OANA GÂZA, TIBERIU B.SAVA, CORINA A.SIMION, CĂTĂLIN S.TUȚĂ

1

Datarea cu radiocarbon a aminoacizilor individuali separaţi prin metoda HPLC, din materialul osteologic

de la Curtea Domnească din Târgoviște

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Radioizotop – Carbon 14

2

12Carbon, 98.89%

6 protoni, 6 neutroni

13Carbon, 1.11% 6 protoni, 7 neutroni

14Carbon, <10-12% 6 protoni, 8 neutroni

T1/2 = 5730 ani

Izotopii Carbonului: instabil,radioactiv stabili

Radionuclid cosmogenic

Principala sursa naturala de C-14 pe pamant este reactia nucleara dintre neutronii din razele cosmice si azotul din atmosfera.

Organism viu 1mol 12C = 1mol 14C Organism mort

1mol 12C ˃1mol 14C

Ciclul 14C în natură

Radiția cosmică Neutron

14Azot

14Carbon Proton

Plantele adsorb CO2 și încorporează astfel 14C

Oamenii și animalele ingerează plante și astfel introduc în organism 14C

Electron

Descompunere beta

14Azot 14Carbon

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Datare radiocarbon material osteologic

Os1

~20% Organic Matrice

Celule ~80% Anorganic

Hidroxiapatita

~85-90% Colagen tip I

Aminoacizi

Materialul osteolgic este datat de obicei, prin masurarea radiocarbon a colagenului extras1.

Curatarea probei Spalare proba os cu apa Milli-Q; uscare la 60°C; mojarare

Demineralizarea 10 mL HCl 0.5 M ; centrifugare / aducere la pH = 7

Gelatinizarea 20 mL HCl 0.2M; agitare 15-24 h,80°C, 400 rpm

Filtrarea colagenului Centrifugare; Filtru Amicon Ultra

Liofilizarea - 45°C, 0.040mbar, 18 h

Extragerea colagenului2

1F. Brock, V. Geoghegan, B. Thomas, K. Jurkschat, T.F.G. Higham, ANALYSIS OF BONE “COLLAGEN” EXTRACTION PRODUCTS FOR RADIOCARBON DATING, RADIOCARBON, Vol 55, Nr 2–3, 2013, p 445–463 2R. Longin, new method of collagen extraction for radiocarbon dating, Nature, 1971, Nr. 230, pp. 241-242

3

“Procesul uzual de datare”

Pretratarea si tratarea probei fizic si fizico – chimic

extractia colagenului

Grafitizarea colagenului obtinerea grafitului

Presarea grafitului intr-un sistem special de inchidere

obtinerea catodului (sub forma unui con)

Incarcarea catodului in sursa sputtering cu ioni Cs si masurarea

C14 prin metoda AMS la acceleratorul tandetron 1MV

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Zeolitul este un mineral

microporos, aluminosilicat

4

Colagen Grafit

Captarea dioxidului de carbon in trapa de zeolit Eliberarea acestuia prin expansiune termica (450°C) Reducerea dioxidului de carbon la grafit pe

catalizator de Fe (500°C) in atmosfera de Hidrogen Amestec omogen: grafit:fier = 1:5 (mg)

Instalatia de Grafitizare Automata (AGE3)*

*L. Wacker, N. Nemec, J. Bourquin, A revolutionary system; Fully automated, compact and simple, Nuclear Methods in Physics Research B, vol. 268, 2010, p. 931-934. *N. Nemec, L. Wacker, H. Gaggeler, Optimization of the graphitization process at AGE-I, Radiocarbon, vol. 52, Nr. 2-3, 2010, p. 1380-1393.

Elementar* 3 coloane: 1.Coloana de combustie (900°C) - combustia totala a probelor organice in prezenta de oxigen; 2.Coloana de reducere (550°C) - reducerea gazelor formate anterior 3. Coloana de uscare umpluta cu Sicapent – retine apa Separarea CO2 din amestecul de gaze rezultat - transportul CO2 in AGE se face folosind Heliu – gaz purtator

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

5

Accelerator Tandetron 1 MV Cockcroft-Walton

Grafit Varsta Radiocarbon

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Rezultatul analizei este raportat in ani radiocarbon inainte de prezent.

“Prezent”= 1950 AD

Conservarea probelor

Influenta mediului inconjurator / contaminanti Osul / coalgenul

degradare > 90%

Nr de probe de oase poate fi redus considerabil

DATAREA AMINOACIZILOR - HPLC

In colagenul de tip I aminoacizi abundenti

o Glicina (Gly) – 33%

o Prolina (Pro) – 12%

o Hidroxiprolina (Hyp) – 10%

o Alanina (Ala) – 10%

o Acidul glutamic (Glu) – 7%

o Treonina (Thr) – 7%

6

Metoda noua: Datarea cu radiocarbon a aminoacizilor individuali separati prin metoda HPLC

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

COLAGEN HIDROLIZA

SEPARAREA AMINOACIZILOR

HPLC

GRAFITIZAREA AMINOACIZILOR

MASURARE AMS

ANALIZAREA DATELOR

*James S O McCullagh, Anat Marom, Robert E M Hedges, Radiocarbon Dating of Individual Amino Acids from Archaeological Bone Collagen, Proceedings of the 20th International Radiocarbon Conference, edited by A J T Jull, RADIOCARBON, Vol 52, Nr 2–3, 2010, p 620–634

Protocol de lucru pentru datarea aminoacizilor din colagen*

Etapele protocolului de separare a aminoacizilor din colagen

Schema de datare a aminoacizilor din colagen

7

HIDROLIZA

• 50 mg colagen HCl 6N, 110°C, 24h

• HCl este indepartat folosind evaporator rotativ (Genevac EZ-2)

• Se obtine un amestec de aminoacizi in stare vascoasa

COLECTAREA FRACTIILOR DE AMINOACIZI

EVAPORAREA FRACTIILOR COLECTATE

OBTINEREA INDIVIDUALA A AMINOCAIZILOR

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Metoda AA_apa_6mL(150 min) Debit: 6mL/min Faza mobila: Milli-Q apa

1-

Hid

roxi

pro

lina

2 –

Aci

d G

luta

mic

3 -

Tre

on

ina

+ G

licin

a

4 -

Pro

lina

5 -

Ala

nin

a

Mix standarde aminoacizi

*James S O McCullagh, Anat Marom, Robert E M Hedges, Radiocarbon Dating of Individual Amino Acids from Archaeological Bone Collagen, Proceedings of the 20th International Radiocarbon Conference, edited by A J T Jull, RADIOCARBON, Vol 52, Nr 2–3, 2010, p 620–634 8

Separarea aminoacizilor prin HPLC

Hydrolyzed collagen Colagen hidrolizat

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Standardele de aminoacizi au fost utilizate pentru a determina ordinea de elutie si timpii de retentie pentru aminoacid*

Contaminare controlata Probe*

Pentru contaminarea controlata s-a utilizat ulei

de mir, de diferite vechimi, de la Manastirea Hurezi

acest proces de contaminare s-a facut conform unor

idei originale din laborator si urmarind cateva idei

din literatura de specialitate, pornind de la

experienta manuscriselor de la Marea Moarta.

Probe

Eficienta separarii prin sistemul

HPLC

Contaminare controlata

Rezultatele obtinute pentru o parte din probele

necontaminate si contaminate, sunt prezentate in

slide-urile urmatoare.

*Anat Marom, James S O McCullagh, Thomas F G Higham, Robert E M Hedges, HYDROXYPROLINE DATING:EXPERIMENTS ON THE 14C ANALYSIS OF CONTAMINATED AND LOW-COLLAGEN BONES, Proceedings of the 21st International Radiocarbon Conference edited by A J T Jull & C Hatté RADIOCARBON, Vol 55, Nr 2–3, 2013, p 698–708

9

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Rezultate RoAMS vs HEKAL

10

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Proba Varsta radiocarbon (BP)

Interval calendaristic (cal AD)

Probabilitatea (%)

Colagen 189.50 (necontaminat)

614 ± 33 1293 – 1404 95.4

Alanina* 677 ± 18 1276-1306 1363- 1385

66.3 29.1

Prolina* 603 ± 18 1300 – 1369 1381 – 1404

74.7 20.7

Colagen 189.50 (contaminat)

479 ± 30 1408 – 1453 95.4

CAZUL M4 Pb. 189.50 Mormant descoperit in interiorul altarului bisericii paraclis de la Curtea Domneasca din Targoviste

Notatia * indica faptul ca proba a fost analizata la HEKAL

Rezultate RoAMS vs HEKAL

11

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

Proba Varsta radiocarbon (BP)

Interval calendaristic (cal AD)

Probabilitatea (%)

Colagen 191.50 (necontaminat)

709 ± 38 1224 – 1235 1242 – 1315 1356 – 1389

1.6 76.3 17.4

Hidroxiprolina* 713 ± 19 1264 – 1295 95.4

Colagen 191.50 (contaminat)

655 ± 31 1278 – 1325 1344 – 1394

45.5 49.9

Prolina* (contaminata)

704 ± 18 1267 – 1299 95.4

CAZUL M2 Pb. 191.50 Mormant descoperita la proximitatea mormantului M4, dar care suprapune fundatia absidei altarului Bisericii paraclis

Notatia * indica faptul ca proba a fost analizata la HEKAL

12

Izolarea si analiza aminoacizilor singulari din proteine pot oferi informatii suplimentare si date radiocarbon mai precise prin eliminarea contaminarii (in cazul de fata cu ulei de mir) si imbunatatirea preciziei de masurare;

Intervalele obtinute la calibrarea varstelor pot deveni compatibile cu plajele de valori estimate

de arheologi daca nu intervin efecte de dieta sau off-seturi care pot induce imbatraniri aparente ale varstei radiocarbon

Metoda de separare prin HPLC s-a dovedit a fi un instrument puternic care poate ajuta la rezolvarea problemelor arheologice prin datele suplimentare care pot diferentia off-seturile aduse de contaminanti de cele aduse prin alte mecanisme; in cazul celor doua probe de la Targoviste este valabil al doilea scenariu;

Cu toate acestea, separarea individuala, purificarea si datarea aminoacizilor din probele de

colagen (os) a fost / este un proces dificil.

CONCLUZII

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

13

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Fizica si Inginerie Nucleara Horia Hulubei Departament Acceleratoare Tandem, Laboratorul RoAMS

VA MULTUMESC PENTRU ATENTIE!