1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Tạ Thu Hằng

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

VÀ CHOLESTEROL MÁU CỦA MỘT SỐ NHÓM HOẠT

CHẤT CHÍNH TỪ CÂY NOPAL (OPUNTIA SPP)

ĐƯỢC NHẬP VÀO VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62420116

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội-2017

2

Công trình đƣợc hoàn thành tại trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên -

Đại học Quốc gia Hà Nội

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học

1. PGS.TS Lê Tất Khƣơng

2. PGS.TS Nguyễn Văn Mùi

Phản biện 1: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà Nội

Phản biện 2: GS. TS Đặng Thị Thu

Trƣờng Đại học Bách khoa-Hà Nội

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng cấp Đại Học Quốc gia chấm

luận án tiến sĩ họp tại Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-ĐHQG Hà

Nội

Vào hồi giờ ngày tháng năm 201

Có thể tìm hiểu luận án tại:

-Thƣ viện Quốc gia Việt Nam

-Trung tâm Thông tin-Thƣ viện, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên-

ĐHQG Hà Nội

3

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Xƣơng rồng (XR) Nopal thuộc chi Opuntia ficus-indica (L.) Mill, là

một loài xƣơng rồng mà từ lâu đƣợc trồng rộng rãi trên khắp vùng khô cằn và

bán khô cằn của thế giới. Nó có nguồn gốc từ Mêxicô. XR Nopal ngoài việc

sử dụng nhƣ rau ăn hàng ngày và chế biến các loại thực phẩm, mỹ phẩm,

dƣợc phẩm, chất đốt sinh học, xử lý nƣớc thải…[Error! Reference source

not found.] theo truyền thống ở Mêxicô cây XR Nopal đƣợc sử dụng để điều

trị bệnh đái tháo đƣờng. Các nghiên cứu cho thấy loài Opuntia ficus-indica

có tác dụng hạ glucose huyết, giảm rối loạn lipid máu, làm tăng dịch chuyến

protein vận chuyển (GLUT4) glucose ra màng tế bào, tăng khả năng hấp thu

glucose, giảm kích thƣớc tế bào mô mỡ...[Error! Reference source not

found.],[Error! Reference source not found.],[Error! Reference source

not found.].

Tỷ lệ bệnh ĐTĐ đang gia tăng nhanh chóng trên toàn thế giới kéo theo

những hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe và kinh tế đối với toàn xã hội. Số

ngƣời mắc bệnh ĐTĐ trên toàn thế giới tăng từ 171 triệu năm 2000 lên 194

triệu năm 2003, đã tăng vọt 246 triệu năm 2006 và đƣợc dự báo tăng lên 380-

399 triệu vào năm 2025. Việt Nam nằm trong 10 quốc gia có tỷ lệ gia tăng

bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới. Ƣớc tính có khoảng 53.458 ca tử vong do

bệnh tiểu đƣờng vào năm 2015.

Cây XR Nopal đã đƣợc Viện Nghiên cứu và Phát triển Vùng nhập nội

từ Mêxicô vào Việt Nam từ năm 2009, đã tiến hành trồng thử nghiệm thành

công chống cát bay, cát nhảy ở vùng đất khô hạn của tỉnh Ninh Thuận. Để

tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu cây XR Nopal dùng làm nguồn dƣợc liệu,

các chất tách từ cây có thể dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đƣờng

là vấn đề có ý nghĩa vì vậy chúng tôi tiền hành đề tài: “Nghiên cứu hoạt tính

sinh học hạ đường huyết và hạ cholesterol máu của một số nhóm hoạt

chất chính từ cây Nopal (Opuntia spp) được nhập vào Việt Nam”

2. Mục tiêu nghiên cứu: Xác định nhóm hoạt chất hay hợp chất chính trong

cây xƣơng rồng Nopal trồng tại Việt Nam có tác dụng hạ đƣờng huyết và hạ

cholesterol.

3. Nội dung nghiên cứu:

4

+ Xác định các thành phần dinh dƣỡng chính, thành phần hóa học của cây

Nopal nhập nội.

+ Thử độc tố LD 50. Xác định tác dụng hạ glucose huyết và lựa chọn đƣợc

phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ƣu thế của cây Nopal trồng tại Việt

Nam trên thực nghiệm.

+ Đánh giá tác dụng và bƣớc đầu tìm hiểu cơ chế gây hạ glucose, choleterol

huyết của cao phân đoạn dịch chiết có tác dụng chiếm ƣu thế của cây Nopal

trồng tại Việt Nam.

+ Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số chất tinh khiết từ thân cây

Nopal trồng tại Ninh Thuận. Đánh giá tác dụng hạ đƣờng huyết của các chất

phân lập trên một mô hình thử nghiệm in vitro.

4.Bố cục của Luận án

Luận án có 144 trang gồm 3 trang mở đầu, 36 trang tổng quan tài liệu,

23 trang đối tƣợng, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu; 55 trang kết quả

nghiên cứu và thảo luận, 3 trang kết luận và đề nghị, 1 trang các công trình

khoa học công bố, 12 trang tài liệu tham khảo, 12 trang mục lục, chữ viết tắt,

danh mục bảng, hình, trang phụ lục luận án có … bảng số liệu và … hình vẽ.

5. Điểm mới của luận án:

- Xác định đƣợc đặc điểm hình thái thực vật, giải phẫu thân, rễ, tên khoa

học của giống XR Nopal trồng tại Ninh Thuận-Việt Nam.

- Xác định đƣợc thành phần dinh dƣỡng, định tính các nhóm chất, phân

lập, xác định cấu trúc và định tên đƣợc các hợp chất phân lập đƣợc

trong cây XR Nopal giống Jalpa.

- Xác định đƣơc 1 giống XR có tác dụng hạ đƣờng huyết hiệu quả nhất

trong 03 giống thử nghiệm.

- Xác định đƣợc phân đoạn Ethylacetat chứa nhiều flavonid, có tác dụng

hạ đƣờng huyết, cholesterol và khả năng hoạt hóa enzym p-AMPK và

p-ACC tốt nhất.

- Xác định đƣợc 01 chất đặc trƣng trong cây XR Jalpa có tác dụng hoạt

hóa p-AMPK và p-ACC, ức chế FAS (tổng hợp acid béo), làm tăng sự

hấp thu glucose trong tế bào, có tác dụng làm giảm đƣờng huyết và

chống béo phì.

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Cây xương rồng Nopal và một số nghiên cứu về chi Opuntia

5

Loài Opuntia ficus-indica (L.) Mill thuộc chi Opuntia, họ Cactaceae,

với khoảng 1.500 loài xƣơng rồng, có nguồn gốc từ Mêxicô và lan rộng khắp

Trung và Nam Mỹ, Úc, Nam Phi, bao gồm cả các khu vực Địa Trung Hải

[Error! Reference source not found.].

Chi Opuntia có chứa một lƣợng đáng kể các axit ascorbic, vitamin E,

carotenoid, chất xơ, axit amin và các hợp chất chống oxy hóa (phenol,

flavonoids, betaxanthin và betacyanin), có lợi ích cho sức khỏe nhƣ: hạ

đƣờng huyết và hạ mỡ máu, và chống oxy hóa [Error! Reference source not

found. ].

1.2.Tác dụng hạ glucose, cholesterol huyết của chi Opuntia

Cây XR Opuntia ficus-indica chứa hàm lƣợng chất xơ, chất nhầy cao.

Uống bột XR Nopal trƣởng thành và XR Nopal non liều 50 mg / kg thể trọng

có tác dụng giảm glucose máu sau ăn trên chuột bị tiểu đƣờng tƣơng ứng là

46,0 và 23,6% (p <0,05) so với nhóm đối chứng[Error! Reference source

not found.].

Opuntia ficus-indica var.saboten (OFS) sử dụng với liều 1 g / kg và 2 g

/kg trọng lƣợng cơ thể có tác dụng hạ đƣờng huyết. OFS kích hoạt

phosphoryl hóa AMPK và MAPK p38 [Error! Reference source not

found.].

Quả của cây Opuntia ficus-indica có nhiều giá trị dinh dƣỡng: ascorbic

acid, vitamin E, carotenoid, sợi, axit amin, và với lƣợng lớn glucose và

fructose và các phenol, flavonoid, betaxanthin và betacyanins, có tác dụng hạ

đƣờng huyết và hạ lipid, có tác dụng hạ đƣờng huyết và hạ lipid và chống

oxy hóa[Error! Reference source not found.].

Dịch chiết từ cây Opuntia humifusa có chứa hàm lƣợng chất chống oxy

hóa cao bao gồm vitamin C, flavonoids và polyphenols, uống với liều 150mg,

250mg, 500 mg / kg trọng lƣợng/ ngày trong 7 tuần điều trị có tác dụng giảm

glucose, triglyceride máu, giảm đáng kể cholesterol tổng số và giảm LDL,

tăng HDL ở những con chuột bị tiểu đƣờng.[93]

Viên nang chứa cellulose vi tinh thể, 70% chất chiết tự nhiên từ nhánh

và quả của Opuntia ficus-indica thử nghiệm trên ngƣời có tác động hạ đƣờng

huyết cấp tính và lâu dài, an toàn. Uống liều 400 mg trong vòng 30 phút

trƣớc khi nạp 75 g glucose đã làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết sau

khi dùng[Error! Reference source not found.].

6

Chuột ăn với chế độ giàu chất béo bổ sung chất chiết xuất Opuntia

ficus-indica (OFI) giàu isorhamnetin glycosides, đƣợc bổ sung với liều thấp

(0.3%) và liều cao (0.6%) vào thức ăn thì có trọng lƣợng cơ thể, cholesterol

toàn phần, LDL và HDL, nồng độ glucose và insulin thấp hơn so với chuột

chỉ dùng chế độ giàu chất béo. Chiết xuất OFI đã kích thích sự bài tiết insulin

trong ống nghiệm, kết hợp với sự gia tăng vận chuyển glucose (GLUT2),

tăng khả năng hấp thụ glucose, tạo thêm năng lƣợng. [89]

Giống XR Milpa Alta thuộc OFI với hàm lƣợng chất xơ, nồng độ

polyphenol cao và khả năng chống oxy hoá đã làm tăng quá trình oxy hóa

axit béo và tổng hợp VLDL, giảm stress oxy hoá, và cải thiện tín hiệu insulin

gan ở chuột Zucker béo phì. Những con chuột bị béo phì Zucker đƣợc cho ăn

chế độ ăn kiêng có bổ sung 4% bột XR Nopal trong 7 tuần thì chỉ số

triglicerid trong máu thấp hơn 50% so với nhóm đối chứng, ngoài ra khối u

gan, dấu hiệu sinh học của tổn thƣơng tế bào gan giảm[Error! Reference

source not found.].

Lợn nái ăn thức ăn thƣơng phẩm bổ sung thêm 2,0 ± 0,5 kg cây xƣơng

rồng Opuntia ficus-indica có chỉ số glucose trong máu hạ tốt hơn, thời gian

cai sữa dài hơn nhóm ăn thức ăn thƣơng phẩm không bổ sung cây xƣơng

rồng OFI. Hiệu quả hạ đƣờng huyết của cây xƣơng rồng là do hàm lƣợng

chất xơ cao, đặc biệt là pectin, gel pectin làm giảm sự hấp thụ carbohydrate.

Ngoài ra, chất xơ cao làm tăng hoạt tính enzyme vi khuẩn, ảnh hƣởng hoạt

tính của α-glucosidase và β-galactosidase, dẫn đến sự ức chế sự thủy phân

liên kết glycosidic[Error! Reference source not found.].

Dầu hạt của quả của cây Opuntia ficus-indica L. MILL. có thành phần

lipophilic chứa 83% axit béo chƣa bão hòa (56% acid linoleic và 20% axit

oleic) có tác dụng bảo vệ có thể ngăn ngừa chứng đái tháo đƣờng ở chuột

đƣợc gây ra bởi Alloxan và ức chế các tổn thƣơng mô ở các tế bào tụy.[28]

1.3. Tác dụng sinh học khác của chi Opuntia:

Hoạt tính kháng viêm

Isorhamnetin-glucosyl-rhamnoside (IGR) chiết từ Opuntia ficus

indica có khả năng ức chế sản xuất các chất trung gian gây viêm da nhƣ

COX-2, yếu tố hoại tử khối u alpha TNF- và interleukin- (IL-) 1 và IL-6. IGR

nhƣ là một hợp chất tự nhiên thích hợp cho phát triển thành phần chống viêm

mới [Error! Reference source not found.].

7

Lorenzo và cộng sự (2017) đã nghiên cứu cho thấy toàn bộ chất nhầy

và các thành phần khối lƣợng phân tử thấp nhƣ acid lactic, D-mannitol,

piscidic, eucomic và 2-hydroxy-4- (4’ -hydroxyphenyl) -butanoic axit trong

Opuntia ficus-indica có tác dụng trong việc chữa vết thƣơng qua mô hình tế

bào in vitro đƣợc đơn giản hóa dựa trên một lớp vỏ keratin [Error!

Reference source not found.].

Hoạt tính chống ung thư

Glycosid isorhamnetin tinh khiết chiết xuất từ O. ficus-indica (giống

Jalpa) có tác dụng gây độc tế bào ung thƣ ruột kết ở ngƣời: HT-29 và Caco2.

Những ảnh hƣởng này liên quan đến quá trình gây chết tế bào (apoptosis)

thông qua cascade, một enzyme dạng protease, đóng vai trò trung tâm trong

việc truyền tín hiệu gây chết tế bào [Error! Reference source not found.].

Betanin, chiết xuất từ quả O.ficus-indica, có thể ức chế sự phát triển

của dòng tế bào ung thƣ bạch cầu K562 mãn tính ở ngƣời thông qua con

đƣờng tự do apoptotic [Error! Reference source not found.].

Flavonoids, trans Taxifolin, và dihydrokaempferol đã đƣợc phân lập

từ Opuntia humifusa có thể là những chất có tiềm năng để điều trị ung thƣ cổ

tử cung ở ngƣời [Error! Reference source not found.].

Chống oxy hóa

Glycoprotein đƣợc phân lập từ O. ficus-indica giống Saboten Makino

(một loài Opuntia đƣợc sử dụng trong y học dân gian ở Triều Tiên) có tác

dụng chống oxy hoá mạnh và các tính chất hypolipidemic có tác dụng bảo vệ

đối với những con chuột đƣợc điều trị bằng triton WR-1339, một chất ức chế

lipoprotein lipase [Error! Reference source not found.].

Bảo vệ tế bào thần kinh

Các polysaccharides của Opuntia Milpa Alta (MAP) có tác dụng bảo

vệ thần kinh đƣợc đánh giá ở mức độ cơ học trong mô hình invitro của tổn

thƣơng thiếu máu ở não chuột. [Error! Reference source not found.].

Giảm triệu chứng của bệnh táo bón

Chuột đƣợc tiêm dƣới da Loperamide (2 mg / kg) để gây táo bón. Cho

chuột uống nƣớc chiết từ Opuntia humifusa với nồng độ 3% và 6% trong

thời gian 25 ngày, kết quả cho thấy độ dày của ruột già cũng tăng lên ở các

nhóm phụ thuộc theo liều. Những kết quả này cho thấy rằng chiết xuất của

Opuntia humifusa làm giảm các triệu chứng của táo bón do loperamide gây ra

[Error! Reference source not found.].

8

Làm chậm sự phát triển tổn thương xơ vữa động mạch và các bệnh

tim mạch

Các nghiên cứu in vivo trên chuột apoE-KO, tự phát triển các tổn

thƣơng xơ vữa động mạch trong điều kiện ăn kiêng cơ bản, chỉ ra rằng việc

bổ sung chế độ ăn uống có chứa bột thân cây O. streptacantha hoặc O.ficus-

indica (10 mg/kg trong 15 tuần) làm giảm đáng kể sự phát triển của tổn

thƣơng xơ vữa động mạch [Error! Reference source not found.].

Ngăn ngừa sự phát triển bất thường của chuyển hóa liên quan đến

béo phì

Flavonoid kaempferol hoặc isorhamnetin chiết xuất từ Opuntia có thể

ngăn sự tích tụ lipid hoặc ức chế sự hình thành adipogenesis thông qua việc

giảm sự điều hòa gen có adipogenic [Error! Reference source not found.].

1.4. Những nghiên cứu hoạt tính sinh học hạ glucose huyết, hạ

cholesterol từ các loài thực vật khác.

Scoparia dulcis L. thƣờng đƣợc gọi là cây đậu ngọt giàu hàm lƣợng

saponin, khi sử dụng ở liều 20 và 30 mg / kg có tác dụng hạ đƣờng huyết

trên mô thí nghiệm bệnh ĐTĐ ở chuột [Error! Reference source not

found.].

Mangifera indica kernel flour (MIKF) hay bột nhân hạt xoài tại

Nigeria là một nguồn giàu các chất flavonoid và axit phenolic, quan trọng về

mặt dƣợc lý. Các chất chiết xuất methanolic của nó ức chế một số enzyme

chủ chốt liên quan đến bệnh lý học và biến chứng của bệnh đái tháo đƣờng

týp 2 in vitro. [Error! Reference source not found.].

Theo Jang Sun-Hee và cộng sự nghiên cứu cho thấy nhân sâm có tác

dụng chống bệnh đái tháo đƣờng trong mô hình bệnh tiểu đƣờng chuột gây

ra bởi streptozotocin, thông qua việc chuyển saponin thành các chất chuyển

hóa của vi khuẩn đƣờng ruột làm giảm 62,5% mức đƣờng huyết. Ngoài ra,

các chỉ số khác nhau glycosylated máu, nồng độ insulin trong huyết thanh

cũng đƣợc cải thiện đáng kể [Error! Reference source not found.].

Quế (Cinnamomum zeylanicum) Chiết xuất quế có thể là một loại

thuốc thay thế hữu ích trong chế độ hàng ngày của bệnh nhân đái tháo

đƣờng, cải thiện hiệu suất của bộ nhớ và giảm rối loạn chuyển hóa lipid

[Error! Reference source not found.].

Cây hồ lô bá (Trigonella foenum graecum) có tác dụng hạ đƣờng

huyết tốt. Sử dụng 10 % bột hạt hồ lô bá và 3% hành tây hàng ngày có sự

9

giảm đáng kể mức glucose trong máu lúc đói. Củ cải đƣờng, hành tây, bột

hạt hồ lô bá tỷ lệ 43%, 35% và 54% có tác dụng giảm cholesterol máu, đặc

biệt là từ các triglyceride LDLc giảm một cách đáng kể [Error! Reference

source not found.].

Các thành phần đƣợc xác định là biểu hiện tác dụng chống bệnh tiểu

đƣờng của cây chóc máu S.reticulata Wight bao gồm salacinol, kotalanol,

ponocinol, salaprinol… Mangiferin, 16-acetate kotalagenin và oligomers

proanthocyanidin khác nhau cũng đã đƣợc phân lập [Error! Reference

source not found.].

Dịch chiết của cây chóc máu (S.reticulata Wight) đã làm tăng sự biểu

hiện hoạt hóa AMPKα (Activated protein kinase α) và AMPKα phosphoryl

hóa trong các tế bào mỡ. Những phát hiện này chứng minh rằng chiết xuất

của S.reticulata Wight có tác dụng trị liệu về béo phì và rối loạn chuyển hoá

lipid [Error! Reference source not found.].

Dịch chiết từ lá dây thìa canh (Gymnema sylvestre) với liều 100, 250

và 500 mg / kg thể trọng đƣợc thử nghiệm trên mô hình chuột nuôi chế độ ăn

nhiều chất béo đƣợc chứng minh hiệu quả hạ đƣờng huyết do hoạt tính ức

chế amylase và giảm đáng kể sự gia tăng trọng lƣợng cơ thể, nồng độ lipid

huyết thanh, insulin và leptin huyết thanh, mô mỡ, viêm gan [Error!

Reference source not found.].

Selenium (Se) và Polysaccharide đƣợc phân lập từ lá sen, có tác dụng

chống oxy hoá và đề kháng insulin. Chuột cống mang thai trƣớc khi sinh

uống liều 50 và 100 mg / kg có tác dụng giảm cân, giảm mức glucose, lƣợng

insulin, giảm cholesterol trong máu [Error! Reference source not found.].

Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của một số cây thuốc tại Việt

Nam đang đƣợc rất nhiều các nhà khoa học trong nƣớc quan tâm.

Sử dụng hỗn hợp lá vối, lá ổi, lá sen (VOS) với liều lƣợng là 200 mg

VOS/kg thể trọng và 400 mg VOS/kg thể trọng trên chuột ĐTĐ trong 8 tuần

liên tục [Error! Reference source not found.].

Tác giả Phùng Thanh Hƣơng đã chứng minh cây bằng lăng nƣớc có

hoạt chất chính là polyphenol và acid corosolic có tác dụng ức chế men

anpha-glucosidase kiểm soát glucose máu sau ăn vì vậy dịch chiết lá bằng

lăng nƣớc có tác dụng hạ glucose máu trên chuột chuột ĐTĐ [Error!

Reference source not found.].

10

Ngoài ra còn có: nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây

chóc máu Nam Bộ Salacia cochinchinensis L Celastraceae [Error!

Reference source not found.], dây thìa canh (Gymnema sylvestre (ReTz.)

R.Br.ex Schult )[Error! Reference source not found.], dịch ép thân cây

chuối tiêu Musa balbisiana Colla [Error! Reference source not found.],

dịch chiết vỏ quả hồng bì Clausena lansium (Lour.)

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu

-Thân cây xƣơng rồng Nopal trƣởng thành, nhánh 20-25cm (03 giống:

Jalpa, TV, PTV-01) đƣợc thu hái tại Ninh Thuận ( Vƣờn giống gốc của Viện

Nghiên cứu và Phát triển Vùng).

-Chuột nhắt trắng đực dòng Swiss, trọng lƣợng từ 18-22 g đƣợc cung

cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ƣơng.

-Tế bào 3T3-L1 (tế bào mô mỡ chuột) đƣợc cung cấp bởi ATCC

(Rockwill, MD, Mỹ).

2.1.3.Hóa chất và thiết bị thí nghiệm

2.1.3.1. Hóa chất

Streptozocin (STZ) bột pha tiêm của hãng Sigma, Glyclazid (Standa)

(Pháp), Acarbose (Glucobay) (Đức), Metformin hydroclorid (Glucophage),

(Đức).

Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập nhƣ: ethanol (EtOH),

methanol (MeOH), n-hexan (Hx), ethyl acetat (EtOAc), dicloromethan

(DCM). Silica gel pha thƣờng (0,040 - 0,063 mm, Merck). Bản mỏng tráng

sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha

đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm). Đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và

365 nm hoặc dùng thuốc thử để phát hiện vết chất.

Dung môi, hóa chất dùng để định tính (EtOH 80%, nƣớc cất,

Pb(CH3COO)2 30%, Pb(CH3COO)2 10%, thuốc thử ninhydrin 3%, thuốc

thử Fehling A và Fehling B, thuốc thử Lugol….

Các dung môi dùng trong định lƣợng polyphenol toàn phần: (EtOH).

Thuốc thử: Folin-Ciocalteau (Merck). Hóa chất Na2CO3 (Trung Quốc).

Các dung môi dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH, Acetonitril

(ACN) của hãng Merck. Acid phosphoric đặc d=1,685g/cm3 của hãng

Merck.

11

Môi trƣờng DMEM và trypsin đƣợc cung cấp bởi Gibco, FBS,

penicillin/streptomycin. Kháng thể p-AMPK, p-ACC, FAS, kháng thể thứ

cấp chuột, kháng thể thứ cấp thỏ và β-actin (Cell signaling); D-14C(U)-

glucose; MTT [3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) 2,5- diphenyl-tetrazolium

bromid] (Sigma); dexamethasone (Sigma), 3-isobutyl-1-methylxanthin,

insulin (Sigma); Các nguyên vật liệu và hoá chất khác đƣợc cung cấp bởi

công ty Sigma.

2.1.3.2. Thiết bị thí nghiệm

Thiết bị phục vụ chiết xuất và nghiên cứu các thành phần hóa học:

Cân kỹ thuật Precisa BJ 610C;Tủ sấy Memmert IN260 (MEMMERT -

Đức); Máy cất quay Rotavapor R-200 (Buchi), BUCHI(Thuỵ Sỹ), Máy siêu

âm Power sonic 405 (POWERSONIC - Hàn Quốc), Máy UV-vis 1800 dải đo

190nm-800nm (SHIMADZU -Nhật Bản); Máy đo độ nóng chảy Kofler

micro-hotstage (Đức); Máy đo phổ khối lƣợng phun mù điện tử (ESI-MS)

AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap (AGILENT -Anh); Máy đo phổ

cộng hƣởng từ hạt nhân Bruker AM 500 FT-NMR spectrometer với chất

chuẩn nội là TMS (BRUKER(Đức), Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích

Shimadzu LC10tvp, detector diod array SPD-M10Avp (SHIMADZU Nhật

Bản);

Thiết bị nghiên cứu hoạt tính sinh học

Máy li tâm để bàn SIGMA 3K 30 (SIGMA-Đức); Máy đo pH

(HORIBA F-51BW HORIBA -Nhật); Máy đo quang TriStar LB 941

Multimode Microplate Reader TRISTA (Đức); Hệ thống phát hiện và phân

tích hình ảnh LICOR Odyssey® CLx LICOR (Mỹ), Máy đếm Tri-Carb 2000

(TRI- CARB -Mỹ)…

2.2. Phương pháp nghiên cứu

Các nghiên cứu thực nghiệm đƣợc nghiên cứu tại khoa sinh-ĐHKHTN,

khoa hóa thực vật, dƣợc lý – Viện Dƣợc liệu

2.2.1. Nghiên cứu về thực vật học:

2.2.1.1. Xác định tên khoa học

Theo phƣơng pháp mô tả, so sánh hình thái, đƣợc đối chiếu bởi các

khóa phân loại đến loài và thứ của chi Opuntia Mill.,thuộc họ xƣơng rồng

Cactaceae trong các bộ Thực vật chí của Trung Quốc[Error! Reference

source not found.].

12

Việc thẩm định lại kết quả, xác định lại tên khoa học mẫu thu thập

đƣợc tại phòng thực vật-Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

2.2.1.2. Nghiên cứu giải phẫu

Theo phƣơng pháp nghiên cứu giải phẫu thực vật, bao gồm các bộ phận

thân, rễ. Các tiêu bản giải phẫu đƣợc làm theo phƣơng pháp nhuộm kép (đỏ

carmin xanh methylen)[Error! Reference source not found.,Error!

Reference source not found.]. Quan sát dƣới kính hiểm vi soi nổi và chụp

ảnh bằng máy kỹ thuật số

2.2.2. Nghiên cứu về hóa học

2.2.2.1. Đánh giá sơ bộ thành phần dinh dưỡng của cây XR Nopal trồng tại

Việt Nam

Vật chất khô (Phƣơng pháp trọng lƣợng), Lipid (Phƣơng pháp Soxlect),

Protein (Sử dụng máy Gerhard theo phƣơng pháp Kjeldahl); Xác định

vitamin A, vitamin C bằng phƣơng pháp HPLC; Xác định vitamin B1, B2,

B6 bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân. Phân tích K, Na dựa trên tiêu

chuẩn Việt Nam TCVN 6196-3:2000; Xác định Zn, Fe, dựa trên tiêu chuẩn

Việt Nam TCVN 8126:2009; Xác định P theo phƣơng pháp TCVN

1525:2000

2.2.2.2. Phương pháp chiết phân đoạn

Mẫu thu về đƣợc loại bỏ phần hƣ hỏng, rửa sạch, phơi trong bóng râm

cho khô, sấy ở 60oC cho đến khi mẫu có khối lƣợng không đổi, nghiền mẫu

thành bột và đƣợc chiết xuất bằng ethanol (EtOH) với phƣơng pháp ngấm

kiệt. Sau đó dịch chiết toàn phần EtOH đƣợc phân đoạn bằng các dung môi

có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat [Error! Reference source not

found.].

2.2.2.3. Phương pháp định tính

Định tính bằng các phản ứng hóa học sử dụng thuốc thử đặc trƣng của

mỗi nhóm chất [Error! Reference source not found.],[Error! Reference

source not found.].

2.2.2.4. Phương pháp định lượng polyphenol toàn phần

Phƣơng pháp định lƣợng polyphenol toàn phần [Error! Reference

source not found.]: sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteau, đo quang ở bƣớc

sóng 760nm, so sánh với acid gallic, sử dụng kỹ thuật đƣờng chuẩn.

2.2.2.5. Phương pháp phân lập các hợp chất:

13

a. Sắc ký lớp mỏng : Dùng để kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập

đƣợc.

Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính

phân cực của các thành phần trong dung dịch. Pha tĩnh là một lớp mỏng các

chất đƣợc hấp thụ trên silicagel.[Error! Reference source not found.]

Sau khi chạy sắc ký xong để phát hiện chất trên bản mỏng có thể dùng

thuốc thử H2SO4 10% đƣợc phun đều trên bản mỏng, sấy khô rồi hơ trên

bếp điện đến khi hiện màu hoặc bằng đèn tử ngoại bƣớc song 365nm và

254nm

b. Sắc ký dựa trên sự phân bố các chất giữa 2 pha: pha cố định và pha di

động. Pha di động hay pha lỏng là dung môi dùng để chiết cho chảy qua cột,

pha cố định hay pha tĩnh đƣợc nhồi vào một cột thủy tinh. Mẫu đƣợc đƣa vào

cột, các mẫu sẽ đi qua cột với các tốc độ khác nhau, các phân tử có kích

thƣớc nhỏ sẽ ngấm sâu vào mạng lƣới của chất nhồi, còn các phân tử có kích

thƣớc lớn hơn sẽ chỉ thâm nhập ở mức độ nhất định, các phân tử có khối

lƣợng rất lớn sẽ không đi đƣợc vào các mao quản. Kết quả là thứ tự các chất

ra khỏi cột theo khối lƣợng thứ tự giảm dần [Error! Reference source not

found.].

2.2.2.6. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

a. Điểm nóng chảy (Mp)

Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện

Dƣợc Liệu.

b. Phƣơng pháp phổ khối lƣợng:

Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ thƣờng đƣợc xác định bằng

kỹ thuật phổ khối lƣợng. Nguyên tắc chủ yếu của kỹ thuật này là dựa vào sự

phân mảnh ion của phân tử chất dƣới dạng bắn phá của chùm ion bên ngoài.

Ngoài ra để xác định đƣợc cấu trúc hóa học của các hợp chất còn dựa vào cơ

chế phân mảnh của các ion bằng phổ MS

c. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR- Nuclear Magnetic

Resonance):Phổ 1H-NMR; Phổ 13C-NMR; Phổ DEPT. Ngoài ra, ngƣời ta

còn sử dụng nhiều kỹ thuật phổ 2 chiều rất hiện đại khác nhƣ: HMQC,

HOMOCOSY, HMBC[Error! Reference source not found., Error!

Reference source not found.].

2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học

2.2.3.1. Xác định độc tính cấp

14

Tiến hành đánh giá độc tính cấp tính của DCTP của 03 giống XR

Nopal thử nghiệm (Jalpa, Tai voi, PTV-01) trên chuột nhắt trắng theo đƣờng

uống, liều dùng là 3g, 6g, 9g, 12g,15g,18g,21g/ kg/ ngày cho mỗi giống XR

Nopal [Error! Reference source not found.], mỗi lô 10 con.

Các chỉ tiêu theo dõi : Hoạt động tự nhiên, tƣ thế, màu sắc (mũi, tai,

đuôi), lông, phân, nƣớc tiểu.Theo dõi số lƣợng chuột chết ở mỗi lô trong

vòng 72 giờ, xác định đƣợc LD50.

2.2.3.2. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết

a) Phương pháp gây tăng glucose huyết bằng STZ

Chuột nhắt trắng sau khi mua về đƣợc để ổn định 3, tiêm màng bụng

STZ (pha citrate pH=4,5) với liều 150 mg/kg. [Error! Reference source not

found.].

b) Phương pháp gây chuột ĐTĐ type 2

Nhóm 1: nhóm ăn thƣờng (ND-normal diet) Chuột đƣợc nuôi bằng chế

độ ăn bình thƣờng (thức ăn chuẩn do viện vệ sinh Dịch tễ cung cấp). Nhóm

2: nhóm nuôi béo (HFD-high fat diet) ăn thức ăn giàu chất béo trong vòng 8

tuần.

Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 bằng cách tiêm màng bụng STZ 120

mg/kg (pha trong đệm citrate 0,01M, pH 4,3)

Sau khi tiến hành tiêm STZ với liều 120 mg/kg, các con chuột tiếp tục

đƣợc nuôi bằng chế độ dinh dƣỡng nhƣ ban đầu. Đo nồng độ đƣờng huyết lúc

đói tại 0 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Sau 14 ngày lấy máu

định lƣợng đƣờng huyết.

c) Phương pháp định lượng glucose huyết

Định lƣợng đƣờng huyết bằng kỹ thuật enzyme, glucose bị oxi hóa nhờ

xúc tác của các enzyme trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết

quả trên máy One Touch Profile Meter của hãng Johnson&Johnson.

d) Phương pháp định lượng cholesterol toàn phần, triglyceride HDLc, LDLc

Định lƣợng cholesterol toàn phần theo phƣơng pháp của Deeg và

Zlegenhorn và định lƣợng triglycerid huyết thanh theo phƣơng pháp của

McGowan, định lƣợng HDL, LDL trên máy xét nghiệm sinh hóa máu bán tự

động TC plus 80.

e) Phương pháp thử tác dụng hạ glucose huyết

Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 03 giống Nopal trên

chuột gây tăng glucose huyết bằng STZ:

15

Chia chuột thí nghiệm thành 8 lô và cho uống các mẫu thử: 6 lô Cho

chuột uống cao dịch chiết toàn phần của 03 giống XR Nopal (Jalpa, TV,

PTV-01) với liều 500mg/kg/ ngày và 1000mg/kg/ ngày [Error! Reference

source not found.]. Lô chứng bệnh lý : Chuột đã gây tăng glucose huyết,

uống nƣớc. Lô uống mẫu đối chứng dƣơng: Chuột đã gây tăng glucose huyết,

uống Glyclazid với liều 100 mg/kg cân nặng. Chỉ tiêu theo dõi: glucose

huyết của các lô thí nghiệm. Cho chuột tất cả các lô uống mẫu thử 7 ngày liên

tục. Sau ngày uống thứ 7, lấy máu đuôi chuột định lƣợng lƣợng glucose huyết

thanh (G7).

Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết, cholesterol trên chuột gây

ĐTĐ type 2 của các cao phân đoạn dịch chiết của giống XR Jalpa

Lô thí nghiệm: Chuột đƣợc bố trí theo 6 lô thí nghiệm: Lô 1: Lô đối

chứng - Chuột đã gây tăng đƣờng huyết, uống nƣớc muối sinh lý với liều

10ml/kg. Lô 2,3,4,5 Chuột đã gây ĐTĐ type 2, uống cao chiết phân đoạn

OFT, OFH, OFE, OFN mức liều khi qui đổi ra dƣợc liệu là tƣơng đƣơng liều

DCTP 1000mg/ kg. Lô 6: Chuột đã gây ĐTĐ type 2, uống thuốc hạ đƣờng

huyết Metfomin

Thí nghiệm đƣợc kéo dài 20 ngày. Đƣờng huyết chuột lúc đói đƣợc đo

tại các thời điểm 0 giờ, 7 ngày, 10 ngày, 20 ngày bằng máy glucose huyết tự

động. Định lƣợng cholesterol toàn phần trên máy xét nghiệm sinh hóa máu

bán tự động TC plus 80.

Dựa trên kết quả thí nghiệm, chọn cao chiết phân đoạn có tác dụng

chiếm ƣu thế nhất để tiếp tục nghiên cứu.

2.2.3.3. Phương pháp đánh giá tác dụng kích hoạt p-AMPK, p-ACC,

ức chế FAS kích thích sự hấp thu glucose.

a) Nuôi cấy và biệt hóa tế bào:

Tế bào 3T3-L1 đƣợc cung cấp bởi ATCC (Rockwill, MD, Mỹ) nuôi

cấy ở 37°C, 5% CO2 trong môi trƣờng DMEM. Sau khi tế bào hợp lƣu với

hỗn hợp các chất gây biệt hóa (1 μM dexamethasone, 500 μM 3-isobutyl-1-

methylxanthin, và 1 μg ml−1 insulin, MDI) đƣợc hòa tan vào môi trƣờng

nuôi cấy tế bào DMEM ở trên trong 2 ngày (Day 2). Các tế bào từ sau 8 ngày

đƣợc biệt hóa và sử dụng cho các thí nghiệm.

b) Xác định độ độc tế bào

Tế bào nuôi cấy trong đĩa ổn định, các mẫu thuốc thử sẽ đƣợc đƣa vào

ủ trong 24 h. Tế bào sống sẽ đƣợc ủ và nhuộm màu với môi trƣờng nuôi cấy

16

tế bào có chứa MTT [3- (4,5- dimethylthiazol-2-YL) 2,5- diphenyl-

tetrazolium bromid] (2 mg/ml, trong 2h). Loại bỏ môi trƣờng. Xác định tỷ lệ

tế bào còn sống giữa mẫu chuẩn và mẫu thử bằng máy đo quang ở bƣớc sóng

570 nm (Máy LB941, Berthold Technologies).[Error! Reference source not

found.]. Tính kết quả: Tỷ lệ % tế bào sống sót đƣợc tính theo công thức: I

(%) = (ODthử/ODchứng)x100% (Trong đó: I (%) là Tỷ lệ % tế bào sống sót;

OD là mật độ quang ở bƣớc sóng λ= 570 nm (ODthử: mật độ quang mẫu thử;

ODchứng: mật độ quang của mẫu chứng).

c) Phương pháp điện di protein

Các tế bào 3T3-L1 đƣợc xử lý với dịch chiết trong 2 h, sau đó thu lại

rồi rửa sạch. Các tế bào đƣợc ly giải trên băng. Dịch chiết tế bào sau đó đƣợc

đun sôi và ly tâm. Nồng độ dịch chiết tế bào đƣợc xác định bằng phƣơng

pháp BCA và điện di trên gel SDS – polyacrylamide 10%. Sau khi điện di,

protein trong gel đƣợc chuyển sang màng nitrocellulose, sau đó đƣợc ủ với

kháng thể nguyên cấp (p-AMPK, p-ACC, FAS và β-actin). Màng sau đó

đƣợc ủ thêm với kháng thể thứ cấp peroxidase liên hợp (chuột hoặc thỏ). Mật

độ các vết đƣợc phát hiện bằng dung dịch west femto (Thermo Scientific) và

hình ảnh đƣợc phát hiện và phân tích bằng máy LICOR Odyssey® CLx

(Lycor Biotechnology, Mỹ).[Error! Reference source not found.]

d) Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK, ACC của các phân đoạn:

Tế bào sau khi ủ với từng phân đoạn OFT, OFH, OFE, OFN với nồng

độ 30μg/ml, Lô chứng: là mẫu trắng dimethylsulfoxid (DMSO), thời gian ủ là

2h, đƣợc thu protein, chạy điện di và phân tích Western blot. So sánh mức độ

biểu hiện của p-AMPK, p-ACC để tìm ra cao phân đoạn dịch chiết có tác

dụng hoạt hóa AMPK rõ nhất.

e) Nghiên cứu đánh giá tác dụng của các chất tinh khiết trên p-AMPK, p-

ACC

Bƣớc 1: Xác định mức độ độc tính trên tế bào mô mỡ 3T3-L1 của 04 hợp

chất tinh khiết astragalin (OF2), rutin (OF4), narciscin (OF5) và typhaneosid

(OF6) đƣợc phân lập từ phân đoạn ethyl acetat. Lô thí nghiệm: Các giếng có

chứa tế bào 3T3-L1 đã biệt hóa, bổ sung các chất ở nồng độ 3 μM, 10μM,

30μM, 100μM đƣợc ủ trong 24 h. Đánh giá mức độ độc tính trên tế bào mô

mỡ 3T3-L1 bằng phƣơng pháp MTT tìm ra dải nồng độ an toàn để thí nghiệm

tiếp.

17

Bƣớc 2: Sử dụng phƣơng pháp Western blot để đánh giá mức độ biểu

hiện của p-AMPK, p-ACC : Tế bào sau khi đƣợc biệt hóa đƣợc ủ với từng

hợp chất với nồng độ 10μM, thời gian ủ là 2h. So sánh mức độ biểu hiện của

p-AMPK, p-ACC để tìm ra chất có tác dụng hoạt hóa AMPK rõ nhất.

f) Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK kích thích sự hấp thu glucose của hợp

chất typhaneosid theo nồng độ

Tế bào 3T3-L1 sau khi đƣợc ủ với typhanosid ở các nồng độ 3 μM, 10

μM, 30 μM đƣợc thu và trộn đều trong dung dịch Krebs-Ringer HEPES chứa

1% BSA trong 30 phút ở máy lắc trong bồn nƣớc 37 °C, sau đó thêm D-

14C(U)-glucose và ủ 30 phút.

Xác định khả năng hấp thu glucose đƣợc bằng cách: lấy 300 μl của

mỗi dung dịch ở trên rồi trộn với 65 μl dầu dinonylphtalate sau đó đem ly

tâm. Các phân đoạn tế bào có gắn 14C đƣợc thu và hòa tan trong dung dịch

chất lỏng phát quang và đƣợc đếm bằng máy đếm Tri-Carb 2000.[Error!

Reference source not found.]

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thống kê

Số liệu đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê với sự trợ giúp của

phần mềm Excel 2007. Biểu diễn số liệu dƣới dạng Xtb ± SD, so sánh bằng

T-test student. Để so sánh sự khác biệt giữa các thời điểm khác nhau trong

cùng 1 nhóm và giữa các nhóm tại cùng thời điểm, dùng thuật toán ANOVA,

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p 0,05, sự khác biệt không có ý nghĩa

thống kê khi p 0,05.

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Nghiên cứu về thực vật học

3.1.1. Xác định tên khoa học của cây Nopal

Tên khoa học chính xác là Opuntia ficus-indica (L.) Mill.,thuộc họ

xƣơng rồng Cactaceae. Kết quả này đã đƣợc giám định lại bởi Ths. Bùi Hồng

Quang, TS. Vũ Tiến Chính Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật với tên

khoa học số hiệu mẫu T.T.H-28/1/2016, hiện đƣợc lƣu trữ tại phòng tiêu bản

(HN) Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật.

3.1.2.Đặc điểm hình thái thực vật

Nopal là cây bụi, mọc thẳng, một số loài có thể dạng leo. Thân cây

hình trụ, nhánh nopal có các lớp biểu bì dày thích nghi với việc lƣu trữ nƣớc,

có màu xanh lá cây.

18

+ Thân cây và nhánh (cành) đƣợc cấu tạo bởi các đoạn thân

+ Rễ cây Nopal có dạng rễ cọc, các rễ phụ phát triển mạnh với số lƣợng rễ

nhiều.

+ Lá là các gai non của Nopal, mọc trên bề mặt nhánh cây, trong hầu hết các

loại xƣơng rồng rau các lá chỉ xuất hiện lúc non (0,5-3mm) sau rồi biến mất.

+ Hoa có nhiều dạng 5-8 cm, hoa xuất hiện giống nhƣ một cái vƣơng miện,

màu sắc đa dạng. Quả Nopal có hình trụ

3.1.3.Đặc điểm giải phẫu

3.1.3.1. Cấu tạo giải phẫu thân

+ Vi phẫu thân: Bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng

nhau. Mô dày gồm 3-4 lớp tế bào thành dày lên ở tất cả các góc, mô mềm cấu

tạo bởi những tế bào thành mỏng hình đa giác, có các tinh thể calci oxalat

hình cầu gai. Libe gỗ tạo thành các bó riêng biệt gồm libe, gỗ cấu tạo bởi các

mạch gỗ nhỏ xen kẽ với các tế bào mô mềm gỗ.

3.1.3.2. Cấu tạo giải phẫu thân rễ

+ Vi phẫu thân rễ: Lớp bần, sát lớp bần có các tế bào hình chữ nhật thành

mỏng là tầng phát sinh bần lục bì. Mô mềm vỏ mỏng, phía trong mô mềm vỏ

là libe cấp 2, có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Gỗ gồm các mạch gỗ

xếp thành bó, trong gỗ có là mô mềm gỗ.

+ Bột thân: Bột màu xanh lục, không vị. Mảnh biểu bì có lỗ khí. Tinh thể

calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm. Mảnh mô mềm. Mạch xoắn

và mạch mạng.

+ Bột rễ: Bột màu trắng ngà, không vị, mùi thơm nhẹ. Mảnh bần gồm các tế

bào hình chữ nhật xếp thẳng hàng nhau. Mảnh mô mềm gồm các tế bào thành

mỏng xép lộn xộn. Hạt tinh bột hình chuông, đơn lẻ. Mảnh mạch điểm và

mạch xoắn rõ. Rải rác trong mô mềm là các tinh thể calci oxalat hình cầu gai.

3.2. Nghiên cứu về hóa học:

3.2.1. Đánh giá sơ bộ thành phần dinh dưỡng của 03 giống cây xương

rồng Nopal nghiên cứu trồng tại Việt Nam.

Bảng 3.2. Hàm lượng một số chất dinh dưỡng trong 100 gram mẫu tươi

của 03 giống Nopal 1 năm tuổi trồng tại Ninh Thuận

Hàm lượng các

chất dinh dưỡng

Đơn vị Jalpa (JP) Tai voi

(TV)

PTV

Protein gram 0,67 0,63 1,16

Lipid gram 0,17 0,17 0,21

19

Xellulose gram 1,77 1,77 1,99

Bảng 3.3. Hàm lượng một số chất khoáng chất và vitamin trong 100

gram mẫu tươi của 03 giống Nopal 1 năm tuổi trồng tại Ninh Thuận

Đơn vị: mg/100g

Tên

giống

P K Ca Na Fe Zn Mg Mn VitA

(Mcg)

VitC Vt

B1

Vt

B2

VtB6

JP 3,0 197 71 6,14 0,53 0,003 82 11 0,62 6,23 0,19 0,60 0,027

TV 10,0 224 155 6,24 0,28 0,003 76 21 1,01 8,84 0,15 0,70 0,027

PTV 9,0 220 204 4,47 0,003 0,001 83 3,0 0,36 8,61 0,20 0,65 0,021

Kết quả nghiên cứu bƣớc đầu cho thấy cây xƣơng rồng Nopal thích

nghi với điều kiện khí hậu khô và nóng tại Ninh Thuận của Việt Nam

3.2.2. Kết quả chiết các cao phân đoạn

3.3.2.1. Dịch chiết toàn phần (DCTP) từ 03 giống XR Nopal nghiên cứu

03 Mẫu XR Jalpa, Tai voi, PTV-01, với khối lƣợng 2400g bột khô/

giống, ngâm từng giống với cồn và cất loại cồn nƣớc dƣới áp suất giảm thu

đƣợc cao chiết tổng với phần trăm tách chiết DCTP của các giống XR Jalpa,

TV, PTV tƣơng ứng nhƣ sau: 12,44%; 12,18%; 12,08%

3.2.2.2. Cao chiết phân đoạn từ giống XR Jalpa

Cao chiết tổng (DCTP) của giống XR Jalpa đƣợc thêm hỗn hợp cồn-

nƣớc (1:1) chiết lần lƣợt trong các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-

hexan, ethyl acetat. Phần trăm tách chiết: cao PĐ Hexan-OFH, cao PĐ ehthyl

acetat- OFE, Cao phân đoạn (PĐ) nƣớc-OFN: 0,81%; 3,78%; 9,8%;

3.2.3 Xác định các nhóm chất, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất

trong cây XR Jalpa.

3.2.3.1. Định tính các nhóm chất trong các cao phân đoạn cây XR Jalpa

Nhóm hoạt chất có trong cây XR Jalpa là rất phong phú: polysaccharid,

đƣờng khử, alcaloid, acid amin, flavonoid, phytosetrol, carotenoid, chất béo.

3.2.3.2.Định lượng polyphenol toàn phần trong các cao phân đoạn

Hàm lƣợng polyphenol toàn phần trong các cao chiết OFT, OFE, OFN

lần lƣợt là 5,617 ± 0,046, 8,726± 0,103 và 4,585±0,049% tính theo acid

gallic. Cao chiết ethyl acetat (OFE) có hàm lƣợng polyphenol toàn phần cao

nhất đạt 8,726± 0,103%.

20

3.2.3.3. Kết quả phân lập các hợp chất, trong phân đoạn có hoạt tính hạ

đường huyết tốt nhất- Ethyl acetat (OFE)

Phân lập đƣợc 08 hợp chất OF1, OF2, OF3, OF3.1, OF4, OF5, OF6,

OF7, trong đó các hợp chất OF1, OF4, OF3, OF6 có hàm lƣợng tƣơng đối

cao so với các hợp chất còn lại, tƣơng ứng đạt là 55mg, 52mg, 25mg, 22mg.

3.2.3.4. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất trong phân đoạn có hoạt

tính hạ đường huyết tốt nhất- Ethyl acetat (OFE)

Bằng các phƣơng pháp sắc kí kết hợp với các phƣơng pháp phổ hiện

đại đã phân lập và nhận dạng đƣợc 8 hợp chất

Bảng 3.9. Bảng tên các hợp chất phân lập từ phân đoạn Ethyl

acetat

STT Hợp

chất

phân

lập

Tên hợp chất Cấu trúc các hợp chất

1 OF1 β-sitosterol 3-O-β-D-

glucopyranosid

2 OF2 Kaempferol 3-O-β-D-

glucopyranosid hay

astragalin

3 OF3 Acid ferulic

4

OF3.1

Acid gallic

5 OF4 Quercetin 3-O--rutinosid

hay rutin O

O

O

HO

OH

OH

OOH

OH

OH

CH2O

OHOH

OH O

2

2'

6'

1''1'''

8

6

OH

6 OF5 Isorhametin 3-O-rutinosid

hay Narcissosid O

O

O

HO

OCH3

OH

OOH

OH

OH

CH2O

OHOH

OH O

2

2'

6'

1''1'''

8

6

OH

21

7 OF6 Isorhamnetin-3-O-

rhamnosyl-rutinosid hay

Typhaneosid

O

O

O

HO

OCH3

OH

OOH

O

OH

CH2

O

OHOH

OH

O

OHOH

OH O

2

2'

6'

1''

1''''

1'''

8

6

OH

8 OF7 Oligosaccharid

3.3. Nghiên cứu về tác dụng sinh học:

3.3.1. Nghiên cứu độc tính cấp của 03 giống XR Nopal trồng tại Việt Nam

Sau khi cho chuột uống cao chiết DCTP từ 03 giống XR Nopal với liều

tăng dần từ 3g- 21g mẫu/kg thể trọng, sau 72h không quan sát thấy biểu hiện

ngộ độc cấp tính.Vì không có chuột chết ở các lô thử nghiệm nên chƣa xác

định LD50 của dịch chiết tổng (DCTP) của 03 giống XR Nopal thử nghiệm.

Điều đó chứng tỏ dịch chiết từ 03 giống cây XR nopal dƣới dạng cao đƣợc sử

dụng bằng đƣờng uống không gây độc cho chuột.

3.3.2. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 03 giống cây xương rồng

Nopal trồng tại Việt nam.

Cho chuột gây tăng glucose huyết bằng STZ uống cao DCTP với liều:

+ Liều uống 500mg/kg/ ngày/ giống: % giảm glucose huyết so với chứng của

03 giống Jalpa, Tai voi, PTV nhƣ sau: 22,4% ; 6,8%; 0,56%.

+ Liều uống 1000mg/kg/ ngày/ giống: % giảm glucose huyết so với chứng

của 03 giống Jalpa, Tai voi, PTV nhƣ sau: 29%; 7,73%; 2,34%

Kết quả cho thấy trong 3 giống cây nopal thử nghiệm, giống Jalpa ở

liều 1000mg /kg thử nghiệm trên chuột có tác dụng hạ đƣờng huyết tốt nhất

3.3.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết, hạ cholesterol của giống Jalpa

trên chuột ĐTĐ typy 2

3.3.3.1. Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2

Kết quả gây chuột nhắt béo:

Lô ăn béo (HFD) có trọng lƣợng trung bình là 62,550,66 đã tăng

260% (gấp gần 4 lần) sau 8 tuần so với thời điểm trƣớc khi cho chuột ăn thức

ăn giàu chất béo (17,310,98). Kết quả trên cho thấy chuột thí nghiệm đã

đƣợc gây béo phì.

Gây tăng glucose huyết cho chuột nhắt béo bằng STZ

Nồng độ đƣờng huyết của nhóm chuột béo phì nhóm HFD khi bị tiêm

STZ tăng là 21,64±1,75; 22,32±1,82; 22,81±2,12; 23,17±2,12 tƣơng ứng tại

các thời điểm 72h, 7 ngày, 10 ngày, 14 ngày. Nhƣ vậy, bằng chế độ ăn giàu

22

chất béo cho chuột ăn liên tục trong vòng 8 tuần kết hợp với STZ đã gây

đƣợc chuột bị tăng glucose huyết, bị ĐTĐ typy 2.

3.3.3.2. Tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn trên chuột

ĐTĐ type2 bằng chế độ ăn giàu chất béo và STZ.

Chuột ĐTĐ type 2 đƣợc điều trị bằng các cao chiết phân đoạn OFT,

OFH, OFE, OFN sau 3,7,10,15, 20 ngày đo nồng độ glucose huyết thì nồng

độ glucose huyết giảm rõ nhất sau 20 ngày tƣơng ứng ở các phân đoạn OFT,

OFH, OFE, OFN là: 37,02% ; 32,50%; 59,04%; 49,62% so với đối chứng.

Uống Metfocmin (thuốc điều trị ĐTĐ) nồng độ glucose huyết giảm 77,3%.

Từ kết quả trên có thể khẳng định cao OFE có tác dụng hạ glucose

huyết tốt nhất.

3.3.3.3. Tác dụng hạ mỡ máu của các cao chiết phân đoạn trên chuột ĐTĐ

type2 bằng chế độ ăn giàu chất béo và STZ:

Đánh giá các chỉ số mỡ máu chuột ở nhóm ND và HFD

Cho chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo (nhóm HFD) và chế độ ăn

thƣờng (ND) liên tục trong vòng 8 tuần đánh giá chỉ số mỡ máu: cholesterol

tổng số, Tryglycerid, HDLc, LDLc. Nhóm chuột ND không bị rối loạn mỡ

máu. Nhóm HFD bị rối loạn mỡ máu, các chỉ số Cholesterol, Tryglycerid,

HDLc ; LDLc tăng so với nhóm ND tƣơng ứng là : 34,35%; 104,3%; giảm

20,53%; 26,73% .

Tác dụng hạ mỡ máu của các cao phân đoạn dịch chiết

Chuột ĐTĐ type 2 đƣợc điều trị bằng các cao chiết phân đoạn OFT,

OFH, OFE, OFN sau 20 ngày đo chỉ số mỡ máu. Phân đoạn ethylacetat

(OFE) của giống XR Jalpa thể hiện tác dụng hạ mỡ máu tốt nhất: cholesterol

toàn phần giảm 31,05%, triglycerid giảm 15,7%, HDLc tăng 31,03%, LDLc

giảm 15,86% so với phân đoạn OFT, OFH, OFN, thử nghiệm trên chuột béo

phì, ĐTĐ type 2.

3.3.4. Kết quả đánh giá cơ chế tác dụng hạ glucose huyết sơ bộ của các

dịch chiết từ các cao chiết phân đoạn thông qua hoạt hóa enzym AMPK.

Sau khi ủ các dịch chiết OFH, OFN,OFT,OFE với nồng độ 30 μg/ml

với tế bào 3T3-L1 trong 2 h, thu đƣợc protein, chạy điện di và đánh giá mức

độ biểu hiện của protein thông qua p- AMPK và p-ACC hoặc β- actin

(protein đối chứng) phƣơng pháp điện di protein (Western blot).

23

Hình 3.19, 3.20, 3.21. Tác dụng của cao chiết cồn 70% và các phân đoạn

của cao chiết cồn 70% của OFI trên protein phospho-AMPK và ACC.

Hình ảnh phân tích Western blot cho thấy: mức độ biểu hiện β- actin

không thay đổi. Cao phân đoạn ethyl acetat (OFE) và cao phân đoạn nƣớc

(OFN) với nồng độ 30 μg/ml đều làm tăng biểu hiện của p-AMPK và p-ACC

rõ nhất so với đối chứng. Tác dụng của phân đoạn OFE rõ hơn phân đoạn

OFN.

3.3.5. Đánh giá tác dụng của các hợp chất tinh khiết Flavonoid từ phân

đoạn dịch chiết ethyl acetat (OFE) trên AMPK và ACC.

3.3.5.1. Xác định độ độc tế bào

Hình 3.22 . Mức độ độc tế bào 3T3-L1 của 4 hợp chất flavonoid phân lập

từ phân đoạn OFE

(Chú thích: **:P<0,01 so sánh với mẫu trắng DMSO)

Kết quả hình 3.22 cho thấy ở nồng độ 3 µM đến 30 µM, cả 4 hợp chất

thử nghiệm đều có tỉ lệ tế bào sống sót đạt > 90%. Do vậy dải nồng độ 3-30

μM là an toàn để thực hiện thí nghiệm tiếp theo trên tế bào 3T3-L1.

3.3.5.2. Đánh giá tác dụng kích hoạt p-AMPK, p-ACC trên tế bào 3T3-L1

của 4 hợp chất flavonoid

Hình 3.23; 3.24; 3.25.:Tác dụng của 4 hợp chất flavonoid phân lập từ

DMSO 3 10 30 3 10 30 3 10 30100 3 10 30

1000

50

100

150

Typhaneosid (M)Narciscin (M)Astragalin (M)Rutin (M)

****

% T

e ba

o so

ng s

ot

24

phân đoạn OFE của OFI trên protein phospho-AMPK và ACC

Ghi chú: 1: Rutin; 2: Astragalin; 3: Narciscin; 4: Typhaneosid

(so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Sử dụng phƣơng pháp Western blot để đánh giá mức độ biểu hiện của

p- AMPK, p-ACC, kết quả cho thấy Rutin với nồng độ mẫu 10 μM có tác

dụng kích hoạt p-AMPK mạnh nhất sau đó đến hợp chất astragalin trên p-

ACC. Astragalin thể hiện tác dụng kích thích p-ACC cao hơn typhaneosid và

cả hai chất đều thể hiện tác dụng kích thích tăng p-AMPK tƣơng đƣơng nhau.

Aicar 2 mM là chất đối chứng chuẩn cho thí nghiệm

3.3.5.3. Tác dụng ức chế FAS theo nồng độ của typhaneosid và astragalin

trên tế bào 3T3-L1

Hình 3.27. Tác dụng ức chế FAS theo nồng độ của typhaneosid và

astragalin trên tế bào 3T3-L1

(so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Kết quả thể hiện ở hình 3.27 cho thấy hợp chất typhaneosid thể hiện tác

dụng ức chế FAS rõ rệt theo nồng độ tăng dần ở 3, 10, và 30 µM.

3.3.6. Đánh giá tác dụng kích hoạt p-AMPK, p-ACC trên tế bào 3T3-L1

theo nồng độ của typhaneosid

DMSO 10 30Astragalin (μM) 3

β-actin

Fas

DMSO 3 10 30

0.0

0.5

1.0

1.5

Astragalin (M)

Ti l

e F

AS

/ -a

ctin

DMSO 10 30Typhaneosid (μM) 3

β-actin

Fas

DMSO 3 10 30

0.0

0.5

1.0

1.5

Typhaneosid (M)

Ti l

e F

AS

/ -a

ctin

25

Hình 3.28; 3.29. Tác dụng kích hoạt p-AMPK và p-ACC của typhaneosid

ở tế bào 3T3-L1 theo nồng độ (so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Kết quả cho thấy, ở dải nồng độ 10-30 μM, typhaneosid hoạt hóa p-

AMPK và p-ACC từ 2-3 lần so với mẫu trắng dimethylsulfoxid (DMSO).

Tác dụng hoạt hóa p-AMPK và p-ACC đều phụ thuộc nồng độ.

3.3.7. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK kích thích sự hấp thu glucose

của hợp chất typhaneosid theo nồng độ

Hình 3.30. Tác dụng hoạt hóa AMPK kích thích sự hấp thu glucose của

hợp chất typhaneosid phụ thuộc nồng độ (so sánh với mẫu trắng DMSO *:P<0.05, **:P<0.01, ***:P<0.001)

Kết quả nghiên cứu cho thấy typhaneosid nồng độ 10-30 μM kích thích sự

hấp thu glucose so với mẫu trắng DMSO. Insulin 100 nM là chất đối chứng

chuẩn cho thí nghiệm

KẾT LUẬN

Cây Nopal mới đƣợc di thực vào Việt Nam nên tất cả các nghiên cứu

này đều là những nghiên cứu đầu tiên.

1.Về thực vật:

- Đã xác định đƣợc đặc điểm hình thái, giải phẫu thân, thân rễ và xác

định đƣợc tên khoa học của cây xƣơng rồng Nopal trồng ở Ninh Thuận-Việt

Nam là Opuntia ficus-indica .

2. Về hóa học:

- Xác định đƣợc thành phần dinh dƣỡng của 03 giống xƣơng rồng

Nopal giống: Jalpa, Tai voi, PTV-01 trồng tại Việt Nam với hàm lƣợng đạt

đƣợc tƣơng ứng nhƣ sau: + Protein (g/100g tƣơi) : 0,67; 0,63; 1,16

26

+ lipid (g/100g tƣơi): 0,17; 0,17; 0,21

+ xenlluloza (g/100g tƣơi): 1,77; 1,77, 1,99

Và có chứa các vitamin (A, C, B1, B2,B6), khoáng chất (P, K, Ca, Na,

Fe, Zn, Mg, Mn)

- Xác định đƣợc các nhóm chất chính trong các cao phân đoạn của cây

XR Jalpa là flavonoid, polysaccharid. Định lƣợng polyphenol toàn phần trong

các cao chiết phân đoạn (OFN, OFT, OFE lần lƣợt là 4,585%; 5,617 %;

8,726 % ).

- Phân lập, xác định đƣợc tên, cấu trúc hóa học của các chất trong phân

đoạn Ethylacetat (OFE) của cây XR Jalpa gồm 08 chất OF1 (β-sitosterol 3-O-

β-D-glucopyranosid, 55mg), OF2 (kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid hay

astragalin,13mg), OF3 (acid ferulic, 25mg), OF3.1 (acid gallic, 15mg), OF4

(quercetin 3-O--rutinosid hay rutin, 52mg), OF5 (isorhametin 3-O-rutinosid

hay Narcissosid,17mg), OF6 (Isorhamnetin-3-O-rhamnosyl-rutinosid hay

Typhaneosid, 22mg), OF7 đƣờng oligosaccharid (18mg).

3. Về tác dụng sinh học

- Độc tính cấp LD50: Dịch chiết OFT của 03 giống xƣơng rồng Nopal

giống: Jalpa, Tai voi, PTV-01 dùng theo đƣờng uống với liều 3-21g/kg thể

trọng chuột, không quan sát thấy biểu hiện ngộ độc cấp tính.

- Cao chiết toàn phần giống Jalpa liều 1000mg/kg cân nặng chuột có

tác dụng hạ đƣờng huyết tốt nhất, glucose huyết hạ 29,01% sau 7 ngày thử

nghiệm trên chuột nhắt gây tăng đƣờng huyết bằng STZ so với 2 giống Tai

voi, PTV-01. Vì vậy, lựa chọn đƣợc giống XR Jalpa có tác dụng hạ đƣờng

huyết hiệu quả nhất để nghiên cứu tiếp.

- Phân đoạn ethylacetat (OFE) của giống XR Jalpa thể hiện tác dụng hạ

glucose huyết và cholesterol tốt nhất: glucose huyết giảm 59,04%,

cholesterol toàn phần giảm 31,05%, triglycerid giảm 15,7%, HDLc tăng

31,03%, LDLc giảm 15,86% trên chuột béo phì, ĐTĐ type 2 so với phân

đoạn OFT, OFH, OFN.

- Cao phân đoạn ethyl acetat (OFE) với nồng độ 30 μg/ml có khả năng

hoạt hóa enzym p-AMPK và p-ACC rõ nhất so với các cao phân đoạn OFH,

OFN, OFT trong tế bào mỡ 3T3-L1, có tác dụng làm giảm glucose huyết.

- Typhaneosid ở dải nồng độ 10-30 μM có khả năng hoạt hóa p-AMPK

và p-ACC từ 2-3 lần so với mẫu trắng DMSO, làm tăng sự hấp thu glucose

gấp 4,01 lần so với mẫu trắng DMSO và ức chế FAS trong tế bào, có tác

27

dụng làm giảm glucose huyết, chống béo phì.

KIẾN NGHỊ

Từ những nghiên cứu thu đƣợc, để có thể sử dụng cây Nopal dƣới dạng

thuốc dùng điều trị đái tháo đƣờng, cần tiếp tục nghiên cứu:

+ Xây dựng vùng nguyên liệu

+ Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế dƣợc lý trên in vitro và in vivo để

đánh giá tác dụng của typhaneosid trên bệnh béo phì, tiểu đƣờng type 2

+ Tiếp tục nghiên cứu nhằm xác định rõ cơ chế tác dụng: nhƣ đánh giá

tác dụng của của thân cây Nopal trên một số đích tác dụng cụ thể khác nhƣ

trên amylase, trên PPARγ ...

+Đánh giá mức độ an toàn trên động vật thực nghiệm: Độc tính bán

trƣờng diễn, độc tính trên sinh sản và sự phát triên, độc tính gây biến chủng,

sinh ung thƣ.

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN

QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1.Tạ Thu Hằng, Lê Tất Khƣơng, Phạm Thị Mỹ Phƣơng, Nguyễn Văn Lam,

Nguyễn Tiến Duy (2012), “Thành phần hóa sinh của một số giống Nopal trên

vùng đất khô hạn tại Ninh Thuận”, Tạp chí Hoạt động Khoa học công nghệ

638(7), tr. 93-96.

2.Tạ Thu Hằng, Đào Văn Minh, Lê Tất Khƣơng, Nguyễn Văn Mùi, Đoàn

Thị Bắc (2016) “Nghiên cứu đặc điểm hình thái và vi học của cây xƣơng

rồng Nopal”, Tạp chí Dược học 487(11), tr. 30-34

3.Tạ Thu Hằng, Đào Văn Minh, Lê Tất Khƣơng, Nguyễn Văn Mùi, Tô Lê

Hồng (2016) “Thành phần hóa học cao chiết Ethyl acetat cây Nopal trồng tại

Ninh Thuận”, Tạp chí Dược liệu 21 (6), tr 372-378.

4. Tạ Thu Hằng, Lê Tất Khƣơng, Đoàn Thị Bắc, Đào Văn Minh (2017),

“Tác dụng tăng hấp thu glucose và ức chế FAS thông qua hoạt hóa p- AMPK

28

trong tế bào 3T1-L1 của Typhaneosid từ cây xƣơng rồng Nopal trồng tại Việt

Nam”, Tạp chí Dược liệu 22(4), tr 247-254.