ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Huy Hoàng

THÁI NGUYÊN - 2017

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ

BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Xác nhận của tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài (ký họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

THÁI NGUYÊN - 2017

i

DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI I. Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu STT Họ và tên Đơn vị công tác

1 ThS. Nguyễn Huy Hoàng Đại học Y Dược - ĐHTN 2 PGS. TS. Lê Văn Sơn Viện Công nghệ Sinh học 3 TS. Phạm Bích Ngọc Viện Công nghệ Sinh học 4 TS. Nguyễn Thu Hiền Đại học Y Dược - ĐHTN 5 TS. Nguyễn Thị Thu Ngà Đại học Sư phạm - ĐHTN

II. Đơn vị phối hợp chính STT Tên đơn vị Họ tên người đại diện

1 Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam PGS. TS. Chu Hoàng Hà

MỤC LỤC

DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI………………………………………………....i

MỤC LỤC................................................................................................................................................................ii

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...........................................................................................................iii

MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………………………………………..1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………………………………………1

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………………2

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………………………………………………..3

3.1. Thay đổi mã di truyền gene Interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật................................................3

3.2. Thiết kế vector chuyển gene Interleukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá...............................................3

3.3. Biểu hiện protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phương pháp Agro-Infiltration...5

3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp............................................................................6

3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp...................................................................6

3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp......................................................................8

Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................................9

4.1. Biểu hiện tăng cường protein Interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá..................................................9

4.2. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC..............................................10

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ……………………………………………………………………………...11

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN Đơn vị: Trường Đại học Y Dược

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung: Tên đề tài: Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở

cây thuốc lá Mã số: ĐH2014-TN05-01 Chủ nhiệm: ThS. Nguyễn Huy Hoàng Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thái Nguyên Thời gian thực hiện: 2014 - 2017

2. Mục tiêu: Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7 tái tổ hợp. Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7

3. Kết quả nghiên cứu: Thiết kế được 2 cấu trúc vector chuyển gene và biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật. Biểu hiện thành công protein ở thực vật bằng phương pháp Agro-infiltration. Đã đánh giá được hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp. 4. Sản phẩm: 4.1. Sản phẩm khoa học: 03 bài báo đăng các tạp chí khoa học, 01 trình tự gen đăng kí trên Ngân hàng gen.

- Nguyễn Huy Hoàng, Nguyễn Thu Giang, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2014), “Interleukin 7 và vai trò trong hệ thống miễn dịch ở người”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, Tập 118 số 04, tr. 153-156.

- Nguyễn Huy Hoàng, Chu Hoàng Hà, Phạm Bích Ngọc, Lê Văn Sơn (2015), “Thiết kế vector mang cấu trúc gen Interleukin 7 phục vụ chuyển gen trong hệ thống thực vật”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, Tập 134 số 04, tr. 25-28.

- Nguyễn Huy Hoàng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà, Lê Văn Sơn (2017), “Biểu hiện tạm thời protein Interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá (Nicotiana benthamiana domin) bằng phương pháp Agro-Infiltration”, Tạp chí Sinh học, Tập 39 số 02, tr. 232-238.

- Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank: MF170526.1 4.2. Sản phẩm đào tạo 4.3. Sản phẩm ứng dụng 01 quy trình thiết kế vector tái tổ hợp mang gene mã hóa protein IL-7 và sản phẩm vector tái tổ hợp. 01 quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium. 01 quy trình biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật bằng phương pháp Agro-infiltration. 5. Hiệu quả:

Khoa học công nghệ: Đề tài hoàn thành sẽ góp phần hoàn thiện các phương pháp sản xuất protein interleukin 7 tái tổ hợp phục vụ trong y học

Thông tin: Cung cấp những thông tin về giá trị của các loại cytokin nói chung và interleukin, trong đó có interleukin 7 nói riêng trong hệ thống miễn dịch của con người

Nâng cao năng lực nghiên cứu của những người tham gia, đặc biệt với chủ nhiệm đề tài. Bổ sung 01 tài liệu tham khảo phục vụ cho việc nghiên cứu, giảng dạy và học tập của học viên,

sinh viên chuyên ngành Di truyền học. 6. Khả năng áp dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu:

Đề tài đã cung cấp quy trình biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá chuyển gene trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối tế bào. Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein interleukin 7 tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn. Ngày 14 tháng 7 năm 2017

Cơ quan chủ trì Chủ nhiệm đề tài

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS 1. General information:

Project title: Research on expressing the recombinant interleukin 7 protein in plant culture systems Code number: ĐH2014-TN05-01 Coordinator: Nguyen Huy Hoang, MA Implementing institution: Thai Nguyen university of Medicine and Pharmacy Duration: from 2014 to 2017

2. Objective(s): - Design the recombinant interleukin 7 encoded gene transferred the plant culture systems culture

systems. - Generates tobacco expressing protein interleukin 7.

3. Research results: - Design of two transgenic vector constructs and recombinant protein expression in plants. - Successfully expression of protein in plants by Agroinfiltration. - The recombinant IL-7 protein was evaluated bioactivity 4. Products: 4.1. Scientific product:

03 articles published scientific journals, 01 sequence has been registered on the genebank - Nguyen Huy Hoang, Nguyen Thu Giang, Chu Hoang Ha, Phạm Bich Ngoc, Le Van Son (2014),

“Interleukin 7 and role in the immune system of humans”, TNU-Journal of scrience and technology, 118 (04), pp. 153-156.

- Nguyen Huy Hoang, Chu Hoang Ha, Pham Bich Ngoc, Le Van Son (2015), “Vector construction contained structure interleukin-7 in plant”, TNU-Journal of scrience and technology, 134 (04), pp. 25-28.

- Nguyen Huy Hoang, Pham Bich Ngoc, Le Van Son, Chu Hoang Ha (2017), “Transient expression of a taste-modifying protein, interleukin-7, in nicotiana benthamiana using agro-infiltration”, Journal of biology, 39 (02), pp. 232-238.

- Hoang,N.H, Ha,C.H., Ngoc,P.B. and Son,L.V. (2017), IL7 human gene is optimized genetic codes which will be expressed in plants, GenBank: MF170526.1 4.2. Training product 4.3. Application product: 01 recombinant vector design process carrying genes encoding interleukin 7 protein and recombinant vector product.

01 recombinant vector transformation process into Agrobacterium. 01 process of recombinant protein expression in plants by method Agroinfiltration.

5. Effects: Science and Technology: The completed project will contribute to the improvement of the methods of recombinant interleukin 7 production in medicine. Information: Provides information on the value of cytokines and interleukins, including interleukin 7 in particular in human immune systems. Improve the research capacity of the participants, especially the leader. Additional 01 reference material for the research, teaching and learning of students, specialized students in Genetics. 6. Transfer alternatives of reserach results andapplic ability:

The subject has provided a process for expression of interleukin 7 recombinant protein in transgenic tobacco plants in a laboratory scale for cell culture purposes.

Initial evaluation of the bioactivity of the recombinant interleukin 7 protein obtained after purification, is the premise for further research.

1

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống được nâng cao thì vấn đề chăm sóc sức khỏe ngày càng được quan tâm, coi trọng. Tuy nhiên, hiện nay con người đang phải đối mặt với rất nhiều bệnh nguy hiểm như HIV, AIDS, tiểu đường, SARS, ebola v.v…. Trong khi đó, việc điều trị chủ yếu là sử dụng thuốc theo từng giai đoạn diễn biến của bệnh nên tính hiệu quả không cao và chỉ mang tính cầm cự. Interleukine là một nhóm các cytokine được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các Interleukine. Trong đó, nhóm Interleukine 7 (IL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T [3]. Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là những tế bào đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người.

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người. Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết.

Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn.

Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người.

Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và interleukine 7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá”. 2. Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7. Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7

3. Nội dung nghiên cứu Tối ưu mã di truyền gene interleukin 7 biểu hiện ở thực vật. Thiết kế gen mã hóa interleukine 7 vào vector chuyển gen phù hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật.

Chuyển cấu trúc gen vào cây thuốc lá Phân tích, đánh giá chất lượng interleukine 7 tái tổ hợp thu được. 4. Cấu trúc đề tài

Đề tài gồm 82 trang, 7 bảng và 16 hình. Sử dụng 107 tài liệu tham khảo, trong đó gồm 3 tài liệu tiếng Việt và 104 tài liệu tiếng Anh.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đề tài đã tham khảo và tổng kết 107 tài liệu, về 3 vấn đề cơ bản liên quan: (1). Interleukin 7; (2). Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học; (3). Nghiên cứu biểu hiện interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá.

Interleukine là một trong các nhóm chính của cytokine, đóng vai trò quan trọng nhất trong hệ miễn dịch của con người. Chúng có chức năng điều hoà miễn dịch, bao gồm cả phát triển tế bào, sự trưởng thành, di chuyển và bám dính. Ngoài ra, chúng còn có khả năng kích hoạt các phản ứng miễn dịch của cơ thể (Chad et al., 2010). Interleukine 7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng

2

phân tử 17,4 kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu nối disulfide nội phân tử (Yoseph et al., 2016). Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13. Hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ hợp đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học. Hàng loạt các cytokine khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng như: hIL-2, hIL-7, IFN-a, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 và EPO (Kwon et al., 2003). Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động đang được quan tâm nghiên cứu. Chính vì lý do đó nên yêu cầu cấp bách đặt ra là phải hoàn thiện các quy trình hệ thống thu nhận cytokine tái tổ hợp nói chung và interleukine 7 nói riêng, phục vụ trong y học.

Các hệ thống biểu hiện thường được sử dụng như: hệ thống vi khuẩn, hệ thống biểu hiện tế bào huyền phù BY2, hệ thống biểu hiện rễ tơ và hệ thống biểu hiện tạm thời ở thực vật. Trong đó, các hệ thống biểu hiện ở thực vật thể hiện khả năng ưu việt hơn so với các hệ thống khác như: khả năng tạo sinh khối, khả năng thu nhận protein tái tổ hợp, ít tốn công chăm sóc v.v… Đặc biệt là các mầm bệnh, virus thực vật không phải là đối tượng gây bệnh cho con người, nên rất phù hợp để biểu hiện các loại protein tái tổ hợp của người phục vụ trong y học

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu Đề tài sử dụng dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum L. Cv Bright Yellow 2), cây thuốc lá N.

benthamiana và N. tabacum K326 do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học cung cấp. Các chủng vi khuẩn E. coli DH-5α, A. tumefaciens, A. rhizogenes, E.coli Rosetta-gami B của Viện

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt nam cung cấp. Tế bào 2E8 do Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp. Các vector: pBSK, pK7WG2D.1, pCB301, pRTRA 35S-TBAG-100xELP, pENTRTM221/cal nhận từ Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

Hóa chất, các bộ KIT được sử dụng của các hãng Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Promega… Các loại enzyme sử dụng của hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…Các thí nghiệm trong nghiên cứu của luận án được thực hiện tại Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng thí nghiệm trọng điểm về Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận án hoàn thành tại Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen interleukin 7 tối ưu biểu hiện protein ở thực vật

Khai thác trình tự nucleotide và trình tự mRNA. Tiến hành thay các codon hiếm trong gen IL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật. Thêm trình tự cmyc, histag, các vị trí nhận biết enzyme giới hạn vào trình tự. Sử dụng BioEdit kiểm tra trình tự nucleotide và trình tự acid amin trước và sau khi đổi mã. 2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen mang gen interleukin 7 tái tổ hợp Trong nội dung đề tài, chúng tôi thiết kế các vector chuyển gen: (1). pRTRA 35S-IL7-100xELP; (2). pCB301_IL7/ELP. 2.3.3. Phương pháp biểu hiện gen ở cây thuốc lá

Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá được thực hiện gián tiếp thông qua A. rhizogene theo phương pháp của Topping (1998) 2.2.4. Nhóm phương pháp phân tích dòng chuyển gen

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR, xác định protein tái tổ hợp bằng lai miễn dịch Western blot. Phân tích biểu hiện protein bằng điện di protein theo Laemmli (1970) và Western blot. Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng ELISA theo phương pháp của Sun và cs (2006). Protein được tinh sạch theo phương pháp IMAC và mITC và được đánh giá hoạt tính sinh học bằng dòng tế bào 2E8.

3

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Thay đổi mã di truyền gene Interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật

Chúng tôi sử dụng trình tự gene interleukin 7 ở người được công bố trên Ngân hàng Gene có mã số: J04156.1 và bảng tần suất các codon phổ biến ở thực vật (Codon Usage Database) [36], cùng với phần mềm Codon Optimization 2.0 để loại bỏ và thay thế khoảng 10% các codon hiếm trong gen IL-7 bằng các codon phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi thành phần và trật tự các acid amin. Ngoài ra, chúng tôi cũng tiến hành loại bỏ trình tự ATTTA trên gen IL-7 được cho là gây bất ổn trong quá trình phiên mã mRNA, kết hợp sử dụng phần mềm của Invitrogene để giảm thiểu sự hình thành cấu trúc mRNA thứ cấp.

Kết quả trên hình 3.1 cho thấy, chúng tôi đã thay đổi thành công mã di truyền của gene interleukin 7 để phù hợp và nâng cao hiệu quả biểu hiện trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin so với gene gốc, với độ tương đồng nucleotide là 63,6 %, độ tương đồng acid amin là 100%. Ngoài ra, để chuẩn bị cho việc cắt và ghép nối gene trong quá trình thiết kế vector chuyển gene, các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn NcoI, SacI, HindIII đã được thêm vào đầu 5’ và 3’ của gene interleukin 7. Đồng thời, chúng tôi cũng thêm các trình tự nucleotide mã hóa cho protein c-myc và epitope his-tag cũng được gắn vào đầu 3’ của gene.

Trình tự nucleotide gene interleukin 7 sau khi được tối ưu có kích thước 536bp, được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Hoa Kỳ) và được nhân dòng trong vector pBSK/IL7. 3.2. Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá 3.2.1. Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

Cấu trúc vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP được mô phỏng như hình 3.2

Hình 3.2. Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP

Chúng tôi tiến hành nhân gene IL-7 từ vector pBSK/IL7 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.A cho thấy, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 564bp.

Vector pRTRA 35S/TBAG-histag-cmyc-100xELP được xử lý với enzyme cắt giới hạn BamHI và điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.B cho thấy, tại đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5051 bp và 1152 bp tương ứng với kích thước của vector pRTRA 35S-histag-cmyc-100xELP mở vòng và gene TBAG theo tính toán lý thuyết. Chúng tôi tiến hành thôi gel và tinh sạch đoạn DNA có kích thước 5051 bp để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.

A B C D

Hình 3.3. Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

(A). Kết quả PCR nhân gene IL-7 bằng IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R; (B). Kết quả cắt vector pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme BamHI; (C): Kết quả colony PCR bằng cặp mồi 35S-SQF và IL7_BamHI_R, 1-10: mẫu khuẩn, (-). Đối chứng âm (pRTRA 35S/TBAG-cmyc-histag-100xELP), (+). Đối chứng dương (pBSK/IL7); (D). Kết quả cắt kiểm tra vector pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP

bằng enzyme giới hạn BamHI Tiến hành lai ghép gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-histag-cmyc-100xELP tạo vector tái tổ hợp

pRTRA 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP với sự xúc tác của enzyme T4 ligase ở 220C trong 1 giờ 30 phút. Plasmid tái tổ hợp sẽ được biến nạp vào tế bào E.coli DH 5α để nhân dòng bằng phương pháp sốc nhiệt.

4

Để chọn lọc các dòng khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc có mang vector chứa gene mã hóa protein IL-7, chúng tôi thực hiện phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu để check chiều 35S-SQF và IL7_BamHI_R. Kết quả thể hiện trên hình 3.3.C cho thấy, trong 10 dòng khuẩn lạc thí nghiệm, có dòng 2, 4, 5, 7, 8, 9 dương tính với băng có kích thước khoảng 0,8kb gồm kích thước của gene mã hóa protein IL-7 (564bp) cộng kích thước của một đoạn promoter (250bp). Để loại bỏ khả năng dương tính giả của phản ứng colony PCR, chúng tôi tiến hành tách plasmid các khuẩn lạc dương tính và thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn BamHI.

Theo tính toán lý thuyết, vector pRTRA tái tổ hợp khi cắt bằng enzyme giới hạn BamHI sẽ cho 2 băng khi kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Tại đường chạy 1 trên hình 3.3.D xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 5 kb và 0,56 kb tương ứng với kích thước vector pRTRA mở vòng (5051bp) và gene IL-7 (564bp). Cấu trúc này sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5α để nhân dòng và sử dụng làm nguyên liệu để thiết kế vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP. 3.2.2. Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP

Plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 được xử lý đồng thời bằng enzyme cắt giới hạn HindIII. Với plasmid pBC301 để tránh hiện tượng tự đóng vòng, sản phẩm cắt với enzyme HindIII sau khi tinh sạch được xử lý tiếp bằng enzyme SAP. Các sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Trên hình 3.4.A cho thấy, ở đường chạy 1 (sản phẩm cắt pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP) xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 2.9 kb và 2.6 kb; ở đường chạy 2 (sản phẩm cắt pCB301 đã xử lý qua SAP) có 1 băng có kích thước khoảng 5.6 kb. Điều này chứng tỏ đã cắt thành công plasmid pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và pCB301 bằng HindIII. Tiến hành thôi gel, tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thước 2.9 kb và 5.6 kb chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo.

Tiến hành phản ứng lai ghép casette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vector mở vòng pCB301 tạo vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái tổ hợp và được biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào vi khuẩn E.coli DH5α để chọn lọc, nhân dòng.

Chọn 5 khuẩn lạc mọc trên môi trường chọn lọc, tiến hành phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, kết quả thể hiện trên hình 3.4.B cho thấy, ở các đường chạy xuất hiện 1 băng có kích thước khoảng 564bp tương ứng với kích thước gene IL-7 theo tính toán lý thuyết. Để tránh khả năng dương tính giả của PCR, chúng tôi tiến hành tách plasmid và cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn HindIII. Kết quả thể hiện trên hình 3.4.C, trên đường chạy 1 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 2.9 kb và 5.6 kb theo đúng kích thước tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã thiết kế thành công vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp.

A B C Hình 3.4. Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép

tạo vector chuyển gene pCB301/IL7/100xELP (A). Kết quả xử lý vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và vector pCB301 bằng enzyme giới hạn HindIII; (B). Kết quả kiểm tra colony PCR pCB301/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng cặp mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, (-). Đối chứng âm (pCB301), (+). Đối chứng dương (pBSK/IL7); (C). Kết quả cắt kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme giới hạn HindIII

Do chỉ sử dụng một enzyme cắt giới hạn khi tạo đầu dính giữa vector pCB301 và cassette 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP nên chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn NcoI để kiểm tra chiều cassette chuyển vào so với chiều của vector pCB301. Vector pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP tái tổ hợp có hai vị trí nhận biết

5

của enzyme giới hạn NcoI, một vị trí nằm trên vector và một vị trí nằm trên cassette, do đó khi xử lý bằng NcoI sẽ cho ra 2 băng có kích thước khác nhau tùy theo cassette gắn xuôi chiều hay ngược chiều với vector pCB301.

Hình 3.5. Kết quả kiểm tra

vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP bằng enzyme NcoI M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1. Sản phẩm cắt ngược chiều; 2. Sản cắt xuôi chiều

Kết quả thể hiện trên hình 3.5 cho thấy, ở đường chạy 1 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 3.6 kb và 4.9 kb tương ứng với kích thước tính toán lý thuyết khi cassette gắn ngược chiều với chiều của vector pCB301, còn ở đường chạy 2 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 6.9 kb và 1.6 kb tương ứng với trường hợp cassette gắn xuôi chiều với vector pCB301. Sau đó, lựa chọn những vector tái tổ hợp có chứa cassette ngược chiều sau khi cắt kiểm tra để biến nạp vào tế bào A.tumefaciens C58C1 bằng xung điện để chuẩn bị cho thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phương pháp Agro-infiltration 3.3.1. Tạo dòng tế bào A.tumefaciens C58C1/pGV2260 mang vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP Từ kết quả ở mục 3.2.5, vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP tái tổ hợp đã được thiết kế thành công, sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng phương pháp xung điện (mục 2.2.3.2.f). Sản phẩm của quá trình biến nạp được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh rifamycin 50 mg/l, carbemycin 50 mg/l và kanamycin 50 mg/l trong 2 ngày. Chúng tôi lựa chọn 5 khuẩn lạc mọc riêng rẽ, tròn đều phát triển trên môi trường chọn lọc để kiểm tra bằng phản ứng colony PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R và phản ứng cắt bằng enzyme giới hạn NcoI. Kết quả thể hiện trên hình 3.6 và 3.7.

Hình 3.6. Kết quả colony PCR bằng cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R

M. Thang DNA chuẩn 1 kb; 1 - 5. Các dòng khuẩn lạc; (-). Đối chứng âm; (+). Đối chứng dương

Trên hình 3.6 cho thấy, tại các đường chạy 1 - 5 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 564 bp, tương ứng với kích thước gene IL-7 nhân bằng cặp mồi IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R, đồng thời giếng đối chứng âm không có băng nào, đối chứng dương là plasmid pBSK/IL7 cũng xuất hiện một băng kích thước khoảng 564 bp. Điều này chứng tỏ phản ứng colony PCR đã thành công và mẫu không bị nhiễm.

6

Hình 3.7. Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI

Để khẳng định chắc chắn cho kết luận, chúng tôi tiến hành tách plasmid các dòng khuẩn dương tính với phản ứng colony PCR và cắt bằng enzyme giới hạn NcoI. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy, tại đường chạy số 1 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 3,6 kb và 4,9 kb đúng theo tính toán lý thuyết của vector pCB301 và cassette 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.

Từ những kết quả trên cho thấy chúng tôi đã biến nạp thành công vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào vi khuẩn A.tumefaciens C58C1/pGV2260. 3.3.2. Biểu hiện tạm thời protein IL-7 bằng phương pháp Agro-infiltration Quá trình biến nạp vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào cây thuốc lá được thực hiện theo quy trình đã trình bày tại mục 2.2.4. Sau 6 ngày biến nạp, tiến hành thu lá, bảo quản ở -800C để chuẩn bị cho các thí nghiệm kiểm tra sự có mặt của vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP và biểu hiện tạm thời của protein IL-7 tái tổ hợp với sự hỗ trợ của protein Hc-Pro ức chế cơ chế câm gene hoạt động trong cây bằng phương pháp western blot. 3.4. Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp Để kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành tách chiết protein tổng số và đo nồng độ theo phương pháp của Bradford (1976), sau đó sử dụng kỹ thuật lai miễn dịch Western blot trên các vị trí biểu hiện tạm thời ở lá non, lá bánh tẻ và lá già. Qua thực nghiệm, chúng tôi nhận thấy khả năng biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp khác nhau ở các lá có độ tuổi khác nhau, trong đó biểu hiện mạnh nhất ở lá non; điều này có thể giải thích do ở lá non có tốc độ sinh trưởng mạnh, sinh tổng hợp protein mạnh hơn so với lá bánh tẻ và lá già. Kết quả thể hiện trên hình 3.9 cho thấy ở các đường chạy 1, 2, 3 xuất hiện một băng có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7 tái tổ hợp theo tính toán lý thuyết, trong khi ở đường chạy đối chứng âm, cây thuốc lá không chuyển gene không xuất hiện băng này

Hình 3.9. Kiểm tra biểu hiện protein IL-7 tái tổ hợp trong lá thuốc lá bằng Western blot

M. Thang protein chuẩn (4 - 20% tris-glycine SDS-PAGE); 1. Lá non, 2. Lá bánh tẻ, 3. Lá già; (-). Đối chứng âm (lá thuốc lá không chuyển gene)

3.5. Phân tích định lượng và tinh sạch protein Il-7 tái tổ hợp Sau khi biểu hiện thành công protein IL-7 tái tổ hợp trong thuốc lá, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (niken) để tinh sạch và định lượng protein IL-7 tái tổ hợp. Đây là phương pháp hiệu quả để tinh sạch protein tái tổ hợp liên kết với his-tag. Phương pháp này dựa

7

trên nguyên lý histidine tạo phức hợp với các kim loại hoá trị II (niken) ở nồng độ pH trung tính. Sự tương tác của protein liên kết his-tag với kim loại phụ thuộc vào nồng độ pH. Protein đích sau khi liên kết với cột tinh sạch, sẽ được hoà tan thu lại bằng cách giảm pH dung dịch hoặc tăng nồng độ của đệm ion hoặc nồng độ của đệm EDTA hoặc imidazole. Sau khi tinh sạch, chúng tôi kiểm tra sự biểu hiện của protein IL-7 tái tổ hợp bằng điện di SDS-PAGE và phương pháp lai miễn dịch Western blot. Kết quả thể hiện trên hình 3.10 cho thấy, chúng tôi chỉ thu được một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa, đúng theo tính toán lý thuyết.

Hình 3.10. Kết quả tinh sạch và định lượng protein IL-7 bằng phương pháp IMAC

(A). Điện di SDS-PAGE: 1A. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2A. Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3A. Protein IL-7 sau tinh sạch (B). Kết quả Western blot: 1B. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP; 2B. Dịch chiết thu nhận sau khi đi qua cột tinh sạch; 3B. Protein IL-7 sau tinh sạch (C). Định lượng protein IL-7 bằng western blot và sử dụng phần mềm ImageJ: 1C, 2C, 3C, 4C: đối chứng dương có nồng độ 50, 100, 150, 200 ng/giếng, 5C. Dịch chiết thô chứa protein IL7-ELP trước xử lý, 6C. protein IL-7 sau tinh sạch (30 µg protein tổng số/giếng.

Từ 1kg mẫu lá tươi, sau khi tinh sạch theo phương pháp IMAC và thu nhận lại protein IL-7 tái tổ hợp bằng concentrator iCONTM, nồng độ protein tổng số được định lượng theo phương pháp của Badford và protein IL-7 được định lượng bằng phần mềm ImageJ trên màng lai. Kết quả thu được 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8 gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg lá tươi. So sánh với một số nghiên cứu biểu hiện protein tạm thời khác thì sự biểu hiện của protein IL-7 trong cây thuốc lá N. Benthamiana của chúng tôi là tương đối cao.

Kết quả này cho thấy hiệu quả của phương pháp biểu hiện tạm thời và tinh sạch protein IL-7 từ cây thuốc lá N. benthamiana trong thời gian ngắn, dễ thực hiện. Để có thể thu được protein IL-7 tái tổ hợp với hàm lượng cao hơn, chúng tôi tiếp tục định lượng và tinh sạch bằng phương pháp mITC dựa trên đặc tính của sự gắn kết giữa ELP với protein đích IL-7. Chúng tôi sử dụng 100 gam lá thuốc lá đã được biến nạp bằng phương pháp agroinfiltration để tinh sạch thu nhận protein IL-7 tái tổ hợp theo phương pháp mITC (mục 2.2.6.2).

Chúng tôi tiến hành thu lại dịch chiết protein sau mỗi bước tinh sạch gồm dịch chiết thô trước tinh sạch, dịch ra khỏi màng sau khi đưa dịch chiết thô qua màng và dịch tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore Q lạnh. Dịch thu được sau từng bước được đo nồng độ protein theo phương pháp Bradford (1976) và phân tích bằng phương pháp lai miễn dịch western blot để kiểm tra protein tinh sạch và đánh giá hiệu suất thu hồi protein. Kết quả thể hiện trên bảng 3.1 và hình 3.11.

Kết quả trên hình 3.11 cho thấy, ở đường chạy 3 xuất hiện 2 băng có kích thước khoảng 64 kDa và 130 kDa (trạng thái dimer) của protein có gắn đuôi ELP; còn ở đường chạy 2 là dịch chiết protein ra khỏi màng lọc sau khi đưa dịch protein thô ban đầu qua màng không xuất hiện băng protein nào, điều này chứng tỏ protein IL7 có gắn đuôi ELP đã được giữ lại trên màng lai không bị rửa trôi cùng các protein khác. Ở đường chạy số 1 là dịch chiết sau khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh ở nồng độ ion thấp chỉ có một băng protein có kích thước khoảng 64 kDa tương ứng với kích thước protein IL-7 tái tổ hợp theo tính toán.

8

Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC

Dịch chiết protein Protein tổng số (mg)

Protein tái tổ hợp (mg)

Hiệu suất thu hồi (%)

Độ tinh sạch (%)

Dịch thô trước tinh sạch 1634,7 38,3 100 X

Dịch IL-7 đã tinh sạch 45,8 36,7 95,82 86,3

Hình 3.12. Định lượng protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch

1. Dịch chiết thô chứa protein IL7/ELP trước khi tinh sạch (30 µg/giếng); 2. Protein IL-7 tách khỏi màng khi rửa màng bằng nước milipore-Q lạnh; 3, 4, 5, 6. Đối chứng dương với các nồng độ 200, 150, 100, 50 ng/giếng.

Từ kết quả xác định nồng độ protein cho thấy hiệu suất thu hồi protein IL-7 bằng phương pháp mITC

đạt 95,82 %, độ tinh sạch đạt 86,3%. Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số là 2,34%, kết quả này tương đương với những nghiên cứu trước đó về hàm lượng protein tái tổ hợp trên protein hòa tan tổng số: 2% [47], [143]; 2,2% [1]; 3% [29]. 3.6. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp Để đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp đã mô tả ở mục 2.2.7 với các nồng độ IL-7 là: 0,125 µg/ml; 0,25 µg/ml; 0,5 µg/ml; 1 µg/ml; 1,5 µg/ml; 2 µg/ml; 2,5 µg/ml. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.13.

Hình 3.11. Kết quả tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp bằng phương pháp mITC M. Thang protein chuẩn; 1. Protein IL-7 tinh sạch sau khi rửa màng bằng nước lạnh; 2. Dịch chiết ra khỏi màng sau khi đưa dịch thô qua màng; 3. Dịch chiết protein chứa IL7/ELP trước tinh sạch

9

Bảng 3.2. Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng interleukin 7 Nồng độ protein IL-7 % hoạt hóa dòng tế bào 2E8

0.125 µg/ml 35.7 0.25 µg/ml 45.3 0.5 µg/ml 53.5 1 µg/ml 65.8

1.5 µg/ml 73.6 2 µg/ml 82.5

2.5 µg/ml 79.3 Giá trị ED50 (µg/ml) 0.35

Qua bảng 3.2 và hình 3.13 cho thấy, protein IL-7 tái tổ hợp có hoạt tính sinh học trong việc hỗ trợ

sinh trưởng và hoạt hoá dòng tế bào 2E8, với khả năng hoạt hóa đạt 82,5% so với đối chứng âm (dòng tế bào 2E8 không bổ sung IL-7 vào môi trường nuôi cấy). Ở các nồng độ chất thử IL-7 tăng dần, % hoạt hóa tế bào của mẫu cũng tăng theo, cho thấy hoạt tính sinh học của mẫu thử khá ổn định; trong đó, khả năng hoạt hóa cao nhất đạt được ở nồng độ 2 µg/ml là 82,5%, sau đó khả năng hoạt hóa không tăng mà lại giảm đi, điều này có thể giải thích do interleukin 7 khi ở liều lượng cao có thể gây ức chế cho sự sinh sản và hoạt hóa tế bào, thậm chí gây chết cho tế bào.

Qua kết quả trên, có thể bước đầu khẳng định protein IL-7 tái tổ hợp có khả năng thể hiện hoạt tính sinh học giống với tự nhiên, mở ra khả năng sản xuất lượng lớn protein IL-7 tái tổ hợp phục vụ trong y học nhằm đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho con người.

Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1. Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá Thực vật hiện nay được sử dụng rất nhiều trong các nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp. Protein tái tổ hợp có thể được biểu hiện trong thực vật thông qua hai phương pháp: tạo cây chuyển gen và biểu hiện tạm thời. Trong phương pháp tạo cây chuyển gen, gen tái tổ hợp được nhân bản trong vector biểu hiện và chuyển vào hệ gen thực vật. Do đó, gen tái tổ hợp sẽ được di truyền qua các thế hệ tiếp theo và có thể sản xuất quy mô lớn protein tái tổ hợp. Trong phương pháp biểu hiện tạm thời, thay vì tích hợp vào hệ gen của thực vật thì gen chuyển sẽ nhanh chóng tạo ra protein tái tổ hợp. Phương pháp này có lợi thế về mức độ biểu hiện protein tái tổ hợp cao hơn rất nhiều so với phương pháp khác, cũng như thời gian sản xuất protein nhanh hơn, không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen trong tế bào thực vật, đặc biệt không gặp phải vấn đề an toàn sinh thái như phương pháp tạo cây chuyển gen. Tuy nhiên, phương pháp biểu hiện tạm thời do gen chuyển không được gắn vào hệ gen của thực vật nên thường bị cơ chế câm gen (RNAi) dịch mã và sau dịch mã tác động, dẫn đến hàm lượng protein tái tổ

35.745.3

53.363.8

73.682.5 79.3

0102030405060708090

0.125 0.25 0.5 1 1.5 2 2.5

% h

oạt h

óa d

òng

tế b

ào 2

E8

Nồng độ mẫu thử (µg/ml)

Protein IL-7

Hình 3.13. Hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp

10

hợp thu nhận được không cao. Đây là cơ chế phản ứng của thực vật trước sự xâm nhập của DNA ngoại lai, dẫn đến sự phá hủy trình tự gen đặc hiệu và làm giảm sản phẩm protein do gen mã hóa. Trong nghiên cứu của luận án, để tránh gặp phải hiện tượng RNAi có thể làm giảm hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp, chúng tôi đã biểu hiện đồng thời cả protein đích interleukin 7 và protein hỗ trợ Hc-Pro của virus khoai tây Y nhằm chống lại hiện tượng câm gen ở thực vật bằng cách ngăn cản sự phân giải mRNA và RNA sợi đôi, từ đó giảm lượng siRNA hoặc phá hỏng chức năng cắt của enzyme cắt sợi đôi Dicer và RISC. Kết quả, chúng tôi đã thu được protein IL-7 tái tổ hợp biểu hiện ở lá cây thuốc lá với hàm lượng khá cao. 4.2. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC

Mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp ở thực vật thường không cao là một trong những giới hạn khi nghiên cứu biểu hiện protein ở thực vật. Đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm vượt qua giới hạn đó để tăng cường khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp khi biểu hiện ở thực vật bằng nhiều phương pháp như: tối ưu hóa codon, kết hợp với một thành phần hỗ trợ như enzyme lichenase, ELP.

Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi đã sử dụng 100xELP cùng với protein IL-7 dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35 nhằm tăng cường khả năng biểu hiện protein IL-7 ở thực vật. Kết quả của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu khác như: Patel và cộng sự (2007) đã tăng cường sự biểu hiện của interleukin 4 của người lên 19 lần và interleukin 10 lên 15 lần khi kết hợp với 27xELP; nghiên cứu của Floss (2009) cũng cho thấy, mức độ biểu hiện của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của kháng thể kháng HIV (2F5 và 2G12) cao hơn khi không có sự kết hợp với ELP. Từ những kết quả này cho thấy sự tích lũy các protein tái tổ hợp là do hiệu ứng của ELP chứ không phải do vị trí của gen chuyển.

Sự tăng cường biểu hiện của protein kết hợp với ELP có thể được giải thích là do các protein kết hợp ELP khó bị protease của tế bào chủ phân cắt hoặc thủy phân hơn. Điều này dẫn tới hàm lượng protein tái tổ hợp cao hơn so với bình thường, góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp tinh sạch và thu nhận protein tiếp theo.

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp nhằm tinh sạch và thu nhận các loại protein tái tổ hợp đạt nồng độ cao và tinh khiết như: phương pháp sắc ký lọc gel, phương pháp sắc ký ái lực (IMAC), sắc ký trao đổi ion, phương pháp đảo chiều thuận nghịch mITC. Tùy thuộc vào nghiên cứu và loại protein, người ta lựa chọn phương pháp tinh sạch tối ưu nhất để thu được hàm lượng protein tái tổ hợp cao nhất.

Phương pháp tinh sạch protein đảo chiều thuận nghịch mITC dựa trên tính chất đảo ngược chuyển từ trạng thái tan sang trạng thái không tan và ngược lại khi nhiệt độ môi trường thay đổi của ELPylated tỏ ra có nhiều ưu điểm và được ứng dụng ngày càng rộng rãi do hàm lượng protein tái tổ hợp thu nhận được nhiều với độ tinh sạch cao, các bước tiến hành nhanh và đơn giản do sự kết tinh của các protein gắn kết ELP được giữ lại trên bề mặt màng và dễ dàng được khử khỏi màng.

Trong nghiên cứu của luận án, chúng tôi sử dụng hai phương pháp để tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp là phương pháp sắc ký ion cố định kim loại (IMAC) và phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC). Đối với phương pháp sắc ký ion cố định kim loại, chúng tôi thu được hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp đạt 252 mg protein IL-7 tinh sạch/8gram protein hòa tan tổng số, đạt tỷ lệ 3,15%, tương đương nồng độ protein IL-7 tái tổ hợp là 252 mg/kg lá tươi. Đối với phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp bằng đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC), chúng tôi thu được hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp đạt 367 mg/kg lá tươi với hiệu suất thu hồi đạt 95,82 % và độ tinh sạch đạt 86,3%. Qua số liệu thu được cho thấy, phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng (mITC) dựa trên đặc tính của ELP có hiệu suất thu hồi cao hơn hẳn các phương pháp khác; kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương đồng với những nghiên cứu trước đó về biểu hiện protein tái tổ hợp có gắn kết ELP như Scheller và cộng sự (2006) đã tổng hợp được protein scFV tái tổ hợp với hàm lượng tăng gấp 40 lần so với thông thường, không gắn với ELP, Theo Floss (2009), việc gắn kết với ELP có thể làm tăng mức độ biểu hiện của các kháng thể vô hiệu hóa HIV biểu hiện trong hạt; ELP kết hợp với các protein tái tổ hợp ở đầu C cũng làm tăng sự tích lũy của nhiều loại protein biểu hiện trong lá.

Từ những kết quả trên cho thấy, việc biểu hiện protein tái tổ hợp gắn kết với ELP và tinh sạch bằng phương pháp đảo chiều thuận nghịch qua màng mITC cho hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp với độ tinh sạch cao hơn so với các phương pháp khác. Mở ra một hướng nghiên cứu nhiều triển vọng cho mục đích thu nhận protein tái tổ hợp của người sản xuất ở thực vật nhằm phục vụ trong y dược học, chữa bệnh cho con người.

11

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 1. Kết luận

1. Mã di truyền của gen hIL-7 được thay đổi phù hợp với hệ thống biểu hiện ở thực vật với độ tương đồng nucleotide là 63,6 % và độ tương đồng acid amin là 100%.

2. Các cấu trúc vector chuyển gen pET32c(+)/IL7; pENTR221/IL7/cal; pK7WG2D.1/cal/IL7; pRTRA 35S-IL7-100xELP; pCB301_IL7/ELP được thiết kế phục vụ chuyển gen vào tế bào vi khuẩn E.coli rosetta-gami B, dòng tế bào huyền phù BY-2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá để biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp.

3. Hàm lượng protein IL-7 tái tổ hợp thu được qua hệ thống nuôi cấy cao nhất đạt 367 mg/kg lá tươi khi biểu hiện tạm thời ở cây thuốc lá và thu nhận bằng phương pháp tinh sạch mITC; thấp nhất khi biểu hiện qua hệ thống nuôi cấy huyền phù BY-2 dao động từ 2,25 ng/µg đến 3,25 ng/µg protein tan tổng số.

4. Hoạt tính sinh học của protein IL-7 đạt 82,5% ở nồng độ 2 µg/ml. 2. Đề nghị

Trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được, để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu sâu hơn; chúng tôi đề xuất một số đề nghị sau:

1. Tiếp tục thử nghiệm protein IL-7 tái tổ hợp đã tinh sạch ở mức độ động vật thí nghiệm và trên lâm sàng nhằm đánh giá sâu hơn hoạt tính sinh học của protein IL-7 trước khi sản xuất trên diện rộng.

2. Nghiên cứu biểu hiện protein IL-7 ở một số loài thực vật khác để làm phong phú nguồn nguyên liệu tổng hợp protein IL-7 tái tổ hợp.