DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTAS · invaden los conservantes y los alimentos ultra procesados, se han ... aroma, presencia de vitaminas y antioxidantes, estos ... celular normal o por la

MANUAL PARA EL ANÁLISIS DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTAS

Aplicaciones en el Estudio de GULUPA

Esta obra está bajo una Licencia Creative Commons Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional.

https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/

https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/

MANUAL PARA EL ANÁLISIS DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTAS

Aplicaciones en el Estudio de GULUPA

Manual para el Analisis de Biocompuestos en Frutas. Aplicaciones en el Estudio de GULUPA/ Quiceno, J., Ospina, L., David, D., Román, M., Betancur, M., Cadavid, N., Cardona, L., Muñoz L., Imbachí, P., Martínez, B., Passaro, C. - Rionegro: Servicio Nacional de Aprendizaje, 2017.

40 p.; 16,5 cm x 23 cmCódigo ISBN: 978-958-15-0278-3

José Antonio LizarazoDirector general (e)

Juan Felipe Rendón OchoaDirector Regional Antioquia

Jorge Antonio LondoñoSubdirector Centro de la Innovación la Agroindustria y la Aviación

Luisa Fernanda Granger SerranoLíder SENNOVA

Esteban OcampoDinamizador Tecnoparque Nodo Rionegro

Adel II González AlcaláInstructor SENNOVA

Manual para el Analisis de Biocompuestos en Frutas. Aplicaciones en el Estudio de GULUPA

AutoresJuan Manuel Quiceno Rico, Biólogo con Especialización en Gestión Ambiental y M.Sc. con Especialidad en Biotecnología de PlantasLeopoldo Andrés Ospina Arbeláez, Agrónomo, Colombiano, [email protected] David Gómez, Ingeniera Biológica, M.Sc. Ciencia y Tecnología de alimentosMelissa Andrea Román Páez, Química con Especialización tecnológica en calidad de aguas, validación de métodos analíticosMaría Isabel Betancur Nieto, Ingeniera Química y Magíster en Ingeniería AgroindustrialNatalia Cadavid Muñoz, Química Farmacéutica con Especialización en Estadística y Magíster en QuímicaLiliana María Cardona Bermúdez, Zootecnista y M.Sc. BiotecnologíaLaura María Muñoz Echeverri , Ingeniera Biológica y M.Sc. BiotecnologíaPaola Catalina Imbachí Narváez, Ingeniera Agroindustrial con Especialización en Ciencia y Tecnología de AlimentosBladimir Antonio Martínez Varela, Tecnólogo de AlimentosCatarina Pedro Pássaro Carvalho, Ing. Agronomo y Ph.D. Ing. Alimentos

ISBN: 978-958-15-0278-3

© Servicio Nacional de Aprendizaje - SENA

Diseño, diagramación e impresión:Divegráficas Ltda.

Hecho el depósito que exige la ley

Este libro, salvo las excepciones previstas por la Ley, no puede ser reproducido por ningún medio sin previa autorización escrita del autor.

Los textos publicados son de propiedad intelectual de los Autores y pueden utilizarse con propósitos educativos y académicos, siempre que se cite al autor y la publicación. Las opiniones aquí contenidas son de responsabilidad exclusiva de los autores y no reflejan necesariamente el pensamiento del editor ni del SENA.

Este libro es producto del proyecto de investigación “Genotipo-ambiente y composición funcional de frutos de gulupa: una estrategia de valor agregado para el fortalecimiento del sector en el Oriente Antioqueño (01-2017-TPRionegro)”, financiado por el Sena en el marco del Sistema de Investigación del Sena SENNOVA y que ha sido ejecutado por Grupo de Investigación Interacción Genotipo-Ambiente y Calidad de frutas, código COLCIENCIAS COL0106783 en el año 2017.

Rionegro, Colombia. Noviembre, 2017.

ANÁLISIS DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTASAplicaciones en el Estudio de GULUPA

3

Introducción

Los cambios en la alimentación siempre han ido muy de la mano con los cambios culturales y económicos concurrentes en la sociedad. Desde la época en que nuestros ancestros cazaban y cultivaban sus propios alimentos, hasta el día de hoy en que nos invaden los conservantes y los alimentos ultra procesados, se han visto modificaciones en la calidad de los productos alimenticios que han ido muy de la mano con los cambios socioculturales y socioeconómicos concurrentes. Algunas de las consecuencias inherentes a dichos cambios, y que se le han sumado al crecimiento poblacional acelerado de la actualidad, han sido la hambruna y la malnutrición. Tanto ha sido la preocupación mundial por dichas problemáticas, que a finales del año 2015 fue propuesta la Agenda 2030 sobre los Objetivos del Desarrollo Sostenible (ODS), como una estrategia mundial que al pretender continuar con el legado de los Objetivos del Milenio, plantea entre sus metas para el año 2030 poner fin al hambre, lograr la seguridad alimentaria y la mejora de la nutrición, promover la agricultura sostenible, garantizar una vida sana, promover el bienestar para todos en todas las edades y garantizar modalidades de consumo y producción sostenibles1.

Iniciativas encaminadas a reducir la subalimentación y la malnutrición, proponen entonces mejorar los rendimientos en la producción de alimentos al igual que mejorar la calidad nutricional de los mismos. Si bien la calidad puede ser algo objetivo o subjetivo según el contexto, representa aquellos parámetros o características que debería cumplir un producto para llevar al consumidor a tomar la decisión de adquirirlo. De esta manera, la calidad de un alimento no solo tiene que ver con las características físicas (observables), sino también con las propiedades fisicoquímicas que influyen sobre las cualidades organolépticas y nutricionales de la misma, lo que lo vuelve más o menos atractivo al comprador2.

Se conoce que los alimentos de origen vegetal como frutas, hortalizas, granos o cereales, etc., son productos de gran interés no sólo porque proveen de azúcares, vitaminas, minerales y otros nutrientes esenciales para la vida, sino también porque son una fuente abundante de compuestos bioactivos, que aunque no tienen una función nutricional definida si ayudan a promover la salud y a prevenir enfermedades como las cardiopatías y el cáncer; motivos que los hacen atractivos para ser incorporados en la dieta diaria3-5.

La tendencia mundial hacia un mayor consumo de frutas y verduras para mantener una buena salud, sumado a la preocupación por lo que llega finalmente a la mesa, hace evidente la necesidad de conocer cuáles pueden ser esas propiedades fisicoquímicas que influyen en la calidad de los alimentos que se consumen en fresco o que sirven como materia prima para alimentos procesados, y que los hacen más llamativos para el consumidor6. Es así como el conocimiento sobre los fitoquímicos que poseen los frutos, verduras, granos, etc., son datos de relevancia en el mercado alimentario de hoy, y su determinación se convierte en una oportunidad para darle valor agregado no solo a los productos en fresco sino a productos elaborados a partir de ellos; de manera que se pueda apoyar la lucha contra la malnutrición.

Esta cartilla fue concebida para brindar al lector una información básica sobre algunos de los compuestos bioactivos encontrados en frutos y verduras, al igual que se detallan ensayos de laboratorio empleados para medirlos a partir de matrices vegetales o alimentos.


5

¿POR QUÉ ES ÚTIL ESTA INFORMACIÓN EN EL ESTUDIO DE FRUTAS COMO LA GULUPA?

Colombia goza de tener una posición geográfica y climática estratégica, que le permite producir gran diversidad de frutos y verduras durante todo el año. Esta característica la convierte en una dispensa hortofrutícola importante para el mundo, lo que se ve reflejado al tener gran variedad de productos compitiendo por el mercado internacional. Tal es el caso del plátano, aguacate, gulupa, uchuva, piña, bananito bocadillo, lima Tahití y mango, como protagonistas de más del 70% de las exportaciones del país7.

Es de resaltar el caso de la gulupa (Passiflora edulis Sims f. edulis), curuba redonda o curuba morada como también se le conoce. Esta fruta pertenece a la familia de las Passifloras donde también se encuentran la granadilla y el maracuyá, y fue la cuarta fruta más exportada en el país en el año 2016, con más de 6.000 toneladas según lo reporta la Asociación Nacional de Comercio Exterior8. Es una fruta que tiene gran acogida debido a su sabor, aroma, presencia de vitaminas y antioxidantes, estos últimos compuestos de importancia nutricional y médica por su capacidad anticancerígena9-10.

Conocer algunos aspectos de importancia nutricional con repercusiones sobre la salud de los consumidores en nuestras frutas y verduras, se convierte entonces en una oportunidad para otorgarle más características de calidad a los productos que comercializamos, más cuando son de talla internacional.


6

¿QUÉ SON LOS FITOQUÍMICOS BIOACTIVOS?

¿QUÉ SON LOS ANTIOXIDANTES?

Se conoce como fitoquímico bioactivo a todo compuesto químico obtenido de las plantas que no es considerado un nutriente, pero que su consumo se ha correlacionado con la mejora en la salud y la reducción en el padecimiento de enfermedades crónicas. Al parecer se conocen más de 5000 componentes fitoquímicos provenientes de frutas, verduras y granos, pero se estima que la lista de los que se desconocen y como consecuencia sus beneficios, pueden ser mayor11.

Se ha propuesto que la actividad sinérgica entre los fitoquímicos presentes en frutas y verduras es la responsable de la actividad antioxidante, anticancerígena y demás beneficios para la salud que pueden tener. Esto explica el hecho de que un solo antioxidante no es capaz de reemplazar la acción combinada que se consigue cuando incorporamos frutas y verduras en la dieta 12.

Se conocen varios tipos de compuestos bioactivos que se han clasificado como carotenoides, compuestos fenólicos, alcaloides, compuestos nitrogenados y compuestos organosulfurados12 (Fig. 1). Los más estudiados entre todos estos grupos de fitoquímicos han sido los carotenoides y los compuestos fenólicos, los cuales se describen más adelante.

La oxidación es una reacción química que involucra la transferencia de electrones desde una molécula donadora hacia una molécula receptora (denominada agente oxidante), quien se reduce en el proceso. Como resultado de dicha reacción se pueden generar especies químicas con electrones desapareados denominadas radicales libres, que son inestables y altamente reactivas13. La reactividad de los radicales libres puede afectar biomoléculas como el ADN, proteínas, carbohidratos y lípidos; lo que ocasiona desequilibrio, daño celular y hasta muerte celular14.


7

Figura 1. Clasificación de los Compuestos Bioactivos o Fitoquímicos de importancia alimenticia y nutricional12.

Los radicales libres y otras especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés), pueden ser producidas mediante el metabolismo celular normal o por la exposición a rayos X, ozono, humo de cigarrillo, contaminantes del aire, químicos industriales, entre otros15. Los radicales libres oxigenados más importantes por su alta reactividad y por estar implicados en patologías son el radical hidroxilo, radical anión superóxido, peróxido de hidrógeno, singulete de oxígeno, hipoclorito, radical de óxido nítrico y radical peroxinitrito14.


8

Para prevenir los daños ocasionados por los radicales libres, las células cuentan con mecanismos de defensa denominados antioxidantes que mantienen el balance celular oxidativo. Cuando se rompe el equilibrio entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes, se produce daño oxidativo a especies moleculares como proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Si esto ocurre se dice que en la célula hay estrés oxidativo16.

Los ANTIOXIDANTES son entonces moléculas, que en pequeñas cantidades previenen o retardan la oxidación de compuestos fácilmente oxidables. De esta manera, son los responsables de la defensa del organismo frente a patologías degenerativas asociadas con el ataque de radicales libres y el estrés oxidativo, como el cáncer, Parkinson, Alzheimer o arterosclerosis17-20.

Acorde con Ratnam y col.21 los antioxidantes se pueden clasificar de acuerdo a su procedencia en antioxidantes enzimáticos o antioxidantes no enzimáticos (Fig. 2). Los primeros son de síntesis celular endógena y corresponden a enzimas, moléculas de bajo peso molecular y cofactores enzimáticos. Los segundos corresponden a moléculas obtenidas a través de la dieta, donde se encuentran los compuestos fenólicos, vitaminas, carotenoides, compuestos organosulfurados y minerales.

Figura 2. Clasificación de los Antioxidantes22.


9

La diversidad estructural de los fitoquímicos favorece la variabilidad en la actividad que puede tener este tipo de moléculas biológicas. En términos de actividad antioxidante, los compuestos bioactivos cumplen su función al participar en reacciones donde hay transferencia de átomos de hidrógeno o en reacciones donde hay transferencia de electrones individuales; ambas determinadas por la estructura del antioxidante y el pH. En este sentido, no existe un método sencillo y universal para determinar la capacidad antioxidante de una muestra donde existe variedad de componentes trabajando sinérgicamente23.

Los métodos que se emplean para evaluar la capacidad antioxidante de una muestra se pueden categorizar en: espectrométricos, electroquímicos y cromatográficos20. En la Tabla 1 se listan algunos de los ensayos espectrométricos que permiten evaluar la capacidad antioxidante de una muestra dependiendo del modo de acción del antioxidante y del agente oxidante.

¿CÓMO SE PUEDE EVALUAR LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE?

Tabla 1. Algunos métodos para evaluar la capacidad antioxidante por espectrometría20.

ENSAYO PRINCIPIO DEL MÉTODO DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO FINAL

DPPH Reacción antioxidante con un radical orgánico Colorimetría

ABTS Reacción antioxidante con un catión radical orgánico Colorimetría


10

ENSAYO PRINCIPIO DEL MÉTODO DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO FINAL

FRAP Reacción antioxidante con un complejo Fe(III) Colorimetría

ORACReacción antioxidante con radicales peroxilo, inducido por el AAPH (2,2’-azobis-2-amidino-propano)

Pérdida de fluorescencia de la

fluoresceína

TRAPCapacidad antioxidante para limpiar los radicales derivados del luminol, generados de la descomposición del AAPH

Detección de quimioluminiscencia

Métodos por Transferencia de Átomos de Hidrógeno

Acorde con Prior y col.23 los ensayos basados en la transferencia de átomos de hidrógeno miden la capacidad de un antioxidante de atrapar radicales libres, por la donación de átomos de hidrógeno. El mecanismo de acción antioxidante en el cual un átomo de hidrógeno (H) de una biomolécula o antioxidante (AH) se transfiere a un radical X•, se puede sintetizar en la siguiente ecuación:

X• + AH → XH + A•

Un sustrato oxidable (AH) es atacado por un radical libre (X•) generando una especie no radical (XH) y un nuevo radical libre A•. El radical A• del fitoquímico se estabiliza por resonancia. Para que las biomoléculas no sufran daño oxidativo, los antioxidantes deben reaccionar más rápido con los radicales libres. La medición de la capacidad antioxidante se basa entonces en cinéticas competitivas que son generalmente rápidas23.

Los métodos de transferencia de átomos de hidrógenos son independientes del solvente y el pH, sin embargo, la presencia de agentes reductores como los metales, son una grave complicación ya que pueden mostrar reactividades altas no reales23.

Siguiendo esté modo de acción de los antioxidantes, se han desarrollado varios ensayos que permiten detectar la actividad antioxidante general o específica. Se destacan el método para determinar la capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC, siglas en inglés para oxygen


11

radical absorbance capacity) y el ensayo para determinar el parámetro antioxidante de captura de radicales (TRAP, siglas en inglés para radical-trapping antioxidant parameter), que miden en general la inhibición de la oxidación inducida por radicales peroxilo23.

Método ORAC: Mide la inhibición antioxidante de la oxidación inducida por el radical peroxilo de manera que refleja la actividad antioxidante rompedora de cadenas mediada por la transferencia de átomos de H. En el ensayo, el radical peroxilo reacciona con una sonda fluorescente (β-ficoeritrina o fluoresceína) para formar un producto no fluorescente, de manera que la capacidad antioxidante se determina por la tasa de disminución y la cantidad de producto formado en un tiempo definido. El resultado es reportado como equivalentes empleando curvas estándar de 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, un análogo hidrosoluble de la vitamina E conocido como Trolox23.

Método TRAP: Mide la capacidad de un antioxidante de interferir con la reacción entre los radicales peroxilo generados por el AAPH [2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride] y una sonda blanco. Variaciones a este método han incluido la medición del consumo de oxígeno, fluorescencia de la R-ficoeritrina o la absorbancia del ABTS (2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-suslfonic acid), de manera que la oxidación de la sonda es detectada óptica o fluorométricamente. La actividad antioxidante se determina cuando se ha consumido todo el antioxidante, la extensión del tiempo de retraso por la apariencia de la sonda oxidada cuando hay presencia de los antioxidantes, y por el porcentaje de reducción de la reacción. Los valores TRAP se expresan normalmente como tiempo de retraso o tiempo de reacción de la muestra comparada con los tiempos correspondientes al Trolox23.


12

Métodos por Transferencia de Electrones Individuales

Los métodos basados en la transferencia de electrones individuales miden la capacidad de un antioxidante de transferir un electrón para reducir algún compuesto, incluyendo metales, carbonilos y radicales23.

Las reactividades relativas en los métodos por transferencia de electrones son usualmente bajas y dependen del pH. Además, los cálculos de la capacidad antioxidante están basados en la reducción del porcentaje de producto más que en la cinética. Es de anotar que componentes traza y contaminantes (metales en particular), interfieren con estos métodos y pueden dar lugar a alta variabilidad y baja reproducibilidad en los resultados23.

Siguiendo este mecanismo de acción de los antioxidantes, se han desarrollado varias estrategias para medir el poder antioxidante de la reducción Férrica, la reducción del radical DPPH, y la capacidad antioxidante equivalente al Trolox, entre otros.

Método de Poder Antioxidante de la Reducción Férrica (FRAP): Mide la reducción del complejo férrico-2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) a un producto coloreado (Fig. 3). El ensayo se lleva a cabo en un pH ácido (3,6) para mantener la solubilidad del hierro. El mecanismo de reacción es únicamente por transferencia de electrones, de manera que en combinación con otros métodos el FRAP es muy útil en distinguir los mecanismos de reacción dominantes con diferentes antioxidantes. Adicionalmente, debido a que los metales reducidos son propagadores activos de cadenas de radicales por medio de la reducción del hidroperóxido a RO•, es interesante para evaluar si valores de FRAP altos se correlacionan con la tendencia de ciertos polifenoles a convertirse en pro-oxidantes bajo ciertas condiciones. La reducción se monitorea midiendo el cambio en la absorción a 595nm en un espectrofotómetro23.


13

Figura 3. Reacción del ensayo FRAP23.

Método 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH): Mide la capacidad de un antioxidante de reducir el radical DPPHŸ (Fig. 4). Este radical es uno de los radicales orgánicos nitrogenados más estables, el cual presenta un color morado intenso. La capacidad de los antioxidantes se puede medir por resonancia espín electrón o midiendo como disminuyen los niveles de absorbancia a 515nm por espectrofotometría23.

Figura 4. Estructura del radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH•)23


14

Método de Capacidad Antioxidante Equivalente a Trolox (TEAC) u otros ensayos con ABTS: Miden la capacidad de los antioxidantes de atrapar el anión de larga vida ABTS•+. En este ensayo, el ABTS (Fig. 5) es oxidado por radicales peroxilo u otros oxidantes a su radical catiónico ABTS•+, quien tiene un color intenso. La reacción del radical con el antioxidante disminuye el color del radical, de manera que los resultados de las muestras problema se expresan como equivalentes al Trolox, el cual es usado para elaborar curvas estándar23.

El radical ABTS•+ se puede generar de varias formas. Por medio de reacciones químicas con dióxido de manganeso, persulfato de potasio, o con reacciones enzimáticas con la metmioglobina, hemoglobina o peroxidasas. Normalmente las reacciones químicas son más demoradas (más de 16 h) que las reacciones enzimáticas23.

Figura 5. Estructura del 2, 2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)23.

La absorbancia máxima del radical ABTS•+ se ha visto a longitudes de 415, 645, 734, y 815 nm; sin embargo, 415nm y 734nm han sido las más empleadas para las mediciones espectrofotométricas23.

¿QUÉ SON LOS COMPUESTOS FENÓLICOS?

Los compuestos fenólicos son metabolitos secundarios de las plantas formados por uno o más anillos aromáticos, con uno más grupos hidroxilos. Según la estructura se clasifican como ácidos fenólicos, flavonoides, estilbenos, coumarinas y taninos12 (Fig. 6). Al ser uno de los grupos de fitoquímicos más diversos en las plantas, su importancia fisiológica y morfológica es


15

considerable: Pueden actuar como fitoalexinas para proteger las plantas de microorganismos, como repelentes para depredadores, atrayentes de polinizadores, pigmentos, antioxidantes y como agentes protectores contra la radiación UV, entre otras24-25.

Figura 6. Estructura general de algunos flavonoides12.

En la dieta los compuestos fenólicos son importantes en la determinación de la calidad sensorial y nutricional frutas y vegetales26-27. De igual manera se ha visto que tienen cualidades como preservantes para alimentos y funciones asociadas con la reducción del riesgo de enfermedades crónicas, gran parte conferida por su capacidad antioxidante12, 28.

Dada la importancia de este tipo de fitoquímicos, se ha desarrollado un método que permite determinar la cantidad de compuestos fenólicos totales, denominado ensayo Folin-Ciocalteu (F-C).

Método de Folin-Ciocalteu (F-C): Mide la capacidad que tienen los polifenoles para reducir el Mo(VI) a Mo (V), como resultado de tal reacción, el reactivo de color amarillo adquiere un intenso color azul que se mide por espectrofotometría en longitudes de onda cercanas a 765nm.


16

Mo(VI) (Amarillo) + e- è Mo(V) (Azul)

El principio de este método colorimétrico está basado en reacciones de transferencia de electrones entre el reactivo F-C y los compuestos fenólicos. Se emplea normalmente el ácido gálico como el fenol estándar de referencia y los resultados se expresan con relación a éste.

¿QUÉ SON LAS ANTOCIANINAS?

Las antocianinas son pigmentos vacuolares solubles en agua que pueden mostrar una coloración roja, morada o azul dependiendo del pH en el que se encuentren. Pertenecen al grupo de los flavonoides y se encuentran en todos los tejidos vegetales desde hojas, tallos, raíces, flores y frutos29.

Las antocianidinas son las estructuras básicas de las antocianinas. Las antocianidinas (o aglicona) consisten de un anillo aromático A unido a un anillos heterocíclico C que contiene oxígeno, y el cual se uno por enlaces carbono-carbono a un tercer anillo aromático B (Fig. 7). Las antocianidinas cuando se encuentran en su forma glicosídica (unidas a un azúcar), se denominan antocianinas29-30.

Las antocianidinas que más se encuentran en las plantas se listan en la Figura 7. Los azúcares más comunes que se encuentran unidos a tales antocianidinas son la glucosa, galactosa, ramnosa y arabinosa; y di o trisacáridos formados a partir de dichos monosacárido31.

Las antocianinas poseen propiedades farmacológicas y funciones biológicas bien conocidas como su capacidad antioxidante y antiinflamatoria32; lo que las hace moléculas perfectas para reemplazar los colorantes sintéticos usados en la industria de alimentos33. Sin embargo, cuando están aisladas son muy inestables y susceptibles a la degradación.


17

En gran medida, su estabilidad depende del pH, temperatura de almacenamiento, estructura química, concentración, luz, oxígeno, solventes, presencia de enzimas, flavonoides, iones metálicos y proteínas34.

Figura 7. Estructura general y sustituyentes para algunas antocianidinas35.

La determinación de las antocianinas en una muestra se puede llevar a cabo de varias formas donde destacan los métodos cromatográficos y los espectrofotométricos. En este último grupo se ubica uno muy popular denominado método diferencial de pH.

Método Diferencial de pH: Mide el contenido de antocianinas monoméricas totales en una muestra, aprovechando el cambio reversible de color de dichas moléculas con los cambios en el pH (Fig. 8). En el método se prepara la muestra en soluciones buffer a pH 1.0 y pH 4.5, y se hacen las mediciones de la absorbancia en la longitud de máxima absorbancia de la solución a pH 1.0. La diferencia en la absorbancia entre las dos soluciones


18

buffer se debe a los pigmentos de antocianinas monoméricas, ya que las antocianinas polimerizadas no exhiben el comportamiento reversible con el pH de manera que son excluidas del cálculo36.

Para el cálculo de las Antocianinas totales se procede con la siguiente ecuación:

A = (Amax – A700nm)pH1.0 – (Amax – A700nm)pH4.5

MW = Peso molecular de la antocianina (Cianidina-3-glucósido)DF = Factor de diluciónɛ = Coeficiente de extinción molar, L x mol-1 x cm-1

l = Longitud de paso de celda

Figura 8. Espectro UV-visible de antocianinas en buffers de pH 1.0 y 4.5. También se muestran las formas flavilio y hemiacetal de las

antocianinas bajo los diferentes pH. R=H o sustituyente glicosídico36.

El cálculo de las antocianinas totales se obtiene empleando el peso molecular y el coeficiente de extinción de la antocianina que se encuentra en mayor medida en la muestra. Usualmente se emplea la información


19

de la Cianidina-3-glucósido por ser una de las antocianinas más comunes en la naturaleza. De esta manera, los resultados se reportan como equivalentes de cianidina-3-glucósido36.

¿QUÉ SON LOS CAROTENOIDES?

Los carotenoides son el grupo más extenso de pigmentos isoprenoides sintetizados principalmente, aunque no de forma exclusiva, por las plantas. Son los responsables de la coloración amarilla, naranja y rojiza de muchos frutos y vegetales, y la mayoría de los animales deben obtenerlo mediante la dieta ya que cumple una función provitamina y antioxidante37-38.

Este grupo de moléculas son importantes en el proceso fotosintético y fotoprotector de las plantas. Su papel fotoprotector proviene de su habilidad para atrapar e inactivar especies reactivas de oxígeno como el singulete de oxígeno formado de la exposición de la luz y el aire. Este mismo papel protector es el que se atribuye a su actividad antioxidante en los seres humanos. Los carotenoides pueden reaccionar con radicales libres y convertirse ellos mismos en radicales. Su reactividad depende de la longitud de las cadenas con dobles enlaces conjugados y las características de los grupos de los extremos. Los radicales carotenoides son estables debido a la deslocalización de un par de electrones sobre la cadena conjugada de polieno de las moléculas. Dicha deslocalización también permite que ocurran reacciones de adición sobre muchos sitios del radical39.


20

Los carotenoides tienen un esqueleto de 40 carbonos formado por unidades de isopreno y se han identificado más de 600 tipos en la naturaleza. Su característica distintiva es una serie de dobles enlaces conjugados que constituyen la parte central de la molécula y le otorgan su forma, reactividad química y propiedades de absorción de la luz (Fig. 9). Se clasifican según sus grupos funcionales en xantofilas y carotenos, las primeras conteniendo oxígeno como grupo funcional y los segundos solo teniendo sus cadenas hidrocarbonadas. El α-caroteno, β-caroteno y β-criptoxantina tienen la capacidad de funcionar como provitamina A. La Zeaxantina y la luteína con los carotenoides principales de la región macular del ojo en humanos12.

Frutos y vegetales naranjados donde se incluye la zanahoria, papaya, mango, calabaza, melón cantalupo entre otros son fuentes ricas en β-caroteno. Los tomates, sandías, pomelos rosados, guayaba rosada entre otros son fuentes ricas en licopeno12.

La disponibilidad y facilidad en la obtención de estos compuestos, ha facilitado su utilización en la industria alimenticia, cosmética y farmacéutica12.

Para el análisis de carotenoides se suele utilizar la extracción con solventes orgánicos como la acetona, cloroformo, hexano, isopropanol, metanol, cloruro de metileno y dietil éter. Con relación a los solventes, el método soxhlet es muy popular para extraer estas moléculas, sin embargo hoy en día existen estrategias más limpias y rápidas como la extracción por fluidos supercríticos. El análisis posterior normalmente involucra técnicas cromatográficas o espectrofotométricas40.


21

Figura 9. Estructura química de algunos carotenoides12.

¿QUÉ ES EL ÁCIDO ASCÓRBICO?

El ácido L-ascórbico (AA) es un compuesto natural encontrado en la mayoría de frutas y verduras (melón cantalupo, pomelo, kiwi, mango, papaya, fresa, brócoli, coliflor, pepino, repollo, etc.). Debe ser consumido en la dieta ya que los humanos no tienen la capacidad de sintetizarlo. Es bastante soluble en agua, pero menos soluble en etanol absoluto, etanol al 95%, ácido acético, acetonitrilo y propilenglicol41.

Bajo condiciones fisiológicas, el AA se encuentra principalmente en su forma reducida, como el monoanión ascorbato (AscH-) que reacciona con ROS para formar el radical ascorbilo relativamente estable (semideshidroascorbato, Asc·-) que se puede reducir de


22

nuevo a ascorbato con acción enzimática (Fig. 10). La capacidad de donar electrones hace el AA el principal componente detoxificante de ROS en fase acuosa, protegiendo las membranas contra la peroxidación al atrapar directamente los radicales peroxilipídicos o por la interacción con el radical tocoferoxilo, dando como resultado la regeneración del α-tocoferol o vitamina E42.

Figura 10. Estructura química del ácido ascórbico y sus derivados42.

Para la determinación del ácido ascórbico se emplean métodos titulométricos, fluorométricos, complexométricos, amperométricos, espectrofotométricos, enzimáticos y cromatográficos43-50. Entre los métodos aprobados por las AOAC se utiliza el método titulométrico con 2,6.diclorofenolindofenol (DCPIP).

Método Titulométrico con 2,6.diclorofenolindofenol (DCPIP): Para el caso de jugos existe el método titulométrico con 2,6.diclorofenolindofenol (Método AOAC 967.21). El principio de este método se basa en la reducción de un indicador coloreado (DCPIP) por acción del ácido ascórbico, hasta que se pierda el color. En el punto final de la titulación de una muestra que contenga ácido ascórbico con la solución coloreada, el exceso de colorante se torna de un color rosado-fucsia en la solución ácida. La titulación del colorante (DCPIP) se puede determinar empleando soluciones de ácido ascórbico estándar. Las muestras de alimentos en solución pueden ser tituladas con DCPIP, y el volumen usado en la titulación se emplea para calcular el contenido de ácido ascórbico51.


23

PROTOCOLOS PARA ANÁLISIS DE BIOCOMPUESTOS EN MATRICES VEGETALES Y ALIMENTOS

En la literatura se pueden encontrar reportadas gran variedad de metodologías para la determinación y análisis de compuestos bioactivos en frutas, verduras y otros alimentos. A continuación, se presentan algunos protocolos para evaluar la capacidad antioxidante, la concentración de antocianinas, carotenoides y ácido ascórbico; a partir de matrices vegetales (frutas, verduras) o extractos vegetales. Se describen los pasos generales y se comparan con variantes encontradas en la literatura para gulupa u otros alimentos relacionados.

EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN ALIMENTOS

Protocolo para Ensayo FRAP

1. Preparar un Solución Buffer Acetato, pH: 3,6Sln A: Acetato de Sodio Trihidratado en H20 destilada (3,1 g/L).Sln B: Ácido Acético Glacial en H2O destilada (1,6%).Utilizar la Sln B para llevar la Sln A hasta un pH de 3,6.2. Preparar una Solución de HCl 40mM.3. Preparar una Solución de TPTZ en solución de HCl 40mM (3,12 g/mL).4. Preparar una Solución de FeCl3 en H20 (5,4 mg/mL).5. Preparar una solución madre 1:1:10 de FeCl3:TPTZ:Buffer, conservando el orden de adición.6. Preparar soluciones del estándar de ácido ascórbico en concentraciones de 0.025mM, 0.033mM, 0.05mM, 0.075mM, 0.1mM, 0.175 mM y 0.25mM.7. Preparar las muestras en tubos de ensayo adicionando 50 μL de cada disolución de ácido ascórbico (o muestra problema), 50 μL de solución buffer y 900 μL de solución madre.8. Preparar blancos de muestra utilizando 50 μL de cada disolución y 950 μL de la solución buffer.9. Incubar las muestras 30min. en completa oscuridad y se procede a leer en espectrofotómetro a 590nm, usando la solución buffer 3,6 como blanco para el equipo.


24

En la literatura se reporta el uso de buffer acetato a 300 mM con un de pH 3,4 y 3.6, los tiempos de incubación de las muestras desde van desde los 4-60 minutos y la temperatura entre 36-37°C. Las absorbancias utilizadas están comprendidas en un rango de 590-595 nm. y utilizan las mismas relaciones y órdenes para elaborar la solución FRAP (10 partes buffer acetato (300 mM)- 1 parte: de la solución (10 mM) TPTZ (2, 4, 6 tripiridil-s-triazina) -1: parte solución (20 mM) FeCl3 acidificada con HCl (40mM)) la solución madre se parara el mismo día en el que realizan las mediciones. Para conformar las muestras se reportan volúmenes desde 180-900 μL de la solución FRAP, el volumen de la muestra desde los 10-50 μL (en algunos casos los autores realizan diluciones de los extractos a evaluar) y desde los 30-50 μL de agua destilada o de solución buffer. Para la obtención de las curvas de calibración se utiliza una solución conocida Fe2+ entre el rango de 100-3000 μM, a partir de una solución madre que varias desde los 1000-3000 μM de FeSO4. Las actividades de los extractos se expresan como μmol de equivalentes de Trolox/g de pulpa, como valor FRAP (g de ácido ascórbico por cada 100 g de muestra), o como equivalentes de ácido gálico/mg de muestra52-59.

Protocolo para Ensayo DPPH

1. Elaborar una curva estándar de Trolox a diferentes concentraciones: 0.25mM, 0.5mM, 0.75mM, 1mM, 1.25mM, 1.5mM, 1.75mM. El Trolox se prepara en Metanol.2. Preparar una solución madre de DPPH 0,4 mg/mL en metanol. Dejar reposar en oscuridad mínimo por 2 h.3. Preparar una solución estandarizada de DPPH en Metanol. Se toma solución madre de DPPH (0,4 mg/mL), se adiciona en un volumen de metanol y se mide la absorbancia a 517nm. Se adiciona DPPH hasta obtener una absorbancia entre 0,3-0,35. Almacenar en oscuridad.4. Preparar en tubos de ensayo 10 μL de cada disolución de Trolox o de muestra problema y se adicionan 990 μL de la solución de DPPH estandarizada. 5. Evaluar Blancos de cada una de las muestras. Los blancos se preparan tomando 10 μL de cada disolución y 990 μL de metanol.6. Preparar Referencias para cada solvente donde se encuentren disueltas las muestras. Se toma 10 μL de metanol (en caso de que este sea el solvente) y 990 μl de solución estandarizada de DPPH.


25

7. Incubar todas las muestras en oscuridad por 30 min. y hacer lectura en espectrofotómetro a 517nm, empleando metanol como blanco para el equipo.

En la literatura se encuentran protocolos donde emplean concentraciones del reactivo DPPH (2,2-Difenil-1-Picrilhidrazilo) en 0,1 μM, 20 mg/mL y 20 mg/L, los solventes utilizados son agua o metanol. Los volúmenes utilizados del reactivo varían desde los 900 μL-3,9 mL. Los volúmenes de la muestra son desde los 30 μL-0,5 mL (en algunos casos los autores realizan diluciones de los extractos a evaluar). Los tiempos de incubación de las muestras se encuentran entre 5 y 60 minutos con temperaturas 10-30°C. Absorbancias máximas 515-517 nm. Las curvas de calibración se encuentran entre 0,08-1000 μM y la actividad antioxidante se expresa μM equivalentes de Trolox/ 100 g de peso seco, o, μM equivalentes de Trolox/g de peso fresco53, 60-65.

Protocolo para Ensayo ABTS

1. Preparar una solución de persulfato de potasio 34 mg/mL.2. Pesar 17 mg de ABTS, adicionar 100 μL de la solución de persulfato de potasio y llevar a 10 mL con agua destilada. Almacenar en un frasco ámbar y usar después de 24 horas.3. Preparar buffer PBS (buffer fosfato) 100mM pH 7.4.4. Estandarizar un poco de solución buffer fosfato adicionando solución de ABTS y midiendo la absorbancia a 732nm hasta lograr un valor de 0.700±0.005.5. Construir una curva de calibración con el estándar de Trolox. Se recomiendan valores entre 0,25-1,7 mM.6. Preparar las muestras tomando 990 μL de solución ABTS estandarizada y agregando 10 μL de la muestra en cuestión.7. Preparar blanco de cada muestra adicionando 990 μL del buffer fosfato y 10 μL de la muestras.


26

8. Preparar referencias para cada tipo de solvente en el que estén diluidas las muestras. En 990 μL del ABTS estandarizado adicionar 10 μL del solvente.9. Incubar todas las muestras por 30 min. y proceder a leer por espectrometría a 732nm.

Las concentraciones de ABTS (Acido 2,2 -azinobis-(3-etilbenzo-tioazolín-6- sulfónico) reportadas son de 3,5 -7 Mm, y concentraciones de persulfato de potasio 1,25-140 mM o persulfato de amonio a 4,9 Mm, y una solución buffer fosfato con pH 7,4. Los solventes para la preparación de las soluciones madre son con agua destilada o etanol y tienen periodos de incubación de 16-24 horas. La solución de trabajo es estandarizada a una longitud de onda 732-754 nm con una absorbancia 0,7± 0,2. Es común encontrar que para la medición de actividad antioxidante se adicionen 10-100 μL de los extractos (muestra), 800-1000 μL de la solución de trabajado de ABTS y en los blancos se utilice el solvente de trabajo con un mismo volumen de la muestra. Los periodos de incubación de las muestras son de 1-30 minutos. Las curvas de calibración 0-8 mM y los resultados son expresados en μM equivalentes de Trolox/ 100 g de peso seco, o, μM equivalentes de Trolox/g de peso fresco. Algunos autores utilizan kits creados por empresas las cuales dan las instrucciones para la cuantificación de antioxidantes59, 66-70.

Protocolo para determinar Compuestos Fenólicos Totales

1. Preparar una Solución de Carbonato de Sodio al 7.1 % al menos con un día de anticipación.2. Preparar una curva estándar con ácido gálico. Se recomiendan concentraciones de 0.313, 0.625, 0.9, 1.25, 2.5 y 2.75mM. 3. Preparar las muestras en tubos de ensayo adicionando 50 μL de cada disolución, 425 μL de agua destilada, 125 μL de reactivo de Folin. Pasados 5 min. se agregan 400 μL de Carbonato de Sodio y se agita.4. Preparar los blancos de muestra tomando 50 μL de cada disolución, 550 μl de agua destilada y 400 μL de Carbonato de Sodio. 5. Incubar las muestras en oscuridad por 30 min. y leer por espectrofoto-metría a 760nm. Se emplea agua destilada como blanco para el equipo.

En la cuantificación de polifenoles utilizan los reactivo Folin – Ciocalteu (FC) y carbonato de sodio (2-20%). Para realizar las muestras se debe seguir un orden en la adición de los reactivos, los extractos (30-1000 μL),


27

luego el FC (30-4000 μL), pasados 1-6 minutos de reacción adicionan el carbonato de sodio 75-2000 μL (algunos autores reportan la adición de un buffer fostato-citrato), se incuba en periodos de 30-90 minutos y se procede a medir en el espectrofotómetro con una absorbancia de 750-765 nm. Los datos son expresados como mg de ácido ascórbico/g peso seco o fresco (GAE)52, 54, 59, 62, 64, 70-76.

Protocolo para determinar Corotenoides Totales

1. Elaborar una curva estándar para el carotenoide más abundante en la muestra. Es común usar el beta-caroteno.2. Pesar 1 g de muestra, mezclar con 5 mL de acetona fría y dejar reposar por 15 min. a 4 ºC y en oscuridad.3. Mezclar con vortex por 2 min. y centrifugar a 1370xg por 10 min.4. Colectar el sobrenadante y al precipitado adicionar 5 mL de acetona fría. Dejar reposar por 15 min. a 4 ºC y en oscuridad.5. Mezclar con vortex por 2 min. y centrifugar a 1370xg por 10 min.6. Colectar el sobrenadante y mezclar con el primer sobrenadante obtenido.7. Filtrar el extracto a través de papel filtro (Whatmann No. 42).8. Leer cada una de las muestras por espectrofotometría a la máxima absorbancia según datos de la curva estándar. Normalmente el rango de absorbancia está entre 449 y 470 nm.9. Expresar los resultados como mg o μg del carotenoide empleado en la curva de estandarización, con relación al volumen de muestra extraído.

Este protocolo sigue los lineamientos descritos por Biswas y col. en el 201177. Para la cuantificación de carotenos en la literatura se reportan extracción con acetona fría, éter de petróleo o con hexano, etanol, acetona (50/25/25). Las muestras son centrifugadas de 1370 a 9000 RPM o 1370 RCF para retirar los solventes, medir absorbancias entre 449-470 nm, los resultados se expresan Resultados en µg/100g55, 78-80.


28

Protocolo para determinar Antocianinas Totales por el Método Diferencial del pH

1. Preparar dos buffers pH 1,0 y pH 4,5 para la cuantificación.2. Para muestras sólidas, pesar aproximadamente 0,5 gramos de muestra y se adicionan 5 mL de agua destilada.3. Para muestras líquidas, proceder directamente a la medición.4. En ocasiones se requiere diluir la muestra en un solvente adecuado (definido previamente).5. Posteriormente, unir la muestra diluida con la solución buffer (pH 1,0 y 4,5).6. Tomar 100 μL y 900 μL de buffer, el valor de absorbancia de todas las muestras se compara con el blanco (buffer solo).7. Pasados 20 minutos, leer en una absorbancia de 520 y 700 nm.8. El valor obtenido debe estar entre 0,2 y 1,4 si pasa estos límites es recomendable diluir la muestra.

El protocolo anterior es utilizado en algunas investigaciones que han cuantificado antocianinas por este método (diferencial de pH), los autores no realizan ninguna modificación al protocolo81-83.

Determinación de Ácido Ascórbico (Vitamina C) por el Método Titulométrico con DCPIP

El 2,6-Dichlorophenolindophenol (DCPIP) Se encuentra dentro los métodos titulométricos y es un método oficial de la AOAC.

1. El ensayo se recomienda hacer por triplicado en Erlenmeyer de 50 mL, se adicionan 5mL de ácido metafosfórico- ácido acético y 2 mL de muestra.2. Titular cada muestra con la solución colorante indofenol hasta que un color rosado persista por 5 segundos.3. Anotar las lecturas (iniciales - finales) y calcule la cantidad de colorante usado para cada titulación4. Fórmula: mg ácido ascórbico en volumen de la solución estándar / (promedio mL de colorante usado en la titulación estandar) - (promedio mL blanco de titulación).


29

Para utilizar este método se deben calibrar las soluciones estándar, para esto se reportan los siguientes reactivos Ácido ascórbico estandarizado, Solución indofenol (0.1N), bicarbonato de sodio (42 mg), DCPIP (50 mg), en la titulación se utilizan de (1-25 ml) muestra, (5-9 mL) de ácido metafosfórico (5-10%) algunos investigadores lo acidulan con ácido acético. Luego titulan hasta que se observe un color rosa (5-15 min.). El procedimiento se repite tres veces y se expresa como cantidad de Vitamina C necesaria para reducir 1 ml de la solución de yodo84-89.

Bibliografía1. Organización de las Naciones Unidas [ONU]. (2017). Objetivos

de Desarrollo Sostenible. Recuperado de: http://www.un.org/sustainabledevelopment/es/.

2. FAO (2003). Manual para la preparación y venta de frutas y hortalizas. Del campo al mercado. Boletín de Servicios Agrícolas de la FAO. Roma. 208 p.

3. Fry, D. M. (1995). Reproductive effects in birds exposed to pesticides and industrial chemicals. Environmental Health Perspectives, 103(Suppl 7):165.

4. Temple, N. J. (2000). Antioxidants and disease: more questions than answers. Nutrition research, 20(3):449-459.

5. Willet, W. C. (1994). Diet and health: what should we eat? Science (Washington), 264(5158):532-537.

6. Jacoby, E., Keller, I. (2006). La promoción del consumo de frutas y verduras en América Latina: Buena oportunidad de acción intersectorial por una alimentación saludable. Revista Chilena de Nutrición, 33(S1):226-231.


30

7. Asociación Hortofrutícola [ASOHOFRUCOL]. (2016). Balanza comercial 2016 vs 2015. Recuperado de: http://www.asohofrucol.com.co/imagenes/Balanza_comercial_2016vs2015.pdf.

8. Asociación Nacional de Comercio Exterior [ANALDEX]. (2016). Recuperado de: http://www.analdex.org/2017/03/21/gulupa-fue-la-cuarta-fruta-mas-exportada-por-el-pais-en-2016/.

9. Orjuela, N. M., Campos, S., Sánchez, J., Melgarejo, L. M., Hernández, M. S. (2011). Manual de manejo poscosecha de la gulupa (Passiflora edulis Sims). En: Laboratorio de fisiología y bioquímica vegetal. Departamento de Biología. Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia. p. 7-22.

10. Wu, X., Cheng, J., Wang, X. (2017). Dietary Antioxidants: Potential Anticancer Agents. Nutrition and Cancer, 69(4):521-533.

11. Liu, R. H. (2003). Health benefits of fruits and vegetables are from additive and synergistic combination of phytochemicals. The American Journal of Clinical Nutrition, 78:517S–520S.

12. Liu, R. H. (2004). Potential synergy of phytochemicals in cancer prevention: Mechanism of action. Journal of Nutrition, 134(12 Suppl):3479S-3485S.

13. Cheeseman, K. H., Slater, T. F. (1993). An introduction to free radicals chemistry. British Medical Bulletin, 49:481-93.

14. Young, I. S., Woodside, J. V. (2001). Antioxidants in health and disease. Journal of Clinical Pathology, 54:176-86.

15. Bagchi, K., Puri, S. (1998). Free radicals and antioxidants in health and disease. Eastern Mediterranean Health Journal, 4:350-360.

16. McCord, J. M. (2000). The evolution of free radicals and oxidative stress. The American Journal of Medicine, 108(8):652-659.

17. Droge, W. (2002). Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological Reviews, 82:47-95.

18. Lee, J., Koo, N., Min, D. B. (2004). Reactive oxygen species, aging and antioxidative nutraceuticals. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 3:21-33.


31

19. Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T., Mazur, M., Teiser, J. (2007). Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 39:44-84.

20. Pisochi, A.M., Negulescu, G. P. (2011). Methods for total antioxidants activity determination. A. Review, Biochemistry and Analytical Biochemistry, 1:1-10.

21. Ratnam, K. V., Ankola, D. D., Bahrdwai, J. K. V., Sahana, D. K., Kavar M. N. V. (2006). A review: Role of antioxidant in prophylaxis and therapy. A pharmaceutical prospective. Journal of Controlled Release, 11:189-207.

22. Carocho, M., Ferreira, C. F. R. (2013). A reviews on antioxidants, proxidants and related controversy. Natural and synthetic compounds, screening and analysis methodologies and future perspectives. Food and Chemical Toxicology, 51:15-25.

23. Prior, R. L, Wu, X., Schaich, K. (2005). Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics of foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53:4290-4302.

24. Naczk, M., Shahidi, F. (2006). Phenolics in cereals, fruits and vegetables: Occurrence, extraction and analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41:1523-1542.

25. Popa, V. I., Dumitru, M., Volf, I., Anghel, N. (2008). Lignin and polyphenols as allelochemicals. Industrial Crops and Products, 27:144-149.

26. Tomas-Barberan, F. A., Ferreres, F., Gil, M. I. (2000). Antioxidant phenolic metabolites from fruit and vegetables and changes during postharvest storage and processing. In: A. Rahman (Ed.) Bioactive natural products (Part D) (pp. 739-795).

27. Lapornik, B., Prosek, M., Golc, Wondra. A. (2005). Comparison of extracts prepared from plant by-products using different solvents and extraction time. Journal of Food Engineering, 71:214-222.


32

28. Valenzuela, A., Nieto, S., Cassels, B., Speisky, H. (1991). Inhibitory effect of boldine on fish oil oxidation. Journal of American Oil Chemists Society, 68:935-937.

29. Ignat, I., Volf, I., Popa, V. I. (2011) A Critical Review of Methods for Characterisation of Polyphenolic Compounds in Fruits and Vegetables. Food Chemistry, 126:1821-1835.

30. Konczak, I., Zhang, W. (2004). Anthocyanins-more than nature colours. Journal of Biomedicine and. Biotechnology, 5:239-240.

31. Bureau, S., Renard, C., Reich, M., Ginies, C., Audergon, J. M. (2009). Change in anthocyanin concentrations in red apricot fruits during ripening. Food Science and Technology, 42:372-377.

32. Kong, J. M., Chia, L. S., Goh, N. K., Chia, T. F., Brouillard, R. (2003). Analysis and biological activities of anthocyanins. Phytochemistry, 64:923-933.

33. Kammerer, D., Carle, R., Schieber, A. (2004). Quantification of anthocyanins in black carrot extracts (Dacus carota ssp. Sativus var. Atrorubens Alef.) and evaluation of their color properties. European Food Research and Technology, 219:479-486.

34. Castañeda-Ovando, A., de Lourdes Pacheco-Hernández, Ma, Elena, Ma, Páez-Hernández, J. A., Rodríguez Galán-Vidal, J. A., & Galán-Vidal, C. A. (2009). Chemical studies of anthocyanins: A review. Food Chemistry, 113:859-871.

35. Durst, R., Wrolstad R. E. (2001). Separation and Characterization of Anthocyanins by HPLC. In: Handbook of Food Analytical Chemistry. New Jersey: John Wiley & Sons. p. 33-45.

36. Wrolstad, R. E., Durst, R. W., Lee, J. (2005). Tracking color and pigment changes in anthocyanin products. Trends in Food Science & Technology, 16(9):423-428.

37. Moran, N. A., Jarvik, T. (2010). Lateral transfer of genes from fungi underlies carotenoid production in aphids. Science, 328(5978):624-627.

38. Namitha, K. K., Negi, P. S. (2010). Chemistry and biotechnology of carotenoids. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 50(8):728-760.

39. Britton, G. (1995). Structure and properties of carotenoids in relation to function. FASEB Journal. 9(15):1551-1558.


33

40. Saini, R. K., Keum, Y-S. (2018). Carotenoid extraction methods: A review of recent developments. Food Chemistry, 240:90-103.

41. Ball, B. (1998). Bioanalysis and analysis of vitamins in food. Chapman and Hall, London 517.

42. Wojcik, M., Burzynska-Pedziwiatr, I., Wozniak, L. A. (2010). A review of natural and synthetic antioxidants important for health and longevity. Current Medicinal Chemistry, 17(28):3262-3288.

43. Casella, L., Gullotti, M., Marchesini, M., Petrarulo, M. (2006). Rapid enzymatic method for vitamin C assay in fruits and vegetables using peroxidase. Journal of Food Science, 54:374.

44. Iwase, H., Ono, I. (1998). Determination of ascorbic acid in food by column liquid chromatography with electrochemical detection using eluent for pre-run sample stabilization. Journal of Chromatography A, 806(2):361-364.

45. Nyyssönen, K., Salonen, J. T., Parviainen, M. T. (2000). Ascorbic acid, in modern chromatographic analysis of vitamins (3rd Ed.) De Leenheer, A. P., Lambert, W. E., and Van Bocxlaer, J. F., eds., Marcel Dekker, New York.

46. O’Connell, P. J., Gormally, C., Pravda, M., Guilbault, G. G. (2001). Development of an amperometric L-ascorbic acid (vitamin C) sensor based on electropolymerised aniline for pharmaceutical and food analysis. Analytica Chimica Acta. 431(2):239-247.

47. Rahman Khan M., Rahman M., Islam M., Begum S. (2006). A simple UV-spectrophotometric method for the determination of vitamin C content in various fruits and vegetables at Sylhet area in Bangladesh. Journal of Biological Sciences, 6:388-392.

48. Sataya, P. A., Mahajan, M., Jain P. (1998). Photometric methods for the determination of vitamin C. Analytical Sciences, 14:889-895.


34

49. Verma, K. K., Jain, A., Sahasrabuddhey, B., Gupta, K., Mishra, S. (1996). Solid-phase extraction clean-up for determining ascorbic acid and dehydroascorbic acid by titration with 2,6-dichlorophenolindophenol. Journal of AOAC International, 79:1236.

50. Xia, W., Yuxia, D., Changxia, S., Jinghe, Y., Yuebo, W., Shuna, S. (2003). Fluorimetric determination of ascorbic acid with o-phenylenediamine. Talanta, 59:95-99.

51. AOAC. (2016). Ascorbic acid in Vitamin preparations and Juices. Association of Official Analytical Chemists, 20th ed., United States of America.

52. Cabrera, S. A., Sandoval, A. P., & Forero, F. (2014). Potencial antioxidante y antimicrobiano de extractos acuosos e hidroalcohólicos de granadilla (Passiflora ligularis). Acta Agronómica, 63(3):204-211.

53. Carvajal de Pabón, L. M., Turbay, S., Rojano, B., Álvarez, L. M., Restrepo, S. L., Álvarez, J. M., ... Sánchez, N. (2011). Algunas especies de Passiflora y su capacidad antioxidante. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 16(4):354-363.

54. da Silva, J. K., Cazarin, C. B. B., Colomeu, T. C., Batista, Â. G., Meletti, L. M., Paschoal, J. A. R., ... Júnior, M. R. M. (2013). Antioxidant activity of aqueous extract of passion fruit (Passiflora edulis) leaves: in vitro and in vivo study. Food Research International, 53(2):882-890.

55. Franco, G., Cartagena, J. R., Correa, G. A. (2013). Estimación del contenido de carotenoides en la pulpa de frutos de gulupa (Passiflora edulis Sims) conforme a la variación del color en la cáscara. Corpoica Ciencia y Tecnología Agropecuaria, 14(2):199-206.

56. Rodríguez, L., Lopez, L., & García, M. (2010). Determinación de la composición química y actividad antioxidante en distintos estados de madurez de frutas de consumo habitual en Colombia, Mora (Rubus glaucus B.), MAracuyá (Passiflora edulis S.), Guayaba (Psidium guajava L.) y Papayuela (Carica cundinamarcensis). Alimentos Hoy, 19(21):35-42.

57. Pérez, J., Saura, F. (2007). Metodología para la evaluación de capacidad antioxidante en frutas y hortalizas, V Congreso Iberoamericano de tecnología postcosecha y agroexportaciones. [en línea]. Recuperado de: www.horticom.com/pd/imagenes/71/429/71429.pdf.

58. Ryan, L., Prescott, S. L. (2010). Stability of the antioxidant capacity of twenty five commercially available fruit juices subjected to an in vitro digestion. International Journal of Food Science & Technology, 45(6):1191-1197.


35

59. Wong, Y. S., Sia, C. M., Eng, H., Ang, Y. K., Chang, S. K., & Yim, H. S. (2014). Influence of extraction conditions on antioxidant properties of passion fruit (Passiflora edulis) peel. Acta Scientiarum Polonorum Technologia Alimentaria, 13(3):257-265.

60. Bondet, V., Brand-Williams, W., Berset, C. L. W. T. (1997). Kinetics and mechanisms of antioxidant activity using the DPPH free radical method. LWT-Food Science and Technology, 30(6):609-615.

61. Brand-Williams, W., Cuvelier, M. E., & Berset, C. L. W. T. (1995). Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT-Food science and Technology, 28(1):25-30.

62. Inocente-Camones, M. Á., Tomas-Chota, G. E., Huamán-Malla, J., Muñoz-Jáuregui, A. M., García-Morán, R. I., Quispe-Fuentes, G., ... Taype-Espinoza, E. D. R. (2014). Actividad antioxidante y fotoprotectora in vitro de una loción y gel elaborados con extracto estabilizado de camu camu (Myrciaria dubia, Kunth). Revista de la Sociedad Química del Perú, 80(1):65-77.

63. Kim, D. O., Lee, K. W., Lee, H. J., Lee, C. Y. (2002). Vitamin C equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals. Journal of Agricultural and food chemistry, 50(13):3713-3717.

64. Kuskoski, E. M., Asuero, A. G., Troncoso, A. M., Mancini-Filho, J., Fett, R. (2005). Aplicación de diversos métodos químicos para determinar actividad antioxidante en pulpa de frutos. Food Science and Technology (Campinas), 25(4):726-732.

65. Rojas, D. C. C., Maldonado, M. E., Londoño, M. C. F., & Marchena, L. A. U. (2015). Características nutricionales y antioxidantes de la fruta curuba larga (Passiflora mollissima Bailey). Perspectivas en Nutrición Humana, 16(2):203-212.

66. Franco, G., Cartagena, J. R., Guillermo Correa, L., Rojano, B., Piedrahita, A. M. (2014). Actividad antioxidante del jugo de Passiflora edulis Sims (Gulupa) durante la poscosecha. Revista Cubana de Plantas Medicinales, 19(3):154-166.


36

67. Kasper, G., Mao, L., Geissler, S., Draycheva, A., Trippens, J., Kühnisch, J., ... Klose, J. (2009). Insights into mesenchymal stem cell aging: involvement of antioxidant defense and actin cytoskeleton. Stem Cells, 27(6):1288-1297.

68. Marquina, V., Araujo, L., Ruíz, J., Vit, R. M. A. (2008). Composición química y capacidad antioxidante en fruta, pulpa y mermelada de guayaba (Psidium guajava L.). Archivos Latinoamericanos de Nutrición, 58(1):98.

69. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radical Biology and Medicine, 26(9):1231-1237.

70. Sánchez, W. F., Murillo, E., Méndez, J. J. (2010). Potencial antioxidante de residuos agroindustriales de tres frutas de alto consumo en el Tolima. Scientia et Technica, 3(46):138-143.

71. Dastmalchi, K., Dorman, H. D., Koşar, M., Hiltunen, R. (2007). Chemical composition and in vitro antioxidant evaluation of a water-soluble Moldavian balm (Dracocephalum moldavica L.) extract. LWT-Food Science and Technology, 40(2):239-248.

72. Faller, A., Fialho, E. (2009). The antioxidant capacity and polyphenol content of organic and conventional retail vegetables after domestic cooking. Food Research International, 42(1):210-215.

73. Heimler, D., Vignolini, P., Dini, M. G., Romani, A. (2005). Rapid tests to assess the antioxidant activity of Phaseolus vulgaris L. dry beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(8):3053-3056.

74. Martínez-Jaimea, O. A., Abraham-Juárezb, M. R., Gómez-Ortegab, A. (2017). Propiedades Fisicoquímicas y Nutracéuticas de dos Genotipos de Maracuyá (Passiflora edulis var. flavicarpa) procedentes de dos regiones de México. Investigación y Desarrollo en Ciencia y Tecnología de Alimentos, 2:249-255.

75. Muñoz Jáuregui, A. M., Ramos-Escudero, D. F., Alvarado-Ortiz Ureta, C., Castañeda, B. (2007). Evaluación de la capacidad antioxidante y contenido de compuestos fenólicos en recursos vegetales promisorios. Revista de la Sociedad Química del Perú, 73(3):142-149.


37

76. Ochoa, C. I., Sepúlveda, J. U., Maldonado, M. E., Zapata, K., Rojano, B. A. (2014). Propiedades antioxidantes de extractos de curuba (Passiflora mollisima Bailey) en crema de leche. Perspectivas en Nutrición Humana, 16(2).

77. Biswas, A. K., Sahoo, J., Chatli, M. K. (2011). A simple UV-Vis spectrophotometric method for determination of-carotene content in raw carrot, sweet potato and supplemented chicken meat nuggets, Food Science and Technology, 44(8):1809-1813.

78. Burns, J., Fraser, P. D., Bramley, P. M. (2003). Identification and quantification of carotenoids, tocopherols and chlorophylls in commonly consumed fruits and vegetables. Phytochemistry, 62(6):939-947.

79. Ellong, E. N., Billard, C., Adenet, S., Rochefort, K. (2015). Polyphenols, carotenoids, vitamin C content in tropical fruits and vegetables and impact of processing methods. Food and Nutrition Sciences, 6(03):299.

80. Pertuzatti, P. B., Sganzerla, M., Jacques, A. C., Barcia, M. T., Zambiazi, R. C. (2015). Carotenoids, tocopherols and ascorbic acid content in yellow passion fruit (Passiflora edulis) grown under different cultivation systems. LWT-Food Science and Technology, 64(1):259-263.

81. Li, Q., Somavat, P., Singh, V., Chatham, L., de Mejia, E. G. (2017). A comparative study of anthocyanin distribution in purple and blue corn coproducts from three conventional fractionation processes. Food Chemistry, 231:332-339.

82. Luna-Vital, D., Li, Q., West, L., West, M., de Mejia, E. G. (2017). Anthocyanin condensed forms do not affect color or chemical stability of purple corn pericarp extracts stored under different pHs. Food Chemistry, 232:639-647.

83. Mojica, L., Berhow, M., & de Mejia, E. G. (2017). Black bean anthocyanin-rich extracts as food colorants: Physicochemical stability and antidiabetes potential. Food Chemistry, 229:628-639.


38

84. Hernández, Y., Lobo, M. G., González, M. (2006). Determination of vitamin C in tropical fruits: A comparative evaluation of methods. Food chemistry, 96(4):654-664.

85. Kumar, G. V., Ajay Kumar, K., Raghu, P. G., Manjappa, S. (2013). Determination of vitamin C in some fruits and vegetables in Davanagere city,(Karanataka)-India. International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 4(3).

86. Nangbes, J. G., Lawam, D. T., Nvau, J. B., Zukdimma, N. A., & Dawam, N. N. (2014). Titrimetric determination of ascorbic acid levels in some citrus fruits of Kurgwi, Plateau State Nigeria. IOSR Journal of Applied Chemistry, 7(9):1-3.

87. Nielsen, S. S. (Ed.). (2003). Food analysis laboratory manual. New York: Kluwer Academic/Plenum Publishers. p. 106.

88. Souza, L. M. D., Ferreira, K. S., Chaves, J. B. P., Teixeira, S. L. (2008). L-Ascorbic acid, β-carotene and lycopene content in papaya fruits (Carica papaya) with or without physiological skin freckles. Scientia Agricola, 65(3):246-250.

89. Tantray, A. K., Dar, S. A., Ahmad, S., & Bhat, S. A. (2017). Spectrophotometric and titrimetric analysis of phytoascorbate. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 6(1):27-31.

Esta cartilla se terminó de imprimir en los talleres de la Litografía Divegráficas en el mes

de noviembre de 2017

Documents

DE BIOCOMPUESTOS EN FRUTAS · invaden los conservantes y los alimentos ultra procesados, se han ... aroma, presencia de vitaminas y antioxidantes, estos ... celular normal o por la