© Copyright by $taś

- 1 -

1. DIAGNOSTYKA GRUŹLICYa. Pobieranie materiałub. Diagnostyka mikrobiologiczna z zastosowaniem testów morfologiczno-biochemicznychc. Metody chromatograficzned. Metody genetyczne

2. DIAGNOSTYKA BAKTERII BEZTLENOWYCH3. TECHNIKA BARWIENIA METODĄ GRAMA:

a. Sposób barwieniab. Mechanizm barwieniac. Efekt barwienia Grama

D i a g n o s t y k a g r u ź l i c y

Wydłużone, pałeczkowate, proste lub lekko wygięte bakteriePrątki to drobnoustroje wolno rosnące, tlenowe, o niezwykłej budowie ściany komórkowej

o Lipidy stanowią 40% masy ściany komórkowej, poza tym znajdują się w niej wielocukry,nukleoproteidy i frakcje białkowej

Znaczna oporność na działanie kwasów (unikalna budowa ściany prątka, a dokładniej obecność w ichścianie kwasu mykolowego)Z trudnością barwią się metodą GramaWiększość prątków to saprofity występujące w glebie i wodzie oraz jako stała flora ludzi i zwierząt

Choroby wywołane przez prątki nazywa się mykobakteriozamio Gruźlica wywołana przez Mycobacterium tuberculosiso Trąd wywołany przez Mycobacterium lapraeo M. bovis, M. avium-intracellulare, M. kansasi, M. gordonaeà prątki atypowe

Zakażenie prątkiem gruźlicy może być zlokalizowane w każdym narządzie, ale najczęściej narządem tymjest: układ oddechowy, przewód pokarmowy, skóra, błony śluzowejNajczęstszą postacią gruźlicy jest postać płucnaPrątki mogą również wywoływać gruźlicę jelit, skóry, węzłów chłonnych, kości czy opon mózgowo-rdzeniowychŹródłem zakażenia jest osoba prątkująca lub chore zwierzę

Pobieranie materiału

Do diagnostyki mikrobiologicznej w kierunku mykobakteriozy materiałem może być: plwocina, materiały zpłukania oskrzelowego, popłuczyny żołądkowe, płyny wysiękowe, przesięki, płyn mózgowo-rdzeniowy,mocz, materiał sekrecyjnyPobranie dużej objętości płynu zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia czynnika chorobotwórczego (w 1ml płynu może być jedynie kilka prątków)

Diagnostyka mikrobiologiczna z zastosowaniem testów morfologiczno-biochemicznych

Plwocina o objętości 10-20 ml ma być pobrana do jałowego naczynia, powinna być odksztuszona rano ipochodzić „głęboko z płuc” à pobrany materiał przenosi się do płytki Petriego à wyszukanie ropnych lubpodbarwionych krwią grudek à przeniesienie ich ezą na szkiełko podstawowe à przykrycie drugimszkiełkiem i rozcieranieà uzyskuje się 2 preparaty à wyschnięcie i utrwalenie w płomieniu palnika

o Obecnie rutynowo stosowaną metodą w laboratoriach jest metoda fluorescencyjna (auramina,rodamina, oranż akrydyny)à prątki świecą

o Dawniej jedyną metodą barwienia prątków była metoda Ziehl-Neelsena à prątki na kolorczerwony, tło na niebieski

§ Wynik ujemny – brak prątków§ Wynik wątpliwy – 1-2 prątki w preparacie§ Wynik dodatni + - pojedyncze prątki w całym preparacie§ Wynik dodatni ++ - pojedyncze prątki w poszczególnych polach widzenia, obfite

prątkowanie

© Copyright by $taś

- 2 -

§ Wynik dodatni +++ - liczne prątki w poszczególnych polach widzenia, bardzo obfiteprątkowanie

Hodowla prątkówo Homogenizacja prątków à żeby usunąć pozostałą florę i zagęścićo Rutynowo stosowane podłoże to podłoże Lowensteina-Jensena (masa jajowa + r-r zieleni

malachitowej) innym stosowanym podłożem stałym jest podłoże agarowe Middlebrooka§ M. tuberculosisà suche, szorstkie, uniesione, żółtobeżowe kolonie o nierównej powierzchni§ M. bovisà małe, bezbarwne, piramidokształtne kolonie

Identyfikacjao Tempo wzrostuo Zdolność do wytwarzania barwnikao Cechami pozwalającymi na odróżnienie M. tuberculosis od pozostałych prątków są: wytwarzanie

czynnika sznurowego i produkcja niacyny

Inne, nowe, przyspieszone systemy hodowli prątków kwasoodpornych:

o Izotopowy półautomatyczny system do hodowania, różnicowania i oznaczania wrażliwości na leki§ Do podłoża dodawany kwas palmitynowy znakowany węglem C14 à prątki, rosnąć

zużywają kwas palmitynowy i wydzielają CO2 znakowany C14 à odczyt na podstawieprzyrostu radioaktywności CO2

o Wzrost na pożywkach Middelbrokaà odczyt wizualny

o Płynny system hodowli z odczynnikami fluorescencyjnymi

o Nieizotopowy, w pełni skomputeryzowany system hodowli prątków na podłożach płynnych àodczyt na podstawie przyrostu CO2

o System hodowli prątków na pożywce płynnej Kirchnera z dodatkiem surowicy oraz solitetrazolowych

Metody chromatograficzne

Skład ilościowy i jakościowy kwasów mykolowych jest charakterystyczny dla poszczególnych gatunkówprątków à analiza chromatograficzna kwasów tłuszczowych wyizolowanych ze ściany komórkowej

Metody genetyczne

Hybrydyzacja kwasów nukleinowychPCRà amplifikacja in vitro wybranych odcinków genomu

D i a g n o s t y k a b a k t e r i i b e z t l e n o w y c h

TlenowceWzględne beztlenowce – to najliczniejsza grupa bakterii chorobotwórczych dla człowieka, np. E. coli, S.aureusBeztlenowce

o Ściśle bezwzględne beztlenowce à nie są zdolne do wzrostu gdy zawartość tlenu w atmosferzeprzekracza 0,5% (np. Clostridium haemolyticum)

o Umiarkowane bezwzględne beztlenowceà troszkę większa tolerancja na tlenMikroaerofile à wymagają tlenu jako końcowego akceptora elektronów, jednak jego stężenie powinnobyć obniżone (5%) (np. Campylobacter jejuni)

chorobotwórczość beztlenowych laseczek sporujących należących do rodzaju Clostridiumo tężec, zgorzel gazowa, botulizm

izolacja i identyfikacja bakterii niesporujących jest trudniejsza, gdyż są one bardziej wymagające, jeślichodzi o warunki hodowli, niż bakterie Clostridium

© Copyright by $taś

- 3 -

Aby umożliwić izolację beztlenowców z materiałów klinicznych muszą być spełnione następujące warunki:o Pobieranie i przesyłanie materiału musi odbywać się w warunkach beztlenowych lub przy

ograniczonym dostępie tlenuo Posiew powinien odbywać się pod osłoną gazu obojętnego, bądź przy krótkotrwałym wystawieniu

na działanie powietrzao Podłoża używane do hodowli powinny być świeżo przygotowywane lub przechowywane w

warunkach beztlenowycho Należy zastosować odpowiednią metodę hodowli, która powinna być prowadzona w mieszaninie

gazów obojętnych przy równoczesnej kontroli warunków beztlenowycho Izolacja kolonii musi być wykonana przy jak najkrótszym wystawieniu na działanie powietrza

Pobieranie i transport materiałówo Materiał do badań może pochodzić z zakażeń toczących się w zamkniętych jamach ciała, z ropni,

materiałem do badań mogą być też skażone pokarmyo Próbki z tych miejsc pobiera się przez aspirację, a nie przez wymazy, aby uniknąć skażenia ich przez

bakterie tlenowe.o Transport

§ Technika otwarta transportu polega na umieszczeniu materiału w szerokiej probówce zCO2, zamkniętej szczelnie gumowym korkiem

§ Częściej stosowaną i prostszą metodą jest tzw. technika zamknięta à wprowadzeniemateriału ze strzykawki przez gumowy korek do fiolek wypełnionych wolnym od tlenugazem (CO2, N2) i specjalnie przygotowanym podłożem do wzrostu beztlenowców

Preparat bezpośrednio Po dostarczeniu materiału do laboratorium wykonuje się preparat bezpośredni barwiony metodą

Grama. W preparatach należy zwracać uwagę na:§ Nieregularnie barwiące się, pleomorficzne, Gram-ujemne pałeczki: Bacteroides§ Cienkie, ostro zakończone Gram-ujemne pałeczki zawierające często ziarnistości:

Fusobacterium§ Duże grube i drobne Gram-dodatnie laseczki ze sporami w środku: Clostridium§ Cienki i nitkowate, bądź grube maczugowate Gram-dodatnie laseczki: Bifidobacterium,

Corynebacterium, Propionibacterium, Ramibacterium, Catenaebacterium§ Gram-dodatnie ziarenkowce, tworzące dwoinki lub łańcuszki: Peptococcus,

Peptostreptococcus§ Drobne Gram-ujemne ziarenkowce: Veillonella

Posiew materiałuo Żeby usunąć tlen z podłoża w którym mają rosnąć należy najprościej zagotować pożywkę, a

następnie ją szybko ochłodzićo Wprowadzenie materiału do pożywki i przykrycie warstwą jałowej parafinyo Preferowaną metodą jest hodowla w anaerostatach.o Obecnie najczęściej stosowane są naczynia, w których atmosferę beztlenową uzyskuje się na

drodze chemicznejo Podłoża z wysianymi materiałami inkubuje się przez 48 godzin.o Obecnie polecanym podstawowym podłożem do hodowli bakterii beztlenowych jest półpłynne

podłoże tioglikolanowe wzbogacone witaminą K i heminą

Identyfikacja beztlenowcówo W przybliżonej diagnostyce bakterii beztlenowych posługujemy się skróconymi schematami

identyfikacyjnymi.o W zasadzie u wszystkich beztlenowców należy dokładnie opisać:

§ wygląd kolonii§ zachowanie ich w promieniach UV§ zmiany w podłożu wokół koloni (depresja podłoża, pęknięcia agaru, hemoliza)§ określić morfologię komórek§ określić barwliwość wg Grama,§ zbadać wytwarzanie katalazy§ zbadać fermentację niektórych węglowodanów

© Copyright by $taś

- 4 -

T e c h n i k a b a r w i e n i a m e t o d ą G r a m a :

Sposób barwienia

1. na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanieść bakterie i po ewentualnym dodaniu płynu fizjologicznegowykonać rozmaz

2. szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wyschnięcia, po czym preparat utrwalić przez trzykrotneprzesunięcie nad płomieniem palnika

3. utrwalony preparat zalewać nad rynienką roztworem fioletu krystalicznego4. odczekać 60 sekund5. tryskawką delikatnie zmyć barwnik6. zalać preparat jodyną lub płynem Lugola7. odczekać 30 sekund8. ostrożnie odbarwić całość w etanolu przez ok. 10-20 sekund9. spłukać preparat wodą10. dobarwić innym barwnikiem, np. safraniną czy fuksyną zasadową przez ok. 30 sekund11. dobrze spłukać preparat wodą i oglądać pod mikroskopem

Mechanizm barwienia

Komórki bakteryjne, zarówno gramdodatnie, jak i gramujemne, zabarwiają się fioletem krystalicznym.Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksyzłożone z barwnika i jodu. Na tym etapie obydwa typy komórek mają zabarwienie granatowe.Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram-dodatnich następuje zmniejszenie pustej przestrzeni wwielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu (ok. 50) nałożonych na siebie siatek. Wrezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie mogą ulec wypłukaniu, co w przypadku 1-2 warstw ubakterii Gram-ujemnych nie jest przeszkodą i alkohol świetnie wypłukuje barwnik.Po zakończonym płukaniu komórki Gram-dodatnie są granatowe, zaś Gram-ujemne – bezbarwne.Dodatkowy barwnik (np. safranina, fuksyna) dobarwia, niezbyt mocno, komórki Gram-ujemne, nie zmieniającbarwy komórek Gram-dodatnich.

Efekt barwienia Grama

W efekcie wyżej przedstawionych działań i opisanego mechanizmu komórki efekty mogą być trojakie:bakterie barwią się na kolor ciemno-fioletowy, prawie czarny, określamy jako Gram-dodatnie lub (Gram +)bakterie barwią się w kolorze czerwonym, określamy jako Gram-ujemne lub (Gram -)bakterie nie barwią się w ogóle metodą Grama