DOCTORADO EN CIENCIAS YBIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Estudio de la enzima Fosfolipasa C en raícestransforma\das de Catharanthus roseus

César de los Santos Briones

Centro de lnvestigación Científica de Yucatán, A.C.

CENTRO DE INVESTIGACION CIENTIFICA DE YUCATAN, A.C.

UNIDAD DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL

"ESTUDIO DE LA ENZIMA FOSFOLIPASA C EN RAÍCES

TRANSFORIVIADAS DE Cafharanfhus roseus"

TESIS QUE PRESENTA

Q.B.B. CÉSAR DE LOS SANTOS BRIONES

PARA OBTENER EL GRADO DEDOCTOR EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGIA DE PLANTAS

MERIDA, YUCATAN, MEXICO1998

A YERENl por todo lo que hemos compartido en la vida y por lo que sigue. .A toda mi familia: a mis padres y hermanos, a la familia Minero-García, por

su fe en mí y por ser todos una familia.

RECONOCIIvllENTOS

Este trabajo se realizó en la Unidad de Biología Experimental del Centro delnvestigación Científica de Yucatán AC. bajo la dirección de la Dra. TeresaHernández Sotomayor y el Dr. Víctor M. Loyola Vargas

Este trabajo fue financiado por la Fogany lnternational ResearchCollaboration Award (R03TW00263), el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología(3016-N9306), la ln{ernati.onal Foundati.on for Science (C/2236-1) y una beca delConsejo Nacional de Ciencia y Tecnología (88202) para César de los SantosBriones.

AGRADECIMIENTOSDe manera especial:A la Dra Teresa Hernández Sotomayor, al Dr Víctor M Loyola Vargas,

Dra. Rosario Muñoz Clares, al Dr. José Luis Boyer, al Dr. Vi.ctor Baizabal, a laRenata Rivera y al Dr. Jorge Santamaria por sus excelentes sugerencias y larevisión crítica con la que enriquecieron el presente escrito

A la Dra Rosario Muñoz Clares, al Dr. José Luis Boyer, al Dr Víctor MLoyola Vargas y a la Dra Teresa Hernández Sotomayor por formar par(e de micomité tutorial en donde se djscutió parte importante de este trabajo.

A la Dra Teresa Hernández Sotomayor por su apoyo incondicional, suinterés por mi formación académica y por la paciencia otorgada durante mi. estanciaen su laboratorio.

AI Dr. Víctor M Loyola Vargas por la dirección y asesoría otorgada alpresente trabajo

AI QFB Armando Muñoz Sánchez por su total colaboración durante larealizacjón experimental de este trabajo y por todos los momentos vividos.

A las autoridades del Centro de lnvestigación Científica de Yucatán A C. enespecial a la Unidad de Biología Experimental por permitirme hacer uso de susinstalaciones.

AI Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologi.a, a la Fogarty lnternationalResearch Collaboration Award y a la ln{ernational Foundation for Science por elapoyo económico brindado durante la realización de este proyecto.

ABREVIATURASPl-PLC .-Fosfolipasa C específica para fosfatidi.linositolPLC .-Fosfolipasa CPI .-FosfatidilinositolPI-3-P -Fosfatidilinositol 3, monofosfatoP14-P ó PIP.-Fosfatidilinositol 4, monofosfatoPI-3,4-P2 .- Fosfatidilinositol 3, 4, bisfosfatoP14,5-P2 ó PIP2 .-Fosfatidmnositol 4, 5, bisfosfato

[3H]-PIP2.-Fosfatidi.linositol 4,5, bjsfosfato tritiado.Pl-3,4,5-P3 .- Fosfatidi.li.nositol 3, 4, 5, trisfosfatol-1,4,5-P3 Ó IP3 ,-lnosítol 1, 4, 5, trisfosfatoDAG.-1,2-Diacilglicerol

PKC.-Proteína cinasa CGPCR - Receptor acoplado a protei.nas GEGF -Factordel crecimiénto epjdérmico .PDGF.-Factor del crecimiento derivado de las plaquetasFGF.-Factor del crecimiento de los fibroblastosPTK Protei.na tirosina cinasalGF.-Factor del crecimiento de la insulinaTIIvl.-Triosa isomerasaPH.-Homología a PleckstrinaSH2.-Homología a Src 2SH3 -Homología a Src 3Src.-Sarcoma de rouslo.§ .-Concentración media inhi.bitoria

EgF£:E:,,,á:g:::::.d::sj:n.:t:t,rnaoaecté{,.cáoc,dotetraacét,co_N,N,N,,N,.DTT.-DitiotreitolPMSF.-Fenil-metil-sulfonil-fluoruroBSA.- Albúmina sérica de bovinoBCA.-Ácido bicinconínicoTCA.- Ácido tricloroacéticoSDS - Dodecilsufato de sodioPAGE.- Electroforesis en gel de poliacrilamida

FPLC -Cromatografía líquida rápida de proteínas

RESUMEN

La fosfolipasa C (PLC), que hidroliza fosfolípidos de inositol paraformar diacilglicerol y fosfatos de i.nositol, se encuentra presente en células demamíferos así como en plantas y varios microorganismos [Shukla, 1982]. Estafamilia de isoenzimas se convierte en un elemento importante al i.ni.ciar unmecanismo de transducción de señales en respuesta a estímulos específicos.Actualmente, en mamíferos se conocen 10 isoenzimas de PLC y se clasifican en 3subfamilias, P, y, y Ó; de éstas, cuatro son de tipo P, dos son de tipo y, y cuatro sonde tipo Ó [Rhee y Choi,1992; Lee y Rhee,1995; Rhee y Bae,1997]. Las isoenzi.masde tipo Ó son la forma más simple, y son las más pequeñas (Mr 85,000) encomparación con las de tipo P y y (Mr 140,000-150,000) El descubrimiento de

proteinas homólogas a las isoenzimas de la familia 8, ampliamente distribui'das enplantas [Shi eí a/,1995|, levaduras [Flick y Torner,1993], y moho de fango [Drayery Van Haastert,1992], sugiere qLie esta familia ha evolucionado en lc)s eucariontesDiferentes estudios han establecido que la PLC tiene una función específicadependiendo del sistema del que se trate Actualmente, sabemos que la PLC existeen plantas y que su actividad es detectable. Sin embargo, no existen evidenciasque sugieran una función fisiológica para la PLC en células vegetales

En el presente trabajo se identificó y caracterizó una aptividad de lafosfolipasa C presente en extractos solubles y extractos membranales de raícestransformadas de Caíharanínus roseus. Durante una curva de crecimiento, en supico máximo de actMdad, la actividad específica de la PLC en los extractosmembranales (65 nmol/min/mg de proteína) fue superior que la actividad específicade la PLC en los extractos solubles (5 nmol/min/mg de proteína). Estos valorescorresporidieron al día 8° y 4° de la curva de crecimiento respectivamente Laactividad de PLC presente en extractos membranales se activó a concentracionesmicromolares de calcio con una concentración media efectiva de 50 HM e hidrolizópreferencialmente al PIP y PIP2. La PLC prese\nte en extractos solubles tambien seactivó a concentraciones micromolares de calcio, aunque ésta tuvo unaconcentración media efectjva de 3.5 LiM, a su vez, ésta catalizó la hidrólisis del Pl yPIP Se estudió el efecto de tres diferentes detergentes. Tritón X-100, deoxicolato yoctilglucósido EI Tritón X-100 inhibió la actividad de PLC en ambos extractos. En elextracto soluble, el deoxicolato tuvo un efecto estimulatorio a bajas concentraciones(0 02-0 04%, p/v) pero un efecto inhibitorio a concentraciones altas (0.15-0 2%,p/v) El octilglucósido tuvo un efecto estimulatorio sobre la actividad de la PLC enel extracto membranal a una concentración de 0 04% y en el extracto soluble apartir de 015%, Se establecjeron diferentes estrategias para la purificación de laenzima en ambos extractos que incluyen cromatografía de mtercambio iónico,cromatografía de afinidad, y cromatografi.a de exclusión por tamaño. La enzimaasociada a la membrana fue solubilizada utilizando Kcl 2 M y fue purificadaparcialmente por cromatografia de afinidad. Se obtuvieron 5 veces cle purificaciónpartiendo del eluato desalado de ambas fracciones y teniendo como mezcla finalalgunas bandas mayoritarias del rango de 55 a 75 kDa Estas estrategias podránservir como antecedente para trabajos futuros relacionados con la purificación de lafosfolipasa C en plantas.

ABSTRACT

The phospholipase C (PLC) isozymes, which cleave i.nositolphospholipids to diacylglycerol and inositol phosphates, are present in mostmammalian cells as well as in plants and various mjcroorganisms [Shukla,1982].PLC isozymes play a crucial role in initiating the signal {ransduction cascade inresponse to specific stimulus. To date, 10 mammalian PLC isozymes have beenidentified and divided into three types known as P, y, and 6 (four PLC-P, two PLC-y,and four PLC-Ó) [Rhee and Choi,1992; Lee and Rhee,1995]. The 6-type isozymesare smaller (Mr 85,000) than the PLC-O and PLC-y (Mr 140,000-150,000) isoforms.To date, Ó-type isozymes have been identified in lower eukaryotes such as yeast[Flick and Torner, 1993], slíme molds [Drayer and van Haastert, 1992], and plants[Shi ef a/.,1995], suggesting that this family has been evolved among eukaryotes.The role of PLC in several systems including invertebrates, microorganisms, andmammalians has been studied. At present, PLC activiv has been identified inplants; however, its functional role has not yet been established

This study shows the identification and characterization of aphosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phospholipase C (PIP2-PLC) in cytosol andmembrane extracts from transformed roots of Cafharanífius roseus During agrowth curve, the maximal specific activity of the enzyme in plasma membranes (65nmol/min/mg protein) was higher than the maximal in cytosol (5nmol/min/mgprotein). These values did correspond at 8" and 4" days of culture, respectively.Both activities were calcium-dependent. PLC activity from membrane extracts wasactivated by micromolar concentrations of calcium; with a half effectiveconcentration of 50 HM and hydrolyzed preferentially PIP and PIP2. PLC acti.vityfrom cytosolic extracts also was activated by micromolar concentrations of calcium,however it had 3.5 uM as half effective concentration; it catalized the hydrolysis of Pland PIP. The effects of three detergents on both activities were also studied. TritonX-100, deoxicholate and octylglucoside. Triton X-100 had an inhibitory effect onboth PLC activiti.es. ln soluble extracts, deoxicholate had a stimulatory effect at lowconcentrations (0.02-0.04%, w/v) but i.nhibited at higher concentrations (0.15-0.2%,w/v) Octylglucoside had a stimulatory effect on membrane associated activity at0.04% and on soluble activity at 0.15%. Several strategies to puri.ficate the enzymeÍn both extracts were followed. lon exchange chromatography, affínitychromatography and gel filtration chromatography were included for the purificationof the enzyme. The membrane-associated activity was solubilized using 2 M KCI ; itwas pamally purified by means of affinjty chromatography. We obtained 5 foldpurification since the desalting step, and a final preparation with several proteins ofmolecular weigh(s ranging from 55 to 75 as de{ermi.ned by SDS~polyacrylamide gelelectrophoresis. We hope that the purification s(rategies used in this study will beuseful for future purification of plant phospholipase C

CONTENIDO

RECONOCIMIENTOSABREVIATURASRESUMENABSTRACTlntroducción

Capítulo 1. AntecedentesSi.stema fosfoinosítidos-calcioReceptores de la superficie celular

Receptores acoplados a protei.nas GReceptores con actividad de tirosi.na cinasa

Proteínas GLa fosfolipasa C en células animales

lsoenzimasCa racteri.sticas estru ctu ra les

Domini.o X y dominio YDominios SH2 y SH3Dominios PHDominios EF-Hand y C2

Mecanismos de regulaciónActivación por receptores con actMdad de tirosina cinasaActivación por receptores acoplados a proteínas GActlvación de la PLC-ó

Localización de las isoenzimas de la PLCCaracterización de las isoenzimas de la PLCFunción de la PLC en diferentes slstemas

Fosfoinosítidos en plantasPLC en plantas

Modelo de estudio. Caíharaníhus roseus (L.) G. Don.HipótesisObjetivos Generales y Particulares

Catharanth us rcseusCapítulo 4. DISCUSION GENERALCapitulo 5. CONCLUSIONESCapítulo 6. PERSPECTIVAS

1

33456778910

10

11

11

11

12

13

1415

15

16

1819

2325

Capítulo 2. -Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphoiipase c activity during 25

capítuio 3. tE:r#:::To9nphpaasr:i:if ::"i:'af:gf::ipr:::"S tTnns::irc::dt:::=f¿rmadas de 43

lNTRODUCCIÓN

Todos los organismos vÍvos reaccionan a señales de su medioambiente para poder sobrevivh y adaptarse a sus condici.ones de vida En losorganismos multi.celulares es necesaria la comunicación intercelular, un conti.nuoflujo de información entre las células que lo integran, tanto para coordjnar y regularel desarrollo, la organización y el metabolismo del gran número de células queconforman los diversos tejidos y Órganos, como para controlar el crecimiento y ladíferenciación y responder a las señales químícas en el medio ambiente. Estacomunicación puede lograrse a través de un contacto directo célula-célula, a travésde la unión de "moléculas señal" a la membrana plasmática de las células, o (en elcaso de células animales) a través de la formación de uniones "gap" cuando setrata de células vecinas [Loewenstein, 1987] Sin embargo, cuando se trata decélulas distantes, éstas se comunican a través de la secreción de mensajerosqui'micos Los mensajeros secretados pueden ser moléculas solubles (hormonas,neurotransmisores, éstas se unen a receptores que se localizan en la superficie delas células blanco) o moléculas hidrofóbicas (tales como las hormonasesteroideales, que son capaces de traspasar la bicapa lípídica de la membranaplasmática y unirse a proteínas específicas dentro de la célula) [Evans,1988]

Muchas de las señales extracelulares son transmitidas a través de lamembrana plasmática por una variedad de mecanismos que usan moléculas comosegundos mensajeros. Esto es, algunas moléculas extracelulares, entre las que seincluyen las hormonas, los factores del crecimiento, Ios neurotransmisores y otrosagonistas, se unen a receptores específicos que se localizan en la superficieexterna de la célula. La unión agonista-receptor Ínicia la producción de segundosmensajeros Estos segundos mensajeros, una vez formados, inducen reaccionesintracelulares que regulan una serie de procesos, tales como el metabolismo, lasecreción, el crecimiento celular, etc La comparación entre eucariontes Ínferiores ysuperiores de los componentes Ínvolucrados en los procesos de transducción deseñales demuestra que muchos de estos mecanismos han sido conservadosdurante la evolución.

En plantas y animales las señales extracelulares controlan elcrecimiento de muchos tejidos, gobiernan la síntesis y secreción de las proteínas yregulan la composición de los fluídos del organismo Las células de éste detectan lo

que está sucediendo en el ambiente extracelular, mantienen su homeostasis y lostraducen en respuestas fisiológicas. Algunas señales inducen una modificación enla actividad de una o más enzimas presentes en las células Este tipo de reacciónpermite a la célula responder rápidamente (en cuestión de minutos o segundos)

Los mecanismos de transducción en las células animales han sidoampliamente estudiados Un ejemplo clásico es la generación de AMP ci.clico por laadenilato ciclasa. Otro mecanismo es aquel que utiliza la hidrólisis de fosfolípidosde inositol por acción de la fosfolipasa C para producir dos segundos mensajeros,el inositol 1, 4, 5-trisfosfato y el díacilglicerol [Bemdge,1990, Taylor eí a/ .1990]

El descubrimiento del sistema de transducción de la cascada de losfosfoinosítidos llevó consigo un gran progreso en el entendimiento de cómo las

1

señales €ran percibidas por las células y convertidas en respuestas intracelularesEste avance condujo, naturalmente, a preguntarse si algún tipo de sistemas deseñales sim.ilares estaban presentes en otros eucar`iontes. Algunos estudios hansugeridolaexistenciadeunsistemasimilaraldelavíadelosfosfoinosítidosenlascélulas vegetales [Sandelius y Sommarin, 1990] Aunque se ha demostrado lacapacidad de liberación de calcio por el IP3 de membranas de cé" vegetales[SchumakerySze,1987|,estosestudiosnohansidoconcluyentesdebidoalhechode que existen reservas muy bajas de fosfatidil.inosftd 4, 5-bisfosfato (PIP2) y de•inositol 1, 4, 5-tr.isfosfato (lp3). Un segundo inconveniente radica en el lento

progreso de la caracterización funcional de los receptores para señales químicastales como` las fitohormonas Algunos estudios preliminares con reguladores decrecimiento han mostrado efectos sobre las actividades enzimáticas de la vía de losfosfoinosítidos y cambios en la reserva de diferentes metabolitos [Murthy et a/.,1989, Connet y Hanke,1987, Ettlinger y Lehle,1988]

En este trabajo se presenta la caracterización y purificación parcial dela fosfolipasa C a parim de raices transformadas de Catharanfhus roseus.

CAPITUL0 1

Antecedentes

SISTEMA FOSFOINOsiTIDOS-CALCIO

Los fosfoinosi'tidos son fosfolípidos que contienen un grupo inositol oinositol fosfato como grupo polar. El fosfatidilinositol es el más simple de losfosfoinosítidos. Los principales fosfoinosítidos con grupos fosfato en el anillo deinosjtol son el fosfatidjlinositol 4-monofosfato (PIP) y el fosfatidilinositol4,5-bisfosfato (PIP2) (Fig.1).

;ít:du::na.díí:g:!i:ás,:=gfgi£,:3i:ngors::íá;:fi!g:s%s::ctí:sf:3!,ií:s:f:::;#','B:4:=:_'i:i;i33?gij:s:toíinositol 1,3,4,5-tetrakisfosfato; F = inositol 1,3,4-trisfosfato: G = inositol l ,4-bisfosfato;

La hidrólisis de fosfolípidos de inositol por acción de la fostolípasa C(PLC) involucra un mecanismo de transducción de señales ubícuo que mediarespuestas celulares producidas por cambios en el medjo ambiente externo.

En células animales, las jsoenzimas de la PLC son actjvadas porproteínas G, receptores con actividad de tirosina cinasa (Jones y Carpenter,1992),

3

o por algún otro mecanismo aún desconocido, promoviendo la hidrólisis del PIP:localizado en la parte interna de la membrana plasmática y convirtiendo a éste enuna molécula soluble en agua (inositol 1, 4, 5-trisfosfato o lp3) y en un componenteque por su naturaleza lipídica permanece asociado a la membrana (dtacilglicerol oDAG) Ambos compuestos per se actúan como segundos mensajeros. afectandonumerosas reacciones celulares [Rhee eí a/ ,1991| La principal fiinción del lp3 esmovilizar calcio de almacenes internos no mitocondriales y quizá también estimularindirectamente la entrada de calcio a la célula con la ayuda de otro metabolitofosforilado, el inositol 1, 3, 4, 5-tetrakisfosfato El lp3 se une a receptoresespecíficos localizados en organelos internos y estimula a los canales de calcioprovocando la liberación y un aumento transitorio del calcio citosólico EI DAG, porsu pane, puede activar a una clase de proteínas cinasas conocidas como proteínascinasas C (PKC). Estas proteínas cinasas son dependientes de diacilglicéridos ycalcio originando fosforilaciones de un amplio rango de proteínas.

RECEPTORES DE LA SUPERFICIE CELULAR

Los receptores de la superficie celular son proteínas que actúan comotransductores de una señal. Éstos unen un ligando con alta afinidad y convierten unevento extracelular en una o más señales intracelulares que alteran la fisiología dela célula Los receptores son clasificados en diferentes familias basadas en sussimilitudes estructurales y modos de transducción receptores acoplados a canalesiónicos, receptores acoplados a proteínas G, receptores con actividad enzimáticaintrínseca y receptores que carecen de actividad catalítica intrínseca pero que seasocian directamente con proteínas tirosina cinasas citosólicas (Fig. 2).

F¿g9%ia 2. Diferentes tipos de receptores celulares. qomado de Lodish et ai„

4

Los receptores acoplados a canales iónicos contienen actividadintri.nseca que permite el paso de iones a través de la membrana celular cuandoson activados por la unión de un ligando [Schofield eí a/., 1987; Grenningloh eí a/.,1987, Langosch eía/.,1988]

Los receptores acoplados a proteínas G modulan la actividad deproteínas dentro de la célula después de la unión con su ligando. Estos receptoresposeen una estructura que contiene siete dominios transmembranales.lntracelularmente, el receptor se acopla a una protei.na intermediaria para regularuna enzima [Strader ef a/. , 1994].

Los receptores con actividad enzimática intrínseca contienen undominio transmembranal. Estos receptores operan directamente como enzimas através de un dominio localizado intracelularmente con actividad de guanilatociclasa, tirosina cinasa o tirosina fosfatasa. Los receptores para varios factores delcrecimiento son proteínas cinasas que son activados por un ligando En muchoscasos, la unión del ligando produce dimerización y activación de la región catalíticade cinasa [Fantl eí a/„ 1993].

Los receptores para muchas citocinas, interferones y factores delcrecimiento se incluyen en una familia de receptores cuyos dominios intracelularescarecen de actividad enzimática intrínseca Sin embargo, a pesar de las diferenciasestructurales existentes entre estos receptores y los que poseen actividad catalíticaintrínseca, el mecanismo de activación parece ser similar. La unión del ligandoinduce djmerización u oligomerización y esto permite el reclutamiento y activaciónde proteínas tirosina cinasas citoplásmicas que se asocian con el dominiointracelular de los receptores [Kishimoto eí a/.,1994, Mui y Miyajima,1994, Heldin,1995].

Receptores acoplados a proteínas G

Las proteínas que penenecen a la superfamilia de receptoresacoplados a proteínas G comparten dos propiedades. Primero, la unión del ligandoal receptor induce la activación de una proteína heterotrimérica que une nucleótidosde guanina (o proteína G) Estos receptores se acoplan, por medio de las proteínasG, a proteínas efectoras (tales como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C, lafosfodiesterasa dependiente de GMP cíclico, y algunos canales iónicos). Segundo,las secuencias de aminoácidos deducidas de los genes clonados que codificanpara receptores acoplados a proteínas G predicen una estructura común queconsiste de siete ci héljces hidrofóbicas transmembranales [Henderson eí a/., 1990].En la estructura de estos receptores, la secuencia ami.no-terminal es extracelular, lasecuencia carboxilo-terminal es citoplásmica y las a hélices están acomodadas enla membrana en sentido contrario a las manecillas de un reloj. Los receptoresacoplados a proteínas G pueden ser divididos en diferentes grupos basándose ensus ligandos naturales, sus homologías de secuencia de aminoácidos y en sussimilitudes estructurales.

5

En células de mamíferos, existe un grupo homogéneo de receptoresacoplados a proteínas G que son activados por ligandos peptídicos pequeños Estegrupo consiste de receptores para péptidos que se encuentran relacionados con elintestino y el cerebro (tales como la secretina y el péptido intestinal vasoactivo), yreceptores para hormonas reguladoras de calcio (tales como la calcitonina y lahormona paratiroidea) [Segre y Goldring,1993]. Estos receptores muestran un altogrado de similitud en las regiones transmembranales hidrofóbicas, pero no sonhomólogos a otros receptores acoplados a proteínas G. También contienen unaregión amino terminal larga (130 aminoácidos) con residuos de cisteínaconservados.

Los receptores acoplados a proteínas G, en células mamíferas, unendiversos ligandos glicoproteínas (tales como las hormonas estimulantes de folículoy de la tiroides), moléculas orgánicas pequeñas (tales como la adrenalina y laacetHcolina), compuestos hidrofóbicos (tales como los canabinoides), y elcromóforo retinal La región extracelular amino terminal varía grandemente enlongitud Los receptores comparten un número limitado de secuencias deaminoácidos conservadas, principalmente en la región transmembranal [Probst efa/,1992] En este grupo diverso de receptores, se ha propuesto que la tercerahorquilla citoplásmica entre la quinta y sexta región transmembranal, una regióncon menos identidad de secuencia, es la regiórt involucrada en la interacción delreceptor con proteínas G específicas [Savarese y Fraser,1992].

Receptores con actividad de proteina tirosina cinasa

Los receptores con actividad de tirosina cinasa contienen un dominioextracelular amino terminal de unión al ligando, un dominio transmembranal y undominio intracelular con actividad de proteína tirosina cmasa Los receptores quepertenecen a esta familia pueden ser divididos en cuatro subclases basándose ensu similitud de secuencia y características estructurales [Ullrich y Schlessinger,1990]. el receptor para el factor del crecimiento epidérmico (EGF), el receptor parala insulina, el receptor para el factor del crecimiento derivado de las plaquetas(PDGF) y el receptor para el factor del crecimiento de los fibroblastos (FGF) Losreceptores para el EGF y para la insulina compaften secuencias homólogasrepetidas de cisteína en sus dominios extracelulares Los dominios extracelularesde los receptores para el PDGF tienen una estructura parecida a la de lasinmunoglobulinas (cinco repeticiones) Los miembros de los receptores para el FGFcontienen tres repeticiones de secuencias similares a la de las inmunoglobulinasLa unión del ligando al dominio extracelular ocasiona la dimerización del receptor,ia cual activa el dominio intracelular con actividad de tirosina cinasa promoviendo laautofosforilación [Schlessinger y Ullrich,1992] EI ligando EGF (monomérico) y elligando PDGF (dimérico) median la dimerización de sus receptores [Heldin et a,I ,1989, Greenfield et al , 1989| Cada uno de los ligandos da origen a una o masrespuestas dependiendo del sistema y ambiente celular de que se trate Laactivación de los receptores con actividad de proteína tirosina cinasa induce a lascélulas a proliferar y diferenciarse en el caso de los receptores para factores delcrecimiento, o a activar vías metabólicas en el caso del receptor para la insulina|Schlessinger.1993|

6

El dominio con actividad de proteína tirosina cinasa es la región másconservada Ésta contiene la secuencia consenso para unión de ATP, como seencuentra en la subunidad catalítica de !as proteínas cinasas dependientes de AMPcíclico Los dominios de cinasa de los receptores para el PDGF y para el FGFcontienen una secuencia insertada de residuos de aminoácidos hidrofílicos, quedividen al dominio de cinasa por la mitad. Esta secuencia insertada probablementeno está involucrada en la actividad de cinasa, pero se cree que tiene una función enlas interacciones del receptor con sus substratos [Kazlauskas y Cooper,1989].

La autofosforilación del receptor tiene una importante función en laactivación de la enzima y en la interacción con sus substratos [Koch eí a/.,1991]Los receptores activados transducen las señales extracelulares no solamente porfosforilación, sino también por interacciones directas de proteína-proteína. Muchossubstratos proteicos de los receptores para factores del crecimiento con actividadde tií.osina cinasas contienen dominios de homología a src (SH2), una regióndescubjerta orlginalmente en las tirosinas cinasas citoplásmícas relacionadas ac-Src. Los dominios SH2 se unen a residuos de tirosina autofosforilados en elreceptor En los receptores para el PDGF y el EGF, los sitios de fosforilación seencuentran en las regiones no catalíticas de los dominios citoplásmicos. Entre lasproteínas que pueden ser substrato para estas proteínas cinasas están lafosfolipasa C-yl y la fosfotirosina fosfatasa Syp [Anderson eí a/.,1990; Margolis eía/.,1990a, b: Moran eí a/.,1990; Kazlauskas eí a/.,1993].

PROTEINAS G

Las proteínas G son una superfamilja compleja y diversa de proteínasaltamente homólogas que unen e hidrolizan GTP. Entre éstas se incluyen proteínasinvolucradas en la síntesis de proteínas y dos clases de proteínas que transducenseñales: las proteínas G heterotriméricas de tamaño grande y proteínasmonoméricas de tamaño pequeño. Las proteínas G heterotriméricas consisten desubunidades a, P y y. La activación, ocasionada por la unión de GTP, produce ladisociación de la proteína G formando un complejo dimérico de subunidades f}y yuna subunidad G libre unida a GTP. Las proteínas G funcionan como interruptoresmoleculares que alternan entre la forma activa (unida a GTP) y la forma inactjva(unida a GDP). La interconversión entre el estado activo y el inactivo ocurre por lahidíólisis de GTP y del estado inactívo al estado activo por intercambio delnucleótido (Boume eí a/.,1991 ].

LA FOSFOLIPASA C EN CÉLULAS ANIMALES

La fosfolipasa C (PLC) es una familia de isoenzimas que catalizan lahidrólisis del fosfatidilinosito]4, 5-bisfosfato (PIP2) Iocalizado en la membranacelular generando dos componentes, uno hidrofóbico y otro hidrofílico,denominados 1, 2-diacilglicerol (DAG) e inositol-1, 4, 5-trisfosfato (lp3)

:,eesnpeencti::,Tneaná:(:|gá3f)jnAc%Rosd::T.puá:t::afi::ío::g::mcoeiig,T:Sme:en:t:j:r:su:producen estos mensajeros secundarios son el de estimular la liberación de calcio(lp3) [Berridge,1993] y el de activar a la proteína cinasa C (DAG) [Dekker eí a/.,

7

1995]. Esta vía bifurcada ejerce control sobre una gran variedad de respuestascelulares incluyendo el crecimiento celular, Ia proliferación, la contracción, laexcitación y la secreción. La actividad de la PLC es ubícua en las célulasanimales, vegetales y en los mic")rganismos [Shukla, 1982; Jones y Carpenter,19921.

¡ni,j:e£:,g::a:i:?g3s;a#::oi:i:eár:::s::,éési::::eÁÍ®:fg::eía:jLÍ:;niig?ti,:,g::tina#1Ía*s:pdi#roTá3r

lsoenzimas

En células animales, la PLC existe en múltiples isoformas y se hanpurificado a homogeneidad varias de ellas; también se han clonado ADNcs de unagran variedad de tejidos y especies y se han identificado aproximadamente 10isoenzimas de PLC [Rhee eí a/., 1989; Rhee y Choi,1992; Waldo eí a/.,1994; Leey Rhee, 1995; Rhee y Bae, 1997]. Todas las enzímas de PLC identificadas hastaahora son polipéptidos monoméricos. En base al tamaño y la comparación de lassecuencias de aminoácidos deducidas, las PLCs puedan ser dMdidas en tresfamilias: PLC-P (de aprox. 150 kDa). PLct (de aprox. 145 kDa), y PLCó (deaprox. 85 kDa). Cada familia posee varios miembros, estos se designan añadiendonúmeros arábigos después de la letra griega, p. ej. PLC-Pl y PLC-P2 [Rhee y

Choi, 1992; Lee y Rhe, 1995]. El cuadro 1 proporciona una clasificación de lasfosfoli pasas C identificadas.

%adLrsárg£:#gdc:€ndebsñ:feanteens¡gu¡dgFMe:g;£*3oaEjncoácakg::ftge+aá+saosr.zóg2a,:

NOMBFtE TAMAÑO (kDa)

Familia p

81 150-154

É¡2 134

P3

'ap A 125

OFtlGEN D-cla]

Cerebro do rsta y bovino [Katan y Parker.1987; Katan eí 8/.,1988)

ADNc HL60 de humano [Krftz oÍ a/., 1990]

ADNcfibroblaBtosdehumano(Kritzeí8/.,1990]

GencmadeDmsapAÁza(Bloomquisteía/.,1988]

CkmmadeDmsopAffi[ShomdgeoÍa/..1991)

CenbroderataybcMno(Suheía/..19881))

HL60, pulrnón, bazo |Emori eí a/., 1989; Banno oÍ a/., 1990;Htxrmaeía/..1990;OhtaoÍa/.,1988]

Cenbro do rata y bo\Áno [Homma eí a/., 1988; Suh oÍ a/.,1988a]

Cenbrodebovino[Meldrumeta/.,1989;Meldmmefa/.,1991]

ADNcdefibroblstc6deliumano[KritzoÍa/.,1990|

ADNcdecerebrodonata(L®yRhee, 1996)

Ca racten'sticas estructu rales

La estructura de las tcs familias de PLC comprende dominioscomunes a todas ellas (domjnio PH de homologi.a a la plcx3kstrina, dominiosEbeFE#unnd=d=o_=#o~Xx=d=ov#XT.±o*=¥.5o^T¡=±_C.2_SLy_3F*.,_oe.=xtr=~S¡=.ELg:E=,::u#S#beta(umregióncarboxmterminaldegn]nlongitud)ygamma(d®dominiosSH2,un dominio SH3 y un dominio PH adicional) (Fig. 4).

F-=-!-.-::.=.-.l-.-!i-±,=_-i--__i-i---i-=F==

.=,

:r:g:u,??o#ñe?pEgFe:#!iécn2g;en5ñá(,£n:o,:sdHá;;mfxTát:es:taá:oaTá:ei#Tin%e::,ng!:;aasfocso::',::

Dominio X y dominio Y. La secuencia de aminoácidos de todas lasisoenzimas de PLC intracelulares contiene dos regiones altamente consewadas,llamadas dominio X y dominio Y (de aproximadamente 170 y 260 aminoácidos,respectivamente) las cuales están separadas por péptidos de secuencia y longMvariable. La conservación de los dominios X y Y en todas las isoenzimas de PLCdesdeOmsopMhastahumanosapoyalaideadequealgunafunciónesencial,talcomo la catálisis, está ascx2iada cx)n estas regiones [Rhee ef a/,1989]. De acuerdoa Essen eí a/. (1996), quienes han cristalizado una versión truncada de la PLCólderata,laregiónXesunamitaddeloqueellosllaman"barril"(triosafosfatoisomerasa) distorsionado pero cerrado". La o.tra miúd del barm TIM es la región Y.

Algunos estudios de mutación y de delección en las PLCJyl y PLCJy2han mostrado que la expresión de cualquiera de las dos regiones solas producenunaproteínainactiva.CuandolasregionesXyYdecualquieradelasdosenzimasse unen, la proteína expresada retiene su actividad catalítica [Bristol e( a/., 1988;Emori eí a/,1989]. Otros estudios de proteólisis con la PLC-8 indican que losdominios X y Y permanecen físicamente asociados después de la ruptura contripsina entre estos dos dominios [Cifuentes ef a/., 1993; EllB ef a/., 1993]. Sinembargo. estos estudios reportaron resultados diferentes sobre el efecto de laproteólisis con tripsina sobre la actividad de PLC-8. Un {ercer estudio sugiere quelos dominios X y Y se asocian fisicamente de una manem que se protege estaregióndelaproteólisisyproporcionaunsitiocatalítico[Femaldefa/,,1994].

Dominios SH2 y SH3. Mientras que las isoenzimas PLC-P y PLCócontienen una secuencia coha de 50 a 70 aminoácidos que separan la región X dela región Y, las isoenzimas PLctl y PLCJy2 contienen una larga secuencia deaproximadamente 400 residuos y se distinguen por la presencia de secuenciassimilares a las regiones de proteínas sm [Rhee et a/., 1989]. Estas isoenzimas

10

contienen dos dominios SH2 (src homology) y un dominio SH3 localizados entrelasregionesXyY[Stahlefa/.,1988;Siiheía/.,1988b].LosdominiosSH2ySH3son pequeños módulos de estructiiras proteicas que comprenden aprox. 100 y 50aminoácidos, respectivamente, y gobieman interaccíones proteína-proteína. Losdominios SH2 y SH3 de la PLCT no son necesarios para la actividad enzimática,ya que la enzima netiene la actividad cuando ki negión SH2/SH3 es eliminada[Bristol ef a/., 1988; Emori eí a/., 1989]. Sin embargo, los dominios SH2 de laPLC+1 están involucrados en la asociación de la PLCJyl con sitios específicosfosforilados en tirosina presente en proteínas [Anderson et a/., 1990; Margolis efaí.,1990a, b; Mohammadi ef a/.,1991; Rotin ef a/.,1992; Soler eí a/., 1993]. Se

piensa que esta interacción es un prerrequisito para la fósforilacíón de la PLCJylen residuos de tirosina por tirosina cinasas activadas. El dominio SH3 se cree quefunciona facilitando la asociación de la PLC+1 con proteínas de citoesqueletoparlicularmente con aquellas que contienen secuencias de aminoácidos ricas enprolina [Bar-Sagi eí a/.,1993; Gout eí a/.,1993].

Dominios PH. En todas las isoenzimas PLC de mamíferos se haencontrado una negíón de aprox. 100 aminoácidos homóloga a una región de lapleckstrína (una proteína sustrato de la proteína cinasa C en plaquetas)denominada dominio PH (por Pleckstrin homology). En los tres tipos de PLC, eldominio PH se ha encontrado en la región amino-{eminal, precediendo a losdominios EF-hand [Parker ef a/., 1994; Essen eí a/., 1996]. Las isoenzimas de tipoPLCT contienen un dominio PH adicional entre los dominios X y Y que es divididopor los dominios SH. En 1992, Rebecchi eí a/. repoilaron que la regiónamino-terminal, que contiene el dominio PH de la PLC-81, es necesaria paraunirse con alta afinidad al PIP2 en vesículas bicapa en ausencia de calcio.También consideraron la posjbilidad de que ese sitio de alta afinidad podría servircomo anclaje de la enzima en la superficie de la membrana durante la hidrólisisp"3esiva del sustra{o catalizada por un sitio activo separado [Cifuentes ef a/.,1993]. Posteriomente, Harlan ef a/., (1994) reportaron que los dominios PH seunen al PIP2 y sugieren que esta región puede ser importante para la localizaciónde proteínas en la membrana a través de in{eracciones con el PIP2. Estasobservaciones sugieren que los dominjos PH pueden tener una funciónbiológicamente significativa en la localización de proteínas por fcBfolípidos demembrana.

Dominios EF-hand y C2. La estructura tridimensional de la PLci}1de rata, que carece del dominío PH, i.eveló que ésta consiste de 4 dominicN3EF-hand (similares a aquellos presentes en la calmodulina) que preceden aldominio X y de un dominio C2 (éste es un dominio de P-intercalaciones que tieneuna estriictura similar al primer dominio C2 de la proteína sinaptotagmina 1) cercade su carboxilo teminal [Essen ef a/., 1996]. Se sugirió que esta última regiónintewiene en la unión clependiente de Ca2+ a las vesículas lipídicas.

Mecanismos de regulación

En células animales, se han identificado dos fomas de receptoreslocalizados en la superficie celular que activan a la PLC los cuales funcionan através de diferentes mecanismos moleculares.

11

Activación por receptores con actividad de tirosina cinasa. Existenreceptores con actividad de tirosina cinasa que activan a la PLC, tales como elreceótor para el EGF, el receptor para el PDGF, el receptor para el FGF y elrecep`or para el factor del crecimiento de los hepatocitos Estos receptores cruzan_ __ ___L:^__^ ,.. A^minir` rii.nnlácimir.r) Con

ia membrana plasmática y contiénen un dominio citoplásmico contirosina cinasa [Nismbe eí a/,1990: Goldsschmit-Clermont eí a/.,recepto" promueven la hidrólisis de los fosfoinositidos a través deque involucran la fosforilación en t.irosina de las isoenzimas de la• £ _ '=____1_ -_---+-r

famh PLC-y. El mecan.ismo de activación involucra la unión ligando-receptor,'„C;\,C)'''\J"````.1--''''____ _

misma que ocasiona dimerización del receptor; a su vez, este complejo conduce ala activación de la actividad intrínseca de proteína tirosina cinasa del receptor por loque fosforila a numerosas proteínas en residuos de tiros`ina incluyendo la regiónintracelular del receptor mismo así como a la PLCJyl [Eriksson eí a/.,1995] Losresiduos fosforilados en tirosina del receptor forman s.itios específicos de uniónpara proteínas que cont.ienen regiones de aproximadamente 100 aminoácidos(dominios SH2) como es el caso de la PLCJy.

Existen algunos reportes que sugieren una asociación física entre laPLclyl y la tirosina cinasa activada del receptor [Margolis ef a/.,1990a, b; Rotin eía/ ,1992, Mohammadi ef a/.,1991|. Estos experimentos de asociación concluyeronque la actividad de tirosina cinasa del receptor para el EGF era esencial para laasociación de las dos proteínas. S'in embargo, Hernández-Sotomayor y Carpenter(1993), en experimentos realizados /.n v/.Íro obtuvieron resultados que sugieren queel receptor para el EGF purificado puede aumentar la actividad de la PLC-ylindependientemente de la fosforilación en residuos de tirosina, y que éstaasociación no requiere del receptor autofosforilado, es independiente de ATP, y laPLC-yl no fosforilada en residuos de tirosina responde al receptor para el EGF.

Otros ensayos /.n v/.Íno de hidrólisis de PIP2 han proporcionadoevidencia directa de que la fosforilación en tirosina de la PLC-yl aumenta suactividad enzimática (Nishibe ef a/„ 1990; Wahl ef at 1992). La activación de laPLC-yl es atribuída a la fosforilación en tres residuos de tirosina (771, 783 y 1254),dos de los cuales se encuentran localizados entre los dominios X y Y [Kim eí a/.,1990b; Kim eí a/„ 1991]. La fosforilación de la PLC-yl por el receptor para el EGFaumenta la act.ividad enzimática aproximadamente de 3 a 4 veces (Nismbe ef a/.,1990; Wahl ef a/.,1992) Asimismo, se produce un gran cambio en la Ks (hay unadisminución de 7.5 veces), esto significa que se aumenta la asociación de laPLC-yl con las micelas que contienen el PIP2. A bajas concentraciones de fracciónmol de PIP2 (0.07) la enzima fosforilada exhibe una velocidad de reacción 4 vecesmás alta y una Km más baja. Sin embargo, a concentraciones altas de fracción molde sustrato (0.33), Ia velocidad máxima (Vmax) de reacción para ambas formas dePLC-yl fueron equivalentes (Wahl eí a/.,1992;).

Existe una amplia variedad de proteínas tirosina cinasas (PTKs) queno son receptores, tales como los miembros de las familias SÍc, Syk, y Jaknyk;éstas cinasas son activadas por receptores que no poseen actividad de proteínatirosina cinasa. Las PTKs activadas fosforilan algunos de los componentes a loscuales se puede unir la PLCT a través de sus dominios SH2, y, por consiguiente,

12

una sola vezactMdad de1991]. Estosmecanismos

es fosforilada en los mismos residuos de tirosina por la PTK AsÍ, en respuesta a launión de ciertos receptores de la superficie celular, las PTKs también fosforilan yactivan a las isoenzimas de la PLC-y [Noh ef a/ ,1995, Lee y Rhee,1995]

Activación por receptores acoplados a proteínas G. Los miembrosde la familia de PLC-P son regulados por proteínas G heterotriméricas

(subunidades G y Pv cuya contribución relativa depende de la PLC-P Ínvolucrada)[Smrcka eí a/,1991; Boyer eí a/.,1992, Lee eí a/,1992; Wu eí a/,1992a, b] Lasproteínas G heterotriméricas (compuestas por subunidades c[, P, y y) transmitenseñales intracelulares de una familia de receptores que se encuentran acoplados aestas proteínas G (GPCR). Esta fami`Iia de receptores incluye a receptoresadrenérgicos y fotorreceptores, entre otros. Los GPCR son proteínas que cruzansiete veces la membrana, es deci.r, contienen siete hélices transmembranales contres horquillas citoplásmicas y un carboxilo-terminal intracelular [Kobílka ef a/.,1987] La unión del li.gando causa un cambio conformacional en la estructura delreceptor, el cual activa a una proteína G heterotrimérica asociada La proteína Gactivada se disocia formando una subunidad a y un complejo de subunidades PyAmbos, la subuni.dad a y el complejo f}y, son capaces de acti.var enzi.mas efectorasintracelulares [Sternweis, 1994], incluyéndose enlre éstas a una PLC específicapara fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato La activación de isoenzimas de la familia de laPLC-P por proteínas G heterotriméricas incluye a la subfamilia GGq de las proteínasGG [Smrcka ef a/,1991] La subfamilia Gq de las subunidades a incluye cuatro

productos díferentes: Gaq, Gctii, Gaw y GGi6 Se ha reportado que éstas (Gciq,Gcm Gc" y Gcti6) acti.van a la PLC-P1 [Wu eí a/.,1992a] y que Gcw6 (y quizás Gaii)son activadores eficientes de la PLC-P2 [Lee eí a/„ 1992] Ninguno de los miembrosde las otras subfamilias de las proteínas Ga activan directamente a la PLC y lasubfamilia Gq únicamente activa a la PLC-P y no a los miembros de las familías -ÓÓ -y de la PLC [Wu eí a/„ 1992b]

La PLC-P2 recombinante es activada por dímeros Py, la PLC-Plrecombinante puede o no ser afectada por Py [Katz ef a/.,1992] o puede ser muchomenos sensible que la PLC-P2 [Boyer eí a/., 1992; Camps ef a/., 1992a]. Serequíeren bajas concentraciones, nanomolares y posiblemente picomolares, desubunidades G para estimular a la PLC [Taylor ef a/., 1991, Smrcka et a/„ 1991]; laconcentración necesaria para el caso de los dímeros Py es del rango mi.cromolar[Boyer eí a/ ,1992, Camps eí a/ ,1992a,1992b]

La familia de PLC-P se distingue de las otras PLCs por la presencia deuna secuencia de gran longitud en la región carboxilo-terminal de la moléculadespués del dominio Y de la enzima En esta región, Wu eí a/ , (1993a) encontraronuna secuencia requerida para la activación de PLC-Pl por Gciq Ellos subdividieronla región C-terminal en dos secuencias. la caja P, que abarca los residuos Thr9°3 yGinl03° y que es esencial para la asociación de PLC-f)1 con la fracción paniculada ysubsecuente activación por Gaq, y la caja G, que es la región localizada entre losresiduos Lys"" y Leu''" y que es requerida para la interacción de PLC-Pl con GciqLas secuencias que se encuentran después de la caja G en la PLC-Pl y en laPLC-P2 son homólogas por lo que se sugiere que ésta es la regíón de la enzima

13

requerida para la act.ivación por las subunidades Ga en ambas .isoformas. Cabehacer notar que la caja P es una secuencia de 128 aminoácidos compuesta de ungran número de residuos cargados, especialmente residuos básicos ygeneralmente lisinas. La asociación con la fracción pahiculada podrñ ocurrir através de los fosfolípidos o algunas proteínas asociadas a la membrana que seencuentran cargadas negativamente.

Posteriormente Wu ef a/., (1993b) encontraron un segmentoam.ino-terminal de la PLC-P2 con una secuencia de aminoác.idos que se extiendehasta el final del dominio Y y que es requerida para la activación por Gpy Tambiénencontraron otra región carboxilo-terminal con el segmento que contiene lasecuencia de aminoácidos requerida para la activación por Gci. Además, sugirieronque Gc" y las subunidades Py pueden modular simultáneamente la actividad dePLC-f)2.

En 1996, Kuang eí a/. identificaron la región de PLC-P2 que interactúa

con Gpy La secuencia que se extiende desde el residuo Leu" hasta el residuoVal6" parece tener una muy alta afinidad por Gpy en la región que abarca desde :1inicio del dominio X hasta el final del dominio Y La proximidad de esta secuenciacon el centro catalítico sugiere que puede estar involucrada en la activación de laPLC-P2

Activación de la PLC-Ó. Actualmente el mecanismo por el cual lasdistintas isoenzimas de la PLC-6 se regulan no se conoce con exactitud. Sinembargo, recientemente se reportó la activación de la PLC-Ól por una nueva clasede proteínas que unen GTP, llamadas Gh [Feng eí a/.,1996] La proteína Gh estáformada por una subunidad a (de aprox 75m kDa) y una subunidad P (de aprox50 kDa) [lm y Graham,1990] La subunidad Ghci, una proteína multifuncional quetambién tiene actividad de transglutaminasa, activa y forma un complejo con laPLC-Ól purificada [Nakaoka eí a/.,1994: Das eí a/.,1993|, esto ocurre en célulasestimuladas via receptor ctradrenérgico (cii-AR) Se ha sugerido que GhG acopladirectamente cii-AR a la PLC-Ó1. Aun no se sabe si otras isoenz.imas de la PLC-ÓtambiénsonactivadasporGhct,osiotrosreceptoresseacoplanaGhcLycómoestárelacionada la actividad de transglutaminasa de Gha con su func.ión activadora de laPLC-ól

En base a la información estructural obtenida después de lacristalización de la PLC-81 [Essen eí a/.,1996|, se propuso un mecanismo catalíticoconsistente en dos pasos "atar y fiiar" El domim PH de b PLC-W ata la enzi" ala membrana debido a la unión específica al PIP2 y el dominio C2 fija al dominiocatalitico con una orientacm favorable hacia la membrana El dominio EF-Handsirve como un enlace flexible entre el dominio PH y el resto de la enzima El ionCap sería requerido para que el dominio C2 pueda funcionar. Además, en lacatálisis pafticipan directamente otro ion de Ca2+, localizado en el sitio activo, y losam.inoácidos His3u e His356

14

Localización de las isoenzimas de PLC.

lnicialmente la mayori.a de las PLCs fueron purificadas de fraccionescitosólicas [Ryu ef a/,1987a, b; Bennet y Crooke,1987; Rebecchi y Rosen,1987;Fukui eí a/.,1988; Homma ef a/.,1988, Meldrum e! a/.,1989, Waldo eí a/.,1994].También se ha caracterizado actividad de PLC que se encuentra asociada a lamembrana [Banno ef a/.,1988; Bano y Nozawa,1987; Lee eí a/„ 1987, Baldassareef a/,, 1989]. La actividad asociada a la membrana puede ser solubilizada conconcentraciones altas de sales, indicando que existen interacciones iónicas queretienen a la PLC asociada a la membrana. Una de las actividades asociadas a lamembrana (PLC-P1) está distribuída igualmente entre el comparti.miento citosólicoy el compartimiento membranal [Lee eí a/., 1987]. El análisis de la hidropatía ysecuencia de aminoácidos de la PLC-Pl no revela la presencía de regionestransmembranales. En contraste, la PLC-yl se encuentra predominan{emente encitosol [Lee eí a/., 1987]

El tratamiento con el EGF en células A431 (las cuales estánenriquecidas con receptores para el EGF) produce la fosforilación de la PLC-yl enresiduos de tirosina (771, 783, y 1254) [Margolis eí a/„ 1989, Wahl eí a/., 1990]Este tratamiento ocasiona una redistribución de PLC-yl (un proceso detranslocación) por lo que aumenta la asociación de la enzima con la fracciónparticulada de la célula [Kim ef a/„ 1990a, Todderud eí a/ ,1990].

Por otro lado, existen evidencias de que la PLC se localiza en elnúcleo de células animales [Martelli eí a/ ,1992; Kuricki ef a/ ,1992; Divecha ef a/„1993a, Divecha eí a/,1993b, Mazzoni eí a/„ 1992] En células Swiss3T3 seobservó que la PLC-Pl se localiza en el núcleo y que ésta se regula por lGF-1[Manelli ef a/, 1992]. Además, Asano ef a/ (1994) también han mostradoevidencias de la existencia de una nueva PLC en el núcleo. EHos purificaron unaPLC nuclear de peso molecular aparente de 85 kDa de hepatoma de ascitos derata La PLC se detectó únicamente en el núcleo de hígado en regeneración

La existencia de múltiples isoformas de PLC fue descrita en estudioshechos en diferentes teiidos en{re los que se incluyen el corazón, el cerebro, lasplaquetas, el hígado, y riñón [Hirasawa eí a/.,1982a, b; Chau y Tai, 1982; Low yWeglicki,1983]

En resumen, las PLCs de tipo P (PLC-P1, -P2, -P3, y -P4) estánpresentes en la fracción particulada y en el núcleo, mientras que las PLCs de tipo yy ó son detectadas principalmente en la fracción citosólica [Lee eí a/ ,1987, Katan yParker,1987; Ryu ef a/ ,1987b; Jhon ef a/ ,1993, Lee eí a/ ,1993; Homma et a/ ,1988; Fukui eí a/ ,1988; Rebecchi y Rosen,1987; Martelli eí a/.,1992; Divecha efa/.,1993a, b; Mazzoni eía/,,1992].

Caracterización de las isoenzimas de PLC

Las primeras isoenzimas de PLC purificadas a homogeneidad decerebro de bovino (de 150,145, y 85 kDa) fueron, más tarde, nombradas PLC-P1,

15

PLC-yl y PLC-Ót respectivamente. Estas isoenzimas fueron caracterizadas yademás se obtuvieron una serie de anticuerpos policlonales y monoclonales paralas tres isoenzimas [Ryu ef a/.,1987a, Suh eí a/ ,1988b] La caracterización incluyóla evaluación de la inmunorreactiv.idad hacia cada una de las formas de PLC en suestado nat.ivo y desnaturalizado Cada anticuerpo reaccionó únicamente con laenzima contra la cual fue preparado Las tres isoenzimas fueron específicas parafosfatidilinositol [Pl], fosfatidilinositol 4-monofosfato (Pl-4-P), y fosfatidilinosM4,5-bisfosfato (P145-P2), y no hidrolizaron fosfatidilinositol 3-monofosfato (PIT3-P),fosfatidilinositol 3,4-bisfosfato (PI-3,4-P2) o fosfatidilinositol 3,4,5-tnsfosfato

(Pl-3,4,5-P3) Se estudiaron las actMdades catalíticas de las tres isoenzimasutilizando vesículas unilamelares pequeñas preparadas con Pl, P14P o P14,5-P2como sustrato Sus actividades catalíticas fueron dependientes de la concentraciónde calcio Con Pl como substrato, la velocidad de hidrólisis aumentó hasta alcanzaruna máxima a 6 mM de Ca2+ y posteriormente disminuyó Sin embargo, cuando laconcentración de calcio estuvo en el rango micromolar, el P14J' y el P14,5|P2fueron mejores substratos para las tres isoenzimas. Con estos dos substratos, lavelocidad de h.idrólisis aumentó hasta alcanzar una máxima a 100 LtM de Ca2+,concentraciones superiores a 1 mM Ca2+ fueron inhibitorias Cuando el substratofue PI-4-P, las tres isoenzimas tuvieron similares actividades específicas a su pHÓptimo, el cual fue 4.8 para la PLC-P1, 5 0 para la PLC-yl , y 5 5 para la PLC" Sinembargo, a pH neutro el orden de actividad específica fue PLC-Ó1 > PLC-yl >PLC-P1. En contraste, el orden de actMdad específica para la hidrólisis de P14,5-P2fue PLC-P1 > PLC-W > PLC-yl, signif.icando que la enzima de 150 kDa es la másespecifica para Pl-4,5-P2 El efecto de iones metálicos sobre la hidrólisis de P14Pmostró que la PLC-Pl y la PLC-yl no son afectadas por 50 iiM de Mg2+, Mn2+, Ca2+,o Ni2+ Sin embargo, el Hg2+, Zn2+, y Cu2+, inhibieron a ambas PLCs La PLC-ylexhibe una alta sensibilidad a estos iones comparada con la PLC-P1, por ej el valorde inhibición lo5 para Hg2+ fue 0 2 LiM para PLcyl y 1 LiM para PLC-PI EI Cd2+

inhibió selectivamente a la PLC-yl con un valor lo5 de 5 HM. Para las tresisoformas, en presencia de 3 mM de Ca2+ y 1 mM de EGTA, la velocidad dehidrólisis de Pl aumentó bastante cuando la concentración de deoxicolato fue de075" mg/ml (0.075-01 % p/v). No se observó algún efecto cuando laconcentración de deoxicolato fue de 0.5 mg/ml (0 05% p/v) [Ryu eí a/ ,1987a]

Morris ef a/. (1990) purificaron una PLC de 150 kD a paftir de lafracción citosólica de eritrocitos de pavo. La actividad específica de la enzima

purificada fue de 6.7" 0 Limol/min/mg de proteína con PIP2 o PIP como substratoEsta actividad fue dependiente de la presencia de Ca2+, con una activación mediamáxima de aproximadamente 70 nM de Ca2+ con ambos substratos Esta PLCmostró un pH Óptimo ácido (pH 40) y una estimulación a concentracionessuperiores de 005% (p/v) de colato de sodio como detergente. La PLC deeritrocitos de pavo no reaccionó con la mezcla de anticuerpos monoclonalespreparados contra las isoenzimas purificadas por Ryu ef a/ (1987a)

Función de la PLC en diferentes sistemas

La función de la PLC se ha estudiado en diferentes sistemas y se hademostrado que la actividad de la PLC se encuentra involucrada en diferentes

16

procesos. S" ef a/. (1989) reportaron que la microinyección de PLC-yl y PLC-Pla células de fibroblasto indujo la síntesis de ADN. Sin embargo, en células demamíferos, Ia actividad de la PLC no fue esencial para la induccíón de la síntesisde ADN [Hill ef a/., 1990] Por otro lado, debido a que la PLCLyl es un substratodírecto de muchos receptores para factores del crecimiento, se piensa que éstagenera señales para la proliferación celular Se ha observado que el contenidorelatívo de PLC-yl en carcinomas mamarios primarios es considerablemente másalto en comparación con el de tejidos de seno normal [Arteaga eí a/„ 1991],Además, una PLC de tipo -y fue purificada de melanoma humano [Perella ef a/,1991], esto implicó que la proliferación celular en células cancerígenas pudieraestar influenciada por los niveles superiores de la PLC-y Recientemente, se reportó

que la PLC-yl es requerida para la proliferación célular en embriones de ratonesasí como la importancía que la enzima tiene para el crecimiento y desarrollo delembrión [Ji ef a/.,1997].

En Orosoph//a, el gene norpA (No receptor potential A) codifica parauna proteína con similitud a la PLC-P de retina de bovino [Ferreira eí a/,, 1993].Cuando se hicieron mutaciones al gene norpA, no se encontró respuesta a laestimulación por la luz, no se detectó actividad de PLC y se produjo ceguera Sesugiere que esta PLC está involucrada en el proceso de fototransducción[Bloomquist eí a/,,1988, Schneuwly eí a/., 1991] También se ha sugerido que ladeficiencia de PLC-P2 ocasiona disfunciones plaquetarias en humanos[Lee eí a/ ,1996].

En Xenopus existe una PLC con un 64°/o de identidad a la PLC-P3 demamíferos [Ma eí a/., 1993] Cuando se inyectó a oocitos con oligonucleótidosantisentido de PLC se redujeron significativamente las corrientes de Cl-

Sacharomyces cerev/s/ae y D/.cíyc)síe//um contienen una PLC consecuencia similar a la de la PLC-ó [Yoko-o eí a/., 1993, Drayer y Van Haastert,1992] En levaduras, la ruptura del gene PLcl produjo defectos en el crecimiento,aunque la severidad dependió de la cepa utilizada [Yoko-o eí a/,1993] En otrosestudios, tambien en levaduras, la elíminación de cíerta secuencia de la PLC diócomo resultado células viables, las cuales, sin embargo, retardaron su crecimientocelular cuando se cultivaron en condiciones no óptimas [Flick y Thorner,1993,Payne y Fítzgerald-Hayes,1993] En O/cíyosíe//um, algunas observaciones previassugirieron que la regulación de la PLC era importante para la quimiotaxis y ladiferenciación [Bominaar eí a/, 1991; Bominaar y Van Haastert, 1994] Sinembargo, la eliminación de una región de secuencia del gene OdpLC dió comoresultado la pérdida de actividad de PLC en las células y no se observó algunaalteración en el crecimiento y desarí.ollo [Drayer eí a/., 1994]

Existen algunas bacterias que secretan a una PLC al medio de cultivo.entre éstas se pueden citar a Bac///us cereus [lkezawa y Taguchi,1981, Volwerk eía/.,1989], Bac/.//us Íhur/ng/'ens/s [lkezawa y Taguchi,1981] Síaphy/ococcus auneus[Low,1981] y C/osír/d/um novy/ [Taguchi e lkezawa,1978] Estas PLCs reconocenla estructura del inositol fosfato presente en el Pl, pero no hidrolizan los derivativosfosforilados del Pl, Pl-4-P y P14,5-P2. Las PLCs de bacterias son monómeros de

17

aprox 35 kDa de masa molecular específicas para la hidrólisis de Pl. Se hareportado que las Pl-PLC de bacterias muestran efectos cuando se incuban conpreparaciones membranales o células sensibles a la insulina [Mato eí a/., 1987;Saltiel y Cuatrecasas,1986; Saltiel ef a/.,1986]. Marques eí a/. (1989) compararonla producción de Pl-PLC en cepas de S, aureus aisladas de pacientes consíndromes tóxicos y de pc)rtadores saludables. Ninguna de las cepas a.isladas deportadores saludables produieron Pl-PLC, 10 de las 32 cepas patogénicas siprodujeron Pl-PLC Además, hubo una significativa asociación entre la producciónde Pl-PLC y el desarrollo del síndrome de deficiencia respiratoria aguda o de lacoagulación intravascular diseminada, como complicaciones de la infección con elestafilococo.`Esta correlación sugirió una función de la PI-PLC en la patogénesis deenfermedades particulares de S. aureus Por otro lado, en L/síer/a monocytogenesse identificó una proteína que es codificada por el gene plcA, y que es homóloga ala PLC de Bac/.//us cereus, y de 8 fhumg/.ens/.s. La expres.ión del gene plcAcorrelaciona con la aparición de actividad de PLC en las células. La actividad dePLC se encontró unicamente en las especies patogénicas del género L/.síer/.a.Cuando el gene sufre una ruptura, la actividad se pierde y la virulenc.ia disminuyeEsto sugiere que la PLC de L monocy{ogenes puede estar involucrada en elproceso de v.irulencia [Mengaud ef a/ ,1991]

En plantas, no se ha establecido alguna función fisiológica para laPLC. Legendre ef a/. (1993) han planteado la hipótesis de que la activación de laPLC puede constitw una vía por la cual un inductor activa la combustión oxidativaen células en suspensión de soya.

FOSF0lNOsiTIDOS EN PLANTAS

En teiidos vegetales se ha demostrado la presencia de PIP2Crain, i993],-se h'a detectádo actividad de PLC [Coté y Crain, igg3, Huang1995], y se ha clonado ADNc que codifican para PLCs [Hirayama ef a/.,1995;a/ ,1995, Yamamoto eí a/ ,1995, mrayama eí a/ ,1997].

Desde el primer reporte de la existencia de fosfoinosítidos en plantas

[Boss y Massel, 1985] han aparecido otras publicaciones indicando que estoscompuestos están presentes tanto en plantas completas como en cultivo de célulaso teiidos [Helsper eí a/ ,1986a, b, lwine ef a/.,1989; Coté e{ a/.,1990, Rincón yBoss,1990] Sin embargo, la distribución de estos IÍpidos es diferente de la que seencuentra en células animales. Por ejemplo, el Índice de PIP a PIP2 es 0.51 enmúsculo de coneio [Akhtar y Abdel-Latif,1980]. En contraste, el Índice de PIP PIP2en células vegetales es de entre 10:1 y 201 y el contenido de PIP2 representa del0% al 0 5% de los fosfolípidos de inositol totales [Dr®bak eí a/,1988; Heim yWagner,1989, Boss,1989]. Se ha estimado que, en células animales, unicamentedel 10% al 20% de las reservas de PIP2 se recambian en respiiesta a un estímuloSi el origen de los segundos mensajeros en plantas es PIP2, la velocidad delrecambio debe ser bastante alta ya que las reservas son relativamente pequeñas.

En plantas superiores existen evidencias para sugerir que una función

primordial de los fosfoinosítidos puede ser la de regular la estructura del

18

citoesqueleto [Tan y Boss,1992; Dr®bak,1993; Gross y Boss,1993; Staiger ef a/.,1993, Yang eí a/., 1993]. En células vegetales se han detectado cambios en losniveles de fosfolípidos de inositol en respuesta a estímulos específicos [Drobak,1992], aunque los mecanismos de regulación de las enzimas involucradas en elmetabolismo de estos IÍpidos no se conocen. También, se ha observado que el lp3causa liberaci.Ón de calcio de las vacuolas [Allen ef a/., 1995]. Kim ef a/. (1996),

presentaron evidencias de que el lp3 estimula la liberación de calcio, el cual luegocierra los canales de K+ en las células puMnares. EIlos midieron la producción deIP3 en protoplastos de tejidos flexores y extensores (que estimularon con variasseñales de luz) usando un ensayo radioreceptor en el cual el IP3 no radiactivo en lacélula compite con el IP3 radiactivo por la unión al receptor específico de lp3 aisladode glándulas adrenales de bovino.

PLC en plantas

En los últimos años han aparecjdo reportes de actividad de PLC envarios si.stemas vegetales; estos estudios han sugeri.do la exístencia en célulasvegetales de un sistema si.milar al de la vía de los fosfoinosítidos descrita en célulasanimales [Sandelius y Sommarin,1990].

En células vegetales se han identificado dos tipos de PLC específicaspara fosfolípidos de inositol. enzimas solubles y enzimas asociadas a membrana[Mc Murray e lrvine,1988, Melin eí a/.,1987; Pfaffman ef a/,1987; Tate ef a/.,1989; Kamada y Muto,1992; Yotsushima eí a/.,1992; Yotsusmma eí a/,1993] Lainformación que va a ser descrita a continuación puede ser resumida en el cuadro2.

La actividad de una PLC en plántulas de trjgo fue caracterizada porMelin ef a/ (1987) La fracci.ón de membrana plasmática estuvo enriquecida defosfolipasa C con actividad para PIP y PIP2. Esta actividad fue mayor en brotes queen raíces. Además, la actividad específica de la enzima en la membrana plasmáticade brotes culti.vados en oscuridad fue superior que aquellos cultivados en luz Encontraste, Ia actividad enzimática en membrana plasmática de rai.ces no fuesensible al régimen de luz. Aunque se encontró actividad de PLC en la fraccióncitosóIÍca, unicamente la enzima en membrana plasmática mostró especificidad desubstrato para PIP y PIP2 Esta enzíma fue dependiente de calcio, se activó aconcentraciones menores de 10 LiM y se inhibió a concentraciones mayores de 10HM A concentraciones bajas de calcio se hidrolizó preferencialmente PIP2. Encontraste a las PLCs de animales, la PLC de plántulas de trigo no se activó porGTP o análogos no hidrolizables de GTP En frijol y soya, se detectó activídad deuna PLC específica para Pl en membrana plasmática y en la fracción soluble. El85-90% de la acti.vidad total se detectó en la fracción soluble, mientras que el 15%estuvo en la fraccion asociada a la membrana; ambas se activaron con 0 5 mM decalcio y a un pH Óptimo de 66 [Pfaffman ef a/.,1987]. La activi.dad de PLC,utilizando Pl como substrato, se ha observado en fracciones citosólicas de apio,coliflor, narciso [Irvine ef a/ ,1980]. En los tubos polínicos de iMm /ong/.#ort/m seobservaron dos actividades de PLC en la fracción particulada y una actividad dePLC en la fracción citosólica [Helsper ef a/ ,1986a, b,1987]. La actividad de esta

19

PI-PLC aumenta durante la elongación del tubo polínico y es estimulada con 1 mMde calcio [Helsper ef a/.,1987] En apio, se ha identificado una enzima asociada ala membrana y una enzima soluble. Mientras que la enzima soluble hidrolizaunicamente PIP, la enzima asociada a la membrana hidroliza también PIP2 a pHneutro y en una manera dependiente de calcio., además, la actividad aumentatambién en presencia de deoxicolato (01%, p/v)[Mc Murray e lrvine, 1988| Enalgas verdes (DL/na//.e//a sa//na) Ia existencia de una PLC estuvo enriquecida en lafracción correspondiente a la membrana plasmática y fue estimulada por calcio yGTP [Einspahr eí a/,, 1989]. En membranas plasmáticas de raíces de avena, laactividad de fosfolipasa C, utilizando PIP2 como substrato, fue de 13 2 nmol/min/mgdeproteínayalcanzaunmáximoaconcentracionesde10LiMdecalcio[Tateeía/,1989]

La purificación de una fosfolipasa C` soluble específica pa,rafosfatidilinositol se realizó a panir de células de arroz cultivadas en suspension

[Yotsushima ef a/., 1992] El peso molecular aparente de la enzima se estimó en 50kDa, tuvo un punto isoleléctrico de 6.3, un pH óptimo de 5 2 y una alta especificidad

para fosfatidilinositol Los valores de Vmax y Km fueron 5 Limol/min/mg de proteina y0.3 mM, respectivamente La fosfolipasa C de membrana plasmática de raíces detrigofuepurificada(parcialmente)25vecesatravesdecromatografíadeadsorciónycromatografíadeintercamb.ioiónico.LaenzimacatalizólahidrólisisdePIPyPIP2con actividades especificas de 5 y 10 Hmol/min/mg de proteína, respectivamente. El. ^ . ____ nin „ a c= c hara PIP. 1 a enzima fue.iviuauc;. t;cit.;`~`,,„`,._ ._ , , _ ,

imo de la actividad fue entre 6-7 para PIP y 6-6 5 para PIP2 La enzima t_ ____ ..-- :^.^-rni^r^m^iarf>c; /1n uM\ rMelin ef a/„ 199pH Óptimo cie ia activioau iut= c;uiic v-, r -,.,.., _ _ _ .dependiente de calcio a concentraciones micromolares (10 LiM) [Melin ef a/.,19(Yotsushima eí a/ (1993) purificaron una fosfolipasa C a paftm de membranas. . . _ _ J_ ^ r\ __-^^l/r-in/mr, \,TÜISU>UIHia t;. c7.. \ i-vv/ r-.„ --_

arroz, los valores de Vmax y Km para fosfatidilinositol fueron de 2 9 Limol/min/mg ymM, respectivamente El peso molecular aparente de la enzima se estimó en_ _ . ii ¿_1:_^ ..,- i-i]rti`;irlz.rl rle 65 VkDa, el punto isoeléctrico fue 51, pH Óptimo para la actividad de 65 y fuemM, respec(lvarllc:lllt=. Ll r+c;ou „,v.~v-._. _r__ _

dependiente de calcio

En las raices de plántulas de avena se reportó la existencia de almenos cuatro variantes de fosfolipasa C, dos citosólicas y dos asociadas a lamembrana [Huang ef a/ ,1995] Las dos PLCs c.itosólicas y las dos PLCs asociadasa la membrana pueden ser separadas en base a su afinidad por la heparina LaPLC citosólica y la PLC asociada a la membrana que se unen a la h?parinapresentan un peso molecular aparente de 50-70 kDa, son activadas aconcentraciones micromolares de calcio y son específicas para fosfoinosítidosfosforilados

20

Cuadro 2, Evidencias de PLC en plantas

PLANTA CARACTERISTICAS REFERENCIA

ACTIVIDAD DETECTADA ENFFUCCION MEMBRANAL FRACCION SOLUBLE

TR'GO Hidrólisis de PIP y PIP2: "drólisis de Pl, Melín eí a/..1987(brote y activación con Ca2+ < 10 L.M,raíces) inhibición con Ca2+ > 10 HM,pHóptimode5,5-6conPIP2,y5,5-75conPIP

FRIJOL y Hidrólisis de Pl (15% de la Hidrólisis de Pl (85% de la Pfaffmann eí a/.SOYA actividad total), concentración actividad total). concentración 1987(ta'lo) Óptima de Ca2+ 0 5 mM, pH Óptima de Ca2+ 05 mM; pH

Óptlmo 6.6_ Óptmo 6 6_Lillum Hidrólisis de Pl (35°/o de la "drólisis de Pl (65% de la Helsper eí a/Longiflorum actividad total); concentración actividad total), concentración 1986a(polen) Óptima de Ca2. 1 mM, pH óptima de Ca2+ 1 mM, pH

Óptlmo 6.5 Óptlmo 6 5APIO (tallo) Hidrólisis de PIP2; activación Hidrólisis de PIP; actwación MCMurray e lrvine,

con 01% de deoxicolato,ConcentraciónÓptimadeCa2+1mM con 01% de doexicolato 1988

TR'GO Hidrólisis de PIP y PIP2, Pical eí a/.,1992(p'ántu'as) activación cx)n 0025% dedeoxícolato;concentraciónÓDtimadeCa2+10uM

AVENA Hidrólisis de PIP y PIP2, Tate ef a/.1989(raíces) concentración óptima de Ca2+10L,M.

PURIFICADA A PARTIR DEFRACCION MEMBRANAL FRACCION SOLUBLE

ARROZ PM aparente de 50 kDa; pl Yotsushima eí a/(celulas en 6 3, pH Óptimo 5 2; específica 1992suspensión) Para Pl, Vmax 5 Limol/min/mgproteína,Km03mM311vecesdepurmcación,activi-dadespecíficadelaenzimapui.a33umol/min/mgproteí-ria,concentraciónÓptimadeca2+100uM

TR'GO Específica para PIP y PIP2, Melm eí a/ ,1992(raíces) 25 veces de purtficación.actividadespeci'ficadelaenzimapura5Limol/min/mgproteína(paraPIP)y10LLmol/mln/mgprotel'na(paraPIP2).pHÓptlmo6-7(PIP)y6-65(PIF'2),concentraciónÓptimadeCa2+10HMy1mM(enpresenciadeMgc124mM)

AFtROZ P M aparerite 42 kDa, pl 51. Yotsushima eí a/ .(células en pH Óptimo 6 5, 220 veces de 1993suspensión) purificación, especi'fica paraPl.Vmai29Limol/min/mgproteína.Km12mM,

21

activacion Por ca2. y sr2+ imwactividadespecíficadelaenzimapura1.9umol/min/mgproteína

' 1995AVENA Dos formas separadas en Dos formas separadas en Huang eía ,

(raíces) base a su afinidad por hepari- base a su afinLdad por hepari-

na; P.M aparente de 42 kDa,81vecesdepurificación, na, PM. aparente de 50-70kDa;561vecesdepurifica-

act¡vidad específica de laenzimapura806 ción; actividad específica delaenzimapura14.6

nmol/min/mg proteína (con nmol/min/mg proteína (con

pip2), concentración Óptima pip2). concentración Óptlma

i de Ca2+ 1 mM` de Ca2+ 1 mM

Actualmente, se ha reportado la clonación de tres genes en plantas deArab/dops/s ma//.ana El gen A{PLC7S codifica para una PLC específica parafosfatidilinositol y es inducido baio condiciones de estrés salino y deshidratación

[Hirayama ef a/,1995], éste gen codifica para una proteína de 561 aminoácidoscon una masa molecular calculada de 64 kDa. Este producto incluye en suestructura los dominios EF-hand (en su región amino terminal), X, Y, y es similar aaqueHas isoformas de la familia Ó, además hidroliza PIP2 y su actividad fuedependiente de calcio

La clonación y secuenciación de un gene (AfpLct) que exhibe un alto

grado de similitud de secuencia con los genes de PLC-Ó de animales fue realizadapor Yamamoto eí a/ (1995) Este gen codifica para una proteína de 533aminoácidos, y contiene en su estructura las dos regiones conservadas en dondereside la actividad catalítica La expresión de este gene no se detectó en plántulasjóvenes Las plantas expresaron este gene cuando se transfirieron desdecondiciones cultivadas con períodos cortos de luz (8 h de luz/16 h de oscuridad)hasta condiciones cultivadas en períodos largos de luz (16 h de luz/8 h deoscuridad)

Recientemente, se reponó el tercer gene de Arabidops/.s Íha//.ana(AfpLC2) [Hirayama ef a/ ,1997]. El producto proteico de este gene exhibe bastantesimilitud de estructura con la de AtpLCIS Ambos son similares a las isoformas dela familia Ó Aunque AtpLC2 posee las regiones X y Y, éste no presentó en suestructura amino terminal el dominio EF-hand ni el domino PH Las plantascultivadas en cond.iciones normales expresan constitutivamente el gen AíPLC2 encasi todos los órganos excepto en las síliques, implicando que AtpLC2 no estáinvolucrada en el desarrollo de la semilla. Los niveles de ARNm de AtpLC2 fueronaltos bajo condiciones normales de cultivo y los niveles de ARNm de plantas quehabían sido expuestas a deshidratación no sufrieron cambio alguno Debido a queel gene AíPLCIS es inducible con estrés salino y de deshidratación, Hirayama eí a/.(1997) indicaron que la expresión de AtpLC7S y A{PLC2 es regulada de diferentemanera bajo las mismas condiciones de estrés, y que la función de éstas Pl-PLCsen las respuestas de estrés pueden ser diferentes

22

También en plantas de soya se caracterizó un gen (PLC7) quecodifica para una proteína que incluye los dominios catalíticos conservados de lasPLC de típo 6. El gen PLcl codifica para una proteína de 600 aminoácidos y poseeuna masa molecular de 68.8 kDa Esta proteína contiene en su estructura (entre lasregiones X y Y) un sitio de unión a Ca2+ de tipo EF-hand; la región amino terminalestá truncada. Debido a estas características, Shi et al„ (1995) sugirieron que estaisoenzima es un miembro de una famma nueva de Pl-PLCs. La localización de estaprotei'na, expresada en plantas de tabaco, indicó que se encuentra tanto en lamembrana plasmática como en el citosol La identidad de esta enzima fueconfirmada por estudios de complementación funcional en levaduras y por pruebasde actividad /.n v/.Íro [Shi eí a/., 1995]

MODELO DE ESTUDIO: Calharanfhus noseus (L.) G. Don.

C. roseus es una angiosperma dicotiledónea, perteneciente a la familiaApocynaceae, originaria de Madagascar y díspersada por cultivo a todo el mundo,es un arbusto pequeño y erguido, de 30 a 60 cm de altura, perenne y común en lasregiones tropicales [Taylor y Farnsworth, 1975]. C roseus es una de las plantasmedicinales más ampliamente estudiadas [Moreno eí a/ ,1995]. Estos estudios sehan enfocado en el aislamiento y semi-síntesis de sus alcaloides. Se han aisladomás de 200 alcaloides de diferentes panes de la planta, muchos de ellos conactividad farmacéutica importante [Cordell,1980; Mersey y Cutler,1986]. De éstos,los más imponantes son la vinblastina y la vincristina con propiedadesantileucémicas, el alcaloide antihipertensivo ajmalicina, y la serpentina que produceefectos sedantes. Los bajos rendímientos de estos alcaloides en la planta, ademásde su alto costo comercial, ha impulsado la investigación hacia nuevos métodosalternativos para la producción de estos alcaloides tales como la sintesis osemi-síntesis [Kutney eí a/ ,1988] y el cultivo de células y tejidos [Miura y Hirata,1986] En las últimas dos décadas, se ha obtenido una considerable cantidad deinformación relacionada con el crecimiento y producción de metabolitossecundanos a partir de cultivos celulares y de tejidos de C. noseus Nan der Heijdenef a/ ,1989; Ganapathi y Gargi,1990, Moreno eí a/„ 1995].

Actualmente, la Unidad de Biología Experimental del Centro delnvestigación Científica de Yucatán cuenta con varios modelos experimentalespara la obtención de alcaloides a partir de cultivos de C. roseus. Uno de éstos es lalínea J1, la cual previamente ha sido caracterizada en cuanto a crecimiento yproducción de alcaloides Esta línea de raíces fue obtenida mediante la infección dehojas con Agrobacfer/.um rh/zogenes [Ciau-Uitz eí a/., 1994]. Adicionalmente, lasraíces transformadas ofrecen ventajas con respecto al cultivo de plantas. Entreéstas se incluyen la estabilidad genética y bioquímica, el no requerimiento defitohormonas exógenas y la alta tasa de crecimiento.

En C. noseL/s se han aislado y caracterizado varias enzimasinvolucradas en la biosíntesis de los alcaloides indólicos [Moreno eí a/., 1995], sinembargo aún no se conocen los mecanismos de regulación correspondientes. Porotro lado, C roseus ha comenzado a ser un modelo para estudios de fisiologíavegetal. La elucidación de los mecanismos de transducción de señales que

23

pudieran estar involucrados o relacionados con la activación o expresión deenzimas de la biosíntesis de los alcaloides, permitiría la manipulación dediferentes factores que puedan conducir al incremento de la producciónalcaloides en cultivos de C. roseus.

24

HIPÓTESIS

Exi.sten estudios que han sugerido la exi.stencia en células vegetalesde un sistema similar al de la vía de los fosfoinosítidos descrita en céw animalesTambién se ha identificado la actvidad de PLC con características diferentes a lasde animales, por lo que es posible la existencia de múltiples isoformas de PLC enplantas que pudieran ser similares a aquellas de otros sistemas Asimismo, al igualque en células ani.males, cada una de las PLCs de plantas tendría mecanismos deac{ivación y regulación djferentes. Este trabajo sería un avance para elentendimiento de la función fisiológi.ca de esta enzima en los mecanismos detransducción de señales en plantas.

OBJETIVOS GENERALES

Caracterizar a la PLC durante el proceso de crecimiento en raícestransformadas de C. noseus.

Purificar a la fosfolipasa C de raíces transformadas de C. roseus.

OBJETIVOS PARTICULARES

Medir los niveles de actividad de la PLC /.n v/Íro, utilizando [3H]-PIP2como sustrato en raíces transformadas de C. roseus.

C. roseus.Determinar el efecto del Ca2+ sobre la PLC de rai.ces transformadas de

Determinar la especificidad del sustrato de la PLC de rai.cestransformadas de C roseus.

Determinar el efecto de diferentes detergentes sobre la PLC de raícestransformadas de C. noseus.

Desarrollar un protocolo que permita la separación y purificación de laPLC de raíces transformadas de C. roseus utilizando técnicas de cromatografíaconvencjonales y de FPLC.

25

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Akhlar A. and Abdel-Latif A. (1980) Reciuirement for calc.ium ions inacetylcholine-stimulated phosphodiesterat¢ cleavage ofphosphatidyl-myo-inositol 4,5-bisphosphate in rabbit iris smooth muscle. JBiochem ,192:783-791.

AIlen G.J., Mü S.R., and Sanders D. (1995) Release of Ca2+ from individual plantvacuoles by both lnsp3 and cyclic ADP-ribose Science, 268.735-737

Anderson`D., Koch C.A., Grey L., Ellis C., Moran M.F., and Pawson T. (1990).BindingofSH2domainsofphospholipaseCyl,GAP,andSrctoactivatedgrowthfactor receptors. Sciencie 250`979-982

Arteaga C.L., Johnson M.D., Todderud G., Coffrey R.J., Carpenter G., andPage D.L. (1991). Elevated contents of the tyrosine kinase substrate

phospholipase C-yl .in primaw human breast carcinomas. Proc. Natl Acad. SciUSA, 8810435-10439

Asano M., Tamiya-Koizumi K., Homma Y., Takenawa T., Nimura Y., Kojima K.,and Yoshida S. (1994) Purification and characterizatm of nuclearphospholipase C specific for phosphoinositides J Biol. Chem,269.12360-12366.

Banno Y., Yada Y., and Nozawa Y. (1988) Purification and charaterization ofmembrane-bound phospholipase C specific for phosphoinositides from humanplatelets. J Biol Chem , 263.11459-11465

Banno Y. and Nozawa Y. (1987) Characterization of pahially punfiedphospholipase C from human platelet membranes. Biochem. J , 248.95-101.

Banno Y., Yu A., Nakashima T., Homma Y., Takenawa T., and Nozawa Y.(1990). Biochem Biophys. Res. Commun ,167 396401

Baldassare J.J., Henderson P.A., and Fisher G.J. (1989). Isolation andrharacterizaticm of one soluble and two membraneassociated forms ofphosphoinositide-specific phospholipase C from human platelets Biochemistry28.601016016.

Bar-Sagi D., Rotin D., Batzer A., Mandiyan V., and Schlessinger J. (1993) SH3domains direct cellular localization of signalling molecules. Cell, 74 83-91

Benneft C.F. and Crooke S.T. (1987). Purification and characterization of aphosphoinositide-specific phospholipase C from guinea pig uterus.Phosphorylation by protein k.inase C /.n vivo. J Biol. Chem., 262..13789-13797.

26

Berridge M.J., Dawson R.M.C., Downes C.P., Heslop J.P., and lrvine R.F.(1983) Changes i.n the levels of inositol phosphates after agonist-dependenthydrolisis of membrane phosphoinosjtides. Biochem. J. 212, 473482.

Berridge lvl.J. (1990). Calcium oscillations. J. Biol Chem., 265:9583-9586

Berridge M.J. (1993) lnositol trisphosphate and calcium signalling. Nature,361 : 315-325.

Bloomquisl B.T., Shorlridge R.D., Schneuwly S., Perdew M., MonteM C., SlellerH., Rubin G., and Pak W.L. (1988). lsolation of a putative phospholipase Cgene of Drosophí/a, norpA and its role in photoftransducti.on. Cell 54, 723-733.

Bominaar A.A. and Van Haastert P.J.M. (1994). Phospholipase C in Oí.cíyosíe//.umd/'sco/deum ldenti.fication of stimulatory and i`nhibitory surface receptors andG-proteins Biochem J., 297.189-193.

Bominaar A.A., Kesbecke F., Snaar+agalska B.E., Peters D.J.M., Schaap P.,and Van Haasterl P.J.M. (1991) Aberrant chemotaxis and differentiation inO/cfyosíe//" mutant fgdc with a defective regulatic)n of receptor-stimulatedphosphoinositidase C J. Cell. Sci„ 100:825-831.

Boss W.F. (1989). Phosphoinosi.tide Metabolism. lts Relatjon to SignalTransduction in Plants ln.. Second Messengers in Plant Growth andDevelopment, W F. Boss and D.J Morré (Eds ), Alan R. Liss lnc , New York,29-56.

Boss W.F. and lvlassel M.O. (1985). Polyphosphoinositides are present i.n planttissue culture cells. Biochem Biophys. Res Commun.,132.1018-1023.

Boyer J.L., Waldo G.L., and Harden T.K. (1992). Py-Subunit activation ofG-psotein-reguylated Phospholipase C. J Biol. Chem , 267.25451-25456.

Boume H.R., Sanders D.A., and Mccormick F. (1991). The GTpase superfamily.conserved structure and molecular mechanism. Nature, 349: 117-127.

Brislol A., Ha S.M., Kriz R.W., Stahl M.L., Fan Y.S., Byer M.G., Eddy R.L.,Shows T.B., and Knopf J.L. (1988). Phospholipase C-148: chromosomallocation and deletion mapping of furiclional domains. Cold Spring Harbor Symp.Quant. Bi.ol., 53:915-920.

Camps M., Hou C., Sidiropoulos D., Stock J.B., Jakobs l{.H., and Gierschik P.(1992a). Stimulati`on of phospholipase C by guanine-nucleotide-binding proteinPy subunits. Eur. J. Biochem., 206..821-831.

27

Camps W Carozzi A., Schnabel P., Scheer A., Parker P.J., and Gierscm P.(1992b) lsozyme-select.ive stimulation of phospholipase C-P2 by G prote.inPy-subunits Nature, 360.684-686.

Ciau-Uitz R., Miranda-Ham M.L., Coello-Coello J., Chí 8., Pacheco L.M. andLoyola-Vargas V.M. (1994). lndole A`kaloid Production by Transformed andNon-transformed Root Cultures of Cafharaníhus roseL/s ln Vitro Cell. Dev. Biol„30:84-88.

Cifuentes M„ Honkanen L., and Rebecchi M.J. (1993) Proteolytic fragments ofphospholipase-specific C-81 J Biol. Chem , 268.11586-11593.

Chau L.-Y. and Tai H.-H. (1982) Resolution into two different forms and study ofthe properties of phosphatidyilinositol-specific phospholipase C from humanplatelet cytosol Biochim. Biophys. Acta, 713:344-351.

Cockcroft S. and Thomas G.M. (1992) Inositol-lipid-specific phospholipase Cisoenzymes and theh differential regulation by receptors Biochem. J., 288:1-14.

Conet R.J.A. and Hanke D.A. (1986). Breakdown of phosphatidylinositol insoybean callus. Planta,169:216-221

CordeH G.A. (1980) The botanical, chemical, biosynthetic and pharmacologicalaspects of Caíharaníhus roseus (L) G. Don. (Apocynaceae) Im Woo W S. andHan 8 H (Eds) Recent advances in Natural Product Research, p.p. 65-72. SeoulNational University Press, Seoul.

Coté G.G., Satter R.L., mrse M.J., and Crain R.C. (1990). Extraction separatiomand characterization of the metabolites of the inositol phospholipid cycle. ln:lnositol Metabolism in Plants, D J. Morre, W.F Boss, and F A. Loewus (Eds.),Wiley-Liss, New York, 113-137

Coté G.G. and Crain R.C. (1993) Biochemistry of phosphoinositides. Annu RevPlant Physiol Plant Mol. Biol., 44 333-356.

DasT.,BaekK.J.,GrayC.,andlmM.U.(1993).EvidencethattheGhproteihisasignalmediatorfromG,-adrenoreceptortoaphospholipaseC.11.Purificationandcharacterization of a Gh-coupled 69-kDa phospholipase C and reconstitution ofai-adrenoreceptor, Gh family, and phospholipase C J. Biol. Chem.,268 27398-27405

Dekker L.V., Palmer R.H„ and Parker P.J. (1995). The protein kinase C andprotein kinase A related gene families Curr Opin Struct. Biol , 5.396402.

Divecha N., Bantic H., and lrvine R.F. (1993a) lnositides and the nucleus andinositides in the nucleus Cell, 74 405407

28

Divecha N., Rhee S.G., Lelcher A.J., and lrvine R.F. (1993b) Phosphoinositidesignalling enzymes in rat liver nuclei Phosphoinositidase C isoform Pl isspecifically, but no predominantly, located in the nucleus Biochem J,289:617-620.

Drayer A.L. and Van Haastert P.J.M. (1992). Molecular cloning and expression ofa phosphoinositide-specific phospholipase C of O/.c¿yosíe//.um c//.sco/.deum. JBiol Chem., 267:18387-18392.

Drayer A.L., Van Der Kaay J., Mayr G.W., and Van Haastert P.J.lvl. (1994). Roleof phospholipase C in O/cíyosíe//.um: formation of Ínositol 1,4,5-trisphosphate andnormal development in cells lackíng phospholipase C activity EMBO J ,13: 1601 -1609

Dr¢bak B.K,, Ferguson 1.8,, Dawson A.P., and lrvine R,F. (1988)lnositol-containing lipids in suspension-cultured plant cells An isotopjc studyPlant Physiol„ 87:217+222.

Dr¢bak B.K. (1992) The plant phosphoinositide system. Biochem J., 288:697-712

Dr®bak B.K. (1993). Plant phosphoinositides and intracellular signaling. PlantPhysiol.,102:705-709.

Einspahr K.J., Peeler T.C., and Thompson A.A. Jr. (1989) Phosphatjdylinositol4,5-bisphosphate phospholipase C and phosphomonoesterase in OL/na//.e//asa//.na membranes. Plant Physiol , 901115-1120

Ellis V.M., Carne A., and Katan M. (1993). Structural requirements of

phosphatidylinositol-specific phospholipase C ói for enzyme activity Eur. JBiochem„ 213.339-347.

Emori Y., Homma Y., Sorimachi H., Kawasaki H., Nakanishi 0., Suzukj K., andTakenawa T. (1989). A second type of rat phosphoinositide-specificphospholipase C containing a src-related sequence not essential forphosphoinositide-hydrolyzing activity. J. Biol. Chem„ 264:21885-21890

Eriksson A., Nanberg E., Rónnstrand L., Engstróm U., Hellman U., Rupp E.,Carpenter G., Heldin C.-H., and Welsh L.C. (1995) Demonstration offunctionally different interactions between phospholípase C-y and the two typesof platelet-derived Growh Factor Receptors J. Biol. Chem , 270:7773-7781

Essen L.-O., Perisic 0., Cheung R., Katan M., and Williams R.L. (1996) Crystalstructure of a mammalian phosphoinositide-specific phospholipase C 6 Nature,380:595-602.

Ettlinger C. and Lehle L. (1988) Auxin induces rapid changes in

phosphatidylinositol metabolites. Nature, 331 : 176-178.

29

Evans R.M. (1988). The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science,240:889-895.

Fantl W.J„ Johnson D,E, and William§ L.T. (1993). Signalling by receptor tyrosinekinases. Annu Rev Biochem„ 62: 453-481

Feng J.-F., Rhee S.G., and lm M.J. (1996) Evidence that phospholipase 61 is theeffector in the Gh (transglutaminase ll)-mediated signaling. J B.iol Chem ,271 : 16451 -16454.

Ferreira P.A., Shoilridge R.D., and Pak W.L. (1993) Distinctive subtypes ofbovine phospholipase C that have preferential expression m the retina and highhomology to the norpA gene product of Drosoph//a. Proc Natl. Acad Sci. USA,90.6042-6046.

Femald A.W., Jones G.A., and Carpenter G. (1994). Limited proteolysis ofphospholipase C-yl indicates stable association of X and Y domains withenhanced catalytic activity Biochem. J , 302.503-509

Flick J.S. and Thorner J. (1993) Genetic and biochemical characterization of aphosphatidylinositol-specific phospholipase C in Saccharomyces cerev/.s/.ae Mol.Cell. Biol ,13:5861-5876.

Fukui T., Lutz R.J., and Lowenstein J.M. (1988). Purification of a phospholipaseC from rat liver cytosol that acts on phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate andphosphatidylinositol 4-phosphate. J. Biol. Chem , 263:17730-17737.

Ganapathi G. and Kargi F. (1990). Recent Advances in indole alkaloid productionby Caíharaníhus roseL/s (Periwinkle). J, Exp. Bot„ 41 :259-267.

Goldschmit-Clermont P.J., Kim J.W., Machesky L.M., Rhee S.G., and PollardT.D. (1991) Regulation of phospholipase C-yl by profilin and tyrosine

phosphorylation Sciencie, 2511231-1233

Gout 1., Dhand R., Hiles l.D., Fry lvl.J., Panayotou G., Das P., Truong 0., ToWN.F., Hsiian J., Booker G.W., Campbell l.D., and Waterfield M.D. (1993). TheGTpase dynamin binds to and is activated by a subset of SH3 domains. Cell,75 25-36.

Greenfield C., Hils 1., Waterfield M.D.. Federwisch W., Wollmer A., BlundellT.L., and lvlcDonald N. (1989). EGF binding induces a conformational change inthe external domain of its receptor. EMBO J., 8.41554124

Grenningloh G., Rienitz A., Schmitl 8., Methfessel C., Zensen M., BeyreutherK., Gundelfinger E.D., and Betz H. (1987). The strychnine-binding subunit ofthe glycine receptor shows homology with nicotinic acetylcholine receptorsNature, 328:215-220.

30

Gross W. and Boss W.F. (1993). Inositol phospholipids and signal transduction. /n.DPS Verma eds , "Control of Plant Gene Expression", CRC Press, Boca Raton,Fl" pp.17-32.

Harlan J.E., Hadjuk P.J., Yoon H.S., and Fesik S.W. (1994). Pleckstrin homologydomains bind to phosphatidylinosi.tol-4,5-bisphosphate. Nature, 371.168-170.

Heim S. and Wagner K.G. (1989). lnositol phosphates in the growth cycle ofsuspension cultured plant cells Plant Sci., 63:159-165

Heldin C.H. (1995). Dimerization of cell surface receptors in signal transduction.Cell, 80:213-223.

Heldin C.H., Emlund A., Rorsman C., and Rónnstrand L. (1989) Dimerization ofthe B-type platelet-derived growth factor receptors occurs after ligand bindingand is closely associated with receptor kinase ac{ivation. J, Biol. Chem ,264.8905-8912.

Helsper J.P.F.G., De Grool P.F.M., Linskens H.F., and Jackson J.F. (1986a).Phosphatidylinositol phospholipase C activity in pollen in L///um /ong/.fi/owmPhytochem„ 25:2053-2055.

Helsper J.P.F.G., De Groot P.F.M., Linskens H.F., and Jackson J.F. (1986b).Phosphatidylinositol monophosphate in Lí./í.um pollen and turnover ofphospholipid during pollen tube extension. Phytochem., 25.2193-2199.

Helsper J.P.F.G., Heemskerk J.W.M., and Veerkamp J.H. (1987) Cytosolic andparticulate phosphatidylinositol phospholipase C acti.vities in pollen tubes ofL/.//.um /ong/Wort/m. Physiol Plant , 71 120-126.

Henderson R., Baldwin J.lvl., Ceska T.A., Zemlin F., Beckmann E., andDowning K.H. (1990). Model for the structure of bacteriorhodopsin based onhigh-resolution electron cyo-microscopy. J. Mol Biol , 213:899-929

Hernández-Sotomayor S.M.T. and Carpenter G. (1993). Non-catalytic activationof phospholipase C-yl /.n v/fro by epidermal growth factor receptor. Biochem. J.,293:507-511.

of DNA synthesis. Science, 248 i66ó-i6é3

Hirasawa 1{., lrvine R.F., and Dawson R.lvl.C. (1982a) Heterogeneity of thecalcium-dependent phosphatidylinositol phosphodiesterase in rat brainBiochem. J , 205:437442.

Hirasawa K., lrvine R.F., and Dawson R.M.C. (1982b). Heterogeneity of thecalcium-dependent phosphatidylinositol-phosphodiesterase of rat liver and

31

T.D., Dean N.M., Mordan L.J., Lau A.F., Kanemi6u M.Y., and Boynton A.L.1990). PDGF-induced activation of phospholipase C is not required for induction

kidney, as revealed by chromatofocusing Biochem. Biophys Res. Commun.,107:533-537.

HirayamaT.,OhtoC.,MizoguchiT.,andShinozawK.(1995)Ageneencodinga

gthr:s!l:tÁd,y:Ln,3:,;os,,-ss,heac,;fá:aphporsopchok,!tis3c?dséncT:?dA:g2d:g#3tá:,andsa„

Hirayama T., Mitsukawa N., Shibata D., and Shinozaw K. (1997) AfpLC2, a

3:::es::áoí:n3egpeht:t:::oánnods,;:::a.¡T,::,:,:sP*oÁpahbo,¿po%S:sgh,a„,:nacoB¡á,:%t,#Biol , 34.175-180

Homma Y., lmaki J., Nakanishi 0., and Takenawa T. (1988). Isolation andcharacterizat'ion of two different forms of inositol phospholipid-specific

phospholipase C from rat brain, J Biol Chem„ 263:6592-6598

Homma Y., Emori Y., Shiba§aki F., Suzuki K., and Takenawa T. (1990) lsolationand characterization of a y-type phosphoinositide-specif.ic phospholipase C

(PLC-y2) Biochem. J„ 269.13-18

Huang C.-H., Tate B.F., Ci.ain R.C., and Coté G.G. (1995) Multiplephosphoinositide-specific phospholipases C in oat roots. characterization andpartial purification. Plant J , 8 257-267

lkezawa H. and Taguchi R. (1981) Phosphatidylinositol-specific phospholipase Cfrom Baci.//us mur/.ng/.ensi.s. Methods Enzymol , 71.731-741.

lm M.+. and Graham R.M. (1990). A novel guanine nucleotide-biding proteincoupled to the crradrenergic receptor. J. Biol. Chem , 265.18944-18955.

lrvine R.F., Letcher A.J„ and Dawson R.M.C. (1980). Phosphatidylinositolphosphodiesterase in higher plants Biochem. J„ 192..279-283.

lrvine R.F., Letcher A.J., Lander D.J., Drobak B.K., Dawson A.P., andMusgrave A. (1989). Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate andphosphatidyl.inositol(4)phosphateinplamtissuesPlantPhysiol,89.888-892.

lrvine R. (1996) Tak.ing stock of PI-PLC. Nature, 380:581-583.

Jhon D.-Y., L.e H.-H., Park D., Lee C.-W., Lee KH., Yoo O.J., and Rhee S.G.(1993) Cloning, secuencing, purification and Gq-dependent activation ofphospholipase C-P3 J Biol Chem , 268'6654-6661.

Ji Q.-S., Winniet G.E., Niswender KJ}, Horstman D., Wi§dom R., MagnusomM.A., and Carp.n" G. (1997) Essential role of the tyrosine kinase substratephospholipase C-yl in mammalian growth and development. Proc Natl Acad.Sci USA, 94.2999-3003

32

Jones G. and Carpenter G, (1992). Regulation of Phospholipase C lsozymes.Prog. in Growth Factor Res., 4:97-106.

Kamada Y. and lvluto S. (1992). Ca2+ regulation of phosphatidylinositol turnover inthe plasma membrane of tobacco suspension culture cells. Biochim. Biophys.Acta,1093:72-79.

Katan M. and Parker P.J. (1987). Purification of phosphoinositide-specific

phospholipase C from a particulate fraction of bovine brain. Eur. J. Biochem.,168 .413-418.

Katan lvl., Kritz R.W., Totty N„ Meldrum E., Aldape R.A., Knopf J.L., and ParkerP.J. (1988). Determination of the primary structure of PLC-154 demonstratesdiversity of phosphoinositide-specific phospholípase C activities. Cell,54: 171 -177.

Katz A., Wu D., and Simon M.l. (1992). Subunits Py of heterotrimeric G proteinactivate P2 isoform of phospholipase C. Nature, 360:686-689

Kazlauskas A. and Cooper J.A. (1989). Autophosphorylation of the PDGF receptorin the kínase insert region regulates interactions with cells protein. Cell,58: 1121 -1132.

Kazlauskas A., Feng G.S., Pawson T., and Valius M. (1993). The 64 kD proteinthat associates with the PDGF receptor subunit via tyrosine 1009 is the SH2containing phosphotyrosine phosphatase Syp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90:6939-6942.

Kim H.Y., Coté G.G., and Crain R.C. (1996). Inositol l,4,5-trisphosphate maymediate closure of K+ channels by light and darkness in Samanea saman motorcells. Planta,198:279-287.

Kim U.H., Kim J.W., and Rhee S.G. (1990a). Ep¡dermal growth factor and

platelet-derived growth factor promote translocation of phospholipase C-y fromcytosol to membrane. FEBS Lett., 270:33-36.

Kim J.W,, Sim S.S., Kim U,-H., Nishibe S., Wahl M., Carpenter G., and RheeS.G. (1990b). Tyrosine residues in bovine phospholipase CJy phosphorylated bythe epidermal growth factor receptor /.n v/.Íro. J. Biol. Chem„ 265:3940-3943.

Kim H.K., Kim J.W., Zilber§tein A., Margolis 8., Kim J.G., Schlessinger J., andRheo S.G. (1991). PDGF stimulation of inositolphospholipjd hydrolysís requiresPLC-yl phosphorylation on tyrosine residues 783 and 1254 Cell, 65:435441

Kishimoto T., Taga T., and Akira S. (1994). Cytokine signal transduction Cell,76:253-262.

33

Kobilka B.K., Matsui H., Kobilka T.S., Yang Feng T.L., Francke U., Caron M.,Lefkowitz R.J., and Regan J.W. (1987) Cloning, secuencing, and expressionof the gene coding for the human platelet ct2-adrenergic receptor. Science,238:650-656.

Koch C.A., Anderson D., Moran M.F., EIlis C., and Pawson T. (1991). SH2 andSH3 domains: elements that control lnteractions of cytoplasmic signallingmolecules Science, 252.668-674

Kritz R., Lin L.-L., Sultzman L., Ellis C., Heldin C.-K., Pawson T., and Knopf J.(1990). Phospholipase C isozymes Structural and functional similarities lnProío-onoogenes /n Ce// Deve/opmení (Ciba Foundation Symposium150): 112-127.

Kuang Y., Wu Y., Smrcka A., Jiang H., and Wu D. (1996) ldentification of a

phospholipase C P2 region that interacts with Gpy. Proc. Natl Acad Sci USA,93 2964-2968.

Kuricki H., Tamiya-Koizumi K., Asano M., Yoshida S., Kojima K., and NimuraY. (1992). Existence of phosphoinositide-specific phospholipase C in rat livernuclei and its change during liver regeneration. J Biochem , 111.283-286.

Kutney J.P., Choi L.S.L., Nakano J., Tsukamoto H., lvlchugh M„ and BouletC.A. (1988) A highly efficient and commercially important synthesis of theantitumor Catharanthus alkalojds vinblastine and leurosidine from catharanthineand vindoline. Heterocycles, 27.1845-1853.

Langosch D., Thomas L., and Betz H. (1988) Conserved quaternary structure ofligand-gated ion channels. the postsynaptic glycine receptor is a pentamer. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 85.7394-7398.

Lee C.H., Park D., Wu D., Rhee S.G., and Simon M.l. (1992) Members of the Gqasubunit gene family activate phospholipase C-P isozymes J. Biol Chem ,267.16044-16047

Lee C.-W., Park D.J., Lee K.H., Kim C.G., and Rhee S.G. (1993). Purification,molecular cloning, and sequencing of phospholipase C-P4 J Biol. Chem.,268:21318-21327

Lee K.-Y., Ryu S.H., Suh P.-G., Choi W.C., and Rhee S.G. (1987). PhospholipaseC associated with particulate fractions of bovine brain. Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84:5540-5544.

Lee S.B. and Rhee S.G. (1995) Significance of PIP2 hydrolysis and regulation ofphospholipase C isoenzymes. Curr. Opin Cell Biol , 7183-189.

34

Lee S.B., Rao A.K., Lee K.-H., Yang X., Bae Y.S., and Rhee S.G. (1996)Decreased expression of phospholipase C-P2 isozyme in human platelets withimpaired function. Blood, 88:1684-1691.

Lee S.B. and Rhee S.G. (1996). Molecular cloning, splice variants, expression, and

purification of phospholipase C-Ó4. J. Biol. Chem„ 271 :25-31.

Legendre L., Yueh Y.G., Crain R., Haddock N., Heinsten P.F., and Low P.S.(1993) Phospholipase C activation during elicitation of the oxidative burst mcultured plant cells. J. Biol. Chem„ 268:24559-24563.

Lodish H., Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., and Darnell J.(1995). Molecular Cell Biology. Third edition. By Scientific American Books, lnc

Loewenstein W.R. (1987). The cell-to-cell channel of gap junctions. Cell,48.725-726.

Low lvl.G. (1981). Phosphatidylinositol-specific phospholipase C fromSíaphy/ococcus aureus. Methods Enzymol„ 71741 -746.

Low M.G. and Weglicki W.B. (1983) Biochem. J , 215:325-334.

Ma H.W., Blitzer R.D„ Healy E.D., Premont R.T,, Landau E.M., and lyengar R.(1993) Receptor-evoked Cl-current in Xenopus Oocytes is mediated through aP-type phospholipase C. J. Biol. Chem., 268..19915-19918.

Mato J.M., Kelly K.l., Abler A., and Jarrett L. (1987). ldentification of a novelinsuline-sensitive glycophospholipid from H35 hepatoma cells. J. Biol. Chem„262: 2131 -2137 .

Margolis 8., Rhee S.G., Felder S., Mervic M., Lyall R., Levitzki A., Ullrich A.,Zilberstein A., and Schlessinger J. (1989). EGF induces tyrosinephosphorylation of phospholipase C-ll: A potential mechanism for EGF receptorsjgnaling. Cell, 57: 1101-1107.

Margolis 8., Li N., Koch A., Mohammadi M., Hurwitz D., Ullrich A., ZilbersteinA., Pawson T., and Schlessinger J. (1990a). The tyrosine phosphorylatedcarboxy terminus of the EGF receptor is a binding site for GAP and PLcy. EMBOJ., 9:43754380.

Margolis 8., Bellot A.M., Haneyer A.M., Ullrich A., Schlessinger J., andSilberstein A. (1990b). Tyrosine kinase actMty is essential for the association ofphospholipase C-y with the epidermal growth factor receptor Mol Cell Biol ,10 .435-441.

35

Martelli A.lvl., Gilmour R.S., Bertagnolo V., Neri L.M., lvlanzoli L., and Cocco L.(1992). Nuclear localization and signalling activity of phosphoinositidase CP inSwiss 3T3 cells. Nature, 358;242-245.

Marques M.B., Weller P.F., Parsonnet B.J., Ransil B.J., and Nicholson-WellerA. (1989). Phosphathidylinositol-specific phospholipase C, a possible virulencefactor of Sfaphy/ococcus aunet/s. J. Clin Microbiol 27:2451-2454.

Mazzoni M„ Bertagnolo V., Neri L,M., Carini C., Marchisio M., Mi[ani D.,Manzoli F.A., and Capitani S. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun.,187: 114-120

Mc Murray W.C. and lrvine R.F. (1988) Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphatephosphodiesterase in higher plants. Biochem J , 249.887-881.

lvleldrum E., Katan M., and Parker P. (1989). A novel inositol-phospholipid-specific

phospholipase C Rapid purification and characterization Eur. J Biochem ,182:673-677 .

Meldrum E., Kritz R.W., Totty N., and Parker P.J. (1991 ) A second gene productof the inositol-phospholipid-specific phospholipase Cs subclass. Eur. JBiochem ,196:159-165.

Melin P., Sommarin M., Sandelius A.S., and Jergil 8. (1987). ldentification ofCa2+ stimulated polyphosphoinositide phospholipase C in isolated plant plasmamembranes. FEBS Lett., 223:87-91.

Melin P., Pical C., Jergil 8., and Sommarin M. (1992) Polyphosphoinositidephospholipase C in wheat root plasma membranes Panial purification andcharacterization. Biochim. Biophys. Acta,1123163-169.

'lengaud J„ Braun-Breton C., and Cossart P. (1991) ldentification of

phosphatydilinositol-specific phospholipase C activity in Li.síerr.a monocyíogenesa novel type of virulence factor? Mol Microbiol„ 5 (2) 367-372.

Mersey B.G. and Cutler A.J. (1986). Differential distribution of specific indolealkaloids in leaves of Caíharaníhus roseus Can J. Bot„ 64.1039-1045.

Miui.a Y. and Hirata -' (1986) An organ culture of Caíharaníhus roseus capable ofproducing substantial amount of indole alkaloids Eur. Pat Appl EP 0200225 A2

Mohammadi M., Honneger A.M., Rotin D., Fishcher R., Bellot F., Li W., DionneC.A„ Jaye M., Rubinstein M., and Schlessinger J. (1991). Atyrosine-phosphorylated carboxi-terminal peptide of the fibroblast growth factorreceptor (Flg) is a binding site for the SH2 domam of phospholipase C|1. Mol.Cell Biol .11.5068-5078.

36

Moran M.F., Koch C.A., Anderson D., EIlis C., England L., lvlartin G.S., andPawson T. (1990). Src homology region 2 domains direct protein-proteininteractions in signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87.8622-8626.

Moreno P.R.H., Van der Heijden R., and Verpoorte R. (1995). Cell and tissuecultures of Cafharan{hus roseus: A literature survey. Plant Cell Tiss. Org. Cult.,42 : 1 -25.

Moi.ris A.J., Waldo G.L., Downes C.P., and Harden T.K. (1990). A receptor andG-proteinLregilated polyphosphoinositjde-specific phospholipase C from Turkeyerythrocytes. J. Biol. Chem., 26513501-13507.

Mui A.L.iF. and Miyajima A. (1994) Cy{okine receptors and signal transduction.Prog. Growth Factor Res., 5:15-35.

Murthy P.P.N., Renders J.M., and Keranen L.M. (1989) Phosphoinosi.tides inbarley aleurone layers and gibberelic acid-induced changes in metaboli.sm. PlantPhysjol., 91:1266-1269.

Nakaoka H., Pérez D.Wl., Baek K.J., Das T., Husain A., Misono K., lm M.+., andGraham R.M. (1994) Gh: A GTP-Binding Protein wi{h Transglutaminase Activityand Receptor Signaling Function. Science, 264.1593-1596.

Nishibe S., Wahl M.l., Hernández-Sotomayor S.M.T., Tonks N.K., Rhee S.G.,and Carpen{er G. (1990). lncrease of the catalytic activi.ty of phospholipase C-ylby tyrosine phosphorylation. Science, 250.1253-1256.

Noh D.-Y., Shin S.H., and Rhee S.G. (1995). Phosphoinositide-specificphospholipase C and mitogenic signaling. Biochim. Biophys. Acta, 1242:99-114

0hta S., Matsui A., Nazawa Y., and Kagawa Y. (1988). Complete cDNA encodinga putative phospholipase C from transformed human lymphocytes FEBS Lett.,242:31-35.

Parker P.J., Hemmings B.A., and Gierschik P. (1994). PH domains andphospholipases -a meaningful relationship? Trends Biochem Sci ,19:54-55

Payne W.E. and Fitzgerald-Hayes lvl. (1993). A mutation in PLC7, a candjdatephosphoinosi{ide-specific phospholipase C gene from Saccharomycescerev/.s/ae, causes aberrant mitotic chromosome segregation Mol. Cell Biol.,13:43514364.

Pfafímann H., Hartmann E., Brightman A.O., and Morre D.J. (1987).Phosphatidylinositol specific phospholipase C of plant stems: Membraneassociated actjvity concentrated in plasma membranes Plant Physiol ,85`.1151 -1155.

37

Pical Ch„ Sandeliu§ A.S., Melin P.-M., Sommarin M. (1992).Polyphosphoinos.itide phospholipase C in plasma membranes of wheat Í7-r/.f/.cumaesf/VL/m L ). Plant Physiol„ 100.1296-11303

Perella F.W., Jankewicz R., and Dandrow E.A. (1991). Phospholipase C fromhuman melanoma: purification and characterization of aphosphatidylinositol-selective enzyme. Biochim B.iophys Acta,1076.209-214

Probst W.C., Snyder L.A., Schuster D.I., Brosius J., and Sealfon S.C. (1992).Sequence alignment of the G-protein coupled receptor superfamily. DNA Cell.B`iol„ 11.1-20.

Rebecchi M.J. and Rosen O.M. (1987) Purification of a phosphoinositide-specificphospholipase C from bovine brain. J Biol. Chem., 262.12526-12532.

Rebecchi M., Peterson A., and MCLaughlin S. (1992) Phosphoinositide-specific

phospholipase C-81 binds with high affinity to phospholipid vesicles containingphosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Biochemistry, 31 12742112747

Rhee S.G. and Bae Y.S. (1997) Regulation of phosphoinositide-specificphospholipase C isozymes J Biol. Chem„ 272 15045-15048.

Rhee S.G., Suh P.G., Ryu S.H., and Lee S.Y. (1989) Studies of lnositolPhospholipid-Specific Phospholipase C. Science, 244.5461550.

Rhee S.G., Kim H., Suh P.G., and Choi W.C. (1991). Multiple forms ofphosphoinositidelspecific phospholipase C and different modes of activation.Biochem Soc Trans ,19:337-341

Rhoe S.G. and Choi K.D. (1992). Regulat.ion of lnositol Phospholipid-specificPhospholipase C lsozymes J. Biol Chem„ 267.12393-12396.

Rincón M. and Boss W.F. (1990). Second-messenger role of phosphoinositides/n. lnositol Metabolism .in Plants. D.J Morré, W.F. Boss, and F.A. Loewus (Eds.),Wiley-Liss, New York,173-200

Rolin D., Margolis 8., Mohammadi M., Daly R.J., Daum G., Li N., Fishcher E.H.,Burgess W.H., Ullrich A., and Schlessinger J. (1992). SH2 domains preventtyrosine dephosphorylation of the EGF receptor. identification of tyr 992 as thehigh affinity binding sites for the SH2 dornains of phospholipase C-y EMBO J„11 :559-567.

Ryu S.H., Cho K.S., Lee K.-Y., Suh P.-G., and Rl`ee S.G. (1987a). Purification andcharacterization of two immunologically distinct phosphoinositide-specific

phospholipase C from bovine brain. J. Biol. Chem„ 262:12511-12518

Ryu S.H., Suh P.-G., Cho K.S., Lee K.-Y., and Rhee S.G. (1987b). Bovine braincytosol contains three immunologically distinct forms of

38

inositolphospholipid-specific phospholípase C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84.6649-6653.

Saltiel A.R. and Cuatrecasas P. (1986). lnsulin stimulates the generation fromhepatic plasma membranes of modulators derived from an inositol glycolipid.Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5793-5797.

Saltiel A.R., Fox J.A., Sherline P., and Cuatrecasas P. (1986). lnsulin-stimulatedhydrolysis of a novel glycolipid generates modulators of cAMPphosphodiesterase. Science, 233:967-972.

Sande[ius A.S. and Sommarin M. (1990). Membrane-Localized Reactionslnvolved Ín Polyphosphoinositide Turnover in Plants. /n: lnositol Metabolism inPlants. D.J. Morré, W.F. Boss, and F.A. Loewus (Eds.), Wiley-Liss lnc„ NewYork, pp.139-161.

Savarese T.M. and Fraser C.M. (1992). /n v/.Íro mutagenesjs and the search forstructure-functíon relationships among G protein-coupled receptors. Biochem. J. ,283: 1 -19.

Schneuwly S., Burg M.G., Lending C., Perdew M.H., and Pak W.L. (1991).Properties of photoreceptor-specific phospholipase C encoded by the noripAgene of Orosophí./a me/anogasíer. J. Biol. Chem„ 266:24314-24319.

Schles§inger J. and Ullrich A. (1992). Growm factor signalling by receptor Vrosinekinases. Neuron, 9:383-391.

Schlessinger J. (1993). How receptor tyrosine kinases activate ras. TrendsBiochem. Sci„ 18:273-275.

Schofield P.R., Darlison M.G., Fujíta N., Buit D.R., St®phonson F.A., RodríguezH., Rhee L.M., Ramachandran J., Reale V., Glencorse T.A., Seeburg P.H.,and Barnard E.A. (1987). Sequence and functional expression of the GABAAreceptor shows a ligand-gated receptor superfamily. Nature, 328:221 -227.

Schumaker K.S. and Sze H. (1987). lnositol 1,4,5-trisphosphate releases Ca2+ fromvacuolar vesjcles of oat roots. J. Biol. Chem., 262:3944-3946.

Segre G.V. and Goldring S.R. (1993). F`eceptor for secretin, calcítonin, parathyroidhormone (PTH)/PTH-related peptide, vasoactive intestinal peptide, glucagonlikepeptide 1, growh hormone-releasing hormone, and glucagon belong to a newlydiscovered G-protein linked receptor family. Trends Endocrinol. Metab.,4:309-314.

Shi J., Gonzálos R.A., and Bhattacharyya M.K. (1995). Characterization of aplasma membrane-assoclated phosphoinositide-specific phospholipase C fromsoybean. Plant J„ 8 (3):381-390.

39

Shortridge R.D,, Yoon J., Rlending C., Bloomquist B.T., Perdew M.H„ and PakW.L. (1991) A Driosoph//a phospholipase C gene that is expressed in the centralnervous system J Biol. Chem„ 26612474-12480.

Shukla S.D. (1982). Phosphatidylinositol specific phospholipase C Life Sci,,30: 1323-1326.

Smith M.R., Ryu S.-H., Suh P.-G,, Rhee S.-G., and Kung H.-F. (1989). S-phaseinduction and transformation of quiescent NIH 3T3 cells by microinjection ofphodpholipase C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86.3659-3663.

Smrcka A.V., Hepler J.R., Brown K.O„ and Sternweis P.C. (1991) Regulation ofpolyphosphoinositide-specific phospholipase C activity by purified Gq. Science,251 :804-807

Soler C., Beguinot L., Sorkin A., and Carpenter G. (1993) lndividual epidermalgromh factor receptor autophosphorylation sites do not stringently defineassociation motifs sor several SH-containing proteins. J. Biol Chem.,268:22010-22019.

Stahl M., Ferenz C.F,, Kelleher K.L., Kriz R.W., and Knopf J.L. (1988). Sequencesimilarity of phospholipase C with the non-catalytic region of src. Nature,332:269-272.

Staiger C.J., Goodbody K.C., Hussey P.J., Valenta R., Drobak B.K., and LloydC.W. (1993). The profilin multigene family of maize differential expression ofthree isoforms. Plant J., 4:631 -641.

Sternweiss P,C. (1994). The active role of Py in signal transduction. Curr. Opin.Cell. Biol., 6.198-203.

Strader C.D., Fong T.M., Tota M.R., and Underwood D. (1994). Structure andfunction of G-protein-coupled receptors Annu. Rev. Biochem., 63.101-132.

Suh P.-G., Ryu S.H„ Moon K.H., Suh H.W., and Rhee S.G. (1988a). Cloning andsequence of multiple forms of phospholipase C. Cell, 54: 161 -169.

Suh P.-G., Ryu S.H., Moon K.H., Suh H.W., and Rhee S.G. (1988b)lnositolphospholtpid-specific phospholipase C: complete cDNA and proteinsequences and sequence homology to tyrosine kinase-related oncogeneproducts Proc Natl Acad Sci. USA, 85 5419-5423

TagLichi R. and lkezawa H. (1978). Phosphatidylinositol-specific phospholipa§e Cfrom C/osírtdwm novyí Type A Arch. Biochem Biophys ,186196-201

Tan Z. and Boss W.F. (1992) Association of phosphatidylinositol kinase,phoaphatidylinositol monophosphate kinase, and diacylglicerol kinase with thecytoskeleton and F-actin fractions of carrot (Daucus caroía L.) cells grown in

40

suspension culture. Response to cell wall-degradeing enzymes. Plant Physiol„100:2116-2120.

Tate B.F., Schaller G.E., Sussman M.R., and Crain R.C. (1989). Characterizationof a polyphosphoinositide phospholipase C from the plasma membrane of Avenasaí/.va Plant Physjol., 91 :1275-1279.

Taylor W.l. and Farnsworth N.R. (1975). The Caíharaníhus alkaloids` MarcellDekker lnc. New York.

Taylor S.J., Smith J.A., and Exton J.H. (1990). Purification from bovine livermembranes of a guanine-nucleotide-dependent actívation of phospholipase C.lmmunologic identification as a novel G-protein cL subunit. J. Bjol. Chem.,265.17150-17156.

Taylor S.J., Chae H.Z., Rhee S.G., and Exton J.H. (1991). Activation of the Plisozyme of phospholípase C by a subunjts of the Gq class of G proteins. Nature,350:516-518.

Todderud G., Wahl M.l., Rhee S.G., and Carpenter G. (1990). Stimulation of

phospholipase C-yl membrane association by epidermal growth factor Science,249:296-298.

Ullrich A. and Sch[essinger J. (1990). Signal Transduction by receptors withtyrosine kinase. Cell, 61 :203-212.

Van der Heijden R., Verpoorte R., and Ten Hoopen H.J.G, (1989). Cell and tissuecultures of Caíharaníhus roseus (L ) G Don: A literature survey. Plant Cell Tiss.Org. Cult., 38:345-349.

Volwerk J.J., Wetherwax P.B., Evans L.M., Kuppe A., and Griffith O.H. (1989).Phosphatidylinositol-specific phospholipase C from Bac/'//us ce/eus, improvedpurificatíon, amino acid composition, and amino-terminal sequence. J. Cell.Biochem., 39:315-325.

Yang W., Burkhart W., Cavallius J., Merrick W.C., and Boss W.F. (1993).Purification and characterization of a Phosphatidylinositol 4-Kinase Activator inCarrot Cells. J. Biol. Chem„ 268.392-398,

Yamamoto Y.T., Conkling M.A., Sussex l.M,, and lrish V.F. (1995). AnArab/.dops/s cDNA Related to Animal Phosphoinositide-Specific Phospholipase CGenes. Plant Physlol.,107:1029-1030

Yoko-o T., Matsui Y., Yagisawa H., Nojima H., Uno 1„ and Toh-e A. (1993) Theputative phosphoinositlde-specific phospholipase C gene, PLC7, of the yeastSaccharomyces cerev/s/ae ls important for cell growth Proc Natl Acad SciUSA, 90.1804-1808.

41

Yotsushima K., Nakamura K., Mitsui T., and lgaue 1. (1992). Purification andCharacterization of Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C inSuspension-cultured Cells of Rice (Oryza saíí.va L.) Biosci. Biotech Biochem.,56: 1247-1251.

Yotsushima K., Mitsui T., Takaoka T., Hayakawa T., and lgaue [. (1993).Purification and Characterization of Membrane-Bound lnositolPhospholipid-Specific Phospholipase C from Suspension-Cultured Rice (On/zasaí/.va L ) Cells. Plant Physiol„ 102.165-172.

Waldo G.L„ Morris A. J., and Harden T.K. (1994). Purification ofG-protein-regulated phospholipase C from Turkey erythrocytes. Methods inEnzymolo`gy, 238.195207.

Wahl M.l., Nishibe S., Kim J.W., Kim H„ Rhee S.G., and Carpenter G. (1990)ldentification of the major EGF sensitive tyrosine phosphorylation sites of

phospholipase C| in intact HSC-1 cells J. Biol. Chem., 265:3944-3948.

Wahl M.l., Jones G.A., Nishibe S„ Rhee S.G„ and Carpenter G. (1992) Growthfactor stimulation of phospholipase C-yl activity. J Biol. Chem„267: 10447-10456 .

Wu D., Lee C.H., Rhee S.G., and Simon M.l. (1992a) Activation of phospholipaseC by the G subunits of the Gq and G„ proteins in transfected Cos-7 cells J. Biol.Chem., 267:1811-1817.

Wu D., Katz A., Lee C.H., and Simon M.l. (1992b). Activation of phospholipase Cby cti-adrenergic receptors is mediated by the ct subunits of Gq family. J Biol.Chem. , 267:25798-25802.

Wu D., Jiang H., Katz A„ and Simon M.l. (1993a). ldentification of critical regionson phospholipase C-Pl required for activation by G-proteins J Biol. Chem.,268.3704L3709.

Wu D., Katz A„ and Simon M.l. (1993b) Activation of phospholipase C P2 by the Gand Py subunits of trimeric GTP-binding protein Proc. Natl. Acad Sci USA,90:5297-5301.

42

CAPITULO 11

Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-Phospholipase C activityduring the growing phase of Cafharanfhus noseus transformedroots.César De Los Santos~Briones, J. Armando Muñoz-Sánchez, José Chín-Vera,Victor M. Loyola-Vargas and S. M. Teresa Hernández-Sotomayor. Publicado en J.Plant Physiol. Vol 150, pp. 707-713 (1997).

ABBREVIATIONS

PLC, phospholi.pase C; PIP2, phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate;lp3, inositol 1,4,5,trisphosphate, PIP, phosphatidylinositol 4-monophosphate; Pl,

phosphatidylinositol; C. n)seus, Cafharan!hus roseus,. EGTA, [ethyl - enebis(oxyethylenenitrilo)] tetraacetic acid; DAG, diacylglycerol; TCA, trichloroacetic acid;SDS, sodium dodecyl sulfate

ABSTRACT

A phosphati.dylinositol 4,5-bisphosphate phospholi.pase C (PLC) activjtywas identified in different tissues from Caíharaníhus nDseus. The §pecific activity ofthe enzyme was 10 times higher in a membrane fraction than in cytosol. During aculture cycle, in two different root lines, PLC-activity in the cytosol reached amaximum that preceded the higher activity in the membranes. Both ac{ivities,soluble and membrane, are calcium-dependent for full activity. Themembrane~bound activity catalyses efficiently phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate(PIP2) and phosphatidylinositol 4-monophosphate (PIP) hydrolysis whilephosphatidylinositol (PI) is a poor substrate. The soluble activity preferentiallyhydrolyzes Pl over PIP and PIP2. Both activities are completely inhi.bited by TritonX-100, whereas they respond differentially to n-octyl P-D-glucopyranisde.

lNTRODUCTION

Phospholipase C has a key role in the signal-transduction pathway inanimal cells. PLC catalyses the hydrolysis of phosphatidyli.nositol 4,5-bisphosphate,generating two potential intracellular second messengers: diacylglycerol and inositol1,4,5 trisphosphate ln mammalian cells, approximately eight distinct PLCisoenzymes have been purified, cloned and sequenced (Rhee ef a/., 1989).Activation of PLC and stimulation of PIP2 hydrolysis in animal cells occurs throughagonists that bind to either G-protein-coupled receptors or tyrosine kinase receptors(for review see Jones and Carpenter,1992; Lee and Rhee,1995).

Purification and biochemical characterization of PLCs have beencarried out mostly with materials of animal orjgin However, the function of the

43

enzyme /.n vÍvo remains unelucidated, ln Drosoph//a, analys.is of the norpA gene hasrevealed that .n encodes a putative PLC (Bloomquist e{ a/ , 1988). Mutations in thisgene render the fly blind (Pak ef a/., 1970), suggesting that PLC is an essentialcomponent of the phototransduction pathway in Orosoph/./a. In Saccharomycescerev/s/'ae, disruption of the PLcl gene results in slow growth or lethal.ity for ceHs,indicating that PLcl is impohant for ceH growh (Yoko -o eí a/. , 1993).

Several repons on plant PLC have emerged in the last few years (forreview see Gross and Boss, 1993) lt appears that all the enzymes hithertoinvestigated, faH in one of two main groups PLC type 1 is predominantly soluble, hasa clear preference for Pl over PIP and PIP2, and requires millimolar concentrationsof Ca2+ for fun activity (MCMurray and lrvine, 1988. Pfaffman ef a/., 1987,Yotsushima ef a/,1992); PLC type U is predominantly associated with plasmamembrane, shows a marked preference for PIP and PIP2 over Pl, and is fullyactivated by low micromolar Ca2+ concentrations (Melin eí a/.,1987, Sandelius andSommann,1990; Yotsushima ef a/.,1993, Melin et a/ ,1992)

Recently, an Arab/.dops/s fha//.ana cDNA has been cloned that exhibits

a high degree of sequence homology to animal PLC-Ó type (Yamamoto eí a/ ,1995). A soybean cDNA has also been cloned that shows strong homology toD/'cfysfel/um PLC and mammalian PLC-Ó isoform (Shi eí a` ,1995) Also, a gene•,. _L___L_i:__^^ r` `i`.hirh ic inrliirf]A bv

encoding a phosphatydilinositol-specific phospholipase C, which is induced bLJIuly>`C3IIUIIl i-L`i am^ ui`^„„„:„: ` . _.=,

rlehvdration and salt stress was identified in Arab/dops/s Íha//.ama (Hirayama eí a/_ __L ----- :-11\,

1995) The possible modes of activation of plant PLC(s) are relevant, especially ifdehydration and salt stress was iut3Hiiiic:u „ .,c]„,uut,u ,..,,... _.._ `` ,___,

exists any analogy to mammalian systems. Evidence in favor of involvement ofG-proteins in plant PLC activation has been reported (Einsparh and Thompson,1990), as has inositol phospholipid breakdown induced by light and auxm (Morse eía`.,1987: Ettlinger and Lehle,1988). lt has also been suggested that a major role forinositol phospholipids in higher plants may be to regulate cytoskeletal structure

(Gross and Boss,1993; Tan and Boss,1992, Drobak,1993, Straiger ef a/ ,1993)However, further investigations of both the b`iochemical and molecularcharacteristics of the plant PLC isoenzymes is required ln tms paper, data arepresented suggesting that PLC activiv can be regulated during the growth ofCaíharar)Íhus noseus transformed roots

MATERIALS AND METHODS

Cell culture. Hairy root line Jl of C roseus was obtained by infectionof leaves with Agrobacíer/um rn/zogenes (Ciau-Uitz et a/ ,1994) and maintained in85 medium (Gamborg eí aL 1968) (1.54 g/1., Sigma), supplemented wm 30 g/Lsucrose, pH was adiusted to 5 7 prior to autoclaving of the medium with 01 molflKOH/HCI One hundred milliliters of medium were placed in a 250 mL Erlenmeyerflask and autoclaved for 20 min at 15 psi. Flasks were inoculated with 0 5 g (freshmass) of hairy roots Roots were subcultured every 14 d. Cultures were grown indarkness at 25°C on a rotary shaker at 100 rpm Normal roots of C roseqsÍnon-transformed) were obtained as described (Ciau-Uitz eí a/ ,1994) and grown inthe same conditions except that the medium was supplemented with 10 nmol/L ofnaphtalene acetic acid Normal roots were subcultured every 28 d

44

Preparation of tissue and cell extracts. Roots were quickly frozenwith liquid nitrogen and homogenized with a politron in buffer A (1g of tissue in 2 5ml; 50 mmol/L Nacl,1 mmol/L EGTA, 50 mmol/L Tris.Hcl pH 74, 250 mmol/Lsucrose,10°/o glycerol,1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride,10 mmol/L sodiumpyrophosphate and 0.2 mmol/L orthovanadate). Extracts were passed through agauze, and tissue debrjs was removed by centrifugation at 12,000 gn for 30 min at 4°C The supernatant was further centrifuged at 100,000 gn for 45 min. The

supernatants (protejn: 3.5-5.0 mg/mL) were recovered as the soluble fraction. Thepellet was resuspended in the same buffer A (protein: 0.5-1 2 mg/mL), and wasused as a crude membrane fraction. Similar protein concentrations were founded inall the tjssues studied. All steps duríng the extraction were performed at 4°C. Thecell extracts were quickly frozen in liquid nitrogen and stored at -75°C. Proteinconcentrations of samples were measured by BCA protein assay reagent usingbovine serum albumin as standard.

PLC as§ay. The hydrolysis of [3H]PIP2 was measured as described byHernández-Sotomayor and Carpenter (1993) and Nishibe eí a/., (1990) in a reactionmixture (50 LtL) that contained 35 mmol/L NaH2P04 (pH 6.8), 70 mmol/L Kcl, 0.8mmol/L EGTA, 0.8 mmol/L Cac12 (final Ca2+ concentration 25 Ltmol/L), 200 Limol/LPIP2 (~20,000 cpm), 0.08 % deoxycholate The reaction was stopped with 100 LtL of1 % (w/v) bovine serum albumin and 250 HL of 10 % (w/v) TCA. Precípitates wereremoved by centrifugation (13,000 gn for 10 min) and the supernatants collected for

quantification of [3H]lp3 release by liquid scintíllation counting Aquasol. ln someexperiments, lp3 the product of hydrolysis of PIP2 by PLC, was separated andcharactenzed on a Dowex AG IXs formate form column (1 mL) according to themethods of Berridge eí a/., (1983).

Calcium dependence. A Cac12/EGTA mixture was used, and the freecalcjum concentration was calculated using EQCAL (Biosoft) and Chelator(Shoenmakers) programs.

Data presentation. All experiments were repeated at least three timesusing extracts prepared on separate occasions, and all gave similar results. Eachfigure contains data from a single, representative experiment assayed in duplicate,the errors varied by less than 10%.

Materials. PIP2 ammonium salt was obtained from BoehringerMannheim. [3H]PIP2 , [3H]PIP, [3H]Pl, and Aquasol were obtained from Du

pont-New England Nuclear BCA protein assay reagent was supplied by PierceChemical Co. 85 medium, PIP and Pl were obtajned from Sigma. Dowex AG 1-Xsformate form was obtained from Bio-Rad.

RESULTS

Change in PIP2-PLC activity during the growth cycle of differentroots lines. Cells in culture grow following a sigmoidal curve, and the metabolicrequirements throughout the growth cycle differ. There js substantial evidence thatenzymes are expressed differentially through this cycle The growth curve for line J1

45

transformed roots from Caíf}araníhus roseus is presented in Fig. 1. This curvesriows a lag period of about 4-5 d, the exponential phase starts during the sixth d,and then a linear phase continues over 14 d after this period, whereiipon the rootsenter a stationary phase

0 4 8 12 16 20 24 28

CULTURE DAYS

!|#,:c::;!:g:e;s:;s,a:n':pi:,P#L?Ct,,anoc.:,'#,,f,:.:;dno:r.Tíe,T!:a::?mt:??;:o:n,'sffiÑeR3)`oBri;'g'£i:;was expressed tn absolute values of lp3 formation. Growth curve (.)

PIP2-PLC activity was detected in the Jl line The specific actMty in thetotal extract (at day 6 of culture) was 20 nmol/min.mg, protein. When the totalextract was fractionated into soluble and membrane fractions by centrifugation, thespecific actMty in the membrane fraction was found to be 65 nmol/min.mg and inthe soluble fraction was 5 nmol/min.mg protein. The activity in both fractions wasthen measured along the growth culture cycle The time-course of PIP2-PLC activityalong the growth culture peaked in the soluble fraction from day 2-4 and from day6-8 for the membrane fraction This (day 8) is the period where the exponential

growth phase starts in line J1 (Fig 1) PLC activity was measured in normal roots

46

which require naphtalene acetic acid for growth and compared with the transformedroot Jl line that does not require external growth factor regulators. As shown in Fig.1, normal roots grow more slowly than transformed roots and follow a more lineargrowth curve. PIP2-PLC activity was also measured in the normal root line. Theabsolute values of actívity differ from those observed in the Jl line (Fig.1). ln thiscase, the soluble activity was higher at the beginning of the cycle before going tobasal levels during the remainder of the cycle. The paftern for the membranefraction was different. There was one main peak of activity between s and 10 d.

To determine whether the observation of PLC activity could beextended to other tissues and cell lines from C. roseus (ranging from normal plantsto suspension cells), the capacity to hydrolyze PIP2 was evaluated ln severalcultures and dlfferent tissues of C. roseus plantlets. Because it was previouslynoted that PLC activity changes according to culture age, we attempted tomeasure in the different cultures when they initiated the exponential growing phase.

As shown in Fig. 2, PLC activity was detectable in all cultures, with ahigher specific activity present in the membrane fraction lt is interesting to observethat the specific activity of the membrane fraction from transformed tissues(tumors) and undiferentiated tíssues (callus) was higher than that from roots,stems, or leaves, whereas, the specific activity of the soluble fraction fromtransformed tissue was higher or similar to specific activity of leaves, stems androots or suspension culture cells.

:¿Fúbíép(dpá-sahcetáv¡b¢a!g)d#e:een;b:ápesir:St:;Sns|:#)Pá-apí:S,anct{¥;tsyu¥saswmiasrffr:ÍdeLn,degree of differentiation. Suspension cells (from tumors obtained from A. Íumeíac/.enstransformed stems); tumor (from stems transformed with A. ÍL/meíac/ens); light callus(from roots); clark callus (from roots); leaf, stem and root from C mseus plant from 4weeks of culture

47

Since the Jl line presented the most prominent peak in PLC activity,we decided to use this line for further characterization of this enzyme

ldentification of hydrolysis products and substrate specificity.The products of inositol phospholipid hydrolysis by the membrane-bound-PLCactivity were analyzed by anion-exchange chromatography. When [3H]PIP2 was thesubstrate, the main product eluted was lp3. The majority of phospholipase activitydegrading the exogenous radiolabeled PIP2 is of a PLC nature since over 95 % of[3H]inositol phosphates released were recovered as [3H]lp3 (data not shown).

The PLC activity of the membrane-bound and soluble fractions withvarious inositol phospholipid substrates js shown in Table 1. ln the membranefraction, PIP2 and PIP were hydrolyzed ~ 20 times the rate of Pl hydrolysis, whereasin the soluble fraction PIP and Pl were hydrolyzed at 10 and 4 times the rate of PIP2hydrolysis, respectively.

Table 1. Substrate specificity of the Jl transformed roots. Soluble and membrane

g,#:r::{':':Estaraieasyed dur¡ng the 6th Culture day in the presence of 2oo Limoi/L of the

SOLUBLE | MEMBRANE

(nmoi min-i mg-1 )

PIP2 0_26 54

PIP 36 54

Pl 1 3

Calcium dependence of phospholipase C. To determine the effectsof varying Ca2+ concentratlons on PLC activity, a series of Ca2+-EGTA buffers at pH6 8 were prepared, using two different computer programs, to yield the free Ca2+concentrations shown in Fig. 3. The hydrolysis of PIP2 of both enzymes, soluble andmembrane, was activated by Ca2+. lnterestingly, the EC5o for the soluble fraction is

greater than for the membrane-bound enzyme. These data differ from previouslypublished data, in which it was reported that the soluble form requires a higher Ca2+concentration for activation than the membrane form (Melin ef a/.,1987; Sandeliusand Sommarin,1990; Yotsushima eí a/„ 1993; Melin eí a/.,1992). Our data showthat there was an inhibitory effect at higher Ca2+ concentrations. Tms occurrencehas also been observed m other plant PLCs (MCMurray and lrvine,1988; Melin eía/.,1987; Hirayama ef a/.,1995).

48

0123456

LOG [ Ca2+ ], nM

:¡ag;3.etEí=:nte3fwc,#cbuaT+ccOo:%::{::ti¡oonnsov:n:'dp2u!,yndgrod¥S+¡_sÉGTThÁB#reor'¥,s',§niiep'jpí2line. For cytosol (.), samples were from clay 4 and for membrane (.), samples werefrom day 6.

Effect of detergents on soluble and membrane associatedphospholipase C activity. To determine the optimal detergent for PLC activity,the effect of various detergents on both soluble and membrane-assocíated PLCactivity was tested using PIP2 as a substrate. When increasing concentrations ofdetergents were added to the assay, three distinct responses were observed (Fíg.4). The non-ionic detergent, Triton X-100, had a dramatlc inhibitory effect on bothPLC actMties. The ionic detergent deoxycholate had djfferent effects. ln the solublefraction, it had a stimulatory effect at low concentrations but inmbited the enzyme athigher concentrations (0.15-0.2 %). ln the membrane fraction, deoxycholate had aninhibitory effect but was less pronounced than in the soluble fraction. Non-ionjcoctylglucoside had very little effect on the membrane associated activity, but didstimulate the soluble actMty.

49

A

8

0 00 05 10 15 20 25

| DETERGENT ] %

E¡egt.er4g.e:tg:C¿,:hf{he:erfi:nea|üco°nncesn?:=tE|:sanadsTnedTct¡83::::e°C:adt3gdptLocsat::¡#d

:n:::i;et;i!!sEr:ftiís:s:reárn::f;:s:r?ghe:nnt:ca::,:ie;ds#orv::,'y:'en,g::tgTeenpTP;af|:ehs:w3::rg;ta?t;Áací3)t3eoí

:ro°±/ymJ.nDTgqu¿:pyTaen%9,rdaen:E ,a#/dv),Cs€8:u°+ dreeos;ecchttí:(€ (oT,rl¿O/C) X-100 ( Á, v/v),

DISCUSSION

The wealth of information accumulated on the molecular mechanismsby which animal cells perceive and transduce external signals starkly contrasts withour relative ignorance of the initial events in plant-specific signaling cascades.Research in a number of different eukaryotic systems has led to a general beliefthat the selectivity of cellular signals required to provide cell-specific responses donot necessarily caH for fundamentally new mechanistic elements to transduce theinitial signal to their final cellular response in each case Extensive evidence,including Ca2+ mobilization studies, suggests a central importance in plants of asignal transduction pathway involving both calcium-and phosphatidylinositol-derivedsecond messengers, which may connect light and other environmental signals tothe regulation of genes. The presence and relevance of second messengers, suchas lp3, and their rapid production in response to phytohormonal or light stimuli, pointto a fundamental role of these compounds in plant signaling (Coté and Crain,1993)

50

Since it has been shown that PLC plays a key role in signalingmechanisms in mammalian cells, the possibility remains that this is the case in

plant cells However, there are only a few repohs concerning the purification andcharacterization of plant inositol phospholipid specific PLCs, but the cloning of aputative Pl-PLC in higher plants has been reported (Yamamoto eí a/., 1995). Todate plant PLC has not been purified to homogenei.ty, and although calcium isrequired for activity, there are no reports about the possible mechanisms foractivation of this enzyme.

ln this study, we detected 1) significant changes (3-10 fold) Ín the PLCactivíty during culture growth (PLC was more prominent during the initiation of theexponential growing phase of the cultures, and was observed in two different rootlines); 2) detection of two different activities in cytosol and membrane fractions (bothactivities have been reported in different plant cells and tíssues, but during the first10 d of culture in the two root lines studied, there was a peak in the soluble activitythat preceded the activity in membranes).

lt has been reported in C roseus suspension cells that the amountsand ratio of the different inositol phosphates depended on the stage of the growthcycle, with the highest levels corresponding to the cell-division phase A role of thephosphatidylinositol cycle in the proliferation control of plant cells was thenproposed The activities of the phospholipid kinases of the Pl cycle also correlatewith the cell division phase of the growth cycle (Heim and Wagner,1989, Grabowskieí a/ ,1991 ). However, to date, it has not been reported how a key enzyme such asPLC changes during a growth cycle, particularly in a differentiated tissue.

ln mammalian cells, it has been shown that the subcellular localizationof the PLC isoenzymes is important. PLC-Pl is primarily membrane associated,whereas PLC-yl and ól are primarily soluble. Translocation of the PLC-yl fromcytosol to membrane compartments has been observed in response to growthfactors (Todderud eí a/ ,1990, Kim eí a/„ 1989). However, the mechanísm by whichthis translocation takes place is unknown. ln our model, we can not rule out thepossibility that translocation from the cytosol to the membrane may occur; therecould also be several isoforms at the beginning of the culture The mechanism bywhich the PLC activity is membrane-associated is unclear from the available results.lt could be that when soluble PLC translocates to the membrane it binds to PIP2

perhaps in a manner similar to that suggested for mammalian PLCÓ (Cifuentes eía/„ 1993). The PH domain (pleckstrin homology), which is found in a broad array ofsignaling proteins including all animal PLC isozymes, has been suggested to be asequence that associates proteins with membranes in order to function (Musacchioeí a/., 1993). Evidence for the interaction of PLCó-PH domains with PIP2 wasprovided ln this enzyme, the amino-terminal region containing the PH domain wasnecessary for binding to phospholipid vesicles containing PIP2 (Cifuentes ef a/ ,1993). These results suggest that PIP2 might be important for localizing protetnscontaining PH domains at the membrane surface. The soluble localization of PLC,as well as for other PLC isozymes in animal cells, presents a logistic problem sincePIP2 is located in the membrane. ln C. roseus the specific activiv for PIP2 hydrolysisis about 10-fold higher in membranes than in the cytosol for most of the tissues

51

studied (Fig. 2, Table 1) ln plants, it has been reported that membrane-bound PLCpreferentially hydrolyzes PIP2 and PIP over Pl (Melin ef a/„ 1987: Sandelius andSommarin,1990; Yotsusmma ef a/.,1993, Melin eí a/ ,1992; Huang eí a/.,1995).

With the discovery that so many of the components of the mammalianphosphoinositide signaling system also are present and functioning in plant cells,the obvious question is: what is the role of this system in plant cell signaling? Thecentral feature of this system is the production of the two messenger molecules lp3and DAG Little attention has been paid to the role of DAG, principally due to thedifficulty in detecting protein kinase C activity in plants, but i( has been shownextensively that lp3 is able to release Ca2+ from intracellular stores in plant cells

(Trewavas and Gilroy,1991). Little is known about the metabolism of lp3 /.n v/.vo, butseveral studies using soluble plant extracts and membrane preparations as enzymesources suggest that, Í.n v/.Íro, the metabolism of lp3 (1, 4, 5) by plant enzymesdiffers significantly from that of other eukaryotes (Memom eí a/., 1989, Dr¢bak eía/.,1991; lrvine eí a/„ 1992; Joseph eí a/,1989). Although we expect the IP3release to be a very fast response, some of the kinases and phosphatases involvedin its metabolism may be regulated in a different way in plants (for reviews seeDr®bak,1992; Cho ef a/ ,1993: Yang and Boss,1994; Yang eí a/.,1993).

ln the search for primary events initiated by phytohormones, both shortand long-term effects on plant grow^h have been studied A major difficulty ras beento distinguish those primary hormonal responses of probable importance in growfthregulation from those that are merely consequences of the primary alterations ofcellular physiology. Growth responses such as cell elongation, however, require thecompletion of a series of metabolic steps to facilitate promotion and spatial controlof cell wall synthesis, as well as cell division. This suggests long-term responses,with time intervals that may vary beween 1 h and several days. Calcium signalsemanating from the plasma membrane are known to be generated by a number ofmechanisms that use calcium channels that are receptor operated, voltagedependent, or regulated by second messengers. The calcium fluxes induced can beeither transient or sustained. The proposed role of calcium as a commondenominator may also explain why previously stimulated cells can retain anenhanced responsiveness that outlasts the initiating stimulus Persistentresponsiveness may be caused by osciiiatory fluxes or repetitive spikes in éaiciumconcentration, creating what has been termed a cellular memory. It is a possibilitythat lp3 has a more relevant role than DAG as a second messenger in plant cells,and also that lp3 levels can be maintained by the continuos activation c)f PLC.

Our work has identified phospholipase C activity capable of hydrolyzing

polyphosphoinositides in different tissues from different degrees of differentiationand organization, at rates comparable to those of other animal and plant tissuesThe enzyme has dependence on micromolar concentration of Ca2+ for its activity asdescribed for other PLCs lt efflciently catalyses PIP2 and PIP while Pl is a poorsubstrale, thereby displaying a different phosphoinositide substrate profilecompared with PLCs from other tissues.Our results agree with those obtained byHuang eí a/,1995. who found two cytosolic and two membrane-associatedenzymes The partially purified enzymes were activated by micromolar calcium and

52

were specific for phosphorylated phosphoinositides. Thus, plants, in contrast toanimals, may have PLCs highly specific for phosphorylated phosphoinositides

With the data presented here, we are presently unable to answer themain question about the mechanism by which external or intemal signals regulatePLC. Guanine nucleotides failed to stimulate th.s enzyme (data not shown). Thepossibility that G-proteins may be involved in the PLC regulation in our modelremains open ln mammalian cells /.n v/.vo or /.n v/'fno, tyrosine phosphorylationincreases the catalytic activity of PLC-yl , suggesting that PLC-yl catalytic activity isregulated by tyrosine phosphorylation (Nishibe eí a/„ 1990) /n v/'Íro experimentsalso showed that the association of EGF receptor can increase PLC-yl activityindependently of tyrosine phosphorylation (Hernández-Sotomayor and Carpenter,1993). We found that the absence of phosphatase inhibitors in the buffer extractreduced more than 50 % the activiv of the membrane-associated activity but did notmodify the soluble activity (data not shown). The fact that mammalian PLC can bemodulated by so many mechanisms opens the possibility that perhaps plant's PLCmay be regulated by a new mechanism not described before. Purification of PLC inour model, to homogeneity, will be essential for a full understanding of thephysiological rates and the regulation of the enzymes

ACKNOWLEDGMENTS.

The authors thank Dr. José Luis Boyer for critical advice, Dr. GrahamCarpenter for generous assjstance with reagents and advice, Dr. Roger Ashburnerfor the revision of the English version of the manuscript, and Sue Carpenter for theadministí.ative work to the FIRCA grant. Suppohed by Fogarty lnternationalResearch Collaboration Award (R03TW00263), Consejo Nacional de Ciencia yTecnología (3016-N9306), lnternational Foundation for Science (C/2236-1) and aConsejo Nacional de Ciencia y Tecnologi'a Fellowship to De Los S -8. C (88202).

REFERENCES

Berridge M.J., Dawson R.lvl.C., Downes C.P., Heslop J.P. and lrvine R.F.(1983). Changes in the levels of inositol phosphates after agonist-dependenthydrolisjs of membrane phosphoinositides. Biochem. J., 212:473482

Bloomquist B.T., Shoilridge R.D., Schneuwly S., Perdew M„ Montell C., Stel[erH., Rubin G. and Pak W,L. (1988). lsolation of a putative phospholipase C geneof Drosoph/'/a, nopA and its role in photottransduction. Cell, 54:723-733.

Ciau-Uitz R., Mii.anda-Ham lvl.L., Coello-Coello J., Chí 8., Pacheco L.M. andLoyola-Vargas V.M. (1994). lndole Alkaloid Production by Transformed andNon-transformed Root Cultures of Caíharaníhus roseus. ln Vitro Cell. Dev. Biol ,30:84-88.

cif:::::shoT;,a:eo-:;::,:::::,anJ?BF:'b?chcehtT::.8(í|9:á#|r:;e3oln,Cfragmentsof

53

Coté G. G. and Crain R.C. (1993) Biochemistry of phosphoinositides. Annu. RevPlant Physiol Plant Mol. Biol , 44:333-356.

Cho M.Hv Shears S.B. and Boss W.F. (1993) Changes in PhosphatidylinositolMetabolism in Response to Hyperosmotic Stress in Daucus caroía L CellsGrown in Suspension Culture. Plant Physiol.,103:637-647.

Dr¢bak B.K., Watkins P.A.C., Chataway J.A., Roberts K. and Dawson A.P.Metabolism of inositol (1,4,5) trisphosphate by a soluble enzyme fraction from

pea (P/sum saí/.wm) roots. (1991). Plant Physiol„ 95.412-419.

Dr¢bak B.K. (1992) The plant phosphoinositide system. Biochem. J , 288:697-712

Dr¢bak B.K.. (1993). Plant phosphoinositides and intracellular signaling. PlantPhysiol.,102:705-709.

Ein§pahr K.J. and Thompson G.A. Jr. (1990). Transmembrane Signaling viaPhosphatudylinositol 4,5-Bisphosphate Hydrolysis in Plants Plant Physiol.,93 361-366

Ettlinger C. and Lehle L. (1988). Auxin induces rapid changes inphosphatidylinositol metabolites Nature, 331.176-178

Gamborg O.L., Miller R.A. and Ojima K. (1968) Nutrient requirements ofsuspension cultures of soybean root cells. Exp Cell Res., 50:151-158

Grabowski L., Heim S. and Wagner K.G. (1991). Rapid changes in the enzymeactivities and metabolites of the phosphatidylinositol cycle upon induction bygrowth substances of auxin-starved suspension cultured Cafharaníhus roseuscells. Plant Science, 75:33-38.

Gross W. and Boss W.F. (1993). lnositol Phospholipids and Signal Transduction./n D.P.S Verma, ed„ Control of Plant Gene Expression, CRC Press, BocaRaton, Fl, pp.17-32.

Heim S. and Wagner K.G. (1989) lnositol phosphates in the growth cycle ofsuspension cultured plant cells Plant Science, 63:159-165.

Hernández-Sotomayor S.M.T. and Carpenter G. (1993). Non-catalytic activationof phospholipase C-yl /.n v/.Íro by epidermal growth factor receptor Biochem J ,293:507-511.

Hirayama T., Ohto Ch,, Mizoguchi T. and Shinozaki K. (1995). A gene encodinga phosphatidylinositol-specific phospholipase C is induced by dehydration andsalt stress in Arabí.dopsí.s Íha//ana. Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92:3903-3907

54

Huang C.-H., Tate B.F., Crain R.C., and Coté G.G. (1995) Multiple

phosphoinositide-specific phospholipases C in oat roots. characterization and

pariial purifica{jón Plán{ J., B:257-2é7.

lrvine R.F., Letcher A.J., Stephens L.R. and Musgrave, A. (1992) Inositolpolyphosphate metabolism and inositol lipids in a green alga, Ch/amydomonasetígameíos. Biochem. J., 281:261-266.

Jones G. and Carpenter G. (1992) Regulation of Phospholipase C lsozymesProg. Growth Factor Res., 4:97-106.

Joseph S.K., Esch T. and Bonner W.D. (1989). Biochem J„ 264.851-856

Kim U.-H., Kim H.€. and Rhee S.G. (1989) Epidermal growth factor and

platelet-derived growth factor promote translocation of phospholipase C-y fromcytosol to membrane. FEBS Lett., 270:33-36.

Lee S.B. and Rhee S.G. (1995). Significance of PIP2 hydrolysis and regulation of

phospholipase C isoenzymes. Curr. Opin. Cell Biol., 7:183-189

Mc Murray W,C. and lrvine R.F. (1988). Phosphati.dylinositol 4,5-bisphosphate

phosphodiesterase in higher plants. Biochem. J , 249.877-881.

Melin P.M., Sommarin M., Sandelius A.S. and Jergil 8. (1987). ldentification ofCa2+-stimulated poliphosphoinositide phospholipase C in isolated plant plasmamembranes. FEBS Lett., 223:87-90.

Melin P.-M., Pical C., Jergil 8. and Sommarin M. (1992) Polyphosphoinositide

phospholipase C in wheat root plasma membranes Partial purification andcharacterization. Biochim. Biophys Acta,1123:163-169.

Memon A.R., Rincon M. and Boss W.F. (1989). lnositol trisphosphate metabolismin carrot (Daucus carofa L.) cells. Plant Physiol , 91.477480.

Morse M.J., Crain R.C. and Satter R.L. (1987). Phosphatidylinositol cyclemetabolites in Samanea saman pulvini. Plant Physiol., 83:640-644.

Musacchio A., Gibson T., Rice P., Thompson J. and Sarastre IVI. (1993) The PHdomain. a common piece in the structural patchwork of signaling proteins.Trends Biochem. Sci.,18:343-348.

Nishibe S., Wahl Ivl.l., Hernández-Sotomayor S.M.T., Tonks N.K., Rhee S.G.and Carpenter G. (1990). lncrease of the catalytic activity of phospholipase C-ylby tyrosine phosphorylation. Science, 250:1253-1256.

Pak W.L., Grossfield J. and Arnold K. (1970) Mutants of the visual pathway ofDrosophila melanogaster. Nature, 227. 518-520.

55

Pfaffmann H., Hartmann E., Brightman A.O., and Morré D.J. (1987).Phosphatidylinositol specific phospholipase C of plant stems. Plant Physiol.,85: 1151 -1155.

Rhee S.G., Suh P.G., Ryu S.H. and Lee S.Y. (1989) Studies of lnositolPhospholipid-Specific Phospholipase C. Science, 244.546-550.

Sandelius A.S. and Sommarin M. (1990). Membranes and Polyphosphoinositides./n Morré D J , Boss W.F., and Loewus F A. eds , Inositol Metabolism in Plants,Wiley-Liss, NewYork, pp 139-161

Shi J., Gonzalez R. and Bhattanchai.yya M. K. (1995). Characterization of aplasma membrane-associated phosphoinosit.ide-specific phospholipase C fromsoybean Plant J., 8 (3).381-390.

Straiger C.J., Goodbody K.C., Hussey P.J., Valenta R., Dmbak B.K. and LLoydC.W. (1993). The profilin multigene family of maize differential expression ofthree isoforms. Plant J , 4:631-641.

Tan Z. and Boss W.F. (1992). Association of Phosphatidylinositol Kinase,Phosphatidylinositol Monophosphate Kinase, and Diacylglycerol Kinase with theCytoskeleton and F-Actin Fractions of Carrot (Daucus carofa L ) Cells Grown inSuspension Culture. Plant Physiol.,100:2116-2120.

Todderud G., Wahl M.l., Rhee S.G. and Carpenter G. (1990). Stimulation ofphospholipase C-./1 membrane association by epidermal growth factor.Sciencie, 249:296-298.

Trewavas A.J. and Gilroy S. (1991). Signal Transduction in plant cells TrendsGenet., 7:356-361.

Yang W., Burkharl W., Cavallius J., Merrick W.C. and Bo§s W.F. (1993).Purification and characterization of a Phosphatidylinositol 4-Kinase Activator inCarrot Cells. J. Biol. Chem., 268:392-398

Yang W. and Boss W.F. (1994). Regulation of Phosphatidylinositol 4-Kinase by theProtein Activator PIK-A49. J. Biol. Chem , 269.3852-3857.

Yammamot(o Y.T., Conkling M.A., Sussex l.M. and lrish V.F, (1995) AnArab/dops/s cDNA Related to Animal Phosphoinositide-Specific Phospholipase CGenes Plant Physiol ,107.1029-1030

Yoko® T., Matsui Y., Yagisawa H., Nojima H., Uno 1., and Tohc A. (1993). Theputative phosphoinositide-specific phospholipase C gene, PLC1, of the yeastSaccnaromyces cerevi.s/ao is important for cell growth Proc. Natl, Acad. Sci.USA, 90.1804-1808.

56

Yotsushima K., Nakamura K,, Mitsui T. and lgane 1. (1992)` Purification andCharacterization of Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C i.nSuspension-cultured Cells of Rice (Oryza safi.va L.). Biosci. Biotech. Biochem.,56 : 1247-1251.

Yotsushima K., Mitsui T., Takoaka T., Hayakawa T. and lgane 1. (1993).Purification and Characterization of Membrane-Bound lnositolPhospholipid-Specific Phospholipase C from Suspension-Cultured Rice (Oq/zasaí/.va L.) Cells. Plant Physiol„ 102:165-172.

57

CAPITULO 111

Purificación parcial de la Fosfolipasa C en raíces transformadasde Catharanthus roseusCésar De Los Santos-Briones, Victor M. Loyola-Vargas y S.M.TeresaHernández-Sotomayor.

lNTRODUCCION

En células animales se han identificado varias isoenzimas de la familiade la fosfolipasa C; éstas difíeren entre sÍ con respecto a los mecanismos deactivación y regulación [Ree y Bae,1997]. Aunque sus substratos son lípidos demembrana, las PLCs se localizan tanto en la fracción membranal como en lafracción citosólica. Muchas de ellas fueron purifícadas en un principio de la fracciónsoluble y posteriormente de la fracción particulada [Rhee eí a/.,1989].

La actMdad de fosfolipasa C también se ha detectado en otrosorganismos como en bacterias [lkezawa y Taguchi,1981], levaduras r/oko-o eí a/.,1993], moho de fango [Bominaar eí a/.,1994], algas verdes unicelulares [Einspahreí a/„ 1989], etc.

En plantas se ha detectado actividad de PLC en raíces, brotes, tallos,inflorescencias y polen de varias angiospermas [lrvine eí a/., 1980; Helsper eí a/ ,1985; MCMurray and lrvine,1988; Tate eí a/„ 1989; Melin eí a/.,1992; Yotsushimaef a/.,1992,1993]. En base a sus características bioquímicas, las PLCs de plantasse han clasificado en dos grupos [Dr¢bak, 1992]. Las PLCs solubles (tipo 1)hidrolizan prefierencialmente Pl y requieren concentraciones milimolares de Ca2+;las PLCs asociadas a membrana (tipo 11) hidrolizan preferencialmente al P14-P y alPIP2 y se activan por concentraciones micromolares de Ca2+[Yotsushima ef a/.,1993].

La mayoría de estos estudíos sostienen la hipótesis de que elmetabolismo de los fosfolípidos de inositol en plantas está involucrado en algúnmecanismo de transducción de señales. Sin embargo, se requieren de estudiosprecisos y detallados para probar esta hipótesis. En lo que se refiere a lapurificación y caracterización de PLCs en plantas, existen algunos repones: noobstante, ninguna se ha purificado a homogeneidad y, debido a esto es escaso elconocimiento no sólo de los mecanismos en los que se involucra a la PLC sinotambién de la posible función que ésta pudiera tener.

MATERIALES Y METODOS

Cultivo de tejidos vegetales. Como material biológico se utilizaroncultivos de raíces de Caíharaníhus roseus obtenidas por transformación mediante

58

el uso de la bacteria Agrobacíen.um rh/.zogenes. De las diferentes líneas obtenidasen el laboratorio se empleó la J1, la cual fue obtenida transformando raíces deplántula y se caracteriza por su rápido crecimiento (tiempo de duplicación igual a 30h) [Ciau-Uitz eí a/„ 1994]. La líneas Jl se cultivó en medio de cultivo 85 (a la mitadde su fuerza iónica) suplementado con 30 g/L de sacarosa Las raíces de la líneaJl fueron subcultivadas cada 14 días en matraces Erlenmeyer de 250 mL utilizando0.5 g de tejido como inóculo inicial.

Extracto Proteico. Las raíces frescas se congelaron en nitrógenolíquido, se trituraron hasta obtener un polvo fino y se homogenizaron con un politrónen el amortiguador A (Nacl 50 mM, EGTA 1 mM, Tris-Hcl 50 mM pH 7.4, sacarosa250 mM, glicerol 10% (v/v), PMSF 1 mM, P-mercaptoetanol 1 mM, pirofosfato desodio 10 mM y ortovanadato de sodio 0. 2 mM) 1 g de tejido en 2.5 mL deamortiguador. El extracto se filtró a través de una gasa y los restos de tejido fueronremovidos por centrifugación a 12,000 X g durante 30 minutos a 4°C. EIsobrenadante obtenido se centrifugó a 100,000 X g durante 45 minutos a 4°C. EIsobrenadante fue recuperado como la fracción citosólica y el sedimentoresuspendido en el mismo amortiguador A se usÓ como la fracción membranalcruda. Las concentraciones de proteína fueron medidas por el método del ácidobicinconínico (BCA) utilizando albúmina de suero de bovino (BSA) como estándar[Smith ef a/.,1985].

Medición de [a actividad de PLC. En nuestro modelo se midjeron losniveles de actividad de la PLC /`n v/.Íro, utilizando [3H]-PIP2 como sustrato, en 2distintos extractos celulares fracciones citosólicas y fracciones membranalescrudas. La hidrólisis del [3H]-PIP2 se midió en una mezcla de reacclón (50 LiL) quecontenía NaH2P04 35 mM (pH 6.8), Kcl 70 mM, EGTA 0 s mM, Cac12 0.8 mM

(concentración final de Ca2+ 25 HM), PIP2 200 uM (~ 20,000 cpm), deoxicolato0.08% (p/v). El tiempo de la reacción fue de 10 minutos y se detuvo con 100 LiL deBSA 1% (p/v) + 250 LiL de TCA 10% (p/v). El precipitado fue removido porcentrifugación (12,000 X g durante 10 minutos) y el sobrenadante se colectó para lacuantificación del [3H]-lp3 formado en líquido de centeHeo Aquasol.

Solubilización de la PLC membranal. Se tomaron las raíces frescasdel 6° día de cultivo La extracción proteica para obtener la fracción membranalcruda se realizó de acuerdo al protocolo ya descrito, con la ligera modificación deque el sedimento obtenido de la centrifugación a 100,000 X g, se resuspendió en elamortiguador A con Kcl 2 M. El sedimento resuspendido se sonicó durante 90segundos y se ultracentrifugó nuevamente a 100,000 X g durante 45 minutos a 4°C.El sobrenadante se recuperó como la fracción membranal solubilizada.

Purificación de la PLC asociada a la membrana. Todos losprocedimientos de purificación se realizaron a 4°C haciendo uso de iin equipo deFPLC® (Fast Protein Liquid Chromatography). Para la extracción de la proteína seutilizaron 100 g en peso fresco de raíces. Se obtuvo la PLC membranal solubilizada(2.3 mg de proteína/mL).

59

PROTOCOLO No. 1

prec,p,tóc.n:::::£::a:::3=:::::##;S::atEu'raed:ra:t:NT:,Tsbg:nhaás::':3':'zaa,::n::un 40% de saturación. El precipitado se separó mediante centrifugación a 28,000 Xg durante 20 minutos Al sobrenadante se le adicionó el volumen necesario de unasolución saturada de (NH4)2S04 para que éste alcance un 60% de saturación. EIprecipitado se separó mediante centrifugación a 28,000 x g durante 20 minutos. Lapastilla se disoMó con amortiguador A y se le adicionó el volumen necesario de unasolución saturada para obtener una concentración final de (NH4)2S041 7 M.

obtemda en::g=ggg£=Í:aé#ní=:a:;;£:5±:£=#3,Íío, :: npareTta rác,xón38nz#t,::Phenyl-Sepharose® CL4B (Pharmacia) previamente equilibrada con 100 mL deamortiguador 8 (Tris 20 mM pH 7.4, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0.6 mM, 2

Hg/mL de leupeptina) Con (NH4)2S041 7 M. La elución se hizo con un volumen de100 mL de amortiguador 8 con un gradiente linear decreciente de 1.7 a 0 M de(NH4)2S04. Se colectaron fracciones de 0.5 mL, se midió la actividad de PLC y laabsorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas.

PROTOCOLO No. 2

desaióutdiza::==::=:=:í=::::i:::!S:i:=i=)::eger;:ta°dem#.r25na('psh°:::':c:a;previamente equilibrada con 5 volúmenes de amortiguador 8 a un flujo de 2mL/min. La elución se llevó a cabo con 100 mL de amortiguador 8 Las fraccionescolectadas fueron de 5 mL La absorbancia se midió a 280 nm.

con,en,an,aggg:g::;1¡É::3!:¡3:::::i:::::col:sm:raacp::oen:3adc:áaa'a,ia6SxqTScm) HiLoad" Q Sepharose® HP (Pharmacia) previamente equilibrada con 100 mLde amohiguador 8. La elución se hizo con un volumen de 200 mL con un gradientelinear de 0 a 1 M de Nacl. Se colectaron fracciones de 3 mL Se midió la actMdadde PLC y la absorbancia a 280 nm en las fracciones colectadas.

depLCseag:%==:=£:=:::±:#:::¡::£=Í=±=áaEt2V%,uxm6eoncc#at:Ldooadfgns:::r:dea£200 prep grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de amortiguador8 conteniendo Nacl 100 mM a un flujo de 2 mL/min. La elución se hizo con 320 mLde amortiguador 8 con Nacl 100 mM. Las fracciones colectadas fueron de 3 mL

ap,,ffi,..aug:g:gg::tiiTg:=g::ggFdeLaHse;raar::i?neepshacr::e3cér'-d6aBd(g:a:::c:a3equilibrada con 100 mL de amortiguador 8 con Nacl 100 mM. Se eluyó con 200 mLde amortiguador 8 con un gradiente linear de NacI 100 a 900 mM. Las fraccionescolectadas fueron de 2 mL.

60

PROTOCOLO No. 3

sedesa,óut,g:hmd:tougnr:f:?,:i::tra:'Ósne:3#x®Eá%risthoarmeamcpar,a:a,:::l,:R,|,:a,g:condiciones del protocolo No.2 anteriormente descrito.

Cromatografía de afinidad. Las fracciones con actividad de PLC seaplicaron a una columna (1.6 x 17 cm) de Heparin-Sepharose® CLJ3B (Pharmacia)equilibrada con 150 mL de amortiguadcm C (fosfato de potasio 20 mM pH 7.3,EDTA 1 mM, DTT lmM, PMSF 0.6 mM, 2 ug/mL de leupeptina). Se eluyó con 250mL de amortiguador C con un gradiente linear de Kcl 0 a 1.5 M. Las fraccionescolectadas fueron de 5 mL.

act¡v,daddegm-ast:9ar:iiícaód::::ac::,nu:nnage±reEe'mv::UcT::i2°':C}a88%Ume)CH°,nLtoean!3Superdex® 200 prep grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL deamortiguador 8 con Nacl 100 mM a un flujo de 2 mL/min. La elución se hizo con320 mL de amortiguador C con Nacl 100 mM. Las fracciones colectadas fueron de3mL.

Purificación de la PLC citosólica. Todos los procedimientos depurificación se llevaron a cabo a 4°C haciendo uso del equipo de FPLC® (FastProtein Liquid Chromatography). Para la extracción proteica se utilizaron 20 g enpeso fresco de raíces El sobrenadante obtenido después de la centrifugación a100,000 X g (~ 12 mg de proteína/mL) se consideró como la fracción que contienela PLC citosólica.

PROTOCOLO No. 1

Precidt¥on con íNHbsoi, El o)mcto cjtosóllco s. ptüpb deacuerdo al protocolo No. 1 descrito para la fracción membranal.

Cromatografía de interacción hidrofóbica La preparación enzimáticaobtenida en el paso anterior se aplicó a una columna de interacción hidrofóbica encondiciones similares a las descritas en el protocolo No. 1 para la fracciónmembranal.

PROTOCOLO No. 2

PredpjtEmon cofi íNH}>SO,. El e)rb.ac±o cttosólkD se pTedptó d. Eamisma forma como se describe en el protocolo No.1 para la fracción membranal.La pastilla obtenida en la última centrifugación se resuspendió con amortiguador A.

Cromatoqrafía de filtración en gel. La preparación enzimática obtenidaen el paso anterior se desaló utilizando una columna (2.6 x 18 cm) de Sephadex®G-25 (Pharmacia) siguiendo las indicacic)nes del protocolo No. 2 descrito para lafracción membranal.

61

con,en,an,ag:::gtg:g,gÉ;::!:;3:::::i::::=col:sm:raacpcr:oen:;adc:sdaa`a,:a6Sxqi:cm) HiLoad" Q Sepharose® HP (Pharmacia) de igual forma a la descrita en elprotocolo No. 2 para la fracción membranal.

ac,,v,dadde;ggg:?Í::i::::::;S:=:=%reE:#ucT3::2`:c;ag3:ume,cf,nLtá:t?Superdex® 200 prep grade (Pharmacia) utilizando las condiciones descritas en elprotocolo No. 2 para la fracción membranal.

depLCseasg:;:g::::is=g::S:a6Laxs,f;a::?ndeesHqeu:a:,:Táeenpí::r:asea.ct:v[d€ag(Pharmacia) de manera similar a la descrita en el protocolo No. 2 para la fracciónmembranal.

Calibración de la columna HiLoad® 26/60 Superdex® 200 prep

grade (Pharmacia). La columna se equilibró con 600 mL de amortiguador 8 quecontenla NacI 100 mM Se prepararon dos mezclas de marcadores de masamolecular (primera. azul de dextrán-2000 kDa, apoferritina443 kDa, P-amilasa-200kDa, BSA-66 kDa., segunda. tiroglobulina-669 kDa, alcoholdeshidrogenasa-150kDa, anhidrasa carbónica-29 kDa, aprotininaú 5 kDa) en elamortiguador de equilibrado Se aplicaron 3 mL de mezcla proteica Se hicieron doscorridas, una para cada mezcla proteica. Se colectaron fracciones de 3 mL.

Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato desodio (SDS-PAGE) Se conservaron alícuotas correspondientes ya sea a lasfracciones eluídas de cada columna o a cada paso de purificación. Las proteínas decada alícuota se separaron en geles de poliacrilamida al 10% con SDS porelectroforesis, de acuerdo al método de Laemml.i (1970), a 50 mA o 30 V. Los gelesse tiñeron con una solución de nitrato de plata [Bloom eí a/„ 1987| o azul decomassie.

RESULTADOS

Solubilización de la PLC membranal.

Se probaron concentraciones crecientes de Kcl para encontrar laconcentración en que la enz.ima se disocia de la membrana. Como control se utilizóuna fracción membíanal resuspendida en amortiguador sin Kcl y s.in ser sometida ala segunda centrifuga.ión. En la figura 1 se observa que la actividad de la PLCaumenta en forma proporcional a la concentración de Kcl alcanzando unaconcentración Óptima de 2 M: esto sugiere que la enzima se disocia de lamembrana debido a la modificación de las interacciones iónicas cuando sepresentan concentraciones altas de sales.

62

SOBRENADANTE PASTILLA

Figura 1. Solubilización de la PLC asociada a la membrana.

Precipitacion con sulfato de amonio.

Como primer paso de purificación se empleó la precipitación consulfato de amonio Para ello se llevaron a cabo experimentos de precipitación paraseleccionar el rango de las concentraciones adecuadas. En estos experimentos seutilizó una solución saturada y se adicionó a alícuotas (5 ml) de extracto soluble omembranal solubilizado hasta que éstas alcanzaron un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,60%, 70%, 80%, o 90% de saturación. Los resultados indicaron lo siguiente: Conrespecto a la actividad enzimática total en ambos extractos (fig. 2 y 3, panel A) seobservó la disminucjón gradual de la actMdad de PLC en el sobrenadante hasta un50% de saturacióm después de ésta concentración la actividad se pierde porcompleto. Con respecto a la actMdad específica de la enzima, en el caso de la PLCmembranal solubilizada (fig. 2, panel 8), a un 10% de saturacjón se observó iinincremento ligero tanto en el sobrenadante como en la pastilla, posiblementedebido a un mecanismo de activación. Posteriormente, a 20%, 30%, y 40%, laactividad enzimática en la pastilla se mantiene en valores similares a los del control;pero al alcanzar un 50% de saturación se observó un incremento de 4 veces conrespecto al control y este patrón se mantiene hasta el 90% de saturación. En elcaso de la PLC soluble (fig 3, panel 8) la actividad específica aumenta ligeramenteen el sobrenadante a un 10% de saturación y posteriormente va disminuyendohasta perderse a un 50% de saturación; mientras que en la pastilla la actMdadespecífica de la enzima va incrementando proporcionalmente hasta un 40% de

63

saturación en donde alcanza un valor similar al del control. Al alcanzar un 50% desaturación la actividad específica de la enzima en la pastilla se incrementa 10veces y a concentraciones superiores a esta la actívidad específica decrecegradualmente Finalmente, en ambos casos (extracto soluble y extracto membranalsolubilizado) se decidió utilizar los rangos vistos entre un 40% y un 60% desaturación para la precipitación con sulfato de amonio, ya que a un 40% desaturación se sacrifica hasta un 50% de actividad específica en el sobrenadantecomparada con la del control pero que eliminará cierta cantidad de proteínas eneste rango de precipitación, y al 60% de saturación se observa un incremento en laactividad especifica de al menos 4 veces comparada con la del control.

0 io 20 30 .0 50 60 70 10 90

PUIFATO DE AHONIO| %

0 10 20 .0 .0 50 60 70 00 90

|SllLFATO OE AHONIO] %

ia;giu:rsá,,:::a;:ie¡|i;d!a:::sei,;ue#;a.:::i:::TCN:óH:,,b2igÁa;f§?:d*£t:gi::t,á£::n:,::#3e:i::ii3a;

64

l Lllll

E#

Ñ0 .0 20 W 40 50 80 10 80 90

PULFAT0 DE AMONlo| %

811 ll_ J.ú =Lí#Ntillnr

o .o 2o 3o ao So 6o lo so go

PUIFATO DE AMONlo| %

;;#:dc:ód:ere,;`:p',?:cii!n::dé.;a!p,,L¡á#:!e:e?ipa:ac:fi¥,eqnsuo:3:e::a£rif:nie::y:,d?en,o,,igBo:oíot:#obtenida de la precipitación.

Purificación de la PLC asociada a la membrana.

Para la purificación de la PLC membranal se inició con la solubilizaciónde ésta en el extracto crudo utilizando 2 M de Kcl. Para establecer la cantidad dematerial usado para la purificación, se tomaron en cuenta los resultados del cuadrode purificación reponado por Yotsushima eí a/. (1992) en donde parten de 22.8 g de

protei'na total con una actividad total de 242 Limol/min (110 nmol/min/mg deprotei.na como actividad específica); ellos iniciaron con columnas de 5 0 x 40 cm ytuvieron un rendimiento final de 0.8% En nuestro caso, la disponibilidad decolumnas de 1.0 cm x 30 cm y de 1.6 x 18 cm en el laboratorio, nos limitó a iniciarla purificación partiendo de 100 gr de raices frescas y que corresponde a 122 gr deprotei'na total y 83 69 nmol/min de actividad total en el extracto citosólico, o 618 mgy 33 68 nmol/min de actividad total en el extracto membranal. A pesar de lascantidades mínimas de proteína y de activldad, en todos los casos se observóactividad de PLC eluyendo después del lavado de la proteínas que no se unieron ala matriz, sugiriendo un sobrecargado de la columna

65

PROTOCOLO No. 1. Se realizó una extracción completa partiendo de20 gr de raíces frescas Este protocolo incluyó una columna de fenil-sefarosa,aprovechando la concentración de sulfato de amonio como requisito de unión a lamatriz. Se cargó a la columna un volumen de 6 mL proveniente de la precipitaciónal 40%-60% con sulfato de amonio que contiene 1.53 mg de proteína y 128 9nmol/min de actividad total. El perfil de unión y elución de la columna defenil-sefarosa del extracto membranal se presenta en la figura 4. Se observó queexiste unión y elución de algunas proteínas en la columna de fenil-sefarosa. Sinembargo, al medm la actividad de PLC, ésta no se detectó durante el lavado de lacolumna, ni durante la elución de la proteína pegada a la columna. Estecomportamiento podría deberse a que la PLC sÍ se une a la fenil-sefarosa aunqueposteriorme`nte es difi'cil eluirla ya que se aplicó extracto con actividad y ésta no sedetectó en ningún lugar de la elución.

100 150 200 250

VOLUMEN (mL)

:#:r:o4enpuenfflá,cdo¡u#::,¡Txdsbec#,agteopT:nmyp.rs:3L£rr:sc¿%,tca£_o45oTo%oL6Looíoedaems:,,fga::ddoerde elución 0.5 mL/fracción

Nuevamente, se reintentó purificar a la enzima siguiendo este

protocolo Se obtuvo la fracción membranal solubmzada, ésta se precipitó consulfato de amonio en el rango de precipitación ya descrito; en esta ocasión, no selogró disolver la pastilla con el amortiguador A Se intentó la disolución adicionandoKcl 0 S M, también se intentó con sonicación Los resultados fueron negativos porlo que se eliminaron estos dos pasos de purificación (precipitación con sulfato deamonio y la cromatografía de interacción hidrofóbica) del protocolo de purificación

para la PLC membranal y se planteó otra estrategia Se pensó que estos resultadosfueron negativos debido a la agregación de la masa proteica en presencia de altasconcentraciones de sales tanto de sulfato de amonio como de Kcl.

PROTOCOLO No. 2 Se obtuvo un extracto y la PLC asociada a lamembrana se disoció de la misma sometiéndola a concentraciones altas de clorurode potasio El extracto membranal soluble (9 5 mL) se aplicó a una columna de

66

G25 para desalar (figura 5) La actividad de PLC se detectó al inicio del volumenvacío de la columna (27-30 mL) y se observó en los dos picos de absorbancia, EIprimer pico de absorbancia no contiene sales a diferencia del segundo pico endonde se detecta conductividad debido a la presencia de sales. Estas últimasfracciones no se tomaron ya que no estaban completamente desaladas Lamuestra desalada (45 mL) se aplicó a una columna de intercambio iónico El perfilde elución (figura 6) muestra un pico de actividad dentro del gradiente de eluciónLas fracciones que tuvieron actividad de PLC (54 mL) se mezclaron y concentraronpor ultrafiltración con membranas DiafloYM30 (Amicon). El volumen concentrado(6 mL) se aplicó a una columna de exclusión por tamaño Esta columna se incluyópara eliminar proteínas de alto y bajo molecular esperando separar las proteínaspresentes dentro de un rango de 50-150 kDa de masa molecular.

. ---. , ..'' , -

.'/

/

0030

0025

0020

0015

0010

0005

0000

-0 005

20 40 60 80 100

VOLUMEN (mL)

:Lg,uáae5seB;fEed£ál2:i,ópnhgret?cT:?d|o6om#%rea:#osh::uubá'ázoarddoeee,u:,nóan,Cg':mu,raaé3i.gnxl8

67

0 50 100 150 200 250 300 350

VOLUMEN (mL)

;:g:r:p6a.c:gg'Hd,:oeáá9LónQds'e#::oe®miTgRrapná|grems:Lacdeoe2no5n:LCoáuem::á`h.¡Suxaásrc:?elución. 3 mL/fracción.

El perfil de elución de la columna de superdex 200 (figura 7) muestraun volumen vacío de aproximadamente 100 mL y un pico con actividad de PLC.Este pico corresponde a una masa molecular de 90 kDa de acuerdo a la curva decalibración (figura 8) obtenida con proteínas de masa molecular conocida.

100 150 200 250 300

VOLUMEN (mL)

5,ugpué:d3pp2orid:ree;,::;o;ned3e2,6:[cdemveoTub:aenna!:ne,::FÓ::!u:nuaír`a2c:,orngocm)deH,Load®

68

10 15 20 25

V.„o

:#a.g.(gu6Wxa6doeccma;'bHr,aLC:g3®ogLepn:Fdaes;on2oP6o::énpasrg3em328::'á?utao|uc:::cideaeiTcrónn:3 mL/fracción.

_/•./-.`:``.``ii€:.l=`=',..,-..-ri`

0 50 100 150 200 250 300 350 400

VOLUMEN (mL)

i'8#:ingseppehT'io8:® e2#mnL dd% JaoiupmL:n Tee:::?orna.' 2e#L7fT:ccC.%':mna (16 X 17 cm) de

69

El pico (un volumen de 2.9 mL) obtenido de la columna de exclusión

por tamaño se aplicó a una columna de afinidad En el perfil de elución de estacolumna (figura 9) no se detectó actividad de PLC

El cuadro de purificación de la PLC asociada a membrana (cuadro 1)indica un incremento en la actividad total cuando el extracto eluye de la columna deSephadex G-25, este fenómeno, que también ocurrió cuando se realizó laprecipitación con sulfato de amonio, se repite en este paso de purificación y porconsiguiente aparentemente aumentan las veces de purificación si se compara conla actividad específica del extracto inicial Este resultado sugiere la existencia dealgún factor inhibitorio que se elimina ya sea durante la precipitación con sulfato deamonio o bien, durante la elución a través de una columna de filtración en gel. Porlo tanto, después del desalado existen 10 veces más de actividad total El últimopaso de purificación alcanzado fue el de la cromatografía por exclusión de tamañopor superdex 200 HP El gel de poliacrilamida al 10% (figura 10) revela en el carrildel pico de Superdex 200 HP la intensificación de 4 bandas de 73 kDa, 65 kDa, 59kDa, y 55 kDa respectivamente Aunque hasta este paso existe cieno grado depurificación, se requiere optimizar la purificación En el carril correspondiente a laproteína no unida a heparina se observan también las mismas bandas siendo lasde 65 y 59 kDa las que se observan menos

Cuadro 1 Cuadro de Purificación de la PLC membranal del 7° dia de una curva decrecimiento

PASO DE PROTEINA ACTIVIDAD ACTIVIDAD VECES DE RENDIMIENTO (%)

PURIFICACION TOTAL TOTAL ESPECIFICA PURIFICACION

(mg) (pkat) (pkat/mg prot.)

Extractomembranal 279 2439 8744 1 100

Extractomembranalso'uble 26.02 2 200 7 84_57 096 90.2

Desalado porG25 234 21781 5 930 87 106 8927

Seíarosa-Q 168 4 069 5 2 422 32 277 1667

Superdex 200HP 0.168 6339 3 773 1 431 259

No unida aSefarosa-heparina 0085 22.95 270 308 0.94

Sefarosa-heparina 0 0 0 0 0

70

lvIW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

FOSFORILASA 8 107 kDa

BSA 76 kDa

OVALBUMINA 52 kDa

ANHIDRASA CARBONICA 36.8 kDa

lNH. TRIP. SoyA 27.2 kDa

LISOZYIVIA 19 kDa

:;g:;:::,:í:°;°a3:d;e;i:8:i#;&CÍ_Í#Í,:¡egs;;dci?TTe::¥b:.a::nLi:,;iíír!e!1:£?Sefti:a;;t#s::a¡:'!;2::°Áir;ÍÍ:g:8é3:Pi::éoespeh®ár:;:#a,t8,deiu,aatocá,:Tancaofuemsn:pde:d#a2r,no-sHeppigí:gé®9,proteínanou"aa

PROTOCOLO No. 3. En este caso se realizó una extracción a partir de20 g de raíces del 7° día de cultivo; se inició con esta cantidad de material vegetalpara observar los perfiles de elución en cada uno de los pasos a seguir en lapurificación, a pesar de la cantidad de proteína se observó actividad de PLC en lasproteínas que no se unieron a la matriz de la columna, nuevamente sugiriendo unsobrecargado de la columna Se obtuvo el extracto membranal solubilizado (5 mL)y se aplicó a una columna de G-25 para desalar. La muestra desalada (27.5 mL) seaplicó a una columna de afinidad, seguida de un volumen de 200 mL deamortiguador C para eluir a la protei'na que no se unió a la matriz de heparinaPosteriormente se eluyó la proteína que sÍ se unió, con 250 ml de amortiguador Cutilizando un gradiente linear de Kcl de 0 a 1 5 M (estas condiciones fuerontomadas del manual que acompaña a la Heparin-Sepharose® CL-6B comercial y semodificaron del protocolo No. 2 para investigar alguna optimización de la elución)El perfil de elución (figura 11) muestra un pÍco de actividad dentro del gradiente deelución, aproximadamente a 0.6 M de Kcl.

71

E,g#:,n:áeppheaí:sg8£5uoc#ddeevL;u:Le:dmeeeTubcr,%nn:,5emnuífaacc:gLumnatt6xí7cm,de

El pem de elución también se observó en un gel de

poliacrilamida-SDS al 10% (figura 12), en cada carrh se aplicó la proteinapreviamente precipitada correspondiente a 0.5 mL de la fracción colectada durantela elución de la columna de heparina A parü del carril correspondiente a los 310mL de la elución, se observó un aumento en la intensidad de tinción de una bandade 56 kDa, ésta permanece hasta los 360 mL de la elución También se observó laseparación de las proteinas de aMo peso molecular (al principio de la elución) conrespecto de las proteinas de bajo peso molecular (al final de la elución).

PICO DE ACTIVIDAD DE PLC

r,ml ELuiDO

FRACCION

107 kDa

76 kDa

52 kDa

3e kDa

27 kDa

'9 koa

:±guYrdaeTc2o:::':sd,::i':,Cd:nd::a':oPuL:nT:gLreaFaaj]nv:St:p::r:sDe%-PAGEall0°/oteñiticon

72

Las fracciones que se obtuvieron de la elución de la columna deheparina se mezclaron de acuerdo al cuadro 2. En este cuadro se aprecia lacantidad de proteína aplicada y la cantidad de proteína eluída

Cuadro 2 Mezclas obtenidas de la elución de la columna de heparina

Fracción corresponde a: vol. total (mL) Cantidad deprot.(mg)

Memb.solubilizada extracto aplicado 4.1 4.2

de mL 30 a 60 prot. no unida 35 0.34de mL 250 a 285 11 40 0.8

de mL 290 a 330 111 45 1.22

de mL 335 a 350 pico de act. PLC 20 0.48de 355 mL a 395 V 45 0.49

Después de haber probado una columna de afinidad como primerpaso de purificación se planteó la estrategia de utilizar como segundo paso lamisma columna de afinídad Para esto, se realizó otro extracto bajo las mismascondiciones que el anterior y se aplicó a una primera columna de afinidad sin alterarninguna condición El patrón de elución (figura 13) resultó ser bastante similar al dela figura 11 `

0010

0005

00000 100 200 300 400 500 600

VOLUMEN (mL)

Figura 13 Perfil de elución de la PLC membranal en una la columna (16 x 17 cm) deHeparin-Sepharose® 250 mL de volumen de elución, 5 mL/fracción.

73

Las fracciones en las que se detectó actividad de PLC (del mL 305 al350) se combinaron y se concentraron por ultrafiltración con membranasDiafloYM30 (Amicon). El volumen concentrado (7 mL) se desaló por filtración engel. El volumen final obtenido del desalado (19 5 mL) se aplicó a una segundacolumna de afinidad bajo las mismas condiciones que la anterior, salvo el gradientede elución que fue creciente de Kcl de 0 a 1 M. El perfil de elución del segundo

paso de purificación se aprecia en la figura 14. En este caso ya no detectamosactividad de PLC en ningun punto de la elución. Sin embargo, el perfil de eluciónfue similar al de la figura 13, aunque se esperaba en su totalidad la unión de laproteína cargada, esto no sucedió ya que durante el lavado eluyó proteína que nose unió (aunque en menor proporción) a la matriz. También se observó el primerpico que elüyó en el primer paso de purificación y que supuestamente ya se habíaseparado del pico que contenía la actividad de la PLC.

0 100 200 300 400 500

Volumen (mL)

E'8#:inlseppheaí;s83. 25UoC# ddeevL£u:Le: dmeeeTubcr¡%nn:'5emnL/?rnaacc::irna (1 6 X 17 cm) de

Aunque no se detectó actividad de PLC, se realizó una corrida de laproteína eluída (de este segundo paso de purificación) en un gel depoliacrilamida-SDS al 7 5 % (figura 15) para observar la separación de bandasdurante la elución. En esta ocasión se observaron las bandas proteicas quecorresponderían al pico de acttvidad siendo éstas las que se observan en loscarriles de las fracciones 52 a 56.

La siguiente estrategia consistió en eliminar la segunda columna deafinidad e incluir, en lugar de ésta, una columna de exclusión por tamañobasándose en la la separación de 4 bandas proteicas presentes en los carriles 52 a56 de la figura 15 AsÍ, nuevamente se repitió todo el proceso de extracción,

74

disociación de la membrana, desalado, elución por la columna de afinidadobteniendo resultados idénticos a los ya señalados. Finalmente las fracciones quecontenían actívidad de PLC se aplicaron a la columna de exclusión por tamaño.

Figura 15. Perfil de elución de la PLC membranal visto en SDS-PAGE al 7.5% teñido connitrato de plata eluída de la segunda columna de Heparin-Sepharose®.

La figura 16 muestra la elución de proteínas en base a su pesomolecular en esta última columna Este perfil indicó la presencia de proteinas dediferente peso molecular la aparición del pico de actividad de la PLC deberíaapreciarse aproximadamente en el mL 190-205 de acuerdo a la figura 7, en dondesÍ se aprecia el pico de actMdad; sin embargo, no detectamos actividad de PLC enninguna de las fracciones eluídas. Esta fue la última estrategia realizada.

75

0_0018

0.0016

0.0006

0,0004

0 0002

0_0000

.',

"-`J,...`+:`.".„`.

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Volumen (mL)

5,ugpu::d:6£Esí,p?:pe;::Lóen82óampLL:eT:,T:r::ad,ee:"ucn,:n:oáu#Lirá:c:Óxn6ocm,deH,Load®

Purificación de la PLC citosólica.

PROTOCOLO No 1 Se obtuvo un extracto citosólico y se sometió aprecipitación con sulfato de amonio (40-60% de saturación) Este protocolo incluyóuna columna de fenil-sefarosa El perfil de unión y elución de la columna defenil-sefarosa del extracto citosólico se muestra en la figura 17 Se observó que, deigual forma que el extracto membranal, sÍ existe unión y elución de algunasproteínas en la columna de fenil-sefarosa, aunque, al medir la actMdad de PLC,ésta no se detectó ni en las fracciones correspondientes a la proteína no unida, men las fracciones eluídas Debido a que se obtuvieron resultados negativos durantela elución se propuso el protocolo no 2 Los resultados negativos pudieronoriginarse por la fuerte interacción existente entre la enzima y la matriz

76

50 100 150 200

VOLUMEN (mL)

:#:F:ole7nupneam:oiuemen'::,i,ÓTgg'c#rdaec,3h:,ioyi-o!iec:hg::S:p:t6E?4g,To4ooL6foáoedaem3:,ifga:?ddoerde elución. 0 5 mLMraccion.

PROTOCOLO No. 2. En esta ocasión para la extracción se emplearon20 g de raíces del 4° día de cultivo. El extracto citosólico obtenido se sometió aprecipitación con sulfato de amonio La resuspension obtenída (5.5 mL) se aplicó auna columna para desalar (figura 18) La actividad de PLC se detectó al inicio delvolumen vacío de la columna (27-30 mL) y abarcó 5 fracciones haciendo un total de22 mL Se pudo apreciar que la proteína sale antes que la conductividadconfirmando el objetivo de desalar la muestra La muestra desalada (20 mL) seaplicó a una columna de intercambio iónico. El perfil de elución de esta Últimacolumna (figura 19) muestra un pico de actividad dentro del gradiente de eluciónLas fracciones que mostraron actividad de PLC (46 mL) se mezclaron yconcentraron con gel de Sephadex®G-25 ya que en ese momento no se disponi'adel equipo de ultrafiltración (Amicon)

77

40 80 120

VOLUMEN (mL)

:Lg:rnaalc8.-,uP:::i2.6':c|isnc#,ldeerisae33acátá#:25P,rpe:;Priiaadc:ai??64oo-:EOÁáesá'La:ohidgeu:dm.:nd:elución; 5 mL/fracción

+

1 ...``_;'.i'`.f+0 50 100 150 200 250 300

VOLUMEN (mL)

0025

0020

0015

0010

0_005

0_000

Figura 19 Perfil de elución del extracto citosólico desalado en una columna (1.6 x 10 cm)

8Í%Tnpa3Camd|£ff;:g#:M Q Sepharose® High Performance 200 mL de amortiguador de

El volLimen concentrado (10 mL) se aplicó a una columna de exclusión portamaño. El perfil de elución de la columna superdex 200 (figura 20) mostró unvolumen vacio de 100 mL y un pico de actividad de PLC pero en una sola fracciónque posiblemente se debió a un ensayo de actMdad erróneo Este pico

78

corresponde a una masa molecular de 156 kDa de acuerdo a la curva decalibraci.Ón (figura 8) obteni'da con proteínas de masa molecular conocida. Tambiénse observó un segundo pico de actividad correspondiendo a una masa molecularde 61 kDa; este pico de actividad coincide con un pico de absorbancia a 280 nm.

:,ugpu::d:%!g#rdeepeg,ruacá:n3d2eo,:Ft:;:t,ousmó::ad:ne,uunc?Ó:?,3u#nLñr,a2c:,;n6ocm,deH,Load®

El volumen concentrado (2.2 mL) de las fracciones (del mL 195 al 201 )que contienen el pico de actividad de PLC obtenido de la eluci.Ón en la columna deexclusión por tamaño se aplicó a una columna de afinidad. En el perfil de elución deesta columna (figura 21) no se detectó actividad de PLC. Esto probablemente fuedebido a la dilución de la proteína de interés durante la elución por la columna Laabsorbancia negativa observada en las figuras 20 y 21 fue el resultado de un errorde calibración en el equipo de FPLC.

79

EiEziil-----,---.

0 50 100 150 200 250 300

VOLUMEN (mL)

L,g#:,n:éepph:r:,sed®e 2ed:CLOLn d:ev¿FumpeLncd:,teq:::ácna, 2enm#r:c::j:mm tt 6 x í 7 cmt de

El cuadro de purificación (cuadro 3) indicó que existen 3 veces de

purificación con la precipitación 40-60% con sulfato de amonio También seobservó que existen aprox 15 veces de purificación en la proteína que no se unió ala Q-Sepharose® Esto se confirmó al observar el gel de poliacrilamida al 10%

(figura 22) en el carrn de la proteina que no se unió a Q-Sepharose® se intensificauna banda de 65 kDa que también aparece en el carril del pico de Q-Sepharose®Aunque en el carril que corresponde al eluato de la columna de superdex seobserva proteína, cuando se midió la actividad de la PIC para obtener el cuadro depurificación, ya no se detectó alctividad alguna Esto sugiere un proceso dedegradación y/o desactivación de la enzima durante su almacenamiento.

80

Cuadro 3. Cuadro de Purificación de la PLC citosólical del 4° dia de cultivo

PASO DEPURIFICAcloN PROTEINATOTAL ACTIVIDADTOTAL ACTIVIDADESPECIFICA VECES DEPURIFICACION RENDIMIENTO (%)

(mg) (pka') (pkat/mgpl'Ot.)

Extracto citosól ico 4853 4077 8403 1 100

Precipitación con(NH4)2S0440-60°/o 919 2 472 43 2688 313 60_63

Desalado por G25 6.56 1 730.5 263.8 313 42.43

No iinida aSefarosa-Q 01 135 1 323.5 15.75 331

Sefarosa-Q 134 50.25 37.47 044 123

Superdex 200 HP 002 0 0 0 0

Sefarosa-heparina 0 0 0 0 0

FOSFORILASA 8 107 kDaBSA 76 kDa

OVALBUMINA 52 kDa

ANHIDRASA CARBONICA 36.8 kDa

lNH. TRIP. SOYA 27.2kDa

LISOZYMA 19 kDa

Figura 22. Perfil de purificación visto en SDS-PAGE al 10% teñido con nitrato de plata WM,Marcadores de pesos moleculares, 1, extracto total; 2, extracto membranal, 3, extractocitosólico: 4, sobrenadante de la precipitación con sulfato de amonio al 40%, 5, pastilla dela precipitación con sulfa`o de amonio al 40%; 6, sobrenadante de la prec.ipitación con

§§#3nd:oedp:TQg_Ts2:5bah;á6:::X;é®,#n:os:í,uLa:{:ea,:Q:Í%:p:í:`:oc::gbcéooné§:c:g:;d:e:aec¿:óTdoa:d:oe,:u:g66oooa{oéTíÍeluato de la columna de Heparin-Sepharose®. En todos los camles se aplicaron 10 iig deproteína`

81

DISCUSION

En células vegetales se ha detectado actividad de PLC tanto en lafracción soluble como en la fracción asociada a la membrana. Ambas poseencaracterísticas diferentes [Helsper eí a/ , 1985; lrvine eí a/ , 1980, MCMurray andlrvine,1988: Melin eí a/ ,1992, Tate eí a/.,1989, Yotsushima eí a/.,1992,1993]. Ensu reporte, Pfaffmann eí a/. (1987), examinaron la distribución subcelular de unaPl-PLC de hipocótilos de soya y frijol. De la actividad total de los homogenados,aproximadamente el 85% fue soluble y el 15% estuvo asociada a la membrana; yde la actividad que estuvo asociada a la membrana la actividad más alta fuerecuperada `en la fracción correspondiente a la membrana plasmática. Nosotrostambién hemos detectado actividad de PLC en fracciones solubles y en fraccionesasociadas a la membrana [De los Santos eí a/,1997] Para solubilizar la PLCasociada a la membrana se intentaron vanos métodos y se obtuvieron los mejoresresultados con la adición de 2 M de cloruro de potasio al amortiguador deextracción [Hernández-Sotomayor eí a/., 1997] Esto indica que esta isoformapuede estar asociada a la membrana débilmente a través de interacciones iónicas.

Existen repones sobre la purificación de PLCs en plantas; sinembargo, esta enzima aún no se ha purificado a homogeneidad Una PLC asociadaa la membrana plasmática fue purificada 25 veces a partir de raíces de trigo [Melinef a/, 1992]. La enzima parcialmente purificada hidrolizó PIP y PIP2 aconcentraciones micromolares de Ca2+. Esta enzima no fue purificada ahomogeneidad debido a su labilidad En arroz, ambas PLC soluble y particuladafueron purificadas a aparente homogeneidad Estas enzimas presentaron masasmoleculares aparentes en electroforesis de SDS-poliacrilamida de 55 y 42 kDa,fueron purificadas 311 y 219 veces, y con actMdades específicas de 33

Limol/min/mg de proteína y 19 Limol/min/mg de proteína, respectivamente[Yotsushima eí a/„ 1992,1993] Ambas enzimas fueron altamente específicas paraPI, aunque la actividad contra PIP2 pudo ser reconstituída por la adición de unfactor proteico perdido durante la purificación En raíces de avena, las dos formaspresentes tienen una masa molecular aparente de 50-70 kDa [Huang eí a/.,1995].

En este trabajo, hemos iniciado la purificación de la PLC de C. roseusa partir de raíces transformadas utilizando diferentes tipos de cromatografía comoSephadex G-25, Heparin-Sepharose®, Q-Sepharose®, y Superdex® 200 Aunque nosabemos con certeza el peso molecular aparente de las PLCs existentes en C.roseus, de acuerdo al análisis de la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamidapudmos apreciar bandas de peso molecular dentro de un rango de 55-75 kDa. Deacuerdo al peso molecular de las familias de PLCs en células animales, la PLC de

plantas corresponderi'a a las PLCs de tipo ó. Además, se han clonado genes dePLC de Arab/dops/s Íha//ana [Hirayama eí a/.,1995,1997; Yamamoto eí a/„ 1995] ysoya [Shi ef a/.,1995] cuyos productos poseen pesos moleculares de 60-70 kDa,similares a las enzimas parcialmente purificadas, y características estructurales

parecidas a las de tipo -ó de animales No obstante, no debemos excluir laposibilidad de que en C. noseus exista alguna otra familia de PLC.

82

El incremento de la actividad total observado después de la adición delsulfato de amonio (en la fracción soluble) y del desalado por filtración en gel G25(en la fracción asociada a la membrana) sugiere la presencia en el homogenadototal de algún factor que pudiera estar afectando la actividad de la PLC cuandoambos se encuentran presentes. Esta sugerencia seguirá presente hasta nodemostrar lo contrario para lo cual se requieren ensayos de reconstitución duranteel proceso de purificación. Por otro lado, aunque se mantuvo en mente iniciar lapurificación con cantidades altas de proteína, siempre se observó sobrecargado enlas columnas sugiriendo el empleo de columnas mas grandes. Teniendo estosantecedentes se plantea como estrategia el empleo de la precipitación con sulfatode amo"o tratando de optimizar los resultados presentados en este trabajo, el usode una columna de heparina en una columna de 2.6 x 60 cm para obtener mayorcapacidad de unión, incluir una columna de exclusión por tamaño preparativa ycomo paso final una columna de exclusión por tamaño analítica.

En nuestro trabajo, la purificación no se logró debido a la pérdida de laactividad de la enzima. Las causas probables son: a) La inactivación por proteólisis,causa poco probable debido a la presencia de inhibidores de proteasas dentro delos amortiguadores de elución en cada paso de purificación; b) La cantidad deproteína presente en la última etapa de la purificación, originando la dilución de lamezcla aplicada como resultado inevitable del proceso de elución de la columna,originando la incapacidad para detectar la actividad; c) La desnaturalización de laenzima por efecto de la dilución, ya que el hecho de que la enzima se encuentreaislada en una solución altamente dilui.da puede originar desnaturalización; d) Laadsorción de la enzima a la superficie de la columna en la última etapa de lapurificación, puesto que la enzima es de naturaleza hidrofóbica puede interaccionarcon la superficie de la columna ayudada además con la alta dilución en que seencuentra presente; e) La labilidad de la enzima, la pérdida de la actividad de laenzima puede deberse a la presencia de pequeñas cantidades de contaminantesen el amortiguador originando algún proceso reactivo; f) El aislamiento de ciertoactivador durante alguna de las etapas del proceso de purificación, minimizando ladetección de la actividad.

Las veces de purificación de ambas PLC soluble y asociada a lamembrana (aprox. 6 y 5 veces respectivamente) no alcanzaron las expectativasdeseadas Sin embargo, se puede asumir cierta purificación parcial, útil pararealizar alguna caracterización adicional de la enzima. Conjuntamente, ya se cuentacon el monta/e de al menos un protocolo de purificación repe`itivo para la obtenciónde una preparación enzimática de PLC parcialmente pura Para el análisis cinéticode la PLC de C, roseus [Hernández-Sotomayor eí a/., en preparación] se utilizó unapreparación enzimática purificada parcialmente a partir del extracto membranal(con una actividad específica de 107 nmol/min/mg de proteína) y empleando elúltimo de los protocolos aquí descritos Estas técnicas de purificación podrán seroptimizadas para trabajos futuros sobre la PLC.

83

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Bloom H., Beier H., Gross H.S, (1987). lmproved silver stainíng of plant proteins,RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis, 8:93-99

Bominaar A.A., and Van Haasteil P.J.M. (1994). Phospholipase C in D/.cíyosfe//umd/.sco/'deum. ldentification of stimulatory and inhibitory surface receptors andG-proteins. Biochem J , 297:189-193.

Ciau-Uitz R., Miranda-Ham M.L., Coello-Coello J., Chí 8., Pacheco L,M., andLoyola-Vargas V.M. (1994). lndole alkaloid production by transformed andnon-transformed root cultures of Cafnaraníhus roseus. ln Vitro Cell. Dev. Biol„30:84-88.

De Los Santos-Briones C., Muñoz€ánchez J.A., Chín-Vera J., Loyola-VargasV.M., and Hemández€otomayor S.M.T. (1997). Phosphatídylinositol4,5-bisphosphate phospholipase C activity during the growing phase ofCaíharaníhus roseus transformed roots. J. Plant Physíol ,150.707-713.

Dr®bak B.K. (1992) The plant phosphoinositide system. BÍochem. J„ 288:697-712.

Einspahr K.J., Peeler T.C., and Thompson G.A. Jr. (1989). Phosphatidylinositol4,5-bisphosphate phospholipase C and phosphomonoesterase in Ouna//.e//asa//.na membranes. Plant Physiol , 90.1115-1120.

Helsper H.P., de Groot P.F., Jackson J.F., and Linskens H.F. (1985)Phosphatidylinositol phosphodiesterase in lily pollen. Plant Physiol., 77

(Supp.):98.

Hernández-Sotomayor S.M.T., De Los Santos-Briones C., Muñoz-SánchezJ.A., Pjña-Chablé M.L., and Loyola-Vargas V.M. (1997). Phospholipase C inCaíharaníhus roseus transformed roots. ln. Advances and Perspectives on theFunction of Plant Roots. Flores H.E„ Lynch J.P., Eissensqt D., eds, AmericanSociety of Plant Physiologists, pp. 422425

Hernández-Sotomayor S.M.T., De Los Santos-Briones C., Muñoz-SánchezJ.A,, and Loyola-Vargas V.M. (En preparacjón). Kinetic analysis ofPhospholipase C from Camaraníhus roseus transformed roots using differentassays

Hirayama T., Ohto Cli., Mizoguchi T. and Shinozaki K. (1995) A gene encodinga phosphatidylinositol-specific phospholipase C is induced by dehydration andsalt stress in Arab/c/ops/s Íha//ana, Proc. Natl Acad. Sci, USA, 92:3903-3907.

Hirayama T„ Mitsukawa N., Shibata D. and Shinozaki K. (1997) AÍPLC2, a geneencoding phosphoinositide-specific phospholipase C, is constitutively expressedin vegetative and floral tissues in Arab/dops/s Íha//'ana. Plant Mol Biol.,34175-180

84

Huang C.-H., Tate B.F., Crain R.C., and Coté G.G. (1995). Multiple

phosphoinositide-specífic phospholipases C in oat roots: characterization andpartial purlfication. Plant J„ 8:257-267.

lkezawa H., and Taguchi R. (1981). Phosphatidylinositol-speclfic phospholipase Cfrom Bac/'//us Íhur/.ng/.ens/s. Methods Enzymol„ 71 :731 -741.

lrvine R.F., Letcher A.J., and Dawson R.M.C. (1980). Phosphatidylinositolphosphodiesterase in higher plants. Biochem. J.,192:279-283.

Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. Nature, 227:680-685.

MCMurray W.C., and lrvine R.F. (1988). Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate

phosphodiesterase in higher plants. Biochem. J., 249:877-881.

lvlelin P., Pical C., Jergil 8., and Sommarin M. (1992). Polyphosphoinositide

phospholipase C in wheat root plasma membranes, Partial purification andcharacterization. Biochim. Biophys. Acta,1123:163-169.

Pfaffmann H,, Hartmann E., Brightman A.O., and Morré D.J. (1987).Phosphatidylinositol specific phospholipase C of plant stems Plant Physiol„85: 1151 -1155.

Rhee S.G., Suh P.G., Ryu S.H., and Lee S.Y. (1989). Studies of lnositolPhospholipid-Specific Phospholipase C. Science, 244:546-550.

Rhee S.G., and Bae Y.S. (1997). Regulation of phosphoinositide-specificphospholipase C isozymes. J. Biol. Chem , 272: 15045-15048.

Shi J., Gonzalez R. and Bhattancharyya M. K. (1995) Charactenzation of aplasma membrane-associated phosphoinositide-specific phospholipase C fromsoybean. Plant J„ 8 (3):381-390.

Smith P.K„ Krohn R.l., Hermanson G.T., Mallia A.K., and Gartner F.H.,Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C.(1985). Measurement of protein using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem„150:76-85

Tate B.F., Schaller G.E., Sussman M.R., and Crain R.C. (1989). Characterizationof a polyphosphoinositide phospholipase C from the plasma membrane of Avenasaf/va. Plant Physiol., 91.1275-1279.

Yammamotto Y.T,, Conkling lvl.A., Sussex l.M. and lrish V.F. (1995) AnArab/.dops/s cDNA Related to Animal Phosphoinositide-Specific Phospholipase CGenes Plant physiol„ 107.1029-1030.

85

Yoko-o T., Matsui Y., Yagisawa H., Nojima H., Uno 1., and Toh-e A. (1993). Theputa`tive phosphoinositide-specific phospholipase C gene, PLC7, of the yeastSaccharomyces cenev/.s/.ae is important for cell growh Proc. Natl Acad Sci.USA, 90:1804-1808.

Yotsushima K., Nakamura K., Mitsui T., and lgaue 1. (1992) Purification andCharacterization of Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C inSuspension-cultured Cells of Rice (Oryza safí.va L ) Biosci. Biotech. Biochem.,56: 1247-1251.

Yotsushima K., Mitsui T., Takaoka T., Hayakawa T., and lgaue 1. (1993).Purification and Characterization of Membrane-Bound lnositolPhospholipid-Specific Phospholipase C from Suspension-Cultured Rice (Ovzasaíwa L.) Cells. Plant Physiol„ 102:165-172.

86

CAPITULO 4

Discusión General

Los fosfolípidos forman parte de un mecanismo de transducción deseñales en las células animales. Existen estímulos que se perciben en lamembrana plasmática y activan a la PLC, Ia cual hidroliza PIP2 y produce lp3 yDAG. EI DAG activa a una proteína cinasa C y el lp3 induce un aumento en laconcentración de calcio citosólico, Consecuentemente, se inician reaccionesenzimáticas reguladas por Ca2+ las cuales conducen a varias respuestasfisiológicas (fosforilación de proteínas, secreción, transporte de iones, divisióncelular, etc.) El lp3 puede ser metabolizado por desfosforilaciones produciendoinositol y Pi, o por fosforilación para formar otros inositol fosfatos.

Aunque en las células vegetales se ha demostradQ la .biosíntesis y elmetabolismo de los fosfolípídos de inositol [Boss y Massel, 1985; Sandelius ySommarin, 1986], no se conoce su función fisiológica; sin embargo se hareportado que la degradación de los fosfolípidos de inositol puede ser inducida porestímulos ambientales como choque osmótico [Einsparh eí a/„ 1988], luz [Morse eía/., 1989] fitorreguladores de crecimiento tales como auxinas [Eftlinger y Lehle,1988] y citocininas [Connet y Hanke,1987]. También se ha detectado actividad defosfolipasa C en una variedad de tejidos vegetales (MCMurray e lrvine, 1988).Todos estos repones proporcionan evidenclas que sugieren que los fosfoli'pidos deinositol tienen una función importante en la transducción de señales en plantas.

En este trabajo, se detectó actMdad de una fosfolipasa C específicapara fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en diferentes teiidos de raíces de C. roseus.Pfaffman ef a/„ (1987) han reportado que, de la actividad total de la PLC de loshomogenados de hipocótilos de soya, el 85% es soluble y el 15°/o está asociada a lamembrana. En células vegetales se han detectado dos tipos de PLC específicapara fosfolípidos de inositol: enzimas solubles y enzimas asociadas a la membrana[Mc Murray e lrvine, 1988]. En base a estos repohes, se decidió fraccionar unextracto total proteico para obtener extractos membranales y citosólicos crudos. LaactMdad de PLC se detectó en ambos extractos aunque la actividad específica dela enzima fue 10 veces más alta en extractos membranales que en los extractoscitosólicos. En las dos líneas de raíces estudiadas, durante los primeros 10 días decultivo se observó un pico de actMdad de PLC de la fracción citosólica que precedea aquella de fracciones membranales. Ambas actividades son detectadas al iniciode la fase exponencial de la curva de crecimiento. Esta variación de la actividad conrespecto al ciclo de cultivo sugiere que el metabolismo de los fosfolípidos de inositol

puede estar involucrado en el proceso de proliferación celular. Estos resultadoscorrelacionan con la detección de actividades de proteínas cinasas del metabolismode los fosfoinosítidos durante el ciclo de cultivo de células en suspensión de C.roseus [Heim y Wagner,1986,1987,1989].

Yotsushima eí a/., (1992,1993) reportaron la purificación ahomogeneidad aparente y la caracterización de una PLC soluble y una PLCasociada a membrana a partir de células en suspensión de arroz. La comparaciónde sus propiedades indica que son jsoenzimas diferentes. La masa molecular

87

aparente de las enzimas asociada a membrana y soluble fue 42 y 55 kDa,respectivamente La PLC asociada a la membrana tuvo un pH Óptimo de 65mientras que la soluble lo tuvo a 5.2 El ion Sr2+ activó a la PLC asociada a lamembrana y no lo hizo con la soluble. Melin ef a/ (1992) reportaron la purificación

parcial y caracterización de una PLC de membranas plasmáticas de trigo Laenzima fue solubilizada con octilglucósido y la purificaron 25 veces. La enzimaparcialmente purificada hidrolizó PIP2 y PIP. En este trabajo se llevó a cabo unacaracterización inicial de ambas actividades detectadas con el fin de realizar unanálisis y comparación de la conducta enzimática. Cabe hacer notar que estacaracterización preliminar fue hecha en extractos crudos AsÍ bien, al determinar laespecificidad por el sustrato observamos que la PLC asociada a membranahidrolizó preferencialmente al PIP2 y al PIP mientras que la PLC de la fraccióncitosólica hidrolizó preferencialmente al PIP y al Pl. Estos resultados preliminarescorrelacionan con aquellas reportadas para las PLCs asociadas a membrana ysolubles respectivamente.

Las PLCs de plantas superiores requieren de Ca2+ para su activación

[lrvine eí a/, 1980] Las actividades de PLC reportadas en plantas sondependientes de Ca2+ a concentraciones micromolares (enzimas asociadas amembrana) y a concentraciones milimolares (enzimas soluble) En contraste con ladependencia de Ca2. de las enzimas solubles reportadas, la actividad de ambasPLCs que detectamos en las raíces de la línea Jl de C. mseus tienen unadependencia total a concentraciones micromolares de calcio y se presenta unefecto inhibitorio a concentraciones superiores de calcio De acuerdo a algunosinvestigad]res, los niveles basales de Ca2+ libre en la célula vegetal se encuentranen un rango Je 100 a 300 nM [Dr®bak,1992, Felle,1988] Esto indica que ambasPLCs se encuentran inactivas a niveles basales en la célula y que la actividadenzimática es estimulada cuando las concentraciones de Ca2+ citosólico se eleva aniveles micromolares en respuesta a algún estímulo a la célula por 1o que podríanestar reguladas por la concentración de Ca2+ en el citosol Parece ser que las PLCsolubles contribuyen a la amplificación de señales en lugar de transducir señalesextracelulares dentro de la célula En células animales se ha reportado que losfosfolípidos de inositol están localizados en la pane citosólica de la bicapa lipídica y

que el contenido de fosfatidilinositoles es mayor en las endomembranas que en lamembrana plasmática [Hokin, 1985] En plantas superiores, Ias membranasplasmáticas están ennquecidas de PIP y PIP2 mientras que los microsomascontienen PI [Boss,1989] Estas observaciones mantienen la función hipotétióa delas PLCs solubles. Sin embargo, también en células animales se ha reportado latranslocación de la PLC-yl desde el citosol hacia la membrana en respuesta afactores del crecimiento aunque no se conoce la naturaleza de este mecanismo[Todderud e( a/ ,1990, Kim ef a/ ,1989]. Por lo tanto, tampoco podemos excluir laposibilidad de que cieha translocación pudiera estarse llevando a cabo

Al determinar los parámetros cinéticos aparentes se observaroncambios durante los primeros 10 días de cultivo, hasta llegar a ser similares Estosdatos no proporcionan información relevante que se puedan tomar en cuenta parasacar conclusiones aunque sÍ nos dan una idea de que el comportamiento

88

enzimático en su máxima actividad es diferente uno del otro. Por ello, esindispensable la determinación de los parámetros cinéticos con la enzima pura.

La estimulación de la actividad de la PLC por deoxicolato y TritónX-100, en membranas plasmáticas de raíces de trigo, se observó a un 0.01% (p/v)[Melin ef a/,1992] y a 0.02-0 025% (p/v) [Pical eí a/.,1992]; la inhibición de laactividad enzimática se presentó cuando la concentraciones fueron superiores a0 05%. En nuestro modelo el Tritón X-100 tuvo un efecto inhibitorio a panir de0.02% (p/v) tanto en la PLC soluble como en la PLC membranal. El deoxicolatoactivó unicamente a la PLC soluble a 0.02% (p/v) El octilglucósido activó a la PLCasociada a membrana pero únicamente a 0 04°/o (p/v) mientras que la PLC solublese activó a concentraciones superiores (0.15-0.2°/o). El aumento de la actividadenzimática en presencia de detergentes podría ser explicada en varias formas: a) elcomplejo substrato lípido-detergente es un mejor substrato para la enzima que elsubstrato lípido solo; y b) el detergente abre una barrera estructural y expone el sitioactivo de la enzima. La primera explicacjón no sería vállda si a concentracionesaltas de detergente se observa inhibición de la enzima. La segunda opción sería laindicada si tomamos en cuenta el efecto diferencial de los tres detergentes sobreuna misma isoenzima. Además, la comparación de los datos reportados para laPLC en plantas sugeriría que el efecto de cierto detergente podría deberse a lacombinación específica de la enzima con el detergente, o bien el sustrato lípido conel detergente.

Aunque existen reportes en relación a la purificación y caracterizaciónde las PLCs especi.ficas para fosfolípidos de inositol en plantas, ésta no ha sidopurificada a homogeneidad. Huang ef a/ (1995) reportaron al menos cuatrovanantes de Pl-PLCs en las raíces de plántulas de avena, dos citosólicas y dosasociadas a la membrana. Las dos variantes citosólicas y las dos asociadas a lamembrana se separaron en base a su afinidad por la heparina. En nuestro modelono descartamos la existencia de isoformas con diferente afinidad por la heparina yaque se detectó actividad de PLC en el perfil de lavado y elución de la proteína en lacolumna de heparina. La purificación parcial de la fosfolipasa C de C. roseus quehemos obtenido puede ser optimizada para lograr la homogeneidad. Ambas PLCsoluble y asociada a la membrana de C. roseus mostraron afinidad por heparina,unión a Q-sepharose, y una buena elución por cromatografía de exclusión detamaño.

La existencia del ciclo de los fosfoinosítidos en células vegetales hasjdo establecida a partir de la determinación tanto de sus metabolitos como de susactividades enzi.máticas [Boss, 1989; Sandelius y Sommarin, 1990]. Desde hacemás de una década, se han realizado estudios preliminares con fitohormonas quemostraron efectos sobre las actividades enzimáticas del ciclo de los fosfoinosi'tidosy cambios en las reservas de sus metabolitos [Falkenau ef a/,1987; Connett yHanke,1987; Murthy eí a/..1989] Ettlinger y Lehle (1988) estudiaron la capacidaddel ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) para reiniciar la división celular de célulasen suspensión de Caíharaníhus roseus mantenidas en la fase Gi. La adición de2,4-D causó una disiminución transiente de PIP y PIP2 acompañada de un aumentoen los niveles de lp2 e lp3, Estos efectos sugerían la estimulación de la PLC porauxinas, por lo que Zbell y Walter-Back (1988) utilizaron el ácido ¡ndolacético (lAA)

89

en células en suspensión de Daucus carioía para observar los efectos que ésteproduciría. La adición de lAA a las preparaciones microsomales redujo los nivelesde PIP`y PIP2 sugiriendo un efecto de la auxina sobre la acción catalizadora de laPLC Otros reportes relacionados con la existencia del metabolismo de losfosfoinosítidos en plantas en respuesta a otras señales refieren a los efectos de laluz sobre el control del movimiento de las hojas en Samanea saman [Morse et al.,1989]. La luz blanca indujo un aumento del lp2 e lp3 así como diacilglicerol.Actualmente, dadas las evidencias se deduce que la PLC en plantas, como encélulas animales, puede estar involucrada en diferentes procesos; es por esto, quese requiere atención y esfuerzo para demostrar una acción concertada de loselementos involucrados en el metabolismo de los fosfoinosítidos en determinadopeoceso La purificación a homogeneidad de al menos una de las isoenzimas de laPLC en C. noseus permitirá un estudio más profundo para conocer la función deestas enzimas en la fisiología vegetal, en el desarrollo, y en la respuesta a cambiosambientales.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Boss W.F. and Massel (1985). Polyphosphoinositides are present in plant tissueculture cells. Biochem Biophys. Res Commun.,132.1018-1023.

Boss W.F. (1989) Phosphoinositide Metabolism lts Relation to SignalTransduction in Plants ln Second Messengers in Plant Growth andDevelopment, W F. Boss and D.J Morré (Eds.), Alan R. Liss, New York, 29-56.

Conet R.J.A. and Hanke D.A. (1987). Changes in the pattern of phospholipidsynthesis during the induction by citokinin of cell division in soybean suspensioncultures. Planta,170:161-167.

Drobak B.K. (1992) The plant phosphoinositide system. Biochem. J., 288:697-712.

Einspahr K.J., Peeler T.C., and Thompson G.A. Jr. (1988) Rapid changes inpolyphosp`hoinositide metabolism associated with the response of Dunalellaoalina to hypoosmotic shock. J Biol. Chem., 263.5775-5779.

Ettlinger C., and Lehle L. (1988). Auxin induces rapid changes inphosphatidylinositol metabolites. Nature, 331.176-178

Falkenau C., Heim S., and Wagner K.G. (1987). Effect of cytokinins on thephospholipid phosnhorylation of the suspension cultured Caínaraníhus roseuscells. Plant Sci., 50.'i73-178.

Felle, H, (1988) Auxin causes oscillations of cytosolic free calcium and pH in Zeamays coleoptiles. Planta,174:495499

Heim S., and Wagner K.G. (1986). Evidence of phosphorylated phophatidylinositolsin the growth cycle of suspension cultured plant cells. Biochem. Biophys. ResComm.,134: 1175-1181.

90

Heim S., and Wagner K.G. (1987). Enzymatic activities of the phosphatidylinositolcycle dunng gromh of suspension cultured plant cells. Plant Sci , 49:167-173.

Heim S., and Wagner K.G. (1989) lnositol phosphates in the growth cycle ofsuspension cultured plant cells. Plant Sci., 63:159-165

Hokin L.E. (1985). Receptors and phosphoinositide-generated second messengers.Annu. Rev. Biochem., 54:205-235.

Huang C.-H., Tate B.F„ Crain R.C,, and Coté G.G. (1995). Multiplephosphoinositide-specific phospholipases C in oat roots: characterization andpartial purification Plant J., 8.257-267

lrvine R.F. Letcher A.J., Dawson R.M.C. (1980). Phosphatidylinositolphosphodiesterase in higher plants. Biochem. J ,192:279-283.

Kim U.-H., Kim H.-S. and Rhee S.G. (1989). Epidermal growth factor and

platelet-derived growth factor promote translocation of phospholipase C-y fromcytosol to membrane. FEBS Lett„ 270.33-36.

Mc Murray W.C. and lrvine R.F. (1988) Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphatephosphodiesterase in higher plants. Biochem. J„ 249.877-881

Melin, P.-M., Pical, Ch., Jergil, 8., and Sommarin, M. (1992).Polyphosphoinositide phospholipase C in wheat root plasma membranes. Pahialpurification and charactenzation. Biochtm. Biophys. Acta,1123:163-169.

Morse M.J., Crain R.C., Coté G.G., Satter R.L. (1989). Light-stimulated inositolphospholipid turnover in Samanea saman pulvini. Plant Physiol., 89:724-727.

Murthy P.P.N., Render§ J,M., and Keranen L.M. (1989). Phosphoinositides inbarley aleurone layers and gibberelic acid-induced changes in metabolism. PlantPhysiol., 91 :1266-1269.

Pical Ch., Sandelius A.S., Melin P.-M,, and Sommarin M. (1992).Polyphosphoinositide phospholipase C in plasma membranes of wheat ( Tn.Í/.cumaesí/.vum L ) Plant Physiol.,100:1296-1303.

Pfaffmann H., Hartmann E., Brightman A.O., and Morré D.J. (1987).Phosphatidylmositol specific phospholipase C of plant stems. Plant Physiol.,85: 1151 -1155.

Sandelius A.S., and Sommarin M. (1986). Phosphorylation of phosphatidylinositolsin isolated plant membranes FEBS Lett„ 201 :282-286.

Sandelius A.S., and Sommarin M. (1990). Membrane-Localized Reactionslnvolved in Polyphosphoinositide Turnover in Plants. /n. lnositol Metabolism in

91

Plants DJ Morré, WF Boss, and FA. Loewus (Eds), Wiley-Liss lnc„ NewYork, pp 139-161.

Todderud G., Wahl M.l., Rhee S.G. and Carpenter G, (1990). Stimulation of

phospholipase C-yl membrane association by epidermal growth factor.Sciencie, 249:296-298.

Yotsushima K., Nakamura K., Mitsui T., and lgaue 1. (1992) Purification andCharacterization of Phosphatidylinositol-specific Phospholipase C inSuspension-cultured Cells of Rice (Oq/za saí/.va L). Biosci. Biotech Biochem.,56: 1247-1251.

Yotsushima K., Mitsui T., Takaoka T., Hayakawa T., and lgaue 1. (1993)Purjfication and Characterizatjon of Membrane-Bound lnositolPhospholipid-Specific Phospholipase C from Suspension-Cultured Rice (Oryzasa(/'va L) Cells. Plant Physiol„ 102:165-172.

Zbell 8., and Walter-Back C. (1988). Signal transduction of auxin on isolated cellmembranes: lndications for a rapíd polyphosinositide response stimulated byÍndolacetic acid. J. Plant Physiol.,133:353-360.

92

CAPITULO 5

Conclusiones

Debido a las ventajas que ofrece un cultivo de raíces transformadas ya la disponibilidad de una línea celular de C. roseus previamente caracterizada enla Unidad de Biología Experimental, Ia actividad de PLC fue caracterizada en lalínea celular J1. Los resultados obtenidos en el presente trabajo derivan lassiguientes conclusiones:

A) La acti.vidad de PLC específica para fosfatidilinositol bisfosfato estápresente en extractos solubles y en extractos membranales en diferentes cultivosde tejidos de C roseus. Durante una curva de crecimiento de la línea J1, ambasactividades alcanzaron un pico máximo durante el inicio de la fase exponencial

8) La actividad de PLC en ambos extractos, membranales y solubles,fue dependiente de calcio a concentraciones micromolares.

C) La actividad de PLC presente en extractos membranales esespeci'fica para fosfoinosítidos monofosforilados y bisfosforilados, mientras que laactividad de la PLC presente en extractos solubles es específica parafosfoinosítidos no fosforilados y monofosforilados

D) El efecto que tienen los detergentes sobre la actividad de la PLC esdiferencial El octilglucósido fue el único detergente de los estudiados que tuvo unefecto estimulatorio sobre la actividad de PLC presente en ambos extractos

E) El protocolo establecido para la purificación parcial de la PLCpresente en extractos solubles y en extractos membranales permite obtener 5-6veces de purificación partiendo del eluato desalado de ambas fracciones Con esteprotocolo se obtienen en la preparación final varias proteínas cuyas masasmoleculares están en el rango de 55 a 75 kDa determínados por SDS-PAGE

93

CAPITULO 6

Perspectivas

Actualmente, es evidente que los constituyentes de la vía de losfosfoinosítidos, incluyendc) los fosfolípidos, inositoles fosfatos y las enzimas, seencuentran presentes en las plantas También es evidente que los medios por loscuales opera esta vía apenas comienzan a ser elucidados, tratando de encontrar suparticipación en mecanismos de transducción de señales a estímulos tales comoluz, fitohormónas, ataque a patógenos y estrés S.in embargo, hasta ahora no haemergido un esquema que defina claramente la posición de los elementos de estavía dentro de las células vegetales.

Aunque a lo largo de los años las investigaciones acerca delmetabolismo de los fosfoinosítidos han sido hechas basándose en los mecanismosque existen en células animales, es necesario enfatizar que esta vía podría nofuncionar en idéntica forma en plantas De cualquier manera, se tiene la ceneza deque esta vía en plantas pahicipa en varios procesos en los cuales se transfiereinformación intercelular e intracelular. Existe una lista de acciones futuras a seguir`

1. PURIFICACIÓN A HOMOGENEIDAD DE LA PLC DE C roseus Laacción inmediata a seguir es la purificación a homogeneidad de cualquiera de lasPLCs presentes en las ralces transformadas de C roseus considerando losantecedentes de este trabajo e incluyendo algún paso adicional. Uno de éstospodría ser la purificación mediante una electroforesis en gel preparativo, una vezidentificada la banda proteica (con anticuerpos comerciales contra alguna PLC deanimales) se cofta del gel y la proteína se electroeluye y concentra. Otra alternativasería una cromatografía de afinidad utilizando una columna con una matriz quecontenga acoplado un anticuerpo dirigido contra alguna de las regiones comunes alas PLCs de ammales, un anticuerpo dirigido contra la secuencia completa dealguna PLC de animales o bien algún ligando específico para um a la PLC (p ej.IP3). Para optimizar el grado de pureza, se puede realizar la combinación de ambasestrategias ya mencionadas seguida de la cromatografia de afinidad yposteriormente la electroelución de la proteína separada mediante el gelpreparativo.

2. PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS. La obtención de losanticuerpos puede hacerse directamente a partir de la banda proteica cortada yelectroeluída del gel, e incluso sin electroeluirla del gel Lo ideal es obtenerlos apartir de una proteína con un alto grado de pureza Los anticuerpos obtenidosserían útiles para realizar estudios de inmunolocalización /.n v/íro e /n v/.vo a nivelcelular o de tejido, o bien para determinar si existe expresión o activación de laenzima a lo largo del ciclo de cultivo

3, ESTUDIOS CINÉTICOS. Con la enzima pura se podrían determinarlos parámetros cinéticos de la enzima. El análisis cinético se realizaría de acuerdo ala cinética de dilución superficial descrita para las fosfolipasas y que incluye dos

94

reacciones: Ia primera es la asociación de la enzima con la superficie micelar y lasegunda es la catálisis interfacial de donde se obtienen los valores de Km y Vmax.Estos valores podrían ser comparados con los parámetros cinéticos reponadospara algunas de las PLCs, o bien servir como referencia en futuros estudioscinéticos con alguna PLC aislada de otra fuente vegetal.

4. SECUENCIACIÓN DE LA ENZIMA. La secuenciación de la enzimapermitiría conocer la homología qiie ésta presenta con las enzimas de célulasanimales y, como resultado, la clasificación dentro de la familia de PLCs Por otrolado, de la secuencia de aminoácidos se puede derivar el diseño deoligonucleótidos para la obtención del gen, mismo que sería útil para expresar laproteína ya sea en alguna bacteria o tejido vegetal mediante transformacióndependiendo de los fines a que se diriga la expresión.

5. EXPERIMENTOS DE RECONSTITUCIÓN. Con la enzima pura yalgunos de los elementos de transducción (receptores, proteínas G, mastoparan)de células animales se podría saber si esta enzima sigue el mismo mecanismo deacción que en animales Además, en estos experimentos se pueden incluirfitorreguladores para conocer su efecto sobre esta vía de transducción de señales.

6. EXPERIMENTOS DE MUTACIÓN. La clonación del gen de la PLCde plantas permitiría realizar experimentos de mutagénesis sitio dirigida, ya seapara conocer la función que tiene la enzima en la célula vegetal, o bien paraconocer los sitios de interaccion con los elementos del mecanismo de transducción.Esto se realizaría cambiando un aminoácido en particular o cierta secuencia deaminoácidos que parezca es requerida para alguna función de la enzima.

95

ffl`ffiüHffiü!Hmü!mmüiñmffi¡mñmr*íS üí®X~ íJx®~XB9 tíb€ Áj

ñmEmÑmmi-ELEiññEñ-EñüüiEmH

oEmm DE "vNlaAcm cl[NTl[10A D[ TllBATAN, A.c.

Ex-hacienda XcumpichAntigua carretera a Progreso Km. 7

Apartado Postal 87 C.P. 97310Cordemex, Yucatán