Cursul 4: Anticorpul€¦ · Definitie •Anticorpul: este o proteina care este produsa ca raspuns la stimularea produsa de antigen si care reactioneaza specific cu acel antigen

Cursul 4: Anticorpul

• Definitie• Anticorpi sau Imunoglobuline• Structura• Izotipuri• Idiotipuri• Alotipuri• Papaina• Pepsina• Productia de anticorpi• Functiile anticorpilor• Aplicatii clinice

1Curs 4 - Imunologie- Prof. Ileana Constantinescu

Definitie

• Anticorpul: este o proteina care este produsa ca raspuns la stimularea produsa de antigen si care reactioneaza specific cu acel antigen.

• Anticorpii sunt imunoglobuline.

• Anticorpii sunt sintetizati de limfocitele B si celulele plasmatice.

Curs 4 - Imunologie- Prof. Ileana Constantinescu 2







Izotipuri

• Sunt doua izotipuri ale lanturilor usoare L (K sauλ) bazate pe diferente structurale.

• Tot pe diferente structurale se formeaza si cele 5izotipuri ale lanturilor H grele (µ,γ,ε,α,δ).

• Cele 5 izotipuri sau clase de imunoglobuline sunt:- IgA, IgD, IgE, IgG si IgM.

• IgA si IgG se impart in 2 mai multe subclasebazate pe diferente structuri ale regiunilor C alelanturilor grele.


Izotipuri• IgA – este abundent in secretii de pe suprafata mucoaselor. Are 2 subclase IgA1 si IgA2 care

contin diferente la nivelul regiunilor C ale lanturilor grele.

• IgD – este o molecula legata de membrana de pe suprafata celulelor B naive. IgD impreuna cuIgM actioneaza ca receptor pentru recunoasterea antigenului.

• IgE – este o clasa de anticorpi legata de membrana celulelor “mast” bazofile, eozinofile decare este legata printr-un receptor al fractiunii Fc. La contactul cu antigenul se producedegranularea si eliberarea mediatorilor inflamatiei. Acest proces are un rol in initiereainflamatiei acute si in reactiile alergice .

• IgG – este cea mai abundenta clasa de anticorpi din sange si tesutul din afara mucoaselor. Arerol in sistemul imun matur, adaptat si este singura clasa de anticorpi care traverseazaplacenta si patrunde in circulatia fetala. Se imparte in 4 subclase IgG1, IgG2, lgG3 si IgG4.

• IgM – este primul tip de anticorpi produsi intr-un raspuns imun; este initial prezent in sangeca pentamer a 4 molecule identice fiecare avand lanturile grele compuse din 5 domenii. IgMse afla ca molecula unica pe suprafata celulelor B naive unde actioneaza ca un receptor deantigen (receptorul celulei B; BCR)


Structura izotipului Ig


Regiunea hipervariabila

• Atat lanturile grele H cat si lanturile usoare L au o regiune variabila care

are anumite regiuni in care secventa aminioacizilor este extrem de

variabila.

Aceste arii hipervariabile din regiunile variabile sunt denumite regiuni

determinante complementare (CDRs) deoarece sunt importante in

determinarea structurii locusului de legare al antigenului (paratop).



Locusul de legare al antigenului este format din regiunile hipervariabileA - regiunile hipervariabile ale IgGB – imaginea marita a locusului de legare a antigenului

ALOTIPURI• Formele diferite ale unei gene pentru un locus particular care determina

compozitia aminoacizilor lanturilor H si L ale IgG pentru fiecare individ se

numesc alotipuri.

• Exista anticorpi specifici de alotipuri care pot detecta diferentele de la

nivelul lanturilor grele si usoare intre indivizi.

• Markerii alotipici au fost utilizati pentru a rezolva cazurile

medicolegale de paternitate si depistarea originii unor pete de sange.

• Utilizarea lor este extrem de valoroasa in verificarea grefarii celulelor

B dupa transplantul medular.


IDIOTIPURI

• Idiotipurile sunt determinanti antigenici unici

(epitopi) prezenti la nivelul sau in apropierea locului

de legare a antigenului de pe lanturile H si L.

• Anticorpii anti idiotip pot fi utilizati pentru a induce

productia de anticorpi de origine intr-un receptor

neimunizat.


Recapitulare

ISOTIPURI, ALOTIPURI & IDIOTIPURI


Izotipurile sunt definite ca diferentele antigenice de la

nivelul regiunilor constante.

Alotipurile sunt caracteristici antigenice ale

imunoglobulinelor care variaza de la individ la individ.

Idiotipurile sunt determinatii antigenici formati de catre

secventele specifice ale aminoacizilor de la nivelul

regiunilor hipervariabile.

PAPAINA

• Papaina este o enzima proteolitica care imparte moleculele IgG in 3

fragmente proximal de regiunea balama.

PEPSINA• Pepsina este o enzima proteolitica care cliveaza moleculele IgG la capatul

carboxi terminal al regiunii balama in apropierea domeniului Cγ2 .


Locurile de actiune proteolitica ale papainei si pepsinei la nivelul moleculei Ig




Diversitatea combinarilor este metoda prin care se produce diversitatea anticorpilor

EXCLUDEREA ALELICA

• Fiecare celula B este capabila sa produca anticorpi de o anumitaspecificitate.

• Fiecare celula B poate produce un lant greu si un lant usor asigurandspecificitatea unica.

• Acest fapt este dat de rearanjamentul genelor in procesul denumitexcluderea alelica.


PRODUCTIA DE ANTICORPI


Productia de anticorpi are 4 faze distincte: faza de lag, faza de log, faza de

platou si faza de declin.


Eliberarea directa de IL-4


Productia de anticorpi monoclonali


FUNCTIILE EFECTORII ALE ANTICORPILOR

Odata ce anticorpul s-a legat la antigenul specific, in conditii de imunocompetenta poate

performa un numar de functii care contribuie la indeparta sau inactivarea antigenului

• Neutralizarea:anticorpii care se leaga de antigenele specifice, virale sau

bacteriene, previn posibilitatea infectarii celulelor gazdei

• Activarea complementului: componentul C1q se leaga de

portiunea Fc a IgG sau IgM cand este legat de antigen. In aceasta situatie el devine

activat initiind cascada clasica a complementului. Acest fapt are cateva efecte cum sunt:

raspunsul inflamator, chemotaxis pentru fagocite, ceea ce duce la liza micro-

organismelor prin formarea complexului de atac al membranei.

• Opsonizarea: anticorpii actioneaza ca opsonine, adica, sunt capabili de a

creste abilitatea fagocitelor de a ingera si distruge patogenii.

• Citotoxicitatea mediata celular: aceasta proprietate

implica folosirea anticorpilor in distrugerea celulelor infectate sau patogenilor prea mari

pentru fagocitoza. Acest lucru are loc cand receptorii Fc ai celulelor NK sau

macrofagelor sunt activati de anticorpii cuplati cu antigenele specifice.26Curs 4 - Imunologie- Prof. Ileana Constantinescu

Imunoglobulina Functii majore

IgG Anticorpul principal in raspunsul imun secundar. Opsonizeaza bacterii facandu-le mai usor de fagocitat. Fixeaza complementul care sporeste rata de distrugerebacteriana. Neutralizeaza toxinele bacteriene si virusurile. Traverseaza placenta.

IgA IgA secretor previne atasarea bacteriilor si virusurilor la membranele mucoase. Nu fixeaza complementul.

IgM Este produs in raspunsul imun primar fata de antigen. Fixeaza complementul. Nu strabate placenta. Receptor antigenic pe suprafata celulelor B.

IgD Se gaseste pe suprafata multor celule B dar si in ser. Rolincert.

IgG Mediaza hipersensibilitatea imediata prin eliberarea de mediatori din mastocite si bazofile in momentul expuneriila antigen (alergen). Apara organismul fata de infectiileparazitare eliberand enzimele din eozinofile. Nu fixeazacomplementul.

Curs 4 - Imunologie - Prof. Ileana Constantinescu 27

Aplicatii clinice

• Anticorpi anti ADN• Anticorpi anti receptori de acetilcolina• Anticorpi anti mitocondriali• Anticorpi anti membrana bazala glomerulara• Anticorpi anti neutrofile• Anticorpi anti nucleari• Anticorpi anti tiroglobulina• Anticorpi anti idiotipici• Anticorpi fixatori de complement• Anticorpi completi• Anticorpi incompleti• Anticorpi reactivi la rece• Anticorpi reactivi la cald• Anticorpi monoclonali OKT3• PRA – anticorpi anti-HLA• Anticorpi policlonali• Anticorpi anti-VHC• Anticorpi anti-HBs

• Toti acesti anticorpi au diferite semnificatii clinice in practica medicala- imunopatologie


Aplicatii Clinice• Anticorpii antinucleari (ANA), anticorpi directionati impotriva antigenelor

nucleare; ANA impotriva unei varietati de diferite antigene sunt aproape invariabilgasite in lupusul eritematos sistemic si frecvent gasite in artrita reumatoida,sclerodermia (scleroza sistemica), sindromul Sjogren si boala mixta de tesutconjunctiv. ANA pot fi detectati prin colorare imunofluorescenta. Testele serologicesunt de asemenea folosite pentru determinarea titrurilor de anticorpi impotrivaantigenelor specifice.

• Anticorpi anti-Ro , anticorpi anti-SS-A.• Ac. anti-SS-A, un anticorp antinuclear care apare in sindromul Sjogren și lupusul

eritematos sistemic. De asemenea se mai numeste Ac. anti-Ro.• Ac.anti-SS-B, un anticorp antinuclear care apare in sindromul Sjogren și lupusul

eritematos sistemic. De asemenea se mai numeste Ac. anti-La .• Anticorpii antithyroglobulina sunt anticorpi impotriva tireoglobulinei, prezenti in

proportie de 50-70% la pacientii cu tiroidita Hashimoto si la aproximativ o treimedin pacientii cu alte tipuri de tiroidita (Boala Graves si carcionom tiroidian)

• Ac. Anti-tiroidieni, a se vedea Ac. Anti-microsomali si Ac. Anti-tireoglobulina.

• Ac. Anti-idiotipici, Ac. anti-idiotip autologi care deprima raspunsul imun in multesituatii experimentale; auto-Ac. anti-idiotip apar in anumite boli autoimune

• Ac. autologi, Auto-Ac. derivati;


Aplicatii Clinice

• Ac. bispecific, un ac. in care fiecare din cele doua situsuri de legare a antigenului este specific pentru determinanti antigeniciseparati. Este un ac. artificial produs in laborator, format prin reasocierea a jumatate din moleculele a doi anticorpi despecificitate diferita pentru a forma un hibrid sau ac. bispecifici cu situsuri de legare distincte. Mai este numit si Ac. hibrid.

• Ac. de blocare, oricare ac. care, prin cu blocuri antigenice ale altei reactii imunologice cu un antigen. La majoritateapacientilor, imunoterapia (hiposensibilizarea sau desensibilizarea) pentru afectiuni alergice induce IgG de blocare a ac. carepot lega alergenul si previn fixarea celulara a IgE, declansand hipersensibilitate imediata; poate induce astfel tolerantaimunologica partiala.Ac. blocanti indreptati impotriva antigenelor specifice tumorale au sugerat un mecanism care permitetumorii sa scape supravegherii sistemului imunitar. Ac. de blocare pot preveni aglutinarea in teste serologice.

• Ac.legati celular, orice anticorp legat la o suprafata celulara fie prin situsurile de combinare de la suprafata celuleideterminante antigenice sau de alte situsuri le receptori specifici de suprafata celulara (receptori Fc, receptori IgE ).

• Ac. reactivi la rece, anticorp de obicei IgM, dar ocazional IgG, care reactioneaza mai eficient cu antigen la 37°C decat latemperaturi mai scazute.

• Ac. de fixare a complementului, ac. care activeaza complementul atunci cand reactioneaza cu antigenul; IgM si IgG (deobicei ac. de fixare a complementului) fixeaza complementul pe calea clasica, in timp ce IgA fixeaza complementul pe caleaalternativa.

• Ac.complet, orice ac. capabil de aglutinare in solutie salina fiziologic. Numit, de asemenea aglutinina salina. Comparativ cuAc.incomplet de reactie incrucisata, unul care se combina cu un antigen, altul decat cel care a indus productia sa.

• Ac. citofilic, Ac. Citotropic.


Aplicatii Clinice

• Ac. citotoxic, orice ac. specific directionat impotriva antigenilor celulari, care atunci cand este legatla antigen, activeaza calea complementului sau activeaza celulele killer, ducand la liza celulara.

• Ac. citotropici, ac. care se leaga la celulele mastocitare si bazofile de receptorii specifici; suntintotdeauna din clasa IgE. In unele cazuri IgG, IgA, IgM de la o specie (ac. heterocitotropic) poatesensibiliza tesuturi ale unei alte specii; de exemplu, iepurele IgG poate sensibiliza pielea de porcpentru anafilaxie cutanata pasiva.

• Ac. heteroclitic, ac. produs ca raspuns la imunizare cu un antigen, dar avand o afinitate mai marepentru un al doi-lea antigen care nu a fost prezent in timpul imunizarii.

• Ac. heterofili, ac. indreptat impotriva antigenilor heterofili. Aglutininele eritrocitare heterofile aleoilor apar in serul pacientilor cu mononucleoza infectioasa (vezi testul Paul-Bunnell). Numite deasemenea Ac.heterogenic.

• Ac. hibrid, Ac. bispecific

• Ac. imun, ac. indus prin imunizare sau incompatibilitate de transfuzie, spre deosebire de ac.naturali.

• Ac. incomplet, 1. Ac. care se leaga de eritrocite sau bacterii, dar nu produce aglutinare; Ac.neaglutinant este detectat testul antiglobulinei (Coombs). De exemplu, ac. IgG anti-RH faceritrocitele sa nu aglutineze in ser, in timp ce ac. IgM fac acest lucru. 2. un fragment de ac.monovalent, de exemplu, fragment Fab.


Aplicatii Clinice

• Ac. isofil, ac. impotriva antigenilor celulelor rosii din sange produsi de specii ale celulelor de originea celulelor rosii.

• Ac. mitocondrial, Ac.antimitocondrial.

• Ac.monoclonal, ac.omogeni chimici si imunologici produsi de hibridoame, utilizati ca reactivi in radioimunitate, ELISA si teste de imunofluorescenta; de asemenea, utilizat in imunoterapiacancerului.

• Ac. natural, Anticorpii prezenți în serul indivizilor normali în absența aparentă a oricărui contact cu antigenul specific, probabil indusă prin expunere la antigeni cu reactivitate încrucișată. Acesta poate rezulta din expunerea necunoscut natural antigeni, de exemplu, produse alimentare sau flora bacteriană.

• Ac. de neutralizare, - neutralizare virala, sub neutralizare.

• Ac. monoclonal OKT3, un anticorp monoclonal de șoarece îndreptat împotriva limfocitelor T3 și folosite pentru a preveni sau trata respingerea după transplantul de organ.

• Ac.panel-reactive(PRA), 1. anticorpul preexistent anti-HLA în serul unui potențial beneficiar de alogrefă care reacționează cu antigenul specific într-un panou de leucocite (vezi căutarea anticorpilor, sub screening). Un procent mai mare de PRA indică un risc mai mare de a aveacrossmatch pozitiv.

2. procentul de astfel de anticorpi în serul primitorului.• Ac.policlonal, ac. produs de mai mult de o clona de ac. ce sintetizeaza celule plasmatice (limfocite

B); ac. care nu este monoclonal, de exemplu, cea produsa prin imunizarea unui animal.


Aplicatii Clinice

• Ac.Prausnitz-Kiistner, ac. IgE citotropic responsabil pentru anafilaxia cutanata;

• Ac. protector, ac. responsabil pentru imunitatea la un agent infectios observat in imunitatea pasiva.

• Ac. Rh, dirijeaza spre antigenul Rh uman. In mod normal nu sunt prezenti, dar pot fi produsi atuncicand persoane Rh-negative primesc sange Rh-pozitiv prin transfuzie sau atunci cand o persoana Rh-negativa este insarcinata cu un fat Rh-pozitiv.

• Ac. de sensibilizare, un termen vag, aplicat la anticorpi care sunt atasati la celulele organismului sicare "sensibilizeaza" celule sau le face susceptibile la distrugere prin apararea organismului uman.

• Ac. coloidal tiroidian, ac. la antigenele coloidului tiroidian, cum ar fi tireoglobulina sa Ca2: intalnitin boala Hashimoto

• Ac. de deplasare TSH (TDA), imunoglobuline de inhibare a legarii TSH.

• Ac. reactivi la cald, ac., de obicei IgG dar ocazional si IgM sau IgA, care reactioneaza mai eficient cu antigenul la 37°C decat la temperaturi mai scazute.

• Toti acesti anticorpi cauzeaza afectiuni medicale = Imunopatologie


Curs 5: dezvoltarea celulelor B• Dezvoltarea celulelor B in maduva osoasa

• Rearanjarea genelor de imunoglobulina

• Recombinarea enzimelor RAG-1 si RAG-2

• Receptorul celular Pre-B: o Ig exprimatatimpuriu in celulele B

• Selectarea celulelor B imature

• Genele de imunoglobulina sunt completrearanjate numai in celulele B

• Surse de diversitate a anticorpilor

34Curs 5 - Imunologie - Prof. Ileana Constantinescu

• Limfocitele B sunt formate în țesuturile hematopoietice ale mamiferelor,mai întâi în ficatul fetal și în final măduva osoasă. Celulele B provin dincelulele stem hematopoietice multipotente care dau naștere tuturortipurilor de celule din sânge.

• Limfopoieza B este în general definită drept generarea de un bazin decelule B mature, cu o diversitate mare de receptori pentru mai multeantigene diferite.

• Fiecare receptor de antigen al celulei B (imunoglobulină, Ig) trebuie săprezinte mono specificitate, astfel încât fiecare celulă B poate produceanticorpi de un singur fel. Celule ce se alatura liniei celulelor B din măduvaosoasă, glicoproteinelor de suprafață celulară expresă CD45RA (B220) șiCD19.

• Două evenimente in formarea limfocitelor B în măduva înainte deretragerea lor in țesuturile limfoide periferice sunt importante:rearanjarea secventelor genelor somatice de lanț greu și ușor deimunoglobulină și expresia unui model caracteristic de suprafață celularăși molecule intracelulare care reglează diferențierea.

• Expresia moleculelor de suprafață celulară a permis recunoaștereaetapelor distincte ale diferențierii celulelor B. Cu toate acestea, trebuie săse realizeze că procesul este unul continuu, astfel încât împărțirea în etapeeste oarecum arbitrară.


Celulele B se dezvolta in maduva osoasa


ETAPE IN DEZVOLTAREA LIMFOCITULUI B

ETAPA REARANJAREA CROMOZOMIALA A GENEI Ig EXPRIMAREA PROTEINEI Ig

IgH IgL

Pre-pro DJ/GL GL/GL -

Timpuriu pro DJ/DJ GL/GL -

Tarziu pro VDJ/DJ GL/GL Receptor Pre-B

Pre VDJ/DJ VJ/GL Igµ

Nou-format VDJ/DJ VJ/GL IgM

Matur VDJ/DJ VJ/GL IgM,IgD

GL:germline


• Limphopoieza B apare pe întreaga durată a vietii oamenilor.• Proliferarea etapelor precursoare este un element cheie în reglarea

producției de celule B. Celulele nonhematopoietice similarefibroblastelor, numite celule stromale, alcătuiesc micromediul carecontroleaza celulele stem în linia de celule B și numărul de limfociteproduse pe zi.

• Celulele stromale formează o rețea reticulară de procese celularecare contacteaza milioane de precursori hematopoietici ai tuturorliniilor. La stadii incipiente, precursorii de celule B (celule pre-pro-B)trebuie să interacționeze fizic cu celulele stromale în ordine pentruca proliferarea și maturarea să apară. Etape ulterioare (ulteriorcelulelor pro-B) prezinta doar nevoia de factori de crestere solubiliprodusi de celulele stromale.

• Celulele stromale produc mai mulți factori de creștere necesari șimolecule de adeziune celulă-celulă. Un factor cheie de creșterepentru limfopoieza B este interleukina-7.


REARANJAREA GENELOR IMUNOGLOBULINEI• Procesul de rearanjare a genei imunoglobulinei a fost studiat extensiv. Rearanjarea

Ig este un proces foarte ordonat, care asigură că numai limfocitele B vor produceimunoglobuline.

• Cea mai veche etapă identificabilă de diferențiere celulară B este celula de pre-pro-B. In aceasta etapa începe procesul de rearanjare a genei Ig.

• Prima rearanjare presupune îmbinarea segmentului D la segmentul J a genei delanț greu a Ig (IgH). Rearanjamente ulterioare aduce regiune V juxtapuse laporțiunea DJ.

• O rearanjare productivă a genei IgH trebuie să aibă loc înainte rearanjare a geneide lanț ușor Ig (IgL) va începe.

• Etapa de celule pro-B este evidențiata prin continuarea rearanjarii IgH, aderarea lazona V cu segmentele ce deja s-au alăturat DJ. În timp ce rearanjamente DJ au locpe ambii cromozomi, rearanjarea VDJ apare de obicei pe un singur cromozom. Încazul în care rearanjarea nu este productiva, de exemplu din cauza introduceriiunui nou codon stop sau frame, rearanjarea continuă apoi la al doilea cromozom.Până la sfârșitul etapei pro-B, rearanjarea IgH este completă.

• Până în momentul când celulele ating stadiul de celule pre-B, Igμ, proteina poate fiobservata în citoplasmă și rearanjarea unuia dintre cele doua lanțurile ușoare deimunoglobulină (IgL) initiate de gene.

• Metoda de rearanjare este similară, dar numai o imbinarea este necesara pentru aaduce secvența regiunii V la segmentul J.

• Rearanjarea începe pe gena kappa, iar în cazul în care acest lucru este neproductiv,atunci genele lambda sunt rearanjate.


RECOMBINAREA ENZIMELOR RAG-1 SI RAG-2

• Două proteine necesare pentru procesul de rearanjare, RAG-1 și RAG-2 (gene deactivare a recombinarii 1 și 2), apar în stadiul de celule pre-pro-B. Genele RAG-1 șiRAG-2 sunt active în toate fazele de rearanjare a Ig, dar aceste gene nu suntexprimate în celulele B mature care au absolvit rearanjarea. Cu toate acestea, Agactivat de celule B in centrele germinale de reexprimare a genei RAG ca celulelesupuse maturarii.

• Transferaza dezoxinucleotidil terminala (TdT) este o alta enzima care esteimplicata in rearanjarea IgH și este exprimată timpuriu în formarea de celule B, darnu este necesar ca rearanjarea să aibă loc.

• Când TdT este prezenta, nucleotide aleatorii sunt adăugate pentru a deschide Nregiuni in timpul rearanjarii segmentelor D și J, crescând astfel diversitateasecvențelor.

• Expresia de TdT diminuata cu stadiul tardiv de celule pro-B, anterior rearanjariilanțului ușor. TdT este un marker de celule leucemice de tip B si T precoce și deorigine descendentă . TdT este exprimat prin precursori normale de celule B numaiîn timpul etapei de rearanjare a genei IgH. În consecință, IgH dar nu Igl prezintadiversitatea regiune N.


RECEPTORUL CELULEI PRE-B: O Ig EXPRIMATA DE CATRE CELULELE B TIMPURII

• Doua proteine exprimate tranzitoriu s-a descoperit recent căformează o moleculă cu lanț usor numit lanțul ușor surogat. Lanțulușor surogat este compus din două produse genetice, lambda 5 șiV-pre-B, care sunt omoloage respectiv cu lambda IgL și geneleregiunii V. Lanțuri ușoare surogat se pot combina cu proteinele μdin lanțul greu în celulele pro și pre-B, formând o structurădenumită receptorul de celule pre-B.

• Combinația de proteine IgH și lanțurile ușoare surogat pot fiimplicate în stimularea proliferării celulelor în faza tardiva de celulepro-B de diferențiere. Puține celule B formează în absențareceptorilor celulelor pre-B. După kappa sau lanțul ușor lambda,proteinele sunt sintetizate, IgL deplasează lanțul ușor surogat deinteracțiune cu proteina IgH astfel încât imunoglobulină intactapoate fi formata și livrata la suprafața celulei.


SELECTAREA CELULELOR IMATURE B• O celulă B nou formată afișează IgM pe suprafața celulei. În această

etapă, celula B este încă imatura și răspunde la antigene diferite fata de ocelulă B matură.

• Celulele imature B pot fi îndepărtate funcțional prin interacțiunea cuauto-antigenul, fie prin moartea celulară programată (apoptoza) sau prinanergie, în care celula este redata ca fiind nonresponsiva în prezențaantigenului. Astfel, in mod similar ca in cazul celulelor T, limfocitele Bimature sunt supuse unui proces de "selecție negativă" pentru a ștergecelulele care sunt reactive la auto-antigene (antigene care in ciudafaptului ca sunt un component tisular normal, devin tinta raspunsurilorumoral si respectiv mediat celular ca in bolile autoimune).

• Celulele B imature care nu sunt eliminate prin procesele de selecțienegativă, părăsesc măduva osoasă și migreaza la nivelul tesuturilorlimfoide periferice sau secundare, cum ar fi ganglionii limfatici și splină.Continuarea maturarii are loc și nou formatele celule B exprima IgD, înplus față de IgM, pe suprafața celulei. Celulele B mature răspund acum pedeplin la antigene și interacțiunea cu celulele T. Atunci cândinteracționează cu antigenul în țesutul limfoid secundar, ca si unele celuleTh, ajuta la formarea de centre germinale, după care hipermutatiasomatica, selecția celulelor care produc anticorpi cu afinitate mare,schimbarea de clasă și producția de plasmoblasti, precum și aparitia decelule cu memorie. 42

Curs 5 - Imunologie - Prof. Ileana Constantinescu

Organizarea genelor Ig


GENELE IMUNOGLOBULINEI SUNT COMPLET REARANJATE NUMAI IN CELULELE B

• Factorii de transcripție specifici țesutului reglementeaza accesibilitatea cromatinei genei Ig.• Segmente de gene Ig sunt flancate de secvențe unice de semnal de recombinare.• Exprimarea enzimelor de recombinare este foarte reglementata în celulele limfoide.• Specificitatea fiecărei celule B nou formate se realizează prin procesele insumate de

diferențiere celulară. Acest fenomen se numește excludere alelică, referindu-se la faptul canumai genele Ig de pe o alelă (cromozom) sunt transcrise și traduse în proteine. Acest lucruasigură că o celulă B va reacționa cu un singur determinant antigenic si va produceanticorpi numai pentru acel antigen.

• Recombinarea somatică a lanturilor grele si usoare ale genei Ig segmente de gene greu și lanțușor reprezinta diversitatea extremă a repertoriului de antigen al celulei B. In gena de lanțgreu, oricare din cele patru regiuni ale segmentului J se poate combina cu oricare dintre 15segmente D, iar produsul VD poate combina cu oricare dintre mai mult de 200 de gene V.

• Diversitatea este extinsa prin aderarea imprecisa a ADN-ului sau chiar adăugarea denucleotide aleatorii de către TdT în timpul rearanjarii. Chiar mai multa diversitate se adaugăprin rearanjamente. Genele cu catene lungi rearanjeaza anterior genele de lanț ușor. Odatăce o rearanjare productiva a lanțului greu este atinsa, o fază de diviziune celulara rapida seproduce, care produce mai multe celule-fiice care exprimă lanțuri grele identice Ig.

• Celulele fiice produc fiecare diferite rearanjamente genei de lanț ușor și, ulterior, proteinecare se combină cu proteinele cu lanț greu pentru a produce mai multe specificități uniceantigenului de legare. In acest mod, nu mai puțin de 1011 specificități diferite de anticorpipot fi generate în repertoriul primar din celulele B nou formate. Cu toate acestea, trebuie săse realizeze că selecția pentru celulele producătoare de anticorpi cu afinitate mare va avealoc în centrele germinale de țesut limfoid secundar.


SURSE DE DIVERSITATE ALE ANTICORPILOR

• Mai multe gene D și J pot combina în mai multemodele diferite, cu până la 200 de gene V.

• Se realătură situsurilor de scindare a AND, potobtine codoni pentru noi secvențe de aminoacizi.

• TdT adaugă nucleotide regiunilor N ale ADN-uluicare sunt scindate în timpul recombinarii.

• Combinarea proteinelor IgH identice cu diferitelanțuri Igl produce mai multa specificitate.


Cursul 6: Dezvoltarea celulelor T

• Arhitectura țesut timic

• Stadiile dezvoltarii celulei T in timus

• Structuri fizice ale genelor receptorilor celulelor T (TCR)

• Selecția de celule T în timus

• Complex major de histocompatibilitate (MHC)

• Soareci transgenici


• Celulele imune care sintetizează și secretă Ig sunt denumite celule B.Identificarea celulelor B vine de la observația că înlăturarea bursei luiFabricius (bursectomie), un organ limfoid secundar la păsări, inhibatotal capacitatea de a produce anticorpi. În schimb, capacitatea de arespinge o grefa de piele străina este intacta la păsărilebursectomizate. Cu toate acestea, eliminarea timusului (timectomia)la șoareci nou-născuți ulterior prelungeste supravietuirea grefei depiele si reduce răspunsul anticorpilor la antigenele specifice.

• Din aceste rezultate, este clar că există cel puțin două tipuri de celuleale sistemului imunitar: celulele B, care produc Ig și participă larăspunsul imun umoral, și celulele T care se dezvoltă în timus și suntresponsabile pentru respingerea grefei de piele și a altor raspunsuriimmune mediate celular.

• Mai mult decât atât, o reducere a răspunsurilor anticorpilor laanimalele timectomizate indică faptul că celulele B nu funcționează înmod independent, ci necesită mai degrabă cooperarea celulelor T.


Recapitulare

STRUCTURA TESUTULUI TIMIC

• Timusul este format din diferite tipuri de celule derivate din diverse origini. Histologic, timusul aretrei componente distincte: cortexul subcapsular, cortexul, și medulara. Dezvoltarea celulelor T saua timocitelor are loc într-o rețea epitelială cunoscuta ca stroma timusului. Dezvoltarea anormala atimusului este data de depletia celulelor T mature si de afectiuni imunodeficitare.

• Si la oameni si la soareci, timusul este un organ bilobat care este situat chiar deasupra inimii,anterior tuturor vaselor mari de sange, dar pozitia sa variaza la alte vertebrate. De exemplu, lapasari, timusul este situat de-a lungul zonei gatului. Histologic, acest organ este compartimentat inlobuli incompleti; fiecare este delimitat de un strat exterior de tesut conjunctiv sau capsula si tesutconjunctiv interlobar sau sept. In cadrul fiecarui lobul se poate identifica exteriorul dens alcortexului inconjurat de celule T ale timusului sau timocite si la interior medulara timusului cu maiputine timocite si corpusculi Hassall, un grup special de celule epiteliale din medulara. Stratul decelule epiteliale care se afla proximal de capsula si sept este cunoscut sub numele de cortexsubcapsular, iar zona dintre cortexul si medulara timusului este denumita jonctiune cortico-medulara. Jonctiunea cortico-medulara se afla acolo unde celulele precursoare intra si migreazaspre regiunea corticala subcapsulara.

• Celulele T mature din cortex migreaza spre medulara. Celulele T mature ies din medulara incirculatia periferica prin intermediul venulelor postcapilare si a limfaticelor. Timocitele in curs dedezvoltare din cortex si celulele T din medulara sunt incorporate intr-o retea epiteliala cunoscutasub numele de stroma timusului care creaza un micromediu unic dezvoltarii celulelor T. In timpuldezvoltarii embrionare, epiteliul timic formeaza un timus rudimentar (anlage timus), care atragecelulele hematopoietice mai intai din sacul vitelin si apoi din maduva osoasa. Celulele carecolonizeaza acest timus rudimentar includ celule precursoare T, celule dendritice si macrofage.



ORIGINEA CELULELOR TIMICE

TIPUL DE CELULA ORIGINEA CELULARA

Epiteliu: Cortex subcapsular Cortex Medulara Celule timice asistente Celule dendritice sau celule interdigitate Macrofage Timocite

Ectodermul din a treia scizura a faringelui Endodermul din a treia punga a faringelui Ectodermul din a treia scizura a faringelui Epiteliu Maduva osoasa Maduva osoasa Sac vitelin, ficat fetal, maduva

• În sindromul DiGeorge la om, un individ se naște cu oaplazie congenitala a timusului. În aceasta condiție, numaidezvoltarea celulelor T este afectată in timp cedezvoltarea celulelor B decurge in mod normal.

• Sindromul DiGeorge este diferit de sindromulimunodeficienței severe combinată (SCID), în caredezvoltarea timusului este normala, dar prezintă defecteîn compartimentele celulelor T și B.


STADII DE DEZVOLTARE ALE CELULELOR T IN TIMUS• Diferentierea limfocitelor T are loc in 2 etape: 1. diferentierea independenta de antigen in

maduva osoasa si in organele limfoide primare; 2. diferentierea dependenta de antigen inorganele limfoide secundare.

• Maturarea limfocitelor semnifica dobandirea imunocompetentei, adica a capacitatii de arecunoaste specific antigenul si de a se activa.

• Celulele precursoare T încep să colonizeze timusul devreme, in timpul dezvoltarii embrionare.Aceasta începe în saptamana 7 - 8 de gestație la om. Rata de dezvoltare a celulelor T în timuseste mai mare înainte de pubertate și scade brusc după aceea, deși numărul de celule T matureîn periferie nu arată o reducere similară.

• Scăderea producției de celule T, de asemenea, se corelează cu atrofia stromei timusului, ostare fiziologică normală cunoscuta ca involuție a timusului. Involuția timusului specificavârstei, este cunoscuta ca involuție cronica si este diferita de involuția cauzată de o infecțieacută, stres, sarcina și alăptarea. În timusul involuat de imbatranire, se pot detecta schimbariin arhitectura a țesutului, în primul rând cu creșterea spațiilor dintre țesutul conjunctiv șiperivasculara și mai târziu cu înlocuirea țesuturilor de mai sus cu tesut adipos. Cu toateacestea, chiar și la indivizi în vârstă, un timus mic rudimentar compus din epiteliu și timociterămâne identificabil.

• Producerea de anticorpi monoclonali care recunosc un epitop specific al unei moleculefacilitează foarte mult caracterizarea și identificarea celulelor în diferite etape ale diferențieriilor. Anticorpii monoclonali care recunosc epitopi diferiți ai aceleiași molecule diferențiate suntgrupati împreună și se constituie ca grup de diferențiere (CD).


• In cazul celor mai timpurii celulele precursoare care ajung în timus, majoritateamoleculelor de suprafață celulară, care sunt ușor detectabile pe celulele T mature,sunt absente.

• Cand ajung în timus, celulele precursoare interacționeaza fizic cu celulele stromaleale timusului, care apoi furnizează stimuli pentru a induce în mod selectivexprimarea unui grup de molecule specifice de pe suprafața celulară. La om, primamolecula specifica celulei T care se exprima in timus este CD1;

• Aceste celule T imature nu exprimă molecule de suprafață CD4 sau CD8 și suntdenumite în mod obișnuit a fi timocite dublu negative.

• Celulele dublu negative, de asemenea, nu exprimă CD3 și, prin urmare, sunt uneorinumite timocite triplu negative. S-a descoperit recent că primele celule Tprecursoare exprimă un nivel foarte scăzut CD4 la suprafața celulei.

• In următoarea etapă distinctă de maturare a timocitelor, timocitele exprimaambele molecule de suprafață CD4 și CD8 și sunt denumite timocite dublupozitive; aceste timocite, de asemenea, încep să-și exprime moleculele desuprafață CD3 și TCR in timp.

• Populația de timocite dublu pozitive este cea mai mare populatie de timocite șieste responsabila pentru celularitatea densa a cortexului timusului. Spredeosebire de celulele dublu negative, celulele dublu pozitive nu proliferează și suntinactive. In urmatoarea etapa de dezvoltare a celulelor T, celulele dublu pozitiveinceteaza complet să exprime fie CD4 sau CD8, și se maturizează în celule pozitiveunice care sunt fie CD4 + sau CD8 +.




Celulele T mature CD4, (Th), asigură funcțiile de intrajutorare celulara și

cooperează cu celulele B în răspunsul imun umoral, în timp ce celulele CD8,

(CTL), sunt responsabile pentru recunoașterea celulelor străine, la fel ca în

cazul grefelor straine, precum și a celulelor infectate de virus pentru care

sunt responsabile de uciderea lor. Astfel, celulele precursoare traverseaza

cortexul subcapsular, cortexul, joncțiunea corticomedulara si medulara, si

interacționează cu stroma timusului fiind induse pentru a se dezvolta și

matura.55


COMPARTIMENTAREA CELULELOR T α:β DESFASURAREA ETAPELOR LA NIVELUL TIMUSULUI

COMPARTIMENTUL TIMIC SUBSETURILE DE TIMOCITE STATUSUL REARANJARII GENELOR TCR

α β

Cortex subcapsular CD3-CD4LOCD8-

CD3-CD4-CD8-

Linie germinativa sau

nerearanjata


nerearanjata


nerearanjata

Rearanjat

Cortex CD3+CD4+CD8+TCR+ Rearanjat Rearanjat

Medulara CD3+CD4+TCR+ sau

CD3+CD8+TCR+

Rearanjat Rearanjat

STRUCTURA GENELOR RECEPTOARE ALE CELULELOR T

• La nivel de gena, TCR α, β, γ, și δ sunt organizate în segmente distincte de gene desemnatevariabil (V), diversificat (D), de asamblare (J), și regiuni constante(C). Genele α și γ au doarsegmentele V, J si C, în timp ce genele β și δ au toate cele patru segmente. Există mai multdecat un V, D, J și C în fiecare locus al genei, cu segmentele V și J având cel mai mare număr;numerele fiecărui segment de genă sunt diferite la șoareci și la om.

• Ca și în cazul celulelor B, o caracteristică unică în dezvoltarea celulelor T este producerea decelule cu un TCR specific fiecare care recunoaște un antigen peptidic specific.

• In timp ce celulele B recunosc epitopi conformaționali, TCR exprimat pe celulele Trecunoaște peptide antigenice care sunt asociate cu complexul major dehistocompatibilitate (MHC), care sunt prezentate de către celulele prezentatoare de antigen(APC).

• Generarea unei mari populații de celule T, fiecare celulă cu o specificitate unică TCR, se realizează prin tăierea și îmbinarea de regiuni ale diferitelor segmente de gene ce codifică TCR. Procesul este cunoscut sub numele de rearanjare a genei și este executat de către produsele a două gene distincte, genele de activare a recombinarii 1 și 2 (RAG-1, RAG-2). Rezultatul final este o colecție de toate particularitățile de TCR exprimate pe celulele T, care este denumit repertoriul de celule T.

• Suprafata celulara a TCR este un heterodimer format din produse genetice de la patru gene distincte: α, β, γ și δ.



Organizarea receptorilor α,δ,β si γ ai unei celule T la om și șoarece. În lanțurile α și γ, ordinea de

rearanjare este VJ, deoarece nu există segmente D. In contrast, ordinea de rearanjare este de la D la J și

de la DJ la V formarea VDJ în δ si β genele catenei receptorilor celulelor T

Rearanjare

Cromozom

Uman Soarece

• Lanțul α al TCR face perechi numai cu lanțul β, în timp ce lanțul γ numai cu lanțul δ.

• Această asociere specifica generează două populații distincte de celule T cu două TCR-uri distincte: populația cea mai abundentă de celule T αβ și populația minoră de cellule T γδ.

• În cadrul populatiei de celule T αβ, ordinea de rearanjarii genei și expresie de rearanjare a lanturilor α și β lanțurile de pe suprafata celulelor are loc într-un mod strict reglementat, paralel cu maturizarea celulelor T de la dublu negativ la etapa dubla pozitiv.

• Lanțul β rearanjează în primul rând celulele dublu negative. Deoarece genele D și J ale lanțului β sunt organizate în două grupuri de D, J, și C, există două șanse pentru o genă Vβ să adere la un segment DJ în fiecare cromozom (total de patru posibilitati de a rearanja o genă Vβ într-o pereche de cromozomi).

• În cazul în care o celulă nu poate realiza toate cele patru șanse de rearanjare a genelor Vβ productiv, va muri. Rearanjareacu succes a unui Vβ pe un cromozom previne celula sa continue o a doua rearanjare a genei Vβ; acest lucru este cunoscutca excluderea alelică.

• Rearanjarea cu succes a lanțului β cu proteine productive și funcționale din lantul β va asigura exprimarea lanțului unic βpe suprafața celulară a celulelor dublu negative. S-a constatat că lanțul β este exprimat pe suprafața celulară în asociere cuo proteină nouă denumită pre-TCR. Este posibil ca funcțiile complexe ale B-pre-TCR ca un receptor pentru un ligandnecunoscut care induce exprimarea CD4 și CD8 și declanșarea rearanjarii TCR. Spre deosebire de rearanjare lanțului B, careeste în conformitate cu excluderea alelică, segmentele V ale unui lanț (Vα) sunt rearanjate pe ambi cromozomi 14.

• În plus, numărul mare de segmente J (70 la om și 50 la șoareci) permite mai multe șanse pentru o rearanjare productivă agenelor TCR Vα. Deoarece locusul δ este situat în interiorul locusului α, rearanjarea genelor Vα rezulta în locusul de deletieal genei δ.

• După reamenajarea cu succes a ambelor lanțuri α și β, celulele dublu pozitive exprimă acum lanțuri TCR αβ. La aceastăetapă, deși αβ TCR sunt exprimate pe suprafața celulară, genele RAG-1 și RAG-2 continuă să fie exprimate, permițând altorgene Vα sa se rearanjeze.

• TCR αβ este exprimat în asociere cu molecula CD3, care formează unitatea funcțională de transducție a semnalului de TCR.

• Moleculele CD3 de suprafață sunt formate din cinci lanțuri: γ, δ, ε (epsilon), £ (Zeta), și η (eta).£ poate forma fie ££homodimeri sau heterodimeri £ η. Cu toate acestea, majoritatea TCR se asociaza cu homodimerii ££. Lanturile γ și δ aleCD3 sunt diferite de lanturile TCR γ și δ, care sunt exprimate numai pe o populație de celule T minora.



Structuri ale receptorului celulei T - CD3 (TCR-CD3) exprimat pe suprafața celulară a celulelor T α,β. Lanțurile α,β

ale TCR formează situsul de legare peptide antigenice, în timp ce complexul CD3 functioneaza drept componenta

a semnalului de transductie. Legăturile disulfurice sunt prezente între lanțuri α si β ale TCR și între două lanțuri

CD3.

SELECTIA CELULELOR T IN TIMUS• Pe lângă furnizarea unui micromediu inductiv pentru celulele T

precursoare pentru a se dezvolta in celulele T mature, timusulexecută două procese critice de screening pentru a selecta celuleleT de protective utile (selecția pozitivă) și pentru a elimina celuleleT autoreactive (selecție negativă) irelevante sau potențialdăunătoare. Ambele procese selective au loc în etapa dublupozitiva.

• Așa cum tocmai s-a discutat, generarea repertoriului de celule T decatre procesul de rearanjare a genei și recombinarea esteintamplator. Deoarece TCR-uri pot recunoaște numai peptideantigenice asociate cu MHC și prezentat de către o celulăprezentatoare de antigen (APC), selecția pentru TCR-uri funcționalădepinde de tipul de MHC exprimate pe APC. Aceste argumente punbazele pentru conceptul de restricție MHC.


RESTRICTIILE COMPLEXULUI MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE (MHC)

• Conceptul de restricție MHC separă în continuare antigenul derecunoaștere a specificitatii TCR exprimat pe celulele T de laexprimarea Ig de catre celulele B, a căror capacitate de a legaantigenul nu necesită restricție MHC.

• În general, celulele T mature CD4 sunt selectate de MHCclasa II, în timp ce celulele T mature CD8 sunt selectate deMHC clasa I pe epiteliului corticalei timusului. Astfel, MHCexprimate de epiteliul corticalei timusului dictează specificulTCR-ului selectat pozitiv.


• Celulele T in curs de dezvoltare aflate in faza dedublu pozitivitate, trebuie să treacă un al doileaproces de selecție în drumul lor spre maturizare.Spre deosebire de procesul de selecție pozitivă încare celulele selectate sunt suportate pentrudezvoltare, procesul de selecție negativă eliminăselectiv celulele T cu specificitate TCR.

• Procesul de selecție negativă asigură că celulele Tmature nu reacționează cu auto-antigenulprezentat de auto-MHC.

• Procesul de selecție negativă este cel mai binedemonstrat în TCR la șoarecii transgenici cuspecificitate pentru antigenul specific masculin.


•Ambele procese de selecție pozitivă și negativă eliminaefectiv majoritatea celulelor T dezvoltate în timus astfel încâtmai mult de 90% din cele în curs de dezvoltare in timocitedublu pozitive mor în timus. Cu toate acestea, moarteaintratimica masiva a celulelor nu induce nici o inflamațiacronică, deoarece aceste celule mor printr-un proces cunoscutsub numele de apoptoza.

•În timus, celulele neselectate sau celulele T autoreactive suntinstruite să moară prin fragmentarea ADN-ului lor. Cu aceastămoarte celulară caracteristică, se pot detecta timocite dublupozitive în cortexul timic și joncțiunea cortico-medulareideoarece mor prin apoptoză din cauza lipsei de selecție pozitivăsau negativă.


SOARECII TRANSGENICI

• Animale transgenice au incluse permanenttransgene, gene exogene care nu fac partedin bagajul lor genetice normal, în ADN-ul lor.

• Șoarecii transgenici sunt construiti prininjectarea de ADN ce conține transgena înpronucleul mascul al ouălor fertilizate șiulterior se face implantarea ouălor fertilizatein soareci gestanti. Dupa nastere, unii urmașivor încorpora transgena și vor fi capabili să otransmita descendenților lor.


Cursul 7: Structura si rolul complexuluiimun de histocompatibilitate (MHC)

• Complexul major de histocompatibilitate (MHC)• Organizarea genetică a MHC• Structura MHC de clasa I• Structura MHC de clasa II• Familia supergenei Imunoglobulinei• Distribuția de antigene MHC• Tipizarea tisulara• Boli associate HLA• Funcția de MHC• Restricția MHC


COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE (MHC)

• Complexul major de histocompatibilitate (MHC) este un grup de genelocalizate pe un singur cromozom la toate speciile de mamifere studiatepana in present.

• MHC permite unui individ care este capabil să genereze un răspuns imunde a distinge ceea ce este propriu lui de ceea ce este strain.

• MHC a evoluat fundamental protejand împotriva agentilor patogeniinvadatori și a tuturor substanțelor care poartă antigene.

• Un individ dobândește capacitatea de a distinge ce este propriu de ceea ceeste strain, în timpul dezvoltării celulelor T și selecției în timus.

• Astfel, capacitatea de a discrimina este un proces dependent de celuleleT. In timpul maturării celulelor T în timus, celule T afla ce este propriu șisunt educate sau selectate pentru a răspunde doar la peptidele antigeniceprezentate de auto-MHC.

• Oarecum ironic, sistemul imunitar al unui mamifer s-a dezvoltat pentru arăspunde la pericolul fata de sine prin recunoașterea agentilor patogenistrăini numai în contextul auto- MHC. În acest fel, sistemul imunitar esteaxat pe eliminarea agenților patogeni care au devenit asociati celulelor și,prin urmare, prezintă pericol iminent.


ORGANIZAREA GENETICA A MHC

• Complexul antigenelor leucocitare umane (HLA) estelocalizat pe cromozomul 6 care, eventual, codifică maimulte sute de gene și este organizat în trei regiunigenetice majore sau locusuri desemnate clasa I, II, șiIII.

• Genele de clasa a III-a codifica în primul rândcomponente ale sistemului complement, care tind săfie relativ conservată (non polimorfă) între membriiidentice sau specii similare. Acest grup de proteine,prin urmare, se consideră separat de MHC clasa I și II.

• Locusurile clasa I și II, codifica fiecare un număr deproteine de suprafata celulara foarte polimorfe,aceste proteine conțin secvențe de aminoacizi foartevariabile care diferă între membrii aceleiași specii.



Cromozom uman 6

•Locusul HLA clasa I este împărțită în sub-regiunile HLA-A, HLA-B și HLA-C, fiecarecodifica lantul de gene classa I α. Locusul HLA clasa II, HLA-D, este împărțită în celpuțin șase sub-regiuni (HLA-DR, -DQ, DP, -DX, -DO, și -DZ), care codifică un numărvariabil de de gene sau pseudogene de pe lantul α și (HLA-DO și -DZ).

•In ciuda polimorfismului considerabil al MHC, un singur individ exprimă unnumăr finit de antigene MHC și în populațiile neinrudite este de obiceiheterozigot pentru fiecare genă MHC.

• Acest lucru înseamnă că nu o singură persoană este capabilă să răspundăputernic pentru fiecare agent patogen care necesită un răspuns al celulelor Tpentru eliminare.


STRUCTURA MHC CLASA I

• MHC clasa I este o molecula heterodimerica exprimata la suprafata celulei care contine douasubunitati diferite : un lant α si β2 microglobulina.

• Molecula MHC clasa I este o glicoproteina heterodimerica de la suprafata celulei compusadintr-un lant greu α variabil (45kd) si un lant usor nonvariabil de β2 microglobulina (12kd).

• Lantul α al MHV clasa I este format din trei domenii globulare extracelulare, α1, α2 si α3, cual treilea domeniu α3 asociat necovalent lantului usor nonpolimorfic de β2 microglobulina(12kd).

• β2 microglobulina este codata în afara MHC pe cromozomul 15 uman și cromozomul 2 lasoareci. Intelegerea structurii de clasa 1 a venit de la studii cristalografice cu raze X, în cazul încare moleculele sunt cristalizate în forma lor cea mai pură. Aceste studii au indicat cădomeniile α1 și α2 ale clasei I α asociaza lanțuri grele într-o structură caracterizată ca un sant.Molecula MHC clasa I canulara este constituita din "părți" formate de eliciile domeniilor α1 șiα2, precum și constituirea unei structuri asemanatoare unei table intre domeniile β.(β-foaiepliata)

• Studierea co-cristalizarii a arătat că fragmente peptidice scurte de aproximativ nouăaminoacizi se încadrează în această canula. Această molecula tridimensională de MHC clasa Iconformata de fetele α1 si α2 si cu un β-foaie pliata cu rol de podea reprezintă un situs delegare al peptide antigenului, în cazul în care peptida antigenică se potrivește moleculecanulare MHC ca o minge de baseball in manusa unui prinzator.



STRUCTURA MHC CLASA II

• MHC clasa II este o molecula heterodimerica exprimata la suprafața celulei, care este constituita din două subunități diferite: un lanț α și un lanț β.

• Structura moleculelor MHC de clasa II, este foarte asemănătoare cu clasa I. Deși o glicoproteină heterodimer de suprafața celulară, molecula MHC clasa II, este compusa dintr-un lanț greu variabil α (30 și 34 kd) și de lanț ușor variabil β (26 la 29 de kd).

• Aceste două domenii globulare extracelulare variabile, α1, și β2, se asociaza necovalent.

• Studii recente cristalografice au indicat că, la fel ca MHC clasa I, moleculele de clasa II sunt caracterizate printr-o canulă formată din regiuni elicoidale ale domeniilor extracelulare α1 și β1, considerat a forma un situs de legare al peptidelor.

• Peptidul găsit în șanțul MHC clasa II este de aproximativ 12 la 24 de aminoacizi în lungime, astfel încât complexul peptidic clasa II a fost asemănat cu o peptidă mare într-o clasă II mai mica.



FAMILIA SUPERGENEI IMUNOGLOBULINEI

• Această familie este constituita din molecule, cum ar fi MHC clasa I și II,care posedă domenii de tip imunoglobulină.

• O caracteristică izbitoare a multora dintre moleculele de suprafață celularăcare participă în răspunsul imun este că au în comun o remarcabilaomologie structural.

• Molecule MHC, precum și molecula de imunoglobulină și lanturile α și βale receptorului celulei T împărtășesc un motiv structural, și anume unasau mai multe domenii extracelulare care conțin aproximativ 70aminoacizi fiecare. Fiecare domeniu este caracterizat de reziduuri decitozină, care oferă o legatura disulfurica inchide fiecare domeniu într-ounitate structurală globulara. Molecula de imunoglobulină, a căruistructură globulară a fost descrisa pentru prima data, a împrumutatnumele său la un grup de molecule care participă la diferite faze alerăspunsului imun, în cazul în care fiecare moleculă este codificată de genedistincte și îndepărtate fizic. Acest grup de molecule este denumit familiasupergenei imunoglobulinei.

• Moleculele MHC clasa I și clasa II ce aparțin acestei familii, ai carei membriposeda domenii globulare legate disulfidic sunt asemanatoareimunoglobulinei.



DISTRIBUTIA ANTIGELOR MHC

• Molecule MHC posedă modele distincte de țesut șidistribuție a tipurilor de celule. În general, moleculele MHCde clasa I se gasesc pe suprafata tuturor celulelornucleate.

• Moleculele MHC clasa II, pe de altă parte, sunt mult mairestricționate în distribuția lor.

• Celulele B, macrofagele, celulele dendritice, și, la omcelulele T activate sunt printre cele mai puternic pozitive laclasa II.

• Anumite tipuri de celule, în special celulele epiteliale, pot fiinduse pentru a exprima MHC clasa II în timpulevenimentelor inflamatorii sau în prezența citokineiinterferonului γ.


77


FUNCTIA MHC

• Pentru a ne asigura că antigenul este prezentat pe moleculele MHC pe suprafatacelulei astfel încât antigenul liber singur nu satureaza moleculele receptorilorcelulelor T (TCR), prevenind astfel eliminarea pericolului a celulelor.

• Pentru a asigura, prin diversificarea MHC pe o specie (MHC polimorfism), căspeciile în ansamblu pot răspunde la antigen și de a supraviețui pericolului, osingură moleculă MHC este incapabil de a se lega la și prezentarea toți antigenii.

• Intelegerea funcției moleculei MHC a fost obținuta cu demonstrarea că celulelecitotoxice sau ucigase T izolate de la un șoarece care a fost imunizat cu un virus arputea doar să recunoască și să distrugă celulele infectate viral din aceeași sau dela tulpinu identice MHC de șoarece (MHC-restricție ).

• Aceste celule citotoxice nu au putut recunoaște și distruge celulele dintr-o tulpinăde șoarece neidentic MHC infectate cu același virus.

• Astfel, raspunsul imun a ajuns să fie cunoscut ca fiind MHC-restricționat. Nu parenumai ca MHC să funcționeze în contextul definirii a ceea ce este de la sine, darrăspunsul imun este limitat la participarea într-un mediu definit ca self. Un astfelde angajament de a vinde apare devreme în timpul dezvoltării și necesită ajutorultimusul pentru a crea și monitoriza mediul MHC-limitat a sistemului imunitaradaptativ. În acest fel, MHC este absolut necesară pentru auto-recunoaștere șiinducerea unui răspuns imun dependent de celule T eficace în timpul procesăriiantigenului și prezentarii.



RESTRICTIILE MHC• MHC class I –Situat pe suprafața tuturor celulelor nucleate. Prezintă peptide derivate din antigeni

endogeni recunoscute de celulele CD8 +• MHC class II - Situat pe celule B, macrofage, celule dendritice și celule T activate prezintă peptide

derivate din antigeni exogeni recunoscute de celulele T CD4 +.

• Celulele T CD8 +, care sunt de obicei celulele citotoxice atunci când sunt activate în modcorespunzător, recunosc antigenul peptidic endogen sau intracelular numai în asociere cu saucanalul incarcat al MHC clasa I asupra celulelor țintă.

• Celule T CD4 +, care sunt denumite celule T helper, sunt limitate la recunoașterea antigenuluipeptidă exogen sau extracelular asociate cu moleculele MHC de clasa II pe celulele prezentatoarede antigen.

• MHC a fost definit ca un grup sau complex de gene care codifică, printre alte produse, glicoproteinade suprafata a celulei inalt polimorfe. Aceste molecule par a fi necesare pentru un răspuns imunefficient la mamifere. Aceste caracteristici pot apărea încurcat la început, dar ar putea fi explicatprin următoarele considerente.

• În primul rând, gradul ridicat de polimorfism al moleculelor MHC clasa I și II, concentrate înregiunea de legare a peptidului asigură o intreaga specie ca are potențialul de a răspunde în modeficient și a elimina orice antigen întâmpină. În al doilea rând, necesitatea unui sistem derecunoaștere asociat de TCR, în scopul de a produce un răspuns imun, și anume peptideantigenice în asociere cu molecule MHC, poate preveni eficient saturația TCR cu antigen liber. Oastfel de situatie ar preveni efectul celulei T helper si/sau uciderea celulei tina care prezintaantigen.



TIPIZAREA TISULARA

• Tipizarea tisulara reprezinta identificarea alelelor MHC exprimate pe suprafațacelulelor, în scopul de potrivire a potențialilor donatori de transplant de țesut șireceptori.

• Importanța MHC pentru succesul transplantului de organe a devenit clara cuprimele studii de transplanturi de țesuturi la șoareci. MHC mai aproape de a fiidentice la donatorul de transplant și primitor inseamna probabilitate mai mica dea respinge grefa transplantata.

• Prin urmare, în scopul optimizarii între donatorul și primitorul de transplant,leucocitele de la un potential donator si proba de sange de la primitor suntexaminate pentru identitatea determinanților MHC utilizând un test decitotoxicitate și / sau o reacție a limfocitelor mixte.

• În testul de citotoxicitate, anticorpii care recunosc specificități diferite aledeterminanților MHC sunt aplicate individual leucocitelor împreună cucomplementul. Dacă leucocitele poartă o moleculă MHC recunoscuta de unanticorp anti-MHC, atunci complementul va fi activat de anticorp și liza celulei vaavea loc. Alternativ, în reacția limfocitelor amestecate, celulele T trebuiesc testatepentru identitate MHC fiind plasate în cultură în mod individual cu celule deidentități cunoscute MHC care nu se divid în condițiile de cultură.

• Limfocitele T sunt stimulate să prolifereze în prezența celulelor care poartădeterminanți MHC străine, dar, de obicei, nu proliferează în prezența MHC.Aceste studii timpurii efectuate cu șoarecii au fost confirmate ulterior in studiileumane.



Numarul alelelor HLA cunoscute in anul 1999




Proba de celule sau tesut

Combină ADN cu secvență

specifică primer fix pentru

fiecare alela

Amplificare PCR

Gel electroforeza – fiecare

proba

1. Colorat cu bromura de

etidium;

2. Fotografiere sub lampa UV

Amplificarea

alelelor HLA

Control

intern

Termo

cycler

Extragerea ADN




Assay Report

Sample ID: 455FM59

Patient Name: F.M. – Kidney donor(mother) for recipient F.I.

Entered on: 1/22/2002

Account: admin LiPA HLA-A/v.1.4/001102

AssayResult

ALLELE GROUP TYPING:

A*02A*24


Assay Report

Sample ID: 456FI38

Patient Name: F.I. – Kidney recipientEntered on: 1/22/2002

Account: admin LiPA HLA-A/v.1.4/001102

AssayResult


A*02 A*24



B*18B*35

Assay Report

Sample ID: 455FM59

Patient Name: F.M. Entered on: 1/24/2002

Account: admin LiPA HLA-B/v.1.4/001102

AssayResult



B*18B*39

Assay Report

Sample ID: 456FI38

Patient Name: F.I. Entered on: 1/24/2002

Account: admin LiPA HLA-B/v.1.4/001102

AssayResult



DRB1*

07

DRB1*

11

Assay Report

Sample ID: 455FM59


Account: admin LiPA HLA-DRB/v.5.4/001102

AssayResult



DRB1*

11

DRB1*

13

Assay Report

Sample ID: 456FI38

Patient Name: F.I.Entered on: 1/21/2002

Account: admin LiPA HLA-DRB/v.5.4/001102

AssayResult


DQB1*

03

DQB1*

03

Assay Report

Sample ID: 455FM59


Account: admin LiPA HLA-DQB/v.2.6/001102

AssayResult


DQB1*

03

DQB1*

06

Assay Report

Sample ID: 456FI38

Patient Name: F.I. Entered on: 1/21/2002

Account: admin LiPA HLA-DQB/v.2.6/001102

AssayResult


PREPARAREA LIZATULUI



100

101

102

6.2

2015 103

Timisoara

Cluj

Napoca

Targu Mures

Iasi

ConstantaBucuresti

104

AFECTIUNI ASOCIATE HLA

• Odată cu apariția tipizarii MHC sau HLA uman,anumite asocieri de boli au apărut corelate cuanumite tipuri HLA.

• Aceste boli sunt, în general de naturaautoimuna.



AFECTIUNI ASOCIATE HLA

AFECTIUNI ANTIGEN HLA ASOCIAT

Miastenia gravis B8,DR3

Lupus eritematos sistemic DR3

Spondilita anchilozanta B27

Sindrom Reiter B27

Tiroidita subacuta B35

Psoriazis Cw6

Boala celiaca DR3,DQ2,DQ8

Boala Addison DR3

Diabet juvenil DR3

Artrita reumatoida DR4

Documents

Cursul 4: Anticorpul€¦ · Definitie •Anticorpul: este o proteina care este produsa ca raspuns la stimularea produsa de antigen si care reactioneaza specific cu acel antigen