INFORME FINAL.

+d-BS L u i s Manuel I n c i á n Jiménez

/ NOMBRE:

TELEFONO:

MATRICULA:

CLAVE:

JCARRERA :

557-26-35

81336114

23.3.57.86

I N G . BIOQUIMICA INDUSTRIAL

TRIMESTRE : 8 8 - 1

HORAS SEMANA: 30

LUGAR DONDE SE LLEVO A CABO: S u b s e c r e t a r í a de servicios

de s a l u d - d i r e c c i ó n g e n e r a l

d e e p i d e m i o l o g í a . S e c c i 6 n - L a b o r a t o r i o Nacional de Re

f e r e n c i a . -

FECHA DE I N I C I O :

/FECHA DE TEMINO:

/NOMBRE DEL TUTOR:

PUESTO:

ADSCRIPCION :

/TITULO DEL PROYECTO:

ALUhlNO :

TUTOR:

13 de J u l i o de 1987

15 de E n e r o de 1988

Miguel S a l c e d o B e c e r r a .

Químico Analista

Departamento de Medicamen-

t o s .

I d e n t i f i c a c i ó n de Gentami-

c i n a por c r o m a t o g r a f í a e n

c a p a f i n a .

J

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... I .

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.. .

, .-

INFORME FINAL

TITULO : I d e n t i f i c a c i b n de g e n t a m i c i n a p o r c r o m a t o g r a f í a e n capa f i n a .

INTRODUCCION :

La g e n t a m i c i n a es un a n t i b i ó t i c o aminoglucós ido d e s c u b i e r t o y

d e s a r r o l l a d o por l a S c h e r i n g Corporat ion,E.U.A. producido p o r l a - fermentac ión de l a Micromonospora p u r p u r e a , p e r t e n e c i e n d o a un g r u - PO de microorganismos d e l c u a l nunca s e - h a b í a a i s l a d o ningún a n t i -

b i b t i c o empleado e n m e d i c i n a humana.La g e n t a m i c i n a es un c o m p l e j o de a n t i b i b t i c o s formado p o r tres componentes: g e n t a m i c i n a C1, g e n t a - m i c i n a C l a y g e n t a m i c i n a C2, en forma de l a sa l s u l f a t o ; l o s d i v e r - sos componentes C se e n c u e n t r a n en l a s i g u i e n t e proporcibn:C1=25 a 50%, Cla=15 a 408, y C2=20 a 5 0 % , los c u a l e s son de d i f e r e n t e for- ma,pero son similares a Kanamicina C , su e s t r u c t u r a c o n t i e n e 2-De0 - x i e s t r e p t a m i n a formada p o r d o s unidades de s a c b r i d o s , s i e n d o estas garosamina y una purpurosamina e n l a s series de g e n t a m i c i n a C ; s u

e s t r u c t u r a es l a s i g u i e n t e :

Las p r u e b a s i n v i t r o han demostrado que l a g e n t a m i c i n a es un a n t i b i ó t i c o b a c t e r i c i d a que actúa i n h i b i e n d o l a s i n t e s i s p r o t e i c a e n microorganismos s u s c e p t i b l e s . E s ac t iva f r e n t e a una ampl ia v a r i e d a d

de bacterias g r a m n e g a t i v a s y g r a m p o s i t i v a s , i n c l u y e n d o E s c h e r i c h i a c o l i , P r o t e u s ~ . ( i n d o l e p o s i t i v a s e indolenegativas),Pseudomonas a e r u g i

I_ n o c a , - especies d e l grupo Klebsiella-Enterobacter-Serratia, C i t r o b a c -

- - . I

INFORME FINAL

incluyendo cepas resistentes a l a p e n i c i l i n a y m e t i c i l i n a ) y Ileisse- r i a gonorrhoeae. La gentamicina es también a c t i v a i n vitro contra es - p e c i e s de Salmonella y ShigelAa.

E l medicamento se usa pr incipalmente en l a s in f e cc i ones d e l - t r a c t o urinario,neumonia y sept i cemia . La gentamicina es muy so lub l e

en agua; so lub l e en p i r i d i n a , en medio á c i do con formación de sa l es , moderadamente so lub l e en metanol ,etanol , acetona y practicamente i n - s o lub l e en benceno e hidrocarburos hal3genadc.s. Puede causar lesión en e l oc tavo par, pr incipalment- veE-tibular s i l a función r ena l e s t a disminuida o s i l a d o s i f i c a c i ó n es a l t a o prolongada.El vertigo pue- de ser e l pr imer s i gno d i ototoxmcidad y debe suspenderse e l medica-

mento.

-

Los primeros c raba j os r e a l i z a d o s con este an t -b i ó t i co fueron - l a s pruebas de s ens ib i l i da6 ; e l método de suscep t ib i l i dad con d i s c o

d e s c r i t o p o r Bauer et. a l . se fundamenta en que un d i s c o de l0mgr. - de gentamicina deber ía produc i r una zona de inh ib i c i ón de 13m. o - más para i n d i c a r sus c ep t i b i l i d ad d e l organismo in f e c tan te .

Poster iormente se h i c i e r o n t r aba j o s con cromatograf ía de capa - f i n a para l a i d e n t i f i c a c i ó n d e l a n t i b i ó t i c o en e l año de 1968 por Ge

ralH. Wagman, Janet V. B a i l e y y Morton M. Miller usando una f a s e muy l e n t a de un sistema de so l v en t es compuestos por cloroformo, metano1

y una mezcla de 1 7 % de h id rox ido de amonio (2:l:l v/v); despues d e l

d e sa r r o l l o , l a s bandas que contienen e l a n t i b i ó t i c o son t ra tadas con un agente de n inh idr ina para r e v e l a r e l desplazamiento de los compu-

e s t o s de l a gentamicina y a s i concluir l a i d e n t i f i c a c i ó n .

-

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r' I L.

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6

t- I L.

...

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INFORME FINAL

GENERALIDADES

CROMAT OGRAF I A

Se denomina c r o m a t o g r a f í a a un p r o c e d i m i e n t o , e n e l c u a l una

s o l u c i 6 n de s u s t a n c i a s a separar se d e s p l a z a en una d i r e c c i ó n prg

determinada por una d i s p o s i c i ó n de a p a r a t o s , p o r medio de una ma- t e r i a s ó l i d a , i n s o l u b l e , i n o r g d n i c a u o r g d n i c a , mas o menos f i n a -

mente repartida, s i e n d o r e t e n i d o s l o s componentes e n medida i n d i - v idualmente d i s t i n t a s . Como mecanismos fundamenta les han de t e n e r - se e n c u e n t a e l r e p a r t o e n t r e dos fases l í q u i d a s , a s í como l a u n i - 6n reversible de l a s c o m b i n a c i o n e s que se d e s p l a z a n a l a s u p e r f i -

c ie d e l a d s o r b e n t e , s i se t r a t a p r i n c i p a l m e h t e de i n t e r a c c i o n e s s u p e r f i c i a l e s f ís icas, se habla de c r o m a t o g r a f í a de a d s o r c i b n . En

caso de l a cromatografía de canje ionmco, se l l e g a a l a formación reversible de a u t e n t i c a s heteropolares c o m b i n a c i o n e s q u í m i c a s en- tre l a combinación que se d e s p l a z a y e l a d s o r b e n t e en este caso, éstos se p r e s e n t a n como i o n e s con cargas d i s t i n t a s . 8 n l a practica

l a mayoria de las veces se t r e t a de una combinación de cromatogra - f í a de a d s o r c i b n , de c a n j e i ó n i c o y de reparto, dominando más o menos uno u o t r o t ipo.

TECNICA GENERAL DE LA CROMATOGRAFIA DE CAPA F I N A

Para o r i e n t a c i b n , se da a c o n t i n u a c i ó n una corta i n t r o d u c c i - ón a l a t é c n i c a - n o r m a l i z a d a de l a cromatografla de c a p a f i n a como se desarral lo por S t a h l .

2Ocm. con una capa de a d s o r b e n t e de 2 5 0 p de grosor. Las s u s t a n c i - as a separar, d i s u e l t a s , se a p l i c a n con una micropipeta a una d i s - t a n c i a de aproximadamente 1.5cm d e l borde i n f e r i o r de l a placa de

vidrio . Después de l a e v a p o r a c i ó n d e l d i s o l v e n t e se c o l o c a n l a s

placas en una camara de s e p a r a c i ó n adecuada, que c o n t i e n e e l e l u -

y e n t e apropiado hasta una a l t u r a de unos 0.5cm. Antes se h a p r o c u

rad0 que l a atmosfera de l a cdmara esté s a t u r a d a con vapor d e l e-

l u y e n t e . E l e l u y e n t e -que también se denomina medio de e l u c i Ó n , d i - s o l v e n t e , m e z c l a y medio de desarrollo- avanza e n e l caso de l a cromatografía monodimensional a s c e n d e n t e , que se emplea l a mayor

Se cubren l a s placas de v i d r i o de formato 1 0 x 2Ocm. o 2 0 x

-

C.

INFORME FINAL

pa r t e de l a s veces, sobrepasando l a mancha de o r i gen . Las d i f e r e n t e s

sustanc ias de 13 so luc ibn apl icada, son arrastradas con ve loc idades

d i f e r en t e s , formandose zonas de sustancias. Esta separacidn se puede

produc i r po r procesos de adsrción, reparto , intercambio i bn i co , o p o r una combinacidn de e s t a s pos ib i l i dades .

Despues de que e l f r e n t e d e l e luyente ha r e c o r r i d o un t r a y e c t o su f i c i en t e (p. e j . , 1 0 cm desde l a l í n e a de o r i g en ) s e saca l a p laca

de l a camara y se seca. Las sustancias separadas, se comprueban en

forma adecuada; sustanc ias co loreadas se pueden ver inmediatamente, algunas combinaciones f luo rescen o absorben en l a luz U.V., o t r a s se hacen v i s i b l e s asper jándolas con r e a c t i v o s de comprobación, po r ejem - p l o se reconocen los aminoácidos como en caso de l a cromatogra f ía en pape l po r l a reacc i6n de n inhidr ina. Como venta ja de l a cromatogra - f í a de capa f i n a sobre sustanc ias de capas i n o r g h i c a s se ha de con- s i d e r a r e l hecho, que para l a comprobaci6n también pueden emplearse r e a c t i v o s a g r e s i v o s y condic iones que, destrozan e l pape l , por ejem- p l o á c i do sulfúrico concentrada O ác ido sulfocr6mico y a continua - ción ca lentamiento a 150OC.

CARACTERISTICAS IMPORTANTES DE UN CROMATOGRAMA Cada adsorbente solo puede adsorber cantidades l imi tadas . En ge -

nera l . l a e x i s t e n c i a de pocos lugares ocupados en l a s u p e r f i c i e d e l adsorbente, supone una no tab l e disminucidn de l a fuerza de adsorci6n

porque los s i t i os más a c t i v o s son ocupados en primer lugar.

zonas "vac ias" . S i e l e luyen te cont iene una sustancia capaz de ser adsorbida con mayor in tens idad que l a s sustancias a separar, y s i es t a s además son semejantes: químicamente y en su a f i n i dad con r espec to

a l adsorbente (p. e j . , los miembros de una serie hom6loga),entonces los componentes d e l sistema r i v a l i z a n po r los mismos lugares de ad - corc ion de t a l forma, que l a s zonas de sustancias en e l cromatograma se suceden s i n d e j a r zonas "vacias".Con t a l e s procesos de desplaza - miento hay que contar siempre en l a c ronatogra f la de adsorción, que se cromatogra f fa una mezcla de v a r i a s sustancias. Por eso,aquf , l a s ve loc idades da desplazamiento dependen mucho más de l a s impurezas

En genera l l a s diversas zonas de sustancias están separadas por

-

"

INFORME FINAL

que en e l caso .de l a cromatogra f la de reparto .

se desplaza en gene ra l más rápidamente que los ibnes inorgánicos.Es - tos ademds, poseen ve l oc idades de desplazamiento d i f e r en t e s .

En so luc iones acuosas de s a l e s inorgánicas , e l f r e n t e acuoso

Ejemplos de a n á l i s i s de e luc ibn, de desplazamiento y f r o n t a l ,

considerados como l a s tres p r i n c i pa l e s formas geométr icas de los - cromatogramas, se encuentran en los tres t i p o s f ís icos de cromato - g r a f í a , es d e c i r , en l a cromatogra f ía de adsorción, de can je i ó n i c o

y de reparto .

SELECCION DE ADSRBENTES Y ELUYENTES En l a cromatogra f la tenemos un cisbema de tres componentes co-

mo mSnimo -adsorbente, medio de elución y compuesto cromatograf iado

-. E l comportamiento c romatogrd f i co depende tanto d e l adsorbente co - mo d e l medio de e luc i6n.Entre ciertos límites, se puede p r ede c i r - qué adsorbentes y medios de e luc ibn son apropiados para l a cromato- g r a f í a de una determinada sustancia. Generalmente, en caso de sus - t anc i a s determinadas, para un adsorbente fuerte ( a c t i v o ) se requie- re e l correspondiente d i s o l v e n t e de fuerte poder de e luc ibn, y vice - versa .

a) Adsorbentes En l a c romatogra f ía de adsorc ión se emplean como adsorbentes

casi s i n excepcidn, óx idos , óx idos h idratados o sa les . Las sustan - c i a s adsorbidas, adsorbatos, son combinaciones po l a r e s o p o l a r i z a - b l es . En genera l , es tán l i g a d a s a l a s u p e r f i c i e d e l adsorbente po r medio de fuerzas e l e c t r o s t á t i c a s , l a s cuales también son responsa - b l e s de l a cohesión de l a red c r i s t a l i n a .

Centros a c t i v o s de adsorción son, po r l o tanto , a r i s t a s , sec - c i ones de rotura , ángulos y lugares de fectuosos de l a s u p e r f i c i e , en los que los i ónes e s tán más o menos a l descubierto.Las s e r i e s pa ra los adsorbentes, ind icadas e n l a t a b l a 1, fueron es tab l e c idas em

pír icamente. Por l a s t ens i ones e l é c t r i c a s s u p e r f i d i a l e s se inducen momentos

d i po l a r e s en l a s combinaciones no po la r es , o se i n t e n s i f i c a n los mo mentos d i po l a r e s ya e x i s t e n t e s en combinaciones po lares .

As í , pues, l a unión del adsorbato a l a s u p e r f i c i e d e l medio de

- -

-

INFORME F I N A L

adsorcidn está producida po r fuerzas ion-dipolo o d ipo lo -d ipo lo

respectivamente. En caso extremo l a po l a r i z a c i bn puede conducir a l a i on i zac idn de l a s moléculas adsorbidas.

LOS puentes de hidrógeno pa r t i c i pan a menudo de l a unidn

entre e l adsorbente y l a sustancia adsorbida. Las moléculas, que

forman puentes de hidrógeno internos , se adsorben más d6bilmen-

t e en s i l i c a g e l , dx ido de aluminio hidratado, que los compues - tos isdmeros que no poseen e s t a s propiedades.Además los puentes de hidrdgeno in f luyen en l a mobi l idad en t r e l a sustancia y e l - e

Luyente. Los adsorbentes r e f e r i d o s en l a t a b l a 1 se unen e s p e c i a l -

mente b i en con e l agua y los a l coho l e s inferiores. Por eso son apropiados como medio de e l u c i ón para combinaciones fuertemente adsorbidas. Es recomendable probar siempre v a r i o s adsorbentes. En caso de l a cromatogra f ía de capa f i n a se optará pr imero por v a r i a r los e luyen tes antes de cambiar e l adsorbente.

b ) Eluyentes

un adsorbente dado, depende d e l medio de e luc ibn empleado, se pueden obtener series con poder de e luc ibn c r e c i en t e llamadas series e iuó t ropas , vease t a b l a 2. Estas series son de gran ayu- da para l a elección d e l e luyente adecuado.

Las mezclas de dos o tres d i so l v en t es de po la r idad d i s t i n - t a , muchas veces dan mejores separaciones que e luyentes química - mente uniformes. Estos e luyentes de v a r i o s componentes, se pue- den ordenar también en series e luótropas . A s í aumenta por ejem-

p 1 ~ con bastante r egu la r idad l a acc ión e luyente en l a serie; e- ter de p e t r d l e o con cant idades crecientes íi0,20,50%) de bence- no; benceno, mezclas de benceno con cant idades c r e c i en t e s de e- t ano l (2,5,10,20%). Todas e s t a s s e r i e s son vá l i da s solamente pa ra adsorbentes h i d r ó f i l o s , no para los carbonos hidrófobos.

Como l a v e l o c i dad de desplazamiento de una combination en

-

c) Comportamiento cromatográ f ico

S i l a s sustanc ias a separar solvente no acuoso poca a f i n i dad

mica. de adscrrción y const i tuc ibn qu í -

poseen l a adsorcibn con un d i -

por los adsorbentes h i d r ó f i l o s

INFOiUáE FINAL

usuales, entonces se t r aba j a r á con un adsorbente fuerte y e luyentes

d éb i l e s , es d e c i r , los que están a l p r i n c i p i o de l a serie e lubtropa Po r l o ccmtrar io , se emplearán adsorbentes d é b i l e s y e luyentes fuer - tes cuando l a a f i n i d a d de adsorcibn de l a s combinaciones es grande.

Poe esto es muy fmportante saber que c a r a c t e r l s t i c a s qulmiooconsti- tuc i ona l e s i n f l u y en en l a fue r za de unión po r adsorcibn. Los p r i n c i p a l e s criterios que r i g e n esto se indican a continuación:

1.- Ins hidrocarburos saturados son poco o nada adsorbidos. La introduccidn de en laces dob les aumenta l a a f i n i dad de adsorcibn,tan

to más, cuando mayor es su n h e r o y más t odav ía s i están conjugados Con l a fntroducc idn de en laces dobles, especia lmente en laces dobles

conjugados, aumenta l a f a cu l t ad de po l a r i z a c i ón de l a s moléculas y

con esto l a fue r za de l a unión adsorbida a l a s u p e r f i c i e de los ad-

sorbentes h i d r ó f i l o s .

-

-

2.- S i se introducen grupos func iona les en un h idroc lo ruro , au

menta generalmente l a a f i n i dad de adsorcibn, pudiéndose observar l a s i gu i en t e serie de adsorcibn descendente:

-

-COOH

-CONH2

-OH -NHCOCH3

-NHZ

-OCOCH3

-N(CH ) 3 2 -NO2

-OCH3

-H

-c1 Las combinaciones c a rbon í l i c a s se adsorben más débilmente que

l a s h f d r o x f l i c a s y amlnlcas. Los grupos C-metilo están s i n una in-

f l u e n c i a e spe c i a l . Es tas r e g l a s de sus t i tuyentes se han deducido d e l comportamiento c romatogrd f i co de combinaciones aromáticas. En

combinaciones saturadas son p o s i b l e s a l t e r a c i one s en e l orden i n d i cado, po r e jemplo , e l orden de los grupos h i d r o x i l o y amino se in- v i e r t en . Pueden observarse i r r egu la r idades , cuando entre l a sustan c i a y e l d i s o l v e n t e pueden formarse puentes de hidrdgeno intermole culares . Esto o r i g i n a una mayor movi l idad.

-

- -

. INFORME FINAL

SULFATO DE GENTAMICINA -

”. .

INTRODUCC ION : En a b r i l de 1969, se da a conocer un nuevo ant ibibt ico,Garamici -

na inyec tab le , que es introducido por los l abo ra to r i o s Schering para

su uso genera l en los Estados Unidos. En e l año de 1963 se a i s l o por primera vez e l a n t i b i b t i c o y se

h i c i e r on los pr imeros - repor tes en l a l i t e r a t u r a . Tuvieron que pasar seis años desde su descubrimiento para que los cientif icos pudieran eva luar a fondo su po t enc ia l , a s í como sus l imi tac iones , para que l a droga e s tuv i e r a o f i c i a lmen t e l i s t a para su d is t r ibuc ibn.

Hoy en d í a , e l s u l f a t o de gentamicina es conocido como Garamici - na inyec tab le , que es una so luc idn acuosa estér i l , l a cual se puede adminis trar por v i a intramuscular o intravenosa; gran pa r t e es cono-

c i d a por su espectro bac t e r i c i da y su e f i c i e n c i a , a s í como su e f i c i - enc ia c l i n i c a , farmacolbgica y su potencial de toxicidad.En los s i - guiente siete años despues de l a introduccidn en los Estados Unidos, 1a.Garamicina inyec tab l e fué usada en más de 4,000,000 de pac ientes y l a droga fué su j e ta a más de 6500 publ icac iones y 29 simposium in - t e rnac iona les .

PERSPECTIVA HISTORICA: Los mejores a n f i b i b t i c o s con que se contaba para e l tratamiento

de i n f e c c i one s s e r i a s de bac t e r i as gram negat i vas eran Kanamicina y Co l i sp id ina ; como siempre, surge una comparacidn con estos agentes bac t e r i c i das , se demostr6 i n vitro l a act ivadad d e l nuevo a n t i b i ó t i - co, s u l f a t o de gentamicina, probando una basta super ior idad, s iendo Gnica su e f e c t i v i d a d contra Pseudomonas, Proteus y Staphylococcus.

Estudios c l í n i c o s , reportados en P a r i s en 1967, mostraron que t an t o i n vivo como i n v i t r o , l a gentamicina e r a verdaderamente Gnica y su e f e c t i v i d a d bac t e r i c i da e r a sorprendente en una gran var iedad de i n f e c c i one s c l i n i c a s causadas por bac t e r i as suscept ib les , y fu6 esp especia lmente usada para tratamientos de pac ientes severamente e n f e r - mos .

INFORME FINAL

pora

Espectro de Garamicina inyectable

- E s c h e r i c h i a c o l i - Pseudomonas aeruginosa - Proteus (indole positiva3 - Proteus (indole negativa) - Klebsiel la species - Enterobacter species - Serratia. 'species

- -

La g e n t a m i c i n a es un a n t i b i d t i c con in i

.

.

Fuente microbiana de antibidticos

.

b l i t o espectro de a c - tividad. Fué e l primer *antibiótico ú t i l a l ser producido por e l gene - ro Micromonospora. Este genero pertenece a i orden Actinomycetales, que incluye tambien a l genero Streptomyces, un genero que ha sido responsable de l a produccibn de muchos otros importantes ant ib ib t i - cos. S i n embargo, solo 16 especies del genero Micromonospora ha sido reconocido, comparado con l o s más de 4 0 0 especies de Stteptomyces que han sido reportados para producir ant ibibt icos .

I

I Eumycetes (hongos) 1

I S c h i z om' ce tes Hongos inper f e c tos

Eubacde r i a l e 6 . A c t inom4cetales F40ni 1 i a l e s

I I I Bacii iacea

Baci l lus

c o i i s t i n a '

gramicidina

I

Aspergilliacea 1

I Streptomycetacea I Micromonos Penidillium strepkomyces I -

t e t r a c i c l i n a (micromonos g r i seo f ulvina porina)

* . ' .

INFORME FINAL

B a c i l l u s S t rept omyce s Micromonospora P en i c i l l i um

bac i t rac ina cloramfenicol everninomicina fumagi l ina .. po l im ix ina neomicina gentamicina

e r i t r omic ina

kanamicina i u c o m i c i n a tobramicina

Especi f icamente, l a gentamicina prov i ene de l a fermentacibn de e l organismo Micromonospora purpurea, ex cual se encuentra en e l l o - do del fondo de algunos l a go s y en ciertos depbs i tos de suelo. E l

cult ivo ael organismo produce un pigmento c a r a c t e r i s t i c o parec ido a

l a genciana, por l o cual e l a n t i b i b t i c o de gentamicina toma de aqui

e l nombre. La f a m i l i a Micromonospora posee c a r a c t e r i s t i c a s únicas l a s cua -

les hacen que su d e s a r r o l l o y propagación se d i f i c u l t e . Por ejemplo,

Micromonospora r equ i e r e de 30 dSas para formar una co lon ia , mientras

que Streptomyces solo r equ i e r e de 5 a 7 d í a s para su formacibn.

en c u l t i v o sumergido l a gentamicina y co-productos, que son e x t r a i - dos por e l uso de r e s inas de intercambio ca t i6n ico . Sa les bás icas de los co-productos son prec ip i tadas , y l a gentamicina r e su l t an t e

queda en l a superficie d e l c u l t i v o como una nata, l a cual es con - centrada y secada para producir l a base de gentamicina. La gentami - tina puede ser i d e n t i f i c a d a y d i s t ingu ida de o t r a s rec inas e x t r a i - das por medio de una cromatograf ía.

~Cbrno se forma l a gentamicina?. Micromonospora purpurea,forma

QUIMICA : La es t ruc tura qulmica de l a gentamicina es muy s i m i l a r a l a de

estreptomic ina, kanamicina y neomicina. En l a s cuatro estan conteni - das dos moléculas de amino-azucares en su estructura y po r l o t an t o son c l a s i f i c a d a s como "an t ib i ó t i coas aminoglucocidos". Sin embargo, en ad i c i ón a los dos amino-azucares, l a gentamicina,kanamicina, neo - micina y tobramicina contienen un tercer amino-azucar, deoxyestrep-

INFORME FINAL

tamina, y por l o t a n t o se refiere a e l los como " an t i b i b t i c o s deox i - estreptaminas". La es t ruc tura química de cada a n t i b i d t i c o se mues - t r a en. l a s i gu i en t e t ab la :

ANT IBIOTICO FERMENTACION POR ESTRUCTURA MOLECULAR

Streptomyces griseus

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E s t reptomicina 3 estructuras a ) e s t r ep t i d i na b ) es t rep tosa

c) N-metil-L-glucosa -

Neomicina S t re ptomyce s 5 es t ruc turas f r a d i a e a ) 2 -deoxiestreptamina

b ) amino c i c l o h e x i t o l c) diamino hexosa (2mole

d) pentosa

culas )

Kanamicina Streptomyces 3 estructuras

kanamyceticus a ) 2-deoxiestreptamina b ) 3-D-glucosamina (ka -

c) 6-D-glucosamina nosamina)

Gentamicina Micromonospora 3 es t ruc turas purpurea a ) 2-deoxiestreptamina

b ) gentosamina ígaroca -

c) purpurosamina mina)

Tobramicina Streptomyces 3 estructuras t enebrar ius a ) 2-deoxiestreptamina

b ) 3-amino-3-deoxi-D-

glucosa c) nebrosamina

INFORME FINAL

La gentamicina tiene l a s s i gu i en t e s propiedades f í s i c a s :

su punto de fus ión se encuentra en t r e 102% y 108OC. Su peso mole- c u l a r es 543. La gentamicina es extremadamente so lub le en agua y

en po l a r e s medios como, l a p i r i d i n a y d i m e t i l formamida. Es so lu - b l e en ác idos medios con formacibn de sa l e s ; es moderadamente solu - ble en metanol, e t ano l y acetona. Es, sirl embargo, inso lub le en e- ter, benceno e hidroc-arburos halogenados.

d e t e r i o r a en almacen, r e f r i g e r a c i ó n o en cuartos con temperatura

controlada. Es resistente a agua h i r v i endo por 30 minutos, y auto- c l a v e s po r 20 minutos. Soluciones acuosas no requieren de r e f r i g e -

rac ión.

La gentamicina es uno de los a n t i b i b t i c o s más es tab l e s . No se

E l s u l f a t o de gentamicina, cont i ene de 50 a 67% de gentamici-

na y de '29 a 38% de i o n su l f a t o . E l pH en solución acuosa conteni- endo 40 mg/ml no debe t ene r menos de 3.5 y no más de 5.5.

MICROBIOLOGIA La a c t i v i d a d ant ibac te r iana de l a gentamicina se ex t i ende a

más organismos gram-negativos de s i g n i f i c a n t e importancia c l í n i c a

e inc luye Pseudomonas aeruginosa, Escher ich ia co l i , e igualmente de indo l e -pos i t i va Proteus (P. - r e t t g e r i , P . - morgani i ) e indole-nega - t i v a Proteus (P. - m i r a b i l i s ) , tan b i en como, K l e b s i e l l a , Enterobac- ter y S e r r a t i a spec i es .

C i e r t a s bac t e r i a s gram-positivas, e n t r e l a s cuales estan- - Sta phylococcus aureus y Staphylococcus ep idermid is , entran en e l es - p e c t r o de l a gentamicina.

S i gn i f i c ado c l í n i c o de ciertos patbgenos:

-

Pseudomonas aeruginosa.- es un importante patbgeno, ha s i d o

impl icado en una va r i edad de i n f e c c i one s s e r i a s . Pseudomonas pneu- monia, por su pa r t e es frecuentemente f a t a l . Pac i entes con f i b r o - s i s q u i s t i c a son part icularmente suscep t ib l e s a in f e cc i ones de Pseu - domonas en los pulmones.

Espec ies Klebsiella-Enterobacter.- e s t a siendo cada vez más i m - por tante , especia lmente en in f e cc i ones en e l t r a c t o r e s p i r a t o r i o en a l c oho l i c o s . Este organismo es tambien l a causa comun de severas y

c a s i siempre f a t a l e s in f e cc i ones en pac ientes con cancer.

INFORME FINAL

Se r za t i a species.- aunque organismos de este genero han s i d o

considerados como patdgenos mínimos. S e r r a t i a spec i e s es ahora re conocido como una amenaza, especia lmente para pac ientes con can - cer; en pac ientes con o t r a s enfermedades crdnicas deb i1 i tantes ;pa c i e n t e s que han estado b a j o una c i r u g í a extensa y en pac ientes que requieren de una ca t e t e r i z a c i dn ur inar ia .

de v a r i o s grados de sever idad. Aproximadamente 80% de l a s infec - ciones d e l t r a c t o u r i n a r i o son causadas po r E.coli; puede tambien

en t r a r en e l f l u j o sanguine0 in fectando otros s i t ios y causando

sept icemia. Este patogeno ha s i d o tambien impl icado en meningui - t i s purulenta, part icularmente en per iodo neonatal y en l a infan-

c i a

-

Escher ich ia coli.- es frecuentemente impl icado en infecciones -

--

Staphylococcus aureus.- es e l mayor patogeno hoy en d ía ; es e l patógeno simple más comun desa r ro l l ado en in f e cc i ones formadas

despues de l a s c i rug í a s ; esto debido a que su rredio de propagaci-

ón es e l a i r e .

S ens i t i v i dad La a c t i v i d a d de l a gentamicina contra Bseudotnonas?aeruginosa,

Proteus ( i ndo l e -pos i t i va e indo le-negat iva ) y Staphylococcus E cies en t e r ap t a s ha demostrado t e n e r un,espectro más amplio que

e i de otros a n t i b i ó t i c o s con los que se h i z d un t ratamiento pre - vio y no se not6 me jor ia tan rfipida como l a presentada con l a u t i l i z a c i b n de l a gentamicina.

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INFORME FINAL

OBJETIVOS

1.- Buscar e l sistema de solventes apropiados para l a i d e n t i f i c a - c ibn de l a gentamicina.

2.- Comparar métodos ac tua l i zados con los reportados en l a mayo-

r í a de los a r t í c u l o s ( t é cn i ca de 19681, que es l a que se u t i l i z a en e l Labora tor io Nac ional de Re fe renc ia , ver d i f e r e n - c i a s y hacer l a s mod i f i cac iones prec i sas .

-

3.- Ver l a s f a l l a s que t i e n e e l método de l a U.S.P. y modi f i car-

l a s .

4. - Hacer v a r i a s cox r idas hasta que e l experimento sea reproduci - b l e confiadamente.

5.- Reportar e l t r a b a j o hecho.

INFORME FINAL

MATERIAL

1 Matraz a fo rado de 1 0 m l .

1 Matraz a forado de 300ml

1 Micropipeta

1 Camara de saturacibn

Cromato fo l ios de a l m i n i o con s i l i c a ge l 60 F254 (Merck) 20 x 20

cm de 0.2 m de espesor

SOLVENTES

Metano1 Cloroformo

Hidrox ido de amonio

Ace tona P i r i d i n a

REACTIVOS

Ectandar de gentamicina U.S.P. Muestra problema de gentamicina

Ninhidr ina Te t rac l o ruro de carbono Iodo

INFORME FINAL

TECNICAS

- Técnica U.S.P. 1968 -

1.- Preparar l a muestra problema y l a solución estandar pesando

aproximadamente lOOmg de muestra y 20mg de estandar t r ans f e - rir cada cant idad a un matraz a forado de 50 m l y 10 n l res- pectivamente y a f o r a r con agua des t i l ada .

2.- Sistema de cromatogra f ía de capa f ina .

a ) Usar s i l i c a ge l 60 F254 bnerck) 20 x 20 cm y 0.2 mm de

espesor. b)pPreparar l a mezcla de solventes: cloroformo/ metanol/ H i

drox ido de amonio (17% amonio), 100:100:100 v/v. Tomar 100 m i y poner los en l a camara de saturación para c r ea r una at -

mosfera uniforme.

-

3.- Usando una microp ipe ta ,co locar e l estandar y l a muestra a - proximadamente 1.5 cm a r r i ba d e l borde i n f e r i o r de l a p laca apl icando 20 u l . de muestra y estandar en l a l i n e a base de l a placa.

4.- De jar que l a s muestras ap l i cadas se sequen completamente.

5.- Colocar l a p l a ca en l a camara de saturación y d e j a r que co- rran los so l v en t es hasta tres cuartas pa r t e s de l a p laca .

6.- Sacar l a p l aca de l a camara de saturación y d e j a r que se se - que.

7 . - Ve r l a separación de l a s manchas con una lampara de luz U.V.

8.- Se puede usar so luc ión de n inhidr ina para asper ja r l a p laca en caso de que no se vean l a s manchas. La so luc ion se prepa r a de l a s i gu i en t e manera: se disuelve una pa r t e de 0.5% de n inhidr ina en acetona (25 m i ) y se adic iona una pa r t e de p i

-

-

aNFORME F I N A L

r i d i n a (25 m l ) ; se c a l i e n t a l a p laca asper jada en t r e 80 y 90°C durante 1 0 o 15 minutos. Las manchas aparecen de un color vio- l e t a .

- Técnica de los l a b o r a t o r i o s Schering - 1.- Preparar po r separado l a muestra y l a solucibn estandar pesan-

do aproximadamente 80 mg de muestra y estandar de s u l f a t o de gentamicina, t r a n s f e r i r cada cant idad a un matraz a fo rado de 50 m l respect ivamente y d i l u i r con agua des t i l ada .

2.- Sistema de cromatogra f fa de capa f i na . z a ) Usar s i lca gel 60 F254 (MercK) 20 x 20 cm y 0.2 nun de espe -

sor. b) Preparaclbn de l a mezcla de so lventes : metanol/ cloroformo

/ h id rox ido de amonio fuerte ( 2 8 % de amoniol, l O O / l O O / l O O

v/v. Tomar 1 0 0 m l de l a mezcla y c o l o ca r l o s en l a camara de saturacibn; d e j a r que los vapores creen una atmosfera - u niforme y en e q u i l i b r i o .

3.- Usando una microp ipe ta c o l o ca r 20 u1 de muestra y de estandar aproximadamente 1.5 cm de l a l l n e a base de l a p l aca y separa- das en t r e s i aproximadamente 1 cm.

4.- Las muestras co locadas aparecen como unas pequeñas manchas que hay que d e j a r que se sequen completamente.

5.- Introducir l a p l aca en l a camara de saturacibn, l a cual se de - j b que se sa turara 2 horas aproximadamente, y se d e j a correr hasta que los s o l v en t e s l legen a l a s tres cuartas pa r t e s de l a placa.

6.- Sacar l a p l aca de l a camara de saturacibn y d e j a r que se ce- que hasta que los vapores de amoniaco cean impercept ib les .

7.- Para d e t e c t a r l a s manchas de l a muestra y e l estandar se usa

INFORME FINAL r .

otra camara de saturacien, l a cual contiene 1% de iodo en tetraclo - ruro de carbono, e l cual ha sido calentado a 105oC para remover e l

exceso de iodo, se coloca l a placa y se espera aproximadamente 2 0 r minutos, se r e t i r a l a placa y se pueden observar l a s manchas, l a s

cuales aparecen de un color casi cafe mientras que toda l a placa

.- se ve de un color amarillo.

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INFORME FINAL

RESULTADOS

A l e s t a r cumpliendo con e l requisito de l servic io socia l en l o s Laboratorios Nacionales de Referencia d e l sector salud pude observar que se tenian problemas con e l método disponible para ident i f i car e l sul fato de gentamicina, por l o que se empez6 a recabar información para ver que modificaciones se l e podia hacer a dicha técnica. Casi toda l a informaci6n recopilada se remonta a l o s primeros trabajos re - alizados en e l año de 1968 por G r a l H. Wagman, e t . a l . por l o que i-

nicialmente se propuso para modificar l a técnica e l hacer pruebas de solubilidad d e l sul fato de gentamicina para modificar l o s solventes empleados. Se comprobb que e l sulfato de gentamicina es muy soluble en agua , metanol,cloroforno,acetona;es poco soluble en etanol y

practicamente insoluble en benceno y en hidrocarburos halogenados.

opto por modificar l a s concentraciones de l o s solventes que bienen en l a técnica de Wagman y l o s experimentos se fuer6n realizando de l a manera siguiente : EXPERIMENTO # 1

Teniendo en cuenta los resultados de solubilidad anteriores se

Se s i g u i 0 a l p i e de l a l e t r a l a técnica de Wagman que es l a mis - ma que reporta l a U.C.P. y no se obtuvb una apreciaci6n c lara de l o s componentes del sul fato de gentamicina ya que, a simple v i s t a no se apreciaba ninguna mancha que se separara de l a muestra y e l estandar tampoco presentaba una separacidn de sus componentes; se observó e l cromatograma con ayuda de una lampara de l u z u l t r a violeta y se veía que l a s muestras y e l estandar hablen tenido un desplazamiento desde l a l ínea base hasta mas o menos l a mitad del croaatograma, pero l a s manchas que aparecían eran uniformes a l a misma al tura pero no se d i

ferenciaba ninguna otra mancha que nos pudiera indicar l a separation

de alguno de los t r e s componentes de l a gentamicina; esto ocurriá i n - cluso con e l estandar, cosa que no,deberla de haber sucedido ya que por l o menos e s t é debiá de presentar l a separacidn de los componen - t e s aiel sul fato de gentamicina. Se puede apreciar esto en e l siguien - t e dibujo, que es una reproduccidn de los cromatogramas que se obte- nían a l hacer l a s pruebas de control.

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INFORME FINAL k

EXPERIMENTO # 4

Despues de una visita a l a p l an ta de Scheramex ubicada en Xo- ch imi l co , pude observar l a t é c n i c a que ap l i can en e s t a indus t r i a

para comprobar l a presenc ia de los componentes de l a gentamicina y

a s l poder cumplir con su r e q u i s i t o de control de ca l i dad que e l los mismos establecen.

La t é c n i c a empleada e s l a que han desar ro l l ado en los labora-

torios de Scher ing y que se menciona en l a pa r t e de l a s t é cn i cas ;

pues bien, l a s concentaaciones de so l v en t es que e l los manejan es 1 0 0 ml metanol: 100 m l cloroformo: 100 m l de h idrox ido de amonio

fuerté ( 2 8 % de amonio)que es e l amoniaco concentrado que se comer- c i a normalmente; y a pa r t e de e s t a va r i an t e en los so l ventes es que e l l os despues de d e j a r que corran los so l v en t es en l a s i l i c a

gel, dejan que se seque perfectamente l a p l aca hasta que no se pe r - c i ba olor a amoniaco y meten e s t a p l aca a una segunda camara de sa turac ibn en donde se encuentra i odo en t e t r a c l o r u r o de carbono, e l cua l despues de unos minutos en que estan sus vapores en contac to con e l cromatograma l o rebe lan pudiendo aprec iarse l a separación

de los compuestos s i n nigun problema y debido a l a concentracibn más fuerte d e l amoniaco se separan más fác i lmente los componentes de l a gentamicina s i n ningun problema y este experimento esmuy re - produc ib le y muy conf i ab l e .

Este m é t odo se r e a l i z o en r epe t i da s ocaciones en l o s Labora -

-

torios Nac ionales de Referencia y ya no presentaba ningun problema p o r los que atravesaban l o s métodos an te r i o r es ; por l o que se empe z b a p r a c t i c a r e s t a t é cn i c a con resu l tados favorables .

E l cromatograma obtenido se representa en l a s i gu i en t e página

donde se puede aprec i a r l a separación de l a s t r e s manchas que com- ponen a l s u l f a t o de gentamicina en sus componentes C1,Cla y C2.

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INFORME FINAL

DISCUSION

En l o s primeros traba jos de cromatoqrafía en e l Laboratorio Na c ional de Referencia se uti l izarbn placas de vidrio para l a cromato graf fa y se preparaba l a s í l i c a g e l para traba jar con e l l a ut i l izan - do l a técnica de Wagman, en donde se reporta l a mezcla de solventes compuesta por: cloroformo,metanol e hidróxido de amonio a l 17% (100 ,

100,100 v/v) y se observaba l a cromatoqrafía con l u z ul tra violeta . S i n embargo, no se observaba la separacibn de los componentes de l a gentamicina, n i en e l estándar, n i en l a muestra Droblema, Esto pu- do suseder debido a una mala preparación de la mezcla de solventes o a i tiempo que tenfan l o s solventes en e l almacen.

Se h i z b e l experimento en repetidas ocaciones obteniendo los mismos resultados, por l o que se descarto e l problema de una r a l a preparación en l a mezcla de solventes y se cambiarón los solventes exis tentes por solventes nuevos.

- -

Teniendo como referencia l a técnica de mapan, se s u s t i t u y o l a placa de vidrio por cromatofolios de aluminio de 20 x 20 c m . y 0.2mm de espesor de s i l i c a gel en donde se colocaban l a s muestras a t r a t a r y con l a misma mezcla de solventes: aunque se podía ver más f á c i l y

uniformemente e l desplazamiento de los compuestos no se observaba una separaci6n de los componentes de l a qentamicina, y se opto por cambiar e l revelado, en vez de usar l u z u l t ra violeta se preparó una solución de n'inhidrina para asper jar la sobre e l cromatograma y a s í observar mejor e l desplazamiento de l a s muestras. Se observaron ne- j o r l a s manchas pero aun a s í no se apreciaba l a separación de los componentes de l a gentamicina. Esto se puede deber a clue l a veloci- dad con que los componentes corren e s muy lenta y se requiere de más tiempo en l a cámara de saturaci6n o a que l a mezcla de solven - t e s no e s l a adecuada. Se de ja más tiempo saturarse l a cámara y más tiempo l a placa en e l l a ; los resultados obtenidos fuerón que s i se notaba una separación de uno de los corpuestos pero no de los t r e s . Por consiguiente, se cambio l a concentración de los solventes en donde despues de unas pruebas se obtuvierón resultados mejores que- dando como mezcla 'de solventes: cloroformo, metanol, hidróxido de a monio 17% 760/120/120 v/v), pero no era muy reproducible l a técnica

-

INFORME FIN?& e

pues de un exper imento a otro var iaba mucho l a sep rac i6n de los compuestos; en algunos experimentos se separaban m y b i en los com puestos (tres), p e r o en otros s610 dos compuestos Be separaban.Es t o se debe pr inc ipa lmente a que se ba ja e l número pe s i t i o s a c t i -

vos de l a s i l i c a ge l a l aumentar l a cant idad de h idrbx ido de amo-

n i o a l 17%, l o cua l permlte que los componentes de l a gentamicina

no sean r e t en i do s t a n t o tiempo en l a s i l i c a ; pe ro como se aumenta tambien l a cant idad de metanol se ve afectada l a s6paracibn de 2

componentes porque su po la r idad es c a s i l a misma. Como ya se contaba con l a t é c n i c a que se a p l i c a en Scheramex

se hicierdn c o r r i d a s con e l l a y se h ic iekbn los siquientes cambi-

os en l a t e c n i c a o r i g i n a l : I) . - Se caiabiarbn los cromatofo lTosde 20 x 20 cm. con 0.2 mm de

espesor de s i l i c a gel po r c romato f o l i o s de 7 x 1 0 Em. con 0.2 mm de espesor , permit iendo con esto que l a v e l o c idad eon que cor rea

los so l v en t es sea más uniforme que cuando se t i e n e que d i s t r i b u i r

a t odo l o l a r g o de l a p l aca de 20 x 20 cm. 21.- Se mod i f i c o solamente l a concentración d e l h idrbx ido de amo- n i o cambiandola d e l 1 7 % a una concentración d e l 2 8 % que es como b i ene comercialmente, permit iendo con esto que los cmmponentes de l a gentamicina sean separados fác i lmente po r l a po lar idad que t i e nen con r e spe c t o a los otros dos solventes. Con ese0 l a mezcla de so l v en t es quedo en l a s i gu i en t e proporción: cloroformo, metanol e h id róx ido de amonio a l 2 8 % ~lOO/lOO/iOO v/v). 31.- Se usa i odo como reve l ado r para aprec i a r fác i lmente l a sepa- rac ibn de los componentes s i n necesidad de aspe r j a r soluci6n de n inhidrtna o u t i l i z a r luz u l t r a v i o l e t a .

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INFORME FINAL

CONCLUSIONES

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3) .-

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5 ) .-

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L ~ S p l acas de v i d r i o con s f l i c a gel no ofrecen resu l tados ade - cuados debido a dos cosas: a).- E l grosor d e l v i d r i o . - no permite que se empape uniforme - mente l a s f l i c a ge l , po r l o cual no hay una buena ve l oc idad de c o r r i d o de los solventes. b1.- Repart ic iSn de l a s f l i c a g e l en el v id r i o . - como se t ie- ne que preparar l a S í l i c a ge l y hacer e l vac iado sobre e l v i- d r i o , a l ex tender l a s f l i c a no siempre se d i s t r i buye uniforme mente p o r lo que esto tambien afecta l a ve loc idad con que co- rren los so l v en t es y en l a s par tes donde hay más espesor de s f l i c a los compuestos se retienen más tiempo a l t e rando los re - sultados. Los c romato f o l i o s de 20 x 20 a n . son buenos para este t i p o de t raba j o , s i n embargo, s i se recor tan de jandolos de 7 x 1 0 cm. se mejoran los resu l tados pues l os solventes se d is t r ibuyen u niformemente en una s u p e r f i c i e menor y corren a l a misma velo c idad; cosa que no sucede con los c romato fo l i os de 20 x 20 cm

pues se nota mayor v e l o c i dad de r epar to en l a s o r i l l a s de l a

placa. Con l a u t i l i z a c i ó n d e l h idróx ido de amonio a l 2 8 % , por e s t a r más concentrado, ba j a los s i t i os a c t i v o s de l a s í l i c a g e l ocu pandolos y permite entonces que los tiempos de re tenc ión de

los compuestos sea menor, a s í los so l v en t es pueden separar más ráp ido l a muestra problema de acuerdo a l a po lar idad de l a s mismas y d e l so l v en t e usado. E l i odo como agente r e ve l an t e es muy ú t i l porque permite ver claramente l a separación de los componentes de la gentamicina s i n neces idad de alguna o t r a sustancia y es más f á c i l de pre- parar que l a n inh idr ina y puede durar mas tiempo s i n descompo nerse, permit iendo con e s t o , s e r u t i l i z a d o para v a r i a s prue - bas. Se t i e n e en l a genhamicina un agente que puede d e sa r r o l l a r s e para uso de t ratamientos de enfermos severos y pac ientes con enfermedades muy agudas.

La expe r i enc i a con gentamicina desde 1968 ha creado un gran

-

- -

-

-

___ * b

INFORME FINAL

uso para manejar l a s enfermedades ser ias provocadas por micro - organismos gram negativos. '

7 ) . - E l descubrimiento del sul fato de gentamicina fué especialmen- t e importante porque e s t e ant ibiót ico aminoglucocido t iene am - p l i o espectro contra Staphylococcus aureus, Enterobactereaceae y Pseudomonas aeruginosa. Además e n años rec ientes , ha incre- mentado e l esfuerzo de E . c o l i , Klebsiel la se. y Serrat ia mar - cescens por desarrol lar res ls tencia a otros antibióticos. S i n

embargo estos esfuerzos h a n sido sensibles a gentamicina. E ) . - La introducción de l a gentamicina aparece como l a introducción

- -

a una nueva era de terapia con ant ibiót icos en l a cual l a f a r - macologfa c l í n i c a tendrá mucho más importancia que con aqen - t e s como l a penic i l ina y cefalosporina.

7

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INFORME . FINAL

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RESUMEN

E l s u l f a t o de gentamicina,U.S.P. , e s un a n t i b i ó t i c o so lub le

en aqua d e l grupo de aminoglucosidos, es der ivado de Micromonosno r a purpurea un act inomicete . La qaramicina inyec tab le e s una solu - c i ó n es tér i l que cont i ene en cada m i l i l i t r o s u l f a t o de qentamici- na u.S.P. equ iva lente a 40 mg. de gentamicina base, 1.8mg. de me- t i l parabeno U.S.P. y 0.2 mq. de propil parabeno U.S.P. como pre-

servativo, 3.2 nq. de b i s u l f i t o de sod io U.S.P. y 0.1 mq. de ede-

t a t o de sodio. La qaramicina inyec tab l e es e s t a b l e y no requ ie re

ref r i ge rac ión .

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Estudios c l í n i c o s han mostrado a l a garamicina inyec tab le s e r

e f i c i e n t e en sept icemia e in f e cc i ones s e r i a s d e l sistema ne rv i oso

c e n t r a l (mening i t is ) , d e l t r a c t o ur inar io , t r a c t o r e s p i r a t o r i o , t r a c t o g a s t r o i n t e s t i n a l , p i e l y t e j i d o suave ( incluyendo quemadu - r a s ) .

La qaramicina inyec tab l e ha demostrado ser e f e c t i v a en i n f e c - cienes s e r i a s de estafilococos. Y puede ser considerada para i n - f ecc iones donde p e n i c i l i n a u o t r a s drogas menos potentes son con-

t ra indicadas. Efectos secundarios han s i d o reportados en pacien - tes con a l t a s d o s i s o t e r a p i a s prolongadas en donde se ven a f e c t a - dos d e l oc tavo par c ranea l ; s iendo v e r t i g o , mareo y do l o r es de ca - beza los primeros sintomas; se debe suspender de inmediato e l t r a - tamiento. E l riesgo de l a reacc ión t o x i c a es b a j o en pac ientes con funsión r ena l normal o quien no r e c i b e garamicina en a l t a s do - c i s o per iodos l a r g o s de tiempo.

De l a gran var i edad de a n t i b i ó t i c o s que se manejan en e l p a l s se l e ha dado gran importancia a l a f ab r i cac i ón de l a qentamicina

pues es un a n t i b i ó t i c o que se amplea para e l im inar gran pa r t e de microorganismos gram posi t ivos y negat i vos , ya que su acción e s de amplio e spec t ro inhib iendo l a s i n t e s i s p r o t e i c a en l o s microor - qanismos suscept ib les .

La p r i n c i p a l importancia de l a f ab r i cac i ón de e s t e a n t i b i ó t i - co e s que solo se absorve por v i a pe r en t e ra l por l o que e s un me- dicamento que no se autorece ta y se puede l l e v a r un con t ro l de su uso. Como es de amplio espectro s u uso, con d o s i s pequeñas (peno-

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res de 3 mg.) se pueden e l im ina r los microorganismos más fdcilmen - t e en r e l a c i bn con otros a n t i b i b t i c o s .

La cromatogra f ía abarca d i v e r s o s grupos de métodos de separa - cibn, de aquí l a gran importancia en química a n a l í t i c a , po r eso a

menudo f a c i l i t a l a separación, a i s lamiento e i d e n t i f i c a c i b n de - componentes de mezclas que de o t r a manera pueden ser resueltos con

gran d i f i c u l t a d . E l término "cromatograf Ía" es d i f i c i l de d e f i n i r

rigurosamente debido a l a var i edad de sistemas y t é cn i cas que han s ido apl icadas , s i n embargo, cromatogra f ía se ref iere a l proceso

basado en d i f e r e n c i a en ve l oc idades po r l a cual compuestos i n d i v i

duales o mezclas migran a t r a v e s de un medio e s t a c i ona r i o b a j o l a

i n f l u enc i a de una f a s e m63il.

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En cromatogra f ia , los componentes de una mezcla son l l e v ados

a t r a v e s de una fase e s t a c i ona r i a porosa, po r medio d e l movimien- to de un l í q u i d o o de un gas llamando a e s t o s f a s e mbvil. En a lgu nas ap l i cac i ones , l a fase e s t a c i ona r i a es un sB l i do finamente d i -

v i d i d o sos ten ido en un v i d r i o delgado o en un tubo metálico. La fase mbvi l se f i l t r a a t r a v e s d e l s ó l i d o , b a j o l a i n f l u enc i a de l a gravedad o como resulhado de un bombeo. En o t r o s métodos l a f a se e s t a c i ona r i a puede ser un pape l poroso o t i e r r a f i n a extendida

en un p l a t o de v i d r i o , aquE l a f a s e mbvi l se mueve en uno u otro po r accibn c a p i l a r o b a j o l a i n f l u enc i a de l a gravedad. La f a s e e s t a c i ona r i a puede tambien ser un l f q u i d o inmovi l i zado, e l cual

es inmisc ib l e en l a f a s e móbil. Procedimientos severos son emplea dos para f i j a r e l l í q u i d o e s t a c i o a a r i o en su lugar .

E l ma te r i a l adsorbente u t i l i z a d o para cromatograf ía de capa

f i n a inc luye : s í l i c a g e l , alumina y po l v o de ce lu losa . La croma- t o g r a f í a de capa f i n a es generalmente más ráp ida que l a cronato-

g r a f í a de pape l y t i e n e más v a l o r reproducib le . Es muy usada pa- r a l a i d e n t i f i c a c i b n de compuestos en drogas, preparaciones b io- químicas y productos natura les .

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TABLA 1

Adsorbentes ordenados según su fuerza de adsorción creciente

(*)

Sacarosa, almidón Inulina Citrato magnésico Talco Sosa Carbonato potásico Carbonato cálcico Fosfato cálcico Carbonato magnesico Maqnesio (Merck) Acido silícico activado Cilicatos de maqnesio activados Oxido de aluminio activado Carbbn animal activado y magnesia

( * * )

Oxido cálcico Fluoruro cálcico Oxido de aluminio (Yerck) Tridxido de cromo Oxido de aluminio alcalino Oxido de aluminio ácido Floridina Frankonita Carbón animal activado

activada

( * ) H.H.Strain, Chromatographic adsortion analysis, Interscience Publ., Inc., Nueva York (1942).

(**)G.Hesse, Adsortions methoden im chemischem laboratorium, de Gruy - ter, Berlín (1943).

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TABLA 2

Serie eiuBtropas (***I

n - Pent an o Eter de petrbleo n-Hexano n-Heptano Ciclohexano Tetracloruro de carbono Tricloroetileno BenCenQ Di cloromet ano Cloroformo (libre ae alcohol1 Diet ileter Acetato de etilo

Piridina Acetona n-Propanol Eta01 Met ano1

Agua

de eluyentes ( * Y )

Eter de petrdleo (p.eb. 30-5OOC) I1 I, " ( " 50-70" ) ,t "

" ( " 70-100") Tetracloruro de carbono Ciclohexano Sulfur0 de carbono Eter dietílico Acetona Benceno Tolueno Esteres de ácidos orgánicos 1,2-dicloroetano,cloroformo y

di clo rome t ano Alcoholes Agua Piridina Acidos orgánicos Mezclas de ácidos con bases, I

i agua, alcoholes o piridina

I

( * * * I G.Wohlleben,en:Handbuch der Lebensmittelchemfe,t.II,ParteI, ed. Springer,BerlPn-Gotinga-Heidelberg,

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