Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010 · Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010 La citometria de flux és una eina indispensable en qualsevol investigació

Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010

La citometria de flux és una eina indispensable en qualsevol investigació bàsica avui en dia. Des dels seus inicis als anys 50 fins avui ha experimentat molts avenços.

Un citòmetre de flux el podem dividir en tres parts:Fluídica

El sistema de fluids del citòmetre crea un flux laminar que ens permet fer passar la mostra per davant de la font d'excitació de manera ordenada, cél·lula a cèl·lula, gràcies a l'enfocament hidrodinàmic que s'aconsegueix.

ÒpticaL’òptica ens permet excitar la mostra, a diferents longituds d'ona, i recollir-ne l'emissió. La llum recollida l'acotem mitjançant una sèrie de filtres per poder diferenciar els diferents fluorocroms

ElectrònicaL’electrònica s'encarrega de processar la senyal rebuda als detectors en senyals interpretables per al software.

Anàlisi de Dades. FCS Express

Hi ha una sèrie d'aspectes bàsics que cal tenir presents a l’hora d'analitzar les nostres dades:

- Quin tipus de dades tenim?- De quin equip hem obtingut aquestes dades?- Quin tipus d'anàlisi volem fer?- Què en farem dels resultats?- Tenim dades provinents d'altres tècniques i cal complementar-los?- Necessitarem exportar les dades? Imprimir-les?

La resposta a aquestes preguntes és molt important, ja que determinarà com farem la nostra anàlisi i quines eïnes del programa ens seran més útils.


Les dades que obtenim del citòmetre s'obtenen en un format "estàndard". Actualment el format que permet emmagatzemar major nombre d'events i paràmetres és el format FCS 3.0. El format que s'obté dels citometres de la plataforma de citòmica és el FCS 2.0 en el cas dels FacsCalibur i el FCS 2.0 ò el FCS 3.0, en els altres.Les dades són arxius de text on per cada cèl·lula i cada paràmetre tenim un valor. També conté informació sobre l'equip que s'ha fet servir, la data en què s'ha creat així com d'altra informació que nosaltres hem introduït a l'hora d'obtenir les dades. Molta d'aquesta informació ve etiquetada com a "Keyword" i ens serà útil per treure-li més partit al programa.

$BEGINDATA=1852$ENDDATA=2450779$FIL=DCs_009-1-4 T-all DC +CD3PE+SB.fcs.fcs$SYS=Windows XP 5.1$TOT=76529$PAR=5$MODE=L$BYTEORD=1,2,3,4$DATATYPE=F$NEXTDATA=0CREATOR=BD FACSDiva Software Version 5.0.2TUBE NAME=009-1-4 T-all DC +CD3PE+SB$SRC=DCsEXPERIMENT NAME=MLR UDC67 - D6 29jun08GUID=65e32bd7-d9ae-45a9-9029-bbfb3171535b$DATE=29-JUN-2008$BTIM=01:34:40$ETIM=01:35:18$CYT=LSRII


L'FCS Express és el programa que l’Institut posa a disposició dels investigadors del centre per poder analitzar les dades obtingudes en la plataforma de citòmica. Es tracta d’un programa d'anàlisi de citometria molt potent. Ens permet fer des de les anàlisis més senzilles fins a les més complexes. Integra dins de la mateixa plataforma eines per:

Analitzar dades provinents de diferents citòmetres.Anàlisi de cicle cel·lular.Proliferació cel·lular. Ens permet importar experiments creats amb el programa FacsDiva. Té una base de dades online que et permet organitzar les dades en base als paràmetres que ens interessi.Permet fer anàlisis en sèrie.………


Com qualsevol altre programa presenta multitud de menús i opcions. Les mateixes accions es poden realitzar de diverses maneres i totes les maneres de treballar són igual de vàlides.

Anirem explicant les diferents opcions a mesura que les anem necessitant.

Així doncs el que farem primer de tot serà crear un document amb les següents característiques:

Títol a cadascuna de les pàginesNúmeros de pàgina parcials i totalsGràfics i estadístics 1 arxiu / pàgina

Comencem!!!


Clickem sobre l'Icona i obrim el programa. Ens apareix un diàleg on es demana quin usuari volem.

L'usuari ens permetrà configurar el programa al nostre gust. Decidir com volem que faci els gràfics, les gates, els estadístics i altres paràmetres. Podem posar-li una paraula clau al nostre usuari de manera que si volem canviar les preferències ens demanarà la paraula clau.


El primer que hem de tenir en compte quan fem servir l'FCS Express és com treballa el programa. Està pensat com si fos el PowerPoint de manera que el mode de funcionament és similar.

Àrea de treball:L'area de treball es pot dividir en dues parts: el full d'impressió i la zona grisa. L'aplicatiu ens deixa fer el mateix tant a una zona com en una altra i no fa distinció, excepte en algun cas concret. Per exemple, a l'hora d'imprimir només imprimeix el que hi ha al full d'impressió.

Començarem per introduir el títol i els números de pàgina per a tot el document. Per això ens valdrem de la Master Page.


Master Page (Pàgina Mestra):

Accessible només des del menú View - Master Page. Ens és de gran utilitat. Qualsevol objecte, gràfic, text que afegim a aquesta pàgina ens apareixerà a totes les pàgines noves que creem. És comparable al Patró de diapositives del PowerPoint. Ens és útil per posar el títol, el número de pàgines o per exemple si volem que a totes les pàgines ens aparegui un gràfic concret. Quan exportem el document a PowerPoint tot el que figuri a la zona grisa també ens apareixerà a les altres diapositives, com a fons.



Així doncs el que farem serà afegir un títol i el número de pàgina a la pàgina mestra. Així ens apareixerà a la resta de pàgines. Així doncs anem a la Master Page. Per afegir un títol cliquem sobre l'icona de quadre de text . I sobre la part de la pantalla on volem crear el títol. Aleshores escrivim el títol que volem per al document.

Faríem el mateix si volem afegir una imatge, però sel·leccionant l'icona d'imatge, per exemple per personalitzar el document amb el logo de l'Institut.

En el cas del número de pàgina necessitem fer servir els "Tokens"...Ja veurem que no és tan difícil com sembla pel nom, els podríem comparar a camps en el word. Insertem un quadre de text on volguem, cliquem amb el botó dret del ratolí dins del quadre text i sel·leccionem la opció "Insert Token".



Ens apareixerà una finestra on ens demanarà quin token o tipus de token volem insertar. Sel·leccionem la opció "Current page Number". Escrivim una / i tornem a fer la mateixa operació però sel·leccionant en aquest cas "Number of pages". Obtindrem el següent:

Per sortir de la Master Page anirem al menú View i desel·leccionarem la opció Master Page. Us semblarà que no em fet res....Anem al menú "Insert" i cliquem a "New Page". I mirem el número de pàgina.


Abans de continuar gravarem el document per no perdre els canvis que hi haguem introduït. Els documents es podrien equiparar a les plantilles, de manera que els podem reutilitzar per analitzar altres dades. El document s'anomena Layout i l'extensió d'aquest arxiu és ".fey". Tenim 3 tipus de plantilla, segons la manera en què la gravem:

-FCS Link: crea un link a tots els arxius FCS que es fan servir, de manera que la propera vegada que obrim la plantilla obrirà els arxius FCS sempre i quan es trobin a la mateixa ubicació.-FCS no Link: no guarda informació dels arxius que estem fent servir de manera que la propera vegada que l'obrim els gràfics apareixeran en blanc.-FCS Embed: guarda les dades dels arxius FCS juntament amb la plantilla de manera que sempre portarem les dades a sobre. Aquest tipus de plantilla ocupa més memòria que les altres dues.


Sel·leccionarem l'opció FCS Link, de manera que cada vegada que obrim el document aquest vagi a buscar els arxius a la carpeta on els tenim guardats. Això si....no podem moure els arxius de lloc....La millor opció és guardar el document en la mateixa carpeta que els arxius.

El que farem ara serà crear els gràfics i estadístics del primer arxiu. Els arxius amb els que treballarem ara seran:

Control - Neg / Fitc+Neg / Pe+Neg / PerCp+Neg / APC +Mostra tot+

Per això el que farem serà, primer de tot afegir tots aquests arxius al FileList. El File List ens permetrà després treballar més ràpidament amb els arxius i poder fer anàlisis en sèrie.


Clicarem sobre l'icona que ens obre el File List. Clickem sobre el botó Add i ens apareixerà un diàleg de sel·lecció d'arxius. Sel·leccionem els arxius que necessitem.

Una vegada tenim els arxius que volem, els podem ordenar com volguem, amb les fletxes, clicant sobre el quadrat petit de la columna o bé arrossegant i deixant anar. També podem afegir algun Keyword que ens ajudi a ordenar-los o que ens doni més informació sobre l'arxiu. Una vegada tenim els arxius que volem i ordenats de la manera que volem clickem sobre OK.


Task BarFunciona com la Task Bar de l'Office. Hi ha 4 vistes disponibles. Segons la opció que escollim tindrem unes opcions o unes altres:

Getting Started - Tenim dos opcionsNew - Per crear una nova plantilla en blanc o a partir d'una plantillaOpen - Per obrir plantilles existents

Page Layout - Ens deixa escollir plantilles predifinides per aplicar a la pàgina oberta

Basic - En blanc o amb text i/o imatgesPlots - Combinant gràficsPlots and Stats - Combinant gràfics i estadístics

Getting Help - Opcions d'ajudaNews - Informació relacionada amb citometria: cursos, xerrades... i publicitat

Des d'aquí podríem crear fàcilment documents amb diferents formats. No en farem servir cap. Anirem a poc a poc. Crearem un document amb 2 gràfics i els estadístics de cadascún dels gràfics, fent servir els arxius que tenim al File List.


Per això clicarem sobre la icona de "Density Plot" i sobre la part del document on volem crear el gràfic. Ens apareixerà una finestra de sel·lecció demanant-nos quin arxiu volem representar en el gràfic. En aquesta finestra hi ha dues pestanyes: File Dialog i File List. Així podrem escollir si volem afegir un arxiu del nostre ordinador que encara no el tinguem al File List o sel·leccionar-ne un del File List. Clicarem sobre File List i sel·leccionarem l'arxiu del Control-.

Ja tenim el nostre primer gràfic creat!!!!!

Ara crearem una Gate en el gràfic que ens permetrà sel·leccinar la població d'interès. Per això cliquem sobre la icona i envoltem la població d'interès. Ens apareixerà una finestra que ens demanarà quin nom li volem donar a la Gate i de quin color la volem dibuixar. En el cas que ja tinguéssim una gate creada ens donaria la opció de substituir-la. Deixem el nom i el color que li dóna per defecte.


Ara traurem els estadístics d'aquest gràfic. per això cliquem amb el botó dret del ratolí sobre el gràfic i escollim la opció "Gate Statistics". Ja tindrem els estadístics del nostre primer gràfic.

Podem modificar aquests estadístics al nostre gust, sel·leccionant quins ens mostra i quins no, de quina població, podem modificar la mida, la lletra posar-li un títol...El que se'ns acudeixi. Per això cliquem amb el botó dret del ratolí i a Format. Aleshores podrem modificar tot el que volguem.

Crearem el segon gràfic de la mateixa manera que el primer. En aquest cas representarem els paràmetres E-Blue A vs D-Blue A. Aquesta vegada no ens demanarà quin arxiu volem fer servir i farà servir l'últim arxiu que hem fet servir. per canviar els paràmetres cliquem sobre el nom del paràmetre en el gràfic i ens sortirà un desplegable amb els paràmetres disponibles. Sel·leccionem els que volem. En aquest gràfic només volem representar aquelles dades que es trobin dins de la Gate 1.

Per això, amb el gràfic sel·leccionat, clicarem sobre el desplegable de la part superior esquerra i marcarem la població que volem analitzar. Ja estem veient en aquest segon gràfic la població Gate 1. Si ho volem comprovar només cal que sel·leccionem el gràfic de nou i mirem què hi diu al desplegable.


Ara crearem uns quadrants en el gràfic i traurem els estadístics d'aquest gràfic. Per això clicarem sobre la icona i clicarem llavors sobre el gràfic, situant el quadrant allà on ens interessi.

Veureu que automàticament apareix a cada quadrant el % d'events que hi ha. De totes maneres no ens conformem amb aquests estadístics i traurem altres estadístics, de la mateixa manera que hem fet amb el primer gràfic, però sel·leccionant Quadrant Statístics en comptes de Gate Statístics.

Així doncs finalment tindrem en la primera pàgina del document 2 gràfics del Control - amb els seus estadístics.


Ara bé quan és molt important saber què volem fer. Només hem representat el Control - , però encara tenim 4 arxius més a representar. Tenim diverses opcions.

Si l'anàlisi que tenim fet és el mateix que volem fer amb els altres arxius no cal que perdem temps fent més pàgines ni gràfics. Farem servir l'eina d'anàlisi en sèrie, Batch Processing.

Si volem representar diferents gràfics o si volem tenir tots els gràfics dels diferents arxius en el document haurem de treballar més....o no.

Començarem pel primer cas.

L'anàlisi en sèrie ens permet analitzar multitud d'arxius de forma ràpida i realitzar tot un seguit d'accions sobre aquestes anàlisis. Les icones relacionades amb l'anàlisi en sèrie són les següents:

L'anàlisi en sèrie treballa amb els arxius que hi ha en el File List. Per això és important omplir la llista amb els arxius que volem i ordenar-los en l'ordre que volem. Recordem els arxius que tenim:


Cliquem sobre la icona i ens presentarà les opcions generals de l'anàlisi en sèrie.

Podem escollir quants canvis d'arxiu volem fer. Podem escollir entre un número concret de canvis o el màxim possible. En aquest segon cas ens dirà quants arxius tenim. També ens deixa escollir quin increment volem fer a cada canvi d'arxiu. Això és important si tenim panells creats, o si en volem crear. En parlarem més endavant d'aquesta opció.Ens dóna la opció de passar les alertes o no. Les alertes ens permeten que aparegui un missatge cada vegada que una mostra compleix un dels requisits que nosaltres li hem indicat. També ho veurem més endavant.També ens permet fer pausa o no després de canviar d'arxiu. Això ens és útil si hem de modificar en alguna gate.Finalment ens demana si volem que torni a posar el primer arxiu en acabar.

Per aquesta primera prova ho deixarem tot tal i com està, i passarem a la segona part.


Cliquem sobre la icona i ens se'ns obrirà una finestra on podem definir tot el que volem que faci durant l'anàlisi en sèrie. Què podem fer?...Moltes coses. Podem afegir diferents accions.

Organitzar aquestes accions en carpetes.

Crear informes

I decidir què hi volem en aquests informes

Finalment tenim l'opció de crear bases de dades online si ens hem registrat.

Així doncs anirem afegint tot el que volguem que el programa faci quan li activem l'anàlisi en sèrie.


Li direm que ho volem imprimir clicant sobre l'icona corresponent. Se'ns obrirà la típica finestra de sel·lecció d'impressió.

Podem escollir entre guardar cada canvi d'arxiu en una presentació diferent o combinar tots els arxius en diapositives diferents de la mateixa presentació. Escollim la 2a opció.Podem crear una presentació nova o afegir diapositives a una presentació ja existent. En farem una de nova. Finalment li donarem un nom a l'arxiu que es crearà i li direm on el volem crear.També marcarem l'última casella, que ens avisarà si ja existeix un arxiu amb el mateix nom.

En el cas d'exportar a PDF o a imatge les opcions són, si fa no fa, les mateixes.

Ho exportarem a Powerpoint. Cliquem sobre . Ens apareix una finestra de diàleg amb les diferents opcions per a aquesta exportació.


Ara li direm que volem crear un informe d'Excel, com el de la imatge.

Ens sortirà una finestra de diàleg on ens demanarà igual que en el powerpoint si volem crear un arxiu nou o si volem afegir les dades a un arxiu ja existent. Començarem per un arxiu nou.

Sel·leccionem la primera opció


Una vegada fet això cal que hi afegim coses a aquest informe, perquè de moment només l'hi hem dit que creï un informe però no li hem dit què hi volem. Per això cliquem sobre l'excel de la finestra de la dreta i se'ns activaran les opcions per afegir coses

Com veieu tot el que podem afegir són Tokens, però com ja hem dit abans no són més que camps. Sel·leccionem "Keyword Token".Ens apareix una finestra on haurem de definir quin Keyword volem.

Volem afegir el nom de l'arxiu a la primera columna. Per això li diem al programa d'on ha de treure el nom "Data Source", en aquest cas del primer gràfic. En la opció "Keyword" sel·leccionarem $FIL i en la opció "Field" escriurem el nom que volem que li doni a la columna: Nom.


Per crear les altres dues columnes de l'informe el que cal és afegir un "Statistic Token", per poder incloure el % de cèl·lules positives en els quadrants que escollim. A "Data Source" sel·leccionem el gràfic de sota. A "Statític" escollim el quadrant que volem, si volem aplicar-hi alguna Gate, quin estadístic volem i quants decimals volem per aquest estadístic. Al camp "Field" igaul que abans escriurem el nom que volem per a la columna on apareguin les dades.

Al final tindrem una cosa així:

Desmarquem la opció Print, bàsicament perquè no tenim impresora...i cliquem sobre l'ok. Es tancarà la finestra.

Finalment, per activar l'anàlisi en sèrie cliquem sobre la icona .

Ja hem analitzat els 5 arxius!!!!


Hem vist com fer l'anàlisi en sèrie. Ara veurem la segona opció que teniem...recordeu?

Si volem representar diferents gràfics o si volem tenir tots els gràfics dels diferents arxius en el document haurem de treballar més....o no.

Si volem omplir tot el document amb els mateixos gràfics i estadístics la cosa es simplifica...imagineu que volem omplir el document amb el mateix que hem fet en l'anàlisi en sèrie, obtenir el mateix que hem obtingut en powerpoint, però en el programa, per després seguir fent anàlisis. Aleshores tenim una opció per anar ràpid. Primer cal que repassem les preferències generals. Anem a "File-Edit Preferences", a la pestanya General i ens fixem en la opció "Duplicate object options". En el primer lloc posem "to the right of", en la 2a "10,20 inches" i marcar la última casella, que ens diu que si un objecte cau fora de la zona d'impressió en els posi a una pàgina nova.

Sel·leccionem tots els elements del document, "Edit-Select All". I després fem "Edit-Duplicate-Multiple duplicate and next".

Ja tenim 1 arxiu / pàgina !!!!


El que farem ara és aprendre a compensar en aquest programa. Primer de tot revisem de nou les preferències per defecte del programa. Penseu que hi ha vàries maneres de treballar, els arxius depenent de si són 2.0 o 3.0 també ens condicionaran a l'hora de treballar, el citòmetre del que provenen les dades també influeix....

Anem al menú File - Edit Preferences. En la pestanya General, en la opció "Default compensation to use" sel·leccionarem la opció "Compensation Default".

En la pestanya Gate, marcarem la primera casella. De manera que quan creem Gates aquestes siguin jeràrquiques.


Hi ha dues maneres de compensar:

ManualAutomàtica

Manual: per compensar de manera manual el que farem serà primer de tot crear un gràfic FSC-SSC o n sel·leccionarem la població d'interès i un segon gràfic on només representarem aquesta població d'interès i on representarem els dos primers paràmetres que volem compensar. En aquest cas E-Blue A vs D-Blue-A. Aprofitarem la plantilla que ja tenim creada. Sel·leccionem tots els elements del document, "Edit-Select All". I després fem "Edit-Duplicate-Duplicate and next". Ens crearà una nova pàgina amb l'arixu següent. Aquest serà el primer arxiu que compensarem, ja que el negatiu no cal que el compensem. Cliquem amb el botó dret del ratolí sobre el segon gràfic de la segona pàgina i sel·leccionem "Compensation"-"Create new".

Ens apareix una finestra on haurem de donar-li un nom a la compensació, i on li direm que faci servir aquesta compensació com a "Default" per als següents gràfics. Com a nom li posarem 4 colors.


Després de donar-li un nom i clicar sobre l'OK ens sortirà la finestra des d'on podrem compensar els 2 paràmetres que tenim.

Com sabrem si hem compensat bé?...Ens hem de fixar en els estadístics. En aquest cas tenim 2 poblacions negatives per el paràmetre D-Blue A, per l'eix de les Y. D'aquestes 2 poblacions una és positiva per al paràmetre E-Blue A i l'altra negativa. Així doncs, cal que aquestes dues poblacions tinguin el mateix valor de "Aritmethic Mean" per a l'eix de les Y.

Abans

Després


Cal fer el mateix per a la resta de paràmetres i arxius. Per compensar el següent paràmetre necessitem el següent arxiu. Així doncs tornem a repetir tot el procés, les vegades que faci falta amb cadascún dels paràmetres a compensar. És important saber a priori quins són els paràmetres que cal compensar entre si. Per això cal que coneguem l'espectre dels fluorocroms que utilitzem, els filtres que tenim en els detectors de l'equip i quin grau de solapament tenim. hi ha diversos recursos en la web que ens informen d'això:

http://probes.invitrogen.com/servlets/spectraviewer?fileid1=7026dnahttp://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/index.jsp

Finalment el que hem d'obtenir és una "Matriu de compensació" emplenada. Per poder veure com queda la nostra afegim un quadre de text al document, cliquem amb el botó dret del ratolí i sel·leccionem "Insert Compensation Matrix". Sel·leccionem la compensació que hem creat, a "Matrix Type" la opció "Compensation", marquem la opció "Use parameter names" i cliquem sobre OK.


http://probes.invitrogen.com/servlets/spectraviewer?fileid1=7026dna

http://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/index.jsp

Ara ja tenim la compensació feta. L'hem fet amb els arxius que teniem de controls. Ara, aquesta compensació l'hem d'aplicar a tots els arxius del nostre experiment.. Si anem afegint gràfics al document ja tindran aplicada la compensació. Però podem fer més coses amb la compensació:

Si anem al menú "Tools" - "Compensation" ja veurem que ens apareixen tres opcions:

Compensation InfoLoad compensation infoSave compensation

L'última ens permet guardar la compensació, aquesta matriu que hem vist abans, en un arxiu. Amb la segona podrem carregar aquesta compensació que hem guardat al document, per poder aplicar-la, si ens és necessari i la primera la veurem ara. Cliquem sobre "Compensation Info".

Veiem que hi ha moltes opcions. També les de Load i Save. Podem editar la compensació que hem creat, crear-de de noves, escollir quina volem com a "Default"...Una opció molt interessant és la de Assign, que ens permet assignar una compensació a tota una sèrie d'arixus, de manera que quan analitzem aquests arxius ja tindran aplicada la compensació que volem.


Molt bé, ara ja sabem compensar, però...com ho podríem simplificar?...Doncs fent servir la opció de compensació automàtica que té el programa. Necessitem els arxius dels controls, crear una sèrie de gràfics i gates i després seguir un assistent (Wizard), que ens guiarà a través de les passes que hem de fer.

Creem una nova plantilla amb els mateixos arxius que abans creant els següents gràfics:

FSC vs SSC: amb el control Neg. Aquí dibuixarem la Gate 1 sobre la població d'interès.Gràfics 1D - histogrames: per cadascún dels controls + de cada fluorocrom. En aquests gràfics només visualitzarem la Gate 1. Si només tenim 1 població no hem de fer res més. Si tenim 2 poblacions, una positiva i una negativa cal que indiquem amb una Gate on es troba la població positiva. Si dibuixem un Marker l'haurem de convertir a Gate. Botó dret del ratolí "Convert Marker to Gate".

Ens ha de quedar una cosa així:

Aleshores ja podem obrir l'assistent. Anem al menú "Tools - Compensation - Compensation Info". En la finestra que ens surt hem de sel·leccionar "Add".


En la nova finestra marquem "Automatic-Automatic compensation Wizard".

Finalment anem seguint les indicacions de l'assistent, que ens anirà demanant que indiquem en quin gràfic tenim la població negativa, la positiva etc... Quan acabi l'assistent li haurem de donar un nom a la compensació que hem creat i dir-li que l'apliqui per defecte als nous gràfics...

I Ja està compensat!!!


Ara ja hem vist les opcions bàsiques del programa. Ara veurem les opcions avançades. Algunes les veurem molt per sobre i altres més en detall.

Començarem pel Cicle Cel·lular: com tots sabeu el cicle cel·lular és una de les anàlisi que més es fa servir. Malauradament molta gent no disposa de les eines necessàries per fer una bona anàlisi i molta gent que disposa de les eines no les fa servir.

Així doncs, com sabeu el cicle cel·lular s'acostuma a analitzar per mitjà de sondes fluorescents que s'intercalen entre les bases del DNA de forma estequiomètrica. Així podem distingir entre les fases G0-G1, S i G2/M segons els seu contingut de DNA. Però aquestes sondes no són perfectes i els citòmetres tampoc de manera que se'ns fa difícil acotar les diferents fases de forma correcta. L'aproximació que molta gent fa és representar en un gràfic d'1D, en un histograma, la quantitat de DNA i mitjançant Markers delimitar les 3 fases. En aquest histograma hem representat només la població d'interès i hem descartat els doblets, això és, 2 cèl·lules en fase G1 que passen juntes per davant del LASER i que donen com a quantitat de senyal la mateixa que una cèl·lula en fase G2.


Amb aquest tipus d'anàlisi estem subestimant i sobrestimant les diferents fases. El qua cal és fer una anàlisi de descomposició del perfil obtingut, de manera que poguem aproximar-nos millor a la realitat. I això ho podem fer afegint un histograma de DNA, en comptes d'un histograma normal. els dos primers gràfics els necessitem igualment. Després cliquem sobre la icona d'histograma de DNA , i sobre el lloc del document on volem crear el gràfic. Ens apareix una finestra on se'ns demana quin paràmetre volem analitzar, quina paràmetre conté la informació de contingut de DNA. En aquest cas sel·leccionem C Blue-A.

Finalment li diem al gràfic que només volem veure la població que ens interessa. Ja tenim creat i analitzat el gràfic de DNA. Ara el que ens cal és treure els estadístics de l'anàlisi de DNA, escollir les opcions que volem...El programa el que fa és ajustar el perfil del gràfic a 6 models diferents, basats en en una sèrie d'algoritmes creats a partir de dades reals. Nosaltres hem de decidir quin és el que ens interessa. El programa ens diu, estadísticament quin és el model que més s'ajusta, però cal que nosaltres decidim si, des d'un punt de vista experimental això és possible.


Per veure les diferents opcions cliquem amb el botó dret del ratolí sobre el gràfic de DNA.

Cliquem sobre "Statistics" i sel·leccionem totes les opcions excepte la primera.

La primera ens dóna els estadístics del cicle cel·lular de la nostra mostra. Ens diu si tenim més d'una població, el percentatge de les diferents fases, la relació entre G2/G1 entre d'altres. La segona ens resumeix els 6 models. Ens diu el % de G2 i %S i ens dona la Chi quadrada com a mesura de com s'ajusta la nostra mostra al model. Ens interessa el model amb la Chi quadrada més baixa....sempre que s'ajusti des d'un punt de vista biològic a la nostra mostra. Cal pensar que cada model està basat en diferents tipus de mostra. Per exemple, el model 2 està pensat per mostres que provenen de teixits parafinats, que han estat tallats i, per tant, presenten nuclis incomplerts. Generalment, el model que ens interessa més a nosaltres és el Model 4, pensat per mostres amb un cicle o més, però de creixement més o menys normal i que presenta un cert grau d'agregats a la mostra. Però....


La tercera opció ens dóna més informació sobre el nostre experiment.

Aquí tenim una interpretació suggerida pel programa i dades estadístiques de l'experiment. Però....Com sabem quin model estem representant i n'estem obtenint estadístics?.. Si sel·leccionem el gràfic podem veure en una de les barres d'eines del programa quin model estem fent servir i si estem analitzant de forma automàtica o no.

Per canviar el model que estem fent servir només cal que cliquem sobre el model que volem en aquesta barra d'eines. Si l'anàlisi que n'obtenim no ens convenç, per exemple, ens diu que tenim 2 cicle ens la nostra mostra, amb diferent contignut de DNA, però nosaltres sabem, per altres dades, que això no és així, o al revés, podem forçar l'anàlisi de forma manual. Per això cliquem sobre la "M" de la barra d'eines i podrem escollir les opcions que desitgem per a l'anàlisi.


Ara veurem moltes altres opcions, que ens ajudaran a millorar la presentació de les nostres dades, a obtenir més informació, a treure suc del programa.

Gates-RegionsFuncionament de la "Gates"

Les gates ens permeten seleccionar en un gràfic una població d'interès i després en un altre gràfic només analitzar aquesta població.La creació de les Gates pot ser de dues maneres:

Jeràrquica: implica que si en un gràfic estem veient la Gate 1 i creem una nova gate en aquest gràfic, la nova Gate serà un subconjunt de la Gate1No jeràrquica: implica que si en un gràfic estem veient la Gate 1 i creem una nova gate en aquest gràfic, la nova Gate no serà un subconjunt de la Gate1. Seria l'equivalent a treballar amb regions en comptes de Gates.

Treballar d'una manera o d'una altra ho podem escollir en el menú.“File”-”Edit Preferences”-”Gate”.


Gates-RegionsFuncionament de la "Regions"

Les regions són semblants a les gates. La diferència entre les regions i les gates està en la posibilitat d'aplicar-les a altres gràfics. En els softwares antics es dibuixaven regions i es creaven gates. Ara s'ha equiparat bastant. Les regions sempre ens donen informació sobre la població que estem veient en el gràfic, encara que canviem la finestra aplicada o els paràmetres, mentre que les gates estan lligades als paràmetres i finestres on han estat creades.

En aquest software, de tota manera, existeixen dos tipus de regions que no són Gates directament, tot i que les podem convertir.

Quadrants: per als gràfics 2D Markers: per als histogrames


Page SorterEns dóna una visió de totes les pàgines que tenim, en miniatura. Si fem doble click sobre alguna de les pàgines se'ns obrirà aquesta pàgina.

Format

Tenim moltes opcions per fer els gràfics al nostre gust. Aquestes opcions les podem definir per defecte, o les podem definir per a cada gràfic en particular. En repassarem algunes. Si cliquem amb el botó dret del ratolí sobre un gràfic i cliquem sobre "Format" ens apareix una finestra on podem definir tota una sèrie d'opcions. Aquestes també es poden modificar des de la barra d'eines, però no tenim una opció que ens serà molt útil, sobretot ara, que és la de "Preview", que ens permetrà anar veient els canvis que fem.


En la pestanya "General", com el seu nom indica podrem modificar certes opcions de bàsiques del gràfic.

Li podem posar un nom al gràfic (no un títol!!!) cosa que ens pot resultar útil durant l'anàlisi en sèrie. Podem intercanviar entre els diferents tipus de gràfics, en el cas dels gràfics 2DDefinir qunates cèl·lules volem que ens representi en el gràfic i "quines".Definir la resolució del gràfic. Podem definir un màxim i un mínim per a cada eix del gràfic. Finalment també ens permet decidir si fer servir una cal·libració en els eixos o no i com volem que actuï el software en el cas de la coincidència de 2 events diferents en el mateix punt


En la pestanya "Overlay", podem escollir diferents opcions per a cadascun dels arxius que tinguem representats en el gràfic. Aquest programa ens permet representar, tant en gràfics 2D com en gràfics 1D, més d'un arxiu. Així doncs podem representar el Control - i les mostres en un mateix gràfic i definir per a cadascun d'aquests "overlays" diferents opcions.

Diferent compensació per als diferents overalys Diferent colorDiferent mida de puntEns permet definir la llegenda si n'hem posat una.Si volem que canviï l'arxiu durant l'anàlisi en sèrie.Si volem que un determinat overlay es vegi o no.


En la pestanya "Axis", (ja hem dit que no explicaríem totes les opcions), ens permet configurar els eixos.

"Derive Axis Titles From" ens permet decidir si volem que el títol del gràfic ens vingui definit pel nom de l'arxiu que estem fent servir o si volem definir un títol nosaltres.A la part de sota podem definir per a cadascun dels eixos

l'escalael títol, en el cas que ho haguem decidit així abansel rang de valors que volem veure. Ens serveix de funció Zoom.el tipus de lletra i la midaSi volem veure etiquetes o no i si volem que aquestes apareguin inclinades o no.Si volem que aparegui una graella per fer-nos de guia.

Les diferents opcions de l'escala ens permetran representar les dades de la manera que més útil ens sigui. Les opcions són:

LinialLogLin/logHyperlogLog with negativeBiexponential

Escollir-ne una o altra depèn de nosaltres.


En la pestanya "Title", podem definir com, on i de quina manera volem el títol del gràfic. O si no en volem cap.

Podem decidir si volem que aparegui a dalt "Header" o a baix "Footer"Si volem que aparegui o no, "Visible"Podem definir el títol en el recuadre blanc, bé escrivint el que volguem, bé fent servir Keywords. Us recomanem l'ús de Keywords. En particular "File Name without path" i "Current Gate". Això ens posarà el nom de l'arxiu i la població que està representada en el gràfic.Podem definir un fons per al títol o noDefinir-ne la posició.


En la pestanya "3D", ens permet veure el gràfic en 3D i definir-ne les propietats.


Parameter MathEns permet crear nous paràmetres a partir dels existents mitjançant operacions matemàtiques.

Parameter LabelsÉs una eina per afegir etiquetes als paràmetres. Generalment els equips on hem obtingut les dades ja afegeixen etiquetes i apareixen en els arxius, però en podem crear de pròpies.

Concentration CalculatorInteressant eina de càlcul de concentració de les nostres poblacions. Aquest càlcul ens el permet fer a partir d'una població de referència, de concentració coneguda, per exemple si hem afegit boles de calibració que venen comercialment per a aquesta fi, o bé a partir del temps trigat en adquirir la mostra i la velocitat del flux. Aquest últim valor l'hem de saber nosaltres.


Histogram subtractionEns permet restar a una mostra la senyal del control. D'aquesta manera podem saber la positivitat real que tenim.

Chanel CalibrationA vegades el que ens cal és saber la quantitat de molècules que tenim d'un determinat marcatge. Per això venen, o podem fer, una sèrie de estàndards que ens determinin una recta patró. Aquesta eina ens permet calcular aquesta recta i donar-nos el valor per a la nostra mostra.


Batch ExportAquesta és una eina molt útil i molt potent. Ens permet treballar amb els arixus per fer-nos més fàcil les anàlisis. Ens permet, a partir d'un o diversos arxius FCS, exportar només els events inclosos en una sola gate, fusionar arxius, eliminar paràmetres, eliminar punts...Ens pot ser molt útil per analitzar mostres que tinguin molts events i dels quals només ens interessi anallitzar una petita subpoblació, ja que així farem que els arxius siguin molt més lleugers i el programa treballi més ràpid.En el cas de tenir diferents arxius d'una mateixa mostra, ens permet fusionar-los.


Mostra 4:Control -4Tractament ATractament BTractament CTractament DTractament E

PanelsEls panells en ajuden a treballar amb sèries repetitives de mostres. Hem vist abans com podem fer "Duplicate and Next" de manera dupliquem un determinat gràfic canviant l'arxiu representat pel següent de la llista. Moltes vegades no ens interessa el següent de la llista, sinó un determinat arxiu que respon a les mateixes característiques que el primer. Per exemple, imaginem que tenim un experiment on a cadscuna de les mostres els fem 5 tractaments. Tenim 4 mostres. Aleshores tindríem el següent:

Mostra 1:

Control -1Tractament ATractament BTractament CTractament DTractament E



Si afegim tots els arxius al "Filelist", creem un gràfic per a cada arxiu de la mostra 1 i després volem fer una anàlisi en sèrie, quan el programa faci "Next" en els gràfics ens trobarem que en el gràfic on tenim representat el Control -1 ens representarà el Tractament A, que ja teníem representat. Nosaltres volem que ens representi el Control-2....aleshores cal que creem un panell!!!


PanelsAnem al menú "Tools-Panels" i ens apareixerà una finestra com la següent:Sel·leccionem la opció Add per poder dir-li la composició del panell.

Li posem un nom al panell, li diem quants tubs té i anomenem aquests tubs. Quan estigui fet cliquem sobre OK. Tornarem a la finestra d'abans. Ara veurem que hem creat un panell i ens indica si està actiu o no. Cliquem de nou sobre OK.Una vegada en el Document podem observar a la part inferior esquerra si tenim algun panell activat o no. I en el Filelist veurem com apareix una nova columna amb el nom dels tubs del panell.


Publish Layout

En el menú File trobem una opció que es diu "Publish Layout". I això què és?...Doncs ens ofereix la possibilitat de publicar el nostre document online, bé als servidors del programa o bé als nostres propis servidors, depenent de la versió que tinguem comprada.

Se'ns obrirà un assistent i només cal que anem seguint les indicacions per publicar el document. Evidentment necessitem haver-nos registrat per poder publicar en el servidor del programa i per tant se'ns demanarà el nom d'usuari i paraula clau per poder publicar.

En finalitzar el procés de publicació obtindrem el "link" per poder accedir-hi. L'assistent ens oferirà la possibilitat de copiar aquest link al portaretalls per enganxar-lo i guardar-lo on volguem o directament enviar el link amb qui nosaltres volguem compartir el document....però.....


....Si volem compartir el document, el Layout, amb algú que no té el programa....?...CAP PROBLEMA. Si hem enviat el link a través de l'assistent, s'inclouen les instruccions per poder obrir el document. Aquestes impliquen la descàrrega d'una miniaplicació anomenada "FCS Express Reader". Podríem comparar-ho a l'Adobe Creator i a l'Adobe Reader. Per crear PDF's cal un programa complert, però per poder visualitzar-los n'hi ha prou amb el Reader, que és gratuït. Així doncs, amb el "FCS Express Reader" qualsevol amb qui haguem compartit el document podrà visualitzar-lo. Però no només això, perquè per fer això en tenim prou en passar el document a PDF i enviar-lo. Un dels avantatges del "FCS Express Reader" és que la persona amb qui haurem compartir el document podrà reanalitzar les mostres, podrà moure les gates, dibuixar diferents gràfics, incloure notes...i fer tota una sèrie de canvis al document. Aquests canvis són configurables segons la versió que tinguem del programa.

Aquesta opció ens és molt útil si volem que algú ens revisi les anàlisis que hem fet, per exemple.


Export to DDS (DeNovo Data Services)

Quan varem veure l'anàlisi en sèrie ens vam saltar una opció que posava "Export to DDS". Ara ho explicarem. L'FCS Express ens dóna la opció d'exportar les dades que volguem a un servidor que ens servirà de Base de Dades i que ens permetrà treballar amb les dades. És una mica complex d'explicar però anirem pas a pas.

La utilitat real d'aquesta eina va molt més enllà d'una simple anàlisi de dades d'un experiment. Imagineu que teniu un projecte en el qual heu obtingut dades de 200 mostres. D'aquestes mostres teniu dades molt diverses i a lo millor us interessa analitzar només una part concreta d'aquestes mostes. Posem per cas que només us interessa analitzar les mostes que preesnten un % de cèl·lules positives per a un paràmetre concret més gran que un determinat valor que heu vist que és indicador d'alguna patologia.

Determinar quines mostres compleixen aquest requisit pot resultar una feina molt pesada i complicada. El DDS ens serà de gran utilitat. Per començar cal que estem registrats, igual que en el cas del Publish Layout. Aleshores cal que anem a:

https://www.denovosoftware.com/cgi-bin/dds.dll/EXEC

Accedirem amb el nostre nom d'usuari i paraula clau.


https://www.denovosoftware.com/cgi-bin/dds.dll/EXEC


Ens trobarem una pàgina com aquesta. Aleshores cal definir què volem guardar i com ho organitzarem. Afegirem un nou Experiment. Cliquem sobre "Add" i li donem un nom i una descripció a l'experiment.

Una vegada fet això ens apareixerà l'opció d'afegir columnes. Cliquem sobre "Add" i podrem donar-li un nom a la columna i definir quin tipus de dada hi afegirem.



Com veieu, les opcions del què podem afegir són molt diverses. Cal definir bé què volem, perquè després omplirem les columnes amb les dades de les mostes a través de l'anàlisi en sèrie.

Per exemple definim 3 columnes. 1 amb el nom de l'arxiu i les altres dues amb el % de cèl·lules en un determinat quadrant.

Una vegada fet això, cliquem sobre "Close" i tornarà a la finestra anterior. Ara cal que omplim aquestes columnes amb les dades que volem. Per això cal fer una anàlisi en sèrie especificant que volem exportar a DDS les dades que hem decidit. Anem al document a partir del qual obtindrem les dades i obrim les opcions de l'anàlisi en sèrie.



En les opcions d'anàlisi en sèrie cliquem sobre Export to DDS i se'ns obrirà una finestra de dialeg demanant que ens identifiquem i que diguem a quin experiment volem afegir les dades. Ho omplim.

Quan ja haguem decidit a quin experiment volem carregar les mostres definirem què volem carregar "Add item to Report". Cal que afegim exactament el què hem definit abans en el servidor. Així doncs hem d'afegir "Keyword Token". Com sempre ens apareix una finestra on ens demana d'on volem llegir les dades. Sel·leccionem el gràfic que volem. A la pestanya "Column" hem de posar exactament el nom de la columna que hem dit al servidor "Arxiu". Finalment a la pestanya "Keyword" sel·leccionarem el keyword on especifica el nom de l'arxiu "$FIL".

Farem el mateix per les columnes dels estadístics.



Ara ja ho tenim configurat. La configuració és igual que quan exportem dades a un excel, però amb la particularitat que el nom de les columnes ja està definit i que no podem equivocar-nos en el nom perquè aleshores, no funciona.

Ara només cal que activem l'anàlisi en sèrie i quan acabi anirem a veure què passa en el servidor.

Ara ens indica el servidor que el nostre experiment té 5 files. Això significa que hem omplerts les columnes les dades de les nostres mostres. Anem doncs al servidor a veure què podem fer.



Tenim les dades al servidor però...què podem fer? Fixem-nos en les opcions que tenim.

Podem afegir un altre experiment, però això ara no ens interessa. Podem veure els detalls de l'experiment, però ja els sabem. Ens interessen les dues opcions següents: "Queries" i "Attachments".Amb la segona podem afegir arxius al nostre experiment. Per exemple algun article que estigui relacionat amb el que volem estudiar.Amb la opció de "Queries" el que fem és definir filtres o crear consultes de manera que poguem classificar les nostres dades de diferents maneres. En veurem un exemple. Sel·leccionem "Queries" i ens apreix una nova finestra. Per defecte ja s'ha creat una consulta que engloba totes les dades "All Results".

Clicarem sobre per veure quin aspecte té la consulta.



A cada fila tenim la opció de descarregar les dades en format excel. Però el que farem ara serà crear una nova consulta. Tornem a la pantalla anterior clicant sobre "Close". Cliquem sobre "Add" per afegir un nou "Querie". Ens apareix una finestra on ens demana un nom per aquesta consulta, "20%".

Ens apareix la opció "Conditions" on podrem definir quines condicions ha de complir aquesta consulta. Cliquem sobre "Add" i definim les condicions que volem per la nostra consulta i cliquem sobre "OK".



Una vegada hem creat la consulta ens sortirà reflectit en la pantalla.

Obrim la consulta que hem creat i veiem quin resultat apareix.

Com veiem, només hi ha 1 arxiu que compleix els requeriments que hem demanat.

Podem fer les consultes tant complexes com volguem, combinar-les entre si....Bàsicament això és el que fa el DDS. Treure'n el màxim profit depèn de nosaltres. Pot ser una eina molt potent i molt útil, però cal tenir ben clar el nostre experiment, quines dades volem guardar, com volem fer les consultes.


Altres coses

Finalment hi ha unes quantes coses que us poden ajudar. En el menú "Help" tenim tota una sèrie d'opcions.

Tenim una ajuda on podem buscar allò que no ens surti o que no sabem com fer. Tenim una sèrie de tutorials guiats per aprendre a fer algunes de les funcions.Hi ha un manual complert del programa en PDF i tenim un també un Foro Online on podem preguntar dubtes i intentar resoldre problemes amb altres usuaris i amb els responsables del programa.

I ja per acabar dir-vos que a la web del programa: http://www.denovosoftware.com teniu una sèrie d'eines que us poden ser molt útils. A part del Foro i del DDS teniu:

Un llibre "Flow Cytometry - A basic introduction" del Dr. Michael G. Ormerod, on es fa un recull de tots els aspectes bàsics de la citometria, amb exemples que ens podem descarregar i visualitzar amb el FCS Express o el FCS Express Reader, ja que són Layouts publicats. http://flowbook.denovosoftware.com/ Una pàgina on s'expliquen casos clínics, també amb exemples com a l'anterior. http://wiki.clinicalflow.com/

Les dues pàgines anteriors tenen una versió Wiki en la que podrem col·laborar en el cas que poguem.


http://flowbook.denovosoftware.com/

http://wiki.clinicalflow.com/

http://wiki.clinicalflow.com/

Documents

Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010 · Curs Teòric-Pràctic Bàsic de Citometria de Flux 2010 La citometria de flux és una eina indispensable en qualsevol investigació