268 Vierteljahrsschrift der Naturf. Gesellschaft in Zürich. 1944

Datum:

18. XH. 1943 147 cm28. I. 1944 198 »

23. H. 286 »

26. HI. 28622. IV. 34330. V. 360 »

28. VI. 322 »

22. VH. 35022. VHI. 285

Es resultiert also nach beiden Messreihenein bleibender Firnzuwachs von ca. 3 Me-tern.

R o t o n d o -Hütte (2570 m). Schliess-lich hat auch Herr Dr. AMRIIHL wieder einevollständige Reihe von Messungen derSchneehöhe an dem von ihm aufgestelltenSchneepegel bei der Rotondo-Hütte beige-bracht, aus welcher wir folgende Schnee-höhen anführen:

Datum: Datum:

2. XI. 1943 5 cm 19. IV. 1944 360 cm15. XII. 45 » 5. V. 305 »

28. XII. 50 » 21. V. 285 »19. I. 1944 55 » 11. VI. 200 »

27. H. 175 » 6. VII. 75 »

3. HI. 270 » 16. VH. 20 »

5. IV 320 » 25. VII.

Résumé 1933-1944: Die Akkumula-tion setzte spät ein und erreichte mit na-mentlich in der ersten Februardekade undim März grossen Beträgen ungefähr nor-male Werte. Die Ablation wurde in denhöheren Firnregionen erst im ausserge-wöhnlich warmen August recht wirksam,vermochte daun aber den Winterschnee z. B.bei der unteren Claridenboje noch fast ganzabzutragen, so dass dort sozusagen keinFirnzuwachs resultierte, während er beider oberen Boje nicht ganz zwei Meter aus-macht, beides kleinere Beträge, als sie demlangjährigen Durchschnitt entsprechen.

Das Phasenkontrast-Verfahren nach ZERNIIïE

zur Untersuchung ungefärbter mikroskopischer PräparateVon

EMIL GANZ (Zürich)

(Mit 12 Abbildungen im Text)

(Ausführliche Fassung eines Referates, gehalten am 2. Sept. 1944 vor der Sektion Botanikan der 124. Jahresversammlung der S. N. G. in Sils.)

1. 1.1herslat

Nach dem Erscheinen des Elektronen-Mikroskops, welches die Auflösungskraftdes Lichtmikroskops gewaltig übertrifft,glaubte man wohl allgemein, dass die Ent-wicklung des Lichtmikroskops als abge-schlossen betrachtet werden könne. Es istder Zweck der nachfolgenden Mitteilungen,zu zeigen, dass diese Vermutung nicht zu-treffend war, dass vielmehr die Lichtmikro-skopie durch ein neues wichtiges Abbil-dungsverfahren bereichert wurde. Der er-zielte Fortschritt liegt indessen nicht

in der Erhöhung der Auflösungskraft, son-dern auf einem ganz andern Gebiet.

Die bisher bei mikroskopischen Unter-suchungen vorwiegend angewendete H e 11-feldbeleuchtung beruht darauf, dassdie verschiedenen Partien der untersuchtenPräparate in verschiedenem Masse Lichtabsorbieren; durch diese Lichtabsorptionwerden sie im mikroskopischen Bild sicht-bar. Bei lichtdurchlässigen Präparaten wirdder Kontrast durch Färbung herbeigeführt.Physikalisch gesprochen erfährt das Licht

Jahrg. 89 Mitteilungen 269

beim Durchgang durch dunklere oder durchgefärbte Präparatstellen eine Intensitäts-verminderung.

Soll ein farbloses, lebendes Präparat imHellfeld untersucht werden, ohne dass maneinen Eingriff in die lebende Substanz (Vi-talf ärbung) vornehmen will, so erhaltenwir bei Beobachtung im Hellfeld in derRegel unbefriedigende Resultate. Der Mi-kroskopiker hilft sich durch Verengern derKondensorblende und durch zu hohe oder zutiefe Einstellung des Mikroskoptubus. Diesich hieraus ergebende Kontrastwirkungwird aber erzielt durch Einbusse an Auf-lösungsvermögen, bzw. durch Einbusse anSchärfe.

Für die Untersuchung lebender farbloserPräparate wird deshalb mit Vorteil oft dieDunkelfeldbeleuchtung verwen-det, die in vielen Fällen vorzügliche Resul-tate ergibt, besonders wenn es sich um dieSichtbarmachung feiner Strukturen, wieGeisseln, Bakterien usw., handelt. Bei dieserBeleuchtungsart wird durch die besondereKonstruktion des Kondensors verhindert,dass direktes Licht in das Objektiv eintritt.Der Grund des Sehfeldes ist deshalb dun-kel; das hell leuchtende Bild der Struktur

entsteht nur durch das an ihr abgebeugteLicht.

Es liegt in der Natur der Dunkelfeldbe-leuchtung, dass im allgemeinen nur scharfeGrenzen zwischen Objektpartien verschie-dener Dicke und verschiedener Lichtbre-chung sichtbar werden, während fliessendverlaufende Übergänge nicht oder nur un-befriedigend dargestellt werden.

Auf die mikroskopischen Abbildungsver-fahren durch ultraviolettes Licht (Ultravio-lett- und Fluoreszenzmikroskopie) brauchtin diesem Zusammenhang nicht eingetretenzu werden.

Es hat dem Mikroskopiker bisher offen-sichtlich an einem Verfahren gefehlt, umlebende, farblos durchsichtige Präparate inoptisch einwandfreier Weise untersuchenzu köunen, ohne Beeinflussung der leben-den Substanz (Fixierung, Färbung). Demholländischen Physiker ZEBNIHIE ist es ge-lungen, diese Lücke durch ein neues Ver-fahren auszufüllen.

Dieses von ZERNTI c (1935, 1) als Phasen-kontrastverfahren bezeichnete neue mikro-skoplsche Abbildungsverfahren beruht aufeiner konsequenten Weiterentwicklung derklassischen Untersuchungen ARRE'S überdie mikroskopische Bilderzeugung.

2. Prinzip des Phasenkontrastverfahrens

Den Unterschied zwischen der Abbildungim Hellfeld und derjenigen mit dem Pha-senkontrastverfahren wollen wir der Über-sichtlichkeit halber an zwei einfachen Ob-jekten, nämlich an zwei Parallelgittern be-trachten, die in Abb. 1 im Querschnitt auf-gezeichnet sind.

Das eine Gitter (links, A. g.) bestehe ab-wechslungsweise aus hellen und dunklenStreifen, welche grosse bzw. kleine Licht-intensitäten durchlassen. In das Wellenbilddes Lichtes übertragen heisst das, dass dieAmplitude der Lichtschwingung ab-wechslungsweise gross und klein sei. ZER-

NInE nennt ein solches, mit der normalenBeleuchtung im Mikroskop abbildbaresGitter deshalb ein Amplitudengit -t e r. Es entspricht einem üblichen mikro-skopischen Präparat mit eigenen Kontra-sten.

Im Gegensatz dazu stellen wir uns einähnliches Gitter vor (rechts Ph. g.), wel-

ches aus ganz durchsichtigem Material be-steht und dessen Streifen nur durch dik-tiere und dünnere Schichten gebildet wer-den. Es ist ein Analogon für jedes unge-färbte, durchsichtige mikroskopische Prä-parat.

Das durchtretende Licht wird hier nichtwie vom Amplitudengitter mehr oder we-niger geschwächt, es erleidet aber eine an-dere Beeinflussung: Da in einem optischdichteren Medium, wie in unserem Objekt,das Licht langsamer fortschreitet als inLuft, ergeben sich in den verschieden dik-ken Teilen Gangunterschiede der Lichtwel-len, die über dem Objekt als Phasen-unterschiede erscheinen. ZEBNIK]Enennt deshalb ein solches Gitter ein P h a -sengitter.

Ein solches Phasengitter wird mit dernormalen Hellfeldbeleuchtung im Mikro-skop mit seinen Phasenunterschieden ge-treulich abgebildet, aber da unser Auge,

-I 0 +I

Ph.g.

-I 0 +I

Ag.

270 Vierteljahrsschrift der NaturF. Gesellschaft in Zürich. 1944

Ap.bl.Abb. 1')

Strahlengang im Mikroskop. Links: Hellfeld, rechts: Phasenkontrastverfahren.

Rg.bl.

wie auch die photographische Platte, nichtfür Phasenunterschiede, sondern nur fürAmplituden-(Intensitäts-)unterschiede emp-findlich ist, kann das Bild der Struktur desPhasengitters nicht wahrgenommen werden.

Durch das Phasenkontrastverfahren ge-lingt es nun, bei dünnen durchsichtigenObjekten die PhasenHnterschiede optischeinwandfrei sichtbar zu machen.

Üm die Arbeitsweise des Phasenkontrast-verfahrens zu verstehen, müssen wir kurzauf den Abbildungsvorgang imM i k r o s k o p (s. «Strahlengang» Abb. 1,Mitte) eintreten, wie er aus der Abbe'schenLehre der mikroskopischen Bilderzeugunghervorgeht. 2) Die Irisblende unterhalb desKondensors [d. h. die Aperturblende (Ap.bl.) in der Ebene EP (Eintrittspupille)]wird durch den Kondensor und das Ob-jektiv in der bildseitigen Brennebenedes Objektivs [mit Ap (Austrittspupille) be-zeichnet] verkleinert abgebildel. Wird nundas Präparat, in unserem Fall das Gitter G,in den Strahlengang gebracht, so wird dieseAbbildung der Blendenöffnung gestört.

1) Die Zeichnungen für die Abb. 1, 11und 12 wurden von der Schweiz. Lichtbild-anstalt hergestellt.

2) Eine ausführliche Darstellung findetsich in METZNER P., Das Mikroskop, einLeitfaden der wissenschaftlichen Mikrosko-pie. Leipzig und Wien, Franz Deutike, 1928.

Durch Beugung am Objekt wird das ein-fallende Lichtbündel in viele Beugungs-bündel (Maxima) zerlegt. Der Übersicht-lichkeit halber haben wlr im Schema nurfünf Bündel eingezeichnet (—II, —I, 0, +I,+II). Wir nehmen ferner an, dass ausserdem direkt durchgehenden Maximum 0von den abgebeugten Bündeln noch zweiBündel, die Maxima —I und +I in dasObjektiv eintreten. Wie das direkte Bündeldie Aperturblende bei 0 abbildet, so erzeu-gen auch die abgebeugten Bündel Bilderdieser Öffnung in der Ebene AP, die soge-nannten Beugungsbilder —I und +I.

Uns interessieren aber nicht die Bilder derBlende, sondern die Abbildung des Git-ters. ARRE hat indessen nachgewiesen, dassdas Bild des Gitters in der Ebene G' eineInterferenzwirkung ist aus den Lichtschwin-gungen aller Öffnungsbilder in der EbeneAP, und dass die Struktur eines mikrosko-pischen Präparates um so objektgetreuererfolgt, je mehr vom Objekt erzeugte Beu-gungsbündel vom Objektiv erfasst werdenund an der Bilderzeugung in der Ebene G'teilnehmen. 3) (Wem» wir den Strahlengang

3) Das Auflösungsvermögen des Mikro-skopes ist daher abhängig von der Grössedes wirksamen Öffnungswinkels, der nume-rischen Apertur des Objektivs, wobei dieVergrösserung nur von sekundärer Bedeu-tung ist.

Jahrg. 89 Mitteilungen 271

genau verfolgen, so sehen wir, dass dieÖffnungsbllder in der Ebene AP ausden von allen Gitterpunkten unterdem gleichen Winkel abgebeugten Strah-len, also den Bündeln des gleichen Ma-ximums entstehen, während bei der In-terferenz in der Bildebene G' alle voneinem Gitterpunkt abgebeugten Strahlen,also in unserem Schema die Maxima —I,0 und +I beteiligt sind.)

Das am Orte G' in der Luft entstehendereelle Bild wird schliesslich mit einer Lupe,dem Okular, betrachtet.

Llnks neben dem Strahlengang sind, inder Aufsicht, von unten nach oben 1. dieAperturblende Ap. bl., 2. über dem Ampli-tudengitter ihre in der Ebene AP erzeugtenBilder —I, 0, +I aufgezeichnet, und 3. zu-oberst die am Bildorte G' erzeugte Abbil-dung des Amplitudengitters A. g.

An Stelle des Amplitudengitters betrach-ten wir nun das Phasengitter im «Strahlen-gang» des Mikroskops. Auch bier wird daseintretende Lichtbündel in Beugungsbündelzerlegt, von denen die in das Objektiv ein-tretenden ebenfalls Bilder der Kondensor-öffnung in der Ebene AP erzeugen.

Auf Grund mathematischer Ableitungenkonnte ZERNIKIE (1942, 6) zeigen, dass beider Abbildung eines Phasengitters, dünneObjekte vorausgesetzt, alle a b g e b e u g-t e n Öffnungsbilder in der Ebene AP (alsoz.B. —I und +I) einen Phasenun-terschied von einer Viertel-w e l l e n l ä n g e besitzen gegenüber denentsprechenden abgebeugten Öffnungsbil-dern eines Amplitudengitters, während dasvom direkt durchgehenden Bündel er-zeugte Öffnungsbild 0 in b e i d e n F ä l-l e n gleich ist.

ZERNH9E zog hieraus folgende Konsequenz:Wenn es möglich wäre, diesen Phasenunter-schied der a b g e b e u g t en Öffnungs-bilder rückgängig zu machen, ohne dasdirekte Öffnungsbild in der Phasezu verändern, so wäre der Schwingungszu-stand aller Öffnungsbilder eines Phasenglt-ters identisch mit dem Schwingungszustandeines Amplitudengitters. Am Bildort G'würde dadurch die gleiche Interferenzer-scheinung erzeugt wie von einem Ampli-tudengitter, so dass auch vom Phasengitterein sichtbares Bild entstehen müsste.

3. Technik des Phase nkontrastverfahrens

ZERNIKE brachte in die Ebene AP der Öff-nungsbilder ein Glasplättchen mit einernur Bruchteile eines Tausendstelmillime-ters dicken Lackschicht, welche die Phasedes durchfallenden Lichtes um eine Vier-telwellenlänge ändert. Damit der Schwin-gungszustand des direkten Öffnungsbildes,der urigeändert bleiben muss, nicht beein-flusst werde, entfernte er die Lackschichtüber der Stelle, wo das direkte Öffnungs-bild erzeugt wird.

Nun erzielte er das vorausgesehene Re-sultat: Das völlig durchsichtige Phasen-gitter ergab ein sichtbares Bild mit hellenund dunklen Amplituden-Kontrasten. Eswar ihm gelungen, die Phasenunter-schiede in Amplitudendiffe-renzen umzuwandeln, so dassdünne oder schwach lichtbrechende Stel-len des Objektes mit einem helleren, dickereoder stärker lichtbrechende mit einemdunkleren Grauton abgebildet werden.

Bei weiteren Versuchen erwies sich, dassein kreisrunder Ring von bestimmten Ab-messungen die vorteilhafteste Form der

röffnung» sei. An Stelle der runden Iris-blende wird deshalb beim Phasenkontrast-verfahren eine Ringblende unterhalb desKondensors eingesetzt. Es zeigte sich f er-ner, dass es praktischer ist, die Phase desdirekten Öffnungsbildes um eine Viertel-wellenlänge zu verändern und die abge-beugten Öffnungsbilder unbeeinflusst zulasseu. In der Auswirkung kommt es aufdasselbe heraus.

Wir kehren nun zu unserem Schema(Abb. 1) zurück. Auf der rechten Seite, ana-log zur Darstellung auf der linken Seite,sind 1. die Ringblende Rg. bl., 2. über demPhasengitter die durch Beugung entstande-nen drei Bilder der ringförmigen Blendeaufgezeichnet, nämlich das mittlere direkte

. Bild 0 und links und rechts davon die abge-beugten, in der Phase verschobe-n e n Bilder +I und —I. Links darüber ist3. im Querschnitt eine verkittete Linse desObjektivs, zur besseren Sichtbarkeit ingrösserem Maßstab, dargestellt. Bei denmikroskopischen Objektiven • fällt die

272 Vierteljahrsschrift der Naturf. Gesellschaft in Züric. 1944

bildseitige Brennebene AP des Objektivsoft zwischen die Linsen. In diesem Fallekann das Phasenplättchen, wie in diesemQuerschnitt angedeutet, zwischen zweiLinsen des Objektivs eingebettet werden.Rechts daneben ist das PhasenplättchenPh. pl. in der Aufsicht und in der richtigenGrösse gezeichnet. Es muss nun lediglichdafür gesorgt werden, dass das Phasen-plättchen im Objektiv das direkte Bild derRingblende genau überdeckt, damit diePhase des ganzen O. Bildes geändert wirdund die Abbildung des Phasengitters zu-stande kommt, wie dies 4. in der obersten

weiteres Zusatzgerät ist das sogenannteHilfsmikroskop, welches an Stelle des Oku-lars in den Tubas eingesetzt wird, damitman das direkte Öffnungsbild in der bild-seitigen Brennebene AP vergrössert be-trachten und mit Hilfe von zwei Zentrier-schrauben mit dem Phasenplättchen zurDeckung bringen kann.

Ohne Präparat auf dem Objekttisch istder helle Ring, das direkte Bild der Ring-blende, auf dunklem Grunde deutlich sicht-bar. Schiebt man nun das Präparat in denStrahlengang ein, so erscheint der dunkleGrund etwas aufgehellt. Die Ursache hier-

Abb. 2Die Zusatzgeräte für das Phasenkontrastverfahren. 1. Der Phasenkondensor; links: von

oben, rechts: von unten gesehen. 2. rechts aussen: das Hilfsmiln•oskop.

Figur angedeutet ist. (Wenn wir von obenin ein abgeschraubtes «Phasen»objektiv hin-einsehen, so ist das Phasenplättchen alsleicht gefärbter Ring gut sichtbar.)

Die Durcharbeitung des Phasenkontrast-verfahrens für die Praxis erfolgte im Zeiss-werk. Köhler & Loos haben hierüber (1941,2) ausführlich referiert. Es wurden vierObjektive mit den Abbildungsmaßstäben10, 20, 40 und Immersion 90 entwickelt, diezwischen den Linsen ein ringförmiges Pha-senplättchen tragen.

In Abb. 2 sind die weiter benötigtenHilfsgeräte abgebildet. An den Kondensor,der wie üblich in die Schiebhülse des Be-leuchtungsapparates eingesetzt wird, isteine drehbare Metallplatte angebaut, welchezwischen leeren Öffnungen vier Ringblen-den enthält, die auf die Aperturen der vierPhasenobjektive abgestimmt sind. 4) Ein

4 ) Für das Forschungsmikroskop Lumi-pan, das mit einer pankratischen Beleuch-tungsanlage ausgerüstet ist, wird der Pha-senkondensor nicht benötigt. Es genügt hiereine einzige Ringblende, die in den Filter-

für ist die Unregelmässigkeit der Struktur,die den meisten Präparaten eigen ist: un-regelmässige Strukturen erzeugen zahl-reiche Beugungsbündel und somit auch ent-sprechend viele sich teilweise überlagerndeÖffnungsbilder.

Setzt man an Stelle des Hilfsmikro-skops ein gewöhnliches Okular in den Tu-bus des Mikroskops, so sind alle optischenKontinuitätsänderungen eines völlig durch-sichtigen Präparates scharf und kontrast-reich sichtbar. Der Wechsel von der Beob-achtung mit der Phasenkontrasteinrichtungzur gewöhnlichen Hellfeldbeleuchtung er-folgt dnrch einfaches Drehen der Blenden-platte auf eine leere Öffnung. Die Phasen-objektive können ohne Einschränkung auchfür die Beobachtung im Hell- und Dunkel-feld verwendet werden.

halter eingesetzt wird. Diese Ringblendewird durch das pankratische System in derbildseitigen Brennebene AP des Objektivsdurch Einstellen des Aperturringes in derden Phasenplättchen der verschiedenen Ob-jektive entsprechenden Grösse abgebildet.

Jahrg. 89 Mitteilungen 273

1. Besondere Merkmale des Phasenkontrastverfahrens

Mit dem Phasenkontrastverfahren wirdeine Kontrastwirkung im mikrosko-pischen Bild erzielt; sie entsteht durch eineoptische Differenzierung der Objekt-struktur nach Brechzahl und Dicke in derBildebene. Das neue Verfahren erzeugt ge-wissermassen eine künstliche «Färbung»des Bildes , nicht des Objektes. Die-ses optische Verfahren hat vor der Färbungdes Objektes durch Farbstoffe den Vorzug,dass es keinen Eingriff in das Objekt be-deutet. Es findet deshalb auch keine Ab-sorption von Licht im Objekt mit den be-kannten Nachteilen statt.

Eine gewisse Beschränkung ist dem Pha-senkontrastverfahren dadurch auferlegt, alsnur kleine Phasenunterschiedesichtbar gemacht werden können; es wirddeshalb mit Vorteil für dünne Präparateangewendet. Bei dickeren Präparaten kön-nen die Phasendifferenzen dadurch sichtbargemacht werden, dass sie in Einschlussmit-tel eingebettet werden, deren Brechungs-index nur wenig von demjenigen des zuuntersuchenden Objekts abweicht.

Da es in der Natur selten ganz reine Am-plituden- und ganz reine Phasenpräparategibt, so können mit dem Phasenkontrast-verfahren auch von Präparaten mit eige-nem Kontrast oder von gefärbten Präpara-ten oft bessere Bilder erzielt werden als mitHellf eldbeleuchtung.

Beim Vergleich der mikroskopischenBilder gefärbter Schnitte im Hellfeld undungefärbter Schnitte desselben Objekts imPhasenkontrastmikroskop sind in der Re-gel Unterschiede festzustellen, da der Gradder Anfärbung offensichtlich nicht von dengleichen Faktoren abhängig ist, welche dieKontrastwirkung im Phasenkontrastmikro-skop verursachen.

Die mit dem Phasenkontrastmikroskop er-haltenen Bilder sind insofern denen desElektronen-Abbildungsmikro-skop s ähnlich, als bei beiden Instru-menten der Kontrast abhängig istvon der Dicke der Strukturelemente.Ein Unterschied besteht hingegen darin,dass beim Phasenkontrastmikroskop dieKontrastwirkung noch abhängig ist vomBrechungsexponenten, währendbeim Elektronenmikroskop Unterschiede inder Dichte zur Darstellung kommen. DiePhasenkontrastbilder können deshalb beider Interpretation der Bilder des Elektro-nenmikroskops unter Umständen gewisseAnhaltspunkte geben.

Ein wlchtiges Merkmal des Phasenkon-trastverfahrens ist der Umstand, dass dielebende Substanz weder physi-kalisch noch chemisch beein-trächtigt w i r d. Dieser Vorteil ist auchder Dunkelfeldbeleuchtung eigen, währendbei allen andern Abbildungsverfahren dasObjekt durch künstliche Eingriffe oder Be-strahlung beeinflusst und unter Ümständenverändert wird (Fixierung, Färbung, Injek-tion, Ultraviolettbestrahlung, Vakuum, Elek-tronenbombardement) .

Ein weites und vielversprechendes Feldfür das Phasenkontrastmikroskop ist dieBeobachtung von Vorgängen inder lebenden Zelle; es kann bei-spielsweise auch der Verlauf von Reaktio-nen durch Einwirkung bestimmter Reagen-zien auf ein farbloses lebendes Objekt stu-diert werden. Derartige Vorgänge könnenauch kinematographisch festgehalten wer-den. So ist es K. MIGHEL (3) zum erstenmalgelungen, Kernteilungsvorgänge lebenderZellen in Zeitrafferaufnahmen mikrokine-matographisch wiederzugeben.

5. Vergleichsaufnahmen Hellfeld—Phasenkontrast

Die Bildpaare der Abb. 3-10 sind Repro-duktionen von Originalaufnahmen, die vonHerrn ED. BOSSHARD, Zürich, mit einer mi-krophotographischen Kleinbildeinrichtunghergestellt wurden. Die obere Aufnahmejedes Bildpaares zeigt das Präparat beider jeweils günstigsten Einstellung beiHellfeldbeleuchtung, die unter e bei An-

wendung der Phasenkontrasteinrichtung.In welcher Weise die möglichst gün-stige Kontrastwirkung bei den Hellfeld-aufnahmen erzielt wurde — ob durch extra-fokale Einstellung des Mikroskops oderdurch mehr oder weniger starkes Verengernder Kondensorblende — ist bei der Be-schreibung der einzelnen Bilder erwähnt.

274 Vierteljahrsschrift der Naturf. Gesellschaft in Züric. 1944

Die mikroskopischen Präparate fürdie Aufnahmen wurden von HerrnProf. Dr. HADORN, Zürich (Abb. 3 und4) ; Herrn A. BOSSART, Rheinfelden(Abb. 6, 7 und 8), und Herrn S. JoHo,Zürich (Abb. 9 und 10) in dankenswer-ter Weise zur Verfügung gestellt.

Abb. 3Eischlauch von Drosophila, Nativpräparat.

250 : 1.a) Kern der Eizelle;b) Kern der Nährzelle;c) Follikelepithel.

Objektiv Ph 40/0.65; Photo-Okular 6x.Zur bessern Sichtbarmachung dhs Ob-jektes wurde bei der Hellfeldaufnahmedie Kondensorblende auf etwas weni-ger als 1/3 der Objektivapertur zuge-

zogen.

Abb. 4Malpighisches Gefäss (Excretionsorgan).

Nativpräparat, 240: 1.Wandzelle mit Kern und Stäbchensaum

von Stabheuschrecke.Objektiv Ph 90/1.25 (homog. Olimmer-

sion); Photo-Okular 6X.Zur bessern Sichtbarmachung des Ob-jektes wurde bei der Hellfeldaufnahmedie Kondensorblende auf etwas weni-ger als 1/3 der Objektivapertur zuge-

zogen.

Jahrg. 89 275Mitteilungen

Abb. 6Lebende Spalthefen und Pilzfäden.

480: 1.Die Querwandbildung bei einigenSpalthefezellen ist beim Phasenkon-trastbild deutllch zu sehen. Man be-achte den die Querwandbildung andeu-tenden Doppelstrich bei der am linkenRande zunächstliegenden Hefezelle desuntern Bildes, sowie die linsenförmige,schon stark ausgebildete Querwand derzweitobersten Zelle in der Mitte des-selben Bildes und vergleiche diese Ein-zelheiten mit dem Hellfeldbild. Aberauch die Mycelfäden des Pllzes sind imPhasenkontrastbild besser dargestellt.Obwohl die Kondensorblende bei derAufnahme des Hellfeldbildes noch nichtübermässig stark zugezogen war, istdie Auflösung schon merkbar schlech-ter. Schliesst man sie mehr, wird auchdas Hellfeld etwas kontrastreicher. Dieim Objekt tatsächlich vorhandenenStruktureinzelheiten sind dann abernoch schlechter sichtbar und an derenStelle treten andere Gebilde, die sichbei genauer Beobachtung als blosseBeugungserscheinungen erweisen, miteiner objektgetreuen Abbildung desPräparates also nichts zu tun haben.

Objektiv Ph 40/0.65;Komplanatisches Okular 12X.

Abb. 5Lebende Epithelzelle der menschlichenWangenschleimhaut in Speichelflüssigkeit.

700: 1.Das scharf und mit richtiger Konden-sorblendenöffnung eingestellte Hell-feldbild zeigt kaum mehr als die Um-risse der Zelle. Im Phasenkontrastbilddagegen sind der Kern und der ganzeInhalt des Plasmas mit ausgezeichne-

tem Kontrast slchtbar.Objektiv Ph 90/1.25 (homog. Ölimmer-

sion) ; Photo-Okular 6X.

276 - Vierteljahrsschrift der Naturf. Gesellschaft in Züric. 1944

Abb. 7Lebende Milchsäurebakterien. 1350: 1.Der Unterschied zwischen Hellfeld undPhasenkontrast ist auffällig. Durchdas Druckraster sind beim Kontrast-bild die Einzelheiten innerhalb derBakterien, die auf dem Negativ derAufnahme als unterschiedlicheSchwär-zung deutlich zu sehen sind, leider fastganz unterdrückt worden. Beim Hell-feld sind die Bakterien durch stärkeresSchliessen der Kondensorblende bes-ser sichtbar gemacht worden. Das Er-gebnis zeigt sehr anschaulich, dassdiese Massnahme nur ein Notbehelf ist.Objektiv Ph 90/1.25 (homog. Ölimmer-

sion); Photo-Okular 6X.

Abb. 8Lebende Bier-Sarzinen von einer Platten-

kultur. 2160 : 1.Der Unterschied im Kontrast tritt deut-lich hervor. Dabei wurde bei der Hell-feldaufnahme zur besseren Sichtbar-machung der Sarzinen das Mikroskopetwas zu hoch eingestellt (der Mikro-skopiker tut dies in der Regel unbe-wusst). Die Sarzinen erscheinen des-halb unscharf und zu gross (man be-achte die Zwischenräume der Vierer-gruppe bei Hellfeld und Phasenkon-trast). Bei genauer Scharfeinstellungund richtiger Kondensorblendenöff-nung sind die Sarzinen im Hellfeldwegen ungenügendem Kontrast kaumzu erkennen; nach stärkerem Schlies-sen der Kondensorblende erscheinensie dunkelgrau auf etwas helleremGrunde. Da an den Rändern der Ob-jektstrukturen dann aber Beugungs-säume auftreten, ist auch auf dieseWeise keine befriedlgende, objektge-treue Abbildung zu erreichen. Im Pha-senkontrastbild dagegen werden dieSarzinen in den richtigen Abmessun-gen mit hervorragendem Kontrast und— trotz der angewendeten Überver-grösserung — mit guter Schärfe dar-

gestellt.Objektiv Ph 90/1.25 (homogene Öl-

immersion) ; Photo-Okular 9X.

Jahrg. 89 Mitteilungen 277

Abb. 9'Ganglienzelle aus Rückenmark (Ochse);

ungefärbtes Schnittpräparat. 675: 1.Durch Präparation geschrumpfte Zelle.Zellplasma, Zellkern mit Chromatin-schollen und vakuolisierten Kernkör-perchen sind im Phasenkontrastbildgut sichtbar. Bemerkenswert sind auchdie durch verschiedene Schwärzungs-grade wiedergegebenen Dichteunter-schiede. Im Hellfeldbild sind alle dieseEinzelheiten lrotz stärkerem Schlies-sen der Kondensorblende nur andeu-

tungsweise zu sehen.Objektiv Ph 90/1.25 (homogene Öl-

immersion) ; Photo-Okular 6X.

Abb. 10Wurzelspitze von Allium Cepa: I£ern-

teihmg; ungefärbtes Schnittpräparat.675:1.

Verschiedene Phasen der Mitose sindgut erkennbar (Prophasen und Ana-phasen). Ausserdem zahlreiche Ruhe-kerne. In den Anaphasen ist besondersdie tonnenförmige Spindelfigur bemer-

kenswert.Objektiv Ph 90/1.25 (homogene Öl-

immersion) ; Photo-Okular GX.

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278 Vierteljahrsschrift der Naturf. Gesellschaft in Zürich. 1944

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Abb. 11Erklärung eines Vektordiagramms.

6. Veranschaulichung der Wirkungsweise des Phasenkontrastverfahrens

Es bleibt nun noch zu erläutern, wiesodurch ein einziges Phasenplättchen die ver-schiedenen Phasenunterschiede eines durch-sichtigen Objektes ihrer Grösse entspre-chend in Helligkeitsunterschiede umgewan-delt werden können. Zur Veranschaulichungder von ZEINucE erstmals Air völlig licht-durchlässige Objekte durchgeführten Be-rechnungen benutzen wir die Vektorclar-stellung der Lichtwe llen.

In einem Vektordiagramm wird die Am-plitude einer Welle mit der Länge einesPfeiles, die Phase derselben mit der Rich-tung des Pfeiles angegeben. Eine ganzeWelle (Abb. 11) umfasst 360°, also einenKreis. Die Amplitude einer Welle, die eineGangdifferenz von einer Viertelwellen-länge (% λ) gegen die erste Welle aufweist,wird somit als Vektor mit einem Winkel

von 90° gegen den Vektor der ersten Welleaufgezeichnet.

ZERNHcE untersuchle nun die Lichtwellengleich nach Verlassen der Gitter (vgl. Abb.12). Bei beiden Gittern (Kolonne I) istdie durch die Gitterspalte gehende Wellemit dem Vektor OP gleich; beim Durch-gang durch die Stege' dagegen tritt eineverschiedene Beeinflussung ein. Beim Am-plitudengitter (A. g.) wird die Welle durchAbsorption geschwächt, der Vektor OP' istdaher kleiner als der Vektor OP. BeimDurchgang durch den durchsichtigen, aberlichtbrechenden Steg des Phasengitters(Ph. g.) wird die Welle zwar nlcht ge-schwächt, aber sie erfährt eine Verzöge-rung, ein en Gangunterschied (Phasenver-schiebung). Der Vektor OP" bildet dahermit dem Vektor OP einen kleinen, derGrösse der Phasenverschiebung entspre-

Abb. 12Die Vektoren über den Gittern und die Superposition des Vektors über den Stegen.

Jahrg. 89 Mitteilungen 279

chenden Winkel. Die Vektordiagramme derbeiden Wellenpaare sind in Kolonne II auf-gezeichnet. Die Vektoren des Amplitnden-gitters zeigen gleiche Phase, aber verschie-den grosse Amplituden; die Vektoren desPhasengitters gleiche Amplituden, aberverschiedene Phase.

Jeder Vektor kann auch als Summe vonzwei Vektoren dargestellt werden (Super-position), ähnlich wie eine Kraft im Paral-lelogramm der Kräfte durch zwei Kräftedargestellt werden kann. So lässt sich derVektor OP' über dem Steg des Amplitu-dengitters (Kolonne III) als Summe derVektoren OP und PP' darstellen, wobei PP'negativ ist. Der Vektor PP' entspricht derAbsorption. Ebenso kann der Vektor OP"dargestellt werden als Summe der Vekto-ren OP und PP", wobei PP" der Phasen-differenz enlspricht.

Für die Analyse der durch die Gilterbedingten Beugungserscheinung betrachtenwir die DarstellHng der Vektoren in Ko-lonne III, indem wir einerseits die Wir-kung der über den Stegen und Spaltengleichen Vektoren OP und andererseitsden. Einfluss der nur über den Stegen auf-tretenden kleinen Differenzvektoren PP',bzw. PP" untersuchen.

Die über dem ganzen Gitter gleichenVektoren OP sind von dessen Struktur un-abhängig und ergeben deshalb keine Beu-gung, sondern nur das direkte Bild (O. Ma-ximum) der EintrittspupilleEP in der EbeneAP (vgl. Abb. 1), wie wenn das Objekteine vollständig durchsichtige Platte wäre.

Dagegen erzeugen die kleinen, nur überden Stegen auftretenden Komponenten PP'bzw. PP" ein vollständiges Beugungsspek-trum.5) Wenn wir das schwache 0. Maximumdieses Beugungsspektrums gegenüber demviel intensiveren O. Maximum der VektorenOP vernachlässigen, so ergibt sich, dass dasO. Maximum aus den Vektoren OP, alle ab-gebeuglen Maxima —I, —II, ....; +I, +II... dagegen aus den Vektoren PP' bzw. PP"entstehen.

Wenn das Phasengitter nur geringe Pha-senänderungen erzeugt, d. h. wenn der Win-

5 ) Die abgebeuglen Bündel werden S pek-tren und die Gesamtheit der Bündel Beu-gungsspektrum genannt, weil das weisseLicht bei der Beugung spektral zerlegt wird.

kel zwischen OP und OP" in Kolonne IIklein ist, dann stehen die Vektoren PP"des Phasengitters (Kolonne III) nahezus e n k r echt (90°) zu den Vektoren PP' desAmplitudengitters.

In Kolonne IV sind die die Beugung er-zeugenden Vektoren PP' und PP" einzelnaufgezeichnet, beim Phasengitter ist ausser-dem die Wirkung von ZERNHfE's Eingriffdargestellt. Durch das Phasenplättchen '/awird der Vektor PP" (gestrichelt) um 90°gedreht (ausgezogen), so dass er die gleicheRichtung erhält, wie der Vektor PP' des Am-plitudengitters. Nun ist es verständlich, dassdie Phasenänderungen gewissermassen inAmplitudendifferenzen umgewandelt wer-den: Je nachdem, ob die Phasenverschie-hung kleiner oder grösser ist, wird auchder Winkel zwischen OP und OP" und da-mit auch der Vektor PP" kleiner oder grös-ser, trotzdem das Phasenplättchen das Lichtder abgebeugten Bündel stets um den glei-chen Betrag von 90° verändert.

Man kann auch die Phase des O. Offnungs-bildes (Abb. 1) entsprechend verändern unddas Licht der abgebeugten Bündel unver-ändert lassen. Dann sind die Vektoren allerBündel des Phasengitters wiederum denendes Amplitudengitters gleic. Das Vektor-diagramm stellt einfach einen anderen Zeit-moment der Schwingung dar.

Selbstverständlich werden durch das Pha-senkontrastverfahren auch Phasenobjektebeliebig unregelmässiger Struktur sichtbargemacht.

Die Zeiss'schen Phasenobjektive sind sohergerichtet, dass sie die Phase des O.öff-nungsbildes weniger verzögern als diePhase der abgebeugten Spektren, d. h. diePhase des O. öffnungsbildes wird relativ zuden abgebeugten Spektren beschleunigt.Dies ergibt positive Bilder, den p o s i t i-ven Phasenkontrast; d. h. kleinePhasendifferenzen werden mit helleren,grössere mit dunkleren Grautönen wieder-gegeben. Wenn die Phase des O. Bildesverzögert würde, so entstünden negativeBilder, der negative Phasenkon-trast ; d. h. leere Stellen im Präparat(der Grund) würden dunkel, Stellen mitgeringer Phasenänderung in einem dun-keln Grauton, Stellen mit etärkerer Phasen-änderung in einen helleren Grauton er-scheinen.

280 Vierteljahrsschrift der Naturf. Gesellschaft in Zürich. 1944

7. Hinweis auf die Originalarbeiten

In beiden Publikationen (1935, 1, und1942, 6) behandelt ZERNIKE die Entstehungdes Bildes des Gitters durch Interferenzin der Bildebene G' für die Fälle der schie-fen Beleuchtung (Schlierenmethode), derschiefen Dunkelfeldbeleuchtung, der zen-tralen Dunkelfeldbeleuchtung (nach SPIE-RER), der Hellfeldbeleuchtung mit engenBündeln und endlich des positiven und desnegativen Phasenkontrastverfahrens. DasResultat ist durch Intensitätskurven darge-stellt, durch welche die überlegene Ge-nauigkeit der Abbildung des Phasengittersbeim Phasenkontrastverfahren für ganzkleine Unterschiede in der Dicke veran-schaulicht wird.

Die mathematische Entwicklung wird inder zweiten Publikation veröffentlicht. Indieser werden ausserdem die Resultate vonUntersuchungen über verschiedene Blen-denformen der Kondensoröf.fnung für dasPhasenkontrastverfahren, sowie Versuchemit verschiedenen Arten von. Phasenplätt-chen bekanntgegeben.. Abschliessend fügtZERNIKE noch bei, dass das Verfahren fürganz kleine Phasendifferenzen empfind-licher gemacht werden kann, wenn die In-tensität des O. Bündels vermindert wird. Daswird dadurch erreicht, dass das Phasen-plättchen über dem O. Öffnungsbild gefärbt,also lichtabsorbierend gemacht wird.

K oh l e r und Loos (1941, 2) entwik-

keln eingehend eine streng durchgeführteErklärung der physikalischen Grundlagendes Phasenkontrastverfahrens in anschau-licher Weise. Sie zeigen, weshalb eine kreis-förmige Ringblende die günstigste Formder Kondensorblende für das Phasenkon-trastverfahren ist. In Wirklichkeit sind näm-lich die Öffnungsbilder nicht so schön ge-trennt, wie dies in den Schemata zur bes-seren Veranschaulichung angenommenwnrde. Die Beschaffenheit der Strukturender mikroskopischen Objekte veranlasstvielmehr Beugungsbilder, die sich starküberlagern. Würde man, wie üblich, alsKondensoröffnung eine Kreisfläche verwen-den, so würden viel grössere Flächenteiledes O. Öffnungsbildes von den benachbartenBeugungsbildern überdeckt und durch denEingriff in der Phase ebenfalls verändert,dadurch würde aber die Kontrastwirkungstark beeinträchtigt. Verwendet man dage-gen eine ringförmige Blende geeigneter Ab-messungen, so werden die Überlagerungender Öffnungsbilder auf ein Minimum her-abgesetzt. Ferner werden mikroskopischeAufnahmen gezeigt mit schlitzförmigenKondensorblenden, Vergleichsaufnahmenim Hellfeld, mit positivem und negativemPhasenkontrast und mit Dunkelfeldbeleuch-tung; iul weitereD Aufnahmen im Hellfeldmit richtiger, zu hoher und zu tiefer Ein-stellung, im Vergleich zur entsprechendenPhasenkontrastaufnahme.

8. Literatur über das Phasenkontrastverfahren

3.1941 K. MICHEL. Die Darstellung vonChromosomen mittels des Phasen-kontrastverfahrens.Naturwissenschaften, Jahrg. 29,Heft 4.

4.1941 W. Loos. Das Phasenkontrastver-

fahren und seine Anwendung in derMikroskopie.Zeiss-Nachrichten, 4. Folge, Heft 2.

5.1941 W. Loos. Das Phasenkontrastver-fahren nach Zernike als biologischesForschungsmittel.Klinische Wochenschrift, 20. Jahrg.,Nr. 34.F. ZERNIKE. Phase Contrast, a newmethod for the microscopic obser-vation of transparent obi ects.Physica Jahrg. IX, Nr. 7 u. Nr. 10.

7. 1944 H. KNOLL. Zur Anwendung der Pha-senkontrastmikroskopie in der Bak-teriologie.Zeiss-Nachrichten, 5. Folge, Heft 2.

1. 1935 F. ZERNIKE. Das Phasenkontrastver-fahren bei der mikroskopischen Be-obachtung.Zeitschrift f. technische Physik, Jg.16, Heft 11.

2. 1941 A. KÖHLER und W. Loos. Das Pha-senkontrastverfahren und seine An-wendungen in der Mikroskopie.Naturwissenschaften, Jahrg. 29, 6. 1942Heft 4.