I SOLYMVARI All E

BY DE SOORT A&RoTis 5TOLONIFERA L.

LEO SOLDAAT

doctoraalverslag

plantenoecologie /populatiegenetica

februari — juni 1985

1111

1110

110 I

UI 0 Iii Ill I ill

•__—•I0

110

1111

11 ''I

0

11

11

I

I

''I

111

III

1111

I0

1111

101

I

Iii

IIll

III

111

llIll

I 111

101

I 00

0 1(11)

II 1101

o iiiii

I Ill

I II

[1 IIQI

00!

011 I

IIIII

IllIII

D 400

I SOLYM VARI All F

BY O .SOORT AGROTJS STOLONIFERA L.

LEO SOLDAAT

doctoraalverslag

plantenoecologie /populatiegenetica

februari — juni 1985

BEGELEI DING

plaritenoecologie:

Drs. C. Kik

populatiegenetica:

Drs. K. Wolff

Dr. R. Bijlsrna

RjksuniverSteit Groninc!Ofl

BibIothe3I( BIooIch ContrumKerklaan 30 — postbus 'I 4

9753 AA HAEN

Doktoraalverslag

Vakgroep Plantenoecologie R.U.G

Biologisch Centrum

Haren (Gn).

Doktoraalverslagen van de Vakgroep Plantenoecologie zijri internerapporten, dus geen offici1e pubflkaties.

De inhoud variert van een eenvoudige bespreking van onderzoeks-

resutaten tot een concluderende diskussie van gegevens in wijder

verband.

De konklusies, veelal sechts gesteund door kortlopend onderzoek,

zijn meestal van voorlopige aard en komen voor reken ing van de

auteur(s)

Overname en gebruik van gegevens slechts toegestaan na overleg met

auteur(s) en/of Vakgroepbestuur.

INHOUDblz.

1. SUMMARY 1

2. SAMEN VATTING 2

3. INLEIDING 3

3.1 milieuheterogeniteit en isozymvariatie 3

3.2 po1yp1odie 4

3.3 vraagstelling 5

4. POPULATIEBESCHRIJVING 6

5. MATERIAAL & METHODE 7

6. RESULTATEN 9

6.1 opbouw van de zymogrammen 9

6.2 isozymvariatie 12

6.3 temporele variatie in de ADH—expressie 16

6.4 po1yp1odie 16

7. DISCUSSIE 18

7.1 isozymvariatie 18

7.2 temporele variatie in do ADH—expressie 19

7.3 polyploTdie 20

8. LITERATUUR 25

9. BIJLAGEN 28

9.1 bijiage I 28

9.2 bijiage II 32

9.3 bijiage III 34

9.4 bijiage IV 48

1. SUMMI\PY

Isozyme variation in four populations of' Agrostis stolonifera L.

in contrasting environments was determined. The enzyme systems

assayed were GPI, EST, PGM, 6-PGD, ADH, IDH.

The variation in isozyme phenotypes between the populations was

great. Only one of' 127 phenotypes occured in two populations, All

other phenotypes occured. in only one of the four populations.

No correlation was found between environmental factors and iso—

zyme variation, indicating that the enzyme—systems analysed

were selectively neutral. The polymorphy-indices in the popula-

tions were about equal.

In one population the amount of different phenotypes was much

lower than in the other three populations. This most presumable

was the result of clonal reproduction. The low level of' genetic

variation due to clonal reproduction may partly be compensated

for by genetic variation (in the form of' differences in plody—

level) within clones.

Also temporal isozyme variation was discovered, During the second

electrophoresis ADH showed other phenotypes than during the first

electrophoresis. The most likely explanation of this phenomenon

is change of ADI-I-expression caused by environmental changes in

the greenhouse the plants were grown in.

A mechanism bringing about isozyme variation within clones and

within individual plants is discussed.

-1—

2. SAMENVATTING

In vier, in hun milieu contrasterende Dopulaties van Agrostis

stolonifera L. werd de isozymvariatie voor zes enzymsystemen

(GPI, EST, PGM, 6—PGD, ADH, IDH) bepaald.

Het aantal verschillende isozymfenotypen in de vier populaties

bleek groot te zijn. Slechts n van de 127 gevonden fenotypen

kwam in twee populaties voor. Alle andere fenotypen kwamenhooguit in n van de populaties voor.Er is geen relatie gevonden tussen milieufactoren en isozymva—

riatie, wat aangeeft dat de onderzochte enzymsystemen selectief

neutraal zijn.

De polymorfie-indices waren in de vier populaties ongeveer

even groot.

Het aantal verschillende isozymfenotypen was in ên populatie

veel lager dan in de andere drie. De oorzaak hiervan is waar—

schijnlijk de sterkere kloonvorming in die populatie. Deze

geringe mate van genetische variatieals gevoig van kloonvorming

kan gedeeltelijk gecompenseerd worden door genetische variatie

(in de vorm van p1odie-verschil1eh) binnen kionen.

Ook temporele isozymvariatie kwam aan het licht. De ADH—feno—

typen bleken bij de tweede electroforese meestal anders te zijn

dan bij de eerste electroforese. De meest waarsciüjnlijke ver—

klaring hiervoor is verandering van de ADH-expressie onder in—

vloed van het milieu in de kas waarin de planten groeiden.

Een mechanisme waardoor ook isozymvariatie binnen kionen en

binnen individuele planten mogelijk is wordt besproken.

—2—

3. INLEIDING

3.1 milieuheterogeniteit en isozymvariatie

Aan het eind van de zestiger jaren kwam de enzymelectroforese in

gebruik in do populatiebiologie. Dit gebeurde nadat gebleken was

dat isozympatronen genetisch genterpreteerd konden worden (15,

19). Het bleek dat de genetische variatie in natuurlijke popula—

ties veel groter was dan men altijd gedacht had. Sindsdien is er

veel gediscussieerd over de vraag in hoeverre het milieu, via na—

tuurlijke selectie, invloed heeft op de genetische variatie in

een populatie.

Veel onderzoekers komen theoretisch tot de conclusie dat in niet—

stabiele milieus de genetische variatie hoger moet zijn dan in

stabiele milieus. Voldoende genetische variatie maakt het voor

een soort mogelijk om tolerant te zijn tegen milieuveranderingen

en om in versehillende milieus te kunnen overleven. Echt.er, in de

meeste onderzoeken met betrekking tot de relatie milieuheteroge—

niteit — genetische variatie kan deze relatie niet bewezen worden.

Er zijn vrijwel altijd alternatieve interpretaties van de onder—

zoeksresultaten mogelijk. De mate van genetische variatie in een

populatie kan bijvoorbeeld beinvloed zijn door het reproductieve

systeem van de soort, genetische drift, migratie en andere facto—

ren.

Do rol van natuurlijke selectie in het handhaven van enzympolymor—

fin en het belang van specifieke milieufactoren als selectieve

krachten, kan vastgesteld worden door de adaptieve betekenis van

individuele enzympolymorfin vast te stellen. Hierbij is het van

belang te weten dat allozymen en isozyrnen vaak verschillende func—

ties hebben, veroorzaakt door:

— verschillen in kinetisch gedrag: bindingaffiniteit substraat—

enzym, maximale reactiesneiheid, stabiliteit onder hoge tem—

peratuur, etc.

— verschillen in drie—dimensionale vormenHet potentieel voor functionele differentiatie is dus aanwezig(16). Het zoeken naar relaties tussen milieufactoren en individu—

ele enzympolymorfin is tot nu toe echter niet erg vruchtbaar ge—

weest. Metabolische processen in eon organisme worden doorgaans

ook niet door én enzym bestuurd, maar door een groot aantal ver—

schillende enzymen, elk verantwoordelijk voor eon deelreactie van

het proces. Daarom zijn multi—locus benaderingen van de relatie

milieuheterogeniteit — enzympolymorfie van belang. Een dergelijk

multi—locus onderzoek is bijvoorbeeld uitgevoerd door Allard et.

al. (2,3,8,14) aan Avena barbata.

Ret onderwerp van dit onderzoek is de interactie tussen het milieu

en de isozymvariatie bij Agrostis stolonifera L. Ret onderzoek

werd uitgevoerd in het kader van het onderzoek van Kik, waarin

gekeken wordt naar de interactie tussen het milieu en een set van

gecorreleerde levenscycluseigenschappen bij een aantal in hun mil-

ieu contrasterende populaties van Agrostis stolonifera L.

3.2 polyplodie

Eên van de factoren diede mate van genetische variatie kan bein—

vloeden is het plodie-niveau van een soort. PolyploTde planten

kunnen een groter aantal allelen voor een locus hebben dan diplo—

de planten. Hierdoor kunnen polyplode planten meer en, in het

geval van multimere enzymen, nieuwe isozymen vormen (1,11,12,23,

24,25,29). Ret grote aantal isozymen in polyplode planten maakt

de genetische interpretatie van electroforesepatronen vaak moei—

lijk. Veel onderzoek is dan ook verricht aan diplode soorten.

Onderzoek bij polyplode plantensoorten naar de relatie tussen

het milieu en iso-/allozymvariatie is door verschillende onder—

zoekers verricht:

Allard et. al. (2,3,8,14,17,21,22) bijvoorbeeld, vonden bij

Avena barbata een correlatie tussen de frequentie van bepaal—

de allozymfenotypen en temperatuur- en vochtigheidsparameters.

In koperverontreinigde milieus vonden Wu et. al. (31,32) p0—

pulaties van Agrostis stolonifera L. met een veel groter aan—

tal verschillende isozymfenotypen dan in populaties in niet-

verontreinigde milieus. Z±j concluderen dat sterke selectie-

voorwaarden (koperverontreiniging) zeker niet per sê leiden

tot reductie van het aantal genotypen in een populatie.

Al Mouemar en uasquez (4) vonden bij Chenopodium album L. het

tegenovergestelde. In een met herbicide behandeld veld (sterke

selectievoorwaarden) bleek de polymorfiegraad lager te zijn

dan in een niet behandeld veld. Zij durven echter niet te con—

cluderen dat dit het gevoig is van selectie.

— —

l3rown et. al. (7) tenslotte vonden een relatie tussen allo—

zymfrequenties en bodemvochtgehaite bij tromus mollis L.

Doze relatie werd gevonden voor drie loci, echter niet voor

het ADH—locus waarvan juist eon relatie met het bodemvocht—

gehalte verwacht word.

Agrostis stolonifera L. is een a11otetrap1od of amphidip1od

(5,6), dat wil zeggen een soort met twee, onafhankelijk van el—

kaar overervende, diplode genomen. Bj$rkman (6) vo.nd bij Agros—

tis stolonifera L. naast tetraploiden ook penta-/hexa— en aneu—

p1oden. Aston (5) vond alleen tetrap1oden en hexaploiden. De

hexaploTden vond hij vooral in natte, productierijke milieus.

Kik en Linders hebben in de vier populaties uit dit onderzoek

planten met de volgende ploTdie-niveau's gevonden (18):

tetraploden (2n = LfX = 28)

pentaploden (2n = 5x = 35)hexaploTden (2n = 6x = )2)aneusomen (planten met een per cel varirend aantal

chromosomen)

In dit onderzoek zal nagegaan worden of er een relatie bestaat

tussen doze plodie-niveau's en het aantal gevonden isozymbanden.

Hierbij wordt er vanuit gegaan dat de mate van isozymvariatie good

gecorreleerd is met de mate van genetische variatie op de onder—

zochte loci.

3.3 vraagstelling

Do vraagstelling bij dit onderzoek luidt als volgi:

1. Hoe groot is do mate van isozymvariatie tussen en binnen vier

populaties van Agrostis stolonifera L.

2. [s er een relatie tussen hot p1odie—niveau en het aantal

isozymbanden.

—5-

4. POPULATIEBESCHRIJVING

De vier populaties waarin de isozymvariatie bepaald is, en een

karakterisering van hun milieu staan in tabel 1.

POPULATIE MILIEUFACTOREN

BV NC ZC BP

BUPGVALLEN hooiland + + - +

NOOPDPOLDERZIJL kwelder ÷ + + +

LAUWEPSMEEP : polder ± ÷ ÷ ±

SCHIERMONNIKOOG : duin — - - -

BV = %bodemvocht NC = nutrintenconcentratieZC zoutconcentratie BP = biomassaproductie+ = relatief veel + intermediair — relatief weinig

TABEL 1. De vier onderzochte populaties van Agrostis stolonifeia

L. en hun milieu. (gegevens naar Kik, unpubi.)

De kwelder in Noordpolderzijl wordt voor een gedeelte van het

jaar begraasd.

Het hooiland in Burgvallen wordt ên keer per jaar, in het najaar,

gemaaid.

—6—

5. MATERIAAL & METHODE

In april 1983 heeft Kik zestig planten verzameld uit elke popu—

latie (zie bijiage I voor de posities van de planten in het veld).

Deze planten staan sindsdien in plastic potten met een rijk grond-

mengsel in een kas. De temperatuur in de kas is nauwelijks te re-

gelen, maar schommelt meestal rond de 20°C. Ongeveer Lf5 van deze

planten uit elke populatie zijn elk twee keer gelectroforeerd.

Van elke plant werd 300 mg. jong bladmateriaal gextraheerd engelectroforeerd op de wijze beschreven door van Dijk en van Del—

den (9).

De gebruikte buffers zijn:

pH 7.0 0,1 M citraat met tris op pH 7.0 gebracht

pH 8.65 (poulik) 0,76 M tris met citroenzuur op pH 8.65

gebrachtpoulik tankbuffer 0,3 N H3B03 met NaOH op pH 8.1 gebracht

(wordt onverdund in de tank gedaan)

De gebruikte gels zijn:

6 % polyacrylamide, buffer pH 7.0 (voor GPI,PGM,6PGD,IDH)

7,5 % polyacrylamide, buffer pH 7.0 (voor ADH)

7,5 % polyacrylamide, buffer pH 8.65 (voor EST)

Na de electroforese werden de gels gekleurd bij 37°C. De gebruikte

kleuringen staan in bijiage II.

CHPOMOSOOMTELLINGEN

Kik en Linders(18) hebben van de meeste gelectroforeerde planten

het p1odie-niveau bepaald.

FENOTYPISCHE POLYMORFIE & GENETISCHE AFSTANDEN

Deze beide gootheden zijn slechts te gebruiken voor onderlinge

vergelijking tussen de populaties. Vergelijking met andere onder—zoeken is niet mogelijk omdat in dit onderzoek de monomorfe sys—temen niet in de berekening zijn meegenomen.

Be fenotypische polymorfie is berekend op de manier zoals beschre—

yen is door Kahler et. al. (17):

—7—

(Pd) voor een enzymsysteem in een populatie

P p(1 - = 1

= frequentie van het i—de fenotype

n = aantal fenotypen per enzymsysteem per populatie

De gewogen gemiddelde fenotypische polymorfie (P) over alle

enzymsystemen is:

k(1/N.)p.

_j=i

(i/N.)j=i 3

N. = totaal aantal fenotypen per j—de enzymsysteem

voor k enzyrnsystemen

De genetische afstanden tussen de populaties zijn als volgtberekend:

= de kans dat twee willekeurige fenotypen voor

een enzymsysteem in populatie X identiek zijn

J idem voor populatie Yyy

= de kans dat twee fenotypen identiek zijn als

de eeri geoen wordt ult populatie X en de

ander uit populatie Y

I = de genora1iseerde identiteit voor het enzymsys—

teem:

J- xy

\/7T1V XX yy

D de genetische afstand tussen populatie X en Y

= _iogIDe genetische afstand oP basis van meerdere enzymsystemen wordt

berekend met behuip van het wiskundig gemiddelde van J enJ voor die systemen.Xy

—8—

6. RESULTATEN

6.1 opbouw van de zymogranimen

In deze paragraaf zullen de zymogrammen (bijiage III) van de

verschillende enzymsystemen besproken worden in het licht van

hun mogelijke genetische basis.

Om een betrouwbare genetische interpretatie van de zymogrammen

te kunnen geven moeten kruisingsexperimenten uitgevoerd worden.

Dit valt echter buiten het kader n dit onderzoek.

Ret aantal polypeptideketens waaruit een enzym is opgebouwd is

overgenomen van Ferguson (10), die deze aantallen geeft voor

menselijke enzymen.

GPI (glucose fosfaat isomerase, dimeer)

Waarschijnlijk gaat het hier om twee loci waarvan de zymogrammen

vlak bij elkaar liggen of elkaar overlappen.Het ene locus geeft altijd een bandje op 4.0 cm. van de originen meestal nog n of misschien meer bandjes ervoor.Ret andere locus beslaat bijna alle isozymbanden vôôr 4.0 cm.

Dit locus heeft waarschijnlijk een groot aantal allelen.

— in enkele gevallen heeft een plant slechts n allel

(bijv. L31, L4l)

- meestal zijn meerdere allelen aanwezig waardoor veel

heteromultimeren gevormd kunnen worden.

Plant S36 bijv. heeft drie allelen: S,I en F en zou

genotype SIIF kunnen hebben. Daardoor kunnen de volgende

dimeren gevormd worden:

dimeren : SS SI IT/SF IF FF

verhouding: 1 : 4 : 6 : 4 : 1

zyrnogram : I U

Plant N42 heeft twee allelen (S en F) en genotype SFFF,

zodat de volgende dimeren gevormd worden:

dimeren : SS SF FF

verhouding: 1 : 6 : 9

zymogram : 9 1De meeste zymogrammen op dit locus zijn echter moeilijk te

interpreteren.

_0_

EST (esterase , mono— en dimeren)

De opbouw van de esterase zyrnogrammen is erg onregelmatig.

Aangezien af en toe planten voorkomen met slechts n isozymband

(bijv. S20, S22, S23) zou er sprake kunnen zijn van &n locus

met een groot aantal allelen.

PGM (fosfoglucomutase,rnonomeer)

PGM gaf twee activiteitsz5nes te zien die PGM—I en PGM—II genoemd

zijn. PGM—I gaf banden te zien inhet gebied 3.2 — L-.1 cm. vanaf

de origin en PGM—II in het gebied L.Lf — 5.1 cm. vanaf de origin.

PGM—II gaf meestal erg onduidelijke banden.

De opbouw van de PGM—I zymogrammen lijkt vrij eenvoudig. Er icomen

vier allelen voor, namelijic S, I, F en P. Ret F allel komt bij

elke plant voor, dus n genoom is waarschijnlijk gefixeerd voor F.

Ret andere genoom variert De verschillende genotypen leveren

de volgende zymogrammen op:

GENOTYPE ZYMOGRAM

1 FFFF

2 IFFF to3 11FF EJO! SFFF Li

5 SSFF U U

6 PFFF [1 I

7 PPFF on8 IPFF Ill9 SIFF

10 SPFFI B I

De zymogrammen voor penta— en hexap1ofde planten zijn hieruit

gemakkelijk af te leiden.

Aangezien zymogrammen Lf, 5 en 10 niet voorkomen en zymograin 9

vrijwel niet is het S—allel waarschijnlijk erg zeldzaana. Ock

het P—allel komt slechts zelden voor (350, N3, Ni', S8).

6—PGD (6—fosfogluconaat dehydrogenase)

Waarschijnlijk gaat het om twee loci. Het linker locus bestaat

vaak uit drie bandjes met af en toe een bandje er tussenin

(bijv. L3k). Dit wijst op een dimere structuur van het enzym.

- 10 -

Andere zymogrammen lijken dit echter tegen te spreken. Plant

S13 en SlLf zouden narnelik niet het fenotype (fill 1) moetenI 13

hebben, maar (fJIlfl), dus ook een heteromultimeer tussen band

2 en 3.

Met rechter locus vertoont altijd een bandje op 3.9 cm. vanaf

de origin en vaak nog n of twee bandjes daarvoor. Blijkbaar

is ên genoom gefixeerd voor het allel dat bandje 3.9 veroor—zaakt.

ADH (alcohol dehydrogenase, dimeer)

De isozymbanden op 2.1 en 3.1 cm. zouden afkomstig kunnen zijn

van twee verschillende loci. Isozyinband 2.6 is altijd erg zwak

gekleurd en zou veroorzaakt kunnen zijn door post—translationele

modificatje. De beide veronderstelde locj vertonen meestal n

allel, waarvan de mate van expressie variert (zie paragraaf

6.3). Af en toe is er een tweede allel aanwezig (L/+, L5, L3Lf).

Dit tweede allel resulteert echter niet in drie isozymbanden,

zoals bij een dimeer enzym verwacht mag worden, behalve in plant

N25 waar dat juist wêl het geval is.

IDH (isocitraat dehydrogenase, dimeer)

De zymogranimen zouden geinterpreteerd kunnen worden als het

resultaat van twee allelen (S en F) op n locus, waarbij n

genoom gefixeerd is voor het F—allel.

ZYMOGRAN VERHOUDING GENOTYPE

TETRA- j 131] 1 : 6 : 9 SFFF

PLOTD 0 I -- 1 : 2 : 1 SSFF'

PENTA- j 131 1 : 8 : 16 SFFFF

PLOTDI 9 13 4 : 12 : 9 SSFFF

UUI 9:12: 4 SSSFF

Echter, het fenotype ( I 131) komt ook voor bij tetraplode planten.

Moeilijk te verklaren S ook het feit dat nooit homozygoot F—indi—

viduen gevond.en zijn. Alleen plant B20 was homozygoot F, maar dit

is geen Agrostis stolonifera L. rnaar Agrostis tenuis.

Er is aangenornen dat bij een niet al te sterke kleuringsintensi—

teit de dunste isozymbanden onzichtbaar blijven. Dit betekent dat

C I 131) en ( 19) dezelfde fenotypen zijn ( zie bijvoorbeeld de

duplo's van plant N39, bijiage III).

— 11 -

6.2 isozymvariatie

Voor het bepalen van de isozymvariatie zijn planten met identieke

isozymfenotypen geclusterd. Hiervoor is gebruik gemaakt van de

enzymsystemen GPI, EST, PGM-I en IDEI. PGM—II en 6-PGD werden niet

gebruikt omdat de zymogrammen voor deze enzymsystemen vaak ondul-

delijk waren. ADH werd niet gebruikt omdat er grote verschillen

waren tussen de zymogrammen van de eerste en de tweede electro—

foreseronde (paragraaf 6.3). De werkwijze voor het clusteren was

als volgt:

a. Alle planten werden ingedeeld aan de hand van het PGI"l—Ifenotype. Daarbij werden de volgende fenotypen onder-scheiden (zie ook paragraaf 6.1):

FENOTYPE

SIFR1

I

2

3 H14 IL5 II!

Er is geen rekening gehouden met verschillen in kleurings-

intensiteit tussen de isozymbanden, omdat deze verschillen

niet altijd duidelijk waren.

b. Vervolgens werden per PGM-I fenotype de planten gescheiden

op grond van de volgende 1DM fenotypen:

F ENOT YP E

1

2 jon3 001If

c. Binnen de nu ontstane clusters werden de planten onderlingvergeleken voor GPI en EST.

d. De planten waarvan de duplo's voor PGM—I en/of 1DM nietnduidig waren, werden vervolgens met alle andere planten

vergeleken voor GPI en EST.

De verdeling van de PGM—I en IDH fenotypen over alle onderzochte

planten staat in bijiage IV.

Na de bewerkingen a t/m d bleven een aantal clusters over waarvan

alle planten voor elk enzymsysteem hetzelfde fenotype bezaten.

- 12 —

Aangenomen is dat de planten uit n cluster ramets zijn van

dezelfde doon. 1)it is waarschijnlijk, omdat:

— de planten uit een cluster vaak viak bij elkaar staan

in het veld (bijlage I)

- de kans dat twee planten na sexuele voortplanting voor

alle enzyrnsystenien hetzelfde fenotype hebben erg klein

is, gezien het grote aantal rnogelijke fenotypen voor elk

enzymsysteem

De samenstelling van de kionen in de vier populaties staat in

tabel 2.

POPULATIE KLOON RAMETS

A B4 B5 37 B8 B12 B13 318 B19 B22BUPGVALLEN

B2Lf B26 B27 B28 B33 B31 B35 B1O(hooiland)

B BlO Bli B15 B16 B23 B30 B31 B39 BLf2

C B6 321 B32 BL1.l B47

D B36 B46

E BI+3 B50

A N39 NL4.L4 N47 N48 NLf9

B N5 N13N15NOORDPOLDEPZIJL

c N3 N4(kwelder)

D N30 N31

E N35 N36

F N18 N22

G N8 N9

H N27 N28

A L12 L13 L20 L39 L42 LLi7 L50LAUWEPSEEP

B L30 L36 L40(polder) L23 L26

D L19 L22

E L14 L38

SCHIEPMONNIKOOGA S7 S9 Sb

B S2 S3(duin)

C S40 SLf2

D SLfL S'45

TABEL 2. Samenstelling van de kionen in de vier populatiesDe plaats van de planten in het veld is te vinden inbijlage I.

- 13 —

Het enige isozymfenotype dat in twee populaties gevonden is,

is het fenotype van plant B38 en L21.

Als maat voor de mate van kloonvorming in de pooulaties is ge-

nomen: 100 — (% verschillende fenotypen van het totaal aantal

bepaalde fenotypen). De getallen staan in tabel 3.

De mate van kloonvorming is in de Burgvallen-populatie dus dui-

delijk sterker dan in de andere drie populaties. In de discussie

wordt hier verder op in gegaan.

De polymorfie-index van de vier populaties is berekend aan de

hand van de enzymsystemen GPI, PGM-I en IDH (tabel 4),op de ma—

nier zoals die beschreven is in het hoofdstuk Materiaal & Metho—

de (blz.7). De enzymsystemen PGM—II, 6—PGD en ADH zijn niet ge—

bruikt om eerder genoemde redenen (paragraaf 6.2). EST is niet

gebruikt om de volgende twee redenen:

— Na de eerste electroforeseronde bleken er veel verschil—

lende isozymbanden te zijn voor GPI en EST. Hierdoor Wa—

ren de fenotypen van planten die op verschillende gels

geelectroforeerd waren, moeilijk te vergelijken. Bij de

tweede electroforeseronde is er daarom voor gekozen om

planten die bij de eerste ronde ongeveer hetzelfde GPI—

fenotype hadden, op ên gel te electroforeren. Zodoende

waren deze planten voor GPI goed met elkaar te vergelijken.

VoOr EST kon dit niet gebeuren omdat dat teveel tijd zou

kosten, zodat onderlinge vergelijking voor EST minder be—

trouwbaar is.

— Nadat in de kas waarin de planten groeiden met een insec-

ticide gespoten was, was elke EST—activiteit in de planten

— 14 —

POPULATIE AANTAL GEELEC— AANTAL VERSCFJIL-TPOFOREERDE LENDEPLANTEN FENOTYPEN

BUPGVALLEN 44 14 (31,8%)

NOORDPOLDEPZIJL 47 35 (74,5%)LAUWERSMEER 46 35 (76,1%)SCHIERMONNIKOOG 47 42 (89,4%)

% KLOON-VORMING

68,225,523,9

10,6

TABEL 3. De mate van kloonvorming in de vier populaties

verdwenen. Hierdoor konden in de eerste electroforeseronde

in de Lauwersmeerpopulatie geen EST—fenotypen bepaald wor—

den, en in de tweede ronde konden in geen enkele populatie

EST—fenotypen bepaald worden.

POPULATIE POLYMORFIE-INDEX (P.) (gewogen

GPI PGM—I IDH gemiddelde)

BURGVALLEN 0,787 0,504 0,455 0,499

NOORDPOLDEPZIJL 0,950 0,462 0,593 0,542

LAUWERSMEER 0,910 0,484 0,649 0,568

SCHIEPMONNIKOOG 0,96b 0,503 0,583 0,556

TABEL 4. De polymorfie-indices in de vier populaties.

Uit tabel 4 blijkt dat, ondanks de sterke kloonvorming in de

Eurgva11enpopu1atie (tabel 3), de fenotypische polymorfie in deze

populatie nauwelijks lager is dan in de andere drie populaties.

De genetische afstanden tussen de populaties voor GPI, PGM—I en

IDH en voor deze drie enzymsystemen samen staan in tabel 5.

POPULATIES GENETISCHE AFSTAND (D) D gemiddeldGPI PGM-! IDH

B — N -400 0,094 2,112 0,750

B — L —OQ 0,191 1,737 0,794

B — S —)oc, o,487 1,485 0,968

N — L —400 0,029 0,091 0,129

N — s —>oo 0,187 0,034 0,160

L — S -4o0 0,066 0,230 0,204

TABEL 5. De genetische afstanden tussen de populaties.

t3=Burgvallen N=Noordpolderzi ji L=Lauwersmeer

S=Schiermonnikoog. —>00 = gaat naar oneindig.

De genetische afstanden voor de drie enzymsystemen verschillen

nogal. Voor GPI gaan de afstanden naar oneindig. Dit komt door

de grote fenotypische polymorfie van UPI (tabel 4).

— 15 —

6.3 temporele variatie in de ADII—expressie

Veel onderzochte planten gaven bij de tweede electroforeseronde

andere ADH—fenotypen te zien dan bij de eerste electroforeseron—

de (bijiage III). Bijvoorbeeld de ramets van de grootste kloon

in de Burgvallenpopulatie (kloon A, tabel 2) gaven bij de eerste

electroforeseronde zonder uitzondering het fenotype ( J J ) te

zien. Bij de tweede ronde bleken de ADH—fenotypen tussen de ra—

mets behoorlijk te verschillen. In het algemeen was er bij de

tweede ronde meer activiteit op het rechter bandje dan bij de

eerste ronde (tabel 6).

POPULATIE VEPSCHUIVINGSRICHTING—R L— GEEN

BURGVALLEN 86 2 12

NOOPDPOLDERZIJL 8 L. 28

LAUWERSMEEP 57 0

SCHIERMONNIKOOG 27 11 61

TABEL 6. % van de gevallen waarin de ADH-acti--

viteit bij de tweede electroforese—

ronde naar rechts (— H), links (L —)

of niet (GEEN) verschoven is t.o.v. de

eerste ronde.

6.2+ po1yplodie

Van de zes onderzochte enzymsystemen zijn alleen GPI, EST en

PGM—I gebruikt voor hot bepalen van het aantal isozymbanden per

p1odieniveau (tabel 7). De overige enzymsystemen gaven te on—

betrouwbare resultaten (PGM-II, 6—PGD) of gaven een waarschijn-.

lijk niet variérend aantal isozymbanden (ADH, IDH). Vanwege het

kleine aantal penta— en hexaploTden (resp. 9 en 1) zijn deze

samen met de aneusornen als ên p1odieniveau ( >28) vergeleken

met de tetraploden (23).

De hypothese: er bestaat tussen do twee ploIdieniveau's geen

verschil in het aantal isozymbanden per plant

werd getoetst met de Mann—Whitney—U test. De resultaten staan

in tabel 7.

— 16 —

EN ZY M-

SYSTEEM

(x)

2

GPI

gem. aantal banden

p

AANTAL PLANTEN MET

13'VALLEN N'ZIJL

28 >28 23 >28

2

1/+

3

1

x ISOZYMBANDEN

L'MEER S'OOG

28 >28 28 >28

1

1

1 5 4

8 3 8 2

3 1 4 1

5 3 3

1 2

5,8 5,20,093

Aantal isozymbanden per plant voor twee verschillende

plodieniveau's in de vier populaties.

28 = tetrap1oden>23 = pentaplolden, hexaploden en aneusomen

P = kans dat het verschil tussen de gemiddelden

toeval is.

Bij i-=0,05 (5%) bestaat voor geen enkel enzymsysteem een verschil

in het gemiddeld aantal isozymbanden per plant tussen de twee plo—

dieniveau' s.

— 17 —

AANTAL ISO-

ZYMB A NJ) EN

2

31

2

1

7 5,70,090

(x) 28 >28

1

5,3 5,30,443

28 >28

EST 3

gem. aantal banden

P

5,2 4,6

0,077

28 >28

5 2

6 6

10 3

1

2,4 2,1

0,223

2 14

3 16

1

3,6 3,60,299

28 >28

5

11 2

1

1,8 2,0

0,298

(x) 28 >28 23 >28 28 >28 28 >28

PGn-I

gem. aantal banden

p

TABEL 7.

2 25

3 7

2,6 2,2

0,088

6 2

15 4

2

1,7 2,0

0,190

11 4 17 1

10 11 14 2

1,5 1,7 1,5 1,7

0,097 0,272

7. I)LSCUSSIE

7.1 isozyrnvariatie

Net feit dat elke populatie een unieke set isozymfenotypen heeft

(op het ene fenotype na dat Nurgvallen en Lauwersmeer gemeenschap—

pelijk hebben) wordt voornamelijk veroorzaakt door de isozymvaria—

tie voor GPI en EST. De variatie voor deze beide enzymsystemen was

veel groter dan voor de andere systemen (bijiage 111). Vandaar dat

de genetische afstanden voor (iPI veel groter zijn dan voor PGM—I

en IDH (tabel 5).

Er lijkt geen verband te bestaan tussen de gevonden isozymfenoty—

pen en het milieu. Een aanwijzing voor een dergelijk verband kan

pas gevonden worden als in een bepaald milieu n of enkele feno—

typen of isozymbanden domineren, zoals bijvoorbeeld werd gevonden

bij Avena barbata in Californi (3, 8, 21, 22). Bij deze haver—

soort vonden Allard et. al. n genotype dat meestal overheerste

in droge, warme gebieden. Ook binnen ên gebied met drogere en

nattere habitats bleek dit genotype vooral in de drogere habitats

voor te komen. Hoewel niet duidelijk was of natuurlijke selectie

aangreep op de onderzochte enzymsystemen zeif, of op nauw daaraan

gekoppelde systemen, bestaat in dit Avena—onderzoek zeker een ver—

band tussen het milieu en het isozymfenotype (in dit geval ook

het genotype).

Voor een dergelijk verband zijn in dit onderzoek geen aanwijzingen

gevonden. De onderzochte enz.ymsystemen zijn waarschijnlijk selec—

tief neutraal.

De kloonvorming in de Burgvallenpopulatie is duidelijk groter dan

in de drie andere populaties (tabel 3). De verspreiding van deze

klonen vindt plaats via de stolonen van de planten. In de kwelder,

waar korte stolonen gevormd worden, staan de ramets dichter bij

elkaar dan in het hooiland, waar langere stolonen gevormd worden

(bijlage I).

De sterke kloonvorming in Burgvallen (hooiland) geeft aan dat de

voortplanting daar voornamelijk vegetatief is. Vegetatieve voort—

planting heeft in het hooiland waarschijnhijk een voordeel ten op—

zichte van sexuele voortplanting. Door de hoge vegetatie kunnen

kleine kiemplanten immers gemakkelijk gebrek aan licht, water en

nutrinten krijgen en doodgaan. Jonge ramets echter zijn minder

— 18 —

afhankelijk van hun directe abiotische omgeving dan kiemplanten,

omdat zij nog via een stolon voedlngsstoffen van do adulte plant

kunnen krljgen (20).

Door de sterke kloonvorming in het hooiland is het aantal isozym—

fenotypen per opervlakteeenheid laag. Zo'n relatie tussen het

reproductieve systeem en de fenotypefrequentie werd bijvoorbeeld

ook gevonden door Uray et. al. (13) bij Puccinellia maritima. In

begraasde kwelders vonden zij sterkere kloonvorming dan in onbe—

graasde kwelders, waarschijnlijk omdat in begraasde kwelders mm-

der ruimte beschikbaar was voor kiemplanten. Het reproductieve

systeem bleek van invloed te zijn op de fenotypefrequenties. In

de, onbegraasde kwelders (sexuele reproductie) kwamen ongeveer

twee keer zoveel isozymfenotypen per oppervlakte—eenheid voor danop de begraasde kwelders (vegetatieve reproductie).Hoewel het aantal isozymfenotypen per oppervlakte—eenheid relatief

laag is in hot hooiland, is de fenotypische polymorfie (P, tabel Lf)

slechts weinig lager dan in de andere drie milieus. De oorzaak

hiervan is dat de polymorfie-index een gewogen gemiddelde is van de

polymorfie—indices van de verschillende enzymsystemen. hierdoor

tellen minder variabele systemen als i-'GM—I en IDH zwaarder mee dan

zeer variabele systemen als UP!. Dat do fenotypische polymorfie inhet hooiland, ondanks de sterkere kloonvorming, maar lets lager is

dan in de andere milieus, geeft aan dat de isozymvariatie tussen

de kionen onderling en de overige planten groot is.

7.2 temporele variatie in de ADi-i—expressie

In tabel 6 was te zien dat de ADH—activiteit tijdens de tweede elec—

troforeseronde naar rechts verschoven is ten opzichte van de eerste

ronde, Het enige verschil tussen de beide ronden is de periode

waarin deze plaats vonden. De eerste ronde duurde van 22/3 — 2LF/4,

de tweede ronde van 21/5 — 21/6. Tijdens de eerste ronde was de ge—

middelde temperatuur in de kas 20,3°C en tijdens de tweede ronde

23,6°C. Deze temperaturen zijn de gemiddelden over alle dagen,00 00bij per dag vier keer de temperatuur bepaald is (om 6. , 12.

18.00 en 24.°°h.). De standaarddeviatie was tijdens de eerste

ronde 2,0 en tijdens de tweede rondo 5,3. Naast een hogere gemid—

delde temperatuur was de variatie in de temperatuur tijdens de

tweede rondo dus ook hoger. Af en toe kwam do temperatuur boven de

40°C. Hierdoor was hot bodemvochtgehalte in de potten tijdens de

- 19 -

tweede ronde waarschijnlijlc lager dan tijdens de eerste ronde.

De planten zeif bevatten in ieder geval duidelijk minder water,

hetgeen bleek bij de bereiding van de extracten: na centrifugatie

bleef minder supernatant over dan tijdens de eerste ronde het ge—

val was.

Deze gegevens doen verrnoeden dat er een verband bestaat tussen

het isozymfenotype en het milieu, zoals dat bij Bromus mollis het

geval is (7). Het byzondere hier is echter dat er sprake is van

temporele variatie in de ADH—expressie binnen individuele plan—

ten.

Het hier beschreven fenomeen lijkt veel op wat Puvinsky et. al.

(26) alternation genoemd hebben:

PtAlternation is a nonmutational inheritable change

in the state (active inactive) of single or

multiple genes. "

Zij vonden binnen kionen van de watervlo Daphnia pulex variatie

in de expressie van G6PD. Deze variatie trad spontaan op n was

te induceren met behuip van glucose (27). De mechanismen waarmee

deze activatie — inactivatie bewerkstelligd wordt zijn nog niet

duidelijk.

Als er werkelijk een relatie bestaat tussen het bodemvochtgehalte

en de ADH—expressie is dat van adaptieve betekenis. Een plant is

dan minder kwetsbaar door schommelingen in het bodemvochtgehalte.

Misschien is dit verschijnsel verantwoordelijk voor de grote fe—

notypische flexibiliteit die Aston (5) vond in sommige populaties

van Agrostis stolonifera L. Deze populaties bleken zowel onder

natte als onder droge omstandigheden goed te overleven.Zie ook 3.

7. polyplodieEen toename van het aantal isozymbanden voor een enzymsysteem bij

een hoger ploTdie—niveau is in geen van de drie populaties gecon—

stateerd (tabel 7). Mogelijk is dit te wijten aan het kleine aan—

tal geteste planten en het relatief kleine verschil in plodie—

niveau tussen de twee testgroepen. In onderzoeken waarin wel een

groter aantal isozymbanden bij een hoger p1odie-niveau gevonden

werd ging het meestal om diplode en tetraploTde planten (12, 23,

25, 28, 29). Roose en Gottlieb (25) bijvoorbeeld hebben onderzoek

gedaan aan drie diploTde Tragopagon soorten (T. dubius, T. porn—

f'olius, T. pratensis) en hun tetraploTde hybriden (T. mirus en

- 20 -

P. miscellus). De diploden waren voor veel loci homozygoot. De

tetraploTden echter waren voor dezelfe loci vaak heterozygoot,

waarbij ze de isozymbanden van de beide dip1ode voorouders te

zien gaven en, in het geval van multimere enzymen, sozns ook

nieuwe isozymbanden.

Interessant is het voorkomen van meerdere p1odie-niveau's binnen

ê6n k],oon. Kloon A in de Burgvallenpopulatie bijvoorbeeld (de

eerste 17 planten in bijiage III) bevat twee tetrap1ode planten,

vier pentaploTden en tien aneusomen, De p1odie—niveau's van de

planten (overgenomen vai Kik & Linders,18) staan achteraan bijiage

I. Om te begrijpen hoe deze p1odieverschi11en kunnen ontstaan

moeten we eerst weten hoe de penta— en hexap1oden en de aneusomen

gevormd worden. Dit zou als volgt voorgesteld kunnen worden:

Tijdens de meiose worden niet alleen normaal geredu—

ceerde gameten gevormd, maar in sommige gevallen ook

unilateraal gereduceerde en ongereduceerde gameten.

Na samensmelting met andere gameten kunnen zo penta—

en hexap1ode planten ontstaan. Deze planten zijn

functioneel steriel (5, 6). In de loop van de tijd

vallen deze planten terug naar het tetraplo!de (en

fertiele) niveau. Tijdens dit proces kan een vari'é—

rend aantal chromosomen in de plantencellen aanwezig

zijn; de planten zijn dan aneusoom.

Tussen de ramets van n kloon kan hierdoor variatie in het aantal

chromosomen ontstaan, en ook binnen een aneusorne rainet bestaat Va—

riatie in p1odie—niveau tussen de plantecellen.

Theoretisch kunnen er tijdens het terugvallen naar het tetrap1o—

de niveau twee dingen gebeuren, die verschillende gevolgen hebben

voor de plant. Dit wordt duidelijk in het volgende voorbeeld:

VOORBEELD

De al1otetrap1ode plant met voor een bepaald locus

het genotype A1A2B1B1 (A,B = chromosoom van genoom

A, resp. 3; 1,2 = allel 1,2) zal bij een normale mel—

ose twee typen garneten vormen, namelijk A1B1 en A2B1.

Bij samensmelting met bijv. gameet A3B3 ontstaan twee

typennakornelingeri: A1AB1B en A2A3B1B3.

Wanneer echter plant A1A2B1B1 ook unilateraal ongere—

— 21 —

duceerde gameten vormt, ontstaan de volgende gameten:

A1A2B1, A1B1B1 en A2131B1. Na samensmeiting met gameet

A3B3 worden de nakomelingen A1A2AB1B3, A1A3B1B1B3 en

A2A331B133 gevormd. Deze pentapl&fde planten vallen in

de loop van de tijd terug naar het tetrapiode niveau.

De twee manieren waarop dat in z'n werk kan gaan zijn:

1.in aile planteieilen verdwijnt hetzelfde chromo—

soom. De pentap1oden vorrnen dan uiteindeiijk de

volgende tetrapio!de pianten:

A1A2A3B1B3 vormt A1A2B1B3 Of A1A331B3 Of A2A3B1B3

A1A3B1B1B3 vormt A1A331B3 Of AA3BB1

A2A3B1B1B3 vormt A2A3B1B3 Of A2A3B1B1

Plant A1A2B1B1 heeft flu dus vijftypennakornelingen.

2.in eike plantecel kan een ander chromosoom verdwij—

neri. Bijvoorbeeld uit pentapiod A1A2A3B133 ont—

staat een tetrapiod met drie typen celien (zie 1.)

oftewel een genetisch mozalek. In elke plant zal de

verhouding tussen deze typen celien anders zijn, zo—

dat een haast oneindig aantal typen nakomelingen

ontstaat.EINDE VOORBEELD

In de literatuur is over een dergeiijk proces niets te vinden.

Het voorkomen van genetische mozaTeken zou een verkiaring kunnen

zijn voor de kleine verschillen in het isozymfenotype van planten,

die regeimatig tussin de twee electroforeseronden gevonden werden

(zie bijv. het GPI—fenotype van Li, L2, L3, Lik, L19, LLi-l en vele

andere). Tijdens de eerste electroforeseronde is immers een andere

populatie van pianteceilen geêlectroforeerd dan tijdens de tweederonde.Of penta— en hexapialde pianten inderdaad terugvailen naar het

tetraplalde niveau en op weike manier dat gaat zal onderzocht moe—ten worden. Wat zon onderzoek ook op zal leveren, n ding staat

al vast, namelijk dat er genetische variatie (in de vorm van plo—

die—verschillen) mogelijk is binnen n kioon en zelfs binnen n

plant. De pianten die dit soort genetische variatie kunnen hebben

(pianten met een verhoogd pioidie—niveau) komen voornamelijk voor

in de Burgvalienpopulatie, zoals te zien is in tabel 8.

- 22 —

Hiervoor zijn verschillende verklaringen mogelijk:

1. Het milieu in de Burgvallen veroorzaakt een sterke

kloonvorming waardoor het aantal genotypen per opper—

vlakte—eenheid verlaagd wordt (blz. 19). Via de vorming

van planten met een verhoogd p1odie-niveau kan de po—

pulatie deze verlaging van de genetische variatie jets

compenseren.

2. Het vochtige milieu in de Burgvallen is op een of andere

manier verantwoordelijk voor het voorkomen van veel plan-

ten met een verhoogd ploIdie-niveau. Dit is niet zomaar

een hypothesem maar is gebaseerd op waarnemingen van

Aston (5) die bij Agrostis stolonifera L. vond dat hexa—

ploden vooral in vochtige milieus voorkwamen. Aangezien

de penta— en hexaploTden functioneel steriel zijn (5, 6)

planten zij zich vegetatief voort. Vandaar de sterke

kloonvorming in de Burgvallenpopulatie.

Deze twee verklaringen in een schema:

— 23 —

POPULATI E MILIEU % TETRAPLOIDEN

BURGVALLEI' hooiland

NOORDPOLDERZIJL kwelder

LAUWERSf4EER polder

SCHIERMONNIKOOG duin

% PENTAPLOIDENHEXAPLOIDENA NEU SON EN

19

70

63

90

81

30

37

10

TABEL 8. % tetraploden en % (penta/hexap1oden en aneusomen)

in de vier populaties.

Behalve voor de populatie kan dit soort genetische variatie ook

betekenis hebben voor individuele planten. Als een plant een

genetisch mozaek is, kan hij daardoor een grotere kans hebben

om milieuveranderingen te overleven. Whitham (30) vond bijvoor—

beeld bij Populus angustifolia dat planten met een (fenotypische)

mozaek—structuur voor bladoppervlakte een verhoogde resistentie

bezaten tegen eon parasiet.

Tot flu toe is weinig bekend over de in deze paragraaf genoemde

vormen van gnetische variatie.

— 24 -

8• LITERATUUP

1. Adams, W.T. & P.11. Allard (1977). Effect of polyploidy onphosphoglucose isomerase diversity in Festuca micro—stachys. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. vol. 74(4), pp.1652—1656.

2. Allard, H.W., G.IR. Babbel, M.T. Clegg & A.L. Kahler (1972).Evidence for coadaptation in Avena barbata. Proc. Nati.Acad. Sci. USA. vol. 69, pp. 3043—3048.

3. Allard, R.W., P.D. Miller & A.L. Kahler (1978). The rela-tionship between degree of environmental heterogeneityand genetic polymorphism. In: Structure and functioningof plant populations. Freysen, A.H.J. & J.W. Woldendorp.(eds.). New York: North Holland Pubi. pp. 49—73.

4. Al mouemar, A. & J. Gasquez (1983). Environmental conditionsand isozyme polymorphism in Chenopodium album L. WeedPesearch. vol. 23, pp. 141—149.

5. Aston, J.L. (1962). Evolutionary divergence in the Gramineae,with special reference to Agrostis stolonifera L.

6. Bjrkman, S.0. (1954). Chromosome studies in Agrostis. II.Hereditas (Lund). vol. 40, pp. 254—258.

7. Brown, A.H.D., D.P. Marshall & L. Albrecht (1974). The main-tenance of alcohol dehydrogenase polymorphism in Bromusmollis L. Aust. J. Biol. Sci. vol. 27, pp. 545— 559.

8. Clegg, M.T. & P.W. Allard (1972). Patterns of genetic dif-ferentiation in the slender wild oat species Avena bar—bata. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. vol. 69, pp. 1820-1824.

9. DIjk, H. van & W. van Delden (1981). Genetic variability inPlantago species in relation to their ecology. I. geneticanalysis of the allozyme variation in P. major subspecies.Theor. Appl. Genet. vol. 60, pp. 285—290.

10. Ferguson, A. (1980). Biochemical systematics and evolution.Blackie. Glasgow and London.

11. Gottlieb, L.D. (1973). Genetic control of glutamate oxaloacetatetransaminase isozymes in the dip1od plant Stephanomeriaexigua and its a1lotetraplod derivative. Bioch. Gen. vol.9, pp. 97—107.

12. Grant, J.E., A.H.D. Brown & J.P. Grace (1984). Cytologicaland isozyme diversity in Glycine tomentella Hayata (Legumi-nosae). Aust. J. Bot. vol. 32, pp. 665—677.

13. Gray, A.J.,, H.J. Pai-sell & R. Scott (19 ). The genetic struc-ture of plant populations in relation to the developmentof salt marshes. In: Ecological processes in coastal envi-ronments. Jefferies, P.L. & A.J. Davy (eds.), pp.43—63.

14. Hamrick, J.L. & P.11. Allard (1975). Correlations between quan-titative characters and enzyme genotypes in Avena barbata.Evolution. vol. 29, pp. 438—442.

15. Harris, H. (1966). Enzyme polymorphisms in man. Proc. Roy. Soc.Ser. B. vol. 164, pp. 298—310.

- 25 —

16. Johnson, j.B. (1976). Genetic polymorphism and enzyme function.In: Molecular evolution. Ayala, i".J. (ed.). Sinauer Asso-ciates, Sunderland, Massachusetts. pp. 46—59.

17. Kahier, A.L., P.W. Allard, M. Krzakowa, C.F. Wehrhahn & E. Nevo(1980). Associations between isozyme phenotypes and environ-ment in the slender wild oat (Avena barbata) in Isral.Theor. Appi. Genet. vol. 56, pp. 31—1+7.

18. Kik, C. & T.E. Linders (unpubl.). On the occurence of aneusomatyin the species Agrostis stolonifera L. and its possibleecological significance.

19. Lewontin, P.C. & J.L. Hubby (1966). A molecular approach to thestudy of genic heterozygosity in natural populations. II.Amount of variation and degree of heterozygosity in naturalpopulations of Drosophila pseudoobscura. Genetics. vol. 54,pp. 595—609.

20. Lovett Doust, L. (1981). rntraclonal variation and competitionin Panunculus repens. New Phytol. vol. 89, pp. 495—502.

21. Marshall, D.P. & P.W. Allard (1970 a). Maintenance of isozymepolymorphisms in natural populations of Avena barbata.Genetics. vol. 66, pp. 393—399.

22. Marshall, D.P. & P. W. Allard (1970 b). Isozyme polymorphismsin natural populations of Avena fatua and A. barbata.Heredity. vol. 25, pp. 373—382.

23. Mitra, P. & C.R. Bhatia (1971). Isozymes and polyplody. I.Qualitative and quantitative isozyme studies in the Triti—cinae. Genet. Pes. Camb. vol. 18, pp. 57—69.

24. Reddy, M.M. & E.D. Garber (1971). Genetic studies of variantenzymes. III. Comparitive electrophoretic studies of estera—ses and peroxidases for species, hybrids and amphidiplodsin the genus Nicotiana. Bot. Gaz. vol. 132(2), pp. 158-166.

25. iRoose, M.L. & L.D. Gottlieb (1976). Genetic and biochemicalconsequences of polyploTdy in Tragopagon. Evolution. vol.30, pp. 818-830.

26. Ruvinsky, A.O., Yu.I. Lobkov & D.K. Belyaev (1983). Spontaneousand induced activation of genes affecting the phenotypicexpression of glucose-6phosphate dehydrogenase in Daphniapulex. I. Intraclonal variations in the electrophoreticmobility of G6PD. Mol. Gen. Genet. vol. 189, pp. 485—489.

27. Puvinsky, A.0., Yu.I. Lobkov & D.K. 3elyaev (1983). Spontaneousand induced activation of genes affecting the phenotypicexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase in Daphniapulex. II. Glucose—induced changes in the electrophoreticmobility of G6PD. Mol. Gen. Genet. vol. 189, pp. 490—494.

28. Sheen, S.J. (1972). Isozyme evidence bearing on the origing ofNicotiana tabacum L. Evolution. vol. 26, pp. 143—154.

29. Smith, H.H., D.E. Hamill, E.A. Weaver & K.H. Thompson (1970).Multiple molecular forms of peroxidases and esterases amongKicotiana species and amphiploTds. J. Heridity. vol. 61,pp. 203-212.

- 26 —

30. Whitham, i.G. (19 ). Host manipulation of parasites: within—plant variation as a defense against rapidly evolvingpests. In:

31. Wu, L., A.D. Bradshaw & D.A. Thurman (1975). The potential forevolution of heavy metal tolerance in plants. III. Therapid evolution of copper tolerance in Agrostis stolonifera.Heredity. vol. 3Lf, pp. 165—87.

32. Wu, L. (1976). Esterase isoenzymes in populations of Agrostisstolonifera L. Bot. Bull. Academia Sinica. vol. 17, pp.175_l8Lf.

33. kot, . C., 3. STiLcovc G. Rcz A V. stac.iVacLiOfr, yd.WLv xooiC c 0svv cud-' csi 4-ov a c2-oc £I: -obc uitov&

c.o. ti-i. CrQw'orc (edc.. Arri Arbor

— 27 —

9 • BIJLAGEN

9 .1 bijiagel: De posities van de planten in het veld (Kik, unpubi.)

0')

c—i

-4t-. —r

0)(N IC') Li)•

(N(0

• •C,-)

•C'(N C')Li)

w(N S

(-'4CJ.—

— (y)

0)N.

•Li)I >

0)I-

CD

BIJLAGE Ta: De posities van de planten in de

Burgvallenpopulatie (hooiland).Ramets van dezelfde kloon hebben

dezelfde kleur (zie tabel 2).

— 28 —

'C",

S (N (N(N

('Si

(N

— 29 —

IIJLA(.iE Ib:

De posities vai

de planten in

de Noordpolder—

zijipopulatie

(kwelder).

Pamets van de—

zelfde kloon

hebben dezeif—

de kleur (zie

tabel 2).

(N (-v)If)

U)U)

"Jo

U)It)

(0 ON-

(N-4

1p

'C')U)

0)'(V.)

(D$(V'-4

(V.)(V.)

cD0) (0

(N

It)(N

.4(N

(N CDI—0')

(N

U)

CD0)

(0

NJL.

-o

00'000z

[cD - - -T.U)

I*UD 14)

cD c3)•

NN iD U)

() (_)

(Nr) m () (N (N

'-U(N

(N Q-)(N -,

0• iJ)3(N 0) a)

• .CD

C..-. (0 a)

LI)

_______

-J

BIJLAGE Ic: De posities van de planten in de

Lauwersmeerpopulatie (polder).

Rainets van dezelfde kloon hebbendezelfde kleur (zie tabel 2).

— 30 —

(j-n3-

3o3 —

0 — —o 10

NJ. tOC)

0)NJ

C-,,

NJ C-fl(0 - £- CD

(i).(J1 0'

(Aj C-flNJ 0) 0)

(0NJ

(A) .L)01 0)

0)

(A)

Li

(0

BIJLAGE Id: De posities van de planten in de

Schiermonnikoogpopulatie (duin).

Pamets van dezelfde kloon hebben

dezelfde kleur (zie tabel 2).

— 31 —

9.2 bijiageIl: Overzicht van de gebruikte kleuringen.

(WI (glucose fosfaatdehydrogenase)

30 ml Tris—HC1—MgC12 (0,1M), met tris op

pH 7,5 gebracht+5mg NADP10 mm, in:

50 mg Fructose—6—fosfaat

6 mg MTT

0,03 ml Glucose—6-fosfaat dehydrogenase

na 10 mm.toegevoegd: 1 mg PMS

EST (esterase)

30 mm. in fosfaatbuffer (0,1M), pH 6,5

(30 ml Fosfaatbuffer (0,1M), pH 6,5na 30 mm. in:

20 mg Fast Red

5 mg — naftylacetaatI ç opgelost in 0,5 mlL 5 mg (3 — naftylacetaat S aceton

PGM (fosfoglucomutase)

(30 ml Tris—HC1—MgC12 (0,1M), pH 7,5

5 mg NADP10 mm. in: 60 mg Glucose—1-fosfaat

6mg MTT

L 0,03 ml Glucose—6—fosfaat dehydrogenase

na 10 mm.toegevoegd: 1 mg PMS

6—PGD (6—Fosfogluconaat dehydrogenase)

(30 ml Tris—HC1—MgC12 (0,1M), pH 7,5

5 mg NADP30 mm. in:

6 mg 6—Fosfogluconaat

L 6 mg

na 30 mm.toegevoegd: 1 mg PMS

ADH (alcohol dehydrogenase)

(30 ml Tris-HC1 (0,05M), p1-i 8,5

30 mm. in: 6 mg NAD1 ml Ethanol

6mg MTT

— 32 —

na 30 mm.toegevoegd: 1 tug PMS

IDH (isocitraat dehydrogenase)

(30 ml Tris—HC1-MgC12 (o,1M), pH 7,5

I 5mg NADP30 nun, in:40 mg Na-isocitraat

6 tug MTT

na 30 mm,toegevoegd: 1 mg PMS

- 33 -

9.3 bijiage Ill: Isozymfenotypen en ploTdieniveau's

isozymfenotypen

Elke plant is twee keer g&électroforeerd. De eerste keer (in de

periode 22/3 — 21-f/4) werd het bovenste fenotype gescoord, de

tweede keer (in de periode 21/5 — 21/6) het onderste fenotype

dat achter elke plant staat.

De betekenis van de tekens is als volgt:

aanwezigheid van de isozymband is niet zeker

I isozymbarid met lage kleuringsintensiteit

0 isozymband. met matige kleuringsintensiteit

I isozymband met sterke kleuringsintensiteit

U brede isozymband met matige kleuringsintensiteit

I brede isozymband met sterke kleuringsintensiteit

wel kleuring, maar het aantal betrokken isozymbanden is niet

duidelijk

kleuringszOne met plaatselijk sterkere kleuring

grens van de kleuringszOne onduidelijk

Ui.kleuringszone die waarschijnlijk uit (in dit voorbeeld) drie

isozymbanden bestaat

Bij elk enzymsysteem staat de afstand van minstens ên van de

isozymbanden tot de origin (links van de banden) aangegeven in cm.

De onderlinge afstanden tussen de banden, vermenigvuldigd met een

factor l,Lf komen overeen met de onderlinge afstanden op de gels.

Niet alle enzymsystemen gaven even goede resultaten. het volgende

tabelletje geeft een overzicht van de betrouwbaarheid van de

gescoorde isozymfenotypen:

GPI EST PGM—I PGM—II 6—PGD ADH IDH

electroforese + + + + + ÷ +

e2 electroforese + ÷ ÷ — — + +

+ = betrouwbaar÷ = rninder betrouwbaar

— = niet betrouwbaar

- 3L -

p1odie—niveau' s

Voor elke populatie staat aan het eind van de lijst met isozym-

fenotypen in die populatie de ploTdie—niveau' s (overgenomen vanKik ? Linders, 18).

De betekenis van de tekens is als volgt:

o tetrap1od0. tetrap1od of aneusoom

El pentap1od0 pentap1od of aneusoomV hexaploTdV. hexap1od of aneusoom• aneusoom

- 35 —

IV/LLI\ / HOOILFj&PI EST PGM -PGD ADH IDHI

.0 .8 '(.4

H II II ID 01 lID10 III 1011 0 11 1101

01 1 i 11 111 ii 11

Dl I I II III 1110 II 0 001

Bi II DII I ID III lIDII III lOll 11 I

138 :1! ID 01 I II0 I I III IOU II I 001

II VI. I I Il 111 lID111 III IOU DID 0111II 0111 1101 1111. I I III III 100 DI I VII

l UI UI I I ID DI DIII 10 1111 001

l0U DIII III 11111 DII 0111

1111 III I I ID II 1101 ID II 0 DVI

IDD 01 I I 10 III 10 DID VOl

1111 DI I I 10 0 I DIII ID 1111 001

Ill11 Dl I I ID III ID 0111 001

till DI I I III DI 001 lOll lID 0111

IDII DI I I Ill III ID 010 001

Dl DI I I ID III 0111 00 110 001

II Ill 11 IV! 0 111 0111

• Bzj I 11 I ill I I ID DI 1101 00 lID DIII

DI I I 10 III II OIl 001

1111 DI I I ID DI 11111 DII lID DIII

II ID 11 III! ! I 0 1101

33 IDI DI I I 00 DI 0111 iD II 11 ODI

111 I I ID III ID 1110 DIII

1111 III I I 011 DI 011! 0 1111 1101

II III 11 101 010 001

1111 III I I 011 II I 001 0 I I 0 001

tOO DI I I ID III 10 DII DIII

1111 flu I I 00 01 001 V 110 001

I I I 0 VI 000 10 I

III lID lIlfl III 1111

— III 0 III 01111 J I I

- 36 -

I I

I

I I

I

I

I

I

I

I

I

I

I I

I I

I I Ill (Oil 11 Ill 0 (III

Bis II 11 01 0011 I I

I 110 I0!I 0 DII (DI

Bi 001 11 DI I I U I I lOll 11 I 101

III 1101 1111 II Ii 11 0(1123 II II Ol DID II lilI a I 11111

3O

II

OIl11 III

0 0!

lID

IlO

I I

III

lilt0

11 ..

I Ill.0 .

...i

iiiI III 11 I 000 (0 liii Ill Ill 1111

liii 0 01 (III II III! 0 I (Ill

BIII1100III0011

I

VOl

11 II

0V0

I

lb

00

1100

I

II(0

(lUll0

I

fIll

JIll

U

ID

1.11(00

U .

1111

I

11(11

I

0 .1. 11

,

(00

...._.i

101

(01

BC

fl

B4

(II III I I

I 11 I

HI110I

I I I

I I I

...

I

(0

(11

10

(DI

III

. .

(III

100

101

1110101

1111 .

IOJ

.

.

.

.

.....

. 0111

III I

lIDIII I

HiI] .1 I

I I U .

:_..J

1101

DIII.

1101

I11L.±ii0111

DOI

B1

B3

B'i

I I I

I I I

III

II I Il IIIII l

I

IOU

110

011

III

1111

10

Ill

III

1111

UI

DI

II

.

00

IOU

(110

1111

1111

III

ID

11

ID .

111011,

.

.

;

01 I

. I I

oil.

.

lID1111

:.. $1.11

OIl..

.

DIII

Ill

IoU! 1101..Oil

III i

1111! .....i.._1

1111 11.__11

6

B

83

B

I OHl11j I0( I

IOU! II(Ill! I

OIII IIIIII

III 1

.

110111

DIIIII 11

11111! LU

.

OI I II

..

(80

IOU

ID

10

1111

110

ID

DI

.10

III

.11 I

Al

ill

III

I

IIIUI

Ill .

Ill

II

Ill

0

.

.

.

.

1

.

UI

0111.

lID.11(11

11

11 Vi.

0 I 11

.

.

l0l1/.IIOL..

.

.101;

.1111 ......J

OOI

III I I DI I II 111 III III 11 I 111 001 1

3? —

Ill

ID

ID

Ill

10

ID

10

(11

00

ID

III III 11:10: III III

H J ( ID 0 11. I 08

(Acosic . 81 11 0 11 I 8 0

0 00 ItO 0

L B 108011 III 11 0 I I 8 I 101

1 11111. U I 0 Jil( 0JII .18 OIl II8 lID Oil

.. II I I 8 81 8 11111.II . . 18:81 ID VI 0 18118 JillIIII till.

0 Oil tat/too

11011 DI II U I 10 81110Ili (1 8 11 II U 801

1(11.111 .. ill 11 II 0111

(tIll II 10 11 01 081Il II . II I 11I 0 11 111(0 tot

ii 01 lilt I 8 18(/180

PLOoe PLQo

L... B. 0. a.

B3

83 0 BBs

H.. B . .. B

.. .B •

L.. s o .

L . Bct

L . .a. I;Icc

H0

H • Bc;

H •

. .B1. 0

H

— 38 —

GPI EST/ KVJLD

AD Loll

NOO RDPOLOER7YL

P&Mi it

Ni

.o4.((III

4.04

11(11

$94, 1

11110 I 0

3.+II &"

8I fill 0 0 Ii UI 1101 0 U II (00

N2. II11 DI III 0 11 I (00H I U 11 11(0 lUll

N3 I I I (DI Ill II I I LU

Ij 0 11 • III! 01¼14 II I 1 (UI 11 (I 1110 to

j_ (0 11 III1'Is• iii II 11110 0(0 110 (110Ill ill III 11 I R IOU

N (fill IV (1100 I11 10110 U

I. 11 DII Ill

M. ii 011 110 U II (II)II t

11 11 (00

ta 101 II II ID 11 III (11 .. 1111

III VII11 11 I

N (DI II II (11 0 III 11 0 10

III H OIl11 a IDIII

11 1101 (0110 00

I1 11 I U 11 (110

Nt I1 1111 III .0 EU

II II H 1111 11 1 11.11 ot/Ntz 111111 III. I 11 (011 .111 110

I 010311 11 flU ID II 1ll

Nt3 11111111 H 1111 III (UI Ill I LII (1111lilt Di11 110 1111

N4 (UI ID I I Ill (II (00 (11 i 01 0 (011

I00 II 11 '11 1111. I 0 1 1111 ([III

N 11111111 II 811 111 1111 111 1(11 (110lIlt Dl11 111 (011

Nq. (11 II (UI 0 ID III ID I 11 III

01 Ii to! 11 11 1111

N IID 111 11 0 III ! .10 i I 0 III

DIII 10! 11 DII IOU

Mi 1(111111 III 00 110 III I 0 . IOU

011I 11(0 0 . 1 UI, IOU

fta I 8010 01 DO 11 IOU .18 I 0 III

I11 iio Ill

1

I

1

—3

— 39 —

0l

11 III

I 0 DI

Iii UI

II DI 0I

DI

10 UI

Ia II

III DI

Ill 0 DI

I U D

11

DI 0

U

U

UI

DI I 10 0

HI 11

ill U

Ill U

U DI

III ll

UI 01

11

DI DI

111

UI UI

U

ID U

11

0 0

flu

0 11

II ItO I H11011

UI •I I I

I I .101

II

IIII I I .1 I I I I

11001

11 0 01

0 1101

Ii 110

II 11110

lilt I 1101

I I Ill II

H 001

111111

110111

I I 1111

I I liii 1111111

DI

I I©Il

I I I

DI 0 II

IDOl

110 011

01@

111 DI

II DI 0 i

— Oi - DI U ID U

UI 0111 DI

01 Ht

UI

I I

UIII fill

11

0:

A

ID

.IUI U

rH

II o

U'

'ml . .. Dl

11111 I I 11 0

- 11111 0 0 D III

101 0 Iii' II

0111 1' UI 100

ID) 0 I I I 0

.

'1111 I 1111011

1101 11011 0

001 I DI U

0111 II II U

1101 I UI DI

11101

.101

11

I

101

I I

11

UI: I

.

IOU U II ' 11'

'1011 I . 01 1101

lAO (1 I I 11

IOU I ''" DI 1101

H 001 lID 0

1101 11 II Dl Ei

AOl 0 I I 0

001 0 1 ' 0 1101

1101 11 II U

H 0111 UI DI 0111

11111 1 II U

1101 Fl Dl. tIll H oo II F

1101 I lot DI l oi i tü A

UI

lOt/tOt

I

11

11

10

DI, 1111

0

r I o III

1101 0 I I 11

1111 11 DI 0111

0 UI ID

11111

U I

0

II 11110

I I

010

UI

II II I

1111

0

Ii UI UI

DI Ill

I ID lID I0

1111

0

ID

DIII

11 Ill

II

II

jO

IhN

N

h4

t

) IJ

hi N

Li

I.

4

— -E+1 -

o tt4

0'

o Ot4

o Gi

'A 9t

•A tt

o

• Qtt) •

0 N •O 'R

o

•

o

'-H

'1

0 Slj

o '14

o £ 0'

0 'N

o

o

o 8MH o w

• N

Q S'

• 9 • H • 'N H

toio1o

Oh o 9"t1

o m o ?h

VN

o ThN

0•

•

o Mj

o I

I ID

all II I'll

II VII

II Ill

a ii Ill

II 1111 I

I II Vi II

U

DI

II

0

II

U

II

a

UI III

a

0

11

V III

U

O fIll

III

aü i

U

UI

a

01

0

DI

DO I

DO!

U

Oaf

DO

ID'

OUt

DI

IV VI

I V UI

1 DI

II DI

0

H VI

I VI

II VI

VI

II VI

I VI

0!. VI

DI

ID Vl I A

I' V

Il' III

111011

UI III I' 11101

'U •

IV lID

I II Fl V

1 II IVI

I 111111

Dliii 1111111

I III ill 1 11 lUll

II 1110

I 'I DI I V I

1 U 111111

--H

:,111J

'N1 --H

VN

. LAU\JK(itt.k ./. PULU-&.PI :E.5T. P&t1 -P&D ., ID

. t .-¼.4 . r

.

,9 ' J.4

,

. 4

H tO (0 8111 tO • till]

1101 II tO [I till to i tO 11111

II 11 ill tO 0111 II

110.118 811 0111 l0 0. 1Q tO

o.oi it Ii to tot to ito too

011110 .11 (1 I [OJItI 8101 tOil

111111! tO l till tO 00 1

11181010 • C) I 1111 11 00 0 tO

II tO 111 000 tO 081 0 tOll

Ill tO . 0.11 . . I 11 lOt I tOil

It • .... to to tO 110 (1111

.001. 10 .1 III IJJ to 0! 8 lilt

Jilt!: Ill ... 11 .111 lOt (0. 118 108

tlt I , 0. Ii 11 II 11 tOt ii to at itt it 11

111110 I II ID it lOt 0 I 10 ID

II 0 tO III ill ItO tilttll DO II 11 III (00

(tIlt: II III 10 11 ItO18100 0 JO 111 11 lID tOllhIDI

tOO II 11 01 to I I II

li_li I I 11 0 I 11 tO

III tO GO III Ill ItO ID!

I 011 0 0 It 0 C)! 11 10!

00 00 110 III Ill I I till

I tOO tO 11 II 11 0 I 0 JO!

00 1111 • 10 00 111 tO I 111 lOll

1101111 II Jill [ lOt 1110 1811

11100000 111 011 In tO I II tOO

tIlt HO I 0 0 0 lID 100

0111 II 011 1110 II Ill I IOU

Ill 10 III 011 10 i 10 DII 001/101

1000 DO 11 II I Oil tO 81 tOO

1000 1111 I V 111 I I 0 100

11810 00 tO 10 F II! 810 ID

10101 l ill III 10 81 ii tO

1011 tO It UI tO ItO 1111

I 100 Ill 0 H U 010 III!

— 2 —

• H

-1

_1

0 00 II] 00 11011 III 11111 1101

H II 0 III III 111 010 00I

122. 0011IJ I 11 11 I F Ill 01 I II

0001 I 111 11! 0 11! Ii Ill

Lz HJ1011 01 l.I11 1111 ID

10110 .1 0 11! I .0 .. .110 lU

L2. - 00 - .I. Ill 000111 - .1111 1.01.

I 0 -- H I - 11 11 1.0 ;.i . -

L.z H0. 10 Dl I1ll lID III

1101111 Dl II Dl 1 11 I Ill Ill

Lzi 1111 00 I ill IF 0 DID IOU

lOt ID 11 I V DI 11l 1011

128 00 H HI I Ill DII IOU

III 111 I .1 I 11 • it II 1110

Lzo 11010 H •• 11 Dl 11111 10 I I IA

110110 I I V DI I .0 • - - lID 0

1o OOIIII lOll lOUD III ID

101 ID I II11 1111 11

13 11 011 01 Ill 110 III

I 0 II0 1111 11

L32 l II 0 1111 III ID I 101

OI JO I I 11 .0 IL3 011 III tO I ID II 10

11 0(11 ID I I 11 Il I Ill

L3 I II 011 Al 1111 IA lID 1011

I1100 1111 0011 0 lUll

L3 001 II 1111 01 ID 110 III

00) 10 H11 OlD II

137 11011111 011 I 0 10 0111 IV!

I Oil DI• 011 0 Dl I loll/till

L OUt III 11 I II ID Ill IOU

001111 II 10 0! 11 OlD lOll

133 II ID II III ID ItO IDO

O O III U I 11 1110 101 loot

L40 1101111 DI IA ID I IA

lOt 11 0 II11 Dl / Ill

L41 I I I 0 0 10 1101 I 1111

I 0 I I 0 DII tei/ooi192 0I lOlA 0111 lID Ill!

O lUll IA 0 II 0 DIll 1111

L43

III . ••. 11 00 • U • I 10 IOU

L_I a IOU

LL _JUIIIIII U ID E U 0(0 118

• [0101 jU ........ 1 0 0 II I (GO/lot

F

IDIOt IU —— tO '11 11 0 110 ID

— UI 811 DI to

0 II It 0 101 III

'JUIOII 1 I 0 0 lID :110

10 I I U 118 101

I IOU 10 11 II U 0 I 0 tillI I 0 0 111 I 0 010 lOt

• U 1 8 10 IOU 11 DI I IOU

L Lco . . .. I II I I 0 I I 0 lOt

• I. IOU [II U II 0 010 0!

2.0ioH L o L33

• L o

H b 0. . 0..0 . • • C'

• Lz. 0

U o• o• L .0

• • o. Lz3 o L, E1..

• L 0. L'i o to 0

..•. L o Lzs 0.Lo 0 LA 0

L:_ (. • o (.'H... Lr7. .• .1.28 o L4'i O•

L 0 o L'is 0.

F-—'• • .

o

F—L o • o.Li o • a a

L4j

- L4 —

-1.

---

.-

(A•

U"-

-r-

•

.Ir

.!r•I

—:.

•;•'

••i

•..•

U',•

.U

'-Lty

-N

.

C =

— C

a =

00

= =

0 =

00 a

0 C

- =

-

—-=

C =

= -

•In

.1

— * rn 0 z Zr ot 0-

a a

0 C

C —

C=

= =

= C

= =

C 0

= =

a =

= =

— —

0 0

C 0

0 =

aO

00.

-C.

0 —

= 0

= 0

= C

= .

= ..

=•

— r

-.. —

— .

— —

—0

—=

— —

a a

0 0

= =

= =

C C

C —

— =

C C

= —

—

— =

—-

——

•—=

._-C

-_•

—

---:

•-

-—-

-

—..—

--—

-•--

.•-

-.•

•

- -

- •

-

= -

— —

— =

a —

==

— —

- —

-o H

C -

= C

= =

0 0

= =

0 =

000

= C

0 0

C —

• =

•0 —

= -

—-

--

- =

-

= •

-•=

= =

.=

--=

c —

_C

= =

C 0

00

0

= 0

= 0

— =

C—

-0

•--0

-.

. --

C.

C

o=

C=

a=

—0

= =

— —

C =

= C

= =

0—

0 0

0 0

0 =

0-

.•

.•

—-

- —

—C

a —

==

-

-C

.—

I•

•

z-

=C

t O

-

— a

——

—•-

:

.- H

0 =

C =

C

— —

• •

0•0•

0 0

—C

- =

— C

o•c

•• —

= =

— C

C0

==

— •

= •

— -

C

= —

C =

C

011/101

11IJ I

01

Ill

fill

Ill

log

1111!

001

ID!

11111

Ill I

DIII

III

I00

11111

11111

III

1101

Ill I

0111

1110

1111

lOll

IC;

OIl

00!

III

II

111

III

Ill

11

a'

Ill

III

ohç

o 11 1 I O H

III!) 111111

ID

I 111111

Ill I 11101

I 0111101

II 11111

ID. 10 (I lID 011

I 11 11111

10

II 110 I 01011

1111 hIll, II I II. 11111

11 l I! Ill!

10 0111101

0 I 11111

11 101111

II III

II 101

UI f 11101 01 II

Al :. liii II

H

lIQ !

f 11fF II

101

Ill III III 1111

Ill 1110

OHI

1111

DII CII

11

DII 11 III

III III fill Ill ill' fill fill 1111

Ill II III Ito III II 0111

110

010 11

1111

Ill fill fill

0

11

11

0

II

A.

11

10

11

ill

0

ill

11

111

0

I

11

0

I

11

DI

11

11

II

F

11

'I

11

III

11

II

II

III

Dl

11

DI

DI

DI

— 9+7 —

Dl

UI Ill

III 11

Ill II

00 II 0

II III

II DI

I ill

II DI

III 11

II I

I Dl

I 110

II 11

III 11

I 11

II 11

II 0

111 11

II 11

II U

I I

II 11

1111 DI

JO UI

0

ID ill ID II

Ill U

I I

I, I

11

II 11

ill

II 00

ID DI

II UI

1 II

Ill

1111

11111

Oil

II

III

'Oil

III

II

Ill

I

III

III

III

II!

II!

00

I!!

1110

III

Ill

Iii

Ill

Ifl

II

III

DO?

lii

ocsh

I 11

Ill

II

111

I I —

LIII H

I

H J•ff

I 1 I I

loll

DI 1010 . . HI III

O lID I

I 0011 1

Ill III —

I ii

11H

11111 II 0 II UI U . lID IOU

DIII HO I II 001 V III U]

III OIl ID ID II III 0 010 00

IDO I ID DII II DVIII lID lUll

11101 I I I II U I HI! U U I I I DO

ID I I LU UI II DID IOU

I DI I 0 !D U II I 0 0. U I U 1111I0 ItO 00 V 1110

011110 U ID ID III, U . VIII ID

DOt D Ill I II II 1111 .553 0 III U II III III 0 0 I lOll

I!O DID II Ill UI II . . lID Ill

IHII ID III DI III 0 . lID Ill

10110 0 Dl 101 0. 0111 100

II II I I I U ID III U. GIll lOll

O II II U I I lOll

LoiE LOWtE

Si 0 0

57. 0 Zo 0

53 0 0 S3

Sq 0 Szz 0 SMO..0

Ss o 5z 0

S 0' 0 942 0

0 5 0

58 0' 0 0

5' o S o & .0

So 0 $18 0 0

SI' 0 0

Sa 0 53o 0 5 o

S'3 0 531 0

5' 0 5 o .0

Ss 0 5 0

S 53l

59 0• 55 0

5e 0

- 47 -

9.L. bijiageiV: verdeling van PGM-I en IDH fenotypen (zie biz. 12)

PGM-1 PGt1-2 PGM- PGM-1-i- PGM-5

N2Lf N6 N8 N9 N21 N3 N4 320 Ni?

L2 L7 Lii N39 N40 N41 NLfLf

L19 L22 L23 N1+7 NLf8 NLf9

L26 L29 LLf L8 L30 L3i

S5 S26 S28 L34 L36 LL+O LL+5

S41 S1+5 511 S23 S51

N2 N7 N12 N5 NiO N13 N15 Ni Ni1+

N33 N3k N37 N18 N22 N27 N28 N20 N26

N L3 L18 L27 N29 N1+6 N50 NLf3

L13 L4/+ Li L5 L14 L35 L16 L28

0 S2 S3 S13 L38 S29

S21 S33 S3L4. 56 S12 SlLi. S20

S36 s38 SLf1 sI s48 S19

S1+7 S55

B38 Bk5 S8 BLf 35 B6 37

N30 N3i 38 39 B12 Bi3() S4 S37 B18 B19 B21 322

B21+ B26 B27 B28

B32 B33 B31+ B35

336 31Q B/+i 31+6

B47 Bk8

S25 S3i

L32 B2 B3 B14 B1+3 350 Bi BlO

S22 N35 N36 N38 Bli B15

L12 L13 L20 L39 316 B23

L1+2 L'+7 L50 B30 B31

B39 B42

B37 Nh N25 N32 L21 L21

N23 N1+2 L6 L10 Li? L37 L41

L9 L/+6 Ll8 Si s18 S1+0 S1+2 S30 S53

S7 S9 Sb S1+6 S51+

Si5 s16 S50H

- 1+8 —