei proteine în IMAC se realizează la un pH dat la care grupările

donore de electroni de pe suprafaţa unei proteine sunt parţial neprotonate. Este

deseori întâlnit în practică inducerea adsorbţie proteinei pe un suport IMAC sub

condiţii uşor alcaline, în prezenţa unei tării ionice crescute a tamponului.

Tampoanele fosfat şi acetat sunt cele mai utilizate în IMAC. Rolul pH-ului este

deosebit de complex în eluţia şi adsorbţia proteinelor, deoarece el influenţează un

număr de proprietăţi, inclusiv caracterul nucleofil al componentelor tamponului,

proprietăţile electron-donor acceptor ale soluţilor şi stabilitatea ionului de metal.

Domeniul de pH cuprins între 6 şi 8 favorizează retenţia resturilor histidinice şi

cisteinice; într-un domeniu mai alcalin, coordinaţiile dintre grupările amino

funcţionale sunt favorizate, ceea ce conduce la o scădere a selectivităţii.

Aditivi şi dezlocuitori de proteine

Detergenţii pot fi utilizaţi în IMAC drept amplificatori de selectivitate. Tween-ul-80, la o concentraţie

de 0,01% (v/v) a fost utilizat în purificarea prolactinei recombinate umane ori a prolactinei de la

primate, dovedind a fi deosebit de util în diminuarea interacţiilor nedorite. Uneori, un solvent organic

este adăugat la tampon pentru a ajuta la îndepărtarea endotoxinelor fără efecte dăunătoarea asupra

împachetării corecte a proteinelor, ori în scopul eliminării unor contaminanţi în cazul purificării

albuminei din extracte proteice

Avantajele şi dezavantajele cromatografie

de afinitate cu metal imobilizat

IMAC se realizează deseori într-o singură treaptă de purificare;

Capacitatea de încărcare cu proteină este relativ înaltă, comparativ cu alte tehnici

de cromatografie de afinitate (0,1–10 mM/ml gel);

Ionii de metal pot fi uşor de îndepărtat de pe răşină cu ajutorul unui agent chelator

mai puternic, EDTA sau EGTA. Ionii de metal diferiţi pot fi astfel testaţi utilizând aceeaşi

răşină chelatoare, pentru a determina ligandul ce dă cele mai mari satisfacţii în

separarea unei proteine de interes;

Trecerea la scală mare a procesului IMAC este extrem de uşoară şi reproductibilă,

ceea ce face din această tehnică un candidat în aplicaţiile industriale;

IMAC este utilizată în concentrarea soluţiilor diluate de proteine;

IMAC este compatibilă un număr mare de tampoane cu forţă ionică crescută şi care

conţin componente chaotrope;

În general, IMAC nu are efecte adverse asupra structurii proteice, fiind raportate

puţine cazuri în care metaloenzimele care posedă un ion de metal esenţial a fost extras.

Un caz a fost de asemenea raportat în pentru o proteină separată prin IMAC pe o

coloană Cu(II) –IDA, dar alterarea a fost cauzată de către agenţii reducători care au

cauzat proteoliza oxidativă catalizată de ionul de Cu(II);

Efectuarea unei treceri (pasaj) printr-o coloană neîncărcată de IMAC, conduce la

obţinerea unor soluţii tranzitoriu sterile deoarece toţi ionii de metal esenţiali creşterii

bacteriene sunt îndepărtaţi prin chelatare;

O răşină IMAC pot fi regenerate de foarte multe ori, fără o pierdere a

caracteristicilor cromatografice. Gelurile utilizate în IMAC sunt extrem de robuste cu

condiţia ca valori de pH sub 4 să nu fie utilizate.

CaracteristicăAfinitatea pentru

metal

Biospecificitate/

bioafinitate

Stabilitatea ligandului Înaltă Scăzută

Încărcarea cu proteină Înaltă Scăzută

Condiţii de eluţie Blânde Deseori extremă

Recuperarea ligandului după

regenerarea coloanei

Completă În general incompletă

Selectivitate Scăzută-medie Înaltă

Cost Scăzut Înaltă

O comparaţie între IMAC şi procedeele standard de cromatografie de

afinitate

dezavantajele utilizării IMAC

Fenomenul de transfer al ionului de metal conduce la pierderi de proteină şi la randamente mici în

recuperare. O altă problemă ar fi dacă proteina ţintă reţine ionul de metal capturat în structura sa. În acest caz

ionul capturat poate afecta sau chiar aboli bioactivitatea proteinei. Sechestrarea ionului de metal de către proteină

este de asemenea periculoasă dacă se intenţionează a o utiliza în scop terapeutic, deoarece o serie de metale în

mod curent utilizate în IMAC sunt considerate a fi carcinogene. Ionii metalici de Co(II) ori Ni(II), aproape generaal

utilizaţi în IMAC, sunt cunoscuţi a fi agenţi carcinogeni, deşi ei sunt consideraţi mutageni slabi, comparativ cu

arsenul ori cromul hexavalent. Nichelul a fost legat de o expresie anormală a unui număr mare de gene

considerate a fi implicate în inducţia cancerului. Acest fenomen poate fi remediat prin alegerea unui alt ion metalic

chelator care interacţionează cu proteina ţintă. O altă cale care poate fi urmată este cea în care se utilizează un

agent chelator adsorbent puternic, de tipul TED [tris(carboximetil)-etilen diamină].

Scurgerea de ion de metal de pe răşină conduce la contaminarea cu acesta a produsului final, problemă

deosebit de importantă în cazul preparatelor terapeutice. O problemă aparte în acest caz este cea datorată chiar

de interacţia dintre ionul metalic şi proteina însăşi,, mai ales în cazul proteinelor cu uz terapeutic, după cum este

cunoscut faptul că ionii de metal nu numai că sunt catalizatori ai reacţiilor oxidative ci şi afectează negativ

stabilizarea preparatelor proteice liofilizate, deşi se ştie că ionii de metal au fost utilizaţi drept aditivi alături de

zaharide în creşterea stabilităţii proteinelor în decursul liofilizării. În acest caz, în care ionul de metal este un factor

destabilizator, creşterea stabilităţii preparatului proteic se poate realiza prin adăugare de agenţi chelatori. Probele

proteice care conţin ion metalici contaminanţi după o treaptă de IMAC pot fi în continuare supuse unor alte etape

de purificare care în final conduc la preparate necontaminate, cu uz terapeutic. În cazul în care se doreşte

eliminarea urmelor de metal într-o singură treaptă se poate recurge la o coloană de tipul de tipul TED în scopul

capturării ionilor de metal contaminanţi din preparatul proteic. O altă cale elegantă de eliminare a scurgerii de ion

de metal o reprezintă utilizarea unor suporturi de imobilizare a metalului cu constante mari de legare a acestuia, şi

astfel se poate preveni pierderea ionului de metal.

Utilizarea condiţiilor oxidative şi catalitice în timpul procesului de separare în condiţiile în care ionii metalici

sunt imobilizaţi sunt nedorite datorită apariţiei unor procese redox care conduc la alterarea proteinei.

Utilizarea cromatografiei de afinitate pentru ion de metal în conjunctie

cu alte tehnici cromatografice

• SECVENŢELE TERMINALE CU AFINITATE PENTRU

METAL: AVANTAJE ŞI APLICAŢII

– Identificarea proteinelor de fuziune

– Creşterea vitezei procesului de purificare

– imobilizarea unei proteine pe o suprafaţă

– Utilizarea secvenţelor tag

– creşterea stabilităţii proteinei şi de creştere a nivelului de

exprimare

CROMATOGRAFIA CU IONI DE ARGINT INCLUŞI

Cromatografia cu ion de argint (denumită uneori şi cromatografie de

argentare) reprezintă o tehnică care se bazează pe o proprietate a ionilor de

argint de a forma complexe polare şi reversibile cu centrii nesaturaţi prezenţi într-

o serie de molecule organice precum cele din lipidic ori flavonoidic. Se face astfel

posibilă separarea pe baza numărului, configuraţiei geometrice şi a poziţiei

legăturilor duble. În practica cromatografică aceasta se realizează în conjuncţie

cu una dintre procedurile cromatografice stabilite: prin TLC, în cele mai multe

experimente realizate în trecut sau mai recent, prin HPLC ori prin cromatografie

de fluid supercritic.

Sistemul, în mod uzual utilizat, implică încorporarea ionilor de argint într-un

suport solid şi uneori, în cazul cromatografiei cu fază inversă, utilizarea unei faze

mobile în care au fost dizolvaţi ioni de argint. Celelalte componente ale

aranjamentului cromatografic de bază sunt similare cromatografiei convenţională.

O multitudine de metode de cromatografie cu ion de argint sunt general

aplicabile la o varietate de probe în timp ce altele, sunt mult mai specifice.

PRINCIPIUL ŞI MECANISMUL CROMATOGRAFIEI CU IONI DE ARGINT INCLUŞI

Cromatografia cu ioni de argint incluşi se bazează pe principiul că moleculele

organice nesaturate reacţionează reversibil cu metale tranziţionale precum argintul,

formând complexe polare cu sarcină transferată. Astfel, se formează o legătură sigma

între electronii 2 p π* ai legăturii duble şi orbitalii 5s şi 5p liberi ai ionului de argint.

Este implicată de asemenea o legătură π între electronii de antilegătură 2 p π* ai

legăturii duble şi orbitalii 4d ocupaţi ai ionului de argint. Tăria complexului este

determinată de accesibilitatea electronilor în orbitali şi de inhibiţiile sterice ale

acestora.

Se cunoaşte mai mult despre stabilitatea acestor complexe realizate în studii de

interacţie a ionilor de argint cu diverse olefine cu catenă scurtă.

În cazul cromatografiei cu ioni de argint incluşi în suportul cromatografic, a

acizilor graşi este cunoscut că, în cazul dienelor cu grupări metilen întrerupte,

stabilitatea complexelor creşte odată cu creşterea numărului de legături duble,

izomerii cu legături duble aflate în poziţie cis sunt mai puternic reţinut decât izomerii

trans, iar stabilitatea scade odată cu creşterea lungimii catenei, şi tinde odată cu

creşterea iniţială a distanţei dintre legăturile duble să devină mai mare. Dienele

conjugate sunt reţinute mai puţin puternic decât dienele cu grupări metilen întrerupte

şi monoenele care sunt mai puternic reţinute comparativ cu monoinele.

Coloanele HPLC de tipul în care ionii de argint sunt legaţi prin

intermediul legăturilor ionice la resturi de acid fenilsulfonic, legate la

rândul lor de matricea de silice posedă proprietăţi chimice relativ bine,

numeroşi factori în special cei legaţi de compoziţie, de temperatură a

coloanei şi de viteza de curgere a fazei mobile pot fi controlaţi cu

acurateţe. Acest sistem a fost utilizat în obţinerea unor informaţii

cantitative asupra mecanismului de interacţie între ionii de argint şi

legăturile duble. S-a constatat că cromatografia cu ion de argint inclus

poate implica un mecanism mixt de retenţie, chiar în acest sistem. De

exemplu, aşa cum ionii de argint participă la complexarea legăturilor

duble, grupările libere de silanol interacţionează cu grupările esterice

ale acizilor graşi.

CROMATOGRAFIA CU FAZĂ STAŢIONARĂ CHIRALĂ

Enantiomerii, după cum bine se cunoaşte, posedă proprietăţi fizico-chimice identice până în

momentul în care sunt plasaţi într-un mediu care este însuşi chiral. Din acest motiv, ei trebuie să

posede o retenţie egală în interacţia cu orice fază staţionară achirală, neputând fi separaţi cu

ajutorul sistemelor cromatografice achirale. Pentru a crea un mediu chiral, se poate adăuga o

componentă chirală adiţională la sistemul cromatografic, aşa-numitul selector chiral. Selectorul

chiral poate fi prezent în faza mobilă (tehnică denumită fază mobilă chirală) ori în faza staţionară

(fază staţionară chirală). Totuşi, în cazul general, selectorul chiral este prezent în ambele faze iar

recunoaşterea chirală se manifestă simultan, în fazele mobilă şi staţionară.

FAZE STAŢIONARE CHIRALE

Majoritatea acestora sunt realizate pe suport de silicagel ce este

acoperit cu un material polimeric de care este legat un izomer optic

activ. De exemplu, forma L a prolinei se leagă la un copolimer reticulat

polistiren-p-divinilbenzen pentru a se produce o fază staţionară optic

activă necesară separării a unor amestecuri racemice de aminoacizi.

În această aplicaţie, ionii de cupru sunt introduşi în soluţia

enantiomerică de analit ce urmează a fi separată. După cum se

observă în figura următoare are loc formarea unui complex terţiar

între faza staţionară, anionii de aminoacid şi cationii de cupru.

Constanta de formare a acestui complex diferă de formele D şi L ale

aminoacidului analit ceea ce face posibilă separarea acestora.

Reprezentarea schematică a complexului

ternar format între L-prolină legată la faza

staţionară, un aminoacid prezent într-un

analit şi ionul bivalent de cupru.

Au fost dedicate o serie de studii pentru dezvoltarea unei mai bune

metodologii în cromatografia chirală, enantioselectivă, ceea ce a condus la

identificarea unor noi faze staţionare chirale. O serie de agenţi chirali au fost

derivatizaţi şi imobilizaţi pe suprafaţa suportului cromatografic (deseori

reprezentat de silicagel) servind drept discriminatori chirali în timpul procesului

cromatografic. De multe ori fazele staţionare chirale sunt de preferat în

procesul de separare cromatografică datorită vitezei de analiză, posibilitatea

analizării ori a purificării unor enantiomeri dintr-un amestec complex, a

reproductibilităţii analizei precum şi a flexibilităţii ei. În plus, sistemele

cromatografice analitice pot fi adaptate la separări preparative când se pot

colecta enantiomeri în formă pură.

Această tehnică cromatografia cu fază staţionară chirală are drept

aplicabilitate practică studiile de recunoaştere moleculară, după cum retenţia

diferenţială a enantiomerilor în sistemul cromatografic care utilizează faze

chirale staţionare poate fi datorată discriminării chirale la nivelul situsurilor

chirale, interacţii care se pot explora.

S-a arătat că parametrii cromatografici obţinuţi prin fazele staţionare

chirale pot fi deosebit de sensibili, ceea ce conduce la separări în cazul unor

enantiomeri cu proprietăţi foarte apropiate. În plus, fazele staţionare chirale pot

fi utilizate în studii specifice de recunoaştere chirală între molecule. O altă

aplicaţie a cromatografiei cu fază chirală o constituie studiul unor medicamente

cu structură chirală.

O clasificare convenţională a tipurilor de

faze staţionare după modul de interacţie

între faza staţionară şi enantiomer este

prezentată în tabelul alăturat

Tip de interacţie Exemple

Afinitate chirală a proteineloralbumina serică, glicoproteina a1-acidă

(orosomucoid), ovomucoid şi chimotripsina.

Acces stereoselectiv la polimeri

chirali helicaţiPolizaharide derivatizate ori libere.

Interacţii sterice μ-μ între un donor şi

un acceptor de tip chiral cu grupări

amido aromatice

Interacţii Pirkle.

Interacţii gazdă-macromoleculă în

interiorul unei cavităţi chiraleCiclodextrine, eteri coroană şi polimeri legaţi.

Schimb de ligandIoni de cupru complexaţi cu zone moleculare

chirale.

Deşi α-1 glicoproteina acidă (AGP, orosomucoid) şi ovomucoidul (OVM) au cel mai mare câmp

de aplicaţii, multe rapoarte ştiinţifice au descris separarea cromatografică şi/sau studii de legare

prin utilizarea albuminei serice bovine (BSA), a albuminei serice umane (HSA) şi a celobiohidrolazei

I (CBH I) drept selectori chiral imobilizat. Toate aceste coloane sunt disponibile comercial la fel ca şi

coloanele chirale cu avidină ori pepsină, legate. Se poate evidenţia că proteine precum proteina de

legare a riboflavinei, ovoglicoproteina (fracţia activă a preparatelor proaspete de ovomucoid) şi

amiloglucozidaza reprezintă sunt candidaţi promiţători în separarea chirală a compuşilor activi. Alte

faze chirale staţionare descrise în literatură utilizează tripsina imobilizată α-chimotripsina,

conalbumina (ovotransferina) şi lizozimul însă aplicabilitatea lor este relativ limitată.

Se mai poate nota că numărul de proteine care pot fi utilizate drept selectori chirali

imobilizaţi în electroforeza capilară ori în alte tehnici înrudite este mult mai mic decât cel utilizat

în cromatografia lichidă. Au fost descrise separări chirale prin electrocromatografie în tuburi

deschise capilare (open tubular capillary electrochromatography, OTCEC) cu proteine adsorbite

pe perete (lizozim, avidină, albumina serică bovină - BSA, orosomucoid, albumina serică umană

- HSA) ca faze staţionare. În paralel la aceste studii au fost testate reţele de BSA–dextran şi

geluri reticulate de BSA şi celobiohidrolază I în geluri de electroforeză de afinitate.

În concluzie, aceste faze staţionare se realizează din proteine naturale legate la matricea

de silice. Caracteristica de bază o reprezintă faptul că aceste proteine conţin un mare număr de

centrii chirali recunoscuţi a reacţiona puternic cu analiţii mici manifestând o selectivitate chirală

puternică. S-au evidenţiat situsuri interactive specifice care conduc la selectivitatea chirală, dar,

sunt prezente mult mai multe situsuri ce numai contribuie la retenţia generală. Aceste alte

situsuri pot fi dezactivate de către aditivii prezenţi în faza mobilă (de exemplu octilamina) care

reduc astfel retenţia generală dar cresc selectivitatea chirală.

Cel de al doilea tip se bazează pe interacţii chirale între solut şi polimeri naturali şi a fost

dezvoltă de către Okamato şi colaboratorii ce au descris în anul 1987 prima preparare de

suport chiral la care polizaharidele au fost legate de gelul de matricea solidă activată cu γ –

amino-propil-silice. Metoda de fixare constă din utilizarea diizocianatului.

Fixarea 3,5-dicloro- şi a 3,5-

dimetilfenil carbamatatului

la celuloză pe gel de γ –

aminopropilsilice.

Dintre diversele tipuri de polimeri polizaharidici precum celuloza, amiloza, chitosanul, xilanul,

curdlanul, dextranul şi inulina, celuloza şi amiloza au fost utilizate în prepararea şi comercializarea

suporturilor cromatografice de separare chirală. Celuloza şi amiloza ca atare nu pot şi nu sunt

comercializate drept suporturi cromatografice de separare chirală datorită capacităţii lor scăzute în

rezoluţie ca şi din cauza problemelor ce apar în manipularea lor. Din această cauză aceşti polimeri

au fost derivatizaţi sub diverse forme (precum tricarbamaţi ori triesteri). Aceşti derivaţi sunt apoi

legaţi pe suportul de silice.

Catenele polimerice ale unităţilor de D−(+) glucoză conţin legături β-1,4 în cazul celulozei şi

respectiv α 1,4 în cazul amilozei. Aceste catene se află într-o parte şi în alta în formă lineară în

cazul celulozei şi în formă elicoidală în cazul amilozei.

Suporturile cromatografice de separare chirală pe bază de polizaharide sunt disponibile atât în

modul de cromatografiere în fază normală cât şi în cel de fază inversă.

Structurile tridimensionale ale celulozei

şi ale amilozei

Mecanismul de recunoaştere chirală la nivel molecular a interacţiei chirale în cazul suporturilor

cromatografice chirale pe bază de polizaharide rămâne încă neclar deşi s-a raportat că rezoluţia chirală realizată

pe baza acestora este realizată prin interacţii de hidrogen, interacţii π – π, interacţii dipol – dipol induse, între

suportul chiral şi enantiomeri.

S-a observat că legarea coordinativă contribuie de asemenea la rezoluţia chirală a enantiomerilor ce conţin

atomi de sulf în cadrul moleculei. În plus faţă de aceste legături, efectele sterice guvernează de asemenea

rezoluţia chirală pe aceste suporturi pe bază de polizaharide. Aşadar, structura tridimensională a racemaţilor (care

conţin grupări funcţionale şi inele aromatice) se asamblează stereogenic în diverse moduri în cavităţile chirale ale

fazei staţionare, care se stabilizează prin aceste legături de magnitudini diferite atât pentru enantiomerii (+) cât şi

pentru cei (−) şi astfel are loc ori se manifestă rezoluţia enantiomerilor.

Structurile chimice şi ale celor mai utilizate

suporturi cromatografice de separare chirală pe

bază de polizaharide (celuloză şi amiloză). Esteri de

celuloză: celuloză triacetat (1); celuloză tribenzoat

(2); celuloză tri-4 metilbenzoat (3); celuloză

tricinamat (4); celuloză tri-3-metilbenzoat (5);

Carbamaţi ai celulozei: celuloză trifenil carbamat

(6); celuloză tri-3,5-dimetilfenil carbamat (7);

celuloză 4-clorofenil carbamat (8); celuloză tri-4

metil fenilcarbamat (9); Carbamaţi ai amilozei:

amiloză tris 3,5-dimetilfenil carbamat (10); amiloză

tris (S)-α metilfenil carbamat (11); amiloză tris (R)-α

metilfenil carbamat (12).

Cel de al treilea tip este reprezentat de substanţele chirale cu o masă moleculară relativă mică

legate la silice. În acest caz fazele chirale staţionare de tip Pirkle sau înrudite cu acest tip de faze

sunt compuse din selectori chirali mici, sintetici ori molecule chirale care sunt ataşate la grupările

silanol ale suportului de silice prin braţe („spacere”) achirale.

Selectorii chirali conţin grupări ori părţi aromatice (fenil, dinitrofenil, naftil, etc.), capabile să

interacţioneze printr-o interacţie “în trei puncte” ce are loc între selectorul chiral şi analit. În plus faţă

de interacţiile prin legături de hidrogen şi cele dipol-dipol, interacţiile π – π dintre părţile aromatice

din structura selectorului chiral şi analit, joacă un rol predominant.

Fiecare dintre grupările legate are un număr limitat de centrii chirali dar, datorită mărimii lor

mici, se pot lega un număr mare de grupări la silice (opus cazului în care complexelor mai mari cu

părţi chirale). Din această cauză apare o probabilitate relativ înaltă de menţinere a interacţiei dintre

solut şi centru chiral. Avantajul fazelor chirale Pirkle este acela că per total, cum molecula care

interacţionează este mică, soluţii nu sunt puternic reţinuţi şi astfel selectivitatea chirală devine

factorul dominant.

William Pirkle este cel care a descoperit şi dezvoltat acest tip de faze staţionare chirale. În

raţionamentul său, Pirkle s-a bazat pe faptul că dacă o moleculă chirală are afinităţi diferite

pentru enantiomeri, ea trebuie să posede un minimum de trei puncte de interacţie; dintre

acestea, cel puţin unul este stereochimic dependent.

În condiţiile utilizării fazei staţionare chirale de tip Pirkle, recunoaşterea chirală se

manifestă la ambele situsuri de legare. Situsurile majore de legare sunt clasificate astfel: inele

aromatice π - bazice; inele aromatice π – acide; situsuri acide; situsuri bazice; situsuri acide;

situsuri de interacţie sterică.

Inelele aromatice sunt potenţial realizatoare de interacţii π – π. Situsurile acide furnizează

hidrogenii pentru formarea punţilor intermoleculare potenţiale dintre aceştia. Situsurile bazice,

ca şi electronii π, pot de asemenea forma punţi de hidrogen. Interacţiile sterice se pot manifesta

de asemenea între două grupări mari.

Suporturile de cromatografie chirală prin interacţie Pirkle se divid în trei clase: π –

acceptori de electroni; π – donori de electroni; acceptori de electroni π şi donori de electroni π.

Figura de mai jos prezintă schematic mecanismul de legare chirală prin interacţie Pirkle.

Reprezentarea schematică a mecanismului de

legare chirală prin interacţie Pirkle. A= grupare π

acidă; B= Situs acid; C= Situs bazic.

Un mare avantaj în utilizarea fazelor staţionare chirale de tip Pirkle o

reprezintă capacitatea de a inversa ordinea de eluţie prin utilizarea aceluiaşi

tip de fază staţionară chirală, dar cu configuraţie absolută inversată. Este

astfel posibil a elua în urme enantiomerul, înaintea celui major, o trăsătură

dorită în cazul determinării purităţii enantiomerilor. Pentru separări preparative

este benefic a elua compusul dorit, primul.

Fazele staţionare chirale de tip Pirkle pot separa o multitudine de

enantiomeri din numeroase grupe de compuşi, precum: medicamente din

clasa acidului aril propionic, compuşi antiinflamatori nesteroidici, compuşi cu

importanţă în agricultură, produse naturale, β- blocante, o multitudine de

compuşi farmacologici activi, etc.

Al patrulea tip de faze staţionare chirale este reprezentat de suporturi ce conţin în

structura lor glicopeptide macrociclice şi a fost introdus în cromatografie de către

Armstrong, în anul 1994.

Acestea sunt compuşi chimici care conţin de asemenea un număr mare de centrii

chirali, împreună cu o serie de cavităţi moleculare în care moleculele de solut pot intra şi

astfel interacţiona cu grupări aflate în aceste zone. Caracterul spaţial al solutului va

determina gradul de pătrundere şi în consecinţă proximitatea interacţiei care, în schimb,

va determina energia de interacţie şi magnitudinea retenţiei.

Antibioticele macrociclice posedă o serie de caracteristici care le permit să interacţioneze cu

analiţii şi astfel să servească drept selectori chirali. Ele posedă un număr de centrii stereogenici şi

grupări funcţionale, care participă la multiplele interacţii cu moleculele chirale.

Antibioticele macrociclice posedă o masă moleculară cuprinsă între 600 - 2200 şi au deseori

numeroase grupări funcţionale inserate pe structura lor. Ele pot fi acide, bazice ori neutre, neavând

ori având o absorbanţă redusă în domeniul UV–VIS. Un serie dintre aceste proprietăţi fizico-

chimice sunt prezentate în tabelul 3.30.

Antibioticele macrociclice pot interacţiona prin interacţii hidrofobe, dipol–dipol, interacţii π–π,

legături de hidrogen precum şi prin repulsii sterice. Una dintre cele mai importante interacţii sunt

cele ionice ori cele de schimb de electroni. În plus faţă de părţile hidrofobe, aceste molecule

posedă grupări hidrofile precum şi un număr de grupări ionizabile, ceea ce permite o bună

solubilitate în soluţii apoase. Cele mai de succes şi mai utilizate antibiotice macrociclice ca şi

selectori chirali sunt glicopeptidele. Ansamicinele, polipeptida tiostreptonă şi aminoglicozidele,

fradiomicină, kanamicină şi streptomicină, au fost de asemenea utilizate drept selectori chirali.

UTILIZATAREA UNOR ANTIBIOTICE CA FAZE STAŢIONARE CHIRALE

Ansamicinele, rifamicina B şi rifamicina SV, au o semnificaţie istorică, deoarece

ele au fost utilizate la început drept selectori chirali exclusiv în electroforeza

capilară, înainte de a fi utilizate în cromatografie. Rifamicina B a fost primul

dintre compuşii ansa utilizaţi în electroforeza capilară pentru separarea efectivă

a unei varietăţi de analiţi ce conţin grupări amino. Aceste au o structură

caracteristică ansa ce cuprinde o structură de inel ori un cromofor ce este înţepat

de o catenă. Catena alifatică poate fi înalt substituită din care cauză

ansamicinele diferă prin tipul şi poziţia substituenţilor pe inelul

naftohidroquinonic, după cum se observă în figură

Structurile chimice, numerotare

(A, B) şi reprezentarea schematică

spaţială (C, D) a rifamicinei B şi a

rifamicinei SV.

Catena alifatică a ambilor compuşi prezintă un etil ester la C21 şi un metil eter la C23.

ansamicinele cele mai des utilizate în separări chirale sunt rifamicina B şi rifamicina SV. S-a arătat

că rifamicina B prezintă enantioselectivitate faţă de compuşi cationici, în timp ce rifamicina SV este

enantioselectivă faţă de soluţi neutrii ori oarecum anionici.

Ansamicinele rifamicina B şi SV, absorb puternic în regiuni spectrale UV şi vizibile din cauza

inelului naftohidroquinonic. Fiecare compus are maximum de absorbţie la 220, 304 şi 425 nm. Din

această cauză rifamicinele sunt utilizate la concentraţii relativ înalte (20–25 mM), separările fiind în

monitorizate (urmărite) cel mai adesea prin detecţie indirectă. Detecţia indirectă se realizează în

general, prin analiza peak-urilor negative, proces datorat reducerii absorbanţei comparativ cu

semnalul de fond (semnal background).

Glicopeptide

Antibioticele macrociclice de natură glicopeptidică par a fi cei mai buni selectori chirali

descoperiţi până în prezent. Ele includ avoparcina, ristocetina A, teicoplanina, vancomicina şi doi

analogi derivaţi ai vancomicinei.

Structurile chimice ale antibioticelor

macrociclice de natură glicopeptidică

utilizate în cromatografia cu fază

chirală: (A) vancomicina, (B)

teicoplanina, (C) avoparcina, (D)

ristocetina A.

Polipeptide şi aminoglicozide

tiostreptona

Kanamicin sulfat

Streptomicina

fradiomicina

O dată cu introducerea fazelor legate ce conţin antibiotic macrociclic acestea au devenit

extrem de populare deoarece s-au dovedit deosebit de utile ca în separările chirale prin

cromatografie lichidă, în special de înaltă performanţă. Antibioticele macrociclice vancomicina,

ristocetina A, teicoplanina, avoparcina, rifamicina B şi tiostreptona au fost utilizate pentru

separări chirale. Antibioticele macrociclice de natură glicopeptididică, vancomicina, ristocetina A,

teicoplanina şi avoparcina par a avea o enantioselectivitate mai largă comparativ cu cea a

ansamicinelor ori a polipeptidului tiostreptonă. Antibioticele macrociclice sunt legate covalent la

gelul de silice prin intermediul unor variate punţi de natură chimică ce le asigură stabilitatea cu

menţinerea proprietăţilor de recunoaştere chirală.

Antibioticele macrociclice de natură glicopeptididică şi tiostreptona sunt ataşate la gelul de

silice prin reacţia grupărilor lor carboxilice cu organosilani, în timp ce antibioticul macrociclic

rifamicina B poate fi ataşată prin intermediul reacţiei dintre grupările aminice cu organosilani.

Antibioticele macrociclice de natură glicopeptidică pot fi de asemenea ataşate prin reacţie de

epoxilare similar metodei utilizate pentru imobilizarea ciclodextrinelor, ori pot fi imobilizate prin

metoda cu izocianat, în mediu anhidru de dimetilformamidă.

Fazele cu glicopeptide legate pot fi utilizate în modul de fază normală, fază inversă ori în solvenţi

organici polari pentru a atinge diferite enantioselectivităţi sau pot fi derivatizare pentru a li se altera

enantioselectivitatea.

Fazele cu antibiotice macrociclice legate realizează criteriul general pe care cele mai utilizate faze

legate îl îndeplinesc, adică sunt suficient de efective ca medii de separare, manifestă o bună rezistenţă

mecanică, alături de un preţ accesibil. Fazele legate cu antibiotice macrociclice sunt similare fazelor

staţionare chirale cu proteine legate şi au o capacitate mai mare alături de o mai bună stabilitate.

Enantioseparările se realizează printr-o multitudine de interacţii precum complexări π–π, legături de

hidrogen, incluziuni hidrofobe, interacţii dipol-dipol, repulsii sterice, precum şi combinaţii ale acestor

interacţii. În timp ce cu alte faze staţionare se pot produce o serie din interacţii asemănătoare, ele nu sunt

în mod normal accesibile pentru o singură fază legată cu o proximitate închisă.

În opoziţie la fazele staţionare chirale cu proteine legate, cele pe bază de antibiotice macrociclice pot

fi utilizate în procedeul cu fază normală fără nici o modificare ireversibilă în enantioselectivitate, proces

datorat în primul caz denaturării proteinei legate. Aceste faze pot fi utilizate şi în separări preparative.

Vancomicina, rifamicina B şi tiostreptona au fost primele antibiotice macrociclice introduse sub formă

legată în cromatografia cu fază staţionară chirală. Dintre acestea trei, numai vancomicina a demonstrat un

potenţial larg de aplicare, fiind folosită atât în procedeul cromatografic cu fază inversă cât şi în cel cu fază

normală. Vancomicina a fost de asemenea derivatizată cu 3,5-dimetil - fenilizocianat (DMP) şi evaluată

apoi din punct de vedere al calităţilor de fază chirală. Faza staţionară cu DMP - vancomicină a fost

capabilă să rezolve o serie de compuşi pe care suportul chiral cu vancomicină nu a reuşit, în special în

cazul hidroxizinei şi a altiazidei.

Suportul chiral cu vancomicină legată a fost utilizat într-un mare număr de aplicaţii, pentru separarea

multor compuşi optic activi. Acest suport chiral a fost utilizat la rezolvarea unor amestecuri racemice de

piridone (derivaţi ai piridinei cu una sau mai multe grupări cetonice pe un inel), arildihidropirimidin

carboxilaţi (analogi dihidropiridinici ai modulatorilor canalelor de calciu de tip nifedipinic, un agent clasic

coronaro – vasodilator şi blocant al canalului de calciu, care reduce accesibilitatea ionilor de calciu la

nivelul musculaturii netede şi a inimii, utilizat în tratamentul anginei pectorale); enantiomeri ai

citalopramului (medicament utilizat în tratamentul depresiilor) ori ai metaboliţilor demetilaţi derivaţi ai

acestuia din plasma umană, a α aminoacizilor şi dansil derivaţilor acestora; imide ciclice, barbiturice,

piperdin-2,6-dione şi produşi de semisinteză din alcaloizi izolaţi din ergot.

Teicoplanina s-a utilizat ca fază chirală legată în separarea a peste de

compuşi 90 optic activi printre care aminoacizi şi peptide, salbutamolului (un

agent simpatomimetic utilizat drept bronhodilator, în special în tratamentul

astmei) şi ai metaboliţilor lui din matrix-uri biologice, în determinarea

enantiomerilor albuterolului (un stimulant β-adrenergic utilizat drept

bronhodilator în tratamentul astei şi a altor boli obstructive de pulmon) din

plasmă, în separarea unor aminoacizi rari aromatici. Aceasta din urmă diferă de

vancomicină printr-o „coadă” hidrofobă, ceea ce-i conferă proprietăţi chirale

diferite. Teicoplanina a fost deseori utilizată împreună cu vancomicina în

separarea unui mare număr de soluţi.

Ristocetina A reprezintă unul din ultimele glicopeptide utilizate în

cromatografia cu fază chirală. Prin utilizarea ei s-au separat peste 230 de

amestecuri racemice, în sistem de fază normală ori fază inversă. Din punct de

vedere al caracteristicilor de retenţie, al stabilităţii coloanei, se pare că acest

suport chiral este complementar primelor două glicopeptide prezentate mai sus,

vancomicina şi teicoplanina.

Avoparcina a fost izolată din pui de găină şi a fost utilizată la drept fază

chirală legată la gelul de silice în analizele HPLC, fiind utilizată în condiţiile în

care alte faze staţionare chirale nu pot rezolva în totalitate o serie de

amestecuri racemice, precum în cazul verapamilului (un vasodilator calciu

blocant utilizat în tratamentul hipertensiunii, anginei pectorale şi a unor aritmii

cardiace), tiroxinei (un hormon ce conţine iod secretat de către glanda tiroidă şi

care amplifică viteza metabolismului celular, reglând creşterea), ori a

mefenitoinei (un medicament toxic anticonvulsiv cu denumire comercială

mesantoin utilizat în tratamentul epilepsiei în condiţiile în care alte medicamente

anticonvulsive devin ineficace).

Al cincilea tip de cromatografie cu fază chirală legată se referă la cea de schimb

enantioselectiv de ligand, tehnică sugerată de Davankov şi colaboratorii spre sfârşitul

anilor ‟70, fiind utilizată la rezolvarea unor amestecuri de racemici în enantiomerii

constituenţi, fiind astfel prima tehnică de cromatografie lichidă care conduce la o

separare completă şi certă a stereoizomerilor din cele mai importante clase de compuşi

naturali ori de sinteză, precum α aminoacizii, hidroxiacizi, aminoalcooli şi a multor altora.

Introducerea cromatografiei cu schimb de ligand a condus la o dezvoltare în cercetarea

chimică (studii stereochimice, sinteze asimetrice, cataliză enantioselectivă) şi în cea

farmacologică.

Principiul de bază al separării enantioselective prin cromatografie cu schimb de

ligand a fost demonstrat de către un selector chiral chimic legat la o matrice polimerică

precum un complex al Cu (II) cu o serie de aminoacizi naturali care formează în anumite

condiţii complexe ternare compuse din ligandul chiral din faza staţionară, ionul de Cu (II)

şi analit. Enantioselectivitatea formării de complexe ternare, de exemplu diferenţa în

stabilităţi termodinamice a două structuri diastereoizomerice ce cuprind enantiomeri (R)

sau (S) ai analitului este extrem de mare.

Implicarea a doi enantiomeri într-un proces de complexare este aproape identic iar

în ceea ce priveşte mărimea şi sarcina celor două complexe diastereomerice ternare

formate acestea sunt exact identice. Două specii diastereomerice pot diferi numai prin

forma spaţială a lor, singura diferenţă care poate afecta în mod dramatic reprezentând-o

adsorbţia lor pe suprafeţe solide ori pseudo-solide. Acest fenomen reprezintă baza fizică

a procesului de discriminare chirală

Metode de separa re

Cromatogra fiaElec tro foreza

de atingere a s tarii de echilibru

(s teady s ta te , displacement e lectrophores is )

focus are (focalizare ) is oe lec trica

isoe lectric focus ing

is o tachophoreza

î n medii s tabilizate , zonalã

(zone e lectrophores is )

frontalã, liberã, de migrare î n s o lutii (tampon)

moving boundary e lectrophores is

suportul s tabilizeazã zone le de migra re

s i pe rmite o ma i bunã sepa ra re

medii suport cu s tructurã capila rã

medii suport cu s tructurã re ticula rã

suporturi chimic active

pe hâ rtiepe s tra t subtire

pe folii de ace ta t de ce lulozãpe aga r, aga rozã

pe amidon

pe poliacrilamidã

e lectroforeza de a finita te

imunoe lectroforeza

Istoric

• 600 i. C. - Thales din Milet

• 1908- Reiss

• 1909 – Michaelis

• 1937 – Tiselius

• 1947 – Martin & Synge - definesc

ionoforeza

Concepte de baza in electroforeza

• Fenomenele electrocinetice de transport se tine cont de

faptul de:

– Particula care migreaza (coloidul de dispersie)

– Mediul de dispersie

Coloizii de dispersie sunt putatori de sarcina electrica

Cohen-la contactul dintre două faze, faza cu constanta

dielectrică mare se încarcă pozitiv

Graham- chemosorbtie

qs reprezintă densitatea electrică superficială

d2 este grosimea stratului dublu

ε este constanta dielectrică a mediului

ϛ (zeta)=potențial electrocinetic care apare la

suprafața particulei din mediu și care

generează separarea electroforetică

k-1 = grosimea stratului dublu electric (sau

lungimea Debye)

kB = constanta Boltzmann

T= temperatura

e = sarcina electrică

F = constanta Faraday

I = tăria ionică zi ; ci = valența respectiv concentrația molară

a ionilor din soluție

O particulă încărcată electric, într-un mediu lichid tamponat, sub acțiunea unui câmp electric uniform, se va

deplasa cu o viteză constantă, determinată de acțiunea a patru forțe:

•Forța de atracție electroforetică (F1) egală cu produsul dintre sarcina electrică Q a particulei ( a entității

electrocinetice) și intensitatea câmpului electric aplicat (E)

•Forța de frecare Stokes (F2), egală cu produsul dintre coeficientul de vâscozitate a mediului (η), raza

particulei (r) și viteza electroforetică, v după relația:

F2= 6πηrv

•Forța de frânare electroforetică (F3) rezultată ca urmare a atracției exercitate de câmpul electric asupra

ionilor electrolitului (soluția tampon în care se deplasează particula) conform relației:

F3= (Q - ε• ξ•r)•E

unde Q

reprezintă sarcina electrică a particulei;

ε este constanta dielectrică a mediului;

ξ reprezintă potențialul zeta;

r este raza particulei;

E reprezintă intensitatea câmpului electric aplicat.

Forța datorată efectului de frânare (F4), forță care apare din cauza redistribuirii ionilor electrolitului în

apropierea particulei, sub acțiunea unui câmp electric uniform.

Imediat după aplicarea unui câmp electric , suma vectorială a celor patru forțe devine

egală cu zero, iar viteza electroforetică devine constantă:

Pentru electroforeza în medii stabilizate (gel de amidon, poliacrilamidă, etc.) F3 și F4 sunt practic

neglijabile, astfel încât forței de atracție electroforetice (F1) se opune forța de frecare Stokes (F2):

ceea ce înseamnă că:

Din ultima relație se calculează viteza electroforetică:

Ecuația de mai sus conduce la relația Huckel:

unde ξ reprezintă potențialul zeta;

ε este constanta dielectrică a mediului;

H este gradientul de potențial, egal cu raportul dintre tensiunea

aplicată, E și distanța dintre electrozi, l.

r este raza particulei;

E reprezintă intensitatea câmpului electric aplicat.

La baza fenomenelor electrocinetice importanță practică are relația Helmholtz-

Smoluchovski:

Henry, plecând de la relațiile Huckel și Helmholtz-Smoluchovski,

le generalizează conform teoriei stratului difuz:

unde re reprezintă raza efectivă a particulei hidratate, r+δ, iar χ este

inversul grosimii stratului dublu electric, fiind cuantificat de relația:

în care: z reprezintă valența;

e este sarcina elementară;

n este numărul ionilor

La temperatura camerei,

pentru n=c (în moli/litru)

Se poate deci evalua potențialul zeta (ξ):

unde v reprezintă viteza electroforetică.

MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ

Mobilitatea electroforetică este în relație de proporționalitate

directă cu viteza electroforetică, fiind raportul dintre viteza

electroforetică și intensitatea câmpului electric. Ea se determină

prin măsurarea intervalului de timp, t, necesar unei particule sau

unei interfețe solid-lichid să parcurgă o anumită distanță, d, sub

acțiunea unei diferențe de potențial exterior.

Dacă l, reprezintă distanța dintre electrozi măsurată în interiorul

soluției, atunci mobilitatea electroforetică se poate scrie:

Cum H (gradientul de potențial), este egal cu

raportul dintre intensitatea câmpului electric

aplicat (tensiunea aplicată), E și distanța dintre

electrozi, l, se poate scrie:

de unde se deduce mobilitatea efectivă (măsurată în sistemul

internațional în m2•V-1•s-1), µ:

În practică se folosește mobilitatea relativă, µo care

este proporțională cu distanța de migrare:

Mobilitatea relativă se calculează prin compararea mobilităților

diferitelor particule, considerându-se că timpul de migrare și

intensitatea câmpului electric sunt constante (adică particulele care

se compară au condiții identice de migrare electroforetică.

Pentru electroforeza în medii stabilizate, când

adică,

Se calculează viteza de migrare drept:

Coeficientul 6π•η•r este denumit coeficient de fricțiune (frecare)

în medii stabilizate. El depinde și de alți factori.

Substituind viteza electroforetică din relația de mai

sus în ecuația mobilității relative:

atunci,

Se observă astfel faptul că mobilitatea relativă este în funcție de

sarcina particulei, Q și de raza sa, r:

unde Q reprezintă sarcina particulelor, iar r este raza particulei. Se poate

spune că particulele cu un raport Q/r identic vor avea o mobilitate

identică

Cum Q este produsul dintre suprafață și densitatea

de sarcină superficială, qs, pentru o particulă sferică

cu raza r, sarcina particulei este:

Q = 4 π•r2•qs

iar mobilitatea relativă este funcție

de raportul Q/r

atunci,

= 4 π•r•qs

ceea ce arată că dacă variațiile dimensiunilor particulelor sunt compensate de

variațiile de sarcină electrică superficială, particulele vor migra cu mobilități

egale.

REZOLUȚIA DE SEPARARE

În electroforeza într-un mediu stabilizat, particulele cu

mobilități (µ) diferite se vor deplasa în zone discrete.

Teoretic separarea diferitelor particule sub formă de zone

discrete este realizată, dacă mobilitățile relative sunt suficient

de diferite și dacă distanța migrării este suficient de mare.

Eficiența unei separări electroforetice este exprimată printr-o

mărime denumită rezoluție de separare, Rs.

Considerând două zone separate electroforetic, cu lățimea benzii egală

cu l1 și l2, iar distanța dintre ele fiind egală cu Δd, rezoluția de separare

este egală cu:

unde Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2, iar l1 și l2 sunt lățimile celor

două zone formate de două tipuri de particule.

Drumul parcurs (distanța) în procesul separării electroforetice este

egală cu: d = v•t

unde v reprezintă viteza electroforetică iar t

este timpul de migrare

Din relația mobilității, µ=V/E se deduce viteza electroforetică, v=µ•E, iar drumul

parcurs de o particulă în funcție de mobilitatea sa este dat de relația:

d = µ•E•td = µ•E•t

Se poate spune că drumul parcurs de o particulă este egal cu produsul dintre

mobilitatea sa, timpul de migrare și câmpul electric aplicat.

Pentru particula 1, drumul parcurs de aceasta este egal cu d1 = µ1•E•t iar

drumul parcurs de particula 2 este egal cu d2 = µ2•E•t.

Cum Δd reprezintă distanța dintre centrele zonelor 1 și 2 fiind egală cu diferența de

migrare între cele două particule (d1-d2) se deduce rezoluția de separare:

Se consideră că: (1) pentru o separare electroforetică eficientă este necesară o

rezoluție de separare cuprinsă între 1 și 1,5; (2) lățimea zonelor de separare (l1 și l2din figura de mai sus) are un rol hotărâtor. Ea este asociată cu dispersia Gauss

datorată procesului aleatoriu de deplasare.

Dispersia totală este suma a cinci termeni care acționează independent:

•Difuziunea termică;

•Microheterogenitatea;

•Difuziunea turbulentă;

•Electrodifuziunea;

•Electrosorbția.

Primii doi termeni acționează și sunt importanți în cazul electroforezei în mediu liber;

difuziunea termică și difuziunea turbulentă este importantă în cazul electroforezei pe

medii stabilizate.

Pe de altă parte, analiza relației rezoluției de separare în contextul proceselor de

dispersie arată că pentru creșterea rezoluției dee separare este de preferat creșterea

intensității câmpului electric și nu a timpului de migrare.

FACTORII CARE INFLUENȚEAZĂ REZOLUȚIA DE

SEPARARE ȘI MOBILITATEA ELECTROFORETICĂ

Mobilitatea particulelor care se deplasează într-un câmp electric uniform

precum și rezoluția de separare dintre particule cu mobilități diferite sunt

influențate de următorii factori:

•pH-ul soluției tampon. Acesta afectează mobilitatea deoarece sarcina

electrică este funcție de pH. Din această cauză, alegerea soluție cu pH

optim conduce la rezoluții superiore.

•Difuziunea postelectroforetică care depinde de metoda electroforetică

utilizată.

•Factori proprii particulelor: mărime, formă, sarcină electrică,

concentrație, gradul de hidratare și disociere.

•Factori caracteristici mediului de separare: vâscozitate, pH, intensitatea

câmpului electric, timpul de migrare.

•Factori dependenți de metoda electroforetică utilizată: difuziunea

postelectroforetică.

•Alți factori.

TĂRIA IONICĂ (FORȚA IONICĂ)

Câmpul ionic dezvoltat de un ion în soluție depinde de: (a)

concentrația sa; (b) valența (sarcina) sa; (c) prezența altor

ioni în soluție.

În soluții diluate, tăria ionică este independentă de natura

chimică a ionului. Pentru a ține cont de toți acești

parametrii, s-a introdus o mărime denumită tărie ionică

(forță ionică).

Prin definiție, tăria (forța) ionică (j) reprezintă semisuma

termenilor obținuți prin înmulțirea concentrațiilor molare

(c) a fiecărui ion în soluție cu pătratul valenței sale (z):

unde i = 1,2,....n

În calculul forței ionice a unei soluții tampon se consideră că acizii slabi sunt

nedisociați, în schimb sărurile lor sunt complet disociate. Astfel, pentru o soluție

tampon conținând 8,8 g/l acid dietilbarbituric și 10,3 g/l dietilbarbiturat de sodiu,

forța ionică este dată numai din disocierea sării de sodiu și ionul de dietilbarbiturat.

Cum dietilbarbituratul are masa moleculară de 206,18g, 10,3 grame reprezintă 0,05

moli/l, de aici se trage concluzia că tăria ionică (j) este egală cu 0,05M.

Teoretic, mobilitatea electroforetică este invers proporțională cu rădăcina pătrată a

forței ionice:

iar mobilitatea electroforetică este invers proporțională cu rădăcina pătrată a forței

ionice:

µ

Din această relație se poate observa că la micșorarea

tăriei ionice are loc o creștere a intensității câmpului

electric uniform aplicat. Astfel, datorită faptului că

rezoluția de separare este direct proporțională cu

intensitatea câmpului electric uniform aplicat,

scăderea tăriei ionice conduce la creșterea rezoluției

de separare.

În general se consideră că: (a) soluții tampon cu forțe

ionice mici permit viteze de migrare mari, deci

mobilități mari; (b) forțe ionice mai mari de 0,15M

conduc la viteze de migrare mici la timpi de migrare

mici dar cu o rezoluție bună. Trebuie totuși avut în

vedere că o forță ionică prea mică poate conduce la

precipitarea probelor.

EFECTUL TERMIC JOULE

În timpul unei separări electroforetice, la trecerea curentului electric prin soluție are loc

o degajare de căldură denumită căldură Joule sau efect Joule. Acest efect este deosebit

de important în condițiile în care poate afecta negativ separarea electroforetică prin

favorizarea proceselor de difuziune, a apariției curenților de convecție ori de denaturare

a probei (mai ales în cazul enzimelor). Din acest motiv este necesară menținerea între

anumite limite a acestui efect.

Efectul termic Joule poate fi controlat (a) în sisteme tampon continue prin valoarea

puterii electrice intrate (dacă temperatura este constantă); (b) în sisteme tampon

discontinue (multifazice) prin controlul rezistenței electrice a mediului de separare.

Rezistența electrică crește odată cu avansarea frontului mobil datorită scăderii

conductivității mediului. Astfel, la o intensitate a curentului (I) constantă, crește

tensiunea (U) și căldura degajată este în relație directă cu timpul de migrare. Dacă

tensiunea este constantă, scăderea intensității este funcție de timpul de separare iar

căldura degajată dezvoltată prin efect Joule va fi redusă însă rezoluția de separare va fi

slabă.

Conform primei legi a lui Ohm, intensitatea curentului (I) este direct proporțională cu

tensiunea electrică (voltajul, V) și invers proporțională cu rezistența (R). rezistența

sistemelor electroforetice este dată de tampoanele utilizate, de tipul de configurații ale

gelului și de volumul total al gelurilor care se rulează, iar tensiunea electrică este dată

de produsul dintre intensitate și rezistență după relația:

ELECTRO(ENDO)OSMOZA

Electro(endo)osmoza este un fenomen electrocinetic care apare în urma deplasării fazei

lichide de dispersie printr-un capilar, sisteme capilare sau medii poroase la aplicarea

unui câmp electric exterior. Ea se caracterizează prin deplasarea electrolitului în câmpul

electric aplicat. Din aceeași categorie de fenomene fac parte potențialul de curgere

(fenomen opus electroendoosmozei) și potențialul de sedimentare.

În medii suport stabilizate (hârtie de filtru, dar mai ales în gelul de agaroză)

electroendoosmoza se corelează cu proporția de sarcini negative ale acestora, motiv

pentru care se induce un flux de lichid spre catod. Cum particulele care se separă sunt

încărcate negativ, iar migrarea lor se realizează spre anod, apar fenomene de convecții

interne, deci se produc modificări ale mobilității electroforetice și astfel ale rezoluției de

separare.

În medii poroase saturate cu o soluție ionică se manifestă o serie de sarcini electrice

fixate pe suprafața fazei solide, distribuția spațială a anionilor și cationilor din faza

lichidă are la bază teoria stratului dublu electric. Dacă sarcinile fixe sunt negative, sunt

necesari cationi în exces din faza mobilă pentru a asigura electro-neutralitatea. La

aplicarea unui câmp electric exterior, acești cationi în exces exercită un moment

adițional în fluidul din por care conduce faza lichidă spre catod. Această mișcare netă a

fluidului față de structura solidului într-un gradient electric impus este denumită

electroosmoză. În practică, viteza electroosmotică este descrisă la scală macroscopică

de relația:

În concluzie, pentru ca electroforeza să fie reproductibilă, este

necesar a se preciza riguros condițiile de lucru precum: calitatea

mediului de separare, proprietățile sistemului tampon,

caracteristicile probei, stabilirea câmpului electric aplicat,

temperatura și timpul de lucru.

Pentru a realiza un experiment de separare și analiză electroforetică sunt

necesare următoarele sisteme:

•Sursă de putere care generează un curent electric continuu, stabilizat;

•Aparatul propriu-zis alcătuit după metoda electroforetică utilizată, având

o construcție variată dar care trebuie să prezinte compartimente pentru

electrozi (din platină, grafit, etc.) și uneori sisteme de termostatare;

•Dispozitive anexe care cuprind: (a) dispozitiv de turnat plăci (amidon,

poliacrilamidă, etc.); (b) cuve de fixare, colorare, spălare (decolorare);

(c) sistem de uscare (uneori cu aer cald); (d) sisteme de evaluare optică

(spectrofotometru cu sistem de baleiere, densitometru cu lungime de

undă fixa, cu sistem de reflexie sau fluorescență, sisteme video de

preluare a imaginii și de analiză a gelurilor; (e) dispozitive specifice.

APARATURA UTILIZATĂ LA

SEPARĂRILE ELECTROFORETICE

ELECTROFOREZA ÎN MEDIU LIBER

Prin definiție, electroforeza în mediu liber se bazează pe deplasarea liberă a

componentelor cu mobilități diferite dintr-un amestec sub acțiunea unui câmp electric

exterior. În acest context, între diferitele componente se formează suprafețe de

separare (fronturi - de unde și denumirea de electroforeză frontală). Aceste fronturi

pot fi observate prin modificarea bruscă a indicelui de refracție (ca și în cazul

ultracentrifugării). Prin măsurarea acestui indice de refracție de-a lungul celulei

electroforetice se obțin diagrame electroforetice denumite diagrame Schlieren. Din

deplasarea fronturilor se calculează vitezele de migrare.

Tehnica este pretabilă la automatizare și computerizare, fiind de asemenea utilizată la

separarea componentelor în flux continuu (proteine, organite celulare, celule).

Aparatura utilizată în electroforeza în mediu liber are la bază aparatul Tiselius,

care are forma literei U, însă aparatele moderne au modificări la sistemul de

electrozi (reversibili), la modul de alimentare cu soluție tampon, modul de

încărcare a probei, modul de înregistrare a vitezei de deplasare.

Părțile principale ale aparatului sunt reprezentate din (a) compartimentul de

electrozi; (b) celula electroforetică; (c) sistemul de termostatare; sistemul de

înregistrare.

Celula electroforetică este alcătuită din trei sectoare care se pot deplasa lateral prin

glisare. Modul de încărcare cu probă este prezentat în figura de mai jos. Separarea

se realizează la temperaturi scăzute (2 - 4oC) la o diferență de potențial de 4-10

V/cm timp de 6 ore.

Să presupunem că avem un amestec de două componente PA și PB (pot fi luate în

discuție două proteine) cu mobilități diferite (µA ˃µB) care se deplasează în aceeași

direcție.

Dacă în momentul inițial concentrația celor două proteine este identică pe tot

parcursul tubului electroforetic, după cum semnalul la sistemul optic este constant.

După introducerea în câmp electric, proteina PA, cu mobilitate mai mare va migra

mai rapid spre anod, îmbogățind frontul de solvent dar sărăcind coada tubului

(figura de mai jos)

Principiul de separare a două

componente prin electroforeză în

mediu liber.

După trecerea unui timp suficient de mare proteina PA se va concentra în fronul

de electroforeză, iar proteina PB va migra după aceasta. Dacă se reprezintă

grafic semnalul primit de sistemul optic se realizează o diagramă Schlieren

(figura 2.3).

Diagrama Schlieren pentru două componente

(PA și PB) separate prin electroforeză în mediu

liber (c=concentrație, n=indice de refracție). .

Prin derivatizarea concentrației sau a indicelui de refracție rezultă o

electroforegramă cu peak-uri electroforetice.

AVANTAJELE UTILIZĂRII ELECTROFOREZEI

FRONTALE

De la introducerea electroforezei în mediu liber (free-flow electrophoresis, FFE), în anii 1960,

această metodă de separare și-a găsit o poziţie permanentă printre metodele de analiză şi

preparative în biochimie precum şi în chimie pentru separarea, de exemplu, a celulelor,

organitelor celulare, a peptidelor, proteinelor, a compușilor anorganici și organici. În FFE,

substanţe de analizat sunt separate în mod continuu într-un câmp electric aplicat perpendicular

peste un strat subțire de tampon transportor în flux continuu după cum se observă în figura

urmatoare.

Un amestec de probă este injectat în fluxul continuu de electrolit transportor, iar după un timp de

migrare, componente, diferit încărcate, se împart pe culoarele de migrare diferite care pot fi în

continuare colectate la capătul aparatului.

Sistemele FFE disponibile la scară largă în comerţ au fost iniţial dezvoltat ca sisteme de curățare

a unei probe, de exemplu, ca o treaptă de Prefracționare înainte de a o electroforeză

bidimensională. În continuare au fost dezvoltate mini sisteme cu dimensiuni reduse de FFE care

se pot cupla la spectrometrul de masă sau la cromatograful de lichide și care permit separarea

continuă cu posibilităţi de detectare a on-line. Această combinaţie de FFE, ca metodă pentru

separarea continuă cu detectare on-line, permite monitorizarea în timp real a analitului, în cazul

probelor biologice ale unor pacienţi, produşi de reacţie, etc. Sistemele rămân în continuare

complicate și sunt încă lente în funcţionare, totuși utilizarea lor pare a fi foarte promiţătoare.

Aparatele electroforetice care funcționează după principiul curgerii libere (frontale) în formă

miniaturizată (µ-FFE) și-ar putea găsi aplicații în construcția unor aparate miniaturizate portabile

de monitorizare a unor pacienți.

O ilustrare a principiului electroforezei

libere frontale și principalele

componente ale unui sistem de

separare electroforetică și micro-

electroforetică. Tamponul curge în flux

laminar într-un film continuu de 0,3 mm,

de sus în jos sub acțiunea forței

gravitaționale. Proba se introduce

lateral. Sub acțiunea câmpului electric,

componentele probei se deplasează

spre anod lateral și totodată de sus în

jos, odată cu tamponul.

Spitalul universitar din Basel

Miniaturizarea FFE implică mai multe avantaje mai ales având în vedere

volumul eşantionului şi de viteză de separare. În contrast cu volumele de

ordinul mililitrilor de probă consumate de tehnicile convenţionale de

dispozitivele FFE, microsistemele FFE au nevoie doar de câteva zeci de

nanolitrii până la câteva sute de microlitri de probă. Acest lucru este deosebit

de util în analizele clinice, în cazul în care de multe ori sunt disponibile numai

volume scăzute de probă biologică. Mai mult, timpul de analiză scade de la

câteva ore-zeci de minute, la câteva secunde în cazul timpului de analiză

microdispozitive FFE

DEZAVANTAJELE ELECTROFOREZEI FRONTALE

Dintre dezavantajele electroforezei frontale se pot enumera:

•Aparatura necesară;

•Amestecarea zonelor datorită difuziunii, curenților de convecție, motiv pentru care

este strict necesară existența unui sistem de termostatare;

Existența unor anomalii de interpretare. Astfel, suprafața peak-ului nu este identică

cu concentrația de proteină. Un alt tip de anomalii sunt legate de migrare. În acest

context viteza de migrare ascendentă nu este identică cu viteza de migrare

descendentă. Acest fenomen, în mod obișnuit, se poate neglija, dar pentru o

electroforeză de mare acuratețe, această anomalie nu este de dorit.

Date recente arată că toate tipurile de electroforeză standard

pot fi aplicate cu succes electroforezei frontale, dintre care

cele mai obișnuite aplicații sunt:

electroforeza frontală în flux continuu,

focalizarea izoelectrică în flux continuu,

izotacoforeza în flux continuu și

electroforeza frontală în trepte de câmp electric

APLICAȚII ALE ELECTROFOREZEI FRONTALE

SEPARAREA POPULAȚIILOR DE CELULE PRIN

ELECTROFOREZĂ ÎN FLUX CONTINUU

Există mai multe dificultăţi implicate în separarea electroforetică de celule sau alte bioparticule.

În primul rând, celulele care urmează a fi separate trebuie să fie prezente ca o suspensie

monocelulară. Agregatele de celule sau ansamblurilor lor nu pot fi separate. Astfel, celule

sanguine, limfatice, sau prezente în alte fluide ale corpului pot fi destul de uşor pregătite, în timp

ce celulele din ţesuturi trebuie să fie mai întâi izolate prin dezintegrare mecanică. Multe proceduri

de izolare a celulelor conduc la o deteriorare a acestora prin disrupere și de eliberare a nucleilor

sau a ADN-ului, oferind preparate care nu pot fi utilizate la separarea electroforetică. Distrugerea

celulelor prin simpla dezintegrare mecanică poate fi redusă prin tratarea țesuturilor cu diferite

enzime combinată apoi cu metode mecanice blânde, cum ar fi amestecare ușoară sau aspiraţie

printr-o pipetă gură largă. Această procedură este singura modalitate de a obţine o suspensie

monocelulară din țesuturi precum cel tumoral. Enzimele care s-au dovedit a fi adecvate pentru

obţinerea de suspensii monocelulare din ţesuturi diferite sunt tripsina, chimotripsina, colagenaza,

hialuronidaza şi dispaza. Cu toate acestea, astfel de enzime, de multe ori au dezavantajul de a

cliva o serie de grupări specifice de suprafaţă, modificând sarcina superficială a acestora, care

reprezintă o condiţie prealabilă pentru separarea electroforetică. Acesta este unul dintre

principalele motive pentru care un număr relativ mic de exemple de succes de separare

electroforetică a celulelor ţesutului pot fi găsite în literatura de specialitate.

O abordare diferită, utilizată la pregătirea prealabilă a celulelor, cum ar fi a nefronilor, care

sunt conectați între ei prin intermediul unor complexe juncționale Ca2+-dependente, este de a

trata țesutul cu complexanți slabi ai Ca2+, precum citratul, EDTA sau EGTA, în combinaţie cu

o agitarea blândă. În general, orice nuclei eliberați în timpul procedurii de izolare pot fi

eliminați prin filtrarea suspensiei pe vată de sticlă introdusă într-o pipetă Pasteur. ADN-ul

liber, care poate apărea în cazul în care nucleii sunt dezintegrați, trebuie să fie de asemenea,

eliminați, deoarece, în câmp electric, conduc la agregarea celulară. Un tratament scurt cu DN-

ază ultrapură (20-30µg/ml) la temperatura camerei timp de 5-10 minute este în general

suficientă.

O altă problemă este alegerea mediului de pregătire şi de separare. Cele mai multe dintre

instrumente de electroforeză în flux continuu prezintă sisteme eficiente de răcire care permit a

se crește tăria ionică a mediului de separare până la 8-10 x 102 µohm/cm. Aceasta este încă o

tărie apropiată condiţiilor fiziologice în care se separă celule în stare viabilă. În scopul de a

atenua pierderea viabilității celulelor acestea trebuie să fie colectate în mai multe soluţii

fiziologice, cum ar fi medii de cultură, după ce acestea au fost separate prin camera

electroforetică. Compoziţia cele mai potrivită a tamponului de separare trebuie să fie

identificată pentru fiecare tip de celule.

ELECTROFOREZA FRONTALĂ

PE COLOANA

O altă aplicație a electroforezei în flux continuu o reprezintă tehnica

denumită electroforeză în flux liber pe coloană, în timp ce metoda cea mai

cunoscută fiind electroforeza preparativă ascendentă.

Aparatul este alcătuit dintr-o coloană cilindrică parțial umplută cu

tampon cu densitate specifică mai mare decât cea a celulelor.

Suprafața astfel realizată va reprezenta stratul de start pe care

celulele sunt depuse (starting cushion).). În continuare coloana se

umple cu o soluție izotonă de tampon.

Densitatea specifică crescută a stratului de start se realizează cu

”Ficoll-Hypaque, sucroză ori apă grea. Electrozii se găsesc în

compartimente separate.

În condițiile aplicării unui câmp electric, celulele vor migra

ascendent spre anod, viteza de migrare a acestora fiind în relație

directă cu sarcina superficială de pe suprafața lor. Separarea durează

circa o oră, formându-se zone distincte care se pot colecta în

fracțiuni. Coloana este termostatată și prezintă o capacitate de circa

2•x106-2•x108 celule/ciclu de separare.

Studying Materials and Processes in Microgravity:

Materials Science

• The Continuous Flow

Electrophoresis

System is used to

separate and purify

biological cells and

proteins.

O importanță deosebită o reprezintă utilizarea electroforezei în mediu liber la

studiul analitic al macromoleculelor biologice. Tiselius, folosind un tampon cu

pH=7,6 a reușit să separeu proteinele serice în patru fracțiuni: albumina, cu

mobilitatea cea mai mare și trei fracțiuni globulinice (α, β și γ, cu mobilități

descrescătoare de la α, la β și γ).). Ulterior s-a observat că la pH=8,6 (la care

toate proteinele serice sunt negative, ele migrând spre anod), globulinele α se

rezolvă ca două subfracții α1 ți α2, iar la introducerea unor ioni de calciu (Ca2+

interacționează cu componentele serice modificând astfel mobilitatea lor) într-un

tampon veronal, fracția β se separă în două componente:β1 și β2.

În mod curent, electroforeza în mediu liber se utilizează la separarea: (a)

celulelor intacte (de exemplu a celulelor sanguine); (b) a organitelor celulare

(lizozomi, mitocondrii, aparat Golgi); sistemelor de membrane celulare.

Procedeul este utilizat la studiul adezivității bacteriilor, la purificarea

plasminogenului tisular exprimat în drojdii, la separarea celulelor transformate și

clonate, fiind utilizată în tehnologia anticorpilor monoclonali.

Prin utilizarea unei celule electroforetice în flux liber orizontale

(figura alăturată) procedeul se utilizează la studiul eritrocitelor

umane din sânge periferic în cazuri normale și patologice (malarie),

în studiul celulelor imunocompetente T și B și a celulelor dendritice,

la diagnosticarea și clasificarea unor leucemii și monitorizarea

tratamentului aplicat precum și la urmărirea efectelor antitumorale

ale unor medicamente. S-a obținut astfel un medicament cu structură

de polizaharid extras din Coriolus versicolor (familia

Basidomicetae) denumit krestin cu efect antitumoral și reversor

(care reinstaurează comportamentul normal al limfocitelor,

readucându-le în limite normale funcțiile leucocitelor și

macrofagelor).).

Prezentarea schematică a reducerii selective și

masive a sarcinii electrice superficiale la unele

populații celulare cu ajutorul unor anticorpi

specifici în cazul separării celulelor cu mobilități

electroforetice apropiate sau identice.

•ELECTROFOREZA ZONALĂ

În momentul în care Tiselius (1937) a publicat lucrarea sa clasică

referitoare la electroforeza în mediu liber. în 1937, Konig (1937)

a indicat posibilitatea de a utiliza hârtia de filtru pentru separarea

electroforetică a amestecurilor de proteine. În deceniul al cincilea

din secolul trecut o serie de cercetători au descris variate tehnici

care au utilizat hârtia ca agent anticonvectiv pentru separarea

amestecurilor de aminoacizi, peptide, proteine și alte substanțe.

Utilizarea hârtiei de filtru sau a altor medii suport solide introduc de asemenea o serie de

factori care implică mobilitatea electroforetică a moleculelor încărcate electric,

electroosmoza, curgerea hidrodinamică a lichidului, adsorbția, efecte cromatografice și

de stivuire. Din acest punct de vedere, electroforeza zonală nu poate fi utilizată pentru

determinarea precisă a mobilității electroforetice, a punctului izoelectric sau a altor

proprietăți de migrare a substanțelor fără o procedură de standardizare adecvată pentru

tehnicile particulare. Suportul ideal ar trebui să fie acela care nu prezintă impurități, este

chimic inactiv în ceea ce privește substanțele separate, nu prezintă activitate adsorbtivă

și prezintă cel mai scăzut efect electroosmotic. Nici o hârtie de filtru nu îndeplinește în

totalitate toate aceste condiții. Totuși, noi medii suport au fost introdusă care posedă

proprietăți mult mai favorabile, precum acetatul de celuloză, gelurile de agaroză și de

poliacrilamidă

În prezent se folosesc o varietate de medii suport stabilizante care se pot împărți în:

•Medii suport cu structură capilară, care

(a) prezintă proprietăți anticonvective - dacă secțiunea capilară este suficient de mică (într-un canal cu

secțiune circulară curgerea descrește cu puterea a 4-a a razei);

(b) sunt stabile fizico-chimic;

(c) prezintă proprietăți mecanice bune;

(d) sunt netoxice;

(e) sunt ieftine și astfel accesibile;

(f) sunt relativ inerte – este cazul hârtiei de filtru, a acetatului de celuloză, a mediilor specifice

cromatografiei pe strat subțire (celuloza microcristalină, silicagelul, alumina, silicagelul);

(g) au proprietăți electroforetice specifice bune – nu interacționează decât foarte slab cu compușii pe care

îi separă (excepție face hârtia de filtru la care se observă o adsorbție nespecifică).

În cazul acestor medii suport, proteinele serice se separă în albumină și patru sau mai multe

componente globulinice dar cu o rezoluție inegală, cu o poziție relativă a fracțiunilor (zonelor)

asemănătoare.

•Medii suport care, datorită structurii poroase caracteristice, participă activ în separare. În acest caz

separarea electroforetică are loc atât densității sarcinilor electrice cât și a efectului de cernere

moleculară. Astfel, două particule cu aceeași sarcină electrică dar cu dimensiuni diferite, vor fi separate

ca zone distincte, particulele mai mici migrând mai ușor. De exemplu, dacă prin electroforeză pe hârtie

proteinele serice se separă în fracțiile albumină, α1-, α2-, β- și γ-globuline, după electroforeza pe gel de

amidon se identifică circa 15 zone proteice. Din categoria acestor medii fac parte gelul de amidon, gelul

de agaroză (unde efectul de sită moleculară apare la concentrații mari de gel) și gelul de poliacrilamidă

(care prezintă avantajul de a putea alege dimensiunea porilor).

•Medii afine, pe care le vom examina într-un capitol special.

ELECTROFOREZA PE HÂRTIE

În acest caz, hârtia de filtru reprezintă mediul stabilizant care posedă următoarele caracteristici:

(a) conține minimum 96% celuloză, insolubilă în NaOH concentrat;

(b) prezintă o capacitate mare de imbibiție (absorbție) - mărimea acestei proprietăți este dată de

firma producătoare și trebuie să fie de două ori mai mare decât greutatea sa;

(c) este lipsită de metale grele (de exemplu Pb), care modifică conductibilitatea sa electrică; (are

o structură uniformă a fibrelor de celuloză, unidirecționate;

(d) prezintă o densitate caracteristică a fibrelor - o hârtie de filtru fină sau medie prezintă o

textură deasă care va conduce la separări în zone bine delimitate, dar într-un timp mai mare, în

timp ce o hârtie de filtru grosieră se îmbibă rapid cu cantități mari de tampon iar separările vor

conduce la zone neclare, într-un timp mai scurt;

(e) la un pH acid și la tării ionice scăzute apar fenomene de adsorbție a proteinelor pe suportul de

hârtie de filtru ceea ce va conduce la formarea benzilor cu coadă.

Tamponul, reprezintă de asemenea o componentă importantă în sistemul electroforetic. În cazul

electroforezei pe hârtie, tamponul se află în compartimentul electrozilor, la un nivel egal și

constantă, evitându-se fenomenul de sifonare. Menținerea evaporării tamponului în limite

rezonabile se realizează prin:

(a) scăderea forței ionice, legată de efectul Joule și de efectul de flux capilar;

(b) saturarea compartimentului de separare cu vapori;

(c) adăugarea de propilenglicol sau glicerină (5-15%) în soluția tampon sau

(d) în cazul electroforezei de înaltă tensiune, prin plasarea hârtiei de filtru în solvenți hidrofobi.

Valoarea pI este specifică unei proteine și ea depinde

de natura solventului și de concentrația electrolitului

(a nu se confunda pI cu punctul izotonic, definit ca

valoarea pH-ului unei soluții apoase de proteină după

îndepărtarea tuturor ionilor necoloidali din soluție).

În separarea electroforetică este necesară o conduce

cu mare atenție pH-ul și tăria ionică a soluției tampon.

De obicei tăria ionică a soluției tampon este cuprinsă

între 0,06-0,1. Soluțiile tampon cu o tărie ionică mai

mică de 0,06 nu tamponează suficient în timp ce

soluțiile cu o tărie ionică mai mare de 0,1 conduc la

un efect Joule, marcant, ceea ce conduce la o degajare

semnificativă de căldură.

Echipamentul utilizat în electroforeza pe hârtie

consistă din două componente principale: o cameră

(tanc) electroforetic și o sursă de putere electrică.

Tancurile electroforetice sunt variate în construcție și

depind de aranjamentul pe orizontală sau verticală a

benzii de hârtie electroforetică precum și de

necesitățile caracteristice ale unor experimente

particulare.

Dependența dintre pH-ul soluției și

sarcina electrică a două polipeptide,

insulina umană și fragmentul

polipeptidice des-B23-B30-

octapeptid insulină (DOI).).

Tancul electroforetic comun utilizat

la electroforeza pe hârtie de voltaj

scăzut este de două tipuri, după cum

hârtia de filtru este așezată. În tipul

orizontal, hârtia de filtru este fixată

orizontal la capetele incintei. La tipul

vertical, hârtia de filtru este așezată

vertical pe o baghetă. La extremități,

banda de hârtie este imersată în vasele

de tampon la aceeași adâncime în timp

ce nivelul tamponului în cele două

compartimente trebuie să fie egal.

Unele aparate prezintă un sistem

labirint prin care comunică, în condiții

speciale, cele două rezervoare,

prevenindu-se astfel fenomenul de

sifonare prin banda de hârtie în timpul

separării electroforetice. Aparatul este

de asemenea prevăzut cu un capac,

realizat de obicei din plexiglas.

Reprezentarea schematică a tipurilor de tancuri utilizate la

electroforeza pe hârtie: (a) tip orizontal; (b) tip vertical; (c) tip cu

banda de hârtie imersată; (d) tip cu banda de hârtie închisă.

Cele mai bune rezultate sunt obținute cu electrozi obținuți din platină în formă de fir sau folie,

care pot fi utilizați în variați electroliți la diverse pH-uri. Pentru a se preveni contaminarea cu

produși de electroliză care se eliberează la nivelul electrodului, banda de hârtie de filtru nu

trebuie să fie introdusă direct în compartimentul electrozilor, ci într-un compartiment adiacent

acestora, iar contactul electric este realizat prin intermediul unor bucăți din hârtie de filtru sau

bumbac a unor punți din agar sau printr-un sistem special de labirint.

Volumul de electrolit-tampon în vase trebuie să fie suficient de mare pentru a preveni influența

produșilor de electroliză asupra separării electroforetice. Volumul V care transportă ionii de

hidrogen în timpul unui experiment poate fi calculat astfel:

unde UH+ reprezintă mobilitatea H+, I este intensitatea curentului (Amperi), t este timpul

(secunde) iar K este conductivitatea soluției. Astfel, în cazul unor electroliți diluați și la timpi

mari de separare, tamponul trebuie să circule continuu între compartimentele cu electrozi.

Sursa de curent trebuie să fie capabilă să ofere un curent sau un voltaj constant, preferabil

ambele. Pentru cele mai comune separări sursa de curent adecvată trebuie să aibă capacitatea de a

oferi 50 mA și 500V. Intensitatea maximă a curentului care poate fi utilizată pe unitatea de arie a

benzii de hârtie de filtru supuse separării electroforetice poate fi calculată astfel:

unde I (mA) reprezintă intensitatea curentului, P (cm2) este aria benzii de hârtie

de filtru măsurată între suprafețele de electrolit și compartimentele electrozilor

iar U (V) este potențialul electric.

În general tensiunea maximă de lucru este de 400 V, cu o cădere maximă de

15V/cm (în medie de 2-10V/cm).

Pentru determinări cantitative substanțele separate pe benzile din hârtie de filtru pot fi utilizate

atât metode directe cât și cele indirecte. În cazul metodelor directe, substanța care trebuie să fie

măsurată trebuie să absoarbă radiație UV sau să fie fluorescentă ori radioactivă. În metodele

indirecte zonele separate trebuie să fie mai întâi colorate iar absorbanța măsurată cu ajutorul unui

densitometru racordat. Au fost construite o serie de densitometre semi - sau total automatizate

care trasează grafic intensitatea luminii transmise sau reflectate de pe o electroforegramă colorată

versus distanța de-a lungul benzii electroforetice în formă de curbe electroforetice. Aria din

interiorul acestor curbe este determinată fie automat printr-o scalare integrată, fie cu ajutorul unui

planimetru ori prin tăierea ariilor reprezentate și cântărirea lor. Sunt descrise de asemenea

scannere computerizate care permit analiza cantitativă completă a unei electroferograme în câteva

secunde. Aria din interiorul acestor curbe este determinată fie automat printr-o scalare integrată,

fie cu ajutorul unui planimetru ori prin tăierea ariilor reprezentate și cântărirea lor.

Aplicarea probei se face pe banda de hârtie de filtru îmbibată

cu soluție tampon, fixată în aparat, după crearea unui mediu

saturat și stabilizat în vapori, cu ajutorul unei pipete capilare,

seringi Hamilton (1-5µl), micropipete, fără a zgâria hârtia. Se

folosesc două tipuri de spotări: în picătură sau în linie.

Profilul electroforetic al proteinelor serice

separate pe hârtie, de filtru, colorate cu

amino black 10B și scannate cu un

densitometru semiautomat.

Albastru de brom fenol

Pentru urmărirea separării electroforetice

se apelează la un colorant ca substanță de

referință. De obicei se utilizează albastru

de bromofenol, un colorant trifenilmetanic

Cei mai folosiți coloranți utilizați în evidențierea componentelor proteice separate

prin electroforeză pe hârtie sunt amino black 10B, Azocarmine B, Light Green SF și

Ponceau Red 2R.

Structura chimică a colorantului diazolic

Amido black 10B, utilizat în practica

biochimică la colorarea totală a proteinelor.

Structura chimică a azo-colorantului Ponceau 2R

(Xylidine ponceau, Ponceau G, Red R, Acid Red

26, Food Red 5).

Componentele lipoproteice ale serului sanguin pot fi detectate pe banda de hârtie prin

colorare cu Sudan Black B ori Oil Red O.

Structura chimică a colorantului diazo Sudan

Black (10)B.

Structura chimică a colorantului diazo Oil Red O

(Solvent Red 27, Sudan Red 5B, C.I. 26125,

C26H24N4O).).

Prin utilizarea acestor proceduri se pot separa și detectate patru fracții lipoproteice:

chilomicroni, α-lipoproteine, pre-β-lipoproteine and β-lipoproteine. Totuși, cea mai

bună rezoluție a fracțiilor lipoproteice din serul sanguin se obțin pe gelul de agaroză ori

pe membrane de acetat de celuloză.

Componentele glicoproteice sunt detectate pe hârtie cu ajutorul

reactivului Schiff-acid periodic, în cazul glicoproteinelor neutre,

difenilamină pentru mucoproteine și glicozaminoglicani,

albastru de toluidină și Azure A pentru glicoproteine acide,

alcian blue pentru glicozaminoglicani acizi.

Pe un ser normal se regăsesc 5-6 fracții glicoproteice, a căror concentrație se

modifică în timpul proceselor patologice ale ficatului, rinichilor, sistemului nervos

central și în timpul maladiilor tumorale.

După colorare, excesul de colorant este îndepărtat de pe banda de hârtie prin spălare cu

un solvent convenabil. Pentru o decolorare mai eficientă se poate adăuga detergent la

soluția de solvent ori spălarea se realizează la o temperatură de aproximativ 80°C.

ELECTROFOREZA PE HÂRTIE LA TENSIUNE ÎNALTĂ

În acest caz tensiunea aplicată este de circa 50-215V/cm, iar la bornele sursei de curent

tensiunea a redresorului este de 10 kV. Se poate afirma că o creștere de la 5V la

100V/cm (adică o creștere de 20 de ori) viteza de migrare crește de asemenea de 20 de

ori dar cantitatea de căldură degajată va crește de 202, adică de 400 de ori, motiv pentru

care este absolut necesară o termostatare uniformă (o termostatare neuniformă conduce

la apariția zonelor de semilună-marginile hârtiei se usucă mai tare. Se mai poate nota că

la concentrații mari de probă rezoluția de separare este scăzută și se vor obține zone cu

coadă.

Electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se utilizează la separarea aminoacizilor (se

produce în tampon acid formic-acetat de sodiu), a peptidelor (separarea se realizează în

tampon piridină-acid acetic (la un pH cuprins între 3,0 și 5,0), glucidelor sau a bazelor

azotate purinice și pirimidinice.

Sub forma bidimensională, electroforeza pe hârtie la tensiune înaltă se poate combina

cu cromatografia pe hârtie.

ELECTROFOREZA PE STRAT SUBȚIRE

În momentul introducerii cromatografiei în strat subțire și a electroforezei în strat

subțire, cu ceva timp în urmă, comoditatea și sensibilitatea crescută (de la 10 la 50 de

ori) în comparație cu tehnicile pe hârtie au fost considerate metode promițătoare

pentru analizele compoziției proteinelor și a acizilor nucleici. Electroforeza în strat

subțire combinată cu cromatografia în strat subțire a reprezentat o metodă de rutină

pentru separarea a unor mici cantități de aminoacizi, nucleotide, ioni anorganici și a

altor substanțe cu masă moleculară mică.

Utilizarea mediilor suport de strat subțire oferă următoarele avantaje față de tehnicile

care utilizează hârtia:

(1) necesită un echipament mult mai simplu pentru preparare;

(2) rezoluția este în general superioară;

(3) separările se pot realiza la potențiale înalte în perioade de timp foarte scurte;

(4) sunt necesare mici cantități de probă, putându-se realiza mai ușor separări atât

cantitative cât și micro-preparative;

(5) probele nu trebuie desalinizate, ele se aplică direct pe strat. Astfel, ureea și

glucidele rămân în start, ionii migrând rapid;

(6) se pot utiliza reactivi agresivi de spray-ere și în acest mod se coboară limita de

detecție.

Din punct de vedere al echipamentului

utilizat, se folosesc aparate convenționale

de tip orizontal, similare celora utilizate

electroforeza pe hârtie, acetat de celuloză

ori pe gel de agar. Pentru separări la

potențiale mai înalte și pentru separări

bidimensionale, s-au descris diverse

camere prevăzute cu sisteme de răcire.

Aparatul pentru electroforeză pe strat

subțire este prezentat schematic în

alăturată. El posedă un plan orizontal

sub care se află un sistem de răcire cu

apă, pe care se așează placa (cu

dimensiuni de 10 x 10 sau 20 x 20 cm) cu

strat subțire (circa 250-300 µm) care este

pusă în contact cu tamponul prin

intermediul unor bride din hârtie de filtru.

Aparatul este acoperit cu o placă de

sticlă. Mica distanță dintre placa cu strat

subțire și placa care acoperă aparatul

acționează ca o cameră umedă și previne

uscarea stratului subțire.

Cameră pentru electroforeză în strat subțire. (a)

placă orizontală prevăzută cu system de răcire; (b)

foițe de izolare; (c) strat subțire pe placă de sticlă;

(d) bride de hârtie (Whatman 3 MM); (e) placă de

sticlă, 5 mm grosime; (f) compartimente pentru

tampon și electrozi; (w) sistem de răcire.

Hunter Thin Layer Peptide Mapping

Electrophoresis System, CE. For high

resolution two dimensional tryptic peptide

mapping and phosphoamino acid (PAA)

analysis

În cazul separărilor efectuate pe ser sanguin, volumul de probă este în funcție de cantitatea de

creatinină. În general proba spotată trebuie să conțină maximum 5 µg de creatinină. Timpul de

separare este de aproximativ 25-30 minute la o tensiune de 30 V/cm.

Proteinele sau alte substanțe macromoleculare pot fi separate prin utilizarea gel filtrarea pe strat

subțire-electroforeza pe strat subțire. În funcție de masele moleculare ale probei, se poate utiliza

Sephadex Superfine (de la G-25 la G-200). Sephadex-ul, echilibrat cu tamponul adecvat, este

depus pe o placă de sticlă. Placa cu strat subțire este plasată într-un aparat adecvat ca cel

prezentat în figura de mai jos, fiind echilibrată cu un tampon care curge prin stratul de gel.

Stratul trebuie conectat cu un rezervor prin intermediul unei bride din hârtie de filtru Whatman

No. 1 la capătul superior, iar placa se înclină într-un unghi de 15-20o față de orizontală.

Aparat pentru o separare bidimensională

utilizând gel filtrarea și electroforeza pe

strat subțire de Sephadex. (a) sistem

suport; (b) fantă pentru conexiunea prin

hârtie de filtru; (c) sistem de răcire a

platformei cu apă; (d) bazin care conține

tampon ori solvent utilizat la dezvoltarea

electroforegramei; (e) sistem de schimbare

a poziției suportului plăcii; (f) orificii și (g)

șuruburi de prindere.

O bucată de hârtie de filtru Whatman 3MM este atașată

la capătul inferior pentru a îndepărta fluidul filtrat. După

finalizarea filtrării, placa este aranjată orizontal iar

electroforeza este realizată pe o direcție perpendiculară

față de prima dimensiune. Pentru a obține o imagine a

spoturilor proteice, placa este acoperită cu grijă cu o

bucată de hârtie de filtru Whatman No. 1 și după 5 minute

de contact, hârtia este îndepărtată de pe stratul subțire,

uscată la 100°C și colorată cu amino black ori un alt

colorant specific proteinelor.

Gel filtrarea pe dextran/electroforeza pe strat subțire a

fost utilizată la separarea proteinelor serice, a diferiți

coloranți tetrazolici, a unor aminoacizi urinari și peptide

și alte substanțe.

Electroforeza pe folie de acetat de celuloza

Dacă inițial membranele de acetat de celuloză au fost produse pentru filtrare, utilizarea membranelor de

acetat de celuloză ca mediu suport a fost sugerată de Kohn în 1957. Foliile de acetat de celuloză se

obțin prin tratamentul celulozei cu anhidridă acetică, iar produsul, triacetat de celuloză este cel mai des

utilizat pentru electroforeză.

Membrana (cu o grosime de cca. 12 µm și cu un diametru al porilor de cca. 0,4 µm) este un material

omogen care conține numai urme de impurități.

Este de culoare alb opacă, cu suprafață netedă și uniformă.

La microscop se observă o structură microporoasă care împiedică difuziunea zonelor sau a spoturilor,

din acest motiv se obține o bună separare a proteinelor plasmatice chiar la o tensiune mică.

Puritatea materialului este mare, lipsesc hemicelulozele, lignina iar metalele grele sunt prezente

numai în urme. Față de hârtia de filtru, adsorbția proteinelor și a altor substanțe pe acest mediu suport

este minimă, deci fenomenul de coadă sau de aspect de cometă fiind practic eliminat.

Timpul de separare este mai scurt iar membranele de acetat de celuloză sunt ideale pentru tehnicile de

imunodifuzie și imunoelectroforeză.

Dintre dezavantajele utilizării membranelor de acetat de celuloză enumerăm prețul mai mare față de

hârtia de filtru, necesitatea de a acorda mai multă atenție pentru obținerea unor rezultate reproductibile.

În prezent s-au adus îmbunătățiri ale produsului inițial prin apariția acetatului de celuloză gelatinizat

(Cellogel).

Foliile (strips-urile) din acetat de celuloză sunt insolubile în apă, alcooli, eteri, acizi și baze diluate și

în majoritatea hidrocarburilor, dar sunt ușor solubile în fenol, acid acetic glacial, diclorometan și

acetonă, și în mod particular în cloroform:etanol 90:10 (v/v) și diclorometan:acetonă 50:50 (v/v).

Strips-urile pot fi transformate în translucide (transparente) prin imersia lor în ulei din semințe de

bumbac, decalină, ulei de parafină ori ulei Whitemore 120, care este important pentru scanarea optică a

benzilor colorate de pe foliile de acetat de celuloză. Ele pot fi impregnate și permanent stocate în

glicerol, care previne destrucția spoturilor colorate.

Pentru separări electroforetice de proteine și acizi nucleici s-au introdus membranele de

nitroceluloză. Aceste membrane, cu o mărime a porilor cuprinsă între 0,1-12 µm, au fost

utilizate în mod constant în analizele de acizi nucleici în special a hibrizilor RNA-DNA și

DNA-DNA. Aceștia prezintă o adsorbtivitate selectivă față de proteine și acizi nucleici în

condiții adecvate.

Membranele de dimensiuni dorite sunt așezate într-o placă Petri cu tampon și lăsate să

plutească până la dispariția petelor alb-opace după care se scufundă complet. Membranele

de Cellogel nu necesită aceste precauții, ele putându-se scufunda timp de 10 minute.

Strip-urile din nitroceluloză (5 x 1 cm), când sunt utilizate la electroforeza proteinelor,

trebuie mai întâi tratate timp de 5 minute cu o soluție de Tween 60, 2% preparată într-un

tampon compus din veronal, citrat și oxalat, pH=8,6. Astfel, membranele de nitroceluloză

tratate cu detergent nu adsorb proteine și pot fi utilizate pentru separări de proteine în

gradienți înalți de potențial de 15-20 V•cm-1 timp de 10-15 minute.

Membranele îmbibate se plasează imediat în sistemul reglabil și se aplică probele cu ajutorul unei

micropipete sau unui dispozitiv de aplicare simultană a probelor (10-16 probe).) Volumul aplicat de probă

este în funcție de grosimea membranei și de concentrația proteică. Nigrozina (denumită și Indian ink) este

cel mai bun colorant al proteinelor pe folii de nitroceluloză. Un alt colorant utilizat în colorarea proteinelor

este Ponceau S.

La pH neutru și alcalin, RNA migrează rapid în folie spre anod, în timp ce DNA nativ rămâne pe linia de

start. DNA monocatenar denaturat migrează spre anod. Membranele de nitroceluloză cu dimensiuni variate

a mărimii porilor, impregnate cu detergenți ori soluții de albumină serică, pot fi utilizate la separări de

proteine, polinucleotide și nucleoproteine.

Modelul de bază a tancurilor electroforetice utilizate pentru

membranele de celuloză seamănă cu cele utilizate la tehnica

electroforetică pe hârtie. O serie dintre acestea prezintă

sisteme de răcire și pot fi utilizate concomitent pentru

electroforeză pe membrane și pe strat subțire. Ambele

separări se pot realiza atât la voltaje scăzute cât și la cele

înalte. Pentru a minimaliza procesul de evaporare, se poate

adăuga glicerol la soluția tampon. Controlul evaporării se

poate realiza și prin folosirea de soluții tampon cu tării ionice

mici (o concentrație mică a soluției tampon favorizează

creșterea vitezei de migrare în paralel cu scăderea efectului

Joule.

Astfel, dacă tăria ionică este dată de relația:

După electroforeză strip-ul de acetat de celuloză este uscat la 100°C

timp de aproximativ 10 minute.

Metodele de colorare și detecție utilizate sunt asemănătoare cu cele

utilizate la hârtia de filtru.

Sunt de preferat ca soluțiile apoase de colorant față de soluțiile

alcoolice, concentrația acestora fiind deobicei mai scăzută față de cea

aplicată pentru hârtia de filtru.

Membranele din acetatul de celuloză și nitroceluloză sunt ideale

pentru examinările absorbțiometrice și fluoro-densitometrice, precum și

de detecție a substanțelor radioactive prin autoradiografie ori prin

metode de scanare directă.

MICROELECTROFOREZA PE ACETAT DE CELULOZĂ

Benzile (strips-urile) de membrane (acetat de celuloză sau nitroceluloză) de mici

dimensiuni (50 x 10mm) disponibile dau posibilitatea efectuării a analizei proteice

complete pe 0,25 µl de ser sanguin (electroforeza microzonală, microelectroforeza pe acetat

de celuloză) în 50 minute.

Procedeul de miniaturizare prin reducerea dimensiunilor membranei, a probelor și a

timpului se bazează pe faptul că mobilitatea electroforetică este relație directă cu distanța de

migrare și invers proporțională cu timpul și intensitatea câmpului electric aplicat după

relația:

Aplicații ale electroforezei pe membrane de acetat de celuloză

Membranele de celuloză sunt utilizate în mod comun pentru separarea proteinelor

plasmatice, glico- și lipoproteinelor, hemoglobinelor, enzimelor și a altor proteine.

Ele putând fi folosite în metodele analitice și în scopuri preparative.

Metoda electroforetică pe membrane de acetat de celuloză este încă cea mai des

utilizată în diagnosticarea unor maladii. Tabelul următor prezintă profilul

electroforetic obținut în urma separării pe Cellogel al unei proteinograme din ser

sanguin normal.

Fracția electroforetică analizatăProcente

%

Deviație

standard

Albumine 61% ± 1,5

Alfa 1-globuline 2,5% ± 1,5

Alfa 2-globuline8%

± 2,0

Beta globuline 10% ± 2,0

Gama globuline 16% ± 3,5

Analiza proteinogramei este deosebit de importantă în identificarea unor maladii prin analiza

concentrației unor proteine serice. Astfel prin interpretarea unei proteinograme se pot depista:

-hipergamaglobulinemiile (creșterea tuturor claselor de imunoglobuline);

-hipogamaglobulinemiile (diminuarea tuturor claselor de imunoglobuline);

-mielomul sau macroglobulinemia lui Waldenström (apariția unei benzi foarte omogene care

semnifică prezența unei proteine monoclonale);

-sindromul nefrotic (hiperexpresia globulinelor α2 și β, cu diminuarea albuminei și a γ

globulinelor);

-ateroscleroza (creșterea β globulinelor);

-poliatrita reumatoidă (creșteri policlonale ale γ globulinelor și creșterea fracției α2 globulinei.

Figura următoare prezintă profilul unei

electroforegrame obținute după procesarea

electroforetică a unei probe de ser sanguin normal.

Tehnica electroforetică care implică membranele de acetat de celuloză

este de asemenea utilă în monitorizarea unui tratament aplicat. Ea este

superioară tehnicilor imunologice în determinarea izoenzimelor

enolazei (procedeul durează circa 10 minute iar necesarul de ser este

de circa 10µl), activitatea enzimatică fiind determinată în aproximativ

5 minute prin bioluminiscență.

Electroforeza pe membrane de acetat de celuloză a fost și este utilizată la studiul comparativ

al unor proteine serice la om și la alte animale.

A fost folosită la studiul histonelor (proteine bazice ale cromatinei la eucariote), la studiul

hemoglobinelor normale și patologice când s-au evidențiat la pH=8,4, hemoglobina A, Hb F, Hb

S, Hb S și Hb C de Hb E și Hb O.

Membranele de acetat de celuloză se utilizează și în tehnicile de imunoelectroforeză,

colorarea efectuându-se în acest caz cu ajutorul AgNO3, iar imunodetecția realizându-se direct,

pe membrană, fără transfer pe o altă membrană de nitroceluloză.

Blocurile de Cellogel (cu o grosime de circa 2,5-5 mm) s-au folosit în scop preparativ, în

acest caz utilizându-se la separare 0,25-1 ml de ser sanguin.

Protéinogramme sérique normal

INTERPRETATION du protéinogramme (2)

Valeurs normales

Causes d‟erreur

sérum hémolysé

présence de fibrinogenen

Inflammation AIGUE (2)

Insuffisance hépatique

(cirrhoses, hépatites fulminantes)

Syndrome NEPHROTIQUE

Hypogammaglobulinémie des

déficits immunitaires

Hypergammaglobulinémie

POLYCLONALE

Hypergammaglobulinémie

MONOCLONALE

Electroforeza pe gel de amidon

Loading samples onto a starch gel for electrophoresis

Electroforeza pe gel din amidon, prima metodă de electroforeză zonală care a pus în

valoare efectul de sită moleculară a mediului suport a fost introdusă de Smithies. Ea a

fost recunoscută drept o tehnică care furnizează mijloace elegante de rezolvare a ionilor

similari și cu mobilități libere identice. Astfel, o matrice de gel - nu și în cazul mediilor

poroase de tipul hârtiei sau a granulelor de amidon - prezintă o structură reticulată care

poate impune o rezistență fricțională apreciabilă la trecerea ionilor, accesul acestora în

structura de rețea fiind dat de mărimea porilor și dimensiunea ionilor care migrează.

Dacă în cazul gelurilor de amidon, domeniul dimensiunii medii a porilor se apropie de

domeniul dimensiunilor proteinelor, fracții proteice variate vor fi întârziate diferențial

într-un grad proporțional cu dimensiunea lor. Ca atare, datorită reticulării fine și având

un efect de sită moleculară, separarea amestecurilor este realizată în astfel de geluri

matrice atât prin dimensiunile, forma, cât și prin diferențele de sarcină electrică.

Amidonul este un polizaharid insolubil în apă. În stare nativă, în prezența apei el se umflă.

Matricea electroforetică se obține printr-o hidroliză parțială când amidonul se convertește într-o

formă care se solubilizează la o temperatură de circa 70oC și care apoi se solidifică într-un gel

ferm la temperatura camerei. Mărimea porilor din gelul de amidon este dată de concentrația

acestuia și de gradul de hidroliză, ea variind într-un domeniu redus prin faptul că nici

concentrații, nici gradul de hidroliză nu pot fi schimbate decât în anumite limite, bine definite,

fără a afecta caracteristicile mecanice ale gelului.

Dacă la început s-a utilizat amidonul din cartof, s-a constatat că rezultate mai bune se obțin cu cel

din orez.

Față de alte medii stabilizante de separare a proteinelor, peptidelor ori a acizilor

ribonucleici, amidonul prezintă o serie de avantaje comparativ cu hârtia, gelatina,

agarul, silicagelul:

(i) Adsorbția celor mai multe proteine pe amidon este neglijabilă;

(ii) Eluția segmentelor de amidon după separarea electroforetică se realizează mai ușor

decât în cazul gelului de gelatină ori agar ceea ce reprezintă un factor important în

scopurile preparative;

(iii) Amidonul formează mai ușor o pastă omogenă cu diverse tampoane față de pudra

de celuloză;

(iv) Electrosmoza este mai mică decât în cazul multor altor medii suport deși acest

fenomen poate cauza o separare slabă, mai ales în cazul când tehnica este cea “de bloc

de amidon” și se realizează în modele de aranjament orizontal.

Electroforeza pe gel de amidon este considerată după unii autori a fi o metodă blândă de

purificare a proteinelor fără șanse de denaturare, putându-se pune alături de metoda salting-out

ori precipitarea cu acizi, alcool sau acetonă. Pe de altă parte, alți autori consideră că din contră, în

timpul electroforezei au loc procese ireversibile de denaturare care conduc la o pierdere

considerabilă de proteină. Chestiunea în cauză se ridică dacă acest proces se manifestă din cauza

dezvoltării de căldură cauzată la intensități de 17-20 mA a curentului electric cu soluții tampon cu

tărie mare. Astfel, procesul de denaturare nu se observă la tării ionice scăzute, rezultatele fiind

satisfăcătoare.

Amidonul este utilizat ca mediu suport

în trei tehnici electroforetice zonale:

Electroforeza clasică pe gel de

amidon, descrisă pentru prima dată de

Smithies;

Electroforeza pe coloană, dezvoltată

de către Carlson și independent de

Flodin și Porath;

Electroforeza pe bloc de amidon,

introdusă de Kunkel și Slater.

Aparatura utilizată în electroforeza pe

gel de amidon este de două tipuri: I)

pentru geluri orizontale; II) aparate cu

gel vertical. Ambele aparate sunt

alcătuite de 2 rezervoare cu soluție

tampon, compartimentate pentru a

împiedica produșii de electroliză să

intre în contact direct cu gelul.

Contactul dintre suport și gel se

realizează prin intermediul unor bride

din hârtie de filtru sau tifon (bumbac)

iar legăturile dintre compartimente se

formează în același mod.

Godeurile se efectuează cu ajutorul unui pieptene din plexiglace care se plasează peste

stratul de amidon înainte de gelificare și se îndepărtează după aceasta. Dimensiunile

godeelor sunt de 15-30 mm lungime, 1 mm lățime și 50 mm adâncime.

În general separări bune sau foarte bune se pot obține la temperatura camerei la o

tensiune de 6V/cm timp de 6 ore sau la o temperatură de 5oC și la o tensiune de

10V/cm, în sistem de tampon continue sau discontinue.

După separarea electroforetică sunt recomandate diverse proceduri de colorare a

gelurilor. Astfel, gelul este extras cu grijă din cuva de electroforeză și tăiate paralel cu

suprafața în două părți egale. Colorarea se realizează prin turnarea colorantului peste

suprafața secționată. O serie de lucrări prezintă colorația cu soluție de Amido black 10B

în metanol:apă:acid acetic glacial (50:50:10) timp de l0-30 min.

Lipoproteinele pot fi colorate prin incubare timp de 16 ore într-o o soluție alcătuită din: 1,2 g

Sudan black 10B, 40 ml de apă distilată, 600 ml etanol și 2 ml NaOH,. Decolorarea completă se

realizează după 6-8 zile după imersare într-o soluție de etanol 60%. De asemenea, pentru a

vizualiza lipoproteinele se poate utiliza o soluție saturată de Oil Red O pregătită într-un amestec

metanol:apă:acid acetic glacial (60:10:30).).

Proteinele care conțin cupru precum hemocianina, sunt detectate prin plasarea gelului secționat

pentru 3-4 ore într-o soluție care conține 50 ml acetat de sodiu l0% și 3 ml de soluție ditio-

oximidă, 0,1% preparată în alcool. Apariția unei colorații verde-închis este un rezultat pozitiv.

Hemoglobinele sunt detectate cu reactiv benzidină sau cea descrisă pentru electroforeza pe gel de

agar. Hem-proteinele pot fi de asemenea colorate cu o-tolidină.

Pentru complexul acestor proteine cu hemoglobina care prezintă o activitate peroxidază-like, o-

dianisidina pare a fi cel mai bun reactiv ea formând o colorație brună.

o serie de aplicații ale electroforezei pe gel de amidon

Material biologic TamponTărie ionică

(Molaritate)pH V mA Timp (ore)

Lipoproteine serice normale și patologiceBarbital

Fosfat

0,1

0,58,6 100-500

25-60

24

Proteine lenticulare bovine Barbital 0,1 8,6 400 - 24

Tuberculo-proteine Barbital 0,1 8,6 360 17-20 30

Fosfataza alcalină intestinală Barbital 0,02 8,6 200 7-9 12

Hormonul de creștere (somatotropină)Acetat

Carbonat

0,017

0,1

4,00

11,2

175

175

30

30

24

72

β-Galactozidză Pirofosfat 0,025 8,5 370 1 16

Chimotripsinogen Cacodilat 0,1 6,6 3,2V/cm - 65

Tirozinază de mamifere Barbital 0,1 8,5 300 11 19

Tripsină Acetat 0.1 4,00 /300 - 10

Hemocianină Borat0,02M borat +

NaOH 0,008M 8,0/3 92V/cm - 12

Hemoglobină Borat 0,05 M 8,5 6V/cm - 5

Plasmă umană Borat 0,025 - 450 - 18

ELECTROFOREZA PE GEL DE AGAROZĂ

Agaroza este singurul hidrocoloid neadeziv care și-a găsit o multitudine de utilizări în științele

separatologice după prepararea sa de către Araki (1937) ca un component aparent fără grupări sulfat,

din agaropectina, bogată în astfel de grupări, la rândul ei obținută din agar.

Cele două componente se separă prin acetilare și dizolvare în cloroform când agaroza acetilată este

solubilă. Încă din secolul al XVII-lea în Japonia, agarul și o mulți alți hidrocoloizi derivați dintr-o serie

de alge roșii de mare din clasa Rhodophyceae (speciile Gelidium și Gracilaria) au fost utilizați la

prepararea hranei.

Agarul a fost introdus ca mediu pentru imunoelectroforeză de către Grabar și Williams în anul 1953,

tehnica originală descrisă de aceștia fiind ocazional utilizată și astăzi. Electroforeza pe agar tratat este

de altfel principala metodă curentă de identificare a variantelor de hemoglobină.

Agarul a fost aplicat de către Polson în anul 1961 pentru separări cromatografice bazate pe

proprietatea sa de sitare moleculară, după care acesta a fost înlocuit gradat cu agaroza, începutul fiind

făcut de către Hjerten (1961).

Conținutul în sulfat a agarozelor de diferite grade furnizate pentru utilizare în laborator este în

general sub 0,12% comparativ cu 4% conținutul în agaropectină. Din această cauză agaroza poate fi

utilizată în prepararea gelurilor fără nevoia utilizării unor aditivi sau a unor agenți de reticulare iar

inerția sa față de interacția cu proteinele și acizii nucleici reprezintă principalele rațiuni ale ei în larga

utilizare ca mediu de separare. Tot ce este necesar în prepararea gelurilor este de a dizolva agaroza

pulbere prin încălzire controlată la fierbere sau aproape de temperatura de fierbere, după care să se lase

să se răcească. Procesul de gelificare se manifestă spontan și este complet în gelurile reci. În plus față

de simplicitatea pregătirii gelului de agaroză, alături de inerția față de interacții cu proteinele și acizii

nucleici îi oferă acesteia o multitudine de avantaje ca mediu de separare precum recuperarea simplă a

probei, netoxicitatea și simplicitatea pregătirii gelului.

Agaroza este de asemenea unică ca aplicativitate în numeroase proceduri imunoelectroforetice.

În comparație cu gelul de poliacrilamidă, gelul de agaroză este un material foarte poros, ceea ce îi

limitează oportunitatea folosirii sale în formă nemodificată în separări de proteine bazate pe

efectul de sită moleculară la cele cu masă moleculară mai mică de 60 kDa. Pe de altă parte, marea

sa permeabilitate face din ea un mediu superior poliacrilamidei pentru studii imunochimice.

Proprietățile gelurilor de agaroză. Din punct de

vedere chimic, agaroza este un polizaharid liniar

compus din unități alternative de D- și L-

galactozobioză (agarobioză) legate prin legături β

1-4 (figura alăturată) cu catene de o lungime dată

de cele 400 de unități de agarobioză, legate prin

legături α 1-3 și cu o masă moleculară de circa 120

kDa (figura de mai jos), cu resturi substituite

carboxilat, piruvat și/sau sulfat.

Gelificarea se manifestă ca un proces de inter-legare a protofibrilelor. Astfel, în timpul acestui

proces, lanțurile dublu catenate elicoidale se desfac iar legăturile 3,6 din structura 3,6

anhidrogalactozei se desfac de asemenea, ceea ce conduce la fragmentarea lanțului inițial în

lanțuri dublu elicoidale mai scurte a căror capete se vor uni încrucișat, proces de numit

schimbarea partenerului. În continuare are loc asocierea în suprafibrile cu raza de 10-20 nm

(figura de mai jos), supraînfășurare care explică rezistența mai mare și porii mai mari a gelului

de agaroză comparativ cu alte geluri care nu formează suprafibrile (ca de exemplu gelul de

amidon, gelul de poliacrilamidă cu un grad de reticulare, C% cuprins între 1 și 5).

Gelurile sunt translucide

deoarece fibrele înfășurate

împrăștie lumina dar devin

transparente prin uscare.

Abilitatea de a forma fibrile groase, puternice permit agarozei să formeze geluri chiar

la concentrații sub 0,2%. Încorporarea agarozei în suprafibre groase fac aceste geluri

înalt poroase până la o concentrație mai mare de 6%, limita la care agaroza poate fi

dizolvată fără a apela la temperaturi de autoclavare. Concentrații până la 16% se pot

realiza numai prin autoclavare. La gelurile cu o concentrație egală cu 2% efectul de

sită moleculară nu este prezent, electroforeza fiind de tip capilar, în timp ce la gelurile

cu o concentrație cuprinsă între 3 și 10%, distanțele între și din interiorul

suprafibrilelor devin egale și ia astfel naștere un gel cu o singură dimensiune a

fibrelor. Porozitatea mare a agarozei o face superioară poliacrilamidei pentru

separarea proteinelor mari, polipeptidelor, complexelor cu un domeniu de masă

(Mr) cuprins între 100 kDa și mai mulți megadaltoni. Prin utilizarea agarozei se

pot separa fragmente de ADN din domeniul 1000 la 23000 perechi de baze (bp).

În cazul agarozei hidroxietilate numărul de lanțuri din constituția suprafibrilelor este

mai mic decât în cazul agarozei nesubstituite și din această cauză porii gelului sunt

mai mici fiind similari cu cei ai gelului de poliacrilamidă, având o mare capacitate de

sitare moleculară similară gelului de poliacrilamidă însă rezistența mecanică este mai

mică decât a agarozei nemodificate. Recent, au fost obținute noi formule de derivați de

agaroză care au proprietăți mecanice îmbunătățite.

În funcție de gradul de substituție cu sarcini negative și de modificările chimice survenite, se

disting trei categorii de agaroză caracterizate prin:

a)conținutul în resturi sulfat (exprimat în %);

b)electroosmoză;

c)temperatura de gelificare;

d)temperatura de topire.

Electroendoosmoza preparatelor de agaroză este dată de parțial de conținutul în resturi sulfat și

piruvat. Ea poate fi măsurată convențional fie

cu ajutorul ciancobalaminei (vitamina B12), colorată în roșu,

fie cu Dextran-500, care poate fi detectat în urma precipitării cu etanol,

fie urmărind migrarea albuminei serice bovine (BSA).

De obicei se utilizează deplasarea BSA la pH=8,6 iar în urma acestei analize se determină

factorul –mr, după care se clasifică agarozele în agaroze cu electroosmoză mare, medie

(standard) și mică. Grupările sulfat prezente în cele mai multe preparate induc o mică

electroendosmoză (EEO) în timpul electroforezei. Electroendosmoza se manifestă ca o curgere

de tampon prin gel. Efectul este datorat faptului că sarcinile negative ale grupărilor sulfat din

matricea de gel nu se pot mișca spre anod motiv pentru care apare ca rezultat o pompare

compensatoare de tampon spre catod. Efectul asupra mobilității proteinelor este în general mic,

totuși devine pronunțat în sisteme de tampon discontinue utilizate pentru îngustarea benzilor din

proba aplicată. EEO poate astfel induce colapsarea gelurilor în sisteme tampon discontinue

datorită electroendosmozei inegale prin frontul de tampon. Astfel, o serie de sisteme de

tamponare descrise pentru gelurile de poliacrilamidă nu funcționează la fel de bine pentru

gelurile de agaroză.

Agarozele cu electroosmoză diferită se utilizează în tehnici specifice precum:

Agarozele cu electroosmoză mare (-mr=0,25) se utilizează în tehnicile de

contraimunoelectroforeză;

Agarozele cu electroosmoză standard și mică (-mr =0,13-0,07) se utilizează pentru

electroforeză și imunoelectroforeză. Ele sunt folosite la separarea acizilor nucleici

(agarozele standard), dedetectând DN-azele, RNA-azele, proteazele, inhibitorii

endonucleazelor, enzimele de restricție și modificare, ligazele, polimerazele.

Agarozele cu electroosmoză egală cu zero sunt utilizate pentru focusare (focalizare)

izoelectrică. Ele se obțin prin adăugarea unor aditivi sau printr-un procedeu chimic

(reacție de substituție) în scopul blocării (contrabalansării) sarcinilor electrice negative

cu grupări electropozitive. Aditivii dintr-o serie de zero-EEO agaroze contribuie la

formarea unui background în timpul colorării.

Agarozele hidroxietilate (numărul de grupări hidroxietil fiind de circa 15%) formează

geluri cu concentrație de 2-10% cu dimensiunile porilor aproximativ egale cu cea a

proteinelor. Ele au o temperatură de gelificare în jurul a 25oC iar temperatura de

solidificare de aproximativ 45oC (25/45). Astfel, o agaroză hidroxietilată 15/45

formează geluri de concentrație 2-10%, asemănătoare gelurilor de poliacrilamidă.

Agarozele cu un procent de 5% hidroxietil formează geluri cu o temperatură de topire

de 60-65oC

Echipamente și sisteme tampon.

Gelurile de agaroză sunt în mod curent utilizate pentru electroforeză plană, orizontală pe care

gelurile sunt plasate între electrodul anodic și catodic aflați în camere umplute cu tampon și

conectate prin punți umede. Cu excepția unor cerințe uzuale la platforma pe care se așează

gelul se poate adapta ușor un sistem de răcire prin recircularea apei. Gelurile sunt turnate în

casete deschise ori prevăzute cu două spațiatoare. Se are în vedere că utilizarea punților din

hârtie sau bumbac conduce la o pierdere de voltaj prin ele ceea ce conduce la o creșterea a

efectului de încălzire și apariția fenomenului de condensare în camera de separare

electroforetică. Pierderea de voltaj de-a lungul gelului trebuie să fie controlată direct de la

nivelul gelului și nu din sursa de curent. În plus hârtia de filtru nu este totdeauna

recomandată deoarece prin utilizarea sa drept bridă de contact, datorită procesului de

electroosmoză, puntea dinspre anod se poate usca împreună cu extremitatea respectivă a

gelului în timp ce la extremitatea catodică se adună lichid în exces, deoarece hârtia de filtru

nu poate prelua și transfera cantități mari de lichid. Condensarea vaporilor pe gel este ușor

de prevenit printr-o simplă barieră de vapori care se așează pe gel. Pentru electroforeza

acizilor nucleici utilizarea punților (bridelor) de legătură a fost eliminată prin aplicarea tehnici

cunoscute drept „submersă” în care gelul este așezat pe o platformă încărcată cu tampon

conectată la camerele electrozilor. Modul de electroforeză submarin nu este în mod curent

aplicabil în electroforeza proteinelor deoarece acestea au tendința de a difuza în tamponul

înconjurător, în timp ce acizii nucleici posedă constante de difuziune foarte mici, motiv pentru

care migrează aproape în întregime prin gel la aplicare unui câmp electric, cu o doar mică

difuziune. Gelurile de migrare din agaroză în format vertical cu camere de electrozi sunt

rareori utilizați deoarece agaroza are tendința de a se dilata și astfel de a părăsi caseta.

Inițial, aplicarea probei în gelul de agaroză s-a realizat

prin tăierea unei fante în gel. Această tehnică este în

continuare utilizată la electroforeza acizilor nucleici,

care formează benzi înguste când migrează nerestinctiv

din soluția de probă în gelul de migrare restrictiv,

comparativ cu proteinele la care se manifestă foarte

mică îngustare a benzii care permează gelul ușor. În

plus, godeurile induc distorsiuni ale benzilor proteice

datorită: (i) procesului de permeație parțială în

marginile godeului înainte de începerea „de facto” a

separării electroforetice; și (ii) datorită tensiunii

electrice inegale care se manifestă le-a lungul godeului

în momentul aplicării unui câmp electric. Datorită

ușurinței cu care soluțiile pot fi îmbibate în agaroză

urmată de compresia temporară cu hârtie de transfer,

probele pot fi depuse pe gel în benzi demarcate prin

intermediul așa-numitei tehnici „folie de aplicare a

probei”, un plastic subțire întins peste gel care are

prevăzute niște fante prin care probele sunt depuse pe

gel. Acest sistem de aplicare a probei a fost sugerat de

Cawley simplificând procedura comparativ cu cea de

formare de godeuri.

Din punct de vedere electric, în cele mai multe aparate se utilizează un gradient de

potențial de 15-20 V/cm. Acesta corespunde unei puteri totale a câmpului electric de

250-300 V și o intensitate de curent de 100-140 mA, depinzând de mărimea electrozilor.

În cazul gelurilor subțiri de 3 mm grosime, tensiunea aplicată este de 6 V/cm.

Fixarea fracțiilor proteice se realizează: a) fie prin imersarea gelului în soluție de acid

acetic 20% timp de o oră, după care gelul se usucă timp de 16 ore la 37oC; b) fie prin

imersarea sa într-un amestec de acid picric (soluție saturată):acid acetic (20%) într-un

raport 3/1 timp de 15 minute, după care gelul se usucă.

Toate metodele comune de colorare utilizate

(bazate pe Coomassie Brillant Blue,

fluorescență, chimiluminescență, și de tip

coloidal) funcționează bine cu agaroza,

metoda cu Coomassie coloidal fiind una

dintre cele mai rapide. Amido Black 10B

(soluție 1% preparată într-o soluție de acid

acetic 7% sau preparată într-un amestec

metanol:acid acetic:apă, în raport de 5:1:5)

este utilizat deoarece produce zone distincte

și facilitează vizualizarea α- și β-

lipoproteinelor.

Structura chimică a Coomassie

Brillant Blue G-250 (sinonime: Serva

blue G sau C.I. acid blue 90), un

colorant trifenilmetanic.

O adaptare a electroforezei pe agaroză o reprezintă electroforeza de înaltă

rezoluție. Ea este utilizată în clinică în laboratorul de analize medicale. Prin

utilizarea ei, se evidențiază schimbări calitative și cantitative ale proteinelor

serice, semnificative din punct de vedere clinic care nu pot fi decelate prin

electroforeză convențională sau pe acetat de celuloză. Practic se lucrează

pe gel de agaroză de 1 mm grosime, turnate pe folii de film flexibil de

poliester, Gelbond™ care sunt păstrate în soluție tampon și în ambalaje

ermetice, care facilitează mânuirea și stocarea gelului prelucrat. Volumul de

probă este de 2-4 µL, putându-se aplica simultan 6 ori 12 probe. Timpul de

separare este de aproximativ 45 de minute la o tensiune de 20V/cm

INTERPRETAREA ELECTROFOREGRAMELOR ÎN TERMEN DE

VARIAȚIE A PROTEINELOR INDIVIDUALE

Abilitatea gelului de agaroză de a

revela proteine diferite variază în

funcție de concentrația de proteină,

capacitatea de legare a colorantului și

de gradul de omogenitate

electroforetică. În general, capacitatea

de legare a colorantului scade odată cu

creșterea conținutului în oligozaharide

și lipide. Figura de mai jos dă o

prezentare schematică a concentrației

relative și eterogenitatea

electroforetică a proteinelor

plasmatice majore, într-un subiect

sănătos, având cel mai frecvent

fenotipDistribuția electroforetică și concentrațiile relative ale proteinelor majore plasmatice

comparativ cu fracțiile obținute prin electroforeză clasică. Abreviații: Alb, Albumină;

Lp, Lipoproteine; Om, Orosomucoid; α1-At, α1-antitripsină; α2-M, α2-

macroglobulină; GC, componente specifice de grup; Hp, haptoglobine; CIG,

globulină insolubilă la rece; Hz, hemopexină, Tf, transferină; C3, complement C3;

Fg, fibrinogen; Ig, imunoglobuină; și CRP, proteină C-reactivă

Tabelul de mai jos prezintă proteinele individuale care pot fi prezente în concentrații

care pot influența profilul electroforetic. Datele din paranteze sunt prezente la așa

concentrații încât nu pot influența semnificativ profilul electroforetic.Proteina țintă Domeniul normal (g/L)

Prealbumina 0,15-0,36

Albumina 39-51

α-Lipoproteine (3-7)

(α-Fetoproteina)a <1-1 -5

(Orosomucoid) 0,40-1,05

α1-Antitripsina 0,8-1,9

Globuline specifice de grup 0,2-0,55

(Inhibitorii inter-α1-tripsină) 0,2-0,7

(Ceruloplasmina) 0,22-0,46

α2-Macroglobulinele 1,2-2,4

Haptoglobinele (1-1, 2-2, 2-1) 0,40-2,9

Globulinele insolubile la rece 0,1-0,3

Transferina 1,7-2,7

β-Lipoproteinele 2,2-7,4

Al treilea component al sistemului complement, C3 0,6-2,2

IgA 1,0-3,0

Fibrinogenul 2,2-4,4

(IgM) 0,6-2,2

IgG 6,5-15,5

(Catenele de imunoglobulină ușoară) <0,001

(Proteina C-reactivă) <0,02

Analiza profilului electroforetic

Zone electroforetice Observație Cauze posibile

Zona prealbuminei Scăzută

Masă celulară hepatică scăzută,

Răspuns inflamator

Malnutriție

Zona albuminei

Scăzută

Răspuns inflamator,

Malnutriție,

Pierderi în greutate,

Maladii maligne,

Un volum extracelular crescut.

Front anodal rapidMedicamente (penicilină)

Icter

Interzona albumină-

α1

α1- Lipoproteine

Intensitate scăzută Leziuni ale celulei hepatice

Intensitate crescută

Malnutriție

Abuz de alcool

Nivel estrogenic crescut postmenstrual

Zona α1

α1-Antitripsina

Polimorfism Variante genetice.

CrescutăRăspuns inflamator,

Alterarea celulei hepatice

Relativ scăzutăDeficiență genetică,

Scăderi în greutate.

Zona α2

α2-MacroglobulinaCrescută

Dependentă de vârstă la copii,

Persoane în vârstă (>70),

Proteinurie selectivă

HaptoglobinaCrescută Răspuns inflamator,

Relativ scăzută Hemoliză in vivo

Imunoglobuline

Benzi înguste Componenta M

Difuzie crescută Creștere policlonală

Apariție în benzi Creștere oligoclonală, infecție virală, malignitate

Un profil policlonal semnificativ al electroforezei proteinelor serice

pe gel de agaroză (anodul fiind în stânga). Banda γ prevăzută cu

asterisc este lărgită și se întinde pe toată aria de mobilitate gama

(Panelul B). Trasarea densitometrică a acestei observații vizuale

relevă un peak difuz de mobilitate gama. Acest profil este cel mai

adesea dat de prezența unui proces inflamator ori reactiv, precum și

în bolile cronice ale ficatului, în bolile țesutului conectiv, în infecții

cronice, ori într-o maladie limfoproliferativă (Panel A).

Zona β1

Transferina

PolimorfismVariante genetice (proteina Bence

Jones, componenta M, hemoglobină)

Crește Deficiență de fier, estrogeni

ScadeMalnutriție, scăderi în greutate răspuns

inflamator

β-

LipoproteinePoziție crescută

Hipercolesterolemie

O mobilitate scăzută cu creșterea

intensității sugerează o obstrucție

biliară

Zona β2

IgACreștere selectivă

Malignitate, infecții ale mucoasei,

artrită, abuz de alcool

C3

Polimorfism Variante genetice,

Poziție Conversia in vivo/invitro a C3 la C3c

CreșteRăspuns cronic inflamator,

Obstrucție biliară

Scade Activarea complementului

Zona γ

Fibrinogen

Crește Răspuns inflamator

PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR DIN PLASMĂ COMPARATIV

CU CELE DIN FLUIDUL CEREBROSPINAL

În mod normal, aproximativ 80% din proteinele fluidului cerebrospinal fluid (CSF) au

originea în plasmă iar restul sunt sintetizate local. Timpul de înjumătățire pentru

proteinele plasmatice care intră în spațiul subarahnoid este de aproximativ o

săptămână, și din acest motiv compoziția în proteine a CSF o urmează pe cea din

plasmă, cu o oarecare întârziere. Rezistența de transfer a proteinelor plasmatice crește

rapid odată cu masa moleculară și din acest motiv raportul dintre proteinele mari

(IgM, β-lipoproteine și α2-macroglobuline) și albumină, este în mod normal mai

scăzut în CSF decât în plasmă. Această discriminare pe baza masei moleculare se

micșorează când concentrația proteică a CSF este crescută.

PROFILUL ELECTROFORETIC AL PROTEINELOR

DIN URINĂ COMPARATIV CU CELE DIN PLASMĂ

Un determinat primar pentru profilul proteinelor urinare este compoziția și cantitatea de

proteine care permează filtrarea glomerulară în relație cu capacitatea resorbtivă tubulară.

În mod normal, aceasta este limitată la aproximativ 200 mg/zi. Asupra pierderii urinare

intense de cantități de proteină, analizele comparative electroforetice disting trei

posibilități majore:

(a) proteinuria glomerulară neselectivă,

(b) proteinuria glomerulară selectivă, și

(c) proteinuria Bence Jones.

PROTEINURIA BENCE JONES

Excreția urinară a catenelor ușoare de imunoglobuline κ ori λ, cu origine monoclonală

(proteinuria Bence Jones) conduce la apariția unei singure (ori uzual dublă) bande, mai mult ori

mai puțin închisă la culoare, undeva în zona α1 spre zona cu mobilitate mică γ. Natura ei poate fi

demonstrată prin imunoelectroforeză, dar este de preferată o evidențiere prin imunofixare după o

electroforeză pe gel de agaroză în prezența antiserurilor anti κ și anti λ. Rezultatul unor analize

imunoelectroforetice convenționale este mai dificil de interpretat decât rezultatul obținut prin

imunofixare dacă concentrația de catenă ușoară monoclonală este scăzută, deoarece catenele

policlonale ușoare apar în urină.

Electroforeza proteinelor urinare pe gel de agaroză în

prezență de dodecil sulfat de sodiu

S-a introdus pentru analiza calitativă a proteinelor urinare electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezența

dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE). SDS-PAGE separă proteinele în funcţie de mărimea lor moleculară, iar

monomerii catenelor ușoare libere (policlonale sau monoclonale) sunt vizualizate ca o bandă cu masă

moleculară (Mr) de 25.000 Da, care sunt deosebite cu uşurinţă de imunoglobulinele intacte (cu masă

moleculară de 150.000 Da). SDS-PAGE diferenţiază, de asemenea, proteinuriea cu origine glomerulară

(proteine, cu masă moleculară de 66.000 Da), de cea cu origine tubulară (proteine cu masă moleculară de

66.000 Da), sau cu origine mixtă. Această metodă este, aşadar, un potenţial instrument clinic pentru evaluarea

funcţiei renale, un important factor de prognostic în MM. Cu toate acestea SDS-PAGE, nu este utilizată pe

scară largă în laboratoarele clinice, pentru că este exigentă din punct de vedere tehnic, un timp mai

mare, şi este mai costisitoare.

Le Bricon și colaboratorii (1998; 2000) propun pentru prima dată o tehnică de

analiză a proteinelor urinare prin electroforeză pe gel de agaroză în prezență de

dodecil sulfat de sodiu (SDS-AGE) la pacienți suferinzi de Mielom multiplu. Astfel,

urina, fără o concentrare prealabilă, se analizează prin SDS-AGE pe suport

Hydragel®, mediu electroforetic utilizat în mod comun la analiza proteinuriei.

Profilul electroforetic a cinci probe diferite obținut

după SDS-AGE. De la stânga spre dreapta: 1,

proteinurie glomerulară selectivă: transferină și

albumină; 2, BJP prerenală pură: dimeri ai

catenelor ușoare și monomer, înainte de

tratamentul cu β mercaptoetanol; 3, proteinurie

mixtă: immunoglobuline, transferină, albumină,

α1- microglobulină (Alfa-1 µ), monomeri ai

catenelor ușoare (policlonali), proteina de legare

a retinolului (RBP) și β2-microglobulină (Beta-2

µ); 4, BJP prerenală pură: monomeri ai

catenelor ușoare; 5, proteinurie tubulară: mici

cantități de albumină, monomeri ai catenelor

ușoare (policlonale) și RBP. Caracterul

monoclonal al catenelor ușoare detectate sunt

confirmate prin imunofixare.

Trebuie însă accentuate o serie de limitări ale tehnicii SDS-AGE. Cea mai

importantă este faptul că SDS-AGE nu poate să realizeze o distincție

definitivă între proteinele monoclonale şi cele policlonale. În absenţa unor

leziuni tubulare (în cazul BJP pură sau în proteinuria glomerulară), se

evidențiază întotdeauna banda electroforetică corespunzătoare

Mr=25.000 Da caracteristică BJP.

În concluzie, SDS-AGE

pare a fi un instrument de laborator clinic pentru urmărire a pacienţilor diagnosticați cu

MM.

SDS-AGE are o înaltă rezoluţie, sensibilitate, şi reproductibilitate.

Într-un laborator specializat, metoda este utilă în monitorizarea progresiei maladiei la

pacienți prin intermediul determinării semicantitative a BJP.

Comparativ cu electroforeză pe gel de agaroză de rutină, SDS-AGE combină simplitatea

(nu este nevoie de o concentrare prealabilă a urinei) cu o sensibilitate crescută pentru

detectarea BJP.

Profilurile electroforetice glomerulare, tubulare ori mixte se identifică ușor pe gelul de

agaroză. Interpretarea profilurilor benzilor proteice după SDS-AGE cere, totuşi,

conştientizarea unor capcane, în special în ceea ce priveşte polimerizarea catenelor ușoare şi

prezenţa unor catene ușoare mono-şi/sau policlonale în specimenele de urină a pacienţilor

diagnosticați cu mielom multiplu.

În unele cazuri, SDS-AGE poate fi ușor mai sensibilă decât imunofixarea în detecția

proteinelor Bence Jones la concentrații scăzute.

ELECTROFOREZA FRAGMENTELOR DE ADN PE GEL DE AGAROZĂ

Acizii nucleici sunt polimeri compuși din unităţi nucleotidice individuale, unităţile fiind conectate prin

intermediul legăturilor diester fosfat la scheletul zaharidic. Efectul net al acestor legături este cel de a oferi

polimerilor o sarcină netă negativă.

Încă de la începutul tehnicilor electroforetice s-a axiomat faptul că moleculele care transportă o sarcină

electrică vor migra într-un câmp electric într-un mod previzibil. Atunci când este supusă unui câmp electric, o

moleculă care transportă o sarcină netă negativă va migra spre polul pozitiv, în timp ce o moleculă încărcată

cu o sarcină netă negativă va migra spre polul negativ.

Atunci când macromolecule de acizi nucleici încărcate electric sunt plasate în matricea

semi-solidă a unui gel, ele vor migra spre polul pozitiv într-un mod previzibil şi

reproductibil, procesul putând fi descris ca o funcţie exponenţială negativă a lungimii

acestora. Altfel spus, moleculele mai scurte vor migra mai repede în timp ce moleculele

mai mari (mai lungi) vor migra mai lent. Într-adevăr, în cazul unui acid nucleic, aflat

într-un câmp electric uniform, orice alt element al expresiei migrării sale este o

constantă, iar mobilitatea sa este complet determinată de mărimea moleculei (masa

moleculară a unui acid nucleic se exprimă în daltoni sau în perechi de baze, base pair,

bp, de fapt nucleotide; o pereche de baze este aproximativ egală cu 660 daltoni).

Metoda este deosebit de simplă, rapidă și sensibilă pentru separarea, identificarea și

purificarea fragmentelor de ADN.

Din punct de vedere practic, intr-un gel de

agaroză, este dificil să se rezolve cu

precizie acizi nucleici dubli catenari mai

mici de aproximativ 100 de baze, deoarece

proprietăţile de cernere moleculară a

agarozei nu sunt suficient de pregnante. Pe

de altă parte, macromoleculele mai mari

de aproximativ 25.000 bp dar mai mici de

aproximativ 2.000.000 bp vor migra în gel

cu viteze diferite, datorită limitării de

mobilitate. Macromoleculele de acizi

nucleici mai mari de 2.000.000 bp nu vor

putea penetra un gel convențional de

agaroză. Astfel, domeniul efectiv de

mărime pentru electroforeza acizilor

nucleici dublu catenari pe un gel

convențional de agaroză este între 100 bp

și 25.000 de bp. În acest interval

comportamentul macromoleculei este

precis şi previzibil. Acest comportament

este prezentat în figura alăturată.

Mobilitatea electroforetică a fragmentelor de

restricție a ADN într-un gel de agaroză. DNA provine

din bacteriofagul lambda în urma digestiei cu enzima

de restricție Hind III. Graficul arată că distanța de

migrare în centimetri în funcție de mărimea în

perechi de baze a fragmentului separat

În anii „80, a fost prezentată o teorie prin care se consideră că

acizi nucleici migrează prin gel asemănător mișcării

ondulatorii a unui şarpe. Astfel macromolecula se mișcă din

față și trage restul de macromoleculă după ea. În acest model,

cu cât molecula este mai mare, cu atât ea interacționează mai

puternic cu matricea de gel și astfel întâmpină o rezistenţă mai

mare din partea acesteia în așa fel încât timpul său de

staționare într-o zonă este mai mare. Aşa cum a fost arătat mai

sus, creşterea rezistenţei gelului este neliniară. Acest model,

numit „biased reptation”, este suficient pentru a explica tot

comportamentul unui acid nucleic într-o matrice de semi-

solidă.

În anul 1989 un grup de cercetători de la Universitatea din

Washington, au testat această teorie, filmând macromoleculele

de ADN care se deplasează printr-un gel de agaroză. Filmul a

arătat atât mișcarea ondulatorie, sigmoidală, cât și

interacțiunile dintre acid nucleic și matricea gelului de

agaroză.

.

Separarea fragmentelor de ADN de dimensiuni

diferite prin electroforeză pe gel vertical. Gelul este

preparat prin turnarea agarozei topite sau a

acrilamidei nepolimerizate între două geamuri de

sticlă aflate la o distanță de câțiva milimetrii. După

solidificarea agarozei ori polimerizarea acrilamidei se

formează o matrice de gel, a cărei pori depinde de

concentrația de gel sau de acrilamidă utilizată.

Deoarece porii sunt mai mari în gelurile de agaroză

decât în cele de poliacrilamidă, cel din înainte este

utilizat la separarea fragmentelor mari de ADN (între

500 și 20 kb) în timp ce al doilea se utilizează la

separarea fragmentelor mici (de la o nucleotidă, până

la 2 kb). Amestecul de fragmente de ADN care

urmează a fi separat este depus într-un godeu din

partea superioară după care se aplică un câmp

electric prin gel. Fragmentele de ADN se mișcă spre

polul pozitiv cu o viteză invers proporțională cu

logaritmul lungimii lor formând benzi care pot fi

vizualizate prin autoradiografie (dacă fragmentele

sunt radiomarcate) ori prin adăugare de colorant

fluorescent de tipul bromurii de etidiu; în acest ultim

caz, agaroza lichefiată este lăsată să se solidifice pe

un suport de sticlă sau plastic orizontal

Cum matricea de gel restricționează difuzia întâmplătoare a moleculelor,

moleculele cu lungimi diferite se separă în zone discrete („benzi”) a

căror lățime este egală cu lățimea godeului unde s-a plasat amestecul

original de ADN

Analiza unor fragmente de ADN după

separare electroforetică pe gel de agaroză.

Prima linie conține fragmente cu masă

moleculară cunoscută de ADN obținute în

urma digestiei cu o enzimă de restricție a

unui ADN cunoscut. Celelalte patru linii

arată diverse fragmente cu mărimi diferite

prezente în probe.

Se poate spune astfel că mobilitatea ADN este funcție de masa moleculară,

câmpul electric aplicat, compoziția nucleotidică, temperatura de lucru și

soluția de tampon utilizată la separare. Deplasarea moleculelor liniare de

ADN se realizează cu o viteză invers proporțională cu logaritmul masei lor

moleculare.

După cum se cunoaște, conformația ADN explică mobilitățile diferite la

mase moleculare egale. Astfel, ADN o serie de conformații: circular închisă

(covalentry closed circle) supraînfășurată (supercoiled), circular deschisă

(open circular), liniară. Moblitatea electroforetică a celor trei forme de

ADN este în funcție de condițiile de lucru.

Pentru vizualizate postelectroforetică a

fragmentelor de ADN se utilizează tehnici

autoradiografice (dacă fragmentele sunt

radiomarcate) ori prin adăugare de colorant

fluorescent de tipul bromurii de etidiu

(figura alăturată).

Bromura de etidiu, o moleculă planară, se

intercalează în structura ADN între bazele

azotate iar buclele supraînfășurate încărcate

cu sarcină negativă ale conformației

circular închise se desfac și în aceste

condiții mobilitatea electroforetică se

reduce.

Legarea bromurii de etidiu la ADN crește de asemenea

fluorescența intrinsecă. Ca rezultat, în condițiile iluminării unui

gel cu lumină ultravioletă, regiunile de gel care conțin ADN,

vor fi mai strălucitoare față de regiunile gelului fără ADN.

La concentrații de 0,1-0,5 µg/ml de bromură de etidiu, toate buclele

înfășurate sau supraînfășurate sunt desfăcute. De asemenea, bromura de

etidiu reduce și mobilitatea conformațiilor circular închise și liniare. ADN

marcat radioactiv poate fi vizualizat și prin autoradiografia gelului. În acest

caz, gelul este depus în contact cu un film fotografic, la întuneric; filmul

astfel expus va indica pozițiile ADN prezent marcat. Dacă filmul se

developează, se obține imaginea fotografică a ADN. Benzile de ADN

radiomarcat pot fi detectate prin analiza particulelor β eliberate de

moleculele marcate din gel. Datele rezultate se pot stoca în computer și pot

fi convertite într-o imagine asemănătoare unei autoradiograme

Compoziția nucleotidică nu influențează în mod semnificativ mobilitatea electroforetică, în

schimb, concentrația de agaroză este esențială: cu cât concentrația de gel este mai mare, cu

atât mobilitatea fragmentelor de ADN este mai mică. Prin folosirea gelurilor în gradient de

concentrație este posibilă separarea ADN de diferite mărimi.

Pentru a obține o rezoluție bună, căderea de tensiune între bornele aparatului de electroforeză

trebuie să fie de 5V/cm. În general, la diferențe mici de potențial, mobilitatea fragmentelor

lineare de ADN este proporțională cu intensitatea câmpului electric.

În general se lucrează la temperatura camerei. Pentru geluri care conțin mai puțin de 0,5%

agaroză, se recomandă migrarea la o temperatură de 4oC. Majoritatea protocoalelor de lucru

recomandă tamponul Tris, 50mM, pH=7,5-7,8 drept optim în ceea ce privește tăria ionică și

capacitatea de tamponare.

Aparatura utilizată este de obicei orizontală, asemănătoare celei utilizate la electroforeza

proteinelor. Este de asemenea necesar un redresor de curent cu o intensitate maximă de 100 mA

și o tensiune maximă de 100V, iar pentru evidențiere postelectroforetică a fragmentelor de ADN

după colorare cu bromură de etidiu, de o lampă UV prevăzută cu un filtru de 300 nm.

Tehnica de lucru pentru electroforeza submersă a fragmentelor de ADN. De obicei se utilizează

o agaroză cu o electroosmoză standard (-mr = 0,13) sau mai mică (-mr = 0,07). Gelurile se prepară

asemănător celor de amidon, iar după solidificare se plasează pe platforma cuvei unde se acoperă

cu tampon, stratul de deasupra fiind de circa 1 mm. La trecerea unui curent electric, rezistența

electrică a stratului de soluție tampon este aproape egală cu cea a gelului și astfel, cea mai

importantă parte a curentului aplicat va trece prin gel. Această tehnică este numită electroforeză

cu gel scufundat (submers) și este cea mai utilizată tehnică de analiză electroforetică a

fragmentelor de ADN.

Electroforeza fragmentelor de ADN în câmp electric

pulsator

Dacă prin metoda clasică, convențională se pot separa fragmente de ADN de până la 20 kbp cu

rezoluție bună, cele până la 40 kbp cu rezoluție satisfăcătoare, pentru separarea fragmentelor

până la 500 kbp se rezolvă cu rezoluție slabă, într-un gel de agaroză foarte fragil cu o

concentrație de 0,1%. La mijlocul anilor `80 s-au dezvoltat o serie de metode de analiză

electroforetică a moleculelor de acizi nucleici în domeniul de mărime care limitează mobilitatea.

Soluția a implicat introducerea mobilității dependente de mărime a moleculelor de acizi nucleici

prin alterarea câmpului electric. Primul tip de alterare implică simpla schimbare de polaritate a

câmpului electric într-o manieră regulată. S-a arătat că o schimbare periodică a polarității va

induce moleculelor o mișcare de întoarcere în forma literei U, în matricea de gel. Chiar pentru

cele mai mari molecule, această întoarcere permite separarea moleculelor. Dacă lungimea

timpului de reversare a moleculelor este de aproximativ o treime din timpul de mișcare spre

înainte, ele se vor putea separa în câteva ore pe agaroză standard. Prima demonstrație practică a

acestei metode, denumită ”electroforeză în câmp inversat” (Field Inversion Gel Electrophoresis-

FIGE), a rezolvat complet printr-o migrare de o secundă înainte urmată de o secundă înapoi

molecule mari de 2.000.000 bp precum cromozomii intacți din drojdie. De atunci s-au dezvoltat o

varietate de metode, în mod comun denumite ”electroforeză în câmp pulsator”. Prin aceste

tehnici cele mai mari molecule de ADN cu o lungime cuprinsă între 2•104 la 107 bp (20 kb la 10

megabp, Mb), se pot separa în funcție de masa lor moleculară. Separarea prin electroforeză în

câmp pulsator depinde de comportamentul singular al moleculelor mari de DNA într-un câmp

electric care este pornit și oprit (pulsat) la intervale mici de timp.

În condițiile în care se aplică un câmp electric unor

molecule mari de ADN aflate într-un gel, molecule

migrează în direcția câmpului electric și de asemenea se

întind pe toată lungimea lor. Dacă curentul este stopat,

moleculele încep să se “relaxeze” prin înfășurări

întâmplătoare. Timpul necesar pentru relaxare este

direct proporțional cu lungimea moleculei. Câmpul

electric este apoi reaplicat într-un unghi de 90° ori 180°față de prima direcție. Moleculele mai mari se

relaxează mai puțin decât moleculele mai scurte în

momentul în care curentul este oprit. Cum moleculele

trebuie să se relaxeze prin înfășurări întâmplătoare

înaintea miscării lor într-o nouă direcție, moleculele

mai mari încep ă se miște în direcția nouă impusă mai

lent decât cele mai scurte. Alternarea repetată a

direcției câmpului electric forțează moleculele mari de

ADN de diferite mărimi să se îndepărteze mai mult și

mai multe între ele.

Electroforeza în câmp pulsator este foarte importantă în purificarea moleculelor mari de

ADN, până la ≈107 bp în lungime. Tehnica este necesară pentru analiza cromozomilor

celulari de la 5•105 bp (cel mai mic fiind cromozomul de la drojdie) până la aproximativ 2-

3•108 bp (cromozomii animali și de plante). Cromozomii cei mai mari trebuie în prealabil

să fie digerați în fragmente de 107 bp ori mai mici înainte de analiză. Astfel de fragmente

de restricție pot fi generate cu ajutorul enzimelor de restricție care taie la situsuri de

restricție găsite la situsuri de restricție de 8 bp

Se poate spune că principiul (caracteristica metodei) o reprezintă faptul că

fragmentele de ADN sunt obligate să-și schimbe periodic direcția de deplasare ca

urmare a schimbării direcției câmpului electric. Intervalul de timp pentru migrare

într-o direcție sau alta determină limita superioară a dimensiunii fragmentelor de

ADN care se vor separa distinct. Dependența de timp este aproape liniară: la

frecvențe de timp de 0,1 secunde, se separă fragmente mai mari de 10 Kbp, în timp

ce la intervale de timp de o oră, se vor separa fragmente de circa 1 Mbp. Timpul

necesar separării prin electroforeză în câmp pulsator este cuprins între 20 și 80 de

ore, în condițiile în care gelul de agaroză are o concentrație de 0,5-1%

Temperatura de lucru este de 14-15oC, la o cădere de tensiune de 2,5-10V/cm.

Calculul voltajului se realizează prin asumarea faptului că în sistemele

electroforetice submarine, numai aproximativ 80% din curent trece prin gel,

căderea de tensiune (V/cm) poate fi estimată prin relația:

Schemele unei serii diverse de tipuri de aparate

utilizate în electroforeza acizilor nucleici în câmp

pulsator.

Mobilitatea moleculelor de ADN este în funcție de tensiunea (diferența de potențial) aplicată,

temperatura de lucru, frecvența schimbării direcției câmpului electric și de soluția de tampon

folosită, din care cauză trebuie identificată combinația optimă tensiune/temperatură (rezoluția

de separare scăzând odată cu creșterea temperaturii și a tensiunii, deși viteza de migrare

electroforetică crește). Din acest motiv se recomandă schimbarea frecvenței ciclurilor de două

sau mai multe ori în timpul separării. Prin această tehnică, este oarecum dificil a se determina

masă moleculară cu toate că se pot utiliza markeri de masă. Asemănător vizualizării

fragmentelor mici de ADN, și în acest caz gelul poate fi colorat cu bromură de etidiu (1 µg/ml),

când fluorescența intens orange a colorantului intercalat în molecula de ADN dublu helicală

conduce la cuantificarea a minimum 50ng de ADN.

Dintre aplicațiile electroforezei în câmp pulsator se pot enumera

obținerea hărților genetice, (a librăriilor metagenomice), a cariotipului

electroforetic la drojdii (Sacharomices cerevisiae, Candida albicans) la

protozoare (Giardia intestinalis). Ea s-a utilizat în studiul genomului

uman, de analiză a unor regiuni implicate în maladii cunoscute precum

complexul major de histocompatibilitate, de analiză a genei distrofiei

musculare Duchenne, unde s-a pus la punct un test molecular de

diagnostic în cazul femeilor ”vector” purtătoare a genei defecte și astfel

de diagnostic prenatal în familii cu risc crescut. Se poate spune că

apariția electroforezei în câmp pulsator a contribuit semnificativ la

dezvoltarea biologiei moleculare.

Dintre dezavantaje se pot enumera timpul mare de izolare și restricție a

ADN care preced electroforeza, acesta fiind dezavantajul major a

analizelor de macrorestricție prin intermediul electroforezei în câmp

pulsator. Astfel, un protocol standard durează cinci-șase zile până la

evaluarea rezultatelor

ELECTROFOREZA PROTEINELOR

PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ

Sursele comerciale furnizează acrilamidă și N,N'-metilen bisacrilamidă

cu o puritate suficientă care permite utilizarea lor fără o acțiune de

pregătire. O serie de reactivi pot fi obținuți în formă pre-mixată

(amestecați) gata pentru reacția de polimerizare. Există disponibile

comercial componente înalt purificate care permit formarea gelurilor

transparente la lungimi de undă cuprinse în domeniul ultraviolet (260

și 280 nm), care permit scanarea directă pentru identificarea acizilor

nucleici ori a proteinelor.

Dintre dezavantaje se pot enumera: neurotoxicitatea, cancerogenitatea

acrilamidei iar la contactul cu pielea, componentele amestecului de

polimerizare pot cauza iritații. În plus, reproductibilitatea depinde de

puritatea reactivilor și a condițiilor de lucru. Ca regulă, componentele

trebuie să fie stocate în vase închise la culoare, la frigider. Odată ce

monomerii au fost dizolvați durata de viață a soluției este de

aproximativ 3 luni. Este recomandat ca pH-ul soluției să fie măsurat

periodic deoarece odată cu îmbătrânirea soluției, pH-ul va crește.

Astfel, această soluție va necesita un timp mai îndelung de

polimerizare, fenomen care servește de asemenea drept indicație că

monomerii se deteriorează.

Acrilamida (amida acidului acrilic, 2-propen amida) este o pulbere

albă, ușor solubilă în apă, solubilă în solvenți polari (etanol, acetonă,

cloroform) și insolubilă în solvenți nepolari (tetraclorură de carbon, n-

heptan) Ea își păstrează proprietăție chimice timp îndelungat dacă este

păstrată corespunzător. Dacă este expusă la lumină, polimerizează slab

și formează mici cantități de poliacrilamidă. Amida acidului acrilic se

prepară fie prin sinteză chimică, prin hidroliza acrilonitrilului, fie prin

biosinteză, când utilizând o tulpină de Cornynebacterium se obține cu

un randament de aproximativ 100% acrilamidă.

Acrilamida se purifică prin recristalizare la o temperatură de 60oC din

cloroform sau soluții alcoolice cu un randament de circa 60%.

Acrilamida astfel obținută este aptă pentru focusare izoelecrică și alte

tehnici unde sunt necesare geluri foarte subțiri.

N,N’Cistaminbisacrilamida este utilizată la gelurile de acrilamidă

solubilizabile, înlocuind echimolecular bisacrilamida. Gelurile se

solubilizează utilizând agenți reducători ai legăturii disulfurice (-S-S-), 2

mercaptoetanol, ditiotreitol, ditioeritriol.

Diacrilpiperazina (N-Bis-acrililpiperazină, BAP) se sintetizează relative ușor

și este foarte solubilă în apă. Ea formează geluri cu conductibilitate mai

mare decât cele obținute prin copolimerizarea acrilamidei cu bisacrilamidă.

Aceste geluri nu se umflă prea tare cu apă iar în prezența dodecilsulfatului

de sodiu porii gelului scad aparent. Prin utilizarea gelurilor cu

diacrilpiperazină drept agent de reticulare separarea și detecția proteinelor

este îmbunătățită, iar transferul proteinelor pe membrane de nitroceluloză

este mai eficient.

N,N’ Dialiltartratdiamina formează geluri care își măresc volumul cu

aproximativ 30% în apă. Ele sunt solubile în acid periodic sau periodat de

potasiu. Gelurile formate de N,N’dialiltartratdiamină au o stabilitate

mecanică mai bună, sunt mai aderente pe sticlă și sunt perfect transparente,

comparabilă cu cea a gelurilor de poliacrilamidă-bisacrilamidă.

Structura chimică a unor monomeri

acrilamido N-substituiți utilizați la

prepararea gelurilor de poliacrilamidă

Versatilitatea gelurilor poliacrilamide este, de asemenea demonstrată de numărul mare de agenți de

reticulare, pe langa Bis, care pot fi folosiți pentru a turna geluri cu proprietăţi specifice în scopul

unei fracţionări diferite. Acestea sunt enumerate în tabelul de mai sus. N,N'-(1,2-Dihidroxietilen)

bisacrilamida (DHEBA) poate fi folosită pentru turnarea geluri reversibile, deoarece structura de

1,2-diol face DHEBA un conpus sensibil la clivaj prin oxidare cu acid periodic. Acelaşi principiu se

aplică, de asemenea, pentru gelurile pe bază de N,N'-(1,2-Dihidroxietilen) bisacrilamidă (DATD)

Alternativ, geluri pe bază de etilen diacrilat (EDA) pot fi utilizate, deoarece acest agenytul de

reticulare conține legături ester care pot clivate prin hidroliză. Agenții de reticulare poli(etilen glicol

diacrilat) fac parte din aceeaşi serie de derivaţi esterici. Așa cum s-a descris anterior, gelurile pe

bază de N,N’-bisacrililcistamină (BAC) conțin punți disulfurice ușor clivabile.

Alți agenți de reticulare.

În general sistemele catalitice se pot împărți în:

Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin reacții redox;

Sisteme catalitice în care radicalii liberi sunt generați prin fotocataliză.

În afara celor două mari categorii există de asemenea sisteme combinate.

Sisteme catalitice redox constau de obicei din:

Inițiator al reacției de polimerizare vinilică (acesta este o substanță care

introdusă în sistemul chimic în concentrație mică poate declanșa procesul

chimic respectiv. Inițiatorul se descompune cu ușurință în radicali liberi). Cel

mai utilizat inițiator al reacției de polimerizare este persulfatul, S2O82-.

Catalizator (accelerator) al reacției de polimerizare (acesta este o substanță

care modifică viteza de reacție, catalizând formarea de radicali liberi, în acest

caz). O condiție necesară pentru a funcționa drept catalizator este de a

poseda două grupări amino separate prin doi atomi de carbon sau o grupare

amino terțiară.

Schema reacției de descompunere a persulfatului și de generare a radicalilor liberi

Cel mai utilizat accelerator în polimerizarea vinilică a

acrilamidei este tetrametiletilen diamina, TEMED. În

acest sistem, TEMED accelerează descompunerea

moleculelor de persulfat în doi radicali sulfat iar

aceștia inițiază reacția de polimerizare

Trebuie însă avut în vedere necesitatea prezenței TEMED

pentru această reacție. Eficiența polimerizării în acest sistem

scade rapid la valori ale pH-ului mai mici de 6,0

1.4. piperazin dimetil (1. 4 dimetilpiperazina, DMPIP)

reprezintă un alt catalizator utilizat în polimerizarea

vinilică. Acesta este însă un catalizator mai slab decât

TEMED, dar este mai bun pentru colorarea gelurilor cu

argint amoniacal (în acest caz se adaugă la sistemul

catalitic tiosulfat de sodiu alături de persulfat).

Un alt sistem catalitic utilizat la prepararea gelurilor de poliacrilamidă este format din

riboflavină și TEMED. Astfel, riboflavina, sub acțiunea radiație UV generează radicali

liberi care inițiază reacția de polimerizare. Sistemul conține și TEMED pentru a mări

viteza de reacție. Polimerizarea durează circa o oră iar în absența TEMED reacția

decurge în aproximativ 8 ore, după circa o oră, doar 60% din monomeri fiind

polimerizați, obținându-se astfel geluri nereproductibile, monomerii neintrați în reacție

putând interacționa cu resturile de aminoacizi din constituția proteinelor supuse separării

electroforetice, putând chiar interacționa cu diverse componente ale sistemului tampon.

De obicei fotopolimerizarea cu riboflavină drept accelerator, este utilizată pentru gelurile cu

pH scăzut .

Un sistem diferit de fotopolimerizare

cuprinde un colorant cationic (albastru

de metilen) și un cuplu redox alcătuit din

sodiu toluen sulfinat, un reducător și

clorură de difeniliodoniu, un oxidant

mediu

Catalizatori ai reacției de fotopolimerizare: A. clorură de difeniliodoniu

(DPIC); B. toluen sulfinat de sodiu (STS), C. albastru de metilen (MB).

Ultimul, poate fi utilizat și în combinație cu riboflavin-5'-fosfatul

FACTORII DE CARE DEPINDE VITEZA REACȚIEI DE

POLIMERIZARE

Viteza reacției de polimerizare depinde de:

(1) Concentraţia netă de monomeri şi de radicalilor liberi ( de obicei se utilizează TEMED

în concentrație de 10 mM și persulfat);

(2) Temperatura la care are loc reacția de polimerizare. În acest context se cunoaște că

reacția de polimerizare este exotermă și din această cauză temperatura trebuie să fie

controlată cu atenție. Ea se desfășoară mai ușor la temperatura camerei, cu toate că există

matrice termostatate. În general la gelurile plate, disiparea căldurii este mai eficientă cu cât

grosimea gelului este mai mică;

(3) Puritatea reactivilor;

(4) Concentrația de inhibitori. Prin inhibitor trebui înțeles orice compus care distruge

radicalii liberi. Astfel, orice compus care poate acţiona ca o trapă pentru radicalii liberi va

acţiona ca un inhibitor de polimerizare. Oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor

și din acest motiv este necesară o degazare corespunzătoare a amestecului de polimerizare

pentru a elimina oxigenul dizolvat în soluţiile de acrilamidă. Prezența oxigenului este critică

pentru o reproductibilitate absolută a electroforezei. Cu toate acestea, pot fi acceptabile și

geluri obținute fără o degazare completă. Alți inhibitori ai reacției de polimerizare sunt (a)

aminele alifatice, (b) compușii aromatici precum piridina, (c) protonii (existenți în mediul

acid).

Pentru ca gelurile să fie reproductibile, toți acești parametrii trebuie să fie controlați cu

atenție.

PROPRIETĂȚILE GELULUI DE POLIACRILAMIDĂ

Prin polimerizarea acrilamidei cu bisacrilamida, se formează o rețea tridimensională în condițiile în care

agentul de reticulare bifuncțional se leagă de lanţurile liniare de poliacrilamidă adiacente formând un mediu

poros în care dimensiunile porilor sunt în funcție de concentrațiile inițiale ale monomerilor (acrilamidă și

bisacrilamidă) și de condițiile de realizare a reacției de polimerizare (sistem catalitic, temperatură, etc.).

Prin convenţie, gelurile de poliacrilamidă sunt caracterizate printr-o pereche de valori, T% şi

C%, în cazul în care T% reprezintă procentul de greutate al cantității totale de monomeri,

inclusiv a agentului de reticulare (în g/100 ml),

adică:

unde a reprezintă cantitatea de acrilamidă iar b este cantitatea de

bisacrilamidă în timp ce V este volumul total de soluție.

C(%) reprezintă procentul (proporția) de agent de reticulare ca procent din totalul de

monomeri, adică din cantitatea totală de monomeri.

C(%) se calculează după relația:

După cum se observă, C(%) este practic gradul de reticulare.

S-au observat o serie de anomalii în condițiile în care se utilizează doi agenți de

reticulare cu mase moleculară diferită. Aceștia nu vor avea aceeași frecvență.

agentul de reticulare mai mic va avea o frecvență mai mare. Astfel, uneori se

utilizează fracția molară, X care poate fi definită ca:

Efectul de cernere moleculară

Termenul de por nu definește un element geometric decât în sens orientativ și comparativ.

Mărimea porilor semnifică rezistența opusă de rețeaua tridimensională a gelului la

deplasarea macromoleculelor (în speță a proteinelor). Cu ajutorul gelului de poliacrilamidă

se pot separa molecule de la câteva sute la câteva milioane de daltoni. Mărimea efectivă a

porilor este în funcție de concentrația totală a monomerilor, T (%) și de proprietățile

agentului de reticulare, C (%).

Dependența de concentrația de monomeri, T(%) și C(%)

O macromoleculă cu sarcină electrică dată în funcție de dimensiunile sale și de

dimensiunile porilor va fi mai mult sau mai puțin frânată în deplasarea sa în câmp, fiind

caracterizată printre altele, prin mobilitatea electroforetică. În practică se folosește

mobilitatea relativă electroforetică care este proporțională cu distanța de migrare. Ea se

calculează prin compararea mobilităților diferitelor macromolecule considerând timpul

de separare și intensitatea curentului electric, constante.

Mobilitatea relativă se notează cu Rf și definește ca raportul

dintre mobilitatea unei macromolecule oarecare și mobilitatea

unei macromolecule standard sau a unui colorant care migrează

cu frontul. Rf poate fi definit și ca raportul între mobilitățile

unei macromolecule în mediu restrictiv µ și mobilitatea sa într-

un mediu liber, nerestriciv, µo după relația:

Rf este o constantă fizică care caracterizează o macromoleculă dată într-un gel cu

o anumită compoziție, în condiții definite

Pentru a obține date despre: (a) dimensiunile și sarcina netă a unei macromolecule, (b) omogenitatea,

(c) concentrația optimă a unui gel care poate rezolva sau diferenția două specii moleculare, se folosesc

reprezentările Ferguson (figura alăturată).

KR (măsura frânării deplasării macromoleculei în gel) și y0 (măsură a mobilității macromoleculei în

mediu liber, nerestrictiv la T (%)=0) sunt parametrii caracteristici ale macromoleculei luate în studiu.

În plus, y0 poate fi corelată cu sarcina electrică netă.

În lumina acestei reprezentări gelurile pot fi:

Zerodimensionale, când fibrele de polimer au o lungime aproximativ egală cu 0, polimerul fiind liniar

și supraînfășurat formând suprafibre cu pori mari cu raza de 20-40 nm.

Unidimensionale, când fibrele de polimer au o lungime ”infinită” iar numărul de capete este

neglijabil. Este cazul poliacrilamidei convențional reticulate cu C(%)=2-5% care pare a avea

predominant caracter de gel unidimensional cu fibre cu rază de 1-2 nm.

Reprezentarea Ferguson. Din panta

dreptei (α) se calculează coeficientul KR iar

din intersecția cu axa oy se obține yo

valoare dată pentru T(%)=0.

Configurațiile geometrice probabile ale diferitelor tipuri structurale de geluri de poliacrilamidă

Tipuri structurale de geluri de poliacrilamidă. A. Poliacrilamidă

nereticulară cu C(%)=0%. Este un gel unidimensional iar consistența

polimerului este lichid-vâscoasă. B. Un gel de poliacrilamidă cu C(%)

de valoare medie. C. Un gel de poliacrilamidă cu C(%) de valoare mare.

D. Un gel de poliacrilamidă reticulat pur, zerodimensional

(C(%)=T(%)).

La valori ale C% situate în domeniul 5-50%, fibrele de poliacrilamidă sunt

zerodimensionale, supraînfășurate, diametrul porilor crește, iar practic moleculele

nu mai sunt frânate în migrarea lor în câmp electric. Figura de mai jos prezintă

dependența factorului de frânare în funcție de concentrația totală de polimeri, T%.

Dependența mărimii porilor de gradul de reticulare, C(%).

În ceea ce privește dependența mărimii porilor de parametrul

T(%), se poate spune că la o valoare constantă a gradului de

reticulare (C%=2-5%), mărimea porilor scade pe măsură ce

valoarea parametrului T% crește după relația:

Astfel, mărimea efectivă a porilor a unui gel de

poliacrilamidă este o funcţie inversă a concentrației totale

de monomeri (T%). Pentru orice concentrație totală de

monomer dat, dimensiunea porilor efectivă, variază de

asemenea, în funcţie de proporţia de agent de reticulare din

amestecul de reacţie (C%). Odată cu creșterea T(%), la o

concentrație scăzută de agent de reticulare, numărul de

catene liniare crește, iar mărimea porilor scade. Când T%

este crescut la o concentrația fixă, dar scăzută de agent de

reticulare, numărul de catene crește iar dimensiunea

porilor se reduce. Pe de altă parte, dimensiunea porilor este

o funcţie bifazică dependentă de C (%). În condițiile în care

se variază C (%), la un T% constant, scade dimensiunea

porilor, nivelul minim fiind atins la aproximativ C=5%

Pe lângă aplicațiile evidente de analiză a purității unor probe proteice, disc-electroforeza

este utilizată la determinări fizico-chimice. Dacă proteina supusă analizei într-o serie de

geluri cu concentrații (T%) și se măsoară mobilitatea ei electroforetică relativă, Rm (Rm, Rf

este definit ca raportul dintre distanța migrată de proteina dată și distanța migrată de

colorantul trasor, de obicei albastrul de bromfenol) în fiecare gel se poate construi o

diagramă liniară, log Rm versus T% (diagrama Ferguson). Această reprezentare poate da o

importantă informație: panta acestei drepte este o măsură a mărimii moleculare și este

denumită coeficient de retardare (retardation coefficient, KR). Prelungirea acestei drepte care

intersectează axa 0y (Y=Rm când T=0) este o măsură a mobilității electroforetice în condiții

libere (când gelul nu este prezent) și așadar este o măsură a sarcinii electrice nete.

Reprezentarea grafică a

logaritmului mobilității

electroforetice a BSA

versus concentrația

(densitatea) gelului (T%) la

un grad de reticulare (C%)

constant de 2%.

În cazul electroforezei bidimensionale, prima dimensiune se realizează în cele

mai bune condiții în geluri cilindrice.

Dacă gelurile placă pot fi în egală măsură omogene sau în gradient, gelurile

cilindrice sunt de obicei omogene.

Creşterea ulterioară a C% cauzează formarea de legături mai scurte şi mai

groase de lanţuri de polimer. Utilizarea unor reactivi de înaltă calitate este o

condiţie prealabilă pentru obținerea unor geluri reproductibile și de înaltă

rezoluţie. Acest lucru este valabil mai ales pentru acrilamidă, care constituie

componenta cea mai abundentă în amestecul de monomeri. Reziduurile de

acid acrilic, poliacrilamidă liniară şi a impurităţilor ionice sunt contaminanţi

majori care scad calitatea preparatelor de acrilamidă.

1. Acid acrilic va copolimeriza cu acrilamida şi bisacrilamida, ceea ce pentru

gelul rezultant conferă proprietăţi de schimbător de ioni.

2. Poliacrilamida lineară, prin furnizarea unui nucleu de polimerizare

necontrolat, poate conduce la geluri nereproductibile.

3. Contaminanţii ionici pot să includă atât inhibitori cât și acceleratoriai

reacției de polimerizare. În special, metale precum cuprul poate inhiba

polimerizarea gelului.

Componentele tampon trebuie să fie de grad de reactiv şi numai apa

deionizată trebuie să fie utilizată pentru toate fazele electroforezei pe gel de

poliacrilamidă.

STRATEGIA DE SEPARARE A

PROTEINELOR PE GELURI DIN

POLIACRILAMIDĂ

În funcție de proprietățile proteinei (proteinelor) luate în

studiu și în funcție de scopul urmărit, trebuie avut în

vedere:

- compoziția chimică, concentrația și structura gelului

de poliacrilamidă (gel omogen, gel în gradient, etc.);

- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);

- condițiile de separare (denaturante, nedenaturante,

disociative, nedisociative);

- sistemul tampon (continuu sau discontinuu)

- forța ionică și pH-ul sistemului tampon.

Compoziția chimică, concentrația și structura gelului de poliacrilamidă

Din punct de vedere al compoziției chimice, acrilamida poate fi polimerizată cu bisacrilamida

(cel mai adesea folosită), bisacrilcistamina (BAC), dialiltartatdiamina (DATD),

dihidroxietilenbisacrilamida (DHEBA), etc. Ultimii trei agenți de reticulare se utilizează la

prepararea gelurilor solubilizabile, în tehnici la scală micropreparativă, deoarece acești

agenți permit solubilizarea gelului în condițiile cele mai avantajoase pentru conservarea

integrității structurale și funcționale a proteinelor luate în analiză.

Dacă gelul este format din două zone, gelul de concentrare (T%=4%) este plasat deasupra

gelului restrictiv de rezolvare, ultimul având o concentrație de monomeri cuprinsă între 5 și

30%. Gelul de concentrare (de stivuire) conține tampon Tris-HCl 0,125 M, pH=6,8, iar gelul de

separare conține tampon Tris-HCl 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele două

geluri suprapuse este desemnată pentru a regla mobilitatea efectivă ale ionilor de glicinat

din compartimentul catodic. Concentrațiile de tampon Tris-HCl din cele două geluri derivă

din considerații electrochimice. Porozitatea gelului de concentrare este atât de mare pentru

a nu împiedică mișcarea proteinelor și funcționează în general ca un mediu suport cu

proprietăți anticonvective în timpul formării zonei înguste de start. Separarea proteinelor se

realizează mai jos, în gelul de rezolvare. Porozitatea acestui din urmă gel este determinată

empiric fiind potrivită mobilității proteinelor din probă. Nu există o regulă clară pentru a

predicționa concentrația corectă a concentrației de gel pentru un amestec de proteine

necunoscute neanalizate electroforetic. Alegerea este făcută astfel ca proteinele de interes

să se separe în gel. În mod obișnuit se începe cu un gel cu 7,5%T pentru electroforeza

inițială a probei cu mobilități necunoscute.

Concentrația gelului se referă la concentrația totală a monomerilor (parametrul

T%) și a gradului de reticulare (parametrul C%) Pentru proteine bine caracterizate,

alegerea concentrației gelului nu reprezintă o problemă. În general, pentru

proteine cu masă moleculară cuprinsă între 20.000 și 150.000 daltoni, se

recomandă geluri cu T%=5-12%. În cazul proteinelor cu masă moleculară cuprinsă

între 10.000 și 80.000 daltoni se recomandă geluri cu T%<10-12% iar în cazul

proteinelor masă moleculară mai mică de 15.000 daltoni se utilizează geluri cu

T%>15%.

Structura gelurilor este strâns legată de parametrii T(%) și C(%) Astfel, un gel

omogen se caracterizează printr-o singură valoare a concentrației totale de

monomeri, T(%), în timp ce un gel cu gradient este caracterizat printr-un gradient

de concentrație, deobicei cuprins între 5 și 20%. Gelurile în gradient sunt mai

avantajoase deoarece oferă mai multe date despre proteinele supuse

electroforezei. Gradientul poate fi liniar sau exponențial, putând astfel vorbi

despre gradient de pori. Gelurile omogene au pori de aceeași mărime.

Pentru obținerea unei rezoluții optime de separare a două proteine, se folosește

un gel omogen de concentrație potrivită. Concentrația gelului este în funcție de

mărimea și sarcina electrică a proteinei luate în studiu, putând să fie stabilită

(determinată) prin măsurarea mobilității fiecărei proteine într-o serie de geluri de

concentrații (T%) diferite.

Se disting patru categorii de probleme (situații) de separare:

•Cele două proteine au densități de sarcină electrică identice, deci mobilități identice

într-un mediu nerestrictiv (panelul A).

•Proteina cu mobilitate mai mare (densitate de sarcină electrică mai mare) este mai mică în

dimensiuni. În acest caz separarea se realizează pe baza mobilității și a masei moleculare.

Se consideră că cele două proteine sunt sinergice iar prin creșterea concentrației de gel

crește și rezoluția de separare (panelul B).

•Una dintre proteine are dimensiuni mai mari și mobilitate electroforetică mai mare. În acest

caz separarea se realizează în funcție de dimensiune și sarcină electrică, cele două proteine

fiind antagoniste. Cazul este caracteristic sistemelor nedisociative (panelul C).

Două proteine au aceleași dimensiuni dar au mobilități electroforetice diferite (este cazul

izoenzimelor, hemoglobinelor, etc.). În acest caz concentrația monomerilor nu are efect

asupra separării relative a celor două proteine. Situația corespunde separărilor prin focusare

izoelectrică sau prin izotacoforeză (panelul D).

Soluțiile de monomeri se prepară uzual ca soluții stoc, concentrate. Pentru gelurile utilizate în

separarea de proteine este preferată o soluție stoc de monomeri cu T%=30% și C%=2,7% care se

prepară prin dizolvarea a 29,2g de acrilamidă și 0,8g de bisacrilamidă în 70 ml de apă complet

deionizată (volumul final fiind de 100 ml iar densitatea specifică de 1,025). Soluția de monomeri

trebuie filtrată și stocată la rece, preferabil într-un vas de sticlă. Pentru gelurile utilizate în

separarea de acizi nucleici se folosește un amestec alcătuit din acrilamidă:bisacrilamidă cu

T%=30% și C%=3,3% preparată din 29g de acrilamidă și 1g de bisacrilamidă.

Concentrațiile de inițiator sunt determinate empiric prin urmărirea polimerizării în timp de 15-

20 minute după adăugare. În aceste condiții, gelificarea se realizează complet în 90 de minute.

Dacă se utilizează geluri de concentrare, este necesar ca acestea să aibă structuri poroase mari.

Pentru o polimerizare rapidă (în circa 8-10 minute) se adaugă persulfat de amoniu, la o

concentrație finală de 0,05% respectiv TEMED, 0,1%.

Soluțiile stoc de monomer și de tampon se combină până la concentrația dorită și apoi se

deaerează sub un vid modest timp de aproximativ 15 minute. Inițiatorul și catalizatorul sunt apoi

adăugate iar amestecul se toarnă în aparatul montat. Dacă se utilizează gel de concentrare, se

prepară și se toarnă mai întâi gelul se rezolvare (separare). El este apoi acoperit cu o soluție de

izobutanol saturat în apă pentru a exclude aerul din vecinătatea superioară a gelului și pentru a

forma o legătură puternică între cele două geluri. După aproximativ o oră, stratul de alcool este

îndepărtat și gelul format în partea superioară se spală cu apă până la dispariția mirosului

caracteristic de butanol, după care se toarnă amestecul de gel de concentrare peste gelul de

separare și se introduce un ”pieptene” formator de godeuri pentru a forma spații în care se aplică

proba. După finalizarea polimerizării și îndepărtarea pieptenului, gelul este gata de utilizare.

Gelurile de poliacrilamidă sunt inerent instabile în afara domeniului de

pH cuprins între 4 și 6. După un stocaj de aproape 4 luni la o temperatură

de 4oC, în tampoanele uzual utilizate în electroforeză, uneori are loc o

scădere notabilă a profilului benzilor separate electroforetic. Astfel,

pentru a obține o rezoluție maximă, este necesar să se utilizeze numai

geluri proaspăt preparate. Alterarea structurii poliacrilamidei este un

proces lent de hidroliză a grupărilor carbox-amididice (-CO-NH2) ale

monomerilor de acrilamidă și care se manifestă în tampoane bazice.

Hidroliza conduce la formarea unor grupări carboxil (-COO-), ionizabile.

Gelurile vechi umflate au o structură a porilor este schimbată ele luând

caracteristici de schimbători de ioni datorită hidrolizei. Îmbătrânirea

gelurilor de poliacrilamidă are o semnificație comercială deoarece

limitează perioada de utilizare a gelurilor preturnate.

Forma gelului

Primele electroforeze care au folosit poliacrilamida drept mediu suport s-au efectuat pe

geluri plate, orizontale și apoi pe geluri cilindrice (unde amestecul de polimerizare se toarnă

în tuburi de sticlă sau plexiglace). În prezent însă, în majoritatea cazurilor se apelează la

separarea pe verticală în geluri plate (geluri placă), cu o grosime a gelului cuprinsă între 50

µm și 3 mm.

Gelurile placă orizontală (sau verticală) sunt simplu de preparat , într-un timp scurt. Pe

un astfel de gel se aplică mai multe probe, inclusiv proteine standard cu masă

moleculară cunoscută, separându-se în condiții identice. Numărul de probe aplicate este

în funcție de necesități iar analiza calitativă și estimările cantitative se efectuează cu mai

multă ușurință și precizie în cazul gelurilor cilindrice. Se elimină astfel artefactele optice,

ceea ce face posibilă fotografierea corectă. În plus, în cazul gelurilor placă, căldura

produsă prin efect Joule este mai repede disipată comparativ cu gelurile cilindrice iar

uscarea gelurilor este relativ simplă.

Gelurile cilindrice sunt

de neînlocuit la separarea proteinelor marcate cu radioizotopi când se urmărește

determinarea cantitativă a radioactivității.

Ele sunt de preferat atunci când trebuie determinată activitatea enzimatică a

fracțiunilor separate deoarece cantitatea aplicată este mult mai mare (fără a afecta

calitatea separării).

Gelurile cilindrice sunt preferate la testarea pH-ului optim de lucru și a concentrației

optime a gelului de poliacrilamidă

CONDIȚII DE SEPARARE

Condițiile de separare trebuie să asigure o solubilizare completă a probelor

proteice, alegerea acestora realizându-se sistematic în funcție de proprietățile

hidrofile/hidrofobe ale proteinelor.

Pentru testarea solubilității numai prin disocierea legăturilor hidrofile, proba este

incubată în soluții tampon alcaline, neutre și acide, în prezența/absența clorurii de

potasiu (0,1-0,5 M), la o temperatură de 4oC, pentru a nu afecta activitatea

biologică.

Dacă proba nu se solubilizează, se repetă testarea în

prezență de EDTA (etilendiaminotetraacetat), 0,1 M. EDTA

complexează ionii metalici divalenți și astfel se desfac

legăturile în care aceștia sunt implicați.

Urea este deseori utilizată ca agent de disociere în electroforeza pe gel. Urea, care disrupe

legăturile de hidrogen și legăturile hidrofobe poate cauza agregări nedorite ori formarea

unor structuri secundare care afectează mobilitățile proteinelor. Ea este deseori utilizată în

denaturarea acizilor nucleici. Urea este un component esențial al gelurilor la care este

necesară menținerea configurațiilor unicatenare a ADN sau ARN, pentru a se determina cu

acuratețe masele moleculare. Disocierea legăturilor de hidrogen necesită uree în

concentrații mari (7-8 M).

Poliolii (de exempul glicerina, trixidroxipropan, propantriolul) este folosită frecvent pentru

solubilizarea proteinelor în condițiile menținerii activității biologice.

O N CH2 CH2 OHO N CH2 CH3

A B

Structura chimică a N-etilmorfolinei (A) și a hidroxietilmorfolinei (B)

Dacă proba continuă să rămână insolubilă se recurge la detergenți,

compuși care modifică hidrofobicitatea relativă a proteinelor și care astfel

îmbunătățesc separarea electroforetică. Într-o mică măsură același efect

se obține prin folosirea tampoanelor relativ hidrofobe pe bază de N-

etilmorfolină sau hidroxietilmorfolină

Electroforeza în condiții denaturante

Cea mai mare parte a studiilor de electroforeză în gel de poliacrilamidă folosește condiții

denaturante, disociative. În aceste condiții, proteinele oligomere disociază în lanțuri

polipeptidice, componente. Astfel, proteinele își pierd activitatea biologică. Detergenții se

utilizează în electroforeză când este necesară disruperea interacțiilor proteină-lipid și

proteină-proteină. În acest scop au fost utilizați o serie de detergenți. Cel mai cunoscut

agent de disociere este dodecilul sulfat de sodiu (lauril sulfatul de sodiu, SDS). SDS este un

detergent ionic care are formula CH3-(CH2)10-CH2-SO3-Na+.

Structura chimică a

dodecilsulfatului de sodiu, SDS.

Se observă brațul nepolar și

regiunea polară care posedă o

sarcină negativă

Cele mai multe proteine sunt ușor solubile în SDS, făcând electroforeza în prezență

de SDS (SDS-PAGE) o metodă general aplicabilă.

Puritatea (calitatea) detergentului este o condiție importantă în SDS-PAGE.

Efectele impurităților prezente în preparatele de SDS sunt impredictibile.

Dintre contaminanți, cele mai nedorite efecte le au probabil alchil sulfații,

alții decât dodecil sulfatul (C12); în special decil sulfatul (C10), tetradecil

sulfatul (C14) și hexadecil sulfatul (C16) Aceștia se leagă la proteine cu

afinități diferite și în consecință afectează mobilitățile.

Contaminanții lipofilici prezenți în preparatele de SDS, printre care

dodecanolul, pot fi incluși în complexele SDS-proteină și în micelele de

SDS conducând la scăderea rezoluției. Numai SDS purificat (care se

realizează prin recristalizare în n heptan) trebuie utilizată pentru

electroforeză, dar chiar cu SDS pur, diferite glicoproteine, lipoproteine și

nucleoproteine au tendința de a se lega la detergent neregulat, rezultanta

fiind o migrare anormală a complexelor SDS-polipeptide în ceea ce

privește masele lor moleculare. În plus, prezența unor săruri anorganice în

preparatul de SDS conduce la modificarea proprietăților tensioactive ale

acestuia. Dintre proprietățile fizice ale SDS se pot aminti:

SDS are o solubilitate în apă de 3% (masă/volum);

SDS precipită la temperaturi cuprinse între 0-10oC.

Dodecil sulfatul de litiu (lithium dodecyl sulfate, LDS) a fost uneori

substituit SDS în analizele efectuate pe geluri de poliacrilamidă după cum

bromura de cetiltrimetilamoniu (cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)

a fost de asemenea utilizată în electroforeza proteinelor.

LDS este mai solubil decât SDS și nu precipită la temperaturi scăzute (la

4oC se leagă afin la poliacrilamidă, deși la 25oC nu prezintă o astfel de

proprietate), ceea ce permite migrarea gelurilor la temperaturi scăzute. S-

a constatat că dacă într-un sistem tampon continuu, SDS este înlocuit cu

LDS, separarea moleculelor cu masă moleculară mică este accelerată

datorită deficitului de LDS în regiunea frontală a gelului. Dacă gelul este

saturat în LDS, rezoluția separării la 4oC pe acest gel este mai bună decât

cea obținută după electroforeză un gel de poliacrilamidă în prezență de

SDS efectuată la 25oC.

CTAB este un denaturant mai slab decât SDS, prezervând anumite

activități biologice care sunt distruse de către SDS.

Majoritatea proteinelor leagă SDS într-un raport constant de 1,4g SDS/gram proteină. În

aceste condiții, sarcinile intrinseci (proprii) ale polipeptidelor sunt nesemnificative

comparativ cu sarcinile electrice negative rezultate după legarea SDS. Densitățile de

sarcină electrică superficială ale complexelor SDS-polipeptide sunt în principiu

identice, ceea ce permite separarea (într-un gel cu porozitate controlată) strict în funcție

de dimensiunile polipeptidelor. În acest fel, pe lângă compoziția (conținutul)

polipeptidelor din probă, se determină și masele moleculare ale polipeptidelor, dacă

sunt separate în același timp cu un set de proteine cu masă moleculară cunoscută, prin

raportare la acestea. Tehnica de lucru este simplă iar cantitatea de probă este de

ordinul a micro sau a nanogramelor.

Cea mai mare parte dintre proteine se solubilizează în SDS, indiferent de sursă, însă

există și excepții: astfel, glicoproteinele și lipoproteinele nu pot fi saturate în SDS,

deoarece, în primul caz, partea neproteică a unităților hidrofile oligozaharidice previn

legarea micelelor de SDS partea proteică numai interacționând cu acesta. Proteinele

puternic bazice (de exemplu, histonele) interacționează prin legare electrostatică a

micelelor de SDS prin intermediul grupărilor sulfat.

În cazul glicoproteinelor, impedimentul poate fi relativ îndepărtat prin

utilizarea tampoanelor Tris-borat în condiții alcaline, astfel crescându-se sarcina netă

negativă a glicoproteinelor ceea ce conduce la viteze de migrare bine corelate cu masa

moleculară.

Migrarea histonelor poate fi îmbunătățită prin utilizarea gelurilor în gradient de

pori care permit catenelor polipeptidice să acceadă la limita lor de pori.

Pe de altă parte, proteinele pure, au tendința ca la temperaturi

ridicate să formeze agregate și să precipite. Este cazul

hemaglutininei bacteriene care disociază complet după 30 de

minute de fierbere la 100oC în prezență de SDS. Competiția

agregare/dezagregare se poate rezolva prin scăderea

concentrației proteinei din probă. Practic, testarea celui mai bun

amestec de disociere se face prin păstrarea constantă a

concentrației proteice, a concentrației de agent reducător (de

obicei β-mercaptoetanol), și a concentrației de detergent cu

varierea timpului de incubare. Dacă rezultatul este

nesatisfăcător, se trece la varierea unui alt parametru dintre cei

arătați mai sus.

S-a studiat interacțiunea diferiților detergenți anionici cu albumina serică bovină

(BSA). În stare nativă, BSA conține 10-11 situsuri cu constante mari de legare a ionilor

de detergent. Legarea ionilor de detergent de proteina nativă nedenaturată se

realizează secvențial (unul după altul), în timp ce legarea detergentului la proteina

denaturată este puternic cooperativă. Existența complexelor discrete proteină-detergent

sugerează că asocierea ionilor de detergent este, de asemenea importantă, atunci când

afinitatea detergentului pentru proteină este mai mică. Un raport de legare mai mare

decât cel normal pentru un singur situs de legare se explică numai prin formarea de

micele de detergent în acel loc, adică ionii de detergent se leagă atât la proteină cât și la

ionii de detergent deja legați. acest fenomen este numit amplificarea legării, iar acest tip

de legare poartă numele legare micelară și s-a demonstrat că este reversibil. La

atingerea concentrației micelare critice acest mecanism încetează.

Saturarea cu SDS a unei proteine depinde de asemenea în punctul izoelectric

al acesteia, indirect influențând comportamentul electroforetic. De asemenea, saturarea

cu SDS este posibilă la temperatura camerei și se aplică la electroforeza

bidimensională, gelurilor folosite la separarea proteinelor prin focusare izoelectrică fiind

pregătite pentru a doua dimensiune, electroforeza pe gel de poliacrilamidă în prezență

de SDS (SDS-PAGE). În acest caz, incubarea la fierbere este înlocuită printr-o incubare

la temperatura camerei într-un amestec format din uree, 9M și Triton X-100, 20%.

Un alt agent de disociere foarte aplicat în disocierea probelor pregătite pentru

electroforeză este ureea.

Denaturarea produsă de uree este dependentă de temperatură, pH și tărie

ionică. Pentru o denaturare completă, se utilizează uree cu o concentrație mai

mare sau egală cu 8M, alături de agenții reducători ai punților disulfurice. Totuși

există proteine care nu se pot denatura.

Avantajul utilizării ureei drept agent de denaturare constă în faptul că în

unele separări electroforetice ea nu afectează sarcina electrică intrinsecă a

proteinei permițând astfel o separare atât în funcție de masa moleculară cât și în

funcție de sarcina electrică. Efectul denaturant al ureei datorat ruperii legăturilor

de hidrogen inter și intramoleculare poate fi reversat prin îndepărtarea ei prin

dializă.

Dezavantajele utilizării sale constau în faptul că nu se poate determina cu

precizie masa moleculară, nu este la fel de eficientă ca SDS în disocierea

proteinelor. De exemplu, ureea disociază în proporție de 50% un lizat celular brut

(la electroforeză, 50% din lizat este agregat nefiind apt să penetrteze gelul) în timp

ce SDS disociază același preparat în proporție de 90%.

Unele proteine, pentru a fi disociate complet necesită prezența simultană

a SDS și a ureei.

Clorura de guanidină (guanidina hidroclorică) este, de asemenea, un

agent de disociere utilizat în disocierea probelor pregătite pentru

electroforeză. În concentrații de 4-6M, ea realizează ruperea legăturilor

necovalente provocând desfacerea structurii cuaternare și distrugerea

structurilor secundare și terțiare datorită capacității superioare de a

participa la stabilirea legăturilor de hidrogen. Majoritatea proteinelor în

guanidină hidroclorică au o conformație total dezordonată și din această

cauză este rareori folosită în separările electroforetice.

Disocierea completă a celor mai multe proteine se realizează prin

incubarea probei diluate în tamponul de migrare la 95-100oC (pe baie de

apă) timp de 2-5 minute în prezența atât a SDS în exces cât și a β-

mercaptoetanolului, ditioeritrolului sau ditiotreitolului (agenți utilizați la

reducerea punților disulfurice)

Mecanismul reducerii

punților disulfurice de

către tiocompuși.

Coloana din stânga:

reducerea cu monotioli

(de tipul β-

mercaptoetanolului).

Coloana din dreapta:

reducerea cu ditioli

ciclizabili (cum ar fi

ditiotreitolul, DTT).

Sferele întunecate

reprezintă suprafața

proteinei.

În procedura Laemmli (1970) probele pregătite pentru electroforeză pe gel de

poliacrilamidă în prezență de SDS (SDS-PAGE) se prepară în tampon Tris-HCl, 0,0625

M, pH 6.8, SDS, 2%, β-mercaptoetanol, 5%, glicerol, 10%, și aproximativ 0,025%

(greutate/volum) colorant de monitorizare a migrării, albastru de bromfenol.

Este de preferat a se prepara un stoc de tampon pentru probă care să conțină toate

componentele cu excepția β-mercaptoetanolului, acesta adăugându-se chiar înainte de

utilizare. Glicerolul oferă probei o densitate care îi permite depunerea sa în godeul

gelului de separare aflat sub tamponul de migrare.

Colorantul de migrare permite atât aplicarea probei cât și monitorizarea migrării

electroforetice (el migrează odată cu ionul frontal, adică odată cu frontul).

Cantitatea de detergent prezentă în tamponul probei este suficientă pentru a asigura

saturarea amestecului de proteine. În cazuri rare, când proba are o tărie ionică foarte

crescută (> 0,2 M), ea poate fi dizolvată în tamponul stoc al probei (tamponul de

încărcare) într-un raport de 1:1 (v/v), fiind totuși, mai indicată o diluție într-un raport de

cel puțin 1:4 (v/v).

Cantitatea de proteină din proba care se încarcă pe un gel depinde de metoda de

detectare utilizată. Proteinele de interes care se încarcă pe gel trebuie să fie într-o

cantitate suficientă pentru a fi ulterior localizate. Detectarea în geluri impune o cantitate

de proteină/bandă de circa 1 µg pentru a avea o vizibilitate uşoară a benzilor proteice

colorate cu coloranţii anionici, de tipul Coomassie Brilliant Blue R-250 sau de 0.1 µg de

proteine/bandă în cazul colorării cu argint.

Electroforeza în condiții nedenaturante

În acest tip de electroforeză se păstrează conformația nativă a proteinelor,

interacțiile dintre subunități și activitatea biologică, separarea realizându-se pe

baza dimensiunii și sarcinii nete a proteinelor. În acest caz, se utilizează

detergenți neionici, în general nedenaturanți, folosiți la solubilizarea proteinelor

de membrană sau a altor proteine când se urmărește păstrarea activității

biologice.

Cel mai cunoscut detergent neionic utilizat în electroforeză este Triton X-100,

care din punct de vedere structural este o polioxietilenă, cu structura chimică

prezentată alăturat (unde n=10). În scopul deslușirii mecanismului molecular de

legare, s-a studiat interacția detergent-proteină. Astfel, Triton X-100

interacționează hidrofob cu unele proteine precum albumina serică bovină

(BSA), albumina serică umană, β-lactoglobulina, în timp ce alte proteine nu

leagă acest detergent (mioglobina, imunoglobulina G umană, etc.). S-a constatat

că BSA are 4 situsuri de legare a Triton X-100, nefiind însă o legare cooperativă

(prezentă la legarea cu SDS), probabil, datorită concentrației micelare critice

relativ mici. Avantajul utilizării Triton X-100 derivă din capacitatea de solubilizare

a proteinelor de membrană, iar în general, sunt preferați detergenți cu o

concentrație micelară critică mai mică de 1 mM.

SISTEME TAMPON

Deşi cunoştinţele cu privire la proprietăţile geluri sunt relativ modeste, se

cunoaşte destul de mult despre comportamentul ionilor din tampoane în

condițiile aplicării unui câmp electric. Astfel, au fost concepute o serie de

sisteme tampon interesante si utile, astfel încât există o mare flexibilitate în

alegerea sistemului de tampon

Tampon de electrolit, evident, are un efect profund asupra migrării electroforetice. Tipul de tampon utilizat

conduce la stabilirea condiţiilor intensității câmpului electric aplicat şi afectează separarea şi de aici

rezoluţia. Proteinele diferă foarte mult în sensibilitatea lor la tării ionice, specii ionice, pH, şi necesitățile

lor în cofactori. Astfel, sistemul de tampon utilizat este în funcție de proba care urmează a fi separată

electroforetic. Tamponul ales pentru separarea proteinelor prin electroforeză nativă (nedenaturantă) de

multe ori depinde mai mult de tipul proteinelor luate în studiu decât de cerințele electroforetice.

Sistemele electroforetice în care ionii unei singure soluții tampon sunt

prezenți în probă, gel și compartimentul electrozilor (concentrația lor putând

fi diferită) la un pH constant se numesc sisteme tampon continue. Un sistem

continuu de tampon se poate utiliza pentru separarea acizilor nucleici şi a

proteinelor în concentraţii de aproximativ 1 mg/ml sau mai mare. În acest caz, în

tancul electroforetic se folosește acelaşi tampon, la un pH constant, ca și la

prepararea gelului. De asemenea, proba este încărcată direct pe gelul unde se va

produce separarea electroforetică. După cum moleculele vor migra prin porii de

gel, acestea sunt fracţionate în funcţie de mobilitatea lor. Lățimea benzilor este

determinată în principal de volumul probei aplicate, acest parametru limitând

rezoluția în sistemele continue de electroforeză.

Probe diluate necesită volume mari pentru a furniza cantităţi detectabile de

material, obţinându-se benzi relativ largi. Utilizarea gelurilor de dimensiunea

porilor constantă, limitează sistemele continue la probe cu o concentrație mare de

proteine care conduc astfel la cele mai bune rezultate. De obicei gelul are porii

suficient de mici pentru a permite separarea în funcție de dimensiunile

macromoleculelor proteice.

Unele proteine plasmatice și celulare se pot separa mai bine în geluri de

poliacrilamidă cu gradient de concentrație în sistem continuu, viteza de deplasare

a proteinelor descrescând în timp și ajungând zero, odată cu atingerea limitei lor de

por. În acest fel, crește rezoluția de separare, electroforeza cu limită de pori fiind foarte

valoroasă pentru separări de proteine pe baza masei lor moleculare.

Se poate spune că într-un gel omogen separarea macromoleculelor se

realizează în funcție de sarcină electrică și masă moleculară, în timp ce într-un gel cu

gradient de concentrație, separarea macromoleculelor se realizează în funcție de

masă moleculară.

De exemplu, într-un gel omogen cu T%=7,5 α1-antitripsina are o mobilitate

mai mică decât albumina, migrând după aceasta, într-un gel în gradient de

concentrație, α1-antitripsina (MM=54.000 Da) va migra în fața albuminei

(MM=68.000Da).

Folosind geluri de poliacrilamidă cu gradient liniar de concentrație (gradient

de pori) %T=3-30, %C=3,8, în sistem de tampon continuu, se constată că distanța de

migrare (D) este proporțională cu logaritmul timpului de migrare după relația:

unde a reprezintă panta dreptei iar b este intersecția cu abcisa

Dreapta de regresie utilizată la calculul

masei moleculare a unei macromolecule

după electroforeză pe geluri cu gradient

de concentrație a porilor.

Există o relație liniară între logaritmul masei moleculare și logaritmul pantei

dreptei de regresie, dată de relația:

Această formulă este utilizată la calculul masei

moleculare a unei proteine studiate.

Îmbunătățirea puterii de rezoluție s-a realizat odată cu introducerea sistemelor de tampon

discontinue. Altfel spus, aceste sisteme sunt concepute pentru a accentua zonele probei pentru

separări de înaltă rezoluție. Sistemele de tampon discontinue (sau multifazice) utilizează ioni

de tamponare diferiți în gel şi în soluţiile de electrozi. În electroforeza zonală multifazică,

discontinuă, probele sunt aplicate pe un gel cu porozitate mare, gelul de concentrare

(stivuire), care serveşte ca și un mediu anticonvectiv. Toate speciile ionice, inclusiv

moleculele din probă, formează fronturi în mişcare.

Ionii din tamponul de gel, formează un front de ioni care se mişcă înaintea moleculelor

de probă.

Ionii din tamponul de electrozi formează un front care se mișcă în spatele probei.

Ionii din probă (macromoleculele cu sarcină electrică) dintre fronturile de tampon se

concentrează (”se stivuiesc”) în zone extrem de îngustă aranjate în ordinea descreșterii mobilităţii

lor. Moleculele din probă se concentrează (se stivuiesc) rapid, în regiuni foarte înguste, nu mai

mari de câteva sute de microni, cu conţinut proteic ridicat, de circa 100 mg/ml proteină.

Probele (macromoleculele) stivuite se vor deplasa prin pori mari ai gelului de stivuire

ca zone individuale foarte înguste, indiferent de volumul de probă iniţial, şi intră în gelul

restrictiv de rezolvare (sau de separare), gel cu o dimensiune mică a porilor, în serii foarte

înguste aflate la distanțe mici, unele de celelalte. Odată ajunse în gelul de rezolvare, cernerea

devine predominantă şi macromoleculele de probă "se destivuiesc" şi se separă, în funcţie de

mărimea şi sarcina lor electrică.

Sisteme de tampon discontinue

Ornstein (1964) şi Davis (1964) au dezvoltat pentru prima dată sisteme electroforetice pe gel de

poliacrilamidă (PAGE) de înaltă rezoluţie pentru separarea proteinelor native. Sistemul propus de

ei a fost atât de popular, încât este încă utilizat pe scară largă. Acesta a fost conceput pentru

analiza de proteine serice, dar funcţionează bine pentru o gamă largă de tipuri de proteine.

Sistemul de tampon Ornstein-Davis este prima tehnică de încercat atunci când se lucrează cu o

probă nouă de proteine native. Ornstein a recunoscut că o înaltă rezoluţie este atinsă atunci când

zona de start a proteinelor din probă este cât mai îngustă posibil. Astfel, el a conceput o metodă

electroforetică care comprimă zonele de proteină cu mult dincolo de limitele atinse prin mijloace

mecanice. Formularea lui se bazează pe ecuaţiile care descriu fluxul de curent în soluţii ionice şi

proprietăţile tampoanelor.

Ideea lui Ornstein a fost cea de includere a proteinele din probă într-un tip de sandwich intim

mărginit de două fronturi de ioni de electroliţi care se deplasează în câmp electric. Sub influenţa

câmpului electric, proteinele din probă devin comprimate între frontul de ioni conducător şi cel

de extremitate finală și segregă în zone învecinate, în ordinea de mobilităţi lor relative. Acest

proces are loc în regiune gelului cu pori mari, de concentrare. Proteinele din probă ajung la gelul

de rezolvare într-o bandă de start foarte subţire. Odată ce proteine trec în gelul de rezolvare,

predomină efectul de separare prin cernere moleculară. Sistemul Ornstein-Davis, folosește ioni de

clorură drept ioni conducători, după cum ionii glicinat sunt ioni finali, în timp ce ionul Tris este

un ion comun. Dintre componentele posibile disponibile în momentul în care sistemul

electroforetic a fost dezvoltat, proprietăţile acestor tampoane au fost cele mai potrivite pentru

cerinţele procesului de electroforeză. În timp, prin analize electrochimice s-au descris o serie de

sisteme tampon care se pretează separării electroforetice.

Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în condiții discontinue și nedenaturante

după Ornstein-Davis. Este instructiv de a considera evenimentele ionice care au loc în

timpul electroforeză discontinue, mai ales având în vedere popularitatea acestuia. Alte

sisteme discontinue funcţionează prin mecanisme similare.

Sistemul Ornstein-Davis, foloseşte la separarea proteinelor, două tampoane diferite care

conţin anioni diferiți şi un cation comun. Ionul clorură, prezent în gel de când acesta este

turnat, devine ion frontal iar ionii glicinat care provin din tamponul de migrare (tamponul

de electrozi) devine ion terminal. Ionul Tris, comun, susţine electroneutralitatea. Cele

mai multe proteine serice transport sarcini negative nete în acest sistem şi migrează

spre anod.

Sistemul Ornstein-Davis constă din patru părţi interdependente: (1) un gel de stivuire

(concentrare), (2) un gel de separare, (3) un tampon de electrod (de migrare), şi (4)

probă. Etapele succesive dintr-o separare electroforetică în sistemul de tampon descris

de Ornstein-Davis sunt prezentate în figura următoare.

Gelul este format din două secțiuni (panel A), o porțiune cu porozitate mare (gelul de

concentrare) cu T%=4 este turnată peste gelul restricitiv de rezolvare (T%=5-30). Gelul

de concentrare conține tampon Tris-Cl, 0,125 M, pH=6,8, în timp ce gelul de separare

conține tampon Tris-Cl, 0,375 M, pH=8,8. Discontinuitatea de pH dintre cele două zone

de gel este desemnată pentru a regla mobilitatea efectivă a ionului glicinat.

ei.

Etapele succesive dintr-o separare electroforetică în sistemul de tampon descris de Ornstein-Davis

Etapele separării unui amestec de proteine în sistem discontinuu tampon Ornstein-Davis. (A) gelul este format din două

secţiuni. Un gel de concentrare cu pori mari aflat în parte superioară este turnat peste un gel restrictiv de rezolvare

(separare). Fiecare secțiune de gel conţine tampon Tris-HCl, dar concentraţiile şi pH-urile celor două tampoane

corespunzătoare celor două secţiuni sunt diferite. Gelul de concentrație este indicat printr-o nuanță de gri deschis în timp

ce gelul de separare este de culoare gri-închis. Proba proteică dizolvată în tamponul gelului de concentrare diluat este

plasată în godeurile gelului de concentrare (linii orizontale întunecate). Tamponul Tris- glicină de electrozi (culoarea

fondului figurii) este în contact cu partea de sus a gelului, partea de sus a probei, precum şi partea de jos a gelului. Anodul

este situat în partea inferioară a gelului iar catodul se află în zona superioară, nefiind prezentate. În acest sistem proteinele

serice de exemplu, au sarcini nete negative şi se mișcă în jos spre anod. Ionii de Tris sunt distribuiți în întregul sistem şi

servesc la menţinerea electroneutralității. Intensitatea câmpului electric, E, la scurt timp după aplicarea unei tensiuni

electrice, este reprezentată în graficul din partea dreaptă a imaginii de gel. Câmpul electric din gel, E este relativ scăzut, ca

o consecinţă a conductivitate relativ ridicată datorată ionilor de clorură, mobili. (B). În momentul aplicării unei tensiuni,

constituenții anionici ai sistemului se vor alinia în ordinea de mobilităţi lor electroforetice. Magnitudinea mobilității ioni

clorură (Cl-), în zona tamponului de gel este mai mare decât mobilitatea ionului glicinat (Gly), provenit din zona tamponului

de electrozi. Proteinele din probă, cu mobilităţi intermediare, sunt introduse într-un sandwich (în ordinea de mobilitatea lor)

între frontul clorură şi frontul de ioni glicinat. Astfel, proteinele din probă devin "stivuite" în regiunea foarte îngustă dintre

cele cele două fronturi de ioni de tampon în mişcare şi formează, spațial, o zonă foarte îngustă de start. Intensitatea

câmpului electric este influenţată de distribuţie locală a purtătorilor de sarcină, care sunt proteinele din zona de probă.

Intensitatea, E, a câmpului în zone diferite care conțin ioni este ajustată, astfel încât toate fronturile ionice migrează cu

aceeaşi viteză. (C). La scurt timp după ce procesul de concentrare este finalizat, proteinele din probă trec în gelul de

rezolvare care este prevăzut cu pori mai mici pori unde mișcarea este încetinită datorită procesului de cernere moleculară.

În gelul de rezolvare, ionii de glicinat depășesc proteinele din probă şi vor migra chiar în spatele ionilor clorură. În timpul

etapei de rezolvare, proteinele vor răspunde la câmpul electric relativ ridicat determinat de ionii glicinat din gel.

Electroforeza continuă cu proteinele din probă în tampon Tris- glicină, până când aparatul este închis.

Stivuirea. Când este aplicată o tensiune de curent, ionii clorură din secţiunile de gel, proteinele

anionice din probă, precum şi ionii de glicinat din zona tamponului de electrod încep să se

deplaseze spre anod (panel B). Tris-ul (o bază), precum şi orice altă proteină cationică din probă

migrează spre catod. Aşa cum ioni de clorură părăsesc proba, în spatele lor se creează o regiune

localizată, de conductivitate scăzută și câmp înalt. Câmpul crescut din spatele frontului de ion

clorură accelerează proteinele din probă şi ionii de glicinat de la tampon electrodului la aceeaşi

viteză ca şi a ionilor clorură (Eµ=constant). Gradul de ionizare a glicinei, la pH-ul tamponului de

electrozi (pH=8,3) este de aşa natură că mobilitatea efectivă a ionilor glicinat este mai mică decât

ca a ionului clorură şi a proteinelor din probă. (Mobilitatea efectivă a unei electrolit slab este

mobilitatea medie a formei ionizate; µef=µx, unde x este fracţiunea de molecule ionizate la un pH

specific iar µ este mobilitatea acestuia. Fiecare moleculă poate fi gândită ca fiind ionizată x% din

timp şi neionizată restul timpului. pKa a glicinei este pH=9,8 iar la pH=8,3, moleculele de glicină

sunt disociate în proporție de 1/30 în ioni glicinat). O regiune a frontului mobil se formează rapid

cu ioni de clorură, frontali și ionii de glicinat în spate, iar proteinele din probă sunt comprimate

între ele. Proteinele formează, zone individuale subțiri, așezate precum fișicul de monede, în

ordinea descrescătoare a mobilităţii, între ionul conducător, clorură şi ionul de sfârşit, glicinat. În

acest timp, pH-ul gelului de concentrare devine 8,3 deoarece ionii de glicină se deplasează prin

acest gel. În stiva creată, fiecare zonă proteică se află într-un câmp electric scăzut care se mișcă

în față și un câmp electric ridicat aflat în spatele ei. Orice moleculă de proteină avansează în zona

din fața sa unde întâlnește un câmp electric cu intensitate scăzută, fiind încetinită până când zona

sa îl va prelua. Invers, o moleculă proteică care provine spatele acestei zone este accelerată de

câmpul electric crescut de acolo. În starea de echilibru, fiecare dintre proteine este concentrată

într-o zona îngustă, de înaltă densitate, determinată exclusiv de mobilitatea sa, în condiţii

electroforetice.

Separarea. În cazul în care regiunile mobile se deplasează în ajung la

interfaţa dintre gelul de concentrare (stivuire) şi gelul de rezolvare, proteinele

vor fi încetinite accentuat datorită existenței porilor restrictivi ai gelului de

separare. În acelaşi timp, pH-ul este brusc crescut la o valoare de 8,8 şi

creşte rapid la un pH de 9,5 deoarece tris-Cl se înlocuieşte cu tris-glicinat.

Mobilitatea efectivă a ionilor de glicinat la pH 9,5 este destul de mare și ca

atare depășește proteinele din probă care sunt încetinite în mișcare de către

porii gelului de rezolvare, migrând chiar în spatele frontului de clorură

(x=1/3) În aceste condiții zonele de proteine devin necomprimate şi începe

să se separe în benzi macroscopice prin cernere moleculară (panel C). In

gelul de rezolvare, proteine se mișcă la pH 9,5. pH-ul de operare a gelului

de separare, egal cu 9,5 a fost introdus în sistemul Ornstein-Davis pentru a

asigura o mobilitate eficientă a glicinatului, mai mare decât cea a celei mai

rapide proteine serice (prealbumina) în geluri cu %T=7,5. După cum are loc

progresul migrării, benzile proteice, inițial foarte subțiri se lățesc într-un ordin

de milimetrii, drept consecință a difuziei și diluției.

Principiul electroforezei pe gel de poliacrilamidă în sistem

discontinuu.

Laemmli (1970) a modificat sistemul Ornstein-Davis, pentru a permite

determinări ale greutate moleculară. Sistemul Laemmli conține SDS 0,1% în

tampoanele Ornstein-Davis şi utilizează o etapă de denaturare prin tratament termic

a probei. Tratamentul este conceput pentru a denatura complet proteinele de probă

în componentele lor polipeptidice constitutive înainte de electroforeză.

În momentul în care un amestec de proteine se incubează într-un tampon

care conţine SDS (2%) şi un agent tiol reducător, cum ar fi 2-mercaptoetanolul

(5%) la temperatură, proteinele sunt complet denaturate iar polipeptidele rezultate,

datorită SDS-ului, se încarcă cu o sarcină negativă uniform, în raport cu masa lor.

Agentul de reducere rupe legăturile disulfurice între segmentele proteinelor native,

în timp ce SDS, un denaturant bine-cunoscut, îmbracă polipeptidele uniform, cu 1,4

g de SDS pe gram de polipeptid. Proprietăţile detergentului ecranează proprietățile

polipeptidelor. Toate filmele SDS-polipeptide iau o formă similară prelungită,

asemănătoare unei vergea, cu dimensiuni proporţionale cu greutatea lor moleculară.

În plus, densitatea de sarcină a complexelor SDS-polipeptidă este independentă de

pH în intervalul 7-10 și astfel fracţionarea în gel este guvernată strict de procesul

de cernere moleculară, astfel încât prin utilizarea acestui sistem se poate la estima

greutățile moleculare ale polipeptidelor separate.

Electroforeza pe geluri de poliacrilamidă în condiții discontinue și denaturante

după protocolul descris de Laemmli.

O serie de tipuri de proteine nu se comportă într-un mod aşteptat în cursul SDS-

PAGE. Proteinele incomplet reduse, cu unele punți intra- sau intermoleculare disulfurice

intacte, nu sunt saturate cu SDS, deoarece o parte din domeniile lor de legare a SDS nu sunt

disponibile la detergent. Glicoproteinele şi lipoproteinele nu sunt, de asemenea, saturate cu

SDS, deoarece componentele lor neproteice nu interacţionează cu detergent. Proteine care

conțin secvențe neuzuale de aminoacizi, în special cele cu un conținut crescut în resturi de

lizină sau cele cu un conţinut crescut în resturi de prolină, proteinele foarte bazice şi cele foarte

acide se comportă anomal în SDS-PAGE, probabil pentru că raportul sarcină electrică/masă a

complexelor SDS-polipeptidă sunt diferite de cele care ar fi de aşteptat, dată pentru

dimensiunea lor. În mod similar, complexele foarte mari SDS-proteină, cu mase moleculare de

sute de kilodaltoni, ar putea avea conformații anormale.

Polipeptidele mai mici de aproximativ 12.000 Da nu sunt rezolvate bine în cele mai

multe sisteme SDS-PAGE. Complexe SDS-polipeptidă mici, fie au aceleaşi conformație

aproximativ sferică, fie nu pot fi separate de zona de micele de SDS pur care se formează în

spatele frontului de ioni conducători.

Sistemele electroforetice descrise de Laemmli și Ornstein-Davis pot fi utilizate la

separarea atât a proteinelor cât și a acizilor nucleici. În cazul separării acizilor nucleic, este

totuși preferat sistemul Laemmli deoarece în cazul acestei tehnici, prezența SDS conduce la

denaturarea nucleazelor contaminante.

ESTIMAREA MASEI MOLECULARE PRIN SDS-PAGE

În procedura descrisă de Laemmli, tratamentul probei anterior SDS-PAGE conduce la

desfacerea proteinelor în subunităţile lor componente şi lasă subunităţile acoperite cu detergent

anionic. Mobilităţile electroforetice ale tuturor complexelor polipeptidă-SDS rezultate își asumă

aceeaşi relaţie funcţională în referitoare la masa lor moleculară. Într-o primă aproximare, vitezele

de migrare a derivaților SDS sunt invers proporţionale cu logaritmii maselor lor moleculare. SDS-

polipeptidele, astfel, se vor deplasa prin geluri într-un mod previzibil, complexele cu masă

moleculară mică vor migra mai repede decât cele mari. Aceasta înseamnă că masa moleculară a

unei proteine poate fi estimată din mobilităţile relative ale subunităţilor sale în SDS-PAGE, calibrat.

Estimările de masă moleculară sunt printre aplicaţiile cele mai des folosite de electroforeza pe gel

şi reprezintă o parte a popularității SDS-PAGE prin metoda Laemmli.

Masele moleculare sunt determinate în SDS-PAGE prin compararea mobilităţii proteinei de

testare cu mobilităţile unor proteine marker cunoscute. Parametrul relevant este

mobilitatea relativă, Rf, definită ca mobilitatea a unei proteine raportată la mobilitatea

frontului de ioni. Acest parametru permite normalizarea mobilităţilor la o mărime

măsurabilă semnificativă şi caracteristică. Mai degrabă decât a determina mobilităţi, este

suficient să se calculeze Rf ca raportul dintre distanta parcursa de o proteina din partea de

sus a gelului de rezolvare împărţit la distanţă de migrare a frontului de ioni. Deoarece

frontul de ioni este dificil de a localiza, în practică, mobilităţile sunt normalizate la colorant

de urmărire care migrează doar puţin în spatele frontului de ioni:

Graficul log M vs Rf construit

din distanţele de migrare a

standardelor conduc la

calibrarea curbei gelului.

Valorile Rf ale proteinelor de

testat sunt apoi comparate cu

cele ale standardelor.

Interpolarea valorilor Rf ale

proteinei de testat pe curba

standard oferă masa ei

moleculară aproximativăCurbă de calibrare, logMr vs. Rf plotată cu o serie de markeri

de masă moleculară cuprins în domeniul 10.000-200.000Da,

separați pe un gel omogen (T%=10% și C%=2,75%) de

poliacrilamidă în prezență de SDS. Se poate observa deviația

de la linearitate. Proteinele marker sunt (masa moleculară,

Mr fiind dată în kDa): miozină (194); RNA polimerază

(subunitatea β) (160); β galactozidază (116); fosforilază B

(94); RNA polimerază (subunitea β) (95); albumină serică

bovină (68); ovalbumină (43); RNA polimerază (subunitea

σ) (38,4); anhidrază carbonică (30); tripsinogen (24.5); β-

1actoglobulină (17,5); lizozim (14,5).

Curbele standard sunt de fapt în formă sigmoidală. Liniaritatea aparentă a

curbei standard nu poate acoperi însă, întreaga gamă de mase moleculare

pentru un amestec de proteine separate într-un gel particular. Cu toate

acestea, log M este suficient de aplatizat, într-un sens matematic, pentru a

permite estimări în masă moleculară destul de exacte care urmează să fie

făcute prin interpolare, şi chiar şi prin extrapolare, peste domenii relativ

mari. Intervalele aproximative utile a gelurilor după SDS-PAGE pentru

estimări de masă moleculară sunt după cum urmează: pentru mase

moleculare din domeniul 40.000 la 200.000 Da, geluri cu T%=7,5%; pentru

mase moleculare din domeniul 30.000 la 100.000, geluri cu T%=10%;

pentru mase moleculare din domeniul 15000 la 90000 Da, geluri cu

T%=12%; pentru mase moleculare din domeniul 10.000 la 70.000 Da,

geluri cu T%=15%.

Amestecuri de proteine standard cu masă moleculară cunoscută sunt

disponibile în comerţ pentru calibrarea geluri în vederea electroforezei

proteinelor.

Markeri de masă moleculară utilizați în SDS-PAGE

• Este important a avea la îndemână o gama largă de markeri de

masă moleculară, astfel încât să se exploreze orice dimensiune a

unui polipeptid. Aceștia ar trebui să suficienți pentru cele mai multe

scopuri, deoarece se întind pe un interval de aproximativ 1000 de

ori a masei moleculare (deşi markeri cu masă mai mică de 10 kDa

sunt rar folosiți).

• Kiturile acoperă intervale de masă moleculară limitate sunt, în

general, disponibile din mai multe surse comerciale De exemplu, se

oferă trei seturi de markeri denumiți markeri pe un domeniu scăzut,

pe un domeniu mare şi markeri pe o gamă largă, pentru a fi utilizate

ca standarde pentru separaţii de proteine în intervale cuprinse între

14.000-90.000 Da, 45.000-200.000 Da, respectiv 6.500-200.000

Da. Dacă aceștia nu sunt de ajuns, se poate pregăti o serie proprie

prin reticularea catenelor polipeptidice ale unor proteine mici (de

exemplu, lizozim, hemoglobină, albumină serică bovină).

ELECTROFOREZA PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ ÎN GRADIENT DE

POROZITATE

Migrarea macromoleculelor într-o matrice de gel cu o concentraţie continuu variabilă

(ceea ce semnifică un gradient de porozitate), are ca efect compactarea zonelor de

proteine de-a lungul direcției de migrare, astfel că banda proteică, traversează

concentrații din ce în ce mai mari de gel, iar viteza sa de migrare scade continuu. Acest

proces conduce la o îngustare progresivă a benzii proteice. Există şi alte motive pentru a

recurge la geluri de porozitate gradată.

Principiul tehnicii este prezentat în figura alăturată, când,

după o separare electroforetică în timp suficient (de cel

puţin 10 kV•h) pentru ca mobilitatea proteinelor să fie

constantă şi în cele din urmă să înceteze pentru că fiecare

element constitutiv al probei să ajungă într-o regiune a

gelului cu o densitate la care dimensiunea medie a porilor

se apropie de diametrul proteinelor (limita de pori). Astfel,

raportul dintre distanţele de migrare a unei proteine cu cea

a oricărui alteia devine o constantă, după ce au intrat toate

într-o regiune a gelului în care acestea sunt supuse unor

condiţii de cernere drastică. Din această cauză profilul

electroforetic devine constant după o migrare prelungită

într-un gel cu gradient de concentrație. Concentraţia de

gel, la care rata de migrare pentru o proteină dată devine

constantă se numeşte limită de pori: dacă acest porozitate

marcată în mod corespunzător cu ajutorul unui set adecvat

de proteine marker, atunci este posibil să se coreleze

distanţa de migrare a oricărui element constitutiv în

amestec cu masa sa moleculară.

Metoda descrisă pentru determinarea masei

moleculare după SDS-PAGE, folosind un gradient

linear de pori. Curba arată o relaţie liniară între

logaritmul masei moleculare și √D (D1/2) pentru o

serie de 34 de proteine standard care acoperă

domeniul de masele moleculare cuprinse între

13.000 și 95.000 Da, separate pe un gel în

gradient T%=3-30% (la un C% constant de 8,4%).

Schema unui sistem pentru turnarea gelurilor de

poliacrilamidă în gradient linear: A, dispozitiv bicameral de

formare a gradientului; B, rezervor; C, cameră de

amestecare; D, supapă; E, bară magnetică de agitare; F,

agitator magnetic; G, robinet; H, pompă peristaltică; I,

tubulatură; J, casetă de turnare a gelului placă vertical.

Calitatea gradientului generat poate fi verificată prin adăugarea

unui colorant, cum ar fi p-nitrofenolul sau albastru de bromofenol

într-unul dintre rezervoare şi apoi de scanarea gelului cu un

densitometru.

În cazul în care se are în vedere

turnarea simultană a unui număr de

geluri placă verticale

Reprezentarea schematică a unui

aparat pentru prepararea unui număr

de geluri de poliacrilamidă cu gradient

liniar de pori: A, sistem de producere a

gradientului; B, rezervor (concentrație

mare de monomeri, T% mare); C,

cameră de amestecare (concentrație

mică mare de monomeri, T% mică); D,

valvă; E, bară magnetică; F, agitator

magnetic; G, robinet de închidere; H,

pompă peristaltică; I, casetă de

turnare a mai multor copii de geluri

verticale.

Limitele concentrației aleasă pentru gradient depinde de compoziția probei ce

urmează a fi separată. Gradienți de tipul 4-24, 4-26, 4-30, 2-30% etc., sunt considerați

în general mai potriviți a se utiliza pentru cele mai multe probe proteice (de exemplu

proteine serice, proteine urinare, etc.), deși, dacă electroforeza este prelungită este

posibil ca proteinele cu Mr în jur de 30,000 Da să migreze în afara gelului.

. Aplicații ale electroforezei pe geluri de poliacrilamidă în gradient de

porozitate

Electroforeza în gradient de pori în prezența SDS poate rezolva, o gamă largă de proteine

într-un domeniu mare de masă moleculară. Prin urmare, asocierea dintre focalizare

izoelectrică şi electroforeza în gradient de pori în prezență de SDS maximizează numărul de

proteine identificate într-un gel după o singură separare bidimensională. Pentru a obţine pI-ul

și masa proteinelor native, se utilizează în prima dimensiune focalizarea izoelectrică în

absența ureei urmată de electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante

În cazul unei proteine multimerice, parţial purificate, numărul de subunități şi masa

moleculară a subunităţilor sunt analizate simultan prin electroforeză 2-D cu electroforeza în

gradient de pori pentru prima dimensiune și SDS-PAGE pentru a doua dimensiune. După o

primă electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante, poziţia proteinelor

multimerice în gel este determinată prin teste specifice acestei proteine pentru estimarea

masei sale moleculare native, după care proteina multimerică este disociată în subunităţile

sale prin tratament cu SDS. Masa moleculară a fiecărei subunități este determinată prin

electroforeză pe gel de poliacrilamidă în prezență de SDS iar numărul de subunități dintr-o

proteină nativă complexă se calculează din aceste valori.

Au fost descrise alte aplicații ale electroforezei în analiza lipoproteinelor, inclusiv lipoproteinelor cu

densitate mare (HDL) precum și a lipoproteinelor cu densitate mică (LDL). În cele mai multe laboratoare de

analiză specializată, metodele uzuale de separare și analiză a lipoproteinelor din ser sunt cele de

ultracentrifugare în gradient de densitate. Un dezavantaj al acestei metode constă din necesarul unui

echipament scump şi personal cu experienţă, în timp ce separarea și analiza acestora prin electroforeză în

gradient de pori este o metodă relativ simplă, necostisitoare, şi sensibilă pentru detectarea subfracțiilor

lipoproteice dintr-un volum mic de ser. În plus, electroforeza în gradient de pori în condiții nedenaturante

separă lipoproteinele, pe baza diferenţelor de dimensiune a particulelor şi astfel poate oferi în mod direct

dimensiunea particulelor, în timp ce separarea ultracentrifugarea în gradient de densitate se bazează pe

diferenţa de densitate, parametru indirect, dependent de dimensiunea particulelor. Dacă, înainte de

electroforeză, în cazul în care lipoproteinele din probă sunt precolorate printr-o tehnică de colorare a lipidelor

(colorare cu negru de Sudan B, de exemplu) migrarea lor poate fi monitorizată în timp real. De exemplu,

HDL poate fi fracţionată în 14 subclase prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante.

În plus faţă de interacţiunea funcţională a proteinelor sau a subunităţilor acestora, reacțiile antigen-anticorp

sunt analizate după separarea prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante. Mobilitatea

unui complex de antigen-anticorp este mai lentă decât cea a unei molecule singulare de antigen. Mai mult

decât atât, un complex al unei molecule de antigen şi doi anticorpi monoclonali care recunosc doi epitopi

distincți migrează mai lent decât un complex format dintr-un antigen şi un anticorp monoclonal. Prin urmare,

prin electroforeză în gradient de pori în condiții nedenaturante se poate determina dacă două anticorpi

monoclonali împotriva acelaşi antigen recunosc epitopi diferiți sau identici, și astfel este posibil realizarea

unui studiu de cartografiere a epitopilor prin electroforeză pe gel.

se poate realiza de asemenea, studiul complexelor ADN-proteine. În analiza de modificare a mobilității

electroforetice (electrophoretic mobility shift assay, EMSA), EMSA cu electroforeza în gradient de pori în

condiții nedenaturante are o capacitate de rezoluţie înaltă şi este utilă pentru analiza complexele ADN-

proteine care conțin proteine diferite ori pentru detectarea unor proteine de legare a de ADN mutanți.

ELECTROFOREZA PE GELURI DE

POLIACRILAMIDĂ ÎN PREZENȚA

BROMURII DE CETIL-TRIMETIL-AMONIU

În cazul în care, în loc de încărcarea negativă cu SDS, se utilizează o

încărcare pozitivă a proteinelor cu detergenți de tipul bromurii de

cetiltrimetilamoniu (CTAB), sarcina negativă a glucidelor se neutralizează

prin legarea suplimentară a unor molecule de detergent. Acest lucru

conduce la obținerea unor benzi mai clare. CTAB este cunoscut că

solubilizează proteinele foarte eficient şi a fost folosit pentru izolarea unor

proteine "dificile"

În CTAB-PAGE proteinele se deplasează spre polul negativ, mai degrabă

decât spre electrodul pozitiv și ca atare trebuie utilizat un sistem diferit de

tamponare.

Electroforeza nativă pe gel de poliacrilamidă în prezență de Coomasie Brillant Blue

În ultimii ani, separarea de complexe proteice prin electroforeză nativă pe gel de poliacrilamidă în prezență de

CBB (Blue native PAGE, BN-PAGE) s-a dovedit a fi o metodă dominantă în identificarea unor tulburări

funcţionale prin analiză din omogenate totale, ţesuturi, celule ori fracţiuni celulare. Metoda a fost utilizată la

determinarea greutății moleculare a complexelor proteice din intervalul cuprins între 10 şi 10.000 kDa. Au fost

analizate cu succes mai ales complexele membranare intrinseci de transfer a electronilor/protonilor din

mitocondrii şi cloroplastele. Metoda a fost combinată cu alte tehnici pentru a determina starea oligomerică,

stochiometria, activitatea enzimatică şi structura moleculară a complexelor multiproteice. Aşa cum multe probe

pot fi separate în paralel, într-o singură migrare electroforetică, printr-o comparaţie directă a complexelor proteice

se permite uşor identificarea unor tulburări, ceea ce permite direcționarea spre analize funcţionale suplimentare. În

proteomică, separarea de înaltă rezoluţie de proteine este, în general realizată prin separări bidimensionale (2-D),

în conformitate cu punctul izoelectric al proteinelor (IEF-PAGE) şi masa lor moleculară (SDS-PAGE). Aceasta

ultimă tehnică de denaturare separă sute de mii de proteine din probe complexe. Cu toate acestea, proteinele

hidrofobe de membrană sunt greu detectabile, după 2-D IEF/SDS-PAGE.

BN-PAGE reprezintă o strategie alternativă de separarea cu rezoluţie înaltă a proteinelor de membrană şi de

menţinere a funcţiei lor enzimatice. Metoda se numește nativă, deoarece cele mai complexe de proteine separate

își păstrează funcţiile enzimatice şi blue native, deoarece separarea electroforetică se bazează pe proprietatea

colorantului Coomassie blue G250 (CBB) de a se lega la proteine. BN-PAGE a fost descrisă pentru prima data în

1991 în cazul separării complexelor de proteine membranare din lanţul respirator al mitocondriei umane. Astăzi,

BN-PAGE reprezintă o alegere în cazul în care este necesară o analiză a interacţiunilor proteinelor native de

membrană, la o rezoluţie înaltă şi cu randament sporit.

Importanţa biologică a interacţiunilor dintre proteine este dată de faptul că proteinele se exprima în funcţie de gene

în toate organismele vii. Proteinele sunt molecule funcţionale care operează pe căi metabolice, de dezvoltare şi de

reglare, dintr-o celulă, ţesut sau dintr-un organism. Proteinele multiple sunt complexe integrate, în scopul

organizării lor în mai multe funcţii enzimatice. Complexe de proteine, prin urmare, reflectă organizarea

macromoleculară a stării celulare, care reprezintă fundamentul în înţelegerea funcţiilor celulare. În practica

proteomică, obiectivul central îl reprezintă identificarea tuturor proteinelor prezente într-o stare definită de

dezvoltare a unui organism, ţesut, celuleă sau subfracție celulară şi de a caracteriza modificările lor calitative şi

cantitative, ca răspuns la schimbările de mediu.

Pregătirea probei în vederea BN-PAGE. Blue native PAGE separă complexe ale proteinelor de

membrană în stare nativă. Pentru a obţine rezultate optime, pregătirea probelor reprezintă pasul

cel mai critic, din acest motiv toate treptele de prelucare se efectuează pe gheaţă. Pentru a mări

șansele de solubilizare a complexelor proteice și de creștere a stabilității lor, se are în vedere că

solubilitatea proteinelor depinde atât de natura probei, precum şi pe tipul de detergent şi de

concentrația acestuia, aceste variabile trebuind testate pentru oricare probă de interes.

Solubilizarea complexelor proteice. Membranele biologice sunt ansambluri complexe de lipide şi

proteine. Un compus lipidic este de obicei compus din două cozi hidrofobe de hidrocarbură

conectate la un cap polar. Lipidele sunt cel mai adesea aranjate într-o structură bistratificată cu

cozile hidrofobe alăturate iar capetele hidrofile ale acestora sunt îndreptate spre exterior.

Proteinele de membrană sunt încorporate în zonele hidrofobe ale bistratului membranar prin

interacţiunea lor cu faza hidrofobă lipidică. Proteine se adună în complexe multisubunitare pentru

a îndeplini funcţiile celulare în cadrul fazei de membrană.

Evoluția unui proces de migrare electroforetică prin BN-PAGE. Imaginile reprezintă trei puncte

caracteristice din perioada de timp de electroforeză prin BN-PAGE. Aparatul electroforetic constă din

anod (partea de jos) şi tancul rezervor de tampon catodic (sus, umplute cu tampon catodic, care conține

CBB, albastru), gelul se află situat între două plăci de sticlă (ca un sandwich) iar menținerea temperaturii

(la 4oC) se realizează printr-un sistem de răcire prin intermediul tamponului anodal în tot timpul

electroforezei. Tamponul din zona anodală este agitat pentru a menține o temperatură constantă. Înainte

de începerea electroforezei, tamponul catodal care conține CBB este completat în rezervorul cu tampon şi

probele sunt depuse în godeuri (săgeata de culoare albă, godeul probei, panelul 1, înainte de începerea

migrării). În timpul electroforezei, probele încărcate electric intră în gelul de concentrare (stivuire) şi după

un timp, colorantul Coomassie care se deplasează cu frontul ajunge la jumătatea gelului de separare. În

acest moment, complexele proteice încep să devină vizibile în gelul de separare. În acest moment,

tamponul cu Coomassie catodic se schimbă cu un tampon catodal incolor (săgeţile de culoare albă,

panelul 2, în timpul migrării). BN-PAGE poate fi oprită atunci când tampon colorat cu CBB pătată a ajuns

la sfârşitul gelului de separare şi separarea de complexe este finalizată (săgeţile de culoare albă, panelul

3, sfârșitul migrării)

BN-PAGE a complexelor de proteine membranare tilacoide.

Markerul de masă moleculară (MP) conține următoarele

proteine standard separate: tireoglobulină 696, feritină 440,

catalază 232, lactat dehidrogenază 140, şi albumină 67, kDa.

Din 1×108 cloroplastele de orz corespunzând la 400 µg de

proteină, au fost izolate plastide care au fost în continuare

lizate, iar membranele tilacoide au fost colectate prin

centrifugare. Proteinele membranare au fost solubilizate cu

dodecilmaltozid şi separate pe un gel de poliacrilamidă cu

gradient liniar de pori (6-12%), prin blue native PAGE (TM).

Linia a doua de gel a fost colorată cu CBB (CS). Pentru a se

determina activitatea diaforazei

NAD(P)H:plastoquinon:oxidoreductazei (asterisc pe partea

dreaptă a gelului), gelul din prima dimensiune, a fost incubat în

50 mM tampon fosfat pH=8,0/EDTA, 1mM. Reacția de culoare

a fost iniţiată prin adăugarea a 0,2 mM NADH şi 0,5 mg/ml

nitro blue tetrazoliu. Gelul s-a incubat în continuare timp de 12

ore. Se evidențiază (prin săgeţi) două complexe proteice care

conţin clorofilă (AS) la o masă moleculară de 550 kDa

(semnalul de sus, echivalent complexului PS I, LHC I) şi un

altul, la o masă moleculară de 120 kDa (semnalul mai mic,

echivalent complexului LHC II).

Electroforeza nativă pe geluri de

poliacrilamidă incolore

nu este nimic altceva, decât un sistem de gel folosit în BN-PAGE, fără a utiliza

colorantul CBB

Pentru a evita o potenţială agregare a proteinelor de membrană din extractele de

detergent în timpul migrării electroforetice, se adaugă detergenţi blânzi la gelurile

native incolore, de exemplu

Detergentul utilizat Proba biologică

Mitocondrie la mamifere

β-D-dodecilmaltozid Mitocondria la drojdii

Cloroplaste la plante (tilacoide)

β-D-decilmaltozid Mitocondrie la mamifere

β-D-octilglucozid Mitocondrie la drojdii

Triton X-100 Mitocondrie la drojdii

Nonidet P-40 Mitocondrie la drojdii

Lubrol Mitocondrie la drojdii

Digitonină Mitocondria la drojdii

IEF este o tehnică electroforetică pentru fracționarea compuşilor amfoterici în funcţie de pI-ul lor

de-a lungul unui gradient continuu de pH. Contrar electroforezei zonale, unde mediul de separare

posedă un pH constant (tamponat) care stabilește o sarcină electrică constantă pe suprafața

moleculei și care conduce, în absența procesului de stivuire (cernere moleculară) la o mobilitate

constantă, sarcina electrică de suprafaţă ale unui compus amfoter în IEF este într-o continuă

schimbare, şi scădere, în funcţie de curba sa de titrare, în timp ce trece de-a lungul unui gradient

de pH până când ajunge la o poziţie de echilibru, adică în regiunea în care pH-ul se potriveşte cu

pI-ul său. Acolo, mobilitatea acestei molecule este egală cu zero iar molecula se oprește.

Gradientul este creat şi menţinut, prin trecerea unui curent electric printr-o soluţie de compuşi

amfoterici, care au valori ale pI-urilor apropiate pe o distanță care cuprinde un domeniu dat de pH.

Transportul electroforetic cauzează acestor amfoliți transportori (CA) stivuirea în funcţie de pI-lor,

astfel încât se realizează un gradient de pH care crește de la anod la catod, și care este stabilizat.

La începutul unei migrării, mediul de separare are un pH uniform, este egal cu pl-ul mediu al

amfoliților transportori. Astfel, cei mai mulți amfoliți au o sarcină netă şi o mobilitate netă. Amfolitul

cel mai acid migrează în apropierea anodului și se concentrează într-o zonă la care valoarea pH-

ului său este egală cu pI, în timp ce cel mai bazic amfolit se deplasează adiacent și în apropierea

catodului. Un amfolit mai puţin acid migrează adiacent şi ușor catodal într-o zonă stablită de pH-ul

său și astfel toți componenții sistemului ating o stare de echilibru. După finalizarea acestui proces

de aranjare (stivuire), unii amfoliți transportori tind să se deplaseze în zone cu pH mai mare sau

mai mic prin procese de difuziune în cazul în care sistemul nu se află într-un echilibru izoelectric.

Dar, aşa cum imediat ce aceștia intră în aceste zone, amfoliții transportori devin încărcați electric iar

tensiunea electrică aplicată îi forțează să se întoarcă înapoi în poziţia lor de echilibru.

SEPARAREA PROTEINELOR PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ

PRIN FOCALIZARE (FOCUSARE) IZOELECTRICĂ

Principiul focalizării izoelectrice. Înainte de încărcarea probei, se stabilește un

gradient de pH. (A) Se încarcă proba și se aplică pe gel. Proteinele vor migra în

funcție de pH-ul lor izoelectric, localizare la care sarcina lor netă este nulă; (B)

Proteinele formează benzi electroforetice care pot fi excizate sau utilizate în

experimente ulterioare.

Din punct de vedere chimic, amfoliții transportori sunt acizi oligo-amino, acizi oligo-carboxilici,

disponibili comercial sub denumiri diferite. Există trei abordări de bază în sinteza amfoliților

transportori:

•abordarea Vesterberg, care implică o reacţie dintre oligo-amine diferite (tetra-, penta-şi hexa-

amine) cu acid acrilic;

•procesul de sinteză chimică propus de Soderberg și colab. care implică co-polimerizarea de

amine, aminoacizii şi dipeptide cu epiclorhidrină;

•abordarea Pogacar-Grubhofer, care a utilizează etilenimina şi propilendiamina pentru reacţii

ulterioare cu propansulfona, vinil sulfonatul de sodiu şi clormetil fosfonatul de sodiu.

Focalizarea izoelectrică cu gradienți de pH imobilizați (CA-IEF).

Se realizează cu tampoane, un set de şase acizi slabi şi baze neamfotere, având o

compoziţie chimică generală, CH2=CH-CO-NH-R, unde R reprezintă fie două grupării

carboxil diferite slab acide, cu pK-uri de 3,6 respectiv 4,6, sau patru grupări terţiare

amino, cu pK-uri de 6,2, 7,0, 8,5, şi 9,3 (disponibile sub denumirea comercială de

Immobiline, figura alăturată).

STRATEGIA DE SEPARARE A PROTEINELOR PE GELURI DIN POLIACRILAMIDĂ

PRIN FOCALIZARE IZOELECTRICĂ

Proteinele, ca molecule amfotere, posedă sarcini nete pozitive, negative, sau neutre în

funcţie de pH-ul de mediului în care se află dizolvate. Sarcina per ansamblu a unei proteine

particulare este determinată de resturile de aminoacizi acizi sau bazici ionizabili de pe

catenele polipeptidice și de grupările protetice. Grupările carboxilice acide (-COOH), din

proteine sunt neionizate în soluţii acide şi disociază în formă anionică (-COO-), la valorile ale

pH-ului mai mari, de mai sus de pH=3,0. Grupările amino (-NH2) şi alți compuși de bază din

proteine, cum ar fi guanidinele, sunt neîncărcate electric la un pH alcalin, dar devin cationi la

un pH mai în jur de 10,0 (de exemplu,-NH3+). pH-ul la care o catenă polipeptidică disociază

este afectat de compoziția totală a proteinei și de proprietățile mediului în care se află

dizolvată. Ca urmare, fiecare grupare individuală ionizabilă dintr-o proteină are un punct

aproape unic de disociere.

Sarcina netă a unei proteine este suma algebrică a tuturor sarcinilor sale, pozitive şi

negative. După cum s-a mai amintit în acest capitol, există un pH specific pentru fiecare

proteină la care sarcina netă care o posedă este egală cu zero. Această valoare este

denumită pH izoelectric (pI) este o proprietate caracteristică fizico-chimică specifică fiecărei

proteine. În cazul în care numărul de grupări acide dintr-o proteină depăşeşte numărul de

grupări bazice, pI-ul proteinei va avea o valoare scăzută a pH-ului. Pe de altă parte, în cazul

în care numărul grupărilor bazice sunt mai numeroase decât cele acide, pl-ul va fi înalt.

Proteinele arată variaţii considerabile ale punctelor izoelectrice, dar valorile pl-urilor se

încadrează de obicei, în intervalul de pH cuprins între 3 și 10.

În general, IEF se efectuează în condiţii nedenaturante, fiind o tehnică de înaltă

rezoluţie. Deseori, rezoluţia a două proteine diferite se realizează la valori ale

pI-ului lor de doar 0,02 unităţi de pH, sau mai puţin. Din cauza acestei înaltei

rezoluţii, probe de proteine care par a fi omogene atunci când sunt testate prin

alte mijloace poate fi adesea separate în mai multe componente prin IEF. Astfel,

microheterogenitatea poate fi un indiciu dat de diferenţe în structura primară,

existența unor izomeri conformaționali, a unor diferenţele de tipuri şi de număr

de grupări prostetice, sau de denaturare a proteinei.

În funcție de proprietățile proteinei (proteinelor) luate în studiu și în funcție de

scopul urmărit, trebuie avut în vedere:

- compoziția chimică, concentrația și structura gelului (de poliacrilamidă ori

agaroză);

- forma gelului (gelul poate fi cilindric sau plat);

- condițiile de separare (IEF, CA-IEF).

REZOLUȚIA DE SEPARARE ÎN FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ

Conform teoriei focalizării izoelectrice şi rezultatelor experimentale, diferenţa

de pI (ΔpI) între două benzi de proteine adiacente rezolvate prin această tehnică

este direct proporţională cu rădăcina pătrată a gradientului de pH şi invers

proporţională cu rădăcina pătrată a gradientului de tensiune (intensitatea

câmpului electric aplicat) conform relației:

ΔpI = (gradient de pH / gradient de voltaj)1/2

Astfel, în focalizarea izoelectrică, un domeniu îngust de pH şi o tensiune înaltă, aplicată, conduce

la o rezoluţie înaltă (un ΔpI mic). În plus faţă de aceşti doi factori, o rezoluţie bună este favorizată

de substanţe cu coeficienţi de difuzie scăzuți. De asemenea, vitezele ridicate de schimbare a

mobilităţii, cu un pH apropiat de punctele lor izoelectrice conduc la o rezoluție înaltă. Cele mai

multe dintre proteine îndeplinesc ultimele două criterii, dar aceşti factori nu sunt, desigur, sub

controlul experimentatorului. Schimbarea distanței dintre electrozi pentru o tensiune dată şi

alegerea unui domeniu de pH, va schimba în aceeaşi măsură atât pH-ul cât şi gradienţii de

tensiune, astfel încât, cu excepţia cazului în care intervalul amfoliților transportori sau tensiunea

electrică aplicată sunt de asemenea, modificați nu au drept consecinţă o modificare în rezoluţie.

APARATURA UTILIZATĂ ÎN FOCALIZAREA IZOELECTRICĂ

SEPARAREA PROTEINELOR PRIN ELECTROFOREZA BIDIMENSIONALĂ PE GEL DE

POLIACRILAMIDĂ

Prima dimensiune a 2D PAGE implică separarea proteinelor prin focalizare izoelectrică care se realizează pe geluri

cilindrice (T=3-5%), turnate în tuburi de sticlă capilare (cu diametrul intern de 1-1,5 mm) sau pe stripuri. În mod

uzual, gelurile conţin uree 8 M şi un detergent neionic sau zwitterionic. Detergentul inclus are de obicei o

concentrație de 2% (masă/volum), aceasta putând fi adesea redusă până la 0,5% fără a afecta modul de separare.

Gelurile conțin de asemenea amfoliți sintetici transportori care generează gradientul de pH-ul necesar procesului de

separare într-o concentrație de 2% (masă/volum). Din acest punct de vedere, sunt disponibili o varietate de amfoliți

sintetici, majoritatea acestora fiind potriviți în 2D PAGE.

Adesea este folosită o gamă amplă de amfoliți (pH 3-10), cu toate că, un amestec de amfoliți dintr-un domeniu de

pH=4-8 poate oferi, de multe ori, rezultate excelente după cum în gelurile cilindrice utilizate în IEF, gradientul final

de pH rareori se poate extinde peste 7,5.

A doua dimensiune poate fi realizată fie pe sisteme orizontale, fie pe sisteme verticale. Pentru set-up-urile orizontale,

de laborator se pot utiliza geluri gata de utilizare ori geluri de poliacrilamidă cu SDS (cu o grosime de 0,5 mm

așezate pe un film GelBond PAG) care sunt plasate pe placa de separare cu sistem de răcire a unităţii de electroforeză

orizontală.

Gelurile de poliacrilamidă supuse anterior separării prin focalizare izoelectrică echilibrate, sunt plasate de-a lungul

gelului care va fi utilizat în a doua dimensiune. Scopul echilibrării gelurilor separate în primă dimensiune prin

focusare izoelectrică este cel de a pregăti proteinele focalizate pentru transferul lor în a doua dimensiune a gelului de

SDS-PAGE. Această operațiune implică incubarea timp de aproximativ 30 minute a gelului folosit la focusare într-o

soluție tamponată care conține SDS, uree și glicerol. Această operațiune este necesară deoarece proteinele care au

fost inițial separate pe baza sarcinii lor electrice intrinsece trebuie să fie echilibrate cu un detergent anionic care oferă

sarcina electrică obligatorii separării în cea de a doua dimensiune (proteinele focalizate la valorile lor de pI sunt

neîncărcate electric) și pentru a asigura ca masa polipeptidică reprezintă caracteristica primară a separării în cea de a

doua dimensiune. Surfactantul anionic SDS este ales în acest scop. SDS formează complexe cu proteinele într-un

raport de aproximativ 1,4 g SDS/g proteină, care supra-acoperă sarcina intrinsecă a proteinei, acordând o sarcină

electrică net negativă complexelor SDS-proteină și dând astfel polipeptidelor aproximativ aceeași formă

hidrodinamică .

Echilibrarea gelurilor supuse focalizării

izoelectrice în detergent (SDS)

Transferul gelurilor de poliacrilamidă

supuse anterior separării prin focalizare

izoelectrică pe suprafaţa gelurilor încărcate

cu SDS în sistem orizontal

Transferul gelurilor de poliacrilamidă

supuse anterior separării prin focalizare

izoelectrică pe suprafaţa gelurilor încărcate

cu SDS în sistem orizontal

IZOTACOFOREZA

Izotacoforeza sau electroforeza de dizlocuire, după cum a fost denumită la un moment dat, este o

dezvoltare mai recentă a principiului descris în 1920, fiind o metodă de separare în funcție de

sarcina electrică. Ea se utilizează pentru separarea particulelor care se deosebesc în special prin

încărcătura electric netă și nu prin dimensiuni fizice, vitezele de separare ale fracțiunilor din

probă, după ce separarea este completă, când s-a atins o stare de echilibru, sunt egale, de unde și

denumirea acestei metode. În această tehnică electrolitul dintre cei doi electrozi nu este o singură

soluție uniformă, ci este formată dintr-o secvență discontinuă de soluții diferite (figura de mai

jos), în care ionii acestora migrează cu aceeași viteză (iso = egal, tachos = viteză, phoresis =

migrare).

Izotacoforeza este similară ”stivuirii”, concentrării în faza staționară sau

electroforezei zonale în sisteme multifazice. În practică, totuși se face distincție

între aceste metode. Concentrarea în faza staționară se realizează în două moduri:

•Concentrarea selectivă (selective stacking) prin care componentul/componentele

de interes sunt incluse în fronul mobil, iar celelalte componente rămân în afara

acestuia (unstacked). Este de altfel cazul izotacoforezei;

•Excluderea selectivă (selective unstacking) prin care componentul/componentele

de interes sunt excluse selectiv din frontal mobil, iar celelalte componente sunt

incluse în acesta.

Deoarece toți ionii sunt forțați să migreze cu aceeași viteză, tăria

câmpului electric este mai mare în aria ionilor cu mobilitate mai mică

și este mai redusă în domeniul ionilor mai mobili. În timpul acestei

migrații se formează zone pure alăturate ale probei alcătuite din

analiți individuali. La echilibru, ionul cu cea mai mare mobilitate

migrează în front, ceilalți migrând în spatele lui în ordinea scăderii

mobilității:

mL->mA->mB->mT-

unde m reprezintă mobilitatea, L-, simbolizează ionul frontal, T-, ionul

terminal, A- și B- fiind ioni din cadrul probei. Zona cu cea mai mare

mobilitate posedă cea mai mică tărie a câmpului electric, iar zona cu

cea mai mică mobilitate prezintă cea mai înaltă tărie ionică a

câmpului. Produsul tăriei ionice și a mobilității fiecărei zone este

astfel constant

Separarea componentelor printr-un model de tren ionic

ELECTROFOREZA DE AFINITATE

Electroforeza de afinitate, în sens larg, include toate metodele utilizate în biochimie și

biotehnologie în care un anumit tip de interacțiune specifică are loc între un component

din proba supusă electroforezei și un alt component prezent în constituția mediului

suport, denumit ligand specific. Cu ceste metode, unele înrudite cu imunoelectroforeza,

altele, cu cromatografia de afinitate, se detectează componentele dintr-o probă care

prezintă afinitate pentru un ligand, se determină omogenitatea sau heterogenitatea

legării componentului/componentelor de ligand, modificările induse de diverse

tratamente și uneori cantitatea de component/componente care leagă specific ligandul,

sau se elfectuează studii cantitative privind formarea complexelor component-ligand (în

speță, proteină-ligand).

Ligandul poate fi liber sau imobilizat în mediul suport. Dacă masa sa moleculară este

foarte mică în raport cu masa moleculară a proteinelor țintă, modificările electroforetice

vor fi relativ mici sau chiar neglijabile, în special dacă și sarcina ligandului este mică

sau zero (de exemplu substratele cu masă moleculară mică și inhibitorii enzimatici).

Efectele asupra mobilității electroforetice vor fi mai evidente dacă ligandul și proteinele

țintă sunt cu mase moleculare relativ apropiate, sau dacă ligandul are fie o sarcină

electrică mare, fie o structură ramificată, care să permită interacțiunea simultană cu mai

multe molecule țintă de proteine. În aceste cazuri interacțiunea se va concretiza printr-o

scădere sau creștere semnificativă a mobilității electroforetice a proteinelor sau prin

apariția unui precipitat.

Toate aceste posibilități stau la baza diferitelor metode aparținând de

electroforeza de afinitate. Cele mai cunoscute metode sunt :

•Imunoelectroforeza încrucișată;

•Imunoelectroforeza tip rachetă;

•Imunoelectroforeza zonală;

•Electroforeza încrucișată;

•Imunoafinoelectroforeza încrucișată;

•Afinoelectroforeza bidimensională;

•Afinoforeza;

•Electroforeza de afinitate propriu-zisă (care este asemănătoare ca

principiu cromatografiei de afinitate).

Imunoelectroforeza încrucișată. Tehnica a fost pusă la punct de către Bog-Hansen, în

perioada 1973-1980 și este utilizată la separarea, identificarea și caracterizarea

glicoproteinelor cu ajutorul lectinelor și a anticorpilor specifici.

Metoda are aplicabilitate în cercetare (de exemplu la studiul interacțiilor anticorpilor

monoclonali) ori în clinică (în laboratorul de diagnostic al maladiilor în care sunt implicate

glicoproteine anormale).

Afinoelectroforeza bidimensională. Tehnica are la bază același principiu ca și

imunoelectroforeza încrucișată, dar spre deosebire de aceasta anticorpii specifici se găsesc

într-o membrană de nitroceluloză. Metoda se caracterizează printr-o rezoluție foarte bună și

este o metodă de perspectivă.

Afinoforeza. A fost pusă la punct de către Shimura și Kasai. Tehnica are la bază

interacțiunea dintre un ligand macromelecular solubil cu sarcină electrică mare (afinofor) și o

proteină. Complexul proteină-afinofor se remarcă printr-o mobilitate electroforetică

substanțial mai mare decât al proteinei libere.

Electroforeza de afinitate propriu-zisă. Este analogă cromatografiei de afinitate. În această

tehnică, ligandul este imobilizat într-un gel astfel că proteina țintă, în cursul electroforezei,

este împiedicată și astfel întârziată datorită interacțiunii specifice.

Se poate remarca faptul că nu există o delimitare netă între variantele asemănătoare

imunoelectroforezei și variantele asemănătoare cromatografiei de afinitate, deoarece

imobilizarea ligandului, în cazul variantelor cromatografice nu este necesar să fie completă,

mai ales pentru liganzii mari.

ELECTROFOREZA CAPILARĂ

Electroforeza capilară (capillary electrophoresis, CE), s-a dezvoltat ca tehnică la

sfârşitul anilor 1980 şi a crescut constant în popularitate de atunci. În forma sa cea

mai simplă şi mai frecvent utilizată, CE reprezintă o întoarcere la metoda originală

descrisă de Tiselius, dar popularitatea sa nu se bazează numai pe această

simplitate inerentă, ci și cu privire la avantajele suplimentare date de viteză,

versatilitate și costuri reduse. Fiind în esenţă o metodă analitică, ea și-a găsit

aplicabilitatea în separarea biopolimerilor, cum ar fi peptide, proteine,

oligonucleotide, ioni de metale și ioni anorganici, precum şi în analiza de

produse farmaceutice ori în monitorizarea calităţii apei. Deşi metodologia de

bază presupune separarea moleculelor pe baza raportului sarcină electrică/masă

moleculară, există simple modificări la procedură, împrumutate de la tehnicile

existente, bine stabilite, care permit separări pe baza dimensiunii sau a punctului

izoelectric, sau care să permită separarea unor molecule fără sarcină electrică, în

timp ce gradul de rezoluţie poate să conducă la separări de izomeri optici.

Aparatura

După cum sugerează şi numele, trăsătura distinctivă a acestei metode o

reprezintă separările efectuate într-un tub capilar (figura de mai jos), a

cărei secțiune transversală (de obicei de 50 µm), are ca scop controlul uşor

a temperaturii. Lungimea capilarei diferă în fincție de aplicaţii diferite, dar

este în mod normal în domeniul de 20-50 cm. Capilarul este umplut cu un

tampon de migrare iar proba este introdusă prin injectare la un capăt al

coloanei, după care se aplică un câmp electric (injecţie electro-cinetică)

ori se aplicare o presiune de gaz (injecţie de presiune). Migrarea prin

capilar este realizată, în mod direct sau indirect, prin aplicarea unui câmp

electric, iar analiţii sunt detectați în momentul în care se deplasează prin

dreptul unei ferestre situate în capătul opus al capilarului.

Schemă de principiu a unui aparat de electroforeză capilară. Sunt

prezentate părțile principale ale instalației. Liniile continue indică

condițiile de separare, în timp ce liniile discontinue indică condițiile de

injecție electrocinetice.

METODE DE DETECȚIE A PROTEINELOR DUPĂ ELECTROFOREZĂ BIDIMENSIONALĂ

PE GELURI DE POLIACRILAMIDĂ

Căutarea unor metode de a vizualiza proteinele rezolvate prin electroforeza pe

oricare suport, de la benzi de acetat de celuloză la geluri de poliacrilamidă

datează de la originile electroforezei în sine. Odată cu introducerea disc-

electroforezei, la începutul anilor 1960, cea mai frecvent utilizată colorație a

proteinelor s-a realizat cu amido black. Cum nevoia de metode de colorare cu

sensibilitate înaltă şi colorare uniformă a crescut pentru a satisface cerinţele de

cuantificare proteine în geluri, colorația cu amido negru a devenit improprie.

Colorantul amido black nu are sensibilitate necesară, calitatea variază de la lot

la lot iar de multe ori proteinele se colorează multicromatic

pentru vizualizarea proteinelor separate prin electroforeza pe benzi de acetat de

celuloză, Fazekas St Groth și colaboratorii (1963) au testat sistematic un numar mare de

tehnici standard de colorare utilizate în industria textilă convenabili ca potențiali coloranți

ai proteinelor după electroforeză. În 1963 ei au introdus în practica electroforetică un

colorant acid, Coomassie Brilliant Blue 250, tradițional utilizat pentru colorarea lânei,

colorant convenabil din punct de vedere al gradului crescut de sensibilitate, a marii

intensități a culorii și a absorbanței peakului. În anul 1965, Meyer şi Lambert au aplicat

cu succes metoda de colorare cu Coomassie Blue descrisă de St. Groth la detectarea

unor proteine din salivă, separate prin electroforeza pe benzi de gel din acrilamidă.

Succesul experimentului de colorare i-a condus pe cercetători în a conchide că

"Commasie Brillant Blue și-ar putea găsi o aplicare în cadrul investigațiilor altor fluide

biologice prin electroforeză în gel de poliacrilamidă".

Coomassie Brilliant Blue, un colorant anionic trifenilmetanic este utilizat în două forme:

Coomassie R-250 (de culoare roșie) și Coomassie G-250 (de culoare verde), ultimul

având două grupări metil adiționale

În prezența unui mediu acid, acești coloranți se leagă de grupările amino a

proteinelor prin interacții electrostatice și hidrofobe. În protocoalele originale

gelurile sunt plasate pentru o perioadă de timp într-o soluție de colorare de 0,1%

colorant Coomassie dizolvat într-un amestec de metanol, 45% (v/v), apă, 45%

(v/v) și acid acetic 10%; background-ul se decolorează într-un amestec alcătuit din

metanol, 25% (v/v), apă, 65% (v/v) și acid acetic 10%.

ALȚI COLORANȚI ORGANICI UTILIZAȚI ÎN EVIDENȚIEREA

POSTELECTROFORETICĂ

Fast Green FCF (food green 3), ușor de

utilizat în densitometria cantitativă.

colorarea proteinelor în geluri de

SDS-PAGE comparabilă ca

sensibilitate cu colorația CBB:

utilizarea acidului 1-(2-hidroxi-4-

sulfo-1-naftilazo)-2-hidroxi-3-

naftoic (acidul calconcarboxilic,

NN).

COLORAȚIA CU CUPRU

Colorația reversibilă cu cupru este o metodă realizată într-o singură etapă pentru

detectarea rapidă a proteinelor fracţionate prin SDS-PAGE. În această tehnică nu

este necesară o etapă de decolorare. Colorarea se bazează pe interacţiunea ionilor

de cupru cu poliacrilamida şi cu proteinele separate. Tehnica de colorare implică

precipitarea ionului de cupru în gel care astfel devine verde opac, în timp ce SDS

previne legarea ionului de cupru la proteine, rezultând astfel o imagine negativă. În

final se evidențiază benzi clare de proteine pe un fundal semiopac albastru-verzui de

poliacrilamidă. Benzile proteice sunt vizualizate în mai putin de 5 minute.

Sensibilitatea colorației reversibile este cuprinsă între 0,5ng și 12ng/bandă proteică.

Colorarea nu interferă cu tehnicile ulterioare de electroeluție a proteinelor și nu

modifică proprietăţile biologice ale acestora. Gelurile colorate reversibil cu ioni de

cupru pot fi decolorate în 20-25 de minute, înainte de transferul sau electroeluția

proteinelor din gel. Un dezavantaj major totuși, este că această colorațioe nu este

compatibilă cu gelurile native

În cazul BSA sensibilitatea metodei ajunge la 0,5-10 ng proteină/bandă, fracțiile proteice fiind

vizibile după o separare pe un gel de poliacrilamidă cu T=12%. În cazul gelurilor cu o concentraţie

mai mică de 12% sensibilitatea scade din cauza creșterii dimensiunilor porilor, cu consecință în

creșterea procesului de difuziune a benzilor de proteine.

COLORAȚIA NEGATIVĂ IMIDAZOL-SDS-ZINC

Un complex al sării de zinc, al SDS și imidazolului precipită în gelul de

poliacrilamidă și formează un background alb opac, dar care rămâne

solubil în prezența spotului proteic. Zonele proteice devin vizibile ca un

background închis la culoare. Sensibilitatea detecției (care este de ordinul

a câtorva nanograme) este cuprinsă între cea a CBB și colorația cu argint.

Evidențierea fosvitinei după colorare reversibilă

cu imidazol-zinc

COLORAȚIA CU ARGINT

Detecția proteinelor prin colorație cu argint este larg utilizată deoarece

sensibilitatea ei este de aproximativ 1 ng per spot, costurile pentru reactivi

sunt relativ scăzute, și-deși presupune o procedură multistadială-rezultatele

sunt disponibile relativ repede. Ideal spoturile sunt brun-închise spre negru pe

un background ușor bej.

Principiul protocolului de colorare cu azotat de argint este următorul: în prima etapă

proteinele sunt fixate; SDS-ul și componentele tamponului sunt îndepărtate prin

spălare cu o soluție de etanol, 40% și acid acetic, 10%. Următoarea treaptă combină

legarea încrucișată a proteinelor din matricea de gel cu ajutorul glutardialdehidei și de

sensibilizare cu tiosulfat de sodiu în prezență de acetat de sodiu. După un număr de

spălări cu apă distilată la intervale exacte de timp, gelul se plasează într-o soluție

care conține azotat de argint 0,25% și o cantitate mică de formaldehidă. Dezvoltarea

se realizează cu formaldehidă la o valoare bazică de pH, care se realizează cu

ajutorul carbonatului de sodiu. Reacția este stopată prin plasarea gelului într-o soluție

de acid acetic, 5% ori într-o soluție de EDTA 1,5%.

Coloratia argentica (silver staining)

• De 100 X mai sensibila decat coloratia cu

coloranti organici

• Metoda simpla, ieftina

– Reducerea fotochimica

– Argint amoniacal

• Metoda ce adimite supracolorarea gelurilor

colorate initial cu CBB

Fosfoproteinele• Colorare in rosu a proteinelor sub actiunea bromurii de

1 etil 2,3 –(1 eilnafto-(1,2d) tiazolin-2-iliden)2-metil-propenil-nafto-(1,2d)-tiazol denumit colorant total

• Fosfoproteinele se coloreaza in albastru

LipoproteinelePrecolorare cu Sudan Black

GlicoproteineleColorare cu sulfit de fucsina (reactiv Shiff) in conditii oxidante realizate cu

acid periodic;

Colorare argentica

Colorare cu Alcian blue (glicoproteinele acide)

Colorare cu izocianat de fluoresceina (FTIC)- lectinebenzi fluorescente

COLORAȚIA FLUORESCENTĂ

Coloranții fluorescenți prezintă un mare domeniu de linearitate

dinamică, de peste 4 ori magnitudine față de colorațiile clasice, cu

rezultate înalt reproductibile deoarece colorația fluorescentă este o

metodă de tip endpoint. De la introducerea colorării cu Nile Red în

ultimii ani, au fost dezvoltați o varietate de coloranți cu diverse și

marcante sensibilități și proprietăți, precum familia coloranților

Sypro® (Orange, Red, Tangerine și Ruby)

Structura chimică a colorantului hidrofob

Nile red.

PREMARCAREA PROTEINELOR CU FLUOROFORI

Electrotrensferul proteinelor pe

membrana (western blotting)-

evidentierea specifica

Hârtia diazobenziloximetilată s

N N+

]

O

CH2

ce lulozã

Nitrocellulose

PVDF (polyvinylidene difluoride)

Tipuri de membrane utilizate în

transferul de proteine

Protein transfer systems

• Proteins migrate to the membrane

following a current (I) that is generated by

applying a voltage (V) across the

electrodes, following Ohm‟s law:

• V = I x R

• where R is the resistance generated by

the materials placed between the

electrodes (that is, the transfer buffer, gel,

membrane, and filter papers)

METODE DE DETECŢIE A PROTEINELOR PE MEMBRANĂ DUPĂ TRANSFER

ELECTROFORETIC

Transferul proteinelor pe membrană (denumit western blotting) reprezintă o tehnică de rutină,

deosebit de utilizată în detectarea şi caracterizarea proteinelor. Metoda prezintă avantajul

specificităţii anticorpilor care conduc la identificarea fără dubii a proteinelor după separarea lor

prin electroforeză pe gel de poliacrilamidă şi transferate pe o membrană. Western blotting-ul

implică recunoaşterea secvenţială dintre trei componente: proteina ţintă, anticorpul primar

care recunoaște proteina ţintă şi un anticorp secundar care recunoaşte anticorpul primar şi

generează un semnal detectabil. După legarea proteinelor la o membrană, situsurile nelegate

sunt inactivate (membrana este blocată), incubată cu un anticorp primar, apoi cu un anticorp

secundar şi în final, spălată. Anticorpul primar se leagă la proteina de interes în timp ce anticorpul

secundar este pregătit pentru detecţie.

Anticorpul secundar poate fi marcat cu un radioizotop, un fluorofor, sau cu o enzimă, în marea

majoritate peroxidaza din hrean (horseradish peroxidase- HRP) sau fosfataza alcalină (AP)

O lungă perioadă de timp, radioizotopii au reprezentat singura cale de marcare a probelor de

anticorpi secundari şi astfel utilizaţi în aplicaţiile de transfer ale proteinelor. Ultimii ani au

dezvăluit noi metode mai puţim periculoase şi mai fezabile decât cele radioactive, care conduc la

rezultate comparabile în ceea ce priveşte sensibilitatea lor. Tehnicile curente de detecţie după

transfer pe membrană includ metode bazate pe detecţia emisiei de lumină (chemiluminiscenţă,

bioluminescenţă, chemifluorescenţă şi fluorescenţă), detecţie prin autoradiografie, ori

colorimetrie.

Detecţia prin chemoluminiscenţă

Chemiluminescenţa reprezintă producerea unei cuante de

lumină detectabilă rezultată în urma unei reacţii chimice. În

detecţia pe membrane de transfer, reacţiile sunt catalizate de

către o enzimă precum fosfataza alcalină ori peroxidaza

conjugată cu un anticorp. Semnalul luminos poate fi

capturat prim impresionarea unui film de tipul celor

utilizate la captura radiaţiilor X sau de către sisteme video

de captare a imaginilor. Beneficiile detectării semnalelor

chemiluminescente de către un sistem de preluare a

imaginilor sunt numeroase. Astfel, domeniul de linearitate

dinamică a sistemelor video este de 2 până la 5 ori

magnitudine mai sensibile comparativ cu sistemele de

impresionare a filmului fotografic. Aceste sisteme video

digitale de preluare a imaginii oferă pe lângă o sensibilitate

crescută şi o economicitate în sensul eliminării

achiziţionării continue de film ori consumabile de

prelucrare al acestuia. Tehnica chemiluminescentă este uşor

de adaptat la procedurile de western blotting existente

deoarece utilizează anticorpi conjugaţi cu enzimă, pentru a

genera semnalul luminos. Treptele de blocare şi spălare sunt

comune celor utilizate în în tehnicile de western blotting.

Cele mai multe metode chemiluminescente necesită puţine

componente necesare în generarea semnalului luminos. În

cazul chemiluminescenţei luminolului, substratul este

oxidat chimic de către HRP cu producţia unui compus aflat

în stare excitată.

În cele mai multe metode bazate pe oxidarea luminolului, semnalul luminos se produce în

momentul în care produsul excitat se întoarce la starea sa de bază. Semnalul este vizualizat prin

expunerea membranei pe un film foto sau prin utilizarea sistemelor de achiziţie a imaginii. Pe

lângă luminol sunt, disponibile comercial şi alte substrate chemiluminescent precum substratele

bazate pe acridan (este cazul Lumigen PS-3 (care utilizează AP sau HRP ca enzimă reporter) ori

substraturi pe bază de 1-2-dioxetan (care utilizează AP ca enzimă reporter) Emisia de lumină

poate fi crescută de până la 1000 de ori prin adăugarea unor amplificatori cu structură fenolică.

Amplificatorul diferă de tipul de kit utilizat. Detecţia chemiluminescentă prezintă ca avantaje,

viteza şi sensibilitatea. Timpul mediu de expunere de 30 secunde până la 15 minute. Timpul scurt

este principala îmbunătăţire faţă de metoda bazată pe detecţia cu 125I, care necesită până la 48 de

ore de expunere pe film foto. Prin această metodă se pot detecta cantităţi de ordinul picogramelor

de proteină mai sensibile decât majoritatea metodelor colorimetrice şi sunt aproximativ egale cu

cele radioizotopice. Este important a se nota că sensibilitatea detecţiei este oarecun dependentă de

afinitatea antigenului şi a anticorpilor primar şi secundar care poate varia considerabil de la o

probă proteică la alta. Detecţia chemiluminescentă nu prezintă în plus dezavantajul celei

radioizotopice în ceea ce prezintă riscul de expunere la iradiere, costul crescut în ceeea ce

priveşte măsurile de protecţie faţă de reziduurile radioactive în ceea ce priveşte contaminarea

mediului. Nu în ultimul rând, membranele utilizate în cazul metodelor chemiluminescente pot fi

utilizate de mai multe ori prin spălare şi rebandarea proteinelor, proces care nu este posibil în

cazul tehnicilor de detecţie colorimetrice.

Detecţia prin bioluminescenţă

Bioluminescenţa este un fenomen de emisie de lumină de către multe organisme. Sistemele

bioluminescente diferă în structura şi funcţia enzimelor şi cofactorilor implicaţi în proces

alături de mecanismul reacţiilor de generare a luminii. Bioluminescenţa poate fi exploatată ca

metodă de detecţie pe membrane. Detecţia prin bioluminescenţă implică incubarea membranei

care conţine un antigen legat/complex anticorp-enzimă în prezenţa unui substrat

bioluminogenic, cu măsurarea simultană a luminii emise. Substratul în acest sistem de detecţie

este un derivat al luciferinei. Detecţia luminii este realizată într-o cameră fotoevidenţiere iar

proteinele sunt vizualizate ca spoturi luminoase. Din punct de vedere al sensibilităţii şi a

vitezei de realizare, tehnica este similară celei de chemiluminescenţă dar nu este generalizată

datorită numărului mic de substrate bioluminogenice comercializate. Membrana PVDF este

preferabilă în detecţia bioluminescentă deoarece membrana de nitroceluloză poate conţine

substanţe ce inhibă activitatea luciferazică şi astfel sunt posibile interferenţe în analiză.

Detecţia chemifluorescentă

Chemifluorescenţa reprezintă a conversie enzimatică a unui substrat

într-un produs fluorescent. Compuşii fluorogenici (substanţe

nonfluorescente sau slab fluorescente care pot fi convertite în produşi

fluorescenţi) sunt utilizaţi cu o mare varietate de enzime, inclusiv cu

AP ori HRP. Enzima clivează o grupare fosfat a unui substrat

fluorogenic cu producerea unui compus înalt fluorescent. Fluorescenţa

poate fi detectată prin utilizarea unui sistem de preluare a imaginii

astfel, cuantificată de către un program. Chemifluorescenţa poate

conduce la produşi de reacţie fluorescenţi stabili, astfel membranele pot

fi analizate în condiţiiile de timp convenabile. Metoda este compatibilă

pentru recolorări şi spălări.

Detecţia prin fluorescență

În cazul detecţiei fluorescente, anticorpul secundar este marcat cu un fluorofor

precum fluoresceină (FITC), Texas Red, rhodamine (TRITC), ori R-phycoerythrin.

Principalul avantaj în detecţia fluorescenţei este faptul că domeniul dinamic linear

este de circa 10 ori mai mare decât în detecţia prin chemiluminescenţă cu o

reducere a sensibilităţii de numai 2–4 ori. Detecţia fluorescentă a proteinelor

legate de membrane poate conduce uneori la o mai bună linearitate şi la

cuantificări mai bune în limitele de detecţie. Detecţia fluorescentă poate fi

deasemenea multiplex. Legarea mai multor fluorofori coloraţi la diverşi antigeni

conduce la detecţia simultană a mai multor proteine ţintă pe aceeaşi membrană.

Autoradiografia

Pentru multe aplicaţii radioizotopii pot fi utilizaţi pentru a marca probele

(în cazul membranelor rezultate din transfer este vorba de anticorpul

secundar) Radioizotopii cei mai utilizaţi în ştiinţele biologice sunt 35S,32P, 33P, 14C, şi 125I. Pentru a detecta radioactivitea, metoda cea mai

utilizată este autoradiografia pe filme de radiaţii X. Autoradiografia

conduce la o relaţie bună între sensibilitate şi rezoluţie fără o investiţie

mare. Pentru intensificarea semnalului autoradiografic se utilizează

scintilatori. Există sisteme de analiză a fosforului care oferă o alternativă

la metodele de detecţie pe film. Marele avantaj al metodei constă într-o

relaţie lineară între intensitatea semnalului şi cantitatea de proteină.

Detecţia colorimetrică

O serie de substrate sunt convertite la un precipitat colorat de către o

serie de enzime precum HRP ori AP, enzime uzual conjugate la

anticorpul secondar. Cele mai comune sisteme utilizează substraturi

precum 5-bromo-4- chloro-3-indolil fosfat/Nitroblue Tetrazoliu

(BCIP/NBT) pentru AP ori diaminobenzidina (DAB) sau 4-cloro-1-

naftol (4CN) pentru HRP. În momentul acumulării de precipitat pe

bandă, se dezvoltă un semnal colorat pe membrană. Reacţia enzimatică

poate fi monitorizată şi stopată în condiţiile în care semnalul are o

intensitate dorită pentru a preveni zgomotele de fond. Metoda este cea

mai simplă dintre toate tehnicile de evidenţiere, semnalul detectabil fiind

rodul legării anticorpului secundar la un anticorp specific proteinei de

interes

Metode de detecţie a proteinelor

după transferul pe membrană

Comparaţie între metodele de detecţie a proteinelor după transfer pe membrană

DETECTAREA ENZIMELOR ÎN GELURIDetectarea activităţilor enzimatice după electroforeză în gel şi stabilirea exactă a benzilor

individuale proteice produse astfel datorită activităţii catalitice specifice rămâne o ţintă

fascinantă. Acest lucru a fost bine evidenţiat de numărul mare de studii focusate în acest scop. Cu

o vedere spre trecut este interesant de observat legăturile intime dintre metodele de evidenţiere

postelectroforetice de cele histochimice din care, majoritatea metodelor de evidenţiere au

provenit. În acelaşi timp, noi enzime continuă să fie descoperite, de unde noi probleme în

evidenţierea lor postelectroforetică.

Singurele probleme sunt întâmpinate din cauza faptului că activitatea enzimatică trebuie

demonstrată după rezolvarea gelului. Separarea proteinelor native care îşi menţin activitatea

nativă în timpul procesului electroforetic este una din metodele posibile. Alternativ, separarea

poate fi realizată în condiţii denaturante de exemplu în prezenţa dodecilsulfat de sodiu (SDS),

urmată de renaturarea în scopul recuperării activităţii enzimatice maxime. În orice instanţă,

activitatea poate fi determinată direct pe gel ori după transfer pe un suport potrivit. Alegerea

tehnicii electroforetice specifice va depinde de proprietăţile individuale ale enzimelor, de alţi

componenţi ale probei ori de rezoluţia maximă atinsă în condiţii native deoarece proteinele native

nu pot fi la fel de bine rezolvate precum cele denaturate.

Astăzi, detecţia activităţilor enzimatice sunt în mod uzual realizate pe geluri plate verticale, mai

mult decât pe geluri cilindrice. Compararea proprietăţilor de migrare este mai uşor realizată şi

este de preferat în condiţii identice, faţă de cele realizate în condiţiile gelurilor cilindrice. Pe de

altă parte, acoperirea cu tampon-substrat care conţine enzime auxiliare, substrat, coenzime, ori

alţi cofactori necesari poate fi produsă maxim numai în cazul gelurilor plate, factori de asemenea

importanţi în detectarea activităţii. Alternativ, transferul pe alte membrane poate reprezenta o altă

alternativă în evidenţierea postelectroforetică a activităţilor enzimatice.

Separarea electroforetică a protein-enzimelor poate fi însoţită de două trăsături diferite.

Este vorba de sarcina intrinsecă a proteinei, proprietate ce poate fi utiliza în procesul de

migrare electroforetică, sau de sarcina extrinsecă, care poate fi indusă.

Separarea pe baza sarcinii intrinseci, în electroliţi cu o singură valoare a pH-ului ori

prin focusare izoelectrică reprezintă alegeri atractive din cauza faptului că astfel se menţine

proteina în starea ei nativă, cu păstrarea activităţii, ce poate în acest mod determinată direct.

Electrofocusarea este în particular utilizată deoarece prin ea se rezolvă izoforme apropiate.

Separarea bazată pe sarcinile extrinseci are la bază denaturarea şi legarea SDS la

situsurile hidrofobe ale proteinei. Pornind de la aceasta, treapta de maturare este necesară după

electroforeză.

Electroforeza în prezenţă de SDS reprezintă una dintre cele mai comune forme de electroforeză

în gel. Ea se bazează pe separarea în funcţie de mărimea proteinei la care domeniile hidrofobe

ale fiecărei molecule proteice interacţionează cu catena alifatică a SDS, care sunt repartizate ca

sarcini extrinseci pe întreaga suprafaţă a proteinei. Din nefericire, cele mai multe enzime sunt

inactivate de către SDS, numai un număr restrâns reţinând activitatea chiar în prezenţa

detergentului.

PREPARAREA PROBEI ŞI ELECTROFOREZA EI

Înaintea oricărei separări şi localizări este necesar a cunoaşte proprietăţile enzimei luate în studiu,

precum pH-ul optim, necesităţile în cofactori, inclusiv a cationilor şi a cosubstratelor. Detergenţii,

agenţii de oxidare sau alţi factori detrimentali care pot influenţa activitatea enzimatică precum

pH-ul şi mediul ionic trebuie monitorizaţi cu stricteţe, atât în timpul preparării probei cât şi în

timpul procesului electroforetic. Ieste bine de notat că prezenţa coloranţilor de evidenţiere a

migrării pot ei însuşi să denatureze ireversibil o serie de enzime. Înaintea electroforezei este

esenţial a se determina concentraţia proteică şi a se efectua un test convenabil al activităţii

enzimatice. O cantitate de 1 până la 10 g de proteină pură reprezintă optimul în timp ce

amestecurile de proteine pot conţine până la 100 g. Este important a alege o cantitate optimă de

soluţie proteică care să prezinte o activitate bine-decelată în urma procesului de evidenţiere

postelectroforetică, o cantitate prea mică făcând dificilă identificarea enzimei în timp ce o

încărcare mare va conduce la suprapunerea benzilor şi la o distorsiune a lor. Electrofocusarea este

pe departe mult mai sensibilă la supraîncărcare, după cum proteina va distorsiona în gradientul de

pH.

În condiţiile în care toate informaţiile pertinente sunt obţinute, este necesar un

experiment pilot în determinarea activităţii enzimatice. În acest scop, este preparat un

gel care conţine toate componentele necesare în timpul procesului de separare

electroforetică. Proba este plasată într-un godeu şi lăsată să difuzeze în matricea

gelului, fără migrare electroforetică. Metoda de detecţie este astfel testată fără separare

electroforetică, în scopul stabilirii prezenţei sau absenţei agenţilor denaturanţi ori a

inhibitorilor în gel. Dacă testele preliminarii relevă o inactivare a enzimei, trebuie

aleasă şi testată o altă strategie de evidenţiere în scopul menţinerii activităţii

enzimatice în timpul procesului electroforetic.

Cele mai comune şi nedorite componente inhibitorii ale gelului de poliacrilamidă sunt

iniţiatorii reacţiei de polimerizare, persulfatul şi riboflavina, monomerul de acrilamidă

nepolimerizat şi acidul acrilic, deseori prezent în amestecul de polimerizare. Există o

serie de căi în limitarea a efectului acestor componente. De exemplu, pre-electroforeza

gelului de separare, singur, înaintea polimerizării gelului de concentrare va elimina

iniţiatorii reacţiei de polimerizare care au capacitatea de a oxida grupările tiol deseori

implicate în actul catalitic. O altă tehnică este aceea de a adăuga acid cisteic la

tamponul de migrare, care va "curăţa" gelul de peroxizi datorită faptului că acest acid

va migra alături de ionul lider, conducător. Alternativ, gelurile subţiri (de 1 mm sau

mai mici) pot fi imersate şi umectate într-un tampon care conţine ditiotreitol în scopul

îndepărtării oxidanţilor. Eliminarea acidului acrilic poate fi realizată prin

recristalizarea monomerului de acrilamidă chiar înaintea polimerizării.

– Captura simultană a produsului reacţiei enzimatice. Produsul reacţiei este cuplat cu unreactiv care conduce la obţinerea unui produs colorat. Această tehnică este utilizată în toatecazurile în care enzima rămâne activă în prezenţa reactivilor de colorare. Marele ei avantaj estereprezentat de faptul că procedura este realizată într-o singură treaptă, fără o difuziesubstanţială a enzimei în gel.

– Postincubarea cuplată a substratului. Această tehnică necesită o metodologie în două trepte.Incubarea enzimei prezente în gel cu substratul este urmată de incubarea cu un reactiv cepermite formarea unui produs secundar colorat şi insolubil. În cazul acesta, difuziunea semanifestă în timpul perioadei iniţiale de incubare a gelului cu substratul.

– Metode autocromice. Evoluţia activităţii enzimatice poate fi urmărită în mod direct prinobservarea modificărilor proprietăţilor optice precum absorbţia luminii sau fluorescenţa, produsăde substrat sau de către produsul de reacţie. O serie de substrate sau coenzime îşi modificăproprietăţile optice în lumină vizibilă sau ultra violetă în timpul reacţiei enzimatice. Schimbareafluorescenţei serveşte de asemenea ca indicator în cazul metodelor autocrome.

– Analiza indicator-matrice. Enzimele de cuplare auxiliare şi substratele cu masă molecularămare necesită o incubare a gelului cu un strat care conţine o matrice indicatoare, un gelsuplimentar, indicator. Incubarea de tip sandwich a gelului de separare şi indicator conduce lalocalizarea activităţii enzimatice. O variantă a acestei tehnici o reprezintă incubarea dupăseparare cu o matriţă pe care proteina a fost transferată şi imobilizată. Astfel, după separare,proteina este transferată din gel pe membrană prin tehnicile descrise ca Western blotting.

– Copolimerizarea substratului în gelul de separare. Substraturile cu masă moleculară mareprecum polimerii carbohidraţi, proteinele sau acizii nucleici pot fi copolimerizaţi în gelul deseparare. Acest procedeu poate totuşi influenţa separarea enzimei. În timpul electroforezei,activitatea enzimatică poate fi stopată prevenindu-se astfel acţiunea ei asupra substratului, deexemplu prin utilizarea unor inhibitori reversibili precum SDS. După separare, gelul este spălat întampon fără detergent, ceea ce conduce la renaturarea sa. O altă cale de prevenire a activăriienzimei în timpul procesului de electroforeză este reprezentată de incubarea cu diverşi agenţichelatori care leagă ionii metalici esenţiali. După finalizarea procesului de separare gelul esteincubat în tampon care conţine cationul esenţial într-o concentraţie mai mare decât cea aagentului chelator, şi prin aceasta se restabileşte activitatea.

PRINCIPIILE LOCALIZĂRII “IN SITU”A ENZIMELOR

Aplicarea cu succes a acestei metode necesită ca sensul reacţiei enzimatice să

conducă la oxidarea substratului cu reducerea concomitentă a coenzimei

(formarea de NADH ori NADPH) Echivalenţii de reducere sunt apoi transferaţi

spre colorantul tetrazolic, reacţie de cele mai multe ori mediată de fenazin

metosulfat; astfel prin reducerea sării de tetrazoliu rezultă formazan, colorat şi

insolubil. Stoichiometria transferului necesită un echivalent de reducere la o

pereche de electroni transferaţi pentru formarea unui formazan din sărurile

monotetrazolice şi doi echivalenţi pentru sărurile ditetrazolice. Astfel, sărurile

monotetrazolice precum MTT (bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazoliu, tiazolil blue) sunt mult mai sensibile decât sărurile de sărurile

de ditetrazoliu. De exemplu, NBT (clorura de 2,2'-di -p-nitrofenil-5,5'-difenil-3,3'-

(3,3'-dimetoxi-4,4'-difenilen) tetrazoliu, în condiţiile reducerii incomplete,

conduce la un formazan de culoare roşie, în timp ce forma total redusă este

albastră.

Oxidoreductaze- Detecţia directă a enzimelor

NAD- şi NADP-dependente prin conversia

coloranţilor tetrazolici la formazani

N

N

CH3

+CH3OSO3

Structura fenazin metosulfatului (N-Metilfenazin metilsulfat).

Compusul are rolul de a cupla transferul de electroni dinspre

NAD(P)H spre sărurile de tetrazoliu, făcînd astfel posibilă

urmărirea reducerii NAD(P)+.

Exemplu: -Glicerofosfat Dehidrogenaza

Amestecul de reacţie, 50 ml, este astfel preparat să conţină 25 mg de NAD+, 15 mg de

clorură de nitroblue tetrazoliu (NBT), 1 mg de fenazin metosulfat (PMS), 5 ml de -

glicerofosfat sare de sodiu, 1 M, pH 7,0 şi 10 ml de tampon Tris-HCI 0,2 M, pH 8,0. Gelul,

care conţine enzima, se incubează la 37°C până când apar benzile albastre. Gelul se clăteşte

cu apă, apoi se fixează într-un amestec etanol/acid acetic/glicerol/apă (5:2:1:4).

Este necesar a se utiliza un control pentru a arăta dependenţa culorii de substrat şi nu ca

efect al reducerii datorate luminii ori a oxidării produse de oxigen.

Formulele generale ale sărurilor de mono- (A) şi di-tetrazoliu (B)

Evidenţierea alcool

dehidrogenazei, EC 1.1.1.1

• un alcool + NAD+ <=>

o aldehidă sau o

cetonă + NADH+H+

• NAD+, 1 mg/ml,

• PMS, 0,02 mg/ml,

• Nitro blue tetrazoliu,

0.2 mg/ml,

• Etanol, 0.1 M

Detecţia enzimelor NAD- şi NADP-dependente prin iluminare UV

Piridin nucleotidele sub formă redusă sunt vizibile direct în lumină UV ca şi

fluorescenţă galbenă în timp ce formele lor oxidate apar ca benzi negre. Faţă de

metodologia descrisă mai sus, această tehnică poate fi aplicată la identificarea

atât a formelor reduse cât şi a formelor oxidate de substrat. O altă însuşire

utilizabilă a metodei constă în capacitatea ca de a detecta benzile “fără

dehidrogenaze”, adică a formării de NADH în absenţa substratului, astfel

eliminându-se coloraţiile fals-pozitive. Un dezavantaj al acestei tehnici este

reprezentat de difuzia continuă a substratului în timpul perioadei de incubare şi

de necesitatea fotografierii în timpul evoluţiei reacţiei.

Oxidoreductazele piridin nucleotid-independente

Tirozinaza prezentă în celulele mamiferelor , o enzimă care

reţine activitatea chiar şi în prezenţă de SDS, poate fi dată ca

exemplu. Chiar dacă procedeul prezentat include ca treaptă în

de evidenţiere îndepărtarea SDS după separarea

electroforetică, ea nu este neapărat necesară în cazul unei

probe care conţine o activitate foarte activă. Enzima

catalizează oxidarea L-tirozinei la L-Dopa (3,4-dihiroxi

fenilalanină) şi în continuare la dopaquinonă. Dopaquinona se

converteşte spontan în dopacrom, un produs maro-închis. Cum

prima treaptă de oxidare este foarte lentă, metoda descrisă

utilizează Dopa ca substrat

Reacţiile de transfer ale grupărilor metil, glicozil, ori fosfat de la un donor spre un acceptor sunt

catalizate de către transferaze. Denumirea generică a acestor enzime este de "donor:acceptor grup

transferaze." Sunt unele cazuri unde donorii sunt ATP ori CoA, care conţin grupări (fosfat

respectiv acil) ce pot fi transferate. În mod curent, detecţia transferazelor implică participarea

unor enzime auxiliare. De exemplu, pentru identificarea hexokinazei (ATP:glucozo

fosfotransferaza) enzima este incubată la început cu glucoză, ATP, şi Mg2+ pentru a produce

glucoză-6-fosfat. Formarea glucozo-6­fosfatului este cuplată cu glucozo-6-fosfat dehidrogenaza,

o enzimă NADP-dependentă. Astfel, formarea de NADPH este detectată printr-o metodă descrisă

în cazul oxidoreductazelor precum transferul de echivalenţi dinspre NADPH spre PMS şi în final

spre sarea de tetrazoliu cu producerea unui formazan. Utilizarea enzimelor auxiliare se realizează

în mod curent şi prin tehnica de acoperire a gelului cu o hârtie sau agar, într-o incubare de tip

sandwich. Alternativ, transferul produşilor de electroforeză pe un alt suport precum membranele

de nitroceluloză este urmată de detectarea activităţii enzimatice pe membrane. Trebuie avut însă

în vedere că enzimele auxiliare necesită condiţii specifice care trebuiesc asigurate pentru a avea

activitate catalitică.

Transferazele

Tehnicile cu gel indicator şi de transfer pe membrane

L-Alanina + -cetoglutarat piruvat + L-glutamat

L-glutamat APAD+ -cetoglutarat APADH NH3++ +

APADH MTTPMS

APAD+ MTT-formazan+ +

APAD-Un analog al NAD, 3-acetilpiridin

adenin dinucleotid

În general, hidrolazele sunt cele mai stabile enzime dintre toate clasele sus

menţionate. Substraturile cromogene pentru multe dintre ele sunt

disponibile comercial, evoluţia reacţieie putând fi monitorizată direct, în

lumină vizibilă, ori în UV. Substraturile sau produşii care-şi schimbă

proprietăţile fluorescente sunt deasemenea larg utilizaţi datorită tehnicilor

de mare sensibilitate. Hidrolazele pot fi deasemenea localizate prim

metode de cuplare cu derivaţi azoici, în care substratul hidrolizat

reacţionează cu săruri de diazoniu, precum Fast Red TR ori Fast Blue

RR.

Hidrolazele

Separarea amestecurilor eterogene sub influenţa forţei centrifuge care apare

când în amestec se realizează viteze de rotaţie mari, poartă denumirea de

separare centrifugală sau centrifugare.

Centrifugarea este o metodă foarte răspândită în aproape toate

subramurile industriei alimentare. Utilajele utilizate pentru separarea sub efectul

forţei centrifuge poartă denumirea de centrifuge, acestea fiind caracterizate prin

elemente în mişcare la turaţie mare.

Materialele din care se construiesc centrifugele trebuie să satisfacă

cerinţele impuse de evitarea coroziunii, de păstrare a calităţilor lichidului şi de

rezistenţă admisibilă. Sub aspectul separării eterogene, efectele forţei centrifuge

şi a celei gravitaţionale sunt aceleaşi, deosebirea constă în faptul că, intensitatea

câmpului centrifugal poate fi modificată prin modificarea turaţiei şi a distanţei faţă

de axul de rotaţie.

CENTRIFUGAREA

Separarea amestecurilor eterogene sub influenţa forţei centrifuge, se realizează pe

două principii:

1) Sedimentare, când separarea sub influenţa forţei centrifuge se realizează pe bază

de diferenţă de sedimentare, prin stratificarea componenţilor. Se aplică amestecurilor

eterogene lichid-lichid, solid-lichid, solid-solid, solid-gaz. Separarea centrifugală pe

principiul sedimentării, poartă uneori denumiri speciale: limpezire) eliminarea

impurităţilor solide dintr-un lichid), concentrare (concentrarea particulelor solide dintr-

un amestec solid-lichid ), etc.

Sedimentarea sub influenţa forţei centrifuge se realizează în două faze:

• depunerea fazei cu viteza de sedimentare sau cu densitatea mai mare, care se

supune legilor hidrodinamicii în cazul sedimentelor solide;

• tasarea sedimentului, care se supune legilor mecanicii solului. Sedimentarea

sub influenţa forţei centrifuge se deosebeşte de sedimentarea sub influenţa forţei

gravitaţionale prin faptul că se realizează sub influenţa acceleraţiei centrifugale.

Centrifugarea se foloseşte pentru accelerarea sedimentării, pentru amplificarea vitezei

de filtrare şi eliminarea fazei lichide dintr-un solid în stare de granule. Se pot realiza

umidităţi minime de 3-10%.

Separarea amestecurilor eterogene

sub influenţa forţei centrifuge

Viteza de sedimentare în câmpul gravitaţional este dată de legea lui Stokes:

2

21

2

2

212

1818

1

dgdwg

unde:

wg- viteza de sedimentare în câmp gravitaţional;

d – diametrul particulelor care sedimentează;

1- densitatea particulelor;

2- densitatea lichidului;

g – acceleraţia gravitaţională

- vâscozitatea cinematică a lichidului

Viteza de sedimentare în câmpul gravitaţional depinde de mărimea

particulelor care sedimentează şi de constantele fizice (1,2, ) ale sistemului

dispers. Rezultă că viteza de sedimentare nu poate fi schimbată decât prin

schimbarea proprietăţilor sistemului, de exemplu prin mărirea particulelor

(coagulare) sau prin micşorarea vâscozităţii (încălzire). O altă posibilitate de

mărire a vitezei de sedimentare este de a lucra într-un câmp de forţe

caracterizat printr-o acceleraţie mai mare decât cea gravitaţională, ceea ce se

poate realiza prin centrifugare.

Într-o centrifugă viteza de sedimentare nu este constantă din cauza câmpului

neomogen a cărui intensitate creşte cu distanţa de la centru.

Durata de sedimentare, adică timpul necesar ca particula cu diametrul d să

parcurgă un strat de lichid egal cu ( R2-R1) se deduce cu ajutorul vitezei medii:

zwg

Rww

Rwdw ggc ,0

2

,0

2

2

212

,018

1

Efectele sedimentării într-un câmp de forţe centrifuge sunt:

• viteze mari de sedimentare;

• sedimentarea particulelor mai fine, adică o separare mai

înaintată a celor două faze din care este format sistemul dispers;

• separarea sistemelor disperse cu diferenţă mică între densităţile

1 şi 2 ale celor două faze.

Ultracentrifugarea zonala

• Svedberg- separarea particulelor in câmp centrifugal

• Intensit cp. Centrifugal

a = x•ω2 x=pozitia radiala

ω=viteza unghiulara

ω = 2π•η

a = x• (2π•η)2

a = x•ω2 / g

• F = me•xω2 me= m-ms

• Fef = m•xω2 - ms•xω2

• Vp=volum particula de masa m

• ρp= densitatea particulei

• ρl = densitatea lichidului

• ms=Vp• ρp

• Fef = m•xω2 - m•(ρl / ρp) xω2

• s = v / a = dx/dt/x•ω2

• Unitate svedberd 1s = 10-13sec

• s = so / (1 + kc) so = val. Coef. la conc. = 0

M = sRT

D(1-l

p)

Factorii care influenteaza

sedimentarea particulelor

• Raza particulei

• Vâscozitatea

• Densitatea mediului