Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk

analisis kualitatif dan kuantitatif. Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya)

dibedakan menjadi: Kromatografi fase normal dan fase terbalik

Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.

Prinsip kerja HPLC :Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke

dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-

komponen ampuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.

Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.

Sebaliknya, solute-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan

keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector

kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

Sistem Peralatan HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa,

alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung

buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram

skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak. Wadah fase gerak harus bersih dan lembam

(inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan

sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak

antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi.

Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,

polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal

(fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan

meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang

polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya

polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari

partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus

dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama

di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama

elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama

elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi

bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks

terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas. (2)

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik

adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan

asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering

digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang

terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan

fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.(3)

2. Pompa. Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert

terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja

tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu

memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak

dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang

digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20

mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk

menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,

reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa

dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran

fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan

sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan

konstan.(4)

3. Tempat penyuntikan sampel. Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara

langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom

menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup

teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal

4. Kolom dan Fase diam. Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional

dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase

diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai tiga keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding

dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase

gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih

ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya

jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel

klinis.

Pendekatan Analisis Kualitatif dan Kuantitatif (11)

Untuk menjamin kondisi yang digunakan dalam analisis kuantitatif stabil dan

reproduksibel, baik pada penyiapan sampel atau proses kromatografi, berikut

beberapa syarat yang harus dipenuhi dalam analisis kuantitatif :

- Analit (solut) harus telah diketahui dan terpisah sempurna dari komponen-

komponen lain dalam kromatogram

- baku dengan kemurnian yang tinggi dan telah diketahui harus tersedia

- prosedur kalibrasi yang sudah diketahui harus digunakan.

Untuk kromatografi planar, luas bercak (spot) atau kerapatan bercak dapat

diukur secara in situ atau dapat juga dilakukan dengan cara : bercak dikerok,

dilarutkan dalam pelarut yang sesuai, dan ditentukan konsentrasinya dengan

menggunakan teknik yang lain seperti dengan spektrofotometri UV, KCKT, dsb

Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan

standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

Keuntungan dan keterbatasan HPLCAda beberapa keuntungan HPLC, yaitu:1. Dapat menganalisis sampel yang tidak mudah menguap atau tidak stabil dengan

pemanasan.2. Interaksi yang lebih selektif dengan molekul sample kerena fasa gerak dan fasa

diam berperan dalam proses kromatografi.3. Berbagai jenis kolom yang selektif.4. Menghasilkan pemisahan dengan kecepatan tinggi.5. Waktu analisis yang cepat.6. Pemasukan sample yang tepat dan mudah dikendalikan sehingga menjamin

presisi kuantitatif.7. Resiko peruraian sample yang lebih kecil karena tidak dilakukan pemanasan.8. Keragaman kolom dan detector berarti bahwa selektivitas metode tersebut dapat

disesuaikan dengan mudah.Keterbatasan HPLC adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali jika HPL

dihubungkan dengan spektrofotometer massa (MS). Selain itu, keterbatasan lainnya adalah jika sample dianalisis sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit diperoleh.

DAFTAR PUSTAKAGritter, Roy J, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung: ITB

Bandung.Hendayana, Sumar, dkk. 1994. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. Semarang:

IKIP Semarang Press. . 2006. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. Bandung: PT Remaja Rosdakarya Offset.

Johnson, Edward L, dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB Bandung.

Bella, Lisa.2009. Skripsi ‘Optimasi Fase Gerak Laju Alir pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin dan Dextrometorfan HBr dalam Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatra Utara.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) | Chem-Is-Try.Org | Situs Kimia Indonesia |HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~ LansidaDasar Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC | BLoG kiTa