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Departament de Genètica i Microbiología
ETIOLOGÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL “FALSO MAL DE PANAMÁ”
DE LA PLATANERA EN CANARIAS
Memoria presentada por
Sonia Sabadell González
para optar al grado de
Doctor en Biología
La Laguna, 26 de noviembre de 2003
Departament de Genètica i Microbiología
ETIOLOGÍA Y EPIDEMIOLOGÍA DEL “FALSO MAL DE PANAMÁ”
DE LA PLATANERA EN CANARIAS
Memoria presentada por
Sonia Sabadell González
para optar al grado de
Doctora en Biología
La Laguna, 26 de noviembre de 2003
EL DIRECTOR LA TUTORA
Fdo. J. M. Hernández Hernández Fdo. M. Luquin Fernández
Dr. de Biología Dra. en Biología
Este trabajo ha sido financiado con la beca
predoctoral del Instituto Nacional de
Investigaciones Agrarias (INIA) y ha sido
realizado en el Instituto Canario de
Investigaciones Agrarias (ICIA) en Tenerife.
AGRADECIMIENTOS
Gracias a todas las personas que han participado y han hecho posible que este trabajo pudiera
realizarse, ya que resulta imposible enumerar todo lo que de alguna manera ha influido
personal y profesionalmente en el resultado final del trabajo. Gracias a D. Manuel Fernández
Galván, presidente del Instituto Canario de Investigaciones Agraria por permitirme la
realización del trabajo en este centro.
Mi más sincera gratitud a Julio Hernández, por haberme elegido para la realización del
trabajo. Gracias a su dedicación, su asesoramiento y su constante capacidad y espíritu de
critica ha sabido mantener viva la discusión que enriquece todo trabajo científico. También
quiero expresar mi gratitud a Aurelio, Jefe de Departamento de protección vegetal.
A Marina Luquin por su tutela y aceptación en el programa de doctorado, por su
asesoramiento en el trabajo de los perfiles de ac grasos. Gracias por tu disponibilidad en todo
lo que que te he consultado. Muchas gracias a todo el equipo del laboratorio de
micobacteriologia de la UAB especialmente Josep, Esther “i” Mercé. A Francesc por su
disponibilidad y ayuda.
A Mª Milagros López, gracias por tu tiempo y tus valiosas correcciones y a Mariano Cambra
por vuestra hospitalidad en Valencia. A Ramón por su dedicación y consejos mientras estuve
con las bacterias. A todos los del laboratorio de bacteriología del IVIA, en especial a Pablo
Llop, - “per tot i per sempre”.
A Araceli Barceló, por sus consejos, dedicación y amistad, por sus palabras siempre serenas y
de ánimo, por su comprensión y cariño. Te recuerdo en muchas ocasiones. Muchísimas
gracias por todos esos momentos. A todos los del CIFA por hacerme sentir como en casa. A
Sabry por enseñarme lo que significa el respeto por las ideas que no se comparten y por sus
lecciones de historia y su amistad. Y a Yvonne y Bernardo por vuestro compañerismo en el
ida a ida estando lejos de casa.
Gracias a Julita, sin ti sería imposible imaginar el laboratorio, por tu sonrisa y serenidad. A
Tere por su disposición a la organización, a Javier por sus buenas vibraciones y por sus
mensajes siempre optimistas, a Luis Rumeu por su ayuda y disposición, a Polito por sus
riegos de fines de semana, a Benedicto el “gran pitufo gruñón”, a Diego por su ayuda,
sugerencias y compañero de fatigas, y en especial a la ayuda prestada en los ensayos de
campo de Aniceto, muchas gracias por estar ahi, a Sandra, que en el último año de tesis ha
sido clave para el desarrollo y finalización de los trabajos de laboratorio. A Tomás Alcoverro
y Mery.
A todas las personas del departamento de protección vegetal del ICIA, gracias por hacerme la
vida más agradable. A Luisa, expresar mi cariño y admiración por su inagotable fuerza
vital…, sobran las palabras ante una puesta de sol. Gracias. Carmen Luisa, tu actividad y
entereza, tus consejos. Muchas gracias. Ana Rosa Socorro Monzón por todos los analisi de
suelos y foliares, a Juan Francisco y Tere por enseñarme. A Glenda ,Agustín, Carlos R.,
Axel, Berto, David, Javi, Elba Lidia, Alfonso y Leandro.
A “Casa Coralia”, Coralia, Nena, Elena, y Mercedes por alimentarme y animarme cada dia. A
mis compañeros Boro, Eva, Yeray y Poli.
A Felipe, por sus consejos, ideas, conversaciones, el culpable de mi interés por los perfiles.., a
Marga por transmitir paz y claridad. A Ana, muchísimas gracias por su ayuda y
disponibilidad. A Salva, por su amistad, sus dibujos y su aliento. A Rosa y Celso, gracias por
ser mis amigos y apoyarme en todos esos momento. A Juani, mi niña, a mis amigos de
siempre que no olvido jamas, a Elena mi alma paralela, Yoli S, Yoli, Caamaño, Fernando,
Damián. A ti, siempre mi dulce Susana. A todos muchas gracias por creer en mi.
A todos los que no nombro, muchas gracias, por la ayuda positiva para facilitar, pero también
por la negativa, por aprender, reforzar y construir. A tu familia, Maria, Nicolás, Manuela,
Inés, Amaro, Alexis, los niños Leticia y Cesar. Un especial recuerdo a Jose Antonio. A ti,
incondicionalmente siempre a ti…ya lo sabes. A mis tias Paqui, Mari y Antonia, a Jordi por la
logistica y a mi familia
A mi madre
A mi padre
A Yolanda
A Joan Antoni
Facultat de Ciències
Departament de Microbiología i Genética
TESIS DOCTORAL
Sonia Sabadell González
2003
RESUMEN
Resumen
RESUMEN
El “Falso Mal de Panamá” (FMP), fue descrito por primera vez en Sudáfrica por Deacon et
al. (1985), como “Fals Panama Disease” por su similitud con el “Mal de Panamá”, cuyo
agente causal es Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC). Estos autores encontraron
especies de Fusarium asociadas a las plantas con FMP, pero las pruebas de patogenicidad
fueron negativas y no pudieron establecer la etiología del FMP. Concluyeron que
posiblemente la causa fuera de origen abiótico –suelos pesados con tendencia a la
compactación y al mal drenaje-, aunque no se descartó la implicación de algún agente
biótico.
En la bibliografía aparecen bajo distintos nombres, descripciones de sintomatologías
similares al FMP. Así, Stover, (1972) y posteriormente Lahav et al. (1999) realizaron una
revisión sobre las primeras descripciones del “Yellow mat” y “Colorado diseases” de los
que tampoco se conoce la causa.
La incidencia del FMP se ha visto incrementada en los últimos 5 años, coincidiendo con el
registro de temperaturas por debajo de la media normal para estas latitudes en los meses de
invierno.
La máxima incidencia de síntomas, coincidió con la proliferación de nuevas plantaciones,
utilizando en muchos casos emplazamientos no idóneos para el cultivo de la platanera y
sorribas con suelos ricos en arcillas que provocaban un mal drenaje y tendían a la
compactación.
Las referencias de la literatura y estas evidencias de campo sugerían que posiblemente nos
encontrábamos ante una situación de estrés de la planta provocada por factores abióticos,
los cuales potenciarían la acción de determinados microorganismos que pudieran tener un
papel en la expresión de los síntomas. Por todo ello, la hipótesis de trabajo para la
explicación de los síntomas del “Falso mal de Panamá” es que posiblemente existiera una
interacción entre factores abióticos y bióticos.
Para desarrollar esta hipótesis se han realizado los siguientes trabajos. Procesamiento de
muestras en el laboratorio para la obtención de una colección de aislados bacterianos y
fúngicos asociados a plantas de platanera con FMP obtenidas a partir de muestreos
realizados en cultivos tanto del norte como en el sur de la isla de Tenerife. Otra fuente de
obtención de muestras fue las que los propios agricultores nos han hecho llegar
directamente o a través de los agentes de extensión agraria de todo el archipiélago.
Resumen
Una vez los aislados fueron identificados y caracterizados, se han desarrollado pruebas de
inoculación in vitro y en invernadero sobre plantas sanas, sin haber sido posible reproducir
los síntomas de FMP en condiciones controladas.
Por otro lado también se han realizado ensayos en invernadero para determinar el efecto
que las características físicas-químicas del suelo pudieran tener sobre la expresión de
síntomas, en los que se obtuvieron resultados preliminares que indican que el tipo de suelo
por sí mismo no es el responsable del conjunto de síntomas de FMP.
Estos resultados, originaron el planteamiento de la combinación de los factores abióticos
de estrés más comunes en las plantaciones afectadas, con una selección de los
microorganismos encontrados en asociación a los síntomas, bajo condiciones de
invernadero. De este modo, se han podido observar puntos necróticos en los rizomas y
amarilleos foliares en las plantas de platanera sometidas a estrés por encharcamiento,
compactación y frío ambiental cultivadas en suelos procedentes de plantaciones afectadas
o bajo inoculación de especies fúngicas pertenecientes al género Fusarium, aunque en
ningún caso se consiguió reproducir los síntomas típicos del FMP.
En este punto del trabajo se planteó un ensayo en condiciones de campo con dosis de riego
superiores a la recomendada y con compactación artificial del suelo, en el que se consiguió
reproducir los síntomas internos de rizoma y oscurecimiento vascular típicos del FMP,
aunque los síntomas aéreos característicos no fueron tan claros.
Complementariamente, se han realizado estudios histoquímicos con el fin de establecer un
criterio de diagnostico diferencial con el MP, a partir de lo descrito por Reinking, (1926)
para el “Yellow Mat”, quien asociaba los síntomas vasculares a una desorganización del
floema, que también se ha podido observar en el caso de las muestras estudiadas de FMP,
con la aportación de que además el xilema podía encontrarse colapsado por sustancias de
diversa naturaleza.
Todos estos resultados sugieren que el FMP es un desorden en cuya causa podrían jugar un
papel muy importante algunos factores del suelo como la compactación, el encharcamiento
y la hipoxia y los desequilibrios nutricionales concomitantes, aunque no se puede descartar
la interacción de alguna especie fúngica o bacteriana en combinación con otros factores
abióticos no estudiados en este trabajo.
Summary
SUMMARY
False Panama Disease (FPD) was first described by Deacon et al. in 1985, in South
Africa, who gave it its name due to the similarity between its symptoms and those of
true Panama disease (PD) caused by Fusarium oxysporum f. sp. cubense (FOC). These
authors found Fusarium species associated with FPD affected plants, but pathogenicity
tests were negative and aetiology could not be established. They concluded that the
probable cause was of abiotic originheavy soils, tending towards compaction and bad
drainagealthough the role of some biotic agent was not excluded.
In the literature there are descriptions of similar symptoms under a variety of different
names. Stover (1972) and later Lahav et al. (1999) reviewed the first descriptions of
“Yellow Mat” and “Colorado disease”, despite which the aetiology of both are still
unknown.
In the Canary Islands, FPD incidence has increased over the last five years, coinciding
with lower than normal mean winter temperatures in some plantation areas.
Maximum symptom incidence also coincided with significant increase in new
plantations. In many instances, these plantations were set up in plots totally unsuitable
for banana cultivation, on heavy clay soils with poor drainage and clearly predisposed
towards compaction.
Literature reports and local field evidences suggested that we were probably facing a
plant stress situation induced by abiotic factors, possibly enhancing or potentiating the
action of microorganisms which would play a role in symptoms expression. The
hypothesis for the present study is that the symptoms observed can be explained by an
interaction of biotic and abiotic factors.
To test this hypothesis, the following work has been done:
Sample processing in the laboratory to obtain bacterial and fungal collections of isolates
associated to FPD-affected banana plants from plantations both in the northern and
southern coastal areas of Tenerife. Also studied were samples sent to the laboratory by
farmers and Extension Service Agents from all the banana producing islands of the
Canary archipelago.
Once the isolates were identified and characterized, inoculation trials were carried out
both in in vitro cultivation in growth chamber and in glasshouse under controlled
conditions. None of the typical FPD symptoms were observed in any of these trials.
Summary
Glasshouse trials were also conducted to determine the effects of some soil physical-
chemical properties on symptom expression. The results suggested that soil alone
cannot explain the appearance of FPD symptoms.
As a consequence of these results, trials combining the commonest stress factors present
in the plantations and some selected associated microorganisms were done under
controlled glasshouse conditions. Necrotic areas in the rhizome and yellowing of the
foliage were observed in plants cultivated on soils from affected plantations and
inoculated with Fusarium spp. and subjected to waterlogging and low temperatures.
Nevertheless, no typical FPD symptoms were observed at any time.
At this point in the work, a field trial was set up to cultivate plants in soil that had been
mechanically compacted and applying various irrigation doses (standard for banana and
two larger doses). Typical internal rhizome symptoms were observed in some plants
although external symptoms were never observed.
Complementary to the above, in view of and based on the Reinking work done in 1926
on “Yellow Mat”wherein symptoms were associated with phloem disorganization,
biochemical studies were also conducted with the aim of establishing a differential
diagnostic with PD. The results showed that in FPD not only is the phloem indeed
disorganized but that the xylem might also be collapsed by different type of substances.
All these results suggest that some soil factors, particularly compaction, waterlogging,
hypoxia, and the nutritional imbalances consequent upon these factors, may play a
causal role in the FPD disorder. Nevertheless, the interaction of some bacterial or fungal
species in combination with certain abiotic factors not studied in this work can not be
excluded.
ÍNDICE GENERAL
Índice
JUSTIFICACIÓN..............................................................................................................1
OBJETIVOS ......................................................................................................................5
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA.........................................................................................7
1 CLASIFICACIÓN BOTÁNICA, ORIGEN, EVOLUCIÓN Y DISTRIBUCIÓN
GEOGRÁFICA DE LA PLATANERA (MUSA SPP.) EN CANARIAS............................8
1.1 Anatomía de la platanera............................................................................................8
1.2 El cultivo de la platanera en Canarias......................................................................11
1.3 Condiciones y características físico-químicas de los suelos en las plantaciones
comerciales de Canarias.......................................................................................................12
2 ASPECTOS FITOPATOLÓGICOS. ENFERMEDADES DE LA PLATANERA.14
2.1 Nemátodos................................................................................................................14
2.2 Virus.........................................................................................................................14
2.3 Bacterias...................................................................................................................15
2.4 Hongos......................................................................................................................18
2.4.1 El Mal de Panamá.....................................................................................................19
2.4.1.1 Descripción. Agente causal: Fusarium Oxysporum f sp cubense (FOC)................21
3 EL FALSO MAL DE PANAMÁ............................................................................23
3.1 Revisión histórica y descripción..............................................................................23
3.2 Especies de Fusarium similares a las asociadas al FMP en platanera y en otras
plantas hospedadoras...........................................................................................................26
3.3 Naturaleza del amarilleo foliar.................................................................................28
3.4 Naturaleza de los oscurecimientos vasculares..........................................................29
3.4.1 Xilema ......................................................................................................................29
3.4.2 Floema......................................................................................................................32
3.5 Interacción factores abióticos/bióticos. Triángulo epidemiológico..........................33
3.5.1 El hospedador. Respuestas defensivas.....................................................................33
3.5.2 El patógeno...............................................................................................................34
3.5.2.1 Efecto de la Temperatura sobre la patogenicidad.....................................................34
3.5.2.2 Efecto del encharcamiento sobre la patogenicidad...................................................35
4 FACTORES ABIÓTICOS.......................................................................................37
4.1 Factores climáticos...................................................................................................37
4.1.1 Temperatura.............................................................................................................38
4.2 Factores edáficos......................................................................................................39
Índice
4.2.1 Encharcamiento del suelo.........................................................................................40
4.2.2 Salinidad...................................................................................................................41
4.2.3 Compactación ..........................................................................................................43
4.2.4 Hipoxia y anoxia radical...........................................................................................44
4.2.5 Deficiencias nutricionales........................................................................................45
MATERIAL Y MÉTODOS............................................................................................. 49
1. INCIDENCIA, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y DESCRIPCIÓN DEL
“FALSO MAL DE PANAMÁ” EN CANARIAS...............................................................50
1.1. Datos climáticos.......................................................................................................50
1.2. Muestreos de material vegetal y encuesta epidemiológica.......................................50
1.3. Análisis Foliares.......................................................................................................51
1.4. Análisis físico-químicos de los suelos agrícolas......................................................51
1.5. Análisis microbiológicos de los suelos.....................................................................53
2. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS
AISLADOS BACTERIANOS Y FÚNGICOS....................................................................54
2.1. Aislamiento e identificación de bacterias asociadas al FMP....................................54
2.1.1. Caracterización fenotípica y metabólica de las cepas bacterianas seleccionadas....54
2.1.2. Pruebas de hipersensibilidad en hojas de tabaco (Lelliot y Stead, 1987).................55
2.1.3. Método de Taxonomía bacteriana por perfil de ácidos grasos de membrana..........56
2.1.4. Protocolo de extracción de ácidos grasos MIS para la identificación de bacterias a
través de Cromatografía de gases (Miller, 1985).................................................................57
2.1.5. Protocolo II, Metanólisis (Luquin et al., 1991)........................................................58
2.1.6. Ensayo comparativo del crecimiento de una cepa bacteriana durante 24 h y 48 h
mediante HPGC...................................................................................................................59
2.2. Identificación y caracterización cultural de los aislados fúngicos...........................60
2.2.1. Crecimiento de Fusarium para su identificación......................................................60
2.2.2. Caracterización por Grupos de Compatibilidad Vegetativa (VCGs) de los aislados
pertenecientes al género Fusarium.......................................................................................62
2.2.3. Caracterización por velocidad de crecimiento en placa con los medios de cultivo
PDA y Komada (Komada, 1975), a 15º C y 25º C de los aislados pertenecientes al género
Fusarium...............................................................................................................................64
3. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD........................................................................65
3.1. Pruebas de patogenicidad de bacterias.....................................................................65
Índice
3.2. Pruebas de patogenicidad de hongos........................................................................66
3.2.1. Ensayos in vitro……………………………………………………………………66
3.2.2. Ensayo preliminar de puesta a punto de la metodología..........................................66
3.2.3. Ensayo 2 en bote convencional empleado para cultivo in vitro:..............................67
3.3. Pruebas de patogenicidad en invernadero................................................................68
3.3.1. Ensayo de patogenicidad en invernadero a 25-30ºC y encharcamiento del suelo...68
3.3.2. Ensayo patogenicidad en invernadero a 15-28º C, encharcamiento del suelo y
simulación de daños mecánicos...........................................................................................69
4. INTERACCIONES DE FACTORES ABIÓTICOS Y BIÓTICOS ........................70
4.1. Ensayos preliminares con suelos de plantaciones afectadas de Falso Mal de Panamá
(FMP) ..................................................................................................................................70
4.1.1. Ensayo con suelos de plantaciones del norte de la isla de Tenerife ........................70
4.1.2. Ensayo con suelos de plantaciones del sur de la isla de Tenerife.............................71
4.1.3. Variables estudiadas en los dos ensayos..................................................................71
4.1.4. Siembras de muestras de material vegetal de plantas muestreadas en las
plantaciones afectadas de las vertientes Norte y Sur. Aislamientos de microorganismos
asociados..............................................................................................................................72
4.1.5. Análisis físico-químicos de muestras foliares y de suelos tanto de vertiente Norte
como de vertiente Sur..........................................................................................................72
4.2. Ensayo de cambio de la estructura física de un suelo de la vertiente norte de
Tenerife mediante la adición de “picón”(lapilli volcánico).................................................73
Variables estudiadas.............................................................................................................73
4.3. Ensayo de diferentes tiempos de encharcamiento en sustrato turba: picón (70:30) en
macetas de 5 litros de capacidad..........................................................................................74
4.3.1. Cálculos de la dosis de riego mediante la evapotranspiración y saturación del
sustrato.................................................................................................................................75
4.4. Ensayo de encharcamiento en sustrato turba:picón (70:30) en contenedores de 50
litros de capacidad................................................................................................................75
4.5. Ensayo de simulación de encharcamiento y compactación del suelo......................76
4.6. Ensayo de compactación y dosis de riego en condiciones de campo......................78
5. ESTUDIOS HISTOQUÍMICOS.............................................................................80
5.1. Material vegetal.......................................................................................................80
5.2. Cortes en fresco.......................................................................................................80
5.2.1. Tinción de cutina (Heslop-Harrison, 1977).............................................................80
Índice
5.2.2. Tinción de celulosa (Heslop-Harrison y Heslop-Harrison, 1981)...........................81
5.2.3. Tinción de lignina (Marín, 1986).............................................................................81
5.2.4. Tinción con azul de Tripán (Phillips y Hayman, 1970)...........................................81
5.3. Cortes de material vegetal incluido en parafina.......................................................82
5.3.1. Fijación, deshidratación e inclusión en parafina......................................................82
5.3.2. Obtención de cortes en parafina y desparafinado....................................................82
5.3.3. Tinción de actividad celular (Gerlach, 1969)...........................................................83
5.3.4. Tinción con Azul de Toluidina (Gahan, 1984).........................................................83
5.3.5. Tinción de hidratos de carbono insolubles...............................................................84
RESULTADOS Y DISCUSIÓN........................................................................................85
1. INCIDENCIA, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y DESCRIPCIÓN DEL
“FALSO MAL DE PANAMÁ” EN CANARIAS...............................................................86
1.1. Incidencia y datos climáticos precedentes................................................................86
1.2. Distribución geográfica de las plantaciones muestreadas........................................89
1.3. Descripción de la sintomatología de las plantas muestreadas asociada al Falso Mal
de Panamá.............................................................................................................................90
1.4. Diferencias y similitudes entre el Mal de Panamá (MP) y el Falso Mal de Panamá
(FMP)...................................................................................................................................92
1.5. Resultados de los análisis foliares............................................................................94
1.6. Resultados de los análisis de suelos físico-químicos...............................................95
1.7. Resultados de los análisis microbiológicos de suelos..............................................98
2. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE AISLADOS
BACTERIANOS Y FÚNGICOS.......................................................................................101
2.1. Caracterización cultural de los aislados bacterianos..............................................103
2.1.1. Identificación fenotípica y metabólica de las cepas bacterianas seleccionadas.
Pruebas de hipersensibilidad en hojas de tabaco (Lelliot y Stead, 1987)...........................105
2.1.2. Ensayo comparativo del crecimiento de una cepa bacteriana durante 24 h y 48 h
mediante HPGC..................................................................................................................107
2.1.3. Caracterización por ácidos grasos de membrana y API 20E, API 20NE...............109
2.2. Identificación y caracterización cultural de los aislados fúngicos 111
2.2.1. Caracterización por grupos de Compatibilidad Vegetativa (VCGs) de los aislados
pertenecientes al género Fusarium.....................................................................................115
Índice
2.2.2. Caracterización por velocidad de crecimiento en placa en los medios de cultivo
PDA y Komada, a 15ºC y 25ºC de los aislados pertenecientes al género Fusarium..........118
3. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD .....................................................................119
3.1. Pruebas de patogenicidad de bacterias...................................................................119
3.2. Pruebas de patogenicidad in vitro de hongos.........................................................123
3.3. Ensayo de patogenicidad de especies fúngicas en invernadero, a temperatura de 25-
30ºC bajo condiciones de encharcamiento.........................................................................133
3.4. Ensayo de patogenicidad de especies fúngicas a temperaturas de 17º-28ºC bajo
condiciones de encharcamiento y con simulación de daños mecánicos............................139
4. INTERACCIÓN DE FACTORES ABIÓTICOS Y BIÓTICOS 143
4.1. Ensayo preliminar con suelos esterilizados y no esterilizados de plantaciones
comerciales........................................................................................................................143
4.1.1. Suelos del Norte de Tenerife..................................................................................143
4.1.2. Suelos del Sur de Tenerife......................................................................................148
4.2. Ensayo de mejora de la estructura de un suelo mediante la mezcla con
“picón”(lapilli volcánico)...................................................................................................155
4.3. Ensayo de encharcamiento del sustrato durante diferentes tiempos (2, 4, 6 y 24h) en
macetas de 5 litros de capacidad........................................................................................160
4.4. Ensayo de encharcamiento permanente e intermitente del sustrato turba:picón
(70:30) en contenedores de 50 litros de capacidad............................................................167
4.5. Ensayo de simulación en condiciones controladas de compactación del suelo y
encharcamiento intermitente.............................................................................................173
4.6. Ensayo “Compactación del suelo y dosis de Riego”.............................................180
5. ESTUDIOS HISTOQUÍMICOS...........................................................................188
5.1. Muestras de cortes en fresco..................................................................................188
5.2. Muestras fijadas incluidas en parafina...................................................................192
CONCLUSIONES...........................................................................................................205
BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................. 208
ANEXO________________________________________________________________I
1. BACTERIAS II
1.1. Medio Agar Nutritivo (NA) ii
Índice
1.2. Medio LPGA ii
1.3. Detección de pigmentos fluorescentes en medio B de King (Hing y col., 1954). ii
1.4. TSBA iii
1.5. Reacción a una solución de KOH al 3% iii
1.6. Tinción del gram iii
1.7. Crecimiento anaeróbico en el medio Hugh y Leifson (Hugh y leifson, 1953) iv
1.8. Reacción oxidasa (Kovaks, 1956) iv
1.9. Reducción de nitratos (Cother, 1987) iv
1.10. Degradación de almidón a glucosa v
1.11. Degradación de la gelatina v
1.12. Prueba de la patata v
1.13. Arginina dihidrolasa (Thornley, 1960) vi
1.14. Esculina vi
1.15. Urea vii
1.16. Composición de los reactivos para el protocolo de extracción de ácidos grasos (I),
Sistema MIS vii
1.17. Consideraciones del sistema MIS o MIDI, en la cromatrografía de gases para la
identificación de microorganismos. viii
1.18. Reactivos utilizados en el protocolo de extracción de ácidos grasos (II). Metanolisis
ix
1.19. Condiciones del cromatógrafo UAB ix
2. HONGOS X
2.1. Medio MS (Murashige y Skoog 1962) x
2.2. Medio de cultivo utilizado en los ensayos preliminares in vitro. xi
3. HISTOQUIMICA XII
3.1. Orígenes de las muestras para cortes en fresco xii
3.2. Orígenes de las muestras procesadas con parafina xii
3.3. Protocolo de deshidratación xii
3.4. Mexclas TBA xiii
3.5. Protocolo de Inclusión en Parafina xiii
4. PLAN DE ABONADO DEL ENSAYO DE DIFERENTES DOSIS DE RIEGO Y
COMPACTACIÓN EN CAMPO XIV
ÍNDICE DE FIGURAS
Índice de Figuras
Fig.1. Ciclo de cultivo de la platanera cultivar ‘Gran Enana’ en condiciones de Canarias.
El cultivo de la platanera en Canarias 10
Fig.2. El triángulo epidemiológico de la enfermedad (tetraedro incluyendo el factor
tiempo) representa las interacciones de los 4 factores principales gráficamente. 33
Fig.3. Protocolo de identificación seguido según los resultados de las pruebas metabólicas
obtenidos. 55
Fig.4. Siembra por agotamiento, en 4 cuadrantes aconsejada por la casa comercial
Hewlett-Packard© 5898 Microbial Identification System, para realizar el perfil de
ácidos grasos sobre las colonias crecidas en el tercer cuadrante a las 24 h de
crecimiento. 57
Fig.5. Esquema para el ensayo de complementariedad entre VCG’s de las especies
pertenecientes al género Fusarium. 63
Fig.6. Esquema del diseño para el cálculo de la velocidad de crecimiento en placa de Petri
de diferentes especies fúngicas. 64
Fig.7. Esquema del diseño empleado para producir encharcamiento sobre las plataneras
del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en macetas de capacidad 5l. 74
Fig.8. Esquema del diseño empleado para el tratamiento de encharcamiento intermitente y
control del nivel de agua, sobre plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en
macetas de 50 l de capacidad. 75
Fig.9. Esquema del diseño empleado para los diferentes tratamientos de encharcamiento,
esterilización y compactación del suelo sobre las plataneras cultivar ‘Gran Enana’. 77
Fig.10. Esquema de la talla del bloque de parafina en función de la orientación de la
muestra insertada para su posterior corte en el microtomo. Disposición de los cortes
sobre el portaobjetos. 82
Fig.11. Mapa de Tenerife 86
Fig.12. Datos meteorológicos 86
Fig.13. Datos meteorológicos 87
Fig.14. Síntomas externos de MP en platanera 93
Fig.15. Síntomas externos de FMP en platanera 93
Fig.16. Síntomas internos de MP en platanera 93
Fig.17. Rizoma con síntomas de FMP en platanera 93
Fig.18. Valores foliares de nutrientes en plantaciones del norte de Tenerife 94
Fig.19. Curva de Richard, para los suelos de plantas enfermas y plantas sanas de la
plantación 1 (P1) de la plantación “El Cardón”. 97
Índice de Figuras
Fig.20. Frecuencia de los géneros fúngicos y total de bacterias /número de puntos de
siembra y procedencia de las muestras. 102
Fig.21. Reacción positiva de hipersensibilidad en hoja de tabaco por la inoculación de una
cepa perteneciente al género Xanthomonas. 105
Fig.22. Cromatograma de las áreas de los picos correspondientes a los diferentes ácidos
grasos. Cepas del primer cuadrante a las 24 h de crecimiento. ..........108
Fig.23. Cromatograma de las áreas de los picos correspondientes a los diferentes ácidos
grasos. Cepas del primer cuadrante a la s 48 h de crecimiento. 108
Fig.24. Cromatograma de las áreas de los picos correspondientes a los diferentes ácidos
grasos. Cepas del tercer cuadrante a la s 48 h de crecimiento. 108
Fig.25. Frecuencia de aislamiento (aislados al menos una vez por submuestra) de las
especies fúngicas asociadas a muestras de material vegetal con síntomas de FMP,
calculada a partir de (número de aislamientos de la especie / número total de
submuestras procesadas) x 100. 111
Fig.26. Frecuencia de aislamiento respecto al órgano del que proceden, de las especies más
abundantes pertenecientes al género Fusarium. 114
Fig.27. Compatibilidad vegetativa entre un aislado F. oxysporum f. sp. cubense mutante nit
1 y mutante nit M VCG 0120 de referencia 117
Fig.28. Comapatibilidad vegetativa débil entre un aislado F. oxysporum f. sp. cubene
mutante nit 1 y mutante nit M 117
Fig.29. a) FOC reacción Komada positiva colonias laciniadas. b) FO reacción Komada
negativo 117
Fig.30. Detalle del avance a través de los vasos del pseudotallo de una cepa de
Xanthomonas campestris inoculada. 122
Fig.31. Peso fresco y peso seco de las plantas de platanera cultivar ‘Gran Enana’ in vitro
bajo temperatura 17º/26º C y con/sin hipoxia radical. 125
Fig.32. Inoculación in vitro con Fusarium subglutinans y control 132
Fig.33. Inoculación con Fusarium subglutinans con y sin aceite mineral 132
Fig.34. Perspectiva general del ensayo de inoculación con diferentes aislados fúngicos
sobre plántulas del cultivar ‘ Gran Enana’ de platanera. 132
Fig.35. Análisis no paramétrico Kruscal Wallis de los valores (escal INIBAP) de severidad
de los síntomas en rizoma observados en plataneras del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas
con especies fúngicas asociadas al FMP, bajo condiciones controladas de invernadero a
26º-30ºC. 133
Índice de Figuras
Fig.36. Análisis no paramétrico Mann-Whitney U de la severidad de síntomas evaluados
mediante la escala INIBAP. de plataneras del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con especies
fúngicas asociadas al FMP, bajo condiciones de encharcamiento y no encharcamiento
en invernadero climatizado con temperaturas entre 26º-30ºC. 134
Fig.37. Vista general del ensayo de patogenicidad en condiciones de invernadero de
diferentes especies fúngicas en combinación con encharcamiento, sobre cv ’Gran
Enana’ 138
Fig.38. Detalle de síntomas en rizoma, avance por el cilindro central de raíz 138
Fig.39. Detalle de rizoma con síntomas de punteado típico de FMP 138
Fig.40. Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma obtenidos en
plataneras cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con una selección de especies fúngicas bajo
condiciones controladas de invernadero a 17º-28ºC y encharcamiento del suelo. ..... 139
Fig.41. Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma obtenidos en
plataneras del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con una selección de especies fúngicas bajo
condiciones controladas de invernadero a 17º-28ºC. A la izquierda: Efecto del
encharcamiento del suelo sobre la expresión de los síntomas en rizoma. A la derecha:
Efecto del corte de las raíces sobre la expresión de los síntomas en rizoma. 140
Fig.42. Tendencia de la diferencia de pH del agua de riego con el pH del agua de drenaje
en plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a encharcamiento e
inoculadas con diferentes especies fungicas. 142
Fig.43. Tendencia de la conductividad (mS) en plantas de platanera del cultivar ‘Gran
Enana’ sometidas a encharcamiento e inoculadas con diferentes especies fungicas. 142
Fig.44. Síntomas en el interior del rizoma en plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’
en diferentes suelos esterilizados/no esterilizados del norte de Tenerife. A la izquierda
valores para los suelos 1 ( C ), 2 ( E ), 3 ( Z. ). A la derecha, Valores para suelo
esterilizado (1) y no esterilizado (2). 143
Fig.45. Frecuencia de plantas con síntomas en rizoma, muertas y sanas en los diferentes
suelos del norte de Tenerife para el tratamiento esterilización/no esterilizacón. Códigos
de suelos C=1; E=2; Z=3. 144
Fig.46. Severidad de síntomas externos de platanera del cultivar ‘Gran enana’ en suelos del
sur de Tenerife. A la izquierda aparece representadas las medias de la suma de rangos
(MSR) de los síntomas en rizoma y amarilleo encontrados en los tres suelos (1, 2, 3)
ensayados. A la derecha aparecen representadas las MSR de los síntomas en rizoma y
amarilleo donde 1: es suelo esterilizado y 2 es suelo no esterilizado. 149
Índice de Figuras
Fig.47. Frecuencia de plantas sanas, muertas y con síntomas en rizoma en los diferentes
suelos del sur de Tenerife para los tratamientos esterilización/no esterilización. 150
Fig.48. Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma, acortamiento de
entrenudos y amarilleo de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelo
procedente de la plantación “Carmelo Villa” ( C ), bajo condiciones de suelo
esterilizado y no esterilizado. 155
Fig.49. Síntomas producidos en plataneras cv ‘Gran Enana’ cultivadas en suelo procedente
de la plantación Carmelo Villa, bajo condiciones de mezcla de suelo (25 %, 50 %, 75
% y 100 %) con picón. 156
Fig.50. Severidad de síntomas de amarilleo y necrosis en rizoma producidos en platanera
del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en sustrato tierra/picón bajo condiciones de
diferentes tiempos de encharcamiento (2, 4, 6 y 24 h), 160
Fig.51. Severidad de síntomas en rizoma de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’
cultivadas en sustrato turba/picón (70:30) bajo condiciones de diferentes tiempos de
encharcamiento. 167
Fig.52. Interacción de los factores suelo esterilizado / No esterilizado * suelo encharcado /
no encharcado. 176
Fig.53. Evolución del pH y de la conductividad del agua de drenaje en un ciclo de 3 d de
encharcamiento/ 4 días de drenaje /3 días de encharcamiento. 177
Fig.54. Bandejas utilizadas en el tratamiento de encharcamiento intermitente. 179
Fig.55. Punteado discontinuo en el pseudotallo característico del FMP 179
Fig.56. Síntoma característico del FMP en rizoma. Oscurecimientos en el anillo vascular y
en la médula. 179
Fig.57. Datos climáticos facilitados por el servicio de meteorología del Dpto. de Suelos y
riegos del ICIA, en la localidad de Güímar. 180
Fig.58. Localización de las plantas con síntomas en el ensayo sobre el efecto de
compactación y diferentes dosis de riego en campo sobre un ciclo de cultivo de cv
‘Gran Enana’ 185
Fig.59. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación y dosis de riego
intermedia (175% del asesorado) 186
Fig.60. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación y dosis de riego
intermedia (175% del asesorado) 186
Fig.61. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación y dosis de riego
intermedia (250% del asesorado) 187
Índice de Figuras
Fig.62. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación y dosis de riego
intermedia (175% del asesorado) 187
Fig.63. Corte en fresco del pseudotallo de planta sana, detalle de la organización los vasos
xilema y floema, en planta sana, x4 sin teñir. 190
Fig.64. Cortes en fresco del pseudotallo de planta con FMP. de vaso xilemático colapsado
en planta x4 sin teñir. 190
Fig.65. Detalle de la Fig.63. Cortes en fresco del pseudotallo de planta con FMP. de vaso
xilemático colapsado en planta x10 sin teñir. 190
Fig.66. Cortes en fresco del pseudotallo de planta con FMP. de vaso xilemático colapsado
en planta x4 Tinción calcofluor. 190
Fig.67. Corte en fresco, detalle de células lignificadas de la endodermis en planta sana.
x10. Tinción Floroglucinol 191
Fig.68. Corte en fresco, detalle de células cercanas a la epidermis lignificadas. x 4 Tinción
con Floroglucinol (sup.). Planta con FMP. (inf) detalle x10 Tinción con Floroglucinol.
191
Fig.69. Detalle de rafidio en corte de raíz de planta con FMP en fresco. x10. Tinción azul
de Tripán. 191
Fig.70. Corte en freco de raíz de planta con FMP, donde se observan los espacios aéreos
que configuran el aerenquima.x4 sin teñir. 191
Fig.71. Corte en fresco de la raíz de planta control. x10. Tinción con auramina O. 191
Fig.72. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta control. x10. Tinción PAS.
194
Fig.73. Corte en parafina (10 mm) de rizoma procedente de planta con FMP. x10. Tinción
PAS. 194
Fig.74. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x4. Tinción
PAS. 194
Fig.75. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. Rafidios. x40.
Tinción con calcofluor. 194
Fig.76. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x10. Tinción
Calcofluor. 195
Fig.77. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x25. Tinción
Calcofluor. 195
Índice de Figuras
Fig.78. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x10. Sin teñir.
195
Fig.79. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x25. Sin teñir.
195
Fig.80. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x25. Tinción
Auramina O. 195
Fig.81. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x25. Sin teñir.
195
Fig.82. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x10. Tinción
Auramina O. 196
Fig.83. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x40. Tinción
Azul de toluidina. 196
Fig.84. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x4. Tinción
Gerlach. 196
Fig.85. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x4. Tinción
Gerlach. 196
Fig.86. Corte en parafina (10 µ) de rizoma procedente de planta con FMP. x10. Tinción
Gerlach. 196
Fig.87. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x10. Sin
teñir. 198
Fig.88. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x10.
Tinción Calcofluor. 198
Fig.89. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x25.
Tinción Auramina O. 198
Fig.90. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x25.
Tinción Gerlach. 199
Fig.91. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x25.
Tinción Azul de Toluidina. 199
Fig.92. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x10. Sin
tinción. 199
Fig.93. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x10.
Tinción Auramina O. 199
Índice de Figuras
Fig.94. Corte en parafina (10 µ) de pseudotallo procedente de planta con FMP. x10.
Tinción Gerlach. 199
Fig.95. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con sana. x25. Tinción
Gerlach. 202
Fig.96. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con FMP. x25. Tinción Azul
de Toluidina. 202
Fig.97. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con FMP. x25. Tinción
Gerlach. 202
Fig.98. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con MP. x10. Tinción Gerlach
203
Fig.99. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con MP. x40. Tinción Gerlach
203
Fig.100. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con MP. x40. Tinción
Gerlach 203
Fig.101. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con MP. x40. Tinción
Azul de Toluidina 203
Fig.102. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con MP. x25. Tinción
PAS 204
Fig.103. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con MP. x40. Tinción
PAS 204
Fig.104. Corte en parafina (10 µ) de raíz procedente de planta con FMP. x25. Tinción
Azul de Toluidina 204
ÍNDICE DE TABLAS
Índice de Tablas
Tabla 1. Valores de referencia extraídos de diferentes fuentes incluidas en (Alves, 1997) y
(Galan Sauco, 1992) 45
Tabla 2. Características culturales de diferentes especies del género Fusarium, empleadas
para su identificación. Procede de diversas fuentes (Nelson, 1983) y (Nelson y Ploetz,
1990). 61
Tabla 3. Caracterización de tipo de mutantes (+): crecimiento tipo salvaje (-): crecimiento
hialino (Ploetz et al., 1992) 62
Tabla 4.Complementariedad entre los diferentes mutantes (Ploetz et al., 1992): 63
Tabla.5. Incidencia del “Falso Mal de Panamá” (FMP) en diferentes áreas de
producción en Las Islas Canarias. 89
Tabla.6. Parámetros físico-químicos del suelo de muestras procedentes de tres
plantaciones del sur de Tenerife. 95
Tabla.7. Valores de referencia para diferentes texturas de suelos de la Capacidad de
campo (CC) y Punto de marchitamiento permanente (Pmp) (Forsythe, 1975) 96
Tabla.8. Análisis de la textura (USDA) de dos parcelas de la plantación comercial
“El Cardón” del norte de Tenerife. 96
Tabla.9. Análisis fisicos de los suelos presentes en la parcela 1 (P1) y parcela 2 (P2)
de la finca comercial “El Cardón”. 96
Tabla.10. Valores medios de UFC/100 g de especies fúngicas, bacterianas en los
medios PDA, Komada y King B, de suelos asociados a FMP, realizados sobre tres
repeticiones de cada subparcela (C1, C2, C3) del suelo de la plantación comercial
“Carmelo Villa” situada en el norte de Tenerife, municipio de Los Realejos. 98
Tabla.11. Valores medios de UFC/100 g de especies fúngicas, bacterianas y Fusarium
spp en los medios PDA y Komada de suelos asociados a FMP, realizados sobre tres
repeticiones de la parcela 1 (P1) del suelo de la plantación comercial “El Cardón” situada
en el norte de Tenerife, municipio de Buenavista. 99
Tabla.12. Valores medios de UFC/100 g en suelo de especies fúngicas, bacterianas en
los medios PDA y Komada de suelos asociados a FMP de la plantación comercial
“Economista” situada en el norte de Tenerife, municipio de Buenavista del Norte 100
Tabla.13. Número total de muestras procesadas para el aislamiento de los
microorganismos asociados al FMP, según el órgano vegetal de procedencia y su
sintomatología (FMP y MP). 103
Tabla.14. Número total de aislados bacterianos y número de cepas seleccionadas para
su identificación y caracterización 103
Índice de Tablas
Tabla.15. Número y caracterización fenotípica en medio LPGA (48 h y 25ºC) de las
cepas seleccionadas para su posterior identificación y caracterización metabólica. 104
Tabla.16. Grupos metabolicos correspondientes a especies y géneros bacterianos
(manual de Bergey’s) en combinación con las pruebas de HR. 106
Tabla.17. Caracterización por ácidos grasos de mebrana, API 20E y API 20NE de las
cepas seleccionadas, representantes de los grupos obtenidos a partir de las cacterizaciones
fenotipicas y de las pruebas metabólicas. 110
Tabla.18. Número y frecuencia relativa de aislamiento de las diferentes especies
fungicas asociadas, en función del órgano estudiado. 112
Tabla.19. Número y frecuencia relativa de los aislados pertenecientes al género
Fusarium asociadas a plantas con síntomas de FMP, en función del órgano estudiado. 113
Tabla.20. Compatibilidad con el VCG 0120 de la selección de aislados pertenecientes
a la especie F.oxysporum y frecuencia de obtención de los mutantes nit 1; nit 3; nit M y
crn. 115
Tabla.21. Velocidad de crecimiento (mm/h) de las especies más frecuentes asociadas a
plantas con síntomas de FMP pertenecientes al género Fusarium, realizada con 5
repeticiones en los medio de cultivos PDA y Komada. 118
Tabla.22. Severidad de síntomas en rizoma y avance de las necrosis en pseudotallo de
plataneras del cultivar. ‘Gran Enana’ inoculadas con aislados bacterianos asociados al
FMP. 119
Tabla.23. Nº de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ que a los 30, 60, 70 y
90 días de la inoculación con aislados bacterianos asociados al FMP, manifestaban
síntomas en rizoma y/o en los vasos. 121
Tabla.24. Severidad expresada en porcentaje de síntomas externos, necrosis en
rizoma, colapso y de muertes de plántulas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’
inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP en pruebas in vitro bajo condiciones de
hipoxia radical y Tª 17ºC/26ºC 123
Tabla.25. Resultados del ANOVA para las variables peso fresco y seco de plántulas
de platanera cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP en
pruebas in vitro bajo condiciones de 26ºC y con/sin hipoxia radical y 17ºC y con/sin
hipoxia radical. 124
Tabla.26. Medias de los valores de los pesos frescos y pesos secos de las plantas de
platanera in vitro cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con diferentes especies fúngicas. 124
Índice de Tablas
Tabla.27. Severidad de síntomas externos, necrosis en rizoma, colapso y porcentaje de
muerte de plataneras cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al
FMP en pruebas in vitro bajo condiciones de temperatura de 17/26ºC y con/sin hipoxia
radical 126
Tabla.28. Efecto del factor especie fúngica sobre la severidad de síntomas externos,
necrosis en rizoma y porcentaje de muerte de plántulas de platanera cv ‘Gran Enana’ en
pruebas de inoculación in vitro. 127
Tabla.29. Resultados de la prueba Man-Whitney U de la comparación del tratamiento
control con cada una de las especies fúngicas para la severidad de los síntomas externos,
necrosis de rizoma, colapso y porcentaje de muertes de plántulas de platanera cv ‘Gran
Enana’ en pruebas in vitro. 128
Tabla.30. Resultados de la prueba de Mann-Whitney U no paramétrica para la
severidad de síntomas externos, necrosis en rizoma, colapso y muerte de plántulas de
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con FOC en pruebas in vitro, Tº 17/26ºC y
con/sin hipoxia radical 129
Tabla.31. Resultados de la prueba de Mann-Whitney U no paramétrica para la
severidad de síntomas externos, necrosis en rizoma, colapso y muerte de plántulas de
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con Fusarium proliferatum en pruebas in
vitro, Tº 17/26ºC y con/sin hipoxia radical 130
Tabla.32. Resultados del ANOVA y valores medios de variables fenológicas de
plantas de platanera del cultivar ‘Gruesa’, inoculadas con diferentes especies fúngicas bajo
condiciones de encharcamiento / no encharcamiento del suelo 135
Tabla.33. Efecto del encharcamiento sobre el peso fresco (pf), peso seco (ps) y altura
de plataneras del cultivar ‘Gruesa’ plantadas en suelo natural y en sustrato de turba:picón
(70:30), utilizados como control bajo condiciones contraladas de invernadero a 25ºC 135
Tabla.34. Valores medios de macro y micronutrientes en hojas de plataneras del
cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con diferentes especies fúngicas asociadas al FMP y
sometidas a encharcamiento del suelo, bajo condiciones controladas de invernadero a 25ºC
136
Tabla.35. Prueba Mann-Whitney de los síntomas en rizoma producidos por la
inoculación con FOC bajo encharcamiento/no encharcamiento y raíces cortadas/no
cortadas 140
Tabla.36. Resultados del ANOVA y valores medios de macro y micronutrientes de
hojas de platanera del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con los hongos seleccionados y
Índice de Tablas
sometidas a encharcamiento del suelo bajo condiciones controladas de invernadero a 17º-
28ºC. 141
Tabla.37. Resultados del ANOVA y valores medios de diferentes variables
fenológicas de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ en muestras de suelos en
esterilizados y no esterizados, procedentes de 3 plantaciones comerciales de la vertiente
norte de la isla de Tenerife con FMP. 145
Tabla.38. Resultados del ANOVA para macro y micronutrientes de las plataneras
cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelos Norte de Tenerife en condiciones de suelo
esterilizado y no esterilizado. 146
Tabla.39. Valores medios de magnesio y boro de muestras foliares combinadas de
platanera cultivadas en suelos del Norte de la Isla de Tenerife 147
Tabla.40. Valores medios de Na (ppm) de muestras foliares combinadas de plataneras
del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelos del norte de Tenerife en condiciones de
suelo esterilizado/no esterilizado. 147
Tabla.41. Resultados del ANOVA para variables fenológicas de plataneras del cultivar
‘Gran Enana’ en tres suelos del sur de Tenerife bajo condiciones de suelo esterilizado/no
esterilizado. 150
Tabla.42. Valores medios para diferentes variables fenológicas de plataneras del
cultivar ‘Gran Enana’ en tres suelos del sur de Tenerife bajo condiciones de
esterilización/no esterilización. 151
Tabla.43. Resultados del ANOVA y valores medios de difrentes variables fenológicas
para el factor suelo esterilizado / suelo no esterilizado de plantas ‘Gran Enana’ en suelos
del sur de Tenerife. 152
Tabla.44. Resultados del ANOVA y valores medios de micro y macronutrientes de
plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ en suelos del sur de Tenerife esterilizados y no
esterilizados. 153
Tabla.45. Valores medios de micro y macronutrientes de muestras foliares
combinadas de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ del Sur de la Isla de Tenerife
cultivadas 153
Tabla.46. Resultados del ANOVA para variables fenológicas de plataneras del cultivar
‘Gran Enana’ cultivadas en mezclas de suelos con diferentes cantidades de picón, de tres
muestras del suelo de la plantación comercial “Carmelo Villa” situada en el norte de la isla
de Tenerife, en condiciones de mezclas de suelos esterilizadas y no esterilizadas. 157
Índice de Tablas
Tabla.47. Valores medios de diferentes variables fenológicas de plataneras del cultivar
‘Gran Enana’ en diferentes mezclas de suelos con picón, de un suelo del Norte de Tenerife
158
Tabla.48. Resultados del ANOVA para variables fenológicas de plantas del cultivar
‘Gran enana’ en diferentes mezclas de suelos con picón, de un suelo del Norte de Tenerife,
parala infección mezcla de suelo por esterilización del suelo. 159
Tabla.49. Valores medios de diferentes variables fenológicas de plantas del cultivar
‘Gran enana’ en diferentes mezclas de suelos con picón, de un suelo del Norte de Tenerife,
parala infección mezcla de suelo por esterilización del suelo. 159
Tabla.50. Efecto de diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h) sobre las
variables fenológicas de plataneras cv ‘Gran Enana’. 161
Tabla.51. Efecto de diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h) sobre las
variables de peso fresco (pf) y peso seco (ps) en diferentes órganos de plataneras del
cultivar ‘Gran Enana’. 161
Tabla.52. Valores medios de micro y macronutrientes del pseudotallo de plataneras
del cultivar ‘‘Gran Enana’’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y
24 h). 162
Tabla.53. Valores medios de micro y macronutrientes del nervio foliar de plantas de
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0,
2, 4, 6 y 24 h). 163
Tabla.54. Valores medios de micro y macronutrientes de “cigarro puro” (última hoja
emitida sin desarrollar) de las plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes
tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h). 164
Tabla.55. Valores medios de micro y macronutrientes del peciolo foliar de plantas de
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0,
2, 4, 6 y 24 h). 164
Tabla.56. Valores medios de micro y macronutrientes de limbo foliar de plantas de
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0,
2, 4, 6 y 24 h). 165
Tabla.57. Resultados del ANOVA y valores medios de diferentes variables
fenológicas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ para el factor tratamiento de
encharcamiento (A, B, C y D)* 169
Índice de Tablas
Tabla.58. Efecto de diferentes tratamientos de encharcamiento (A, B, C y D) sobre las
variables de peso fresco (pf) y peso seco (ps) en diferentes organos de platanera del
cultivar ‘Gran Enana’ 169
Tabla.59. Efecto de diferentes tratamientos de encharcamiento (A, B, C y D) sobre
variables relacionadas con raíces de platanera del cultivar ‘Gran Enana’. 170
Tabla.60. Analisis de macro y micronutrientes en el limbo foliar de plantas de
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tratamientos de encharcamiento
(A, B, C y D) cultivadas en macetas de 50 l de capacidad en sustrato turba:picón (70:30).
171
Tabla.61. Analisis de macro y micronutrientes en el peciolo foliar de plantas de
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tratamientos de encharcamiento
(A, B, C y D) cultivadas en macetas de 50 litros de capacidad en sustrato turba:picón
(70:30). 172
Tabla.62. Síntomas en rizoma de plantas de platanera de cultivar ‘Gran Enana’
cultivadas en suelo esterilizado y no esterilizado, sometido a encharcamiento y
compactación. 173
Tabla.63. Resultados del ANOVA y valores medios de las variables fenológicas de
plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelos esterilizados y no
esterilizados bajo condiciones de encharcamiento intermitente y compactación. 174
Tabla.64. Valores medios del diametro del pseudotallo y emisión de nº de hojas en
platanera del cultivar ‘Gran Enana’ bajo el efecto de la interacción del tratamiento
encharcamiento con esterilización del sustrato tierra:picón (70:30). 176
Tabla.65. Resultados del ANOVA para las variables Altura del pseudotallo,
(Altl9l59); Diámetro (Diaml9l5) y Número de hojas(Nhl9l5) de plantas de platanera del
cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en una parcela bajo diferentes niveles de compactación
del suelo y diferentes dosis de riego. 181
Tabla.66. Valores medios de los factores bloque y riego para las variables altura,
diametro y número de hojas de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en
una parcela bajo diferentes niveles de compactación del suelo y diferentes dosis de riego
181
Tabla.67. Resultados del ANOVA para las variables PL-PAR; PP, PR; NM y ND de
plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelo con diferentes niveles de
compactación y a diferentes dosis de riego. 182
Índice de Tablas
Tabla.68. Valores medios paras los factores bloque y riego de las variables PL-PAR;
PP; PR; NM; y ND 183
JUSTIFICACIÓN
Justificación
2
JUSTIFICACIÓN
Desde finales de la década de los 80, cuando se estaban iniciando los trabajos sobre el Mal
de Panamá (MP) en Canarias (Hernández, 1997), se empezaron a observar casos con una
sintomatología similar pero de los que no se podía aislar su agente patógeno, Fusarium
oxysporum f. sp. cubense (FOC), sino otras especies fúngicas entre las cuales se
encontraban miembros de la especie colectiva F. oxysporum, habitantes comunes de los
suelos, acompañadas en muchos casos de bacterias. Los agricultores utilizaban el término
“veta negra” para diferenciar estos casos de los de la “veta amarilla”, nombre popular del
MP. Los primeros casos, se presentaron en Buenavista, municipio situado en el Norte de la
Isla de Tenerife.
Sin embargo, la incidencia de casos fue aumentado en los últimos años, sobre todo en los
años 96, 97 y 98, en el que se llegaron a alcanzar valores del 20% o superiores. A lo largo
de los años 1999-01, el número de casos ha sido menor, quizás porque también ha
descendido el número de nuevas plantaciones, motivado por la suspensión de las
subvenciones al material de plantación, por haber tenido una climatología favorable
durante este periodo o porque el agricultor ya reconocía los síntomas asociados y no
necesitaba de un diagnostico, y en muchos casos sabían también que mejorando la
estructura de sus suelos y espaciando el riego durante el día conseguían mejorar el drenaje
y en muchos casos solucionaban el problema.
Según las cifras de incidencia del año 1998, sólo en el material de plantación se podrían
estimar unas perdidas en torno a los 108.000 €, a lo que habría que añadir todos los gastos
de mano de obra, riegos, abonados etc. Dado que las cifras de incidencia podrían suponer
el equivalente de unas 60 Ha, el total de perdidas podría estimarse en unos 480.000-
600.000 € para dicho año. En los casos de plantaciones muy afectadas, las perdidas podrían
considerarse totales, pues los hijos también suelen estar afectados o acaban afectándose y
no parecía conveniente utilizarlos para continuar el ciclo productivo. Estas cifras, aunque
pueden resultar poco importantes, si lo son para un sector que es muy sensible a cualquier
incidencia que amenace la rentabilidad de la producción, y que había asistido en la última
década a la sustitución del cultivares ‘Pequeña Enana’ por el ‘Gran Enana’, al último
episodio de Mal de Panamá, a la aparición del BSV (Banana streak virus) y la expansión
del “picudo” (Cosmopolites sordidus).
Justificación
3
Este sector era el año 1999 el segundo de mayor importancia en cuanto a la superficie
cultivada, con 8.922,7 Ha, de las cuales 7.296,7 correspondían a la provincia de Tenerife,
con una producción total de 362.313 Tm que suponían 141.323.604 € y una contribución a
la producción agraria del 20,86% (Anónimo, 1999). Su importancia económica y social es
enorme pues da lugar a 25.000 empleos directos y 100.000 relacionados cultivo y que
agrupa tanto a pequeños como a grandes productores (Anónimo, 1995-1996).
En Sudáfrica, Deacon et al. (1985) describieron una sintomatología similar al “Mal de
Panamá” causado por FOC a lo que denominaron “Fals Panama disease”, estableciendo
los primeros criterios para diferenciarlos. En nuestro trabajo hemos utilizado la traducción
al castellano “Falso Mal de Panamá” para una sintomatología coincidente con sus
descripciones.
A principios y mediados de siglo pasado se describieron en la región centro americana y
Caribe desordenes aparentemente similares bajo las denominaciones de “Yellow Mat”
(“Mata Amarilla”) por Prescott (1917) y Dunlap (1923), y “Colorado disease” por Permar
(1925) y Reinking (1926) aludiendo a la región donde se observó.
La etiología del desorden se desconoce. En las pruebas de inoculación realizadas por los
autores citados y por Hernández (1997), con algunas especies fúngicas pertenecientes al
genero Fusarium, no se logró reproducir los síntomas. Por ello, se ha sugerido que algún
factor abiótico pueda ser la causa del desorden, en particular los relacionados con suelos
pesados, compactación y mal drenaje que pueden conducir a problemas de nutrición
aunque no se ha excluido la implicación de algún agente biótico. En nuestras
observaciones preliminares (Sabadell González and Hernández, 1999), la mayoría de las
plantaciones que presentaban “Falso Mal de Panamá” también presentaban suelos
arcillosos y los máximos picos de incidencia se dieron en enero y febrero, los meses mas
fríos del año.
La acción de las bajas temperaturas, la compactación y el encharcamiento del suelo
producen síntomas de amarilleo en platanera, pero no se ha documentado que produzcan
decoloraciones vasculares. En platanera y otras plantas hospedadoras, se han descrito
anomalías del xilema y del floema asociadas tanto a factores biótico como a factores
abióticos, incluidas las deficiencias nutricionales. Los oscurecimientos vasculares se han
asociado tradicionalmente a respuestas defensivas ante patógenos vasculares aunque
también pueden producirse como respuestas inespecíficas a organismos no patógenos o
Justificación
4
factores abióticos que producen activación enzimática oxidativa, acumulación de
fitoalexinas, necrosis celulares sistémicas y bloqueos xilemáticos en algunas ocasiones.
En platanera ha sido documentada la perdida de resistencia del cv. ‘Willian’ a FOC,
provocada por el encharcamiento y la hipoxia concomitante. En otros patosistemas se han
citado casos de complejos de enfermedades como en la seca del olivo, o de especies
fúngicas de debilidad de debilidad, en las que era necesaria la concurrencia de algún agente
abiótico para la expresión de la enfermedad, o la presencia de endófitos que eran patógenos
latentes o especies saprófitas.
Por todo lo expuesto y siguiendo las hipótesis de Deacon et al., se ha considerado de
interés la realización de este trabajo, cuyo objetivo último ha sido contribuir al
conocimiento de la etiología y epidemiologia de este desorden.
OBJETIVOS
Objetivos
6
I. Determinar la incidencia, distribución y los factores que favorecen la
aparición del FMP.
II. Aislamiento, identificación y caracterización de las especies fúngicas y
bacterianas asociadas al FMP.
III. Determinar la patogenicidad de los aislados fúngicos y bacterianos asociados
al FMP tanto en pruebas de inoculación simples como bajo la acción de factores
abióticos.
IV. Estudiar el papel de los factores abióticos tipo de suelo, compactación y
encharcamiento en la expresión de síntomas del FMP.
V. Realizar estudios histológicos para determinar la naturaleza de los
oscurecimientos vasculares asociados al FMP y establecer un diagnóstico
diferencial con el MP.
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Revisión Bibliográfica
8
1 CLASIFICACIÓN BOTÁNICA, ORIGEN, EVOLUCIÓN Y DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA DE
LA PLATANERA (MUSA SPP.)
La platanera es una planta monocotiledónea, orden Scitaminales, familia Musaceae, donde
se encuentran las subfamilias Heliconioideae, Strelitzioideae y Musoideae (Simmonds,
1966). Esta última incluye los géneros Ensete y Musa. El género Musa está constituido por
cuatro series o secciones: Australimusa, Callimusa, Rhodochlamys y (Eu-) Musa
(Simmonds 1962; 1966). Basándose en el número básico de cromosomas, Cheesman y
Simmonds (1948) dividieron el género Musa en dos grupos: especies con n=10
cromosomas, que pertenecen a las secciones Australimusa y Callimusa; y especies con
n=11 cromosomas, que integran las secciones Rhodochlamys y (Eu-) Musa. Esta última
incluye la mayoría de las variedades cultivadas de platanera que provienen del cruzamiento
de los diploides silvestres M. acuminata Colla (AA) y M. balbisiana Colla (BB), los cuales
se originaron en el continente asiático, probablemente en la península Malaya (Simmonds,
1966) y de cuyas combinaciones resultan tres niveles cromosómicos distintos: diploides,
triploides y tetraploides, con 2, 3 y 4 múltiplos del número básico de cromosomas (n=11)
respectivamente (Simmonds y Shepherd, 1955).
La distribución geográfica de la platanera viene condicionada por sus exigencias climáticas
ya que su zona de origen corresponde a los grandes bosques tropicales húmedos del
sudeste asiático, en los que la atmósfera está siempre al borde de la saturación y el suelo
permanece siempre húmedo. Requiere calor constante y humedad elevada para su correcto
desarrollo. Estas condiciones se dan en la franja comprendida entre los paralelos 30º de
latitud Norte y Sur (Galan Sauco, 1992), en las regiones cuya temperatura extrema clásica
media oscila entre 10ºC y 40ºC. La humedad, temperatura y radiación solar así como las
características de los diferentes tipos de suelos son los factores abióticos más importantes
para el desarrollo de la planta. En el apartado de estrés abiótico se tratarán detalladamente
sus efectos.
1.1 Anatomía de la platanera
Diferentes autores han descrito extensamente la planta (Champion, 1968), (Simmonds,
1966) y (Soto, 1985). Basado en estos estudios, a continuación se presenta un resumen de
las principales características de las partes subterránea y aérea. El aparato subterráneo esta
formado por la sucesión en el tiempo y el espacio, de tallos vegetativos de forma masiva y
Revisión Bibliográfica
9
globulosa, denominado rizoma, cuya función es de reserva además de ser el órgano a partir
del cual se desarrollan las raíces (Simmonds, 1966). Las raíces son largas, cilíndricas, poco
ramificadas y numerosas. Exploran el suelo en una profundidad de 20-30 cm y en un radio
de 2-3 metros.
Del rizoma emergen lateralmente nuevas yemas que serán los “hijos” y que constituirán la
siguiente generación. Bajo condiciones de cultivo y mediante la practica del deshijado se
eliminan los no deseados y suele dejarse uno solo. (Fig.1).
El aparato aéreo se compone de pseudotallo, pecíolos y limbos foliares. La vaina es el
primer segmento del pecíolo directamente insertado en el rizoma. Está formada por tejidos
conductores y fibro-suculentos. El conjunto concéntrico de todas las vainas constituye el
pseudotallo.
El limbo esta formado por dos semilimbos que son surcados muy regularmente por los
nervios transversales (Champion, 1968). Los dos semilimbos no son exactamente
simétricos. La emisión y diferenciación floral a partir de la fase vegetativa, tiene pocos
signos externos que permitan saber en que momento se va a producir, aunque un parámetro
eficaz es el número de hojas emitido, que suele ser un número constante en cada cultivar
hasta que se produce la emisión floral o “piña”. Simmonds (1966) describe para el cv.
“Dwarf Cavendish” que la piña se producía después de las hojas 16 a 21en primer ciclo.
(Galan Sauco y García Samarín, 1984); Galan Sauco (1992) describe para los cv.
‘Cavendish’ en condiciones de Canarias y de los subtrópicos, que a partir del 3er ciclo,
pueden llegar a emitir 40 hojas en total. Otro indicador eficiente es la reducción del área
foliar de las últimas tres hojas antes de la inflorescencia (Alves, 1997).
Desde el punto de vista histológico, Sandoval y Müller (1990) estudiaron la morfología y
anatomía de los diferentes órganos relacionándolos con su función en la planta. Lecuona
(1975) realizó un estudio exhaustivo del cultivar ‘Pequeña Enana’ siendo su trabajo el
primer estudio histológico de la platanera realizado en Canarias.
En M. rosacea (M. ornata), Alquini y Morretes (1996) hacen particular referencia al
desarrollo del sistema vascular.
Fig. 1. Diagrama del ciclo vegetativo de la platanera cv ‘Gran Enana’, bajo condiciones de clima subtropical en Canarias. (Diseño de Salvador Díaz),
siembra 5- 15 días 2 meses 6 meses 12 meses 14 meses 17 meses
Revisión Bibliográfica
11
1.2 El cultivo de la platanera en Canarias
Las Islas Canarias, situadas en el Oceano Atlántico cerca del Trópico de Cáncer entre las
latitudes 27º 24’ N y entre las longitudes 13º 20’ t 18º 19’ Oeste, poseen zonas de baja
altitud con climas de tipo subtropical e incluso tropical que hacen posible la adaptación de
gran número de especies “tropicales” que suelen ser siempre verdes, leñosos o herbáceos y
con escasa o nula tolerancia a heladas (Galan Sauco, 1992).
Según la cronología dada por Simmonds (1966) y la revisión realizada por Galan Sauco
(1992), la platanera (cultivares Acuminata) se establece en las costas del Mediterráneo
sobre el siglo VII. Parece que a Canarias llega a finales del siglo XV traído por
portugueses procedente de Guinea. Desde Canarias se estima que llegó a América a
principios del siglo XVI (año 1516 a Santo Domingo).
Los actuales cultivares utilizados en Canarias son triploides de M. acuminata Colla (AAA),
pertenecientes al subgrupo ‘Cavendish’ que incluye los cultivares mas utilizados en los
subtrópicos, (Simmonds, 1966) y (Galan Sauco, 1992).
En Canarias predomina el cultivar (cv.) ‘Pequeña Enana’, aunque a partir de la década de
los 90 comenzó una sustitución progresiva por el cultivar ‘Gran Enana’ del mismo grupo y
por selecciones locales de ‘Pequeña Enana’ como ‘Gruesa’, ‘Brier’, ‘Negrita’, entre otras.
La evolución de la superficie cultivada en las islas ha sido diversa (Anónimo, 1999). En
Tenerife, Rodríguez Brito (1985) cita que el incremento del cultivo llega hasta mediados
de la década de los 70, cuando se produce un estancamiento de la superficie total, aunque
ocurre un traspaso de superficies cultivadas de vertientes norte a sur. Actualmente se esta
produciendo una disminución en dichas zonas debida a la competencia con el sector
turístico.
La platanera es el principal cultivo del Archipiélago Canario con una superficie del orden
de 9194 ha en 2001y 418.000 Tm de producción anual comercializada en la Unión
Europea. Tenerife es la isla de mayor extensión y dedicación al plátano, con casi 4180 ha
en 2001 y 6.000 ha (datos ISTAC). Los plátanos se producen en Canarias con un alto nivel
de tecnología que incluye la preparación artificial del suelo, la utilización de plantas de
cultivo in vitro de cultivares selectos y modernas técnicas de fertirrigación. Canarias es
también el lugar donde la utilización de invernaderos para el cultivo del plátano está más
avanzada en el ámbito mundial. Ello permite obtener rendimientos superiores a 90
(t/ha/año) en las mejores explotaciones plataneras (Rodrigo López, 2002).
Revisión Bibliográfica
12
1.3 Condiciones y características físico-químicas de los suelos en las
plantaciones comerciales de Canarias.
En general, en los suelos de Tenerife predominan las arcillas (Perez Mateos y Fernandez
Caldas, 1972) y (Rodriguez Pascual, 1971). Las tierras utilizadas para el cultivo de la
platanera son muy diversas, en Canarias predominan los suelos volcánicos, que a menudo
no son mucho más que roca fragmentada, lapilli o “picón”, obligando a los agricultores a
preparar el terreno o “sorriba” construyendo terrazas en las que se incorporan tierras
procedentes de las zonas altas de la isla (Galan Sauco, 1992), muy ricas en arcillas, sobre
todo alófanas (Dominguez, 2001).
Estos suelos tienen tendencia a la compactación y a presentar drenajes pobres.
Características similares han sido descritas para algunos suelos de Guadalupe (Dorel, 1990,
1993; Dorel y Ozier Lafontaine, 1998).
Alvarez et al. (1999) describen químicamente los suelos dedicados a la platanera de
Canarias desde el punto de vista de la fertilidad. La mayoría, muestran pH neutros o
ligeramente alcalinos, valores que pueden comprometer la disponibilidad de los iones
hierro y manganeso para las plataneras en algunas plantaciones. Se observaron valores
muy elevados de sodio perjudiciales para las plataneras que provocan toxicidades
específicas y estrés por salinidad. El fósforo se encuentra en los niveles máximos
requeridos por la platanera generalmente, lo que puede provocar bloqueos de
disponibilidad de zinc. Los valores de calcio, magnesio, y potasio muestran medias
elevadas, aunque la relación Ca:Mg y K:Mg en algunos suelos se decanta en beneficio del
magnesio y potasio, respectivamente, lo cual puede llegar a afectar a la nutrición de las
plataneras. Sobre el desequilibrio potásico-magnésico en los cultivos de plátanos en
Tenerife, Garcia et al. (1978) concluyeron que el desequilibrio favorece al potasio en
contra del magnesio y conduce a que la planta manifieste síntomas de carencia de
magnesio y exceso de potasio. También habían observado que los niveles de sodio fueron
siempre valores en exceso de la misma forma que los de potasio en muchos suelos, con la
consecuencia de toxicidad y salinidad.
En Canarias, Suárez (2000) caracterizó el agua de riego utilizada en los suelos agrícolas
del norte de Tenerife, en su mayoría procedente de pozos y aguas subterráneas, que poseen
un elevado contenido de iones tóxicos como el Sodio y el Cloro y escasa presencia de
Calcio, que provoca un aumento de SAR (Relación de adsorción de sodio). Vargas y
Revisión Bibliográfica
13
Rodríguez (2000) estudiaron la calidad del agua de riego en la zona productora del sur de
Tenerife, de mejor calidad que la del norte. El aporte de agua con elevado sodio y bajo
Calcio, a suelos con elevado contenido en arcillas expansibles hace que se produzcan
hinchamientos de estas, ocasionando problemas de infiltración y acumulación de sales
procedentes de los abonos, que puede conducir a encharcamiento además de salinidad en el
suelo (Suárez y Santana, 2002).
Revisión Bibliográfica
14
2 ASPECTOS FITOPATOLÓGICOS. ENFERMEDADES DE LA PLATANERA.
A continuación se presenta una breve descripción de las principales enfermedades y
desordenes conocidos hasta el momento de la platanera (Jones, 2000).
2.1 Nemátodos
Son varias las especies de nemátodos asociadas a la platanera: El de mayor importancia
económica es R. similes. Las heridas causadas por su actividad son una vía de entrada de
microorganismos secundarios, que producen coloraciones rosadas, pardeamientos
vasculares y pudrición. Este nemátodo no se encuentra presente en Canarias. El género
Helicotylenchus spp. y la especie Rotylnchulus reniformis tienen una gran importancia
como parásitos de musáceas en muchos lugares productores de plátano o banano aunque en
Canarias, solo esta descrito Helycotylenchus sp.
Otros nemátodos importantes descritos para la platanera en Canarias cuya sintomatología
en raíces se manifiesta de forma diferente según la naturaleza del nemátodo son:
agalladores como Meloidogyne incógnita y M. Javanica o lesionadores como
Helicotylenchus multicinctus, Pratylenchus coffeae. La sintomatología externa recuerda a
situaciones de estrés abiótico y bloqueos de nutrientes tales como amarilleos foliares y
decaimiento principalmente (Rodríguez Santana et al., 1984).
2.2 Virus
Virus del Bunchy top (BBTV): Los síntomas iniciales consisten en estrías verde oscuras a
lo largo de las nervaduras de las hojas y del peciolo. Posteriormente se observa una
reducción de la lámina foliar y clorosis. Internamente se produce una hiperplasia con
aumento de la división celular e hipertrofia del floema y parénquima adyacente que puede
conducir a necrosis e invasión de sustancia mucilaginosas. El agente causal pertenece al
grupo de los luteovirus, presentando partículas isométricas de diámetro variable entre 20 y
28 nm. Se transmite a través del pulgón Pentalonia nigronervosa Coquerel. Está
considerada la principal virosis de la platanera, distribuida por Asia, África y algunas islas
del Pacífico (Dale, 1993), hasta el momento no se ha descrito en Canarias (Thomas y Iskra
Caruana, 2000).
Virus del mosaico del pepino (CMV): Los síntomas caracteristicos varían desde suaves
estrías amarillas hasta necrosis en las hojas. El agente causal presenta partículas esféricas y
Revisión Bibliográfica
15
un gran número de estirpes. Se transmite a través de áfidos como el Aphis gossypii Glover.
Presente en Canarias.
Virus del rayado (BSV): Aunque la sintomatología es muy similar al CMV (Lockhart y
Jones, 2000) varia según el aislado, el cultivar y el ambiente y puede expresarse desde una
discretas motas cloróticas hasta estrías necróticas. Generalmente los síntomas suelen ser
rayas discontinuas o a veces continuas amarillas o cloróticas desde el nervio central a los
márgenes. Pertenece al grupo de los badnavirus. Esta transmitido por Planococus citri, y se
encuentra en Canarias.
Virus de las brácteas (BBrMV): Es el que más recientemente se ha descrito. Se
diferencia del resto de virosis por producir un mosaico característico en las bracteas,
aunque también produce en ocasiones un aumento de la pigmentación del pseudotallo.
Pertenece a los potyvirus. Está transmitido por Aphis gossypii Glover, Rhopalosiphum
maidis (Fich) y Pentalonia nigronervosa Coquerel.
Otras virosis descritas en la platanera son: “Virus del mosaico suave” (BanMMV) que
produce una sintomatología incierta, a veces observándose mosaico y rayas cloróticas en
hojas y el “Virus de la muerte de la hoja terminal” (BDBV) que produce clorosis en
hojas y arrugas, necrosis marginal y muerte de la última hoja no desenrrollada o hoja
“cigarro puro”.
2.3 Bacterias
En la platanera la enfermedad más importante producida por una bacteria es el “Moko”,
cuyo agente causal es Ralstonia solanacearum (Yabuuchi, 1995); Pseudomonas
solanacearum E.F. Sm raza 2, biovar 1; Burkholderia solanacearum) (Hayward, 1994). Se
trata de un organismo aerobio, gram negativo, no fluorescente. El patógeno utiliza los
vasos conductores como medio de multiplicación y dispersión. Los haces vasculares
acaban bloqueándose dando lugar a los síntomas característicos de amarilleo y marchitez,
semejantes a los que la planta manifiesta cuando sufre sequía, como ocurre en otras
enfermedades vasculares como el MP. Existen dos vias infección, por el suelo (en la
mayoria de plantaciones comerciales) y por insectos (en plátanos de cocinar). En los
cultivares AAA, las plantas infectadas por ‘moko’ muestran amarilleamiento normal en las
hojas más viejas, que se va acentuando al mismo tiempo que se propaga a las más nuevas.
El follaje afectado se marchita y se dobla, quedando las hojas colgadas y adheridas a la
planta (en falda). Los hijos de plataneras enfermas presentan también amarilleos y
Revisión Bibliográfica
16
marchitez con seca. La planta también presenta síntomas internos que se asemejan mucho a
los síntomas asociados al MP (Thwaites, 1999) pues en el rizoma aparece una serie de
puntos que pueden ser de color amarillo, marrón oscuro o casi negros, aunque la diferencia
con la enfermedad vascular de origen fúngico es la presencia además de áreas blandas de
color oscuro. Tales puntos no son otra cosa que el corte de las venas internas conductoras
de la savia, las cuales han sido coloreadas por la acción tóxica de los agentes patógenos. Es
característica de suelos arcillosos. Se encuentra ampliamente distribuida por todo el
mundo, aunque no se encuentra descrita en Canarias.
La enfermedad conocida como “Banana Blood disease”, que produce marchitez foliar y
coloración roja de los frutos, está presente en Java y Sumatra y su etiología ahora parece
estar clara (Thwaites, 1999) ya que podría estar producida por unas cepas bacterianas muy
próximas a Ralstonia solanacerum, antes denominadas Pseudomonas celebensis nombre
no válido actualmente (Eden Green y Sastraatmadja, 1990) o Xanthomonas campestris
(Davis et al., 2000). Molina (1999), Stover y Espinoza (1992), la citan como Pseudomonas
celebensis (Xanthomonas campestris pv. celebensis).
La “Javanese Vascular Disease”, enfermedad de particular interés, aunque no bien
estudiada, en cuya etiología parecen intervenir especies de Fusarium y de Pseudomonas
(Thwaites, 1999).
También han sido citadas como de menor gravedad otra serie de géneros y especies
productoras de podredumbres blandas del pseudotallo y del rizoma como Erwinia sp.
en especial la especie E. carotovora subsp. atroseptica, que produce una pudrición en el
rizoma (Pereira y Nunes, 1988), E. carotovora (Cedeno-M et al., 1990), E. carotovora
subsp. atroseptica (Lakshmanan y Mohan, 1992), E. carotovora (Robinson y Manicom,
1991) y E. chrysanthemi. En bananos FHIA, Guzman y Sandoval (1996) describen una
decoloración vascular en producida por E. carotovora. También se describen en
podredumbres blandas del rizoma los géneros Xanthomonas, en especial Xanthomonas
campestris pv. manihotis (Hahn et al., 1989) y Pseudomonas (P. solanacearum biovar 3)
(Eden Green et al., 1994). Pseudomonas solanacearum race 1, fue aislada de plantas
enfermas de Musa shizocarpa, y posteriormente inoculada en el diploide Sucrier (AA), un
cultivar derivado de M. acuminata causando amarilleo foliar pero no fue patogénica en
bananos triploides (Akiew, 1992).
Revisión Bibliográfica
17
Dickey y Victoria (1980), citaron a Erwinia carotovora spp. paradisiaca, E. paradisiaca,
E. carotovora spp. chrysanthemi y E. chrysanthemi como causantes de podredumbre del
pseudotallo de Musa paradisiaca Linnaeus. En Cuba, Rivera Docando (1978) describió
como causante de enfermedad de pseudotallo a Erwinia chrysanthemi [pv. chrysanthemi] y
de la podredumbre del cormo a E. carotovora spp. carotovora en el cultivar ‘Macho’ de
plátano de cocinar.
Como causantes de la “pudrición acuosa del pseudotallo” se ha citado a E. chrysanthemi
pv. paradisiaca (Salazar y Duque, 1994) en Musa spp. Otras bacteriosis de Musa spp. han
sido atribuidas a P. solanacearum biovar 3 (Hayward, 1994).
El “Bugtok”, aunque es predominantemente una enfermedad de los frutos, también puede
afectar al pseudotallo y ha sido atribuida a estirpes de R. solanacearum, en los cultivares
‘Saba’ y ‘Cardaba’ (Soguilon et al., 1994) pertenecientes al subgrupo Musa balbisiana y su
transmisión puede ser por insectos (Soguilon et al., 1995). También llamada “Taprouk
disease” ha sido asociada a P. solanacearum biovar 1 (Hayward, 1994).
La “enfermedad bacteriana de Abacá” en la que parecen intervenir especies próximas a
Ralstonia solanacearum raza 2 y cuya sintomatología es similar a la del “moko”, aunque
se diferencia por causar rayas marrones a lo largo de las venas de las hojas (Thwaites,
1999).
“Enfermedad bacteriana” de Ensete ventricosum causada por Xanthomonas
musacearum (Demeke, 1986). Recientemente, se ha asociado a la especies X. campestris
pv. musacearum (Korobko, 1997). Chase y Jones (1987) también describen a X. campestris
como causante de podredumbre blanda en Strelitzia reginae.
Otras bacterias no patogénicas han sido aisladas de plantas de platanera como
contaminantes in vitro, tales como Mycobacterium sp., Bacillus subtilis y B. Cereus
(Benjama, 1994; Houwe et al., 1998). También se han encontrado como contaminantes de
los medios utilizados en cultivo in vitro Staphylococcus xylosus, S. aureus, S. cohnii,
Bacillus sp., Corynebacterium sp. y Pseudomonas vesicularis (Kneifel y Leonhardt, 1992)
y contaminaciones endógenas causadas por bacterias pertenecientes a los géneros
Pseudomonas, Erwinia y Bacillus (Surga y Guevara, 1994).
Revisión Bibliográfica
18
2.4 Hongos
Enfermedades foliares
La Sigatoka-amarilla se caracteriza por la presencia de manchas amarillas foliares,
causadas por Mycosphaerella musicola Leach. Puede provocar pérdidas superiores al 50%
en la producción. La infección ocurre en las hojas más nuevas. Se da en zonas con régimen
de lluvias intenso y con temperaturas medias alrededor de 25ºC. No se ha descrito en
Canarias hasta el momento (Meredith, 1970).
La Sigatoka-negra, es muy parecida a la Sigatoka-amarilla, también es una enfermedad
foliar y los síntomas en el subgrupo Cavendish se caracterizan inicialmente por motas
marrones rojizas que progresan a rayas negras en las hojas maduras. Esta causada por
Mycosphaerella fijiensis Morelet (Carlier, 2000), mucho más agresivo que M.musicola
Leach (Jones, 2000). No se encuentra descrita en Canarias.
Son las enfermedades de etiología fúngica con mayor importancia económica y por su
amplia distribución mundial. Otra especie patógena es Mycosphaerella eumusae, nueva
enfermedad cuyo anamorfo es Septoria, de ahí la denominación inglesa “Septoria leaf spot
of banana” (Carlier et al., 2000).
Enfermedades de la raíz
Dos especies de Cylindrocladium fueron descritas para banana causantes de lesiones
radicales: C. gracile y C. spathiphylli (Declerck et al., 2002); (Risede y Simoneau, 2001).
Este género ha sido asociado a infecciones del nemátodo Radopholus similis. Esta
interacción nemátodo-hongo varia según el clima y las características del suelo y causa
disminución del vigor del sistema radical (Jones, 2000).
Enfermedades del rizoma
Armillaria mellea y A. tabescens causantes de podredumbres en el cormo no es muy
común. Jones (2000) cita solo tres lugares Australia, Kenia y Florida donde se ha
encontrado asociada a nuevas plantaciones establecidas en tierras deforestadas.
En Colombia se ha descrito en plátano (‘Dominico Harton’, AAB) una enfermedad
conocida como “llaga estrellada”, producida por Rosellinia pepo. Se diagnostica fácilmente
debido a la presencia de cordones miceliares que se ven a simple vista en la superficie
exterior del rizoma. Se suele asociar a suelos que habían sido deforestados hacia poco
tiempo, donde quedan muchos restos de madera. Es un patógeno común de otras especies
como el café y el cacao (Belalcazar, 1991).
Revisión Bibliográfica
19
También han sido citadas otras enfermedades menores de la platanera como las producidas
por Rhizoctonia solani en plántulas (Zhang et al. 1999; 2000), y Ceratobasidium stevensii
descrito por Benchimol et al. (2001) en Musa cv. Yangambi. Este hongo penetra en la
planta de forma natural por el peciolo, exhibiendo micelio blanco en cuerdas (rizomorfos)
que causa eventualmente seca de las hojas
Frisullo (1994) determinó mediante pruebas de patogenicidad que el amarilleo que
presentaban algunas plataneras con síntomas de podredumbre de rizoma y raíz, era
producida por Fusarium compactum.
Se han descrito algunos hongos endófitos como patógenos de debilidad u oportunistas en
banana (Photita et al., 2001) tales como, Xylariaceous taxa, Guignardia cocoicola,
Colletotrichum gloeosporioides (Glomerella cingulata), C. musae, Guignardia cocoicola,
varios micelios estériles, Xylariaceous spp., Deightoniella torulosa, Pyriculariopsis
parasitica y Dactylaria sp. Muchos de los aislados endófitos son patógenos establecidos de
la platanera. Estos resultados soportan la hipótesis de que algunos endófitos son patógenos
latentes o oportunistas.
2.4.1 El Mal de Panamá
También denominada “Marchitamiento por Fusarium”, se trata de la enfermedad más
grave en la platanera presente en las Islas Canarias (Ploetz y Galan Sauco, 1998). Está
producida por Fusarium oxysporum f.sp. cubense (E.F. Smith) Sn & Hansen (FOC). La
infección ocurre en las raíces, ascendiendo después al rizoma y pseudotallo. Causa
amarilleo de las hojas más viejas a las más nuevas (Simmonds, 1966) y (Stover, 1990).
Dada la similitud de síntomas entre el Mal de Panamá y el Falso Mal de Panamá (Deacon
et al., 1985) y (Sabadell González y Hernández, 1999) en este apartado, se describen los
síntomas, incidiendo en qué mecanismos actúan en el desarrollo y su expresión así como
en la biología del agente causal FOC.
La primera constatación de que el Mal de Panamá (MP) estaba causado por Fusarium
oxysporum f.sp. cubense (FOC), la realizó Smith en 1904. Es la enfermedad más
devastadora que se conoce de la platanera (Rutherford, 1999; Stover, 1990).
Se halla distribuida por todas las zonas productoras de plátano mundiales (Stover, 1990).
Simmonds (1966) describió los factores más importantes que afectan a la presencia y curso
de la enfermedad. En primer lugar la edad de la planta, las plantas jóvenes son más
susceptibles que las adultas. La condición general del sistema radical; daños o heridas
Revisión Bibliográfica
20
provocan la respuesta de la emisión de nuevas raíces las cuales son más susceptibles que
las viejas. Aguilar et al. (2000b) observó en cv. ‘Willians’susceptible a raza 4 subtropical y
resistente a la raza 1, que en suelos pesados y de mal drenaje, el sistema radical de la planta
puede ser más susceptible a la infección de un aislado FOC próximo a la raza 1. En este
sentido, en Canarias Domínguez (2000) comprobó que el tamaño de las partículas, los
elementos coloidales y las condiciones de pH y conductividad son factores que favorecen
la supervivencia de FOC en suelo. Simmonds (1966) también citó que suelos ligeros y bien
aireados favorecen a Fusarium oxysporum f sp cubense y a la enfermedad, en tanto que los
suelos compactos y constantemente humedecidos favorecen a la planta al reducir la
actividad de los hongos.
El nivel nutritivo de la planta y fertilidad del suelo pueden afectar al desarrollo del MP.
Alvarez et al. (1981) observaron que en suelos de plantaciones afectadas con niveles
elevados de materia orgánica, calcio y zinc, la incidencia de MP era menor. Una tierra muy
fértil favorece la supervivencia de la planta mejorando el crecimiento de la planta más que
actuando sobre el patógeno. El pH del terreno más adecuado para la planta suele ser neutro
o ligeramente alcalino. El pH elevado limita la enfermedad.
Rishbeth (1955) citado por Simmonds (1966), observó que el cv. ‘Lacatan’ resistente a
FOC sucumbía a la enfermedad en condiciones del terreno excepcionalmente
desfavorables, como en arcillas ácidas mal drenadas o cuando se aplicaban cantidades
excesivas de fertilizantes nitrogenados a las plantas.
La patogenicidad puede ser determinada por medio de pruebas adecuadas en plantas
susceptibles. Tras los trabajos de Stover (1959a; 1959b) sobre diferentes metodologías para
la determinación de la patogenicidad de diferentes aislados sobre diferentes cultivares, Sun
y Su (1984.) establecieron una metodología para la realización de pruebas de
patogeneicidad rápidas y bajo condiciones controladas, mediante la inoculación de
plántulas de cultivares ‘Gross Michel’ y ‘Cavendish’ de entre 1-2 meses de edad y 10-15
cm de altura, procedentes de cultivo in vitro, con suspensiones de 3x 10 4 esporas / ml. La
expresión de los síntomas ocurrió a los 15 días y el colapso a los 30 días de inoculación.
Revisión Bibliográfica
21
2.4.1.1 Descripción. Agente causal: Fusarium Oxysporum f sp cubense (FOC)
El Mal de Panamá (MP) está causado por el hongo Fusarium oxysporum f.sp. cubense
(E.F. Smith) Sn & Hansen (FOC), perteneciente a la clase de los Deuteromicetos o hongos
imperfectos.
En relación con las estructuras del hongo, las macroconidias son producidas en
esporodoquios sobre conidióforos ramificados en la superficie de las plantas infectadas o
en un medio de cultivo artificial. También pueden ser producidas en formas simples en el
micelio aéreo (especialmente en un medio de cultivo). Las microconidias presentan formas
ovaladas y se originan sobre microconidióforos o monofilialides cortos en el micelio aéreo,
(Booth, 1971; Nelson, 1983; Nelson y Ploetz, 1990). Ambas pueden ser formadas en los
vasos xilemáticos de las plantas infectadas, pero las microconidias son las que usualmente
predominan en estos tejidos. Estas estructuras sirven como fuente de diseminación del
hongo dentro y fuera de las plantas (Beckman, 1990).
Las clamidosporas poseen paredes gruesas, y su producción es abundante sobre los tejidos
infectados en estados avanzados de la enfermedad. Usualmente se forman solas o en
grupos y pueden estar intercaladas o en la parte terminal de las hifas (Booth, 1971; Nelson,
1983; Nelson y Ploetz, 1990). Son consideradas estructuras de resistencia, y pueden
permanecer en el suelo en estado de latencia por un largo período de tiempo, en presencia
o ausencia de plantas hospedadoras y su diseminación ocurre con el movimiento de suelos,
semillas o materiales de propagación infestados (Nelson, 1981; Beckman, 1990).
Se ha demostrado que la temperatura óptima para el crecimiento y esporulación de
Fusarium oxysporum es 30ºC, pudiendo tener un comportamiento saprofítico muy
vigoroso a temperaturas entre 10 y 30ºC. Es capaz de crecer y esporular sobre un amplio
rango de valores de pH (óptimo a pH 7,5 - 8,5); creciendo mejor en condiciones de
oscuridad continua. Las clamidosporas al germinar, llegan a crecer sobre las raíces en los
diferentes puntos de contacto, hasta lograr entrar directamente a las mismas o por heridas
(Nelson, 1981) y (Beckman, 1987).
Trujillo (1962) y posteriormente Beckman (1990), hicieron unos estudios exhaustivos
sobre las alteraciones histoquímicas que se producen en la platanera por la infección de
FOC. Aguilar et al. (1999, 2000a) también realizaron una serie de trabajos en los que se
estudiaron los elementos y cambios estructurales que se dan en la infección del patógeno
Revisión Bibliográfica
22
vascular desde el punto de vista histoquímico, como el oscurecimiento de los haces
vasculares y las respuestas defensivas celulares frente a la infección por FOC.
En las poblaciones naturales de F. oxysporum se han descrito subpoblaciones (formae
specialis = f.sp.) caracterizadas por su especialización patogénica a determinadas especies
vegetales. Las f. sp. (en su patosistema) pueden estar a su vez divididas en razas (Kistler,
1997; Ploetz, 1999). En FOC existen 3 razas que atacan a la platanera (Stover, 1990). Para
la forma specialis “cubense” se han definido las siguientes razas: raza 1- “Gross Michel”
(AAA), raza 2- Bluggoe (ABB), raza 3 –Heliconia sp. y raza 4-Cavendish (AAA) (Waite,
1977). La reciente aparición de una nueva raza, la llamada raza 4 tropical, ha supuesto una
nueva amenaza para el sector platanero, pues presenta un espectro patogénico más amplio
que el de la raza 4 subtropical (Ploetz, 1997).
La caracterización de las poblaciones de FOC que se utiliza actualmente fue propuesta por
(Puhalla, 1985) para F. oxysporum y se basa en los Grupos de Compatibilidad Vegetativa
(VCG’s). Los aislados que pertenecen al mismo VCG tienen la capacidad de formar
heterocarion estables. Puhalla (1985), demostró que el VCG puede ser una herramienta
práctica para distinguir diferentes poblaciones dentro de las formas especiales (f.sp.) de F.
oxysporum. Indicó que agrupar los aislados en formas vegetativas de compatibilidad se
puede utilizar como el protocolo sustituible de las pruebas de patogeneicidad. La
determinación de los VCG se realiza a partir de enfrentamientos de complementariedad
utilizando mutantes auxótrofos para la cadena del nitrato, donde interviene el enzima
nitrato reductasa (Correll, 1987b). FOC tiene orígenes evolucionarios diferentes (O'
Donnell et al., 1998). Todos los cultivares son del sudeste asiático y casi todos los VCG’s,
también excepto uno de África y otro de Florida, existiendo una coevolución del huésped
con el patógeno (Bentley et al., 1998).
En el patosistema grupo “Cavendish”-FOC, presente en Canarias solo se encuentra
presente la raza 4 subtropical perteneciente al VCG 0120 (Hernández, 1997), la cual puede
diferenciarse de F. oxysporum saprófitos por características morfológicas, debido a la
formación de lacinias en medio Komada (Ploetz y Correll, 1988; Regalado-Guijarro,
1998). Desde un punto de vista practico esto sólo puede aplicarse en el patosistema
presente en Canarias y en Sudáfrica, donde solo existe un VCG 0120 y una raza (raza 4
subtropical), porque se ha demostrado que los aislados de la raza 1 pertenecientes al VCG
0120 también dan colonias laciniadas (Ploetz, 1990).
Revisión Bibliográfica
23
3 EL FALSO MAL DE PANAMÁ
3.1 Revisión histórica y descripción
“Falso Mal de Panamá” (FMP) (Sabadell González y Hernández, 1999) proviene de la
traducción literal del inglés de la primera descripción bajo el término “Fals Panama
Disease” (FPD) realizada por Deacon et al. (1985) quienes describieron los síntomas
asociados, tanto internos como externos y establecieron algunos criterios de diagnostico
útiles. Los primeros síntomas aéreos podrían confundirse con los típicos de plantas que
sufren problemas de encharcamiento y pobre drenaje debido a la presencia de suelos
pesados: abrochamiento o acortamiento de entrenudos, amarilleo, desarrollo lento y
anómalo de la planta, necrosis en el interior de los limbos. Sin embargo, cuando se
realizaba un corte transversal en el rizoma, se observaban oscurecimientos vasculares
similares a los observados en el verdadero “Mal de Panamá” (MP), que podían continuar
ascendiendo por el pseudotallo, aunque en el FMP eran de forma discontinua, mientras que
el MP son continuos pudiéndose seguir su trayectoria desde el rizoma hasta el pseudotallo.
Los hijos pueden estar afectados o no. Las raíces también podían estar muertas, o presentar
necrosis en los ápices.
Deacon et al. (1985) también estudiaron la microflora asociada a los síntomas observados y
realizaron estudios de patogenicidad en condiciones normales con algunas de las especies
aisladas, sobre todo con Fusarium oxysporum (FO), obteniendo resultado negativos.
Observaron que en ocasiones no se obtenía ningún organismo en los aislamientos. Además,
establecieron que el patrón de distribución podía ser errático dentro de una plantación y
que había grandes diferencias de incidencia entre plantaciones, encontrando máximos de
incidencia de hasta el 60 %. Después de estos resultados trataron de correlacionar el
desorden con otros agentes bióticos y con algunos factores abióticos, encontrando que en
ocasiones estaba asociado a altas poblaciones de nematodos (Meloidogyne spp) y en otras
parecía estar relacionado con bajas temperaturas, o con suelos pesados de pobre drenaje y
con tendencia a la compactación. No pudieron establecer claramente la etiología ni la
epidemiología y sugirieron que podría tratarse de un desorden relacionado con algún tipo
de estrés. Estudios posteriores de Deacon (1997) y los de Snyman, (Zaag de Beer,
comunicación personal), confirmaron que los nematodos no eran la causa directa, sino en
todo caso un factor de estrés.
Revisión Bibliográfica
24
En Jones (2000), Lahav (1999) realiza una revisión de la bibliografía referente a
enfermedades de origen desconocido citando autores que bajo distintos nombres describen
unos desordenes cuyos síntomas parecen similares a los que hoy asociamos al FMP. Entre
otros se refiere a Prescott (1917) que lo denomina “Colorado disease”, porque apareció en
la región de Colorado, Honduras y a Dunlap (1923) y Permar (1925), quienes observan lo
descrito por Prescott (1917) en la región de Changuinola, Panamá.
Tras un período en que no aparecen referencias al desorden, posiblemente -apunta Lahav
(1999) porque se había abandonado el uso del cv. ‘Gross Michel’ por su alta
susceptibilidad al Mal de Panamá-, volvieron a detectarse casos en los años 50-60, cuando
la zona se replantó con cultivares del subgrupo Cavendish (AAA), denominándose
entonces “Yellow Mat”, una traducción al inglés del termino español “Mata Amarilla”. En
estas fechas aparece la “enfermedad de Roxana” citada por Allen (1957) en la provincia de
Limón, Costa Rica, que también hace referencia a síntomas similares a los descritos para
“Yellow Mat”, con daños asociados al floema y atribuida posiblemete a un virus.
Lahav (1999) hace referencia a que sometiendo las plantas a situaciones de encharcamiento
no se reproducen los síbtomas del “Yellow mat”. También hace mención a las pruebas de
patogenicidad y estudios histológicos realizados por Reinking (1926). Sus trabajos no
explicaban la etiología del “Yellow Mat” ya que no pudo reproducir los síntomas con las
inoculaciones de especies pertenecientes al género Fusarium, pero sí estableció un criterio
de diagnóstico diferencial entre el “Yellow Mat” y el MP mediante estudios histológicos
con los que concluyó que los oscurecimientos vasculares estaban asociados al floema y no
al xilema como en el caso del MP.
Barnes (1962) describió algo similar para los cultivares del grupo Cavendish ‘Giant
Cavendish’ y ‘Lacatan’ en áreas de Granada, en la región caribeña. En general se observó
que la incidencia era errática y baja en toda la zona de la costa atlántica hasta Surinam
donde el desorden también ha sido descrito por Da Costa (1982).
Kangire (2000) describió un desorden similar al producido por FOC en Uganda, aunque lo
atribuyó a condiciones de estrés provocado por una elevada cantidad de calcio y fósforo en
suelo. Recientemente, Maciel Cordeiro y Lúcia Borges (2000) en Brasil, en los estados de
Bahia y Amazonas ha observado plantas con síntomas que se corresponden con los
descritos hasta el momento como “Mata amarilla” o “Colorado diseases”, de causa incierta,
aunque en este caso también esta asociado a podredumbres blandas en el pie del
Revisión Bibliográfica
25
pseudotallo causadas por Erwinia en cultivares ‘Aterra’ (AAB). En cuanto a las posibles
causas, citan de nuevo a los suelos pesados y mal drenaje y posible implicación de la
nutrición potásica, aunque la eliminación de esta hipótesis pasa por la mayor probabilidad
de que sea un problema patológico ya que tiene una distribución vascular.
Aunque no sabemos si estamos ante un patosistema real huésped/patógeno, y por tanto no
podemos hablar de susceptibilidad o resistencia, los síntomas se corresponden a la
respuestas ante algún factor de estrés, ya sea biótico o abiótico. No existen muchos
documentos en la bibliografía que se ocupen específicamente de los cambios histoquímicos
producidos por estrés abiótico en la platanera. No obstante, existen abundantes referencias
para otros patosistemas, en los que se explican procesos similares a los descritos en el FMP
como es el caso de los oscurecimientos vasculares, amarilleos foliares, cambios en la
organización y estructuras celulares, explicados todos mediante los mecanismos de defensa
de las plantas ante agresiones bióticas, abióticas o por su interacción. Los oscurecimientos
vasculares producidos por FOC han sido muy estudiados por Aguilar et al. (2000b);
Beckman (1990); Beckman et al. (1974) y Trujillo (1962). Respecto a las posibles causas
del “Yellow Mat”, Lahav (1999) concluye que podrían estar relacionadas con factores
abióticos del suelo, dado que algunos síntomas foliares recordaban a la deficiencia en
potasio y en calcio (Stover, 1972), y en condiciones de bajas concentraciones de O2 y alto
CO2 que se dan en situaciones de encharcamiento, el potasio se absorbe con dificultad y se
producen bloqueos entre los diferentes iones del suelo, en especial del calcio (Hammond
1955) y que en todo caso podía estar implicado algún microorganismo con carácter
oportunista, aunque no se descartaba la implicación de fitoplasmas o virus (Stover,
1972#460) y (Lahav, 1999).
Como los trabajos de Deacon et al. (1985), los de Prescott (1917) y los de Dunlap (1923)
referidos por Lahav et al. (1999), así como nuestras observaciones preliminares (Sabadell y
Hernández, 1999) y (Hernández y Sabadell, 2002) sugerían diferentes causas abióticas
como posible origen del desorden, a continuación se revisa cómo afectan los factores
ambientales a la platanera, y a otras plantas hospedadora con especial referencia a su
implicación en síntomas similares a los descritos para el FMP. Nos centraremos
principalmente en los factores abióticos mas comunes que hemos encontrado asociados a
plantas sintomáticas en nuestras observaciones preliminares o, en las plantaciones
afectadas que describiremos como efecto de la compactación, efecto del encharcamiento,
Revisión Bibliográfica
26
efecto de la temperatura, efecto de los daños mecánicos, efecto del abonado (deficiencia en
Calcio y micronutrientes) así como efecto de las especies fúngicas y bacterianas y el efecto
de la interacción de factores.
3.2 Especies de Fusarium similares a las asociadas al FMP en platanera y en
otras plantas hospedadoras.
Deacon et al. (1985), Reinking (1926) y Sabadell González y Hernández (1999)
encontraron especies de Fusarium asociadas al FMP y al “Yellow mat” pero ninguno de
los estudios han podido demostrar el papel de dichas especies en el FMP ni en el “Yellow
mat”. Quizás fuera necesaria la interacción de ciertos factores de estrés como ocurre en el
síntoma de seca del olivo (Hernandez et al., 1998) o la combinación de determinados
microorganismos, ya que con frecuencia, varios patógenos radicales se presentan formando
complejos de etiología compleja, o bien participan como patógenos secundarios o de
debilidad en plantas afectadas por diversos tipos de estrés (Schippers y Gams, 1979).
En Sudáfrica el Falso Mal de Panamá ha sido asociado con daños causados por nematodos
por Deacon (1997), aunque se demostró que no eran la causa del problema y que como
mucho podían ser un factor de estrés añadido, con una importancia relativa en el desorden
que nos ocupa. En Canarias, también se han encontrado nematodos asociados a algunos
casos de FMP. Quizás el papel del nemátodo, si es que tiene alguno sería causar una
modificación de la susceptibilidad del huésped a determinados hongos (Hasan, 1993) o
incrementar la severidad de la enfermedad (sinergismo), como ocurre en el caso del estudio
de Vovlas et al. (1994) en Creta, sobre platanera con síntomas aéreos de decaimiento y con
necrosis en raíces producidas por diferentes nematodos. Los síntomas de decaimiento eran
más intensos especialmente cuando las raíces se encontraban infectadas además por
hongos y/o bacterias del suelo cuya frecuencia de aparición fue: Acremonium sp. (24%),
Rhizoctonia solani (12%), Fusarium oxysporum (12%), F. solani (6%), Phytium sp. (4%),
Fusarium compactum (3%) y Cylindrocarpon sp. (3%). Además de la presencia
consistente de estos hongos encontró asociadas especies bacterianas pectinolíticas de los
géneros Erwinia y Pseudomonas. Pinochet y Stover (1980) encontraron especies fúngicas
asociadas con Radopholus similis, el cual causa lesiones al cv. ‘Cavendish’. Cuando se
inoculan conjuntamente con hongos como Cylindrocarpon musae las necrosis son más
extensas, seguido de Fusarium solani y Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuroi).
Acremonium stromaticum causa menos daño que los otros hongos pero en presencia del
Revisión Bibliográfica
27
nemátodo destruye más raíces. En otro estudio, Pinochet (1979) encontró una asociación
de determinadas especies fúngicas con lesiones de nematodos tanto en plátano como en
banano. Los hongos se encontraron en el 71% de bananas muestreadas: Acremonium
stromaticum (22%), Fusarium solani (18%), Cylindrocarpon musae (17%) y F.
moniliforme (14%). Los mismos hongos y con frecuencias similares fueron encontrados
asociados a lesiones de nematodos en plátanos. Peregrine (1992) describe que las lesiones
características que se producen en las raíces de Ensete a causa de Pratylenchus goodeyi, se
encuentran asociadas a hongos secundarios del suelo que aumentan la intensidad del daño.
Además, detectó la presencia de Xanthomonas campestris pv musacearum en las lesiones y
posteriormente invadiendo el sistema vascular y pseudotallo.
En otro patosistema encontramos la primera descripción de la asociación de las especies
Pythium ultimum, P. irregulare, Rhizoctonia solani AG4, y Fusarium proliferatum en
Trifolium vesiculosum, formando un complejo de enfermedades (Pemberton et al., 1998).
Especies de Fusarium tales como F. oxysporum, F. subglutinas, F. proliferatum, F solani
asociadas al FMP (Hernández y Sabadell, 2000, 2002; Sabadell González y Hernández,
1999; Sabadell y Hernández, 1999; Sabadell y Hernández, 2003), o al “Yellow Mat” han
sido asociadas a otras plantas hospedadoras demostrándose en algunos casos que eran el
agente causal de la enfermedad. Wu y Huang (1997) en lirio, Chao et al. (1998) en álamos,
describen F. proliferatum como patógeno vascular. F. subglutinans (Gibberella fujikuroi
var. subglutinans) fue aislado de tejidos necrosados en hojas, ramas y pseudobulbo (Mee et
al., 1998) así como ocasionalmente también fue aislado F. moniliforme (G. fujikuroi) en
plantas de Cymbidium sp.(Broadhurst y Hartill, 1996). Aislados procedentes de la corona y
de las raíces de espárrago con síntomas de podredumbre, pertenecientes a las especies F.
proliferatum, F. oxysporum y de F. solani fueron evaluados en test de patogenicidad in
vitro. Los aislados de F. proliferatum y F. oxysporum fueron los más patogénicos. La
patogenicidad de los aislados de F. oxysporum fue caracterizada como F. o. f.sp. asparagi
(Elena y Kranias, 1996). Las cuatro especies Fusarium solani, F. proliferatum, F.
oxysporum y F. subglutinans (Gibberella fujikuroi var. subglutinans) fueron aislados de
raíces de orquídeas enfermas y se demostró su asociación con el incremento de las necrosis
radicales cuando fueron reinoculados en raíces sanas (Benyon et al., 1996).
Engels y Kramer (1996), estudiaron la producción de micotoxinas producidas por especies
del género Fusarium presentes en Lolium spp., encontrando una amplia variedad de
Revisión Bibliográfica
28
especies capaces de producirlas. Fusarium proliferatum y F. subglutinans [Gibberella
fujikuroi var. subglutinans], especialmente, producen micotoxinas tales como la
beauvericina, fusaproliferina que pueden ser toxicas para los seres humanos (Moretti et al.,
1998). En el caso de F proliferatum, Abdalla et al. (2000) demostraron su patogenicidad
sobre palmeras datileras mediante inoculaciones, además de comprobar la producción de
micotoxinas tales como beauvericina, fumonisina B1, fusaproliferina, ácido fusarico y
moniliformina. En el caso de F. subglutinans [Gibberella fujikuroi var. subglutinans].
Tapia et al. (1998) y Borrás Hidalgo et al. (1998; 1999) y han determinado la producción
de determinadas toxinas implicadas en la patogenicidad de esta especie en piña. Toxinas
producidas por F.solani, podrían estar implicadas en las ostrucciones xilematicas en citrus
(Nemec, 1995). Existen algunas referencias bibliográficas que atribuyen un carácter
patogénico a especies de Fusarium únicamente bajo condiciones de estrés para la planta
como es caso de F. subglutinans en maíz (Kostecki, 1994).
Kistler (1997), trabajando con arroz, demostró que algunos microorganismos oportunistas
formaban parte de la flora saprófita endófita y que esta flora era dependiente del área de
cultivo. Estos microorganismos oportunistas o de debilidad coincidiendo con situaciones
de estrés del hospedador pueden provocar procesos infecciosos que desemboquen en una
enfermedad (Agrios, 1988). El impacto de dos hongos, Colletotrichum musae y Fusarium
moniliforme (Gibberella fujikuroi), sobre la capacidad fotosintética de dos cultivos, banana
y maíz, fue estudiado por Pinto et al. (2000). Las curvas de respuesta a la luz de ambas
especies mostraron que la capacidad fotosintética fue severamente reducida en las plantas
infectadas con endófitos, concluyendo que es posible que la reducción fotosintética en
ambos cultivos fuera causada por toxinas producidas por los hongos.
3.3 Naturaleza del amarilleo foliar
El amarilleo de las hojas, es una sintomatología asociada al FMP. Los amarilleos foliares
pueden producirse por factores bióticos y abióticos como ya hemos visto a lo largo de la
revisión.
Dentro de los bióticos, los más característicos son los producidos por patógenos vasculares
como Fusarium oxysporum, Verticillium sp., Ceratocystis sp., Ralstonia sp., Calvibacter
sp. causantes de enfermedades sistémicas. En platanera, este es uno de los síntomas más
característicos tanto del Mal de Panamá como del Moko (Thwaites, 1999). En los
patosistemas FOC-platanera; Ralstonia-platanera, como en otros patosistemas, el amarilleo
Revisión Bibliográfica
29
se produce como consecuencia de la obstrucción de los haces vasculares por el patógeno,
aunque no se descarta el papel que puedan tener ciertas toxinas fúngicas como hemos visto
en el apartado anterior. Esta situación dificulta el flujo de agua y nutrientes desde la raíz y
provoca una carencia de elementos tales como el calcio, zinc y hierro en las hojas de
crecimiento activo, lo cual induce la movilización de estos elementos desde las hojas más
viejas (Beckman, 1990).
Dentro de los factores abióticos, el amarilleo también ha sido relacionado en platanera y en
otras plantas hospedadoras con situaciones de encharcamiento y la asfixia radical
concomitante (Aguilar, 1998a); el estrés hídrico tanto por exceso como por defecto de
agua, así como por diversas carencias y toxicidades tales como deficiencias en boro
(Venter y Currier, 1977) y (Ali y Jarvis, 1988), y otras bastante comunes como las de
calcio, hierro, zinc, etc. Todos estos aspectos serán comentados con mayor detalle en los
siguientes apartados de esta revisión
3.4 Naturaleza de los oscurecimientos vasculares
A nivel celular podemos establecer diferencias entre los producidos por invasión de
patógenos vasculares fúngicos y bacterianos, que generalmente se dan en el xilema o los
producidos por diferentes formas de estrés abiótico donde nos encontramos con
alteraciones en la organización y funcionalidad muy importantes tanto en el xilema como
en el floema. En platanera los oscurecimientos vasculares asociados al xilema han sido
muy estudiados en el Mal de Panamá y en el Moko por Trujillo (1962) y Beckman (1987;
1990). En el caso del “Yellow Mat”, Lahav (1999) describe que en plantas afectadas en el
episodio de 1964, se observaron oclusiones en el floema con material amorfo y menciona
los estudios de Reinking (1926), citados por Dunlap (1923) donde las obstrucciones
vasculares fueron asociadas la floema, lo cual sirvió para establecer un diagnóstico
diferencial entre el MP y el “Yellow Mat”
3.4.1 Xilema
La mayoría de oscurecimientos en el xilema están asociados a la infección por hongos y
bacterias vasculares (Van Alfen, 1982) y (Beckman, 1987). Los vasos del xilema de
plantas infectadas por hongos vasculares presentan una típica acumulación de geles de
color pardo/marrón producidos por la planta, y compuestos principalmente polisacaridos y
fenoles. Este pardeamiento según disferentes autores se deben en parte a la oxidación de
Revisión Bibliográfica
30
los fenoles por enzimas de la propia planta o del microorganismo patógeno (Novo et al.,
2002).
Trujillo (1962) y Beckman et al. (1974) en el estudio de la patogénesis del MP en
platanera, explicaron el papel de los fenoles en la defensa de la platanera frente a FOC,
describiendo los procesos de invasión y colonización de los vasos xilemáticos y las
respuestas celulares defensivas, concluyendo que a mayor concentración de sustancias
fenólicas menor era el número de las perforaciones naturales en las placas cribosas, con lo
que la planta manifestaba una mayor resistencia a la infección y diseminación del
patógeno. Beckman (1990), también observó que son las células acompañantes del xilema
las que tienen capacidad de respuesta frente a las infecciones y que en las etapas iniciales
de FOC en platanera el xilema se encuentra colapsado por diferentes sustancias como
callosas, lípidos y gomas, o evaginaciones de células acompañantes bloqueando la luz del
haz que reciben el nombre de tílides.
Para otras plantas hospedadoras también se han descrito oscurecimientos vasculares
asociados al xilema que se producen como respuesta a la invasión de patógenos, o como
respuesta a un agente etiológico desconocido, pero no hemos encontrado referencias para
especies de Fusarium asociadas al FMP en platanera.
Así, Trujillo y Obrero (1978) observaron que Cephalosporium sp. en Cassia serattensis
inducía la formación de tilosas en xilema. El bloqueo de los haces vasculares lleva
asociada la sintomatología de marchitamiento (Duniway, 1971) y manifestación de
carencias nutricionales como describen Hampson y Sinclair (1973) en melocotoneros
inoculados con Cytospora leucostoma, que causa cancros en ramas y una importante
disfunción del xilema colapsándolo e impidiendo el transporte de nutrientes. Los árboles
inoculados manifestaban síntomas semejantes a los que se producen bajo estrés hídrico en
las ramas distales de los sitios inoculados. Las hojas de estas partes distales mostraban
síntomas de deficiencia en calcio y un bajo contenido en aluminio, boro, calcio, magnesio,
manganeso, fósforo y zinc cuando se compararon con otras zonas de los mismos árboles no
infectadas. Las gomas presentes en los tejidos de cambium y xilema eran las principales
causantes de la disfunción xilemática. Esto sugiere que las gomas juegan un papel
relacionado directamente con la viscosidad de los fluidos que transportan a través del
xilema los elementos nutritivos y el bloqueo xilemático, como respuesta a la infección de
C. leucostoma.
Revisión Bibliográfica
31
Mollenhauer y Hopkins (1976) estudiando la vid susceptible a la Pierce’s disease,
observaron agregados bacterianos que colapsan el xilema impidiendo el transporte del agua
y nutrientes manifestando deficiencias nutricionales. En las variedades resistentes además
se observó la inducción de formación de tilosas y gomas por la planta con el fin de
encapsular las bacterias y evitar la infección de otros elementos del xilema.
Beretta et al. (1988) realizaron estudios en Citrus, donde se compararon dos enfermedades
de sintomatología vascular similar y cuyo agente causal no se conocía. Los síntomas se
caracterizaron por un bloqueo del xilema debido a sustancias, en un caso amorfas y en el
otro formando fibras. Tras un estudio histoquímico concluye que las sustancias amorfas
reaccionaron positivamente para callosa, lignina, sustancias pépticas, gomas, proteínas y
lípidos. Las sustancias filamentosas se teñían positivamente para ligninas, gomas, proteínas
y lípidos.
Respecto a los oscurecimientos xilemáticos producidos por factores abióticos, Marriott et
al. (1979) hacen referencia a raíces de yuca que se decoloran por perdidas de agua
producidas por cortes y abrasiones y describen que las decoloraciones se encuentran
asociadas al colapso del xilema. Rickard et al. (1979) estudiaron la naturaleza de la
pigmentación en el xilema de Cassava mediante técnicas histoquímicas y concluyó que
contenían compuestos lipídicos, lignina y carbohidratos derivados de células
parenquimatosas adyacentes, las decoloraciones en xilema son resultado de un proceso
fisiológico de la planta en respuesta a heridas.
Algunas de las alteraciones bioquímicas típicas de respuesta hipersensible que se dan en
las reacciones incompatibles con hongos, bacterias y virus en las plantas, pueden ser
inducidas por estrés o por productos químicos sin necesidad de agentes bióticos (Van
Loon, 1983). Se han observado oscurecimientos vasculares asociados al xilema debidos a
cortes en los tallos de crisantemo (Van Doorn y Cruz, 2000).
Noon y Booth (1977) describen en raíces de Cassava, decoloraciones vasculares de las que
aisla microorganismos asociados a las decoloraciones que no se encuentran en los tejidos
sanos. Pero cuando los inoculan no se reproducen los síntomas. Los resultados sugieren
que estos microorganismos no son la causa primaria de las decoloraciones y que pueden
ser debidas a causas endógenas fisiológicas.
Van Doorn y Cruz (2000), estudiaron los bloqueos xilemáticos que se producían en las
flores de crisantemo bajo temperaturas entre 5º-20ºC, y otras condiciones ambientales con
Revisión Bibliográfica
32
el fin de evitar la infección con bacterias. Los resultados sugieren que los bloqueos
xilemáticos están relacionados con reacciones oxidativas.
3.4.2 Floema
En procesos no infecciosos como son el estrés abiótico, deficiencias nutricionales, o
procesos infecciosos que conducen a bloqueo de nutrientes en etapas posteriores, también
se ve afectado el floema, pues se ve alterada su función (Clark y Smith, 1988; Stewart et
al., 1973).
Algunas especies de Fusarium como las asociadas al FMP, han sido citadas para otras
plantas hospedadoras como causantes de decoloración en floema. Blodgett et al. (1998)
estudiaron la sistémica decoloración vascular en tallo y raíces y el decaimiento de la parte
aérea de Amaranthus hybridus en Sudáfrica. Los síntomas incluían decoloración en el
floema, xilema del cormo, cancros negros y debilitamiento del tallo propenso a quebrarse.
Fusarium sambucinum, F. oxysporum, y F. subglutinans se encontraron asociados a esta
sintomatología.
Las virosis y micoplasmosis (fitoplasmas) utilizan el floema como medio de dispersión en
la planta (McCoy, 1982), pues son patógenos que necesitan de la maquinaria celular para
completar su ciclo vital. Las Rickettsias también invaden la planta a través del floema y
células adyacentes (Kohn et al., 1974).
Existen casos reflejados en la literatura de oscurecimientos vasculares asociados al floema
causados por estrés abiótico, como es el caso en la caña de bambú (Liese, 1998), donde
esta sintomatología se asocia a daños mecánicos en las raíces al realizar la practica cultural
de deshijado. En este caso, parece que los oscurecimientos son debidos a la oxidación de
determinados componentes fenólicos, como respuesta hipersensible a una herida, que
desemboca en el colapso y cicatrización de la zona dañada con el fin de evitar infecciones
(Van Loon, 1983) en (Ponz, 1995).
Revisión Bibliográfica
33
3.5 Interacción factores abióticos/bióticos. Triángulo epidemiológico
La enfermedad depende de cuatro factores: la susceptibilidad de la planta cultivada (planta
huésped), la presencia de un patógeno, las condiciones ambientales favorables para la
infección (temperatura, humedad relativa, tipo de suelo y fertilidad, etc.). La severidad de
la enfermedad depende del tiempo y de la interacción entre los tres factores (Roget, 2001).
Muchas veces encontramos que la actuación de un factor provoca una mayor
susceptibilidad a otros o que es necesaria la interacción de varios factores abióticos y
bióticos para que el resultado se manifieste como enfermedad. Fig.2. El triángulo epidemiológico de la
enfermedad (tetraedro si incluimos el factor tiempo) representa las interacciones de los 4 factores principales gráficamente.
3.5.1 El hospedador. Respuestas defensivas
La respuesta de la planta ante los factores de estrés puede ser especifica o inespecífica ante
la agresión de un determinado factor. Las plantas poseen una serie de mecanismos de
defensa que pueden clasificarse en pasivos o preexistentes, en los que se incluyen barreras
estructurales (cutícula, reservorios de compuestos antimicrobianos localizados
estratégicamente) y activos, los cuales se dan en respuesta a un patógeno invasor y que
requieren del metabolismo del hospedador (Osbourn, 2001). Estos mecanismos de defensa
activos son inducidos por el patógeno y pueden ser respuestas primarias (reacciones de
hipersensibilidad) las cuales generalmente terminan en muerte celular programada o
apoptosis, respuestas secundarias las cuales son inducidas por moléculas señal o elicitores
y finalmente resistencia sistémica adquirida (SAR en terminología inglesa) inducida
hormonalmente, como es el caso de las fitoalexinas (Nicole et al., 1996).
En general los procesos defensivos que se dan bajo estrés abiótico suelen ser inespecíficos
y también pueden darse ante la infección por un patógeno (Anónimo, 2002). Este hecho, da
lugar a una sintomatología convergente, en diferentes desordenes y enfermedades de
etiologías muy diversas, como los marchitamientos, amarilleos foliares, etc. Por ejemplo,
la lignificación de las paredes celulares puede activarse bajo condiciones de estrés
Revisión Bibliográfica
34
inespecífico (López Encinas, 2003). Otro ejemplo de ello es la respuesta inespecífica que
consiste en la síntesis de monofenoles, esta puede conducir a la acumulación en tejidos no
dañados de grandes cantidades de productos ya preformados, o dar lugar a la aparición de
nuevos productos, las fitoalexinas, que aparecen bajo situaciones de estrés abiótico (ej.
deficiencia en Boro (Cakmak y Römheld, 1997) y biótico, existiendo una diferencia en su
acumulación que permite diferenciar las respuestas. Como consecuencia aparecen necrosis
celulares en algunas ocasiones ya que como describen Garcia et al. (1978) existe
independencia entre los fenómenos de acumulación de fitoalexinas y necrosis celular.
Algunas de las alteraciones bioquímicas típicas de respuesta hipersensible que se dan en
las reacciones incompatibles con hongos, bacterias y virus en las plantas, pueden ser
inducidas por estrés o por productos químicos sin necesidad de agentes bióticos (Van
Loon, 1983).
Deborath et al. (2001) compararon en arroz, la inducción de diferentes enzimas, y
acumulación de compuestos fenólicos y lignina bajo la inoculación de Rhizoctonia solani
(patógeno) y Pestalotia (Pestalotiopsis) palmarum (no patógeno), observando que la
actividad enzimática de peroxidasa (PO) y fenilalanina amonio-liasa (PAL) fueron
significativamente incrementadas después de la inoculación con R. solani y P. palmarum,
siendo mayor la respuesta en las plantas inoculadas con el organismo no patógeno
comparándolo con la inoculación del patógeno. La inoculación de P. palmarun, fue
seguida de una rápida acumulación de compuestos fenólicos y aumentó el contenido en
lignina en un 91% frente al 37% con la inoculación del patógeno Rizoctonia solani.
Beckman (1987) describe que la producción de geles o gomas que es la primera fase del
bloqueo xilemático, puede darse como respuesta inespecífica a invasión de organismos
patógenos o no patogénicos.
3.5.2 El patógeno
3.5.2.1 Efecto de la Temperatura sobre la patogenicidad
En general, la temperatura es un factor que afecta al desarrollo y crecimiento de todos los
organismos. En el caso de los hongos fitopatógenos, el rango de temperatura óptimo del
desarrollo de la fase vegetativa miceliar se encuentra en el rango optimo de crecimiento del
huésped al que ataca, siendo entre los 20-30ºC en general, variando entre las diferentes
especies.
Revisión Bibliográfica
35
No obstante puede suceder que el rango de temperatura en el que se produce la infección
sea para la planta huésped una temperatura inferior a la optima de su crecimiento, en la que
todas las constantes vitales y mecanismos de respuesta frente a los patógenos se vean
ralentizados y el hongo fitopatógeno no encuentre resistencia a su penetración en la planta.
El desarrollo de la sintomatología de la enfermedad puede producirse una vez la planta ya
infectada de forma latente, se encuentre en condiciones favorables para su desarrollo y para
el desarrollo del hongo en su interior. Zeller & A. Schmidle en Kohn et al. (1974)
concluyeron que bajo condiciones naturales la infección por P. syringae y P. mors-
prunorum sobre “cereza ácida” ocurre a 5-10º C, pero los síntomas típicos y el desarrollo
del daño solo se manifiesta a 15-20º C.
Puede darse el caso de una interacción entre factores de estrés abiótico que condicionen
una mayor susceptibilidad del huésped a una enfermedad determinada. Muchos hongos
fitopatógenos del suelo infectan a su huésped en invierno, cuando se produce la parada
vegetativa de las plantas debida al frío ambiental. Generalmente en esta época del año
también se producen lluvias de gran intensidad que pueden provocar una mayor
permanencia del agua en el suelo y provocar situaciones localizadas o generales de hipoxia
en el sistema radical, que estaría aumentando la posibilidad de infección en el caso de que
hubiera un patógeno presente (Aguilar et al., 2000b). Pires de Matos et al. (2000)
mostraron que la intensisdad de la fusariosis en la piña producida por F. subglutinans,
dependía de los factores ambientales, las bajas temperaturas aumentaban la intensidad de la
enfermedad.
3.5.2.2 Efecto del encharcamiento sobre la patogenicidad
El encharcamiento conduce a situaciones de estrés para la planta y puede que esta no tenga
una capacidad de respuesta adecuada frente al ataque de un patógeno, pero hay que
destacar, que en el caso de los hongos fitopatógenos del suelo, los efectos negativos del
encharcamiento pueden afectar también al correcto desarrollo, viabilidad y supervivencia
del hongo en el suelo. Stover (1953), observó que algunos Fusarium spp sobrevivían mejor
en suelos con un 15 % de saturación de agua. A mayor contenido de humedad, por ejemplo
65 %, la supervivencia de las bacterias se ve favorecida a expensas de los Fusarium spp. y
otros hongos. Simmonds (1966) describe un método para destruir FOC mediante la
inundación del terreno durante periodos de seis meses. Estos lagos artificiales, se
renovaban una vez y media cada semestre para compensar las perdidas debidas a filtrado y
Revisión Bibliográfica
36
evaporación. El resultado de esta profunda inundación fue la creación de unas condiciones
casi anaerobias, desfavorables para la supervivencia de FOC. Con este método se
consiguió la destrucción de un 95 % de los hongos del suelo.
Marin et al. (1995) observó que el crecimiento de 2 aislados de F. moniliforme (Gibberella
fujikuroi) y 4 aislados de F. proliferatum fue significativamente influenciado por el
potencial de agua. El rango de temperatura óptimo fue entre 20-35º C. El crecimiento se
paró a 4ºC y 0.994-0.96 aw existiendo una interacción entre estas dos variables sobre el
crecimiento de los hongos. Optimo pH y temperatura para el crecimiento fue 5.5 y 25ºC
para los dos aislados de F. proliferatum y pH 7.0 y 30ºC para los asilados de G. fujikuroi.
Los efectos del pH, temperatura y aw individualmente, interacción dos a dos e
interacciones triples fueron todas encontradas estadísticamente significativas para los tres
aislados.
Bolkan et al. (1979) observó que conidias libres de Fusarium moniliforme var.
subglutinans sobreviven mejor con temperaturas en suelo de 4º y 18º C que a 25º y 30º C ,
en suelo aireado y húmedo con 10- 35% de contenido de material vegetal.
Dada la escasa literatura que hay sobre el FMP, trataremos de encontrar algún indicio en la
literatura que se refiera a síntomas similares a los descritos para el FMP producidos por
los factores ambientales tanto en platanera como en otros cultivos.
Revisión Bibliográfica
37
4 FACTORES ABIÓTICOS.
El concepto de estrés en los vegetales se refiere a la influencia de determinados factores
externos que afectan al normal funcionamiento fenológico de la planta tales como efectos
sobre el crecimiento del cultivo y sobre la productividad (Bingham, 2000; Chellemi, 2001;
Irizarry et al., 1980) y que determinan una mayor sensibilidad a sufrir ataques por parte de
patógenos (verdaderos y/o de debilidad-oportunistas) (Burgess, 1998) y (Aguilar et al.,
2000b) o a manifestar desordenes fisiológicos (Eckstein y Robinson, 1996). Un ejemplo es
en el pino rojo, Stanosz et al. (2001) demostraron la presencia de Sphaeropsis sapinea
como endofito patógeno latente. La enfermedad se producía bajo situaciones de estrés
hídrico
En situaciones de estrés abiótico (seca, daños mecánicos, daños por desinfección,
disponibilidad de oxigeno, cambios en el potencial hídrico, salino y osmótico, cambios de
pH) se estimula el metabolismo de los compuestos fenólicos (Weaver, 1994). La
acumulación de estas sustancias puede provocar en ocasiones la necrosis de las células que
las acumulan como respuesta a una situación de estrés biótica o abiótica (Garcia- Arenal,
1978), como hemos revisado anteriormente en el apartado de respuestas de las plantas.
4.1 Factores climáticos
Los factores climáticos son inmodificables cuando se trata de cultivos al aire libre, aunque
en invernadero pueden atenuarse valores extremos que serían perjudiciales para el
desarrollo y el rendimiento adecuado del cultivo o incidir en la severidad de una
enfermedad o plaga determinada.
La altitud es un factor limitante para el desarrollo de la planta, en general los rendimientos
se reducen con el incremento en la altitud y el ciclo vegetativo se prolonga. Las variaciones
en altitud prolongan el ciclo biológico. En Canarias por cada 100 m de altitud se prolonga
el ciclo 45 días (Aubert, 1973). En la 3ª zona (límite para el desarrollo comercial del
cultivo), a 300 m.s.n.m. en la vertiente norte, pueden producirse severos daños por frío.
El viento es un factor atmosférico de mucha importancia por sus efectos sobre el
crecimiento y desarrollo de la planta. Uno de los daños más comunes es el desflecamiento
de los semilimbos. El área foliar se reduce y afecta directamente al peso de los racimos y a
la calidad de estos (Champion, 1968).
Revisión Bibliográfica
38
El rango de energía comprendida entre 0,4-0,7 nm del espectro de la radiación solar es el
más importante por su intensidad y por su calidad, pues influye directamente en la
capacidad fotosintética de la planta. Además, la calidad espectral de la luz regula el
fototropismo y controla procesos como la germinación y la floración. La duración del
fotoperiodo es importante para el desarrollo de los patrones de la planta. Las musaceas
crecen y se desarrollan bien en condiciones de semipenumbra. Se ha observado que en
plantas que crecen en condiciones de menor intensidad de luz, se prolonga su periodo
vegetativo, son más altas y desarrollan mayor área foliar (Champion, 1968; Soto, 1985).
4.1.1 Temperatura ambiental
La Temperatura está relacionada con la altitud, la radiación solar y los movimientos de la
atmósfera. Influye sobre la respiración y fotosíntesis de la planta y en consecuencia sobre
su ciclo vegetativo. La temperatura idónea para el cultivo de la platanera oscila entre los
15,6 y 37,8ºC, la media idónea es de 27ºC dependiendo de la variedad. Para los cultivares
del subgrupo Cavendish, mejor adaptados a los subtrópicos, se produce una parada
vegetativa entre los 9º-11ºC en el limite inferior y entre 38º-40ºC en el limite superior
(Ganry, 1973; Green, 1969). Temperaturas mayores o menores pueden causar deterioro y
lentitud en el desarrollo, además de daños en la fruta (Ganry, 1973).
Las bajas temperaturas, inferiores a 16ºC producen un efecto semejante a un exceso de
agua, la planta muestra síntomas de marchitamiento y aparece una coloración amarilla
generalizada acompañada de una muerte prematura de la planta. Se producen obstrucciones
o cierres en los conductos respiratorios y nutricionales. Este efecto fisiológico se produce a
causa de bajas temperaturas y también por exceso o por deficiencia hídrica y se conoce
como “obstrucción foliar”. El crecimiento de las vainas foliares se reduce y se produce un
acortamiento de entrenudos o pecíolos, así como un bloqueo de la emisión de hojas que
obstruye la salida de la inflorescencia (Soto, 1985). Los periodos de fríos matinales y
bajadas de temperaturas nocturnas por debajo de 10ºC durante más de 4 horas, que afectan
con regularidad a zonas del norte de las islas canarias pueden ocasionar paralización
parcial del desarrollo de la planta, con un efecto de obstrucción foliar ya mencionado antes
(Champion, 1968).
Un síntoma común en la platanera, producto del efecto de bajas temperaturas y también
asociado al FMP es el abrochamiento y el amarilleo de las hojas, debido también a que la
Revisión Bibliográfica
39
disponibilidad y absorción de los nutrientes presentes en el suelo que se puede ver reducida
(Green, 1969).
A nivel histológico se producen cambios como el cierre estomático que provoca la
disminución de la evapotranspiración (Suarez Sanchez y Santana Ojeda, 1996; Marriott et
al., 1978; Robinson y Bower, 1988). En los estudios realizados por Santana et al. (1992) en
la isla de Tenerife en los años 1988 y 1990 se observó que la evapotranspiración de las
plataneras Dwarf Cavendish se veía reducida durante los meses de enero y febrero cuando
se dan las temperaturas mas bajas del año. No obstante, aunque los síntomas externos por
frío pueden coincidir con los descritos para el FMP, los síntomas internos no se han
descrito asociados a estos factores.
4.2 Factores edáficos
El mantenimiento de la humedad del suelo próxima de la capacidad de campo parece
indispensable para el crecimiento óptimo del banano (Dorel y Ozier Lafontaine, 1998).
Factores físicos como el nivel freático, arcillas impermeables o capas de arena presentes en
el suelo pueden alterar la profundidad efectiva y la permeabilidad del suelo (Forsythe,
1975).
Las características químicas (Jackson, 1982) del suelo hacen referencia a pH, capacidad de
intercambio catiónico (CIC), contenido y disponibilidad de elementos nutritivos, que de
una forma combinada determinan el estado de fertilidad de un suelo.
La platanera muestra un rango de adaptación muy amplio, por lo que puede cultivarse tanto
en suelo ácidos con pH 4.0, como alcalinos con pH 8.0. Su mejor comportamiento
productivo se registra entre pH 6.0 y 7.0. Las siembras en suelos ácidos pueden presentar
problemas de bloqueo de nutrientes respecto a la disponibilidad en formas asimilables por
la planta de los elementos siguientes: fósforo, magnesio, boro, calcio y molibdeno, además
de toxicidad por manganeso, hierro y aluminio. Cuando se trata de suelos alcalinos, pueden
haber problemas de deficiencias en zinc, hierro, manganeso, boro, formación de fosfatos
insolubles y posible exceso de sodio.
Las características del suelo, tanto físicas como la capacidad nutritiva, salinidad,
encharcamiento, impedancia mecánica y patógenos presentes en el suelo capaces de
infectar las raíces, tienen un efecto directo sobre el crecimiento, actividad fotosintética y la
duración del cultivo (Chellemi, 2001). Las raíces presentan respuestas determinadas ante
las condiciones especificas del suelo que consisten en variaciones de las elongaciones,
Revisión Bibliográfica
40
numero de raíces y exudados radicales. También se producen cambios en la arquitectura
radical (Bingham, 2000).
4.2.1 Encharcamiento del suelo
Como consecuencia de situaciones de encharcamiento en el suelo pueden producirse
principalmente tres tipos de estrés abiótico sobre la planta: hipoxia radical (Daugherty y
Musgrave, 1994; Huang y Johnson, 1995; Shtefyrtse y Chernat, 1994), aumento de la
salinidad (Barrett-Lennard, 1986) y mayor compactación (Engelaar et al., 1993) que
desglosaremos más adelante. También, existen cambios químicos asociados directamente
al encharcamiento de los suelos como son el bloqueo de determinados nutrientes e iones, el
aumento de la conductividad eléctrica (Naidoo et al., 1992) y la disminución del pH. Se
sabe que en condiciones de encharcamiento se incrementan las tasas de enzimas como la
alcohol deshidrogenasa, la lacasa, la superoxido dismutasa, entre otras (Burdick y
Mendelssohn, 1990) y se incrementa la compactación de los suelos (Grimaldi, 1986). Otra
consecuencia del encharcamiento es que debido a la saturación de humedad, se favorece la
aparición de plagas y enfermedades.
Generalmente periodos prolongados de encharcamiento conducen a la compactación del
suelo y producen alteraciones de conductividad eléctrica, disminución del potencial redox,
aumento de la salinidad y del pH que alteran la distribución y el equilibrio entre los iones y
elementos del suelo, disminuyendo la disponibilidad de estos para la planta (Cachorro et
al., 1993; Ding y Musgrave, 1995; Eckstein y Robinson, 1996), en especial del calcio, así
como cambios celulares en respuesta a todos estos factores abióticos (Barrett-Lennard,
1986; Malcolm y Lewis)
El encharcamiento de los suelos produce sintomatología de amarilleo foliar y provoca
necrosis en las puntas de las raíces similares a las que provoca el FMP, pero nunca ha sido
citado como causante de los síntomas internos en rizoma y oscurecimientos vasculares que
se dan en este desorden FMP. Lahav et al (2000), cuando revisan el “Yellow Mat”
menciona que el encharcamiento por si mismo no producía el FMP, y tampoco se han
encontrado síntomas similares en otros patosistemas. Holder y Gumbs (1983) estudiaron el
efecto del encharcamiento sobre la producción de un cultivo de platanera, concluyendo que
se ven reducidas todas las variables fonológicas, altura y diámetro del pseudotallo, así
como la productividad medida en número de dedos por mano y número de manos por piña
en un 43 % menos que los controles. También describieron otros problemas asociados
Revisión Bibliográfica
41
como la anaerobiosis en la zona radical cuyo efecto se traduce en una disminución del
volumen de las raicillas, reducción de la evapotranspiración, de la respiración y otras
actividades metabólicas como cambios hormonales.
Aunque el encharcamiento de los suelos es un factor limitante para el cultivo de la
platanera, no ha sido muy estudiado. Solo existen unos pocos trabajos, como el realizado
por Ghavami (1976), en bananas, ensayó diferentes profundidades del agua de drenaje (60,
90 y 120 cm), observando que la mayor profundidad producía marchitamiento en el
cultivo, y que a menor profundidad del agua de drenaje, menor era la duración del ciclo
(crecimiento vegetativo y maduración de los frutos). Irizarry et al. (1980) en Platanos, cv.
‘Maricongo’ estudiaron como afectaba el mantenimiento del agua de drenaje a diferentes
profundidades, sobre el desarrollo radical y la producción de plátanos.
Aguilar et al. (2000b) hacen referencia a que el exceso de agua puede dañar el sistema
radical y contribuir a la susceptibilidad de los bananos al MP debido a la aparición de
situaciones de hipoxia radical, especialmente tras lluvias muy intensas o suelos pesados.
En otras plantas hospedadoras, como en bambú, Sheikh et al. (1978) citan la posible
predisposición de las plantas al ataque de Poria, Rhizoctonia y Polyporus, que causaron la
muerte, debido al crecimiento bajo condiciones de encharcamiento. En tomate, Bradford y
Hsiao (1982) describieron una reducción del potencial de hídrico de raíces, disminución de
la transpiración, apertura permanente de los estomas y epinastia de los peciolos debido a la
inducción de la producción de etileno bajo encharcaniento del suelo. Otros autores han
estudiado la influencia de la salinidad como resultante del encharcamiento, en combinación
con la hipoxia tales como Owen Bartlett (1977) en el desarrollo radical del algodón y
Stevens (1995) en Sultana grapevines.
4.2.2 Salinidad
Como hemos visto anteriormente, el agua de riego utilizada en Canarias suele tener un
elevado contenido en sodio y cloro. Esta condición, unida al bajo contenido de calcio y
elevado contenido de arcillas de los suelos en Canarias, además del aporte de potasio
mediante el abonado, provocan que estos suelos tiendan a la salinidad y se comprometa la
estructura del suelo apropiada para un buen drenaje y se produzcan bloqueos de
determinados elementos (Suárez y Santana, 2002).
La consecuencia del estrés salino sobre las plantas es principalmente, el aumento de la
presión osmótica de la solución del suelo y como consecuencia una mayor dificultad en la
Revisión Bibliográfica
42
absorción de agua (Lahav, 1995) por lo que se producen bloqueos de nutrientes en el suelo
destacando su efecto sobre el calcio como ha sido citado por Adams et al. (1990) en
tomate, Halperin et al. (1997) en cebada, Azaizeh y Steudle (1991) en maíz, y Lahav,
(1995) en platanera. Este elemento interviene entre otros procesos, en la formación del
sistema radical y en la formación del xilema, el cual disminuye de tamaño, por lo que
también disminuye la capacidad de transporte de agua a todos los órganos y tejidos de la
planta. Asch et al. (1995) en arroz y Udovenko et al. (1976) en cebada, trigo y judías,
describieron estas modificaciones. En maíz, Azaizeh y Steudle (1991) hacen referencia a
los cambios experimentados en el transporte del agua desde el suelo a la planta bajo
salinidad y como la adición de calcio puede compensar la pérdida del transporte. En fresa
se han descrito cambios similares por Dobren' kova (1980). El Zinc interviene, junto con el
boro y el calcio en la diferenciación celular y desarrollo del xilema, hecho que se ve
alterado bajo condiciones de salinidad observándose una disminución en el número y
tamaño de los haces del xilema también observado por Gadallah y Ramadan (1997). La
salinidad ademas puede producir retraso en el desarrollo y manifestación de deficiencias en
calcio observado por Belda et al. (1996) en el tomate. Los mismos autores, en el mismo
cultivo también determinaron que la salinidad aumenta la conductividad eléctrica en el
suelo y mediante estudios histoquímicos realizando tinciones con safranina reveló la mayor
lignificación de los haces del xilema (Belda y Ho, 1993).
El estrés abiótico producido por la salinidad conduce a cambios estructurales como la
reducción del cilindro central vascular de los haces lignificados (el xilema y fibras) y el
aumento del tejido parenquimático en el córtex de Atriplex spp (Abo Hassan et al., 1980).
También se ha descrito una disminución en el numero y en el tamaño de los vasos
xilemáticos en tomate (Moskaleva y Sinel' nikova, 1976), en rábano (Melati et al., 1993)
También podemos encontrar deposiciones de lignina en los haces vasculares de las raíces
de Phaseolus vulgaris determinándolas con tinciones de azul de toluidina, como describe
Cachorro et al. (1993) en respuesta al estrés salino y bajas concentraciones de iones de
Calcio en suelo.
Beretta et al. (1988) observaron oclusiones en los vasos del xilema por la acumulación de
Zinc en suelo debido a estrés salino en Citrus. Reinhardt y Rost (1995) estudiaron los
efectos de la salinidad en el desarrollo de los tejidos en algodón cv. ‘Acala SJ-2’,
concluyendo que la salinidad afecta al crecimiento y diámetro de las raíces. También
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observaron que las raíces expuestas a salinidad muestran una mayor vacuolización en las
células de todos los tejidos, más notorio en las células del metaxilema situadas en el córtex.
Otros cambios que induce la salinidad son la prematura diferenciación del protofloema, la
intensa tinción de la endodermis y el interior de algunas células de parénquima y del
xilema, y la inducción de emisión de nuevas raíces laterales más frecuentes que en las
raíces de plantas no estresadas. Como indicador de salinidad en las raíces puede tomarse
como referencia el aumento de la acumulación de la hormona ABA. Un caso de
interacción de estrés por salinidad e infección de un patógeno es el descrito por Howell et
al. (1994), quienes demostraron el efecto interactivo de la salinidad y Verticillium Albo-
atrum en la severidad de la verticilosis en alfalfa.
4.2.3 Compactación
Desde el punto de vista físico la compactación es una consecuencia inmediata del
encharcamiento, provocando cambios estructurales en los suelos, que condicionan cambios
de las relaciones hídricas entre la planta y el suelo, tales como disminución de la porosidad
(Heiskanen y Roeber, 1996) y por lo tanto un cambio en la capacidad de campo, punto de
marchitez, etc. que afectaran directamente a la planta y a su nutrición.
Situaciones de encharcamiento y sequía en el suelo durante periodos de tiempo
prolongados provocan el agotamiento del oxigeno disponible para la planta, compactación
del suelo, sobre todo cuando este contiene un elevado porcentaje de arcilla, pudiendose
producir heridas y necrosis en las raíces de las plantas (Malcolm y Lewis).
En Canarias, los estudios de Domínguez (2000) en las áreas con índice de MP mas severas,
mostraron que los suelos tenían tendencia a la formación de agregados estables de arcillas
con el agua de riego, que podían conducir a situaciones de anaerobiosis en el suelo y
elevado contenido en Hierro. El reducido tamaño de las partículas, cuando se secaba el
suelo, tendían a la compactación.
En su tesis doctoral, Aguilar (1998b), puso de manifiesto que el efecto de la compactación
no ha sido muy estudiado en platanera. La compactación del suelo afecta al desarrollo de la
planta y provoca una disminución de la altura de la planta, un retraso en la floración y una
reducción del número de hijos emitidos. La reducción de la aireación del suelo puede
producir asfixia radical. También tiene efectos sobre el enraizamiento, reduce el número de
raíces, siendo estas mas anchas en diámetro. También afecta a la nutrición de la planta
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pues provoca una reducción de la absorción del nitrogeno, fósforo, potasio y el calcio y
una absorción masiva del manganeso (Dorel, 1993).
La escasa bibliografía referente a las consecuencias de la compactación del suelo en
platanera, se refiere a los efectos sobre el desarrollo del cultivo aunque no existen síntomas
en el interior del rizoma ni de oscurecimiento vascular asociados a este factor abiótico de
estrés.
4.2.4 Hipoxia y anoxia radical
La saturación hídrica del suelo reduce el oxigeno, aumenta el CO2 y la concentración de
etileno en el suelo (Huang et al., 1997a; Huang et al., 1997b; Ponnamperuma, 1984),
(Trought y Drew, 1980). La disponibilidad de oxigeno se ve reducida pues todos los poros
del suelo están llenos de agua y esta no se renueva, agotándose en poco tiempo el oxigeno
disuelto en ella debido a la actividad metabólica de microorganismos del suelo y a la
propia actividad de las raíces de la planta desplazando el aire que ocupaba los poros.
Además, este hecho se ve agravado porque el oxigeno presenta una capacidad de difusión
en el agua 1/10.000 de su valor en el aire y la escasa aireación conduce a situaciones de
hipoxia (4 kPa de O2) o anoxia (ausencia de O2), debido al consumo de este por las raíces y
microorganismos del suelo. El agua presente en el suelo en cantidades excedentes a la de
capacidad de campo es perjudicial para todas las plantas y la platanera es muy sensible a
ella. Sus raíces requieren del oxigeno para realizar su función. El efecto de la asfixia en la
platanera es el amarilleamiento que comienza por las nervaduras. Si la asfixia se prolonga
en el tiempo, las raíces serán irremediablemente dañadas y se producirán necrosis en los
ápices y cambios estructurales en ellas.
Aguilar et al. (1999) observaron que las raíces de platanera experimentan cambios
estructurales cuando se producen situaciones de hipoxia, como la inducción de la
formación de aerenquima, mecanismo de defensa para facilitar la aireación aunque podría
ser utilizado por los patógenos del suelo para colonizar la planta (Malcolm y Lewis). La
anoxia radical puede conducir a la planta a una mayor susceptibilidad al ataque de
determinados patógenos como demostraron Aguilar et al. (2000a) quienes probaron que en
situaciones de saturación hídrica la resistencia del cv. ‘Willians’ a la infección por FOC,
podía perderse.
En otras plantas hospedadoras, Everard y Drew (1989) describieron tres etapas del efecto
del encharcamiento y la deficiencia de oxigeno sobre el sistema radical del girasol: cierre
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estomático, marchitamiento y oclusiones en xilema. A nivel celular aparecen
modificaciones químicas en las paredes celulares, como la lignificación y la suberificación,
además de una mayor presencia de cristales de oxalacelato que reciben el nombre de
rafidios (Lecuona, 1975).
Ding y Musgrave (1995) también observaron el aumento de aerenquima en un 40 % en
raíces de trigo bajo condiciones de encharcamiento. Bingham (2000) y Liao y Lin (2001)
hacen una revisión de los cambios que se dan en las raíces bajo situaciones de hipoxia-
anoxia, desde el punto de vista metabólico: cambio de rutas metabólicas aeróbicas hacia
anaróbicas; expresión diferencial de determinadas hormonas como ABA y morfológicos-
anatómicos: como el aumento de tejido aerenquimático, etc.
Misaghi et al. (1978) también relacionaron las oclusiones presentes en xilema en algodón
con estrés hídrico y la infección por Verticillium dahliae.
En cuanto a la posible traducción en practicas agrícolas que mejoren los cultivos, Burgess,
(1998) en Eucaliptus indica que los tratamientos previos en condiciones de hipoxia ayudan
a soportar las condiciones de anoxia, conclusiones a las que también llega Aguilar, (1998a)
en platanera.
4.2.5 Deficiencias nutricionales
La manifestación de deficiencias nutricionales en las plantas es un indicador sin lugar a
dudas de una situación de estrés en la planta, ya sea de origen biótico o abiótico. En la
siguiente tabla se muestran los valores de referencia extraídos de diferentes fuentes
incluidas en Alves (1997) y en Galan Sauco (1992) para una correcta nutrición de la
platanera tomando la muestra foliar de acuerdo con el método internacional de referencia
(MEIR) basado en numerosos ensayos de Martin-Prevel (Galan Sauco, 1992).
Tabla 1. Valores de referencia extraídos de diferentes fuentes incluidas en (Alves, 1997) y (Galan Sauco, 1992)
Nutriente Bajo Medio AltoN(%) <2.40 2.40-2.80 >2.80P(%) <0.13 0.18-0.25 >0.25K(%) <2.90 2.90-4.00 >4.00Ca(%) <0.40 0.74-1.70 >1.70Mg(%) <0.20 0.30-0.50 >0.50Na ppm <0.60 >3500Fe ppm <70 70-200Zn ppm <15 20-35 >35Mn ppm <80 >80 >6000B ppm <10 60-300 >300K/(Ca+Mg) 0.5-3
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Las deficiencias nutricionales, influyen en el normal desarrollo y funcionamiento de los
tejidos y órganos de las plantas. Las deficiencias nutricionales pueden venir ocasionadas
por la ausencia en el suelo o por la incapacidad de la planta de transportarlos o asimilarlos.
Así muchas enfermedades vasculares conducen a la manifestación de deficiencias en la
planta debido a la interrupción del transporte del agua y micronutrientes movibles (calcio,
manganeso, zinc) a través del xilema como ha sido citado por (Zimmermann et al., 1994) y
por Clark y Smith (1988) para Kiwi, y del resto de nutrientes y micronutrientes inmovibles
(Boro) a través del floema según han referido Marschner et al. (1996), Welch y Rengel,
(1999) y Epstein (1973) para banana, aunque existen descripciones en la literatura del
movimiento del Boro a través del floema en determinadas condiciones de estrés (Raven,
1980), (Shelp et al., 1995), (Brown y Hu, 1998), (Hu et al., 1997) a nivel general y Lehto et
al. (2000) en coníferas.
Diferentes autores hacen especial mención a la deficiencia en calcio, boro y zinc, y sus
implicaciones en los cambios celulares, y mediante técnicas histológicas describen las
consecuencias en los tejidos, y su implicación en el desarrollo del xilema y especialmente
en el desarrollo y diferenciación del floema (Abo Hassan et al., 1980; Adams y Ho, 1989;
Adams et al., 1990; Herichova, 1986; Pissarek, 1980) en diferentes plantas. En Canarias,
Borges Perez (1991) demostró que una aplicación de zinc en el suelo reduce notablemente
la incidencia y severidad del Mal de Panamá.
En las plantaciones de platanera de Canarias encontrar deficiencias nitrogeno, fosforo y
potasio resulta extraño, ya que son componentes principales de los abonos que se aplican
habitualmente. Todo lo contrario, el exceso de potasio en suelo puede ser muy frecuente en
los suelos Canarios (Garcia et al., 1978). La toxicidad por exceso, se presenta como un
halo marginal decolorado evolucionando luego a necrosis. Para el sodio raramente se da la
deficiencia. Es mas frecuente la toxicidad por exceso. Se presenta en forma de quemaduras
que empiezan por un halo marginal y terminan por necrosis por todo el borde de la hoja.
Las carencias mas importantes en Canarias son el calcio y zinc, (Garcia et al., 1978),
cationes fácilmente retenidos por el suelo bajo situaciones de encharcamiento como se ha
visto anteriormente. La aparición de los primeros síntomas de deficiencia tanto como en
zinc y como en calcio se produce en las hojas más jóvenes.
En el caso de zinc aparecen manchas cloróticas en bandas, a menudo casi blancas en el
sentido de las nervaduras secundarias y de anchura variable, alternadas con bandas
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perfectamente verdes. Aspecto similar a la virosis por CMV (Lockhart y Jones, 2000). Son
frecuentes hojas de tamaño reducido, puntiagudas, muy alargadas, agrupándose en roseta,
similares a las de la carencia en hierro. También puede darse la producción de frutos
deformados.
La deficiencia en calcio se caracteriza por clorosis generalizada en forma de dientes de
sierra en las extremidades de las hojas. Escaso desarrollo vegetativo, acortamiento de
entrenudos con modificación del plano de emisión foliar en hélice, ondulaciones de los
márgenes. Influencia sobre el rendimiento cuantitativo casi nulo, pero frutos de calidad
mediocre con tendencia a la separación mucho antes de la madurez. También pueden
presentarse hojas con los limbos reducidos que adoptan una forma semejante a “cola de
pescado”. Factores abióticos como el encharcamiento y la salinidad pueden conducir a
bloqueos de disponibilidad de calcio y otros elementos para las plantas como ha sido citado
por Drew et al. (1979) para trigo, y para tomate por Adams et al. (1990) como se ha visto
anteriormente. El calcio esta implicado en la formación de la lámina media de las
membranas celulares. Muchos patógenos sintetizan enzimas extracelulares pectinolíticas
que pueden degradar esta lamina y utilizarla como vía de entrada. Marschner (1986),
demostró que la presencia de calcio en el suelo podía inhibir la actividad enzimática de
estos.
La sintomatología aérea de la deficiencia en Boro recuerda a la descrita para el FMP o
‘Yellow Mat’ (Jones, 2000), amarilleo que comienzan por las hojas más jóvenes.
Deformaciones morfológicas en las hojas jóvenes, limbos muy reducidos y ondulación de
los márgenes. Necrosis de color tabaco sin clorosis previa por el borde de las hojas,
principalmente en el extremo. Clorosis entre nervaduras y estrías perpendiculares a las
nervaduras secundarias. El crecimiento es interrumpido. Su carencia es la responsable de la
degeneración de las raíces y el desarrollo de la cavidad “blackish” en el meristemo apical
del rizoma Charpentier (1968) en Jones (2000). El boro interviene en los procesos de
división celular y en el metabolismo de los ácidos nucleicos. Una deficiencia de este puede
llegar a bloquear la división celular de las raíces principalmente (Ali y Jarvis, 1988). El
Boro también interviene en la formación de las paredes celulares e interfiere en las
reacciones enzimáticas dependientes del manganeso (Blevins y Lukaszewski, 1998). Una
correlación entre la deficiencia en boro y el aumento de la severidad en raíz de la
enfermedad llamada corazón negro en nabos y rábanos fue encontrada por Shelp et al.
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(1987). Venter y Currier (1977) determinaron que la deficiencia en boro inducía la
formación de callosa, elemento presente en las oclusiones xilemáticas. Cakmak y Römheld
(1997) estudiaron la inducción de la formación de compuestos fenólicos, además de
cambios en la permeabilidad a protones de las membranas celulares e incrementos en la
actividad enzimatica de la polyfenoloxidasa bajo deficiencia en boro. Camacho-Cristóbal y
González-Fontes (2002) observaron que la deficiencia en boro provoca cambios
cualitativos y cuantitativos en el metabolismo fenólico de plantas de tabaco, además de de
un aumento en la actividad de las enzimas fenilalanina amonioliasa (PAL) y polifenol
oxidasa (PPO).
Resulta difícil la distinción de la deficiencia en boro con las deficiencias en azufre, aunque
esta última es típica de las plantas procedentes de cultivo in vitro, a los dos meses de ser
plantadas presentan una clorosis en las dos o tres hojas mas nuevas, reversible y
acompañada por una disminución de la velocidad de crecimiento (Lahav y Israeli, 2000).
En plantas adultas no es muy frecuente. El magnesio es importante por su relación con
potasio, que puede mejorarse si se añade calcio (Charpentier, 1968) en (Lahav y Israeli,
2000).
Alvarez et al. (1999) observaron que los suelos canarios se caracterizan por contener
manganeso y hierro en niveles bajos, aunque en los sistemas agrícolas, estas carencias
generalmente se suplen con el abonado. Los síntomas de la deficiencia en manganeso se
inician en hojas jóvenes. Inicialmente clorosis marginal que se desarrolla en clorosis con
aspecto estriado siguiendo las nervaduras transversales. Lahav y Israeli (2000) describen
que esta deficiencia aumenta la probabilidad de que las hojas sean atacadas por el hongo
Deightontella torulosa, que provoca necrosis marginales. Influencia sobre el rendimiento.
Cuando hay un exceso de manganeso aparecen manchas blancas que luego se necrosan de
manera similar a las quemaduras de sol. Por último la deficiencia en hierro se caracteriza
por una clorosis generalizada de la planta.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material y Métodos
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1. INCIDENCIA, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y DESCRIPCIÓN DEL “FALSO MAL DE
PANAMÁ” EN CANARIAS.
1.1. Datos climáticos
Para hacer un estudio de la incidencia temporal y local del desorden, se han analizado los
datos climáticos que han sido facilitados por el servicio de meteorología del Cabildo de
Tenerife (años 1996-99) y por el departamento de suelos y riegos del ICIA (años 1999-
2002). Hemos utilizado la temperatura y humedad relativa para intentar correlacionar los
momentos de máxima expresión de la sintomatología con los datos de temperaturas bajas
extremas.
1.2. Muestreos de material vegetal y encuesta epidemiológica
Se revisó el material suministrado a los agricultores en el año 1999, seleccionando aquellos
casos que eran superiores a mil plantas, dentro de las zonas productoras de plátanos Las
Galletas en la vertiente sur y Buenavista en la vertiente norte de la isla de Tenerife. La
selección incluyó al menos un 5% de los casos de FMP. Esta metodología estaba basada en
la que se utilizó para el estudio del último episodio del Mal de Panamá (Alonso et al.,
1994; Hernández, 1997). En las visitas a las plantaciones, se realizaba una encuesta a los
agricultores sobre las condiciones del cultivo basada en la utilizada por Alonso et al.
(1994) en sus estudios sobre el MP, con el fin de poder definir el contexto del FMP,
buscando los factores comunes en las plantaciones que pudieran estar influyendo en la
expresión de los síntomas.
En 18 plantaciones los muestreos se realizaron directamente en campo, 11 de la vertiente
norte y 7 de la vertiente sur. En total se muestreó material vegetal procedente de 90 plantas
con síntomas. Además, a lo largo de la realización del trabajo, esporádicamente se han
visitado otras fincas con FMP cuyos propietarios se han puesto en contacto con nosotros o
bien nos remitían muestras de material vegetal al laboratorio para que fueran
diagnosticadas. En conjunto, el número total de plantaciones objeto de estudio ha sido de
59 de las que se han estudiado 172 plantas.
Todas las muestras se han procesado con el fin de realizar los aislamientos de los
organismos asociados. Se estudiaron 567 fragmentos o submuestras procedentes en su
mayoría de rizoma, y cuando fue posible de pseudotallo y raíz. Los fragmentos se
Material y Métodos
51
desinfectaron superficialmente con una serie de lejía comercial (35 g de cloro activo) 5%,
alcohol 70% y agua destilada estéril. Se realizaron siembras de material afectado en
medios PDA, Komada (Komada, 1976) y LPGA, para la obtención de la colección de
aislados asociados a plantas sintomáticas de FMP, que han sido objeto de estudio en este
trabajo.
1.3. Análisis Foliares
Para determinar si el estado nutricional de las plantas estaba relacionado con la expresión
de síntomas asociados al FMP, se tomaron entre 3-5 muestras foliares por parcela de unos
1000 m2, en algunas de las plantaciones más severamente afectadas. Los análisis foliares se
realizaron según la Norma Internacional (Martin-Prèvel, 1984) siempre que el estado
fenológico de las plantas lo permitía y se determinaron los micro y los macrolementos de
acuerdo a los métodos oficiales de análisis (Anónimo, 1994). Todos estos análisis se
realizaron en el Laboratorio de Suelos y Riegos del ICIA, y la metodología empleada fue la
protocolizada para cada elemento: N, P, K, B, Zn, Ca, Na, Mg, Mn, y Fe.
Los métodos utilizados para los análisis foliares fueron:
N: Mineralización vía húmeda y determinación colorimétrica en Autoanalizador Technicon
AAII como el complejo salicilato de amonio y leído a 660 nm.
P , K ,Ca , Mg , Na , Fe , Mn , Zn y Cu: Mineralización (incineración a 450 ºC y extracción
con ácido clorhídrico diluido caliente) y determinación:
P: Colorimétricamente como el complejo ácido vanadomolibdofosfórico y leído a 420 nm
en Autoanalizador Technicon AAII.
Na, K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn y Cu: Espectrofotometría de absorción atómica con lámparas
específicas para cada elemento, añadiendo 1% P/V de La en el caso de Ca y Mg y 0.1% de
Cs en el caso de Na y K.
1.4. Análisis físico-químicos de los suelos agrícolas.
Se eligieron 5 plantaciones con alto índice de incidencia. Se realizaron análisis físico-
químicos y microbiológicos de 5 muestras alteradas por parcela de unos 1000 m2 de
superficie.
También se realizaron muestreos de los suelos de 2 plantaciones comerciales de la
localidad de Buenavista del norte de Tenerife, de las que se tomaron muestras inalteradas y
muestras alteradas. Las muestras inalteradas se tomaron con anillos metálicos diseñados
Material y Métodos
52
para esta metodología. Los análisis físicos se realizaron sobre muestras inalteradas
determinándose, la densidad aparente, y las curvas de absorción de Richards (1965) según
Forsythe (1975), donde se calcularon las pf 3 (1/3 de 1000 cm) (agua correspondiente a la
capacidad de campo) y 4.2 (16000 cm) de presión atmosférica (correspondiente al punto de
marchitez). También se calculó la porosidad obtenida en función del volumen del anillo y
del peso de la muestra de suelo. Estos análisis fueron realizados en el laboratorio de
hidrología bajo la supervisión del Dr. Carlos Regalado.
Todas las muestras alteradas se procesaron para análisis químicos en los que se
determinaron los cationes y los aniones solubles, los cationes de cambio, la capacidad de
intercambio catiónica (CIC), el N, el K, el P y los microelementos, pH, CE, porcentaje de
saturación, Nitritos, Nitratos y materia orgánica (Klute, 1986.; Page, 1986.). Estos análisis
se realizaron en el laboratorio de Suelos y Riegos bajo la supervisión de Dña. Ana Rosa
Socorro.
Los métodos de análisis de suelos utilizados fueron (Forsythe, 1975):
Conductividad eléctrica (C.E. y pH) medidos en pasta saturada
Ca, Mg, Na y K: Se determinan por absorción atómica, en llama aire-acetileno, en el caso
de Ca y Mg se añade solución al 1% p/v de lantano y para Na y K 0.1% de Cs.
Carbonatos y Bicarbonatos: Volumetría ácido-base empleando fenolftaleina y naranja de
metilo como indicadores.
Cloruros: Volumetría de precipitación usando cromato potásico como indicador.
S-SO4: Se determinan turbidimétricamente con sulfato de bario, usando suspensión semilla
de sulfato de bario y solución de goma de acacia-ácido acético.
N-NO3: Los nitratos son reducidos a nitritos por hidracina en solución alcalina,
reaccionando con sulfamilamida para dar un compuesto que es leído a 550nm.
Bases cambiables: Extracción con AcONH4 1N pH:7 y determinación del Ca, Mg, Na y K
por absorción atómica.
C.I.C.: saturación del suelo con iones NH4, desplazamiento con Na.
P : Método colorimétrico de OLSEN.
Materia orgánica oxidable: Se determina el carbono orgánico del suelo que se oxida con
dicromato en presencia de ácido sulfúrico.
X*Ca = CIC - ( XMg + XNa + XK ).
Material y Métodos
53
Textura: Densímetro Bouyoucos, ( arena: 2.0 mm - 0.05 mm, limo: 0.05mm - 0.002mm,
arcilla: < 0.002mm ).
1.5. Análisis microbiológicos de los suelos.
Se estudiaron 3 muestras procedentes de 3 puntos distintos de cada plantación. De cada
una de ellas se realizaron tres repeticiones y el número final de Unidades Formadoras de
Colonias (UFC) se calculó a partir de la media del conteo de tres placas por duplicado en
cada medio de cultivo.
Las muestras de suelos para los análisis microbiológicos, fueron previamente secadas al
aire libre y luego tamizadas con un tamaño de poro de 0.5 mm. Se procesaron mediante el
método de las diluciones y siembra en placas empleando los medios PDA patata dextrosa
agar), Komada y KB, para la obtención de la flora total, flora Fusarium sp. y flora
bacteriana (Warcup, 1950; Weaver, 1994). Se sembraron 100 µl por placa de las diluciones
10-1-10-4. Las UFC se contaron en las diluciones 10-2 y 10-3 en la mayoría de los casos.
Material y Métodos
54
2. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS AISLADOS
BACTERIANOS Y FÚNGICOS
2.1. Aislamiento e identificación de bacterias asociadas al FMP.
Los métodos de aislamiento empleados han sido los clásicos en fitopatología, a partir de
muestras vegetales dilaceradas en agua destilada estéril, previamente desinfectadas
superficialmente con una dilución de lejía comercial (50 g de hipoclorito sódico) al 1 %, se
realizaron inicialmente siembras en medios de cultivo generales LPGA y NGA. Según las
características culturales, se realizaron descripciones de las diferentes morfologías de las
colonias y éstas se purificaron en medios diferenciadores y selectivos para obtener
finalmente cepas purificadas con las que poder realizar los pasos de identificación y
caracterización siguiendo los criterios de Bradbury (1986; 1988), Hernández y Dubón
(1992), Lelliott y Stead (1987), Schaad (1988) y de Sneath (1986).
La identificación de las cepas se realizó por medio de caracterizaciones metabólicas,
ácidos grasos y claves sistemáticas Sneath, (1986) y Hernández y Dubón (1992).
2.1.1. Caracterización fenotípica y metabólica de las cepas bacterianas
seleccionadas.
El conjunto de todas estas pruebas se realizó en el IVIA, bajo la supervisión de Mª
Milagros López y Ramón Penyalver. Las cepas purificadas y conservadas en viales con
una solución crioprotectora (glicerol al 30%) a temperatura de �80ºC, se dejaron
descongelar a temperatura ambiente. Se pipetearon 5 µl de cada cepa transfiriéndolos a
tubos de ensayo con 4.5 ml de agua destilada estéril. Se sembraron en los medios de
cultivo LPGA y KB, en triple estría por agotamiento. Después de 24 h de incubación a
25ºC, se agruparon por similitud de color, tamaño y forma de las colonias. A cada grupo se
le asignó un número y se conservaron repicadas en tubo inclinado con medio de cultivo
Agar Nutritivo, a temperatura ambiente para las posteriores pruebas.
Para su caracterización se usaron pruebas bioquímicas, tales como la composición de la
pared celular (tinción de Gram, KOH 3% y aminopeptidasa), oxidasa, ureasa, indol,
esculina, arginina, gelatina, APN, almidón, patata, crecimiento aeróbico y anaeróbico en el
medio Hugh y Leifson y observación bajo lámparas de rayos ultravioleta para ver si eran
fluorescentes o no en medio KB (Sands, 1990).
Material y Métodos
55
De la combinación de los grupos morfológicos y bioquímicos obtuvimos otros subgrupos,
de los cuales se eligió un representante (Rudolph et al., 1990). Las clasificaciones se
realizaron siguiendo los siguientes pasos ( fig.3):
Gram Negativas
Aerobias Anaerobias
facultativas
Oxidasa Oxidasa
(+) (-) (+) (-)
Azotobacter Enterobacterias
Acetobacter (Erwinia)
Flavobacterim Vibrionaceae
Cytophaga Aeromonadaceae
Psedomonas Pasteurolaceae
Azospirillum Cardiobacteriaceae
Herbaspirillum
Xhantomonas
Fig. 3. Protocolo de identificación seguido según los resultados de las pruebas metabólicas obtenidos.
Todos los resultados se registraban en una base de datos con el fin de facilitar el
agrupamiento de cepas con características similares y se clasificaban en tipos bacterianos.
2.1.2. Pruebas de hipersensibilidad en hojas de tabaco (Lelliot y Stead, 1987)
Con el objetivo de reducir el número de cepas, los resultados de taxonomía se unieron en
una hoja de cálculo de Microsoft Exel a los resultados de la prueba de hipersensibilidad en
hoja de tabaco (HR) descartando las que no pertenecían a un género descrito para la
platanera y que eran HR negativo. Una cepa HR negativo seguro que no tiene capacidad
patogénica, en cambio una HR positivo puede tenerla o no.
Se preparó una suspensión de las cepas bacterianas en agua destilada estéril con una
concentración en el rango de 10 6 y 10 8 UFC/ml, que fue cultivada durante 24h a 25º C en
medio King B y se inyectó en el espacio intercelular de la hoja de tabaco desde el envés,
por presión, empleando una jeringuilla hipodérmica. Se efectuaron dos inyecciones por
Material y Métodos
56
cada cepa en distintas hojas de la planta de tabaco. La reacción se consideró positiva si se
formaba la necrosis plateada característica en la hoja a las 24 h. Los controles se realizaron
con la misma metodología pero inyectando únicamente agua destilada estéril.
2.1.3. Método de Taxonomía bacteriana por perfil de ácidos grasos de membrana.
Para la clasificación e identificación de los aislados bacterianos se recomienda que las
descripciones se basen en 25 o más cepas, siendo 10 el mínimo aceptable. La diversidad de
la estructura de los ácidos grasos, la conservación de los patrones en los diferentes taxones
y su estabilidad hace de ellos unos elementos excelentes para la identificación de bacterias.
La caracterización de los aislados por la composición cualitativa y cuantitativa de los
ácidos grasos de membrana fue utilizada por primera vez por Holdeman et al. en 1977 en
bacterias anaerobias. Los ácidos grasos están formados por una cadena alifática con un
número, en general par, de átomos de carbono (de 4 a 22) y un radical COOH, que les
permite unirse a otros grupos. Según la longitud de su cadena pueden ser de cadena corta
(4 a 6 átomos de carbono), de cadena media (de 8 a 10) o de cadena larga (de 12 o más).
Los ácidos grasos presentes en la membrana de las bacterias fitopatógenas poseen entre 9 y
20 carbonos.
Para caracterizar un taxón, es necesario analizar diferentes repeticiones con cepas de
diferentes orígenes, y mediante el cálculo de las medias y desviación estándar para cada
muestra se puede construir un determinado perfil característico. La clasificación a nivel de
género se realiza comparando las diferencias de los perfiles cualitativamente
(presencia/ausencia de los ácidos grasos). A nivel de especies o subespecies es necesario
calcular las fracciones entre los ácidos grasos estables de 14:0 y 16:0, o entre 15:0 ISO y
15:0 ANTEISO.
Todos estos cálculos se simplifican con un sistema automatizado creado por la casa
comercial Hewlett-Packard© 5898 Microbial Identification System con la cooperación del
Dr. Donald Fieldhouse (Sasser, 1990).
Se han realizado dos protocolos distintos. El método MIS (Sample Processing Procedure)
y el método de metilación (Luquin et al., 1991). Con éste último método se obtiene el
perfil de ácidos grasos totales en la membrana bacteriana.
Los resultados de las pruebas fenotípicas, los perfiles de los ácidos grasos, los API® 20E,
API® 20NE y las inoculaciones se procesaron utilizando el programa estadístico SYSTAT©
10 y mediante una base de datos creada en Microsoft© EXCEL 2000.
Material y Métodos
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2.1.4. Protocolo de extracción de ácidos grasos MIS para la identificación de
bacterias a través de Cromatografía de gases (Miller, 1985).
Se pretende obtener un cromatograma con un perfil específico que viene dado por la
composición (tanto cualitativa como cuantitativa) en ácidos grasos de la membrana celular
bacteriana con el objetivo de utilizarla como técnica de diagnosis y de identificación a
nivel de especie (Siverio et al., 1996). El protocolo utilizado para la extracción de los
ácidos grasos de la membrana celular bacteriana consta de 5 fases que consisten en:
siembra de las cepas, saponificación, metilación, extracción y aclarado.
La siembra de las cepas se realizó en el medio TSBA (fig. 3), a partir de cultivos puros
obtenidos a través de sucesivas siembras en estría en medios generales como son PDA,
LPGA, NGA, o LB.
De acuerdo con el esquema de siembra de la fig. 4, se escogió el tercer cuadrante, donde
las bacterias se encuentran en crecimiento exponencial y donde aún no hay problemas de
competencia por el espacio y por los nutrientes.
Las placas de TSBA se incubaron a 28 ºC y transcurridas 24 h, se recogieron unos 40 mg
de biomasa con un asa de siembra y se pasó a un tubo de ensayo.
Fig. 4. Siembra por agotamiento, en 4 cuadrantes aconsejada por la casa
comercial Hewlett-Packard© 5898 Microbial Identification System,
para realizar el perfil de ácidos grasos sobre las colonias crecidas en el
tercer cuadrante a las 24 h de crecimiento.
Los reactivos con el símbolo #, utilizados en el protocolo se describen en el anexo 1.17. El
proceso comenzó con una saponificación de las células producida por la incorporación de 2
ml del reactivo #1 en el tubo de ensayo. Tras la agitación con vórtex durante 5-10
segundos, los tubos fueron introducidos en un baño a 100ºC y transcurridos 5 minutos se
agitó con vórtex de nuevo durante 5-10 segundos y se volvieron a introducir los tubos en
un baño a 100ºC, a los 25 minutos se enfriaban rápidamente introduciéndolos en hielo.
Para la metilación, se dispensaron 4 ml del reactivo # 2 en cada tubo, se agitaron los tubos
con vórtex durante 5-10 segundos y se introdujeron en un baño a 80ºC. Pasados 10 minutos
se enfriaron los tubos rápidamente en hielo.
Material y Métodos
58
La extracción de los ácidos grasos se realizó dispensando 1,5 ml del reactivo # 3 en la
muestra y agitando verticalmente durante 10 minutos. Se extrajo la fase inferior (fase
acuosa), se añadieron 3 ml del reactivo # 4 en la muestra y se agitaron verticalmente
durante 5 minutos para aclarar la muestra del reactivo #3. Opcionalmente, si no se
separaban bien las dos fases, se podía centrifugar durante 5 minutos a 2.500 rpm. Otra
alternativa era añadir a la muestra con una pipeta Pasteur, 3 gotas, de una solución salina
saturada (20 g NaCl /100 ml de agua destilada). Finalmente se procedió a la extracción de
la fase superior (fase orgánica), la cual se transfirió a un vial que se selló con un tapón
hermético para su posterior inyección en el cromatografo. Si no se obtenían perfiles claros
o los picos resultantes eran muy pequeños, podía ser debido a que no se recogía suficiente
biomasa bacteriana para la extracción. Este problema podía solucionarse evaporando la
muestra con un flujo de nitrógeno (gas), y resuspendiéndola en 100 µl del reactivo # 3 o de
hexano puro. De esta manera se consiguió concentrar la muestra unas 100 veces. Las
condiciones del cromatógrafo se describen en el anexo 1.19.
2.1.5. Protocolo II, Metanólisis (Luquin et al., 1991)
Las cepas bacterianas se sembraron en medio LPGA, de forma confluente, y se incubaron a
28ºC durante 24 h o 48 h (según fuera la tasa de crecimiento de éstas). Siempre se tuvo en
cuenta que el cultivo no tuviera problemas de envejecimiento ni de muerte celular. La
muestra se recogió en un tubo de tapón de rosca y se añadieron 2 ml del reactivo # 0. Se
agitó durante 10-15 segundos en vórtex y se incubó durante 1 hora a 80ºC en un baño (bien
eléctrico o de agua). Se dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadieron 2 ml de hexano,
agitando durante 10 minutos verticalmente, hasta conseguir una buena separación de las
dos fases. Se eliminó la fase inferior. La superior se pasó a otro tubo igual que el utilizado
para el protocolo MIS. Se dejó evaporar el contenido acelerando el proceso mediante
incubación a 40 º C en un baño (eléctrico o de agua) y con un flujo constante de nitrógeno
(g), directamente sobre la muestra. Esta operación se repitió 2 veces volviendo a añadir
otros 2 ml de hexano en la muestra. Finalmente se añadieron 0,5 ml de hexano y se
conservó en la nevera hasta ser inyectado en el cromatógrafo.
Material y Métodos
59
2.1.6. Ensayo comparativo del crecimiento de una cepa bacteriana durante 24 h y
48 h mediante HPGC.
Según el manual de la casa comercial Hewlett Packard, es aconsejable dejar crecer durante
24 h a 28º C el cultivo bacteriano que se quiere identificar. Para el análisis, se recomienda
recoger unos 40 mg de biomasa bacteriana del cuadrante tercero de una placa sembrada en
estría dividida en cuatro cuadrantes tal y como se muestra en la fig.4.
Pero pueden existir diferentes problemas si se sigue con rigor esta norma del protocolo:
existen cepas bacterianas que a las 24 h de incubación a 28ºC, no han crecido lo suficiente
como para recoger del tercer cuadrante 40 mg de biomasa bacteriana, o al revés, puede que
tengan un crecimiento tan rápido que ya existan problemas de competencia y mortalidad en
dicho cuadrante, lo que nos estaría interfiriendo luego en la composición de los ácidos
grasos de membrana.
Así pues, con este ensayo, se quiso comprobar:
• Si existían diferencias en la composición de ácidos grasos de membrana de una cepa
bacteriana entre los diferentes cuadrantes de una placa sembrada en estría confluente.
• Si existían diferencias, entre el crecimiento a las 24 h y las 48 h (ambas a 28ºC) respecto
a la composición en ácidos grasos de membrana.
Se partió de un cultivo puro, sembrando de la forma que se aconseja en el método original
en medio de cultivo TSBA (fig.4). Se realizó por triplicado por si había problemas de
cantidad para algún cuadrante, para así poder reunir suficiente cantidad de biomasa
bacteriana. También se sembró en forma de estría confluente en medio TSBA en sólo una
placa, pues sembrando de esta manera no existen problemas de biomasa disponible. Se
realizó el protocolo como se ha descrito anteriormente, dejando crecer la cepas durante 24
h a 28º C y además durante 48 h a 28º C.
Material y Métodos
60
2.2. Identificación y caracterización cultural de los aislados fúngicos
La identificación se realizó siguiendo características culturales y morfológicas utilizando
manuales generales (Barnett, 1972) y claves especificas. Para Fusarium se siguieron los
criterios de Nelson (1983), Booth (1971) y los de Snyder y Hansen (1940).
La caracterización cultural se realizó de acuerdo con la morfología y coloración de las
colonias aisladas. También se tuvieron en cuenta características como la producción de
pigmentos difusibles en el medio, de manera similar a como se empleó con las bacterias,
velocidad de crecimiento en medio PDA (Patata Dextrosa Agar) y Komada (Komada,
1976) a 25ºC y 17ºC, y observaciones microscópicas. Para la obtención y confirmación de
cultivos puros, se obtenían cultivos monospóricos de todos los aislados a partir de siembras
en estría de diluciones que daban lugar al crecimiento de un número de colonias entre 10 y
30 por placa a las 24 horas de crecimiento. Cuando había contaminaciones bacterianas, se
realizaba un lavado del explante de una colonia introduciéndolo en un tubo con agua
destilada estéril y se resembraba en un medio con antibióticos, generalmente Komada
(Komada, 1975). Se repetía la operación si era necesario hasta que no aparecían
contaminantes en el medio de cultivo, y se procedía a la congelación en un medio
crioconservador (glicerol 30%) a temperatura de - 80ºC, después de haber repicado la
colonia en un medio rico en carbohidratos como PDA.
2.2.1. Crecimiento de Fusarium para su identificación
En medios habituales como PDA, las colonias presentan un crecimiento rápido, que suele
ocupar toda la placa (8-9 cm de Ø en 1 semana). El color que desarrollan depende de la
especie y puede ser blanquecino, crema, anaranjado, rosa, rojizo, púrpura, etc. Estas
coloraciones también pueden variar según los diferentes medios de cultivo. El micelio
aéreo suele ser abundante y de aspecto algodonoso. La velocidad de crecimiento, la
morfología y la pigmentación de la colonia son datos importantes para la identificación.
Las condiciones de cultivo para el crecimiento y la esporulación estándar son 25ºC durante
el día y 20ºC durante la noche.
Los colores de las colonias usados en las claves de identificación y la descripción de las
especies se encuentran ilustradas en las fichas número 1-8 del libro de Nelson, Tousson y
Marassas (Nelson, 1983), tanto de la superficie como del reverso en medio PDA. Estos
colores son los que hemos tomado como referencia para establecer una clasificación
Material y Métodos
61
cultural de los nuestros aislados. La caracterización de las variantes en los cultivos
monospóricos se realizó a partir de la descripción de 10 por cepa aislada. Los elementos
que se han considerado para la clasificación cultural y diferenciación de especies se
muestran en la siguiente Tabla 2.
Tabla 2. Características culturales de diferentes especies del género Fusarium, empleadas para su identificación. Procede de diversas fuentes (Nelson, 1983) y (Nelson y Ploetz, 1990).
F. oxysporum F. solani F. moniliforme F. subglutinans F. proliferatum
Color micelio aéreo
Blanco, púrpura, azul
Blanco, crema Blanco, púrpura
Blanco, púrpura Blanco, púrpura
Color reverso colonia
Salmón pálido a púrpura oscuro
Crema, púrpura oscuro
Púrpura pálido a oscuro
Púrpura, azul pálido a oscuro
Púrpura, pálido a oscuro
Color difusible en agar
A veces, rojo A veces violeta No No No
Color esporodoquios
Naranjas, azules
Crema, azul, verde, nunca naranja
Naranjas Naranjas Naranjas
Macroconidias ++, producidas en esporodoquios
+++ producidas en esporodoquios
+, producidas en esporodoquios
++, producidas esporodoquios y en micelio
++,producidas esporodoquios y en micelio
Microconidias +++ , células individuales, ovales
+++, asociadas en cabezuelas, ovales
+++, forman largas cadenas, ovales
+++, ovales, aglutinadas semejante a glóbulos rojos
+++, ovales, forman cadenas
Conidióforos Monofialides cortas, +++ Polifialides -
Monofialides muy largas, +++ Polifialides -
Monofialides cortas, ++ Polifialidas -
Monofialides cortas, ++ Polifialides ++
Monofialides cortas, + Polifialides +++
Clamidosporas +++ + - - -
Estado perfecto No se conoce Nectria haematococca
Gibberella fujikuroi
Gibberella subglutinans
No se conoce
Características importantes
Monofialides cortas, predominio de microconidias, presencia de clamidosporas
Monofialides muy largas, microconidias en cabezuelas
Monofialides, microconidias en largas cadenas. Polifialides ausentes
Presencia de polifialides y ausencia de cadenas de microconidias
Polifialides que producen cadenas de microconidias.
+++: muy abundantes, ++: abundantes, +: presentes, -: ausentes
Material y Métodos
62
2.2.2. Caracterización por Grupos de Compatibilidad Vegetativa (VCGs) de los
aislados pertenecientes al género Fusarium
Se siguió la metodología descrita por Correll (1987b), aunque en nuestro caso sólo se
utilizó el VCG de referencia 0120, ya que es el único presente en Canarias (Regalado-
Guijarro y Hernández, 1998) al cual pertenece F. oxysporum f sp cubense causante del Mal
de Panamá.
Para la inducción de los mutantes de la cadena nitrato reductasa (nit), por cada aislado, se
seleccionaron 2 líneas monospóricas, teniendo en cuenta la variabilidad presente en 10
monospóricos por aislado, que fueron sembradas en medio mínimo más 1,5 % de clorato
potásico (Puhalla, 1985).
La caracterización de los tipos de mutantes nit se realiza haciéndolos crecer con 5 fuentes
distintas de Nitrógeno (tabla 3):
Tabla 3. Caracterización de tipo de mutantes (+): crecimiento tipo salvaje (-): crecimiento hialino (Ploetz et al., 1992)
1 2 3 4 5 6
Salvaje + + + + + Ligero
Nit 1 - + + + + Sí
Nit 3 - - + + + No
Nit M - + - + + Sí
1. nitrato (NO3): MM completo (Medio básico + nitrato)
2. nitrito (NO2): M básico + 0.5 g/l Na NO2
3. Hipoxantina: M básico + 0.2 g/l hipoxantina
4. amonio (NH4): M básico + 1 g/l amonio tartrato
5. Acido úrico: Medio básico + 0.2 g/l ácido urico (no da información)
6. En realidad los nit 3 se confirman por no poder excretar nitrito al medio, el resto de
mutantes y el tipo salvaje si lo pueden hacer, aunque con el crecimiento en los
anteriores medios, esta prueba no se utiliza.
Los enfrentamientos se realizaron con los mutantes nit 1, nit 3 y nit M de los aislados con
el nit M del VCG 0120 de referencia cedido por el Dr. Randy C. Ploetz de la Universidad
Material y Métodos
63
de Florida, que se dispusieron siempre en el centro de la placa, utilizando la misma
plantilla, donde también se realizaron marcas isocéntricas para que los explantes de los
aislados estuvieran a la misma distancia del explante central correspondiente al VCG 0120
(fig. 5).
La lectura se realizaba a los 15 días y en adelante hasta que se producía la aparición del
heterocarion o los micelios de ambos aislados se unían sin haber formado la reacción de
compatibilidad (fig 5).
Fig. 5. Esquema para el ensayo de complementariedad entre VCG�s de las especies pertenecientes al
género Fusarium. Diseño de la plantilla basada en Domínguez, (2000).
En la tabla 4, se presentan las reacciones compatibles o incompatibles que se dan entre los
diferentes tipos de mutantes.
Tabla 4.Complementariedad entre los diferentes mutantes (Ploetz et al., 1992):
Nit 1 Nit 3 Nit M
Nit 1 -/+ -/+ +
Nit 3 -/+ - +
Nit M + + -/+
+: reacción compatible, formación de heterocarion. -: reacción incompatible, no se forma heterocarion. +/-: reacción variable, puede formarse heterocarion o no.
En el centro se colocaba el mutantenit M perteneciente al VCG 0120de colección (en rojo) y los nitobtenidos de nuestros aislados secolocaban alrededor (en verde).
Formación de heterocarión,
compatibilidad vegetativa +.
Material y Métodos
64
2.2.3. Caracterización por velocidad de crecimiento en placa con los medios de
cultivo PDA y Komada (Komada, 1975), a 15º C y 25º C de los aislados
pertenecientes al género Fusarium.
Se eligieron las temperaturas 25º C y 15º C porque de acuerdo con las claves sistemáticas,
la velocidad de crecimiento a 25º C es un criterio utilizado para la identificación de algunas
especies y corresponde al óptimo de muchas especies fúngicas y los 15º C por las bajas
temperaturas que pueden registrarse en platanera en Canarias en los meses de invierno.
Fig. 6. Esquema del diseño para el cálculo de la velocidad de crecimiento en placa de Petri de diferentes
especies fúngicas.
El ensayo se desarrolló a partir de 2 cultivos monospóricos seleccionados a partir de 10 de
cada aislado de diferentes géneros, aunque la selección incluyo proporcionalmente más
aislados del género Fusarium, mayoritariamente de la especie F. oxysporum.
Los medios de cultivo se dispensaban poniendo 17 ml por placa para que la cantidad de
medio no introdujera variabilidad en la velocidad de crecimiento. Partiendo del cultivo
monospórico desarrollado en PDA durante siete días, se ponía un explante del hongo, en
forma de cilindro de diámetro 4 mm en el centro de la placa, utilizando una plantilla donde
se habían marcado el centro exacto de la circunferencia de la placa de Petri. Las lecturas se
realizaban diariamente. Con una regla se medía el diámetro del crecimiento miceliar,
siempre entre dos puntos que se encontraban marcados en la placa (Fig. 6). Por cada medio
de cultivo y aislado se incluyeron 5 repeticiones. La velocidad de crecimiento era la
pendiente de la recta de regresión lineal resultante de todas las medidas en mm respecto al
tiempo (Koch, 1975).
A un tiempo ( t ) en horas, lecorresponde un crecimiento( c ) en mm, donde la relación es:
c = b t + a
donde b representa la velocidad decrecimiento expresada en mm/hcuando a = 0.
c
Material y Métodos
65
3. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD
3.1. Pruebas de patogenicidad de bacterias
La caracterización patogénica se realizó uniendo todos los datos morfológicos, fisiológicos
y metabólicos con los resultados de las pruebas de hipersensibilidad en el tabaco y las
pruebas de inoculación en plataneras sanas. Con todos los aislados se inocularon plantas de
platanera. Las cepas identificadas como enterobacterias (gram negativas, oxidasa
negativas) fueron sometidas a las pruebas API 20E© y las cepas identificadas como no
enterobacterias (gram negativas, oxidasa positivas) a los API 20NE© (Peñalver, 1994). Las
cepas gram positivas se procesaron como un solo grupo, eligiendo un único representante
que también fue inoculado en platanera sana.
Las cepas bacterianas a evaluar se cultivaron durante 24 h a 25º C en el medio KB y se
prepararon suspensiones en agua destilada estéril a una concentración de aproximadamente
10 8 UFC·ml-1. Se inocularon 3 plantas de platanera por cada cepa seleccionada. Todas las
plantas procedían de cultivo in vitro. Cuando las plantas tenían entre 6-8 hojas se
inyectaron con una aguja hipodérmica 0.2 ml de la suspensión en los peciolos de la 4ª o 5ª
hoja emitida antes de la última hoja no desenrollada o �cigarro puro�. Se señalizó la zona
del pinchazo con un círculo.
También se inoculó a nivel del rizoma, dejando una punta de micropipeta de 200 µl
clavada durante 2 horas aproximadamente hasta que la suspensión fue absorbida por la
planta. Como control se utilizó agua destilada estéril con los mismos procedimientos. Las
pruebas se realizaron en macetas, en el invernadero climatizado del IVIA a 25ºC y
utilizando un sustrato de mezcla perlita:tierra esterilizado al vapor. Se regó con una
solución nutritiva adecuada para la platanera y rica en micronutrientes (ANEXO. Solución
Nutritiva).
Una vez por semana durante 6 meses se observaban las plantas estableciéndose como
criterio el avance en mm de las bacterias inoculadas en el peciolo, y la aparición de algún
síntoma como marchitez y amarilleo foliar. Al final del ensayo se cortaron todas las plantas
a nivel del rizoma efectuando varios cortes seriados, tomando como variable la presencia o
ausencia de necrosis vasculares o oscurecimientos en la superficie.
Material y Métodos
66
3.2. Pruebas de patogenicidad de hongos
3.2.1. Ensayos in vitro
El objetivo de estos ensayos era encontrar una metodología que pudiéramos estandarizar,
que dieran reacciones rápidas para un diagnóstico de hongos fitopatógenos o hongos
saprófitos en la platanera. Existen referencias que utilizan pruebas con plántulas del
huésped para determinar la patogenicidad de diferentes microorganismos en el marco de
los postulados de Koch.
La metodología se ha elaborado a partir de diferentes estudios similares a los nuestros y
recomendaciones del INIBAP (Panis y Tien Thinh, 2001) y los de García-Rodríguez et al.
(1987) en sus estudios sobre la propagación in vitro de plataneras (Musa acuminata Colla
AAA var. �Dwarf Cavendish�) en las Islas Canarias.
Los valores de los síntomas internos y externos se analizaron según las pruebas no
paramétricas de Kruskal Wallis y de Mann Whitney, según si se trataban de varias o de
solo 2 muestras) que utilizan la comparación en rangos de los valores de la variable
estudiada. Las variables de crecimiento se analizaron según un ANOVA paramétrico. La
separación de medias se hizo según la prueba de rango múltiple de Tukey con nivel de
significación de aceptación de la hipótesis nula cuando p≤0,05. Todos los datos fueron
analizados en el programa estadístico Systat version10 Copyright © SPSS. Inc., 2000.
3.2.2. Ensayo preliminar de puesta a punto de la metodología.
La metodología empleada consistió básicamente en la inoculación de aislados obtenidos de
plantas con síntomas en plántulas de platanera obtenidas in vitro y colocadas en tubos de
ensayo grandes que contenían medio de cultivo de enraizamiento habitualmente utilizado
para la propagación in vitro de las plántulas de platanera por la empresa CULTESA. Esta
inoculación se realizó en combinación con condiciones de hipóxia en las raíces de la
planta. Este factor se consiguió añadiendo una capa de aceite mineral en la superficie de 4
cm de altura, de forma similar a como se cultivan bacterias anaerobias o se realizan
pruebas de fermentación como es el caso de la utilización de la glucosa con el medio Huff-
Leisson. Los especies fúngicas elegidas para la inoculación fueron: F. oxysporum, F.
subglutinans, F. proliferatum y F. solani, incluyéndose 3 repeticiones por inoculo en
condiciones normales y 3 por inoculo en condiciones de hipóxia. Los controles
consistieron en 3 plantas sin tratamiento alguno y 3 plantas con el aceite mineral
Material y Métodos
67
Las inoculaciones se realizaron tras una semana de haber dispensado el aceite en las
plantas que correspondía. El inoculo consistió en 1 ml de una suspensión de conidias que
oscilaba entre 104 y 106 conidias / ml, contadas con hematocitómetro que se transfirieron al
medio de cultivo donde se desarrollaba planta con una jeringuilla hipodérmica.
El ensayo se mantuvo durante 2 meses en condiciones de laboratorio a aproximadamente
25ºC y 280 lux de intensidad lumínica con un fotoperiodo de 16 h/día de luz fluorescente
blanca con 4 tubos situados a 16 cm de distancia. Al final del ensayo se sembraron
fragmentos de las raíces, rizoma y pseudotallo de las plantas inoculadas para comprobar
que se reaislaban de ellas los inóculos. Estos fragmentos vegetales se desinfectaron
superficialmente con una solución de lejía comercial al 0,5% durante 1 minuto, alcohol
70% durante 30 seg., lavado con agua destilada estéril y secado en la campana de flujo
laminar durante media hora antes de sembrarlos en medio de cultivo PDA y Komada.
También se comprobó que el inoculo de los tratamientos con aceite mineral continuara
vivo al final del ensayo realizando una siembra en PDA a partir de una picadura con un asa
de Köller realizada directamente en el aceite mineral.
3.2.3. Ensayo 2 en bote convencional empleado para cultivo in vitro:
Dado que en el ensayo preliminar se observó que las especies fúngicas se desarrollaban
muy rápidamente sobre el medio de cultivo, y posiblemente competían con la planta por
los nutrientes, se introdujeron cambios en la composición que básicamente consistieron en
la eliminación de las hormonas que lleva el medio de cultivo de enraizamiento. En el
Anexo3 se describe la composición del medio de cultivo utilizado
Básicamente, la metodología del ensayo fue la misma que en el ensayo preliminar, solo
que en este caso se abarcó un mayor número de aislados con 5 repeticiones por tratamiento
y se introdujo la variable temperatura, acondicionando dos cámaras con este objetivo, una
con una bomba de refrigeración que mantenía la temperatura constante entre 15 y 17ºC y la
otra con temperaturas entre 26 y 28ºC, las dos con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 de
oscuridad y una intensidad lumínica de 150 µE m2/s (280 lux) procedentes de tubos
fluorescentes de luz blanca. Los especies fúngicas elegidas para la inoculación fueron: F.
oxysporum, F. subglutinans, F. proliferatum y F. solani, incluyéndose 5 repeticiones por
inoculo en condiciones normales y 5 por inoculo en condiciones de hipóxia. Los controles
consistieron en 5 plantas sin tratamiento alguno y 5 plantas con el aceite mineral, en la
superficie del medio. También se introdujo la inoculación con todos los aislados a la vez y
Material y Métodos
68
con Trichoderma sp. y con un hongo sin determinar aislados de plantas con síntomas de
FMP.
3.3. Pruebas de patogenicidad en invernadero
A la hora de plantear pruebas de patogenicidad tanto para hongos como para bacterias, nos
hemos basado en referencias de la fitopatología clásica, en las que se utilizan inóculos con
concentraciones muy elevadas de células respecto a lo que se espera encontrar en
poblaciones naturales, utilizando plantas en condiciones controladas de invernadero que
suelen durar entre 3 y 6 meses.
La escala de evaluación de los síntoma internos se ha basado en la recomendada por el
INBAP en (Orjeda, 1998).
Las plantas se regaron siguiendo las recomendaciones semanales realizadas a los
agricultores facilitadas por el Departamento de Suelos y Riegos del ICIA. En las plantas no
adultas, se aplicaba un factor de corrección que se calculaba en relación con el área foliar
de las plantas (Suárez, 1994).
3.3.1. Ensayo de patogenicidad en invernadero a 25-30ºC y encharcamiento del
suelo
Se realizó en condiciones controladas de invernadero utilizando tierra procedente de una
plantación donde se dio el problema con gran incidencia, la cual se esterilizó al vapor. Se
trabajó con plántulas de cultivo in vitro del cultivar �Gruesa�. Los inóculos fueron líneas
monospóricas de 28 aislados en total, 9 pertenecientes a la especie F. oxysporum, 7 a la
especie F.subglutinans, 6 a la especie F. proliferatum, 4 a la especie F. solani, 1
perteneciente al género Thichoderma sp., 1 de una especie sin determinar y un tratamiento
consistente en una mezcla de todos los inóculos juntos. También se introdujo un aislado de
FOC. Las plantas se inocularon con 50 ml de suspensiones de esporas del orden de 104 a
106 conidias/ml de cada especie fúngica. Se realizaron inoculaciones en condiciones
normales (25º C, 80%, riego normal) y después de haber sometido a las plantas a
encharcamiento permanente durante 2 semanas, con 8 repeticiones por tratamiento.
Mediante agujeros que se cerraban o no, se mantenía un nivel de encharcamiento
constante, creando situaciones de encharcamiento, cuyo tiempo de acción de 5 días
encharcado y 2 días de drenaje semanalmente. El abono soluble de composición N:P:K
(3:1:7) se aplicó mediante al riego por goteo a razón de 1 g/l, sin correcciones para el
Material y Métodos
69
calcio ni para microelementos. Se realizó un seguimiento de la evolución de pH y
conductividad eléctrica del agua de riego y del agua drenada en los tratamientos de
encharcamiento intermitente pero no se realizó ninguna corrección.
Variables estudiadas
Al final del ensayo, se estudió la aparición o no de síntomas y las variables normales de
crecimiento fenológico. Semanalmente se realizó una lectura de la altura y del diámetro del
pseudotallo y del número de hojas emitidas. Al final del ensayo se contó el número de
raíces en cada planta y se evaluaron los síntomas aéreos de amarilleo y �abrochamiento� o
acortamiento de entrenudos, así como los síntomas internos en rizoma mediante la escala
INIBAP. También se anotó la presencia/ausencia de nemátodos agalladores (Meloidogine
spp.) y lesionadores (Pratylenchus spp.). Se realizaron siembras de rizoma tanto de plantas
asintomáticas como de las que presentaban algunas necrosis en el interior del rizoma.
También se realizaron análisis foliares de los tratamientos control encharcados y no
encharcados, con la misma metodología que los descritos en el punto 1.3 de ésta sección.
3.3.2. Ensayo patogenicidad en invernadero a 15-28º C, encharcamiento del suelo y
simulación de daños mecánicos.
Se evaluó la capacidad patogénica de 28 aislados procedentes de plantas que presentaban
los síntomas asociados al FMP, 9 pertenecientes a la especie F. oxysporum, 7 a la especie
F.subglutinans, 6 a la especie F. proliferatum, 4 a la especie F. solani, 1 perteneciente al
género Thichoderma sp., 1 de una especie sin determinar y un tratamiento consistente en
una mezcla de todos los inóculos juntos. La prueba de patogenicidad se diseñó utilizando
plántulas de cultivo in vitro del cultivar �Gruesa�, considerando la interacción de estos
aislados fúngicos con el factor encharcamiento intermitente. Se utilizó un suelo procedente
de una plantación afectada de FMP, previamente desinfectado al vapor, rico en arcillas y
con tendencia a la compactación. El ensayo se mantuvo en una primera fase a 28º C y
posteriormente a 17º C. Fue fertilizado con un abono complejo N:P:K+Ca (14:7:14:14) y
microelementos. Además se realizó corrección del pH y CE del agua de riego. Las
inoculaciones se realizaron añadiendo 50 ml de una suspensión de esporas que contenía
entre 10 4 y 10 6 conidias/ml.
Por cada inoculo se realizaron los siguientes tratamientos: 8 plantas encharcadas mediante
la inmersión de las macetas en cubos perforados a 20 cm del suelo para mantener el nivel
Material y Métodos
70
constante y 8 plantas con drenaje. A mitad del ensayo se realizaron cortes en las raíces a 4
de las 8 plantas de cada tratamiento.
Variables estudiadas
Las variables fenológicas estudiadas fueron: presencia/ausencia de necrosis en rizoma, y
seguimiento de la evolución semanal del pH y CE en las plantas con tratamiento de
encharcamiento. La duración del ensayo fue de 6 meses y vino condicionada por la
aparición de síntomas en plantas inoculadas con aislados de referencia pertenecientes a la
especie FOC. Al final del ensayo se realizaron siembras del material vegetal que
presentaba algún tipo de necrosis en rizoma, en PDA y K, así como la recuperación del
inoculo de cada maceta presente en el suelo, mediante la técnica de dilución y siembra en
placa empleando los mismos medios de cultivo.
Se evaluaron los síntomas internos en rizoma mediante la escala INIBAP, y se realizaron
análisis foliares de los tratamientos control encharcado y control no encharcado mediante
las técnicas descritas en el apartado 1.3 de ésta sección.
4. INTERACCIONES DE FACTORES ABIÓTICOS Y BIÓTICOS
4.1. Ensayos preliminares con suelos de plantaciones afectadas de Falso Mal de
Panamá (FMP).
El objetivo de estos ensayos fue estudiar si las condiciones físico-químicas y/o
microbiológicas del suelo podían inducir síntomas de FMP en plántulas de platanera
4.1.1. Ensayo con suelos de plantaciones del norte de la isla de Tenerife
Se eligieron suelos de 3 plantaciones comerciales de la zona productora de la vertiente
norte de la isla de Tenerife, que presentaban el problema con alta incidencia. El ensayo se
realizó bajo condiciones controladas de invernadero, con plantas procedentes de cultivo in
vitro del cultivar �Gran enana�. La mitad de cada suelo se esterilizó al vapor, tres veces
consecutivas dejándolos enfriar durante 24 h entre cada tratamiento. El suelo, una vez
esterilizado, se distribuyó en macetas de 1.5 l de capacidad, del mismo modo que se
distribuyó la otra mitad sin esterilizar. El control consistió en un sustrato turba :picón -
lapilli volcánico- (70:30), la mitad del cual fue esterilizado al vapor y la otra mitad no. El
ensayo fue de tipo factorial incompleto con 3 suelos, 3 muestras por suelo, 2 tratamientos
Material y Métodos
71
del suelo: esterilizado y no esterilizado y 7 repeticiones (plantas) por combinación de
factores.
Las plantas se dispusieron en grupos de filas y columnas. Los grupos de 7 macetas con un
mismo tratamiento, se colocaron al azar dentro de las columnas, que se orientaron
perpendicularmente al gradiente de insolación del invernadero.
Se regaba a mano diariamente con 150 ml de un abono soluble N:P:K (3:1:7) sin
corrección para calcio ni micronutrientes, a la dosis de 1 g/l. El pH y la conductividad
eléctrica se midieron una vez por semana en el agua de riego, pero no se realizó ninguna
corrección. El ensayo se mantuvo durante 3 meses. Las plantaciones de donde fueron
tomados los suelos, los tratamientos y los códigos empleados se describen a continuación:
Finca Zamora (Z), Finca Carmelo Villa (C), Finca Economista (E). La codificación
consistió en las iniciales de las plantaciones, seguidas por el número de la muestra (1-3);
esterilizado o no (S, N); número de repeticiones (1-7).
4.1.2. Ensayo con suelos de plantaciones del sur de la isla de Tenerife
Se utilizó la misma metodología que para el ensayo anterior, esta vez con suelos de 3
plantaciones de la zona productora de la vertiente sur, dos que presentaban problemas de
falso mal de panamá y una con problemas de Mal de Panamá que se introdujo como
control. El ensayo se realizó en el mismo invernadero que el anterior con condiciones de
temperatura y humedad controladas. La duración del ensayo fue de 4 meses, cuando se
había producido la expresión de síntomas en las plantas cuyo suelo contenía inoculo
natural de F. oxysporum f. sp. cubense (FOC).
Las fincas muestreadas fueron:
Finca Justino Martín Rocha (J), Finca José Carmelo Rodríguez San Blas (JC), Finca Juan
Floreal -Mal de Panamá- (F). La codificación consistió en las iniciales de las fincas,
seguidas por número de muestras del suelo (1-3); esterilizado o no (S, N); número de
repeticiones: (1-7).
4.1.3. Variables estudiadas en los dos ensayos
Se realizó una lectura semanal de la altura y del diámetro del pseudotallo así como de la
emisión de hojas. Al final del ensayo se evaluó la severidad de síntomas en el interior del
rizoma y de síntomas externos, incluido los no típicos del FMP, utilizando una adaptación
de la escala INIBAP empleada en la valoración de síntomas de Mal de Panamá. Esta es una
Material y Métodos
72
escala 1-3 para los síntomas aéreos: siendo 1 ausencia de amarilleo en hojas y 3 todas las
hojas amarillas. Para la severidad de síntomas en rizoma se utilizó una escala 1-6, siendo 1
la ausencia de decoloraciones en el rizoma y 6 todo el rizoma decolorado.
También se estudió la presencia/ausencia de nemátodos y las variables peso fresco y seco
de la parte aérea, y peso fresco y seco de la raíz. De las plantas que presentaban alguna
anomalía respecto el control, tales como necrosis radicales y/o oscurecimientos en la estela
del rizoma, se tomaron muestras y se realizaron aislamientos.
4.1.4. Siembras de muestras de material vegetal de plantas muestreadas en las
plantaciones afectadas de las vertientes Norte y Sur. Aislamientos de
microorganismos asociados.
Antes de montar el ensayo se muestrearon plantas con síntomas en estas plantaciones. El
material vegetal objeto de estudio fueron fragmentos de rizoma, de pseudotallo y de raíz.
Una vez seleccionado, fue esterilizado superficialmente con una dilución de lejía comercial
al 0,1 %, seguida de una inmersión en alcohol al 70 % y aclarado con agua destilada
estéril. Las siembras se realizaron en medios de cultivo PDA y Komada. Se aislaron y
purificaron las colonias fúngicas y bacterianas en función de la morfología de las colonias.
Después del ensayo se sembraron fragmentos vegetales de rizoma correspondientes a
plantas que presentaban alguna anomalía respecto el control, tales como necrosis radicales
y/o oscurecimientos en la estela del rizoma.
4.1.5. Análisis físico-químicos de muestras foliares y de suelos tanto de vertiente
Norte como de vertiente Sur.
Antes y después del ensayo se realizaron análisis físico-químicos de los suelos empleados
para la realización de las pruebas de patogenicidad. Las muestras de antes del ensayo
fueron alícuotas de las tres repeticiones de los suelos una vez esterilizados al vapor.
Después del ensayo se combinaron las tierras de las 7 repeticiones de cada tratamiento.
Antes del ensayo, se realizaron muestreos foliares de todas las plantaciones, siguiendo la
metodología internacional (Martin-Prèvel, 1984), en la que se utiliza la tercera hoja antes
de la última emitida. Después del ensayo también se analizaron muestras foliares conjuntas
de las repeticiones de cada uno de los tratamientos.
Todos estos análisis se realizaron en el Laboratorio de Suelos y Riegos bajo la supervisión
de Dña. Ana Rosa Socorro Monzón. La metodología empleada fue la protocolizada para
Material y Métodos
73
cada elemento: N, P, K, B, Zn, Ca, Na, Mg, Mn, y Fe en foliares; y pH, CE, Porcentaje de
saturación, CIC, Ca, Mg, Na, K, P, Nitritos, Nitratos y Materia orgánica (MO) en suelos.
4.2. Ensayo de cambio de la estructura física de un suelo de la vertiente norte de
Tenerife mediante la adición de “picón”(lapilli volcánico).
El objetivo de este ensayo fue estudiar si los cambios en la estructura física del suelo
repercutían en la inducción de síntomas de FMP.
La metodología seguida fue la misma que en los anteriores ensayos. Se recogieron tres
muestras de suelo de la plantación afectada, el cual ya había sido estudiado en los ensayos
de suelos del norte de Tenerife y fueron caracterizados como suelos con tendencia a la
compactación. Se realizaron una serie de mezclas del suelo con diferentes proporciones de
picón. Del mismo modo que en los anteriores ensayos, la mitad de los tratamientos fueron
esterilizados al vapor tres veces consecutivas en tres días y la otra mitad no. En este caso
los tratamientos fueron: Tierra natural (n) 100 %, repeticiones (n=1, 2, 3); Tierra (n) +
Picón 25%; Tierra (n) + Picón 50%; Tierra (n) + Picón 75% y Picón 100 %, cada una con 7
repeticiones, esterilizadas (S) y no esterilizadas (N). Las plantas utilizadas pertenecían al
cultivar �Gran Enana�. La distribución del ensayo se hizo al azar y se llevó a cabo en
condiciones controladas de invernadero durante 4 meses. La solución nutritiva y la
frecuencia de riego fueron idénticas que en los anteriores ensayos.
Variables estudiadas
Se realizó una lectura mensual de la altura y del diámetro del pseudotallo así como de la
emisión de hojas. Al final del ensayo se estudiaron las variables peso fresco y seco de la
parte aérea, peso fresco y seco de la raíz. Los síntomas externos y del interior del rizoma se
valoraron con una escala similar a la utilizada en la escala del INIBAP para la evaluación
del MP, descrita anteriormente.
Después del ensayo se sembraron fragmentos vegetales de rizoma correspondientes a
plantas que presentaban alguna anomalía respecto el control, tales como necrosis radicales
y/o oscurecimientos en la estela del rizoma. También se realizaron análisis físico-químicos
de los suelos empleados y análisis foliares de muestras conjuntas de las repeticiones de
cada uno de los tratamientos según la metodología descrita anteriormente.
Material y Métodos
74
4.3. Ensayo de diferentes tiempos de encharcamiento en sustrato turba: picón
(70:30) en macetas de 5 litros de capacidad.
Con el objetivo de estudiar el efecto del tiempo de encharcamiento y la hipoxia asociada
sobre la producción de síntomas de FMP, se diseñó un ensayo probando tiempos de
encharcamiento medidos en horas. Previamente se calculó la cantidad de agua necesaria
para la saturación del suelo a capacidad de campo y así calcular el riego diario para el
tratamiento control. El método empleado se describe en el punto 4.3.1.
Se probaron 5 tratamientos de encharcamientos: A: 2 horas diarias, B: 4 horas diarias, C: 6
h diarias y D: encharcamiento total. El control fue regado con el abono soluble utilizado en
los anteriores ensayos, con cantidades corregidas diariamente según el método de pesada
en saturación y pesada a las 24 h descrito en el apartado anterior.
Se utilizaron plantas de plataneras del cultivar �Gran Enana� cultivadas en macetas de 5
litros de capacidad, llenadas con 700 g de una mezcla tierra:picón (70:30) El ensayo se
distribuyó en cuadrado latino con 5 repeticiones por tratamiento en condiciones
controladas de invernadero. El procedimiento seguido para el encharcamiento consistió en
introducir las macetas en cubos (fig. 7). Los cubos tenían un agujero a 15 cm de la base
para mantener el nivel de agua en todas por igual, que correspondía a la mitad de la
maceta. El ensayo duró 3 meses. Fig. 7. Esquema del diseño empleado para producir encharcamiento sobre
las plataneras del cultivar �Gran Enana� cultivadas en macetas de
capacidad 5l.
Variables estudiadas
Se tomaban medidas semanales de la altura y del diámetro del pseudotallo, número de
hojas y se median la conductividad y el pH del agua drenada antes y después de rellenar
los cubos hasta el nivel establecido.
En el momento del desmonte se estudiaron los pesos frescos y secos a 60ºC de la parte
aérea y raíz, el número de raíces, y la presencia / ausencia de nemátodos. Se realizaron
análisis foliares y de suelos como en los anteriores ensayos.
suelo
agua
Material y Métodos
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4.3.1. Cálculos de la dosis de riego mediante la evapotranspiración y saturación del
sustrato.
Se utilizaron 20 macetas de 1,5 l de capacidad, con 700 g de un sustrato tierra: picón
(70:30).En primer lugar se calculó el contenido de humedad del suelo, con el método de
secado del suelo a 105 ºC, pesándolo antes y después utilizándose 5 repeticiones.
Posteriormente se calculó el consumo de agua debida a la evaporación sin la planta durante
una semana, utilizándose 20 macetas. El método consistió en la saturación del suelo al
100%, pesándolo a continuación, y volviéndolo a pesar transcurridas 24 horas. La
diferencia de peso era debida únicamente a la evaporación del agua
Por último se plantaron las plantas en las macetas, empleando el mismo procedimiento
(pesada en saturación 100%-pesada a las 24 h). La diferencia correspondía a la suma del
consumo de la planta más la evapotranspiración. Estas medidas fueron realizadas a lo largo
de 13 semanas diariamente.
4.4. Ensayo de encharcamiento en sustrato turba:picón (70:30) en contenedores de
50 litros de capacidad.
Se probaron cuatro tratamientos de encharcamiento, teniendo en cuenta la duración y la
intensidad de este: A: encharcamiento intermitente (5 días/ 2 días aireación) hasta la mitad
de la maceta (17,5 cm); B: encharcamiento permanente total (34 cm); D: encharcamiento
total (34 cm) 5 días/ 2 días aireación y C: control sin encharcar. Se utilizaron plantas del
cultivar �Gran Enana� de 4 meses de edad.
El ensayo se dispuso en cuadrado latino. El sustrato utilizado fue una mezcla de
turba:picón. El picón fue esterilizado al vapor, mientras que la turba no lo fue. La duración
del ensayo fue de 6 meses. El diseño de las macetas fue (fig.8):
Fig. 8. Esquema del diseño empleado para el tratamiento de encharcamiento intermitente y control del nivel
de agua, sobre plataneras del cultivar �Gran Enana� cultivadas en macetas de 50 l de capacidad.
Nivel de agua
grifo
Bolas de arcillas
Malla metálica
Material y Métodos
76
Variables estudiadas
Las variables estudiadas fueron las mismas que en los anteriores ensayos. Además, se
midió diariamente el oxigeno disuelto en agua, la conductividad y el pH.
El abonado fue el mismo que se había utilizado en los anteriores ensayos. El riego consistía
en mantener diariamente los niveles de agua establecidos como tratamientos. El control se
regaba con la media de la cantidad de agua añadida en el resto de tratamientos, que
correspondía al agua consumida por la planta mas la perdida por evapotranspiración. Al
final del ensayo se midió el área de la superficie foliar y mediante la escala INIBAP, se
valoraron los síntomas aéreos y en el interior del rizoma del mismo modo que se hace en el
Mal de Panamá.
Los análisis foliares se realizaron diferenciando en análisis de limbos, análisis de nervios y
análisis de peciolos. Los sustratos se analizaron como el resto de suelos, para los nutrientes
más importantes en la platanera.
4.5. Ensayo de simulación de encharcamiento y compactación del suelo
El objetivo del ensayo fue estudiar el efecto de la interacción encharcamiento y
compactación.
El diseño del ensayo fue de tipo factorial. Se realizó en un invernadero climatizado (28 ºC /
80% HR). Las plantas fueron abonadas con 1g/ l de abono complejo soluble 15:5:30 N:P:K
aplicado en el riego con una dosis de 600 cc/día. Los tratamientos fueron (Fig. 8): suelo
esterilizado/no esterilizado; suelo compactado/ no compactado; 4 días encharcado/ 3 días
no encharcado siempre intermitente. Para ello se diseñaron cubetas que contenían 2
repeticiones de cada compactación distribuidas en suelos esterilizados y no esterilizados.
El encharcamiento intermitente se consiguió usando cubetas provistas de grifo que podía
abrirse o cerrarse (fig.9).
Material y Métodos
77
Fig. 9. Esquema del diseño empleado para los diferentes tratamientos de encharcamiento, esterilización y
compactación del suelo sobre las plataneras cultivar �Gran Enana�.
Se utilizaron macetas de 1.7 l de capacidad, en las que siguiendo la metodología habitual
se consiguieron 2 valores de densidad aparente para simular la compactación:
*1500 g de suelo/ 1700 ml: r =0.88 g/ml
*1800 g de suelo/ 1700 ml: r= 1.06 g/ml
Estos valores son similares o ligeramente superiores a los normales de campo.
Para evaluar el efecto de la microflora presente en el suelo sobre la expresión de síntomas
del FMP, la mitad del suelo fue esterilizado al vapor y la otra mitad no.
Variables estudiadas
Antes del ensayo se realizó un recuento de flora total del suelo por el método de siembra a
partir de un banco de diluciones en PDA, medio Komada (Komada, 1975), selectivo para
Fusarium que permite la identificación de colonias de Fusarium oxysporum f.sp. cubense
(FOC) (Sun et al, 1978) y medio King B especifico para bacterias.
Se realizó un seguimiento semanal del comportamiento de las variables fenológicas de
crecimiento: altura, número de hojas emitidas y diámetro de la base del pseudotallo,
también se estudió la evolución del pH y de la conductividad del agua drenada. En la
lectura final se estudiaron las variables: Número total de raíces, severidad de síntomas
aéreos y en el interior del rizoma. Al finalizar el ensayo se realizaron aislamientos de
plantas con síntomas claros, dudosos y de plantas sanas.
Como en los anteriores ensayos, los suelos se analizaron los principales nutrientes, antes y
después del ensayo. Se realizaron análisis foliares como se describe en el primer ensayo,
mediante muestras combinadas de las repeticiones de cada tratamiento.
Suelo Esterilizado Suelo No Esterilizado
ρ= 1.06 ρ= 1.06ρ= 0.88 ρ= 0.88
Material y Métodos
78
4.6. Ensayo de compactación y dosis de riego en condiciones de campo.
El objetivo del ensayo fue estudiar el efecto de la compactación y de la dosis de riego en
condiciones de campo sobre la inducción de síntomas de FMP. Se realizó en una parcela
experimental de tamaño 1566 m2, perteneciente al ICIA situada en la localidad de Güimar
en la vertiente sureste de la isla de Tenerife.
La planificación de este ensayo fue compleja, pues se diseñó con restricciones a los
gradientes principales de la parcela experimental, principalmente en base a la insolación y
a los tratamientos de acondicionamiento que se realizaron en el suelo. La finca fue
subdividida en tres parcelas, dos de las cuales fueron lavadas para eliminar el depósito de
sales añadiéndose estiércol a razón de 5 Kg/m2. La parcela no lavada y otra que si lo fue,
fueron compactadas mediante una apisonadora. Dos semanas después se plantaron las
plantas de platanera del cultivar �Gran Enana�, la mitad procedentes de CULTESA (in
vitro) y la otra mitad de �cabezas� de plantas madre denominadas �aceleradas�. El riego se
aplicó mediante un sistema de riego por goteo consistente en aros provistos de 4 goteros
(2,5 l/h cada uno) por planta. El tratamiento de riego, fue aplicado con tres dosis diferentes,
calculadas a partir de las predicciones de riego semanales realizadas por el equipo de la
Dra. C.L. Suárez del Dpto. de Suelos y Riegos del ICIA: Normal (100%), intermedia (175
%), y superior (250 %). El ensayo se dispuso en bloques al azar con 3 bloques (parcelas), 3
dosis de riego por bloque y dos tipos de material vegetal de plantación dentro de cada dosis
de riego y bloque. Los riegos quedaron distribuidos con un diseño en cuadrado latino con 3
filas y 3 columnas de forma que todas las parcelas tuvieran todos los tratamientos.
Durante las etapas juveniles de la platanera, se aplicaron unos coeficientes de corrección a
la dosis de riego recomendada por el Dpto. de Suelos y Riegos del ICIA para aquella zona,
basados en la relación del área de sombreado de las plantas respecto al marco de
plantación. Este procedimiento se realizó hasta que el coeficiente fue 1,0 que es el
momento en que la planta puede considerarse adulta. El abonado se aplicó mediante el
riego y se ajustaba a de acuerdo con el plan de abonado que se presenta en el anexo 4,
calculado semanalmente para cada tratamiento (100, 175 y 250 %) de riego ajustado al
asesoramiento de riego semanal realizado por el Dpto. de Suelos y Riegos a los
agricultores. Las plantas borde se regaban y abonaban de la misma forma que la dosis 100
% de riego.
Material y Métodos
79
Variables estudiadas
Antes del ensayo se realizaron muestreos de suelos para análisis físico-químicos y
microbiológicos. Se instalaron 18 sensores TDR (Time resonance difference) -2 por
bloque-, en los que se tomaban lecturas semanalmente a los 15 minutos aproximadamente
después del riego. A mitad del ciclo, se pusieron sensores ECHO 10 y ECHO 20 -
medidores de agua volumétrica en suelo- los cuales recogían medidas continuas cada 5
minutos. Semanalmente se realizaba una lectura de número de hojas emitidas, altura y
diámetro basal del pseudotallo. Estas mediciones se continuaron hasta el momento de
floración de la planta. Se realizaron muestreos foliares según la norma internacional basada
en la tercera hoja antes de la floración, así como recogida de muestras del suelo alteradas y
no alteradas para los análisis físico-químicos y microbiológicos. La producción fue
evaluada mediante las variables peso de la �piña� (racimo), número de manos y número de
dedos.
Cuando la �piña� ya había sido cortada, también se cortaba a la planta madre, para la
evaluación de los síntomas internos. Se tomaban muestras de rizoma para el aislamiento de
los microorganismos asociados mediante la desinfección superficial y siembra de los
fragmentos vegetales en PDA y Komada. En estos momentos el segundo ciclo continúa a
partir de los hijos emitidos por las plantas madre ya cortadas.
Material y Métodos
80
5. ESTUDIOS HISTOQUÍMICOS
Los estudios histoquímicos que se presentan han sido realizados en el CIFA de Churriana
(Málaga) bajo la supervisión de la Dra. Araceli Barceló Muñoz.
5.1. Material vegetal
Los cortes en fresco se realizaron a partir de muestras procedentes de dos plantas sanas,
dos con síntomas de encharcamiento pero sin los síntomas clásicos de FMP y dos con
síntomas de FMP. De cada planta se eligieron muestras de rizoma, pseudotallo y raíces.
Las características de cada planta se detallan en el punto 3.1 del anexo.
El material vegetal utilizado para el estudio de las muestras incluidas en parafina consistió
en tres plantas procedentes de una plantación comercial afectada por Falso Mal de Panamá,
una planta con sintomatología característica de Mal de Panamá, una planta afectada por
picudo y dos plantas sanas. En el momento del muestreo se dispuso de un banco de tubos
con fijador F:A:A, para inmediatamente después del corte, introducir la muestra en la
solución fijadora y así evitar en lo posible reacciones de oxidación que se dan en contacto
con el aire y que pudieran alterar las posteriores observaciones microscópicas.
De cada una de plantas se tomaron tres muestras de rizoma, tres de pseudotallo y tres de
raíces (Anexo 3.2). Se eligieron algunas de las técnicas histoquímicas más comunes que se
describen a continuación.
5.2. Cortes en fresco
Los cortes en fresco se realizaron a mano, en muestras sin fijación previa, con una cuchilla
de afeitar y tras depositarlos en un portaobjetos, se tiñeron para su observación inmediata
(Barceló Muñoz, 1995; Clark, 1993). La observación de los cortes se realizó con un
microscopio óptico de fluorescencia Laborlux 12 de Leitz. Las fotografías fueron tomadas
con un sistema microfotográfico WILD MPS 45 Photoatomat.
5.2.1. Tinción de cutina (Heslop-Harrison, 1977)
La cutina se tiñó aplicando una gota de Auramina O (0,01% en tampón fosfato 0,05 M)
(Sheldon y Dickinson, 1983) sobre los cortes realizados en fresco y se colocó el cubre. La
cutina y otros lípidos que contienen ceras ácidas insaturadas, muestran fluorescencia de
Material y Métodos
81
color amarillo verdoso cuando incide sobre ella un haz de luz ultravioleta. Esta reacción es
inmediata y pierde intensidad rápidamente.
La observación de los cortes se realizó con un microscopio óptico de fluorescencia
Laborlux 12 de Leitz. Las fotografías fueron tomadas con un sistema microfotográfico
WILD MPS 45 Photoatomat (Barceló Muñoz, 1995).
5.2.2. Tinción de celulosa (Heslop-Harrison y Heslop-Harrison, 1981)
La tinción de celulosa se realizó aplicando una gota de calcofluor (0,07 % en agua
destilada) sobre los cortes en fresco. El calcofluor tiñe selectivamente la celulosa que al
incidir sobre ella un haz de luz ultravioleta, muestra fluorescencia de color azul.
Las observaciones microscópicas se realizaron en las mismas condiciones que en la tinción
con Auramina O.
5.2.3. Tinción de lignina (Marín, 1986)
Se realizó con Floroglucina clorhídrica, preparada de la siguiente forma :
Floroglucina 0,1 g
HCl 8 ml
Alcohol absoluto 8 ml
La lignina se tiñe de forma temporal color rojo cereza. Las preparaciones se observaron al
microscopio óptico.
5.2.4. Tinción con azul de Tripán (Phillips y Hayman, 1970)
Esta tinción se utiliza como técnica habitual para la cuantificación de número de
propágulos formadores de endomicorrizas arbusculares que han conseguido infectar una
raíz, ya que permite detectar la presencia de micelio en el interior de las raíces. Antes de la tinción, las raíces se colocaron en KOH al 10% y se dejaron a temperatura
ambiente toda la noche. Se eliminó el KOH; se lavaron las raíces con agua corriente; se
añadió HCl 0,1 N durante 2 ó 3 minutos; se eliminó el HCl; se añadió azul Tripán (0.05%
en ácido láctico) durante 10 minutos a 90ºC y se eliminó el colorante. Las raíces se
conservaron en glicerol ácido (500 ml de glicerina; 450 ml de ácido láctico; 50 ml de HCl
1%) hasta su observación en el microscopio.
Material y Métodos
82
5.3. Cortes de material vegetal incluido en parafina.
5.3.1. Fijación, deshidratación e inclusión en parafina
Se tomaron las muestras de rizoma, pseudotallo y raíces, e inmediatamente se cortaron,
sumergidas en fijador, en porciones de 2 cm x 1 cm aproximadamente. Las muestras se
fijaban un mínimo de 24 h en una solución de F:A:A (Formalina: ácido acético
glacial:alcohol etílico 70%) en proporción 5:5:90 (v/v/v).
Una vez fijadas todas las muestras, se procedió a su deshidratación mediante baños de
alcohol butílico terciario (TBA) de gradiente creciente, según el protocolo que se describe
en el anexo 3.3. Las mezclas de TDA se muestran en la tabla 3.4 del anexo.
Tras la deshidratación, la inclusión en parafina se realizó mediante baños sucesivos en
gradiente creciente de parafina, según el protocolo que se describe en el anexo 3.5.
5.3.2. Obtención de cortes en parafina y desparafinado
Antes de realizar los cortes en el microtomo de deslizamiento Leitz, los bloque de parafina
se tallaron a mano, de forma que en el extremo por donde se comienza a cortar quede una
pirámide con el vértice completamente plano tal como se muestra en la figura 10 siguiente:
Fig. 10. Esquema de la talla del bloque de parafina en función de la orientación de la muestra insertada para
su posterior corte en el microtomo. Disposición de los cortes sobre el portaobjetos.
Tras el tallado, los bloques se cortaron en secciones de 10 µm, en sentido longitudinal y
transversal al eje de las muestras. Los cortes se depositaron sobre unas gotas de agua
formalada al 3% [Formalina 3% (Formol 40%) en agua] en portaobjetos ( fig. 9) a los que
previamente se les había extendido una capa de adhesivo Haup [gelatina 1% (p/v), fenol
2% y glicerina 15% (v/v)] y secaron sobre una placa calefactora a 36ºC durante unas horas.
La eliminación de la parafina se realizó mediante tres baños sucesivos de 2 minutos en
xileno, un baño de 2 minutos en la mezcla xileno:alcohol (1:1) y una serie decreciente de
alcoholes al 100, 70 y 40 %, cada uno de 2 minutos, para su hidratación, terminando en un
baño de agua destilada para si a continuación se realiza una tinción con un colorante
disuelto en agua o terminando en alcohol al 40% si la tinción se va a realizar con un
Material y Métodos
83
colorante disuelto en alcohol. Después de cada tinción se montan las preparaciones de una
forma permanente con una resina sintética DPX (Marín, 1986).
5.3.3. Tinción de actividad celular (Gerlach, 1969)
La tinción de Gerlach es una técnica en la que se utilizan tres colorantes, la safranina, el
cristal violeta y el verde luz simultáneamente, lo que permite teñir de forma diferencial
distintas estructuras en los tejidos observados. Los nucleolos y la pared celular lignificada
se tiñen de rojo, los citoplasmas y la celulosa de las paredes celulares aparecen en verde.
Los gránulos de almidón se observan de color violeta. El proceso de tinción fue el
siguiente:
Después del baño de desparafinado en alcohol al 40 %, los cortes se sumergieron durante 1
hora en safranina al 3 % disuelta en etanol al 50 %; a continuación tras lavar
abundantemente con agua destilada se sumergieron durante 90 segundos en una solución
de cristal violeta al 1 % en agua; después de lavar los cortes nuevamente con agua
destilada, se sumergieron varias veces en etanol al 90% seguido de una inmersión de 1-3
segundos en Verde luz al 0,25 % en etanol al 90 %. Se completó la deshidratación con
isopropanol anhidro 98-99 % durante 2 minutos 2 veces, se aclararon durante 2 minutos 2
veces con xilol al 100% y se montaron con DPX.
5.3.4. Tinción con Azul de Toluidina (Gahan, 1984)
El azul de toluidina permite diferenciar distintos componentes de los tejidos, debido a que
presenta metacromasia, tiñe con distintos colores dependiendo de los grupos ácidos que
contenga una sustancia, variando el color de azul-verde para sustancias como la lignina,
suberina y algunos taninos, a tonalidades rojo-púrpura para sustancias como la celulosa. El
almidón no se tiñe. El citoplasma y el ARN de color púrpura y el ADN en azul o azul-
verde.
La tinción se realizó individualmente en cada portaobjetos, siguiendo el protocolo
siguiente después del ultimo baño en agua destilada del protocolo de desparafinado:
Se aplicó una gota de azul de toluidina al 0,5 % en agua destilada, sobre la muestra
dejando el porta sobre la placa calefactora a 60ºC durante 30 segundos y se realizó un
lavado con agua destilada dejándolo secar en la placa calefactora y se montó en DPX.
Material y Métodos
84
5.3.5. Tinción de hidratos de carbono insolubles
El almidón y otros hidratos de carbono insolubles se tiñeron mediante la técnica del PAS.
Los polisacáridos y paredes celulares se tiñen de color rojo muy intenso (Jensen, 1962).
El protocolo para la tinción de PAS se inició en el último paso del desparafinado con un
baño de agua destilada durante 2 minutos y se continuó con el siguiente protocolo:
Las muestras se sumergieron en ácido periódico al 0,5 % en agua destilada durante 2 horas.
Se realizaron tres baños consecutivos en agua destilada durante 10 minutos en total y se
sumergieron en el reactivo de Schiffs en oscuridad durante 45 minutos. De nuevo, se
volvieron a lavar las muestras mediante tres baños consecutivos en agua destilada durante
10 minutos en total y se sumergieron durante 2 minutos cada uno en una serie creciente de
alcohol al 40, 70 y 90 %. Finalmente se realizaron tres inmersiones de las muestras de 2
minutos cada una, en las mezclas Xileno:Etanol (1:1), Xileno I (100%) y Xileno II (100%).
Finalizado el protocolo los portas se montaron en DPX.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y Discusión
86
1. INCIDENCIA, DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y DESCRIPCIÓN DEL “FALSO MAL DE
PANAMÁ” EN CANARIAS.
1.1. Incidencia y datos climáticos precedentes
La mayoría de las plantaciones que se muestrearon durante los años 1999-2002, presentaron
problemas de FMP, a partir de marzo, después de 6-8 meses de haber sido transplantadas a
campo, aunque llegaron muestras al laboratorio durante el resto del año. En el momento de
inicio del trabajo, cabe destacar los datos de temperatura de los meses enero, febrero y marzo
del 99 con respecto a los años anteriores (Fig.11, 12, 13): en los tres son menores las medias
de las máximas y de las mínimas, tanto al aire libre como en invernadero en la localidad de
Las Galletas, en el sur y en Buenavista del norte de la isla de Tenerife.
Buena Vista, aire libre
0102030405060708090
100
ene.9
8
mar.98
may.98
jul.98
sep.9
8
nov.9
8
ene.9
9
mar.99
0102030405060708090100
temperatura max temperatura mínima
Humedad relativa max Humedad relativa mínima
Fig.11. Mapa de Tenerife,representando las diferentes zonasclimáticas y los municipios másimportantes.
Fig.10. Datos meteorológicos de la zonaproductora de Buenavista al aire libre,situada en la vertiente noreste de la islade Tenerife (enero 98-abril 99).
Resultados y Discusión
87
Fig.13. Datos meteorológicos de la zonaproductora de Las Galletas, bajoinvernadero, situado en la vertiente sur-oeste de la isla de Tenerife (octubre 96-marzo 99).
Fig.12. Datos meteorológicos de lazona productora de Las Galletas,al aire libre (octubre 96-marzo99).
Datos meteorológicos facilitados por el servicio de meteorología del Cabildo de Tenerife. Los datos representados están basados en las medias mínimas extremas mensuales de temperatura ºC y Humedad relativa (HR %).
La isla de Tenerife tiene una superficie total de 2034,21 km2. Puede dividirse en seis zonas por
su paisaje, su clima y la situación geográfica (colores en la Fig 10). El Norte de la isla se ve
muy influenciado por los vientos alisios, los cuales aportan humedad que permite un paisaje
verde y el mantenimiento del bosque de la Laurisilva en el macizo de Anaga. El Sur es más
seco y cálido, con vegetación adaptada al clima semi-árido (Fig. 10). Las plantaciones
muestreadas las hemos agrupado en tres grandes zonas de la isla de Tenerife: Zona (NO-N)
desde los municipios de Buenavista del Norte a La Orotava, estación meteorológica situada en
el Botánico del Puerto de la Cruz, donde la temperatura mínima registrada fue de 9º C en
enero del 1999, Zona (SO-S) desde Santiago del Teide a Arona, estación meteorológica
situada en Cueva del Polvo (Guía de Isora), donde la mínima registrada fue de 9,9º C en enero
del 1999 y Zona (SE-S) desde Güímar a San Miguel, estación meteorológica situada en
Las Galletas, Invernadero
0
20
40
60
80
100
oct.9
6
ene.9
7ab
r.97
jul.97
oct.9
7
ene.9
8ab
r.98
jul.98
oct.9
8
ene.9
9
0
20
40
60
80
100
temperatura max temperatura mínima
Humedad relativa max Humedad relativa mínima
Las Galletas, aire libre
0
20
40
60
80
100
oct.9
6
ene.9
7ab
r.97
jul.97
oct.9
7
ene.9
8ab
r.98
jul.98
oct.9
8
ene.9
9
0
20
40
60
80
100
temperatura max temperatura mínima
Humedad relativa max Humedad relativa mínima
Resultados y Discusión
88
Güímar donde se registró la temperatura mínima de 10º C en enero del 1999 y de 9,5º C en los
meses de febrero y marzo.
Puede observarse que en los inviernos de 1999 a 2002 se registraron temperaturas medias
mínimas extremas más bajas de lo normal respecto a los años anteriores en las tres zonas
representadas. En Las Galletas, bajo invernadero (fig. 11) se registraron 11,2º C y al aire libre
(fig.12) 11,1º C en el mes de febrero de 1999; en Buenavista del Norte en cultivo al aire libre
(fig.13) se registraron 13,3º C en enero de 1999, que se corresponden a los meses donde se
recibieron y muestrearon el 80 % de las plantaciones que presentaban los síntomas clásicos de
FMP y asociados a bajas temperaturas (Cabrera Cabrera et al., 1997; Champion, 1968; Galan
Sauco, 1992; Ganry, 1973; Green, 1969; Soto, 1985), como acortamiento de entrenudos,
amarilleos foliares y parada del desarrollo de la planta con obstrucción foliar en muchos casos
descritos en los primeros trabajos de Hernández y Sabadell (2000) y Sabadell González y
Hernández (1999). Las condiciones subtropicales que se dan en Canarias son similares a las de
Sudáfrica donde Deacon et al. (1985) realizaron los estudios sobre el FMP.
Deacon et al. (1985), propusieron la hipótesis de que el FMP es un problema relacionado con
factores de estrés en primer lugar y que secundariamente Fusarium o otros microorganismos
relacionados, tengan un papel secundario en la expresión de los síntomas de FMP. Observó
que el FMP se producía en el primer o segundo año de haber plantado en lugares que antes
estaban dedicados a otros cultivos tales como aguacate, mango o patatas, antes de plantar con
plataneras, en suelos arcillosos. Lahav et al. (2000) citando a Reinking (1926), también asoció
el problema con suelos arcillosos y con problemas de drenaje, extremas fluctuaciones de la
zona saturada de agua, aunque el encharcamiento no era la causa. Dada la similitud de
síntomas con la deficiencias en potasio, propuso la idea de que este elemento estuviera
implicado, ya que bajo situaciones de hipoxia y elevado CO2, se impide la absorción de
potasio.
Nuestras observaciones de campo sugieren que en las condiciones de Canarias el FMP podría
estar asociado, entre otros factores abióticos, a las bajas temperaturas. La expresión de los
síntomas asociados al FMP se produjo mayoritariamente en las épocas en las que se detectaron
medias mínimas más bajas de los últimos años.
Resultados y Discusión
89
1.2. Distribución geográfica de las plantaciones muestreadas
En la tabla 5 se presentan las zonas de producción, plantaciones estudiadas y las muestras
recibidas y procesadas en el laboratorio, con la incidencia de FMP asociada, durante el periodo
comprendido entre el 1999 hasta el 2002.
Tabla.5. Incidencia del “Falso Mal de Panamá” (FMP) en diferentes áreas de producción en Las Islas Canarias.
Zonas de producción Nº de plantaciones Nº de muestras Incidencia (%) Norte Tenerife 27 90 41,78 Sur Tenerife 23 60 42,22 La Palma 10 17 30,00 Otros 3 5 30,00 Incidencia media 63 172 36,00
La incidencia expresada en % se refiere al número de plantas afectadas respecto al número de plantas total en cada plantación. Los valores de la tabla se refieren a la media del número de plantaciones afectadas en cada zona productora de la isla de Tenerife y de otras islas en menor número.
El FMP se ha detectado en todas las zonas productoras de plátanos, independientemente de la
localización o de si el cultivo era bajo invernadero o al aire libre, aunque la mayoría de las
plantaciones donde se detectó eran nuevas y el material de plantación procedía de cultivo in
vitro del cultivar ‘Gran Enana’ o de selecciones locales de ‘Pequeña Enana’, por lo que se
desconoce la influencia del tipo de material de plantación o del cultivar en la expresión del
desorden.
La mayor incidencia se ha dado en cultivos al aire libre del norte de la isla de Tenerife,
generalmente en plantaciones que se encontraban a unos 150 m de altitud sobre el nivel del
mar, posiblemente debido a que en estas zonas las diferencias térmicas entre el día y la noche
eran más grandes, datos que de nuevo sugieren la relación de la expresión de los síntomas de
FMP con las bajas temperaturas ambientales.
La mayoría de las plantaciones muestreadas en el norte de Tenerife al inicio del trabajo, 12
eran nuevas. Se trataba de antiguas plantaciones dedicadas a la patata y reconvertidas al
plátano en algunas ocasiones, y en otras se trataba de suelos que habían estado dedicados al
plátano pero que habían sido abandonadas durante los últimos 10 años y que en este momento
Resultados y Discusión
90
se querían volver a plantar posiblemente debido a las nuevas subvenciones estatales a los
productores de plátanos.
En el Sur de Tenerife las plantaciones muestreadas 6 al inicio del trabajo, no eran recientes, ya
estaban dedicadas al cultivo de la platanera pero habían sido resembradas ese año, y aunque la
mayoría eran bajo invernadero, estas presentaron el problema en el año más frío, el 1999, año
en el que se hicieron los muestreos en base al material vegetal vendido, mientras que en el
Norte fueron apareciendo plantaciones afectadas durante todo el tiempo de realización de este
trabajo.
Basándonos en las observaciones de campo, la mayoría de las plantaciones,
independientemente de la zona geográfica donde se encontraban, tenían en común evidencias
de suelos con elevado contenido arcilloso y mal drenaje. Estas observaciones se confirmaron
con los análisis de la estructura que se realizó para suelos procedentes de plantaciones con
problemas, utilizados para la realización de los ensayos que se presentan.
1.3. Descripción de la sintomatología de las plantas muestreadas asociada al Falso Mal
de Panamá.
En la mayoría de los casos, los síntomas aéreos se caracterizan porque las hojas totalmente
desarrolladas más nuevas presentaban amarilleos marginales (semejantes a la salinidad) y
zonas del interior de los limbos necrosadas. El “puro” o hoja aun no desenrollada, en muchos
casos presentaba zonas necrosadas y en ocasiones se podía encontrar colapsada. A veces,
cuando la planta estaba próxima a la parición de la “piña”, la inflorescencia quedaba colapsada
en el interior del pseudotallo, muchas veces resquebrajandolo para salir al exterior, y sin frutos
con calidad comercial. La altura de las plantas así como el desarrollo fenológico se
encontraban disminuidos respecto a las plantas sanas y el plano de emisión de las hojas se
encontraba alterado. Datos similares fueron descritos por Holder y Gumbs (1983) asociados a
daños por encharcamiento. Las plantas experimentaban un acortamiento de los entrenudos
presentando lo que localmente se conoce como “abrochamiento”. No se observaron síntomas
acusados de marchitamiento ni de amarilleo generalizado, síntomas característicos tanto por
deficiencia como por exceso de agua en el suelo, así como por exposición a bajas temperaturas
(Green, 1969; Soto, 1985).
Resultados y Discusión
91
Las raíces se encontraban muy deterioradas y muchas estaban muertas, presentando síntomas
característicos de haber estado bajo condiciones de encharcamiento y compactación de los
suelos tales como la separación de la corteza del anillo central, las puntas de los ápices
necrosadas, ausencia de pelos absorbentes y elevada ramificación de las raíces adventicias. El
suelo en la mayoría de los casos quedaba adherido a las raíces, mostrando clara evidencia de
estar en saturación hídrica y presentar elevado contenido en arcillas.
Los síntomas observados son muy similares a los descritos por Deacon (1985) y a los
asociados al Yellow Mat (Dunlap, 1923; Prescott, 1917) citados por Lahav et al.(1999). A su
vez estos síntomas también son característicos de factores climáticos- edáficos como las bajas
temperaturas y la estructura, compactación y condiciones hídricas del suelo, descritas por Soto
(1985).
Los síntomas en rizoma eran muy característicos. Cuando se hacia un corte paralelo al suelo,
se observaba un punteado disperso en el centro del rizoma que se era más intenso en el anillo
vascular. Los puntos de inserción de las raíces muertas en el rizoma parecían en algunos casos
ser el origen de estos oscurecimientos, pudiéndose seguir el avance de los oscurecimientos
vasculares hasta alguno de los puntos interiores. En las vainas, esta decoloración vascular en la
mayoría de los casos ascendía por el pseudotallo, llegando hasta 1 m del suelo en los casos
más avanzados. El oscurecimiento vascular avanzaba de forma discontinua presentando el
aspecto de un texto en “morse”, tal y como describieron Deacon et al. (1985), Sabadell
González y Hernández (1999) y recientemente en Brasil Cordeiro et al... (2001). En algunos
casos el tejido parenquimático que rodea el anillo vascular en rizoma adquiría inmediatamente
al corte una coloración grisacea muy intensa que recordaba la saturación hídrica, además del
normal oscurecimiento generalizado que se produce en plantas sanas debido a la oxidación de
los fenoles en contacto con el aire.
El conjunto de síntomas internos y externos característicos del desorden no ha podido ser
asociado a ningún agente causal aunque Deacon et al. (1985) y Lahav et al.(1999) han
sugerido varias hipótesis descritas en la revisión bibliográfica, entre ellas las de interacción de
factores abióticos con algún tipo de agente biótico.
Resultados y Discusión
92
1.4. Diferencias y similitudes entre el Mal de Panamá (MP) y el Falso Mal de Panamá
(FMP).
Las observaciones de campo y las muestras de laboratorio de plantas afectadas de “Mal de
Panamá” y de “Falso Mal de Panamá” nos han permitido establecer las siguientes diferencias,
recogidas en Zaag de Beer (2001).
El FMP, no suele producir muerte de plantas a corto plazo, aunque sí reduce notablemente la
cosecha. El MP, si produce la muerte de la planta y también reduce la cosecha. En conjunto,
tanto los síntomas del interior del rizoma, como los externos (fig 14, fig.15) son similares a los
observados en el MP: amarilleos, necrosis marginal, y en ocasiones, colapso de la hoja cigarro
y decoloraciones de los haces vasculares en el interior del rizoma y a lo largo del pseudotallo,
aunque el patrón de distribución en la zona medular del rizoma es diferente pues las
decoloraciones se presentan como un punteado disperso, en lugar de estar asociadas
únicamente al anillo vascular como se observa en el MP (fig.16, fig. 17).
La continuidad de las decoloraciones en los haces del rizoma y a través del pseudotallo,
también es un elemento de diagnóstico diferencial, pues cuando se trata de MP existe una
continuidad de la decoloración del vaso dañado en función del avance del hongo. En el caso
del FMP, el oscurecimiento de los vasos es discontinuo.
Resultados y Discusión
93
Fig. 15. Síntomas externos de FMP
en platanera
Fig. 16. Síntomas internos de MP en
platanera
Fig. 17. Rizoma con síntomas de
FMP en platanera
Fig. 14. Síntomas externos de MP en
platanera
Resultados y Discusión
94
1.5. Resultados de los análisis foliares
En general no se pudo asociar la deficiencia de uno o varios elementos con los síntomas de
FMP. En algunos casos los niveles de calcio foliar eran bajos pero en general no suficientes
para la expresión en la planta de los síntomas clásicos de deficiencia, y este valor no se repetía
constantemente en las plantaciones muestreadas (fig.18). Por otro lado, debido a que el agua
de riego es alcalina, estos valores se dan normalmente en muchas plantaciones que no
presentan problemas. Los valores de referencia para las plataneras adultas de una correcta
nutrición se muestran en la tabla 1 de la revisión bibliográfica. A continuación se presentan los
valores foliares para plantaciones del norte de Tenerife (Figura 18)
Fig.18. Valores foliares de nutrientes en plantaciones del norte de Tenerife
Posiblemente los bajos valores de algunos elementos como el calcio registrados en los análisis
foliares, sean consecuencia de las bajas temperaturas registradas ya que estas pueden conducir
a una reducción de la absorción y disponibilidad de los nutrientes tal como describe Green
(1969), unido al efecto negativo de la estructura y características físico-químicas de los suelos
con elevado contenido en arcillas y elevado contenido de Na en el agua de riego en
plantaciones de platanera de Canarias (Suarez y Santana, 2002), asi como las condiciones de
encharcamiento y compactación que pueden conducir a bloqueos en la disponibilidad de
nutrientes Chellemi (2001), Forsythe (1975) y Jackson (1982) en descripciones de los
procesos fisico-quimicos que tienen lugar en los suelos bajo estas situaciones.
Valores de Na, Fe, Zn y Mn (ppm) en dos plantaciones del norte de Tenerife
0200400600800
100012001400
1 2
Plantaciones
ppm
NaFeZnMn
Valores foliares de N, P, K y Mg (ppm) en dos plantaciones del norte de
Tenerife
01000020000300004000050000
1 2
Plantaciones
ppm
NKCaMgP
Resultados y Discusión
95
1.6. Resultados de los análisis de suelos físico-químicos
Los análisis de suelos en algunas plantaciones afectadas, revelaron que en ciertos casos la
materia orgánica en suelo era baja (Tabla 6) aunque no existe un patrón constante en los casos
estudiados que pueda relacionarse directamente con el FMP.
Los valores del Punto de marchitamiento permanente (Pmp) relativamente altos, casi del 50%
en una de las plantaciones, son característicos de suelos con elevado contenido en materiales
orgánicos y materiales arcillosos, los cuales poseen gran cantidad de reservas hídricas en
forma higroscópica, es decir no utilizables por las plantas (Forsythe, 1975). En la tabla 6 se
muestran los resultados de análisis fisico-químico.
Tabla.6. Parámetros físico-químicos del suelo de muestras procedentes de tres plantaciones del sur de Tenerife.
Donde se muestrearon 9 puntos de cada plantación. MO : Materia Orgánica (%); P: Fósforo Olsen (ppm); pH: en pasta saturada; CE: mS/cm a 25ºC; Pmp: Punto de marchitamiento permanente (%); SD: Desviación estándar.
Los niveles de fósforo se encuentran dentro de un rango adecuado según diferentes autores
que han estudiado los suelos agrícolas dedicados a la platanera en Canarias y otros lugares del
mundo, como Lahav (1995) y Simmonds (1973). El pH no parece haber experimentado una
reducción drástica por el efecto del encharcamiento presente en la plantación 1, no obstante la
conductividad eléctrica (CE) fue elevada en las tres plantaciones, aunque es un dato que se
encuentra dentro del rango normal descrito para los suelos agrícolas canarios por Pérez
Mateos (1972), Rodriguez Pascual (1971), Dominguez (2000; 2001) y Álvarez (1999).
A continuación se presentan los valores de referencia (tabla 7) para diferentes texturas de
suelos (Forsythe, 1975) y los resultados de los análisis de texturas USDA (tabla 8) realizados
sobre 2 plantaciones del norte de Tenerife en el laboratorio de Suelos y Riegos del ICIA.
Var Plantación 1 SD Plantación 2 SD Plantación 3 SDMO 0.60 0.00 0.80 0.57 0.90 0.72P 36.00 11.31 32.00 28.28 84.00 42.14
pH 6.70 0.14 7.10 0.00 6.70 0.35CE 1.38 0.35 1.79 0.06 7.07 7.46
Pmp 48.50 2.12 43.00 1.41 43.67 11.93
Resultados y Discusión
96
Tabla.7. Valores de referencia para diferentes texturas de suelos de la Capacidad de campo (CC) y Punto de marchitamiento permanente (Pmp) (Forsythe, 1975)
Tabla.8. Análisis de la textura (USDA) de dos parcelas de la plantación comercial “El Cardón” del norte de Tenerife.
Capacidad de Campo (CC) corresponde al % agua a 1/3 bar y el Punto de marchitamiento permanente (Pmp) al % agua a 1/15 bar
En la tabla 9 se presentan los resultados de las curvas de Richards realizadas para los suelos de
las plantaciones P1 y P2 incluidas que en la tabla 8.
Tabla.9. Análisis fisicos de los suelos presentes en la parcela 1 (P1) y parcela 2 (P2) de la finca comercial “El Cardón”.
Capacidad de Campo (CC) corresponde al % agua a 1/3 bar y el Punto de marchitamiento permanente (Pmp) al % agua a 1/15 bar. El agua útil para la planta o (porcentaje) % agua disponible para la planta es el resultado de la diferencia de la CC menos la Pmp y se expresa como ml de agua / 100 g de suelo. Los datos están basados en 8 repeticiones por plantación
La plantación 1 tenia las plantas ya paridas con los frutos ya emitidos y estaban más afectadas
con síntomas muy claros en rizoma y la parte aérea. En la plantación 2, las plantas aun no
habían parido y presentaban síntomas iniciales en el rizoma pero no aéreos. La textura USDA
(tabla 8), franco-arcillosa (tabla 7) de estos suelos se corresponde a lo descrito para los suelos
Canarios por Pérez Mateos (1972) y por Rodriguez Pascual (1971). En la tabla 9 se observa
que los valores de densidad aparente de los suelos son elevados, y podrían indicar un grado de
compactación medio de los suelos de estas plantaciones. Esta compactación del suelo puede
impedir un buen drenaje y provocar situaciones de encharcamiento que favorezcan la
CC PMPArena gruesa 9 a 10% 2-5%Arena fina 15 a 20% 6%Limo arenoso 20-25% 8-10%Limo arcilloso 25-30% 13-15%Arcilla 30-40% 20%Humus más del 100% 50%
densidad aparente %agua a 1/3 bar %agua a 15 bar %agua disponible para la plantaP1enfermas 1,83 25,05 16,97 8,08
P1sanas 1,93 22,80 15,47 7,33P2enfermas 1,71 23,69 16,00 7,68
P2sanas 1,86 23,37 15,59 7,79
Arcilla Limo Arena Textura USDAP1 37,0 25,6 37,4 FRANCO-ARCILLOSAP2 28,8 27,3 44,0 FRANCO-ARCILLOSA
Parcela 1 (P1) y Parcela 2 (P2), donde el número de repeticiones por muestra fue de 8 por parcela de superficie media de 1000 m2.
Resultados y Discusión
97
Finca El Cardón
1,25
1,3
1,35
1,4
1,45
1,5
1,55
0,1 1 10 100
Log de presión de succión
cont
enid
o de
agu
a
P2enfermas P2sanas
aparición de zonas con bajo contenido de O2 en la rizosfera, cambios estructurales y la
presencia de heridas y necrosis en las raíces de las plantas como describen diferentes autores
como Trought y Drew (1980) en trigo, Dorel (1990, 1993) y Dorel y Ozier Lafontaine (1998)
en platanera.
Fig.19. Curva de Richard, para los suelos de
plantas enfermas y plantas sanas de la plantación 1 (P1) de la plantación “El Cardón”.
(P1) de la finca comercial “El Cardón”, valores basados en 4 repeticiones de cada muestra. El log de la presión de succión, se refiere a la diferencia de contenido de agua antes y después de aplicar una succión. Capacidad de Campo (CC) corresponde al porcentaje (%) agua a 1/3 bar y el Punto de marchitamiento permanente (Pmp) al porcentaje (%) agua a 1/15 bar. El agua útil para la planta o porcentaje (%) agua disponible para la planta es el resultado de la diferencia de la CC menos la Pmp y se expresa como ml de agua / 100 g de suelo. Los datos están basados en 8 repeticiones por plantación
Aunque el análisis USDA (tabla 8) caracteriza los suelos de estas dos plantaciones con textura
franco-arcillosa, según la capacidad de retención de agua útil para las plantas, se podrían
clasificar como suelos limo-arcillosos (tabla 7). Este tipo de suelo, se caracteriza por retener el
agua higroscópicamente (no útil para la planta) en un porcentaje elevado. En el caso de la
plarcela (1) la capacidad de campo (CC: 1/3 bar succión) se encontraba a un 25 % y el punto
de marchitamiento (Pmp: 1/15 bar succión) a un 15 % de contenido de agua en el suelo
(fig.19, tabla 9) Estos valores de contenido de agua pueden conducir a situaciones de hipoxia,
con el tiempo (Forsythe, 1975). Estos suelos poseen elevada capacidad de campo pero con un
volumen de agua higroscópica muy elevada, que da como resultado un nivel medio de reserva
útil (8 %) para las plantas (tabla 9). Aunque los valores para las plantas sanas y las enfermas
Resultados y Discusión
98
sean similares, es posible que estas características del Suelo y las derivadas de ellas, jugaran
un papel en la inducción de los síntomas.
1.7. Resultados de los análisis microbiológicos de suelos
A continuación se presentan los resultados de los análisis microbiológicos realizados en suelos
de plantaciones comerciales situadas en el norte y sur de Tenerife. Los suelos de estas
plantaciones han sido utilizados para la realización de los ensayos que se han realizado a lo
largo de este trabajo, y por tanto se consideran los análisis microbiológicos antes del ensayo.
La plantación Carmelo Villa ( C ) esta en el municipio de Buenavista del Norte de la isla de
Tenerife, y su suelo ha sido objeto de estudio en diferentes ensayos (suelos del norte, mejora
de la estructura del suelo, compactación y encharcamiento) debido a que presentaba signos de
diversos factores de estrés. La incidencia de FMP fue de un 40 % (tabla 5). En la tabla 10 se
presentan los resultados de los análisis microbiológicos.
Tabla.10. Valores medios de UFC/100 g de especies fúngicas, bacterianas en los medios PDA, Komada y King B, de suelos asociados a FMP, realizados sobre tres repeticiones de cada subparcela (C1, C2, C3) del suelo de la plantación comercial “Carmelo Villa” situada en el norte de Tenerife, municipio de Los Realejos.
Se sembraron mezclas de 4 muestras de suelo por punto de muestreo (C1, C2 y C3) y de cada una se realizaron 3 repeticiones en cada medio de cultivo, K, PDA y KB. Los datos se refieren a la dilución 10E-2 para hongos, que es donde aparecían un número superior a 30 colonias e inferior a 300. Para las bacterias se elegía la dilución 10E-3, donde se podían contar más de 3 colonias y menos de 300.
La Finca “El Cardón” (tabla 11) se encuentra en el término municipal de Buenavista en la
vertiente norte de Tenerife. Esta plantación fue elegida por presentar una parcela con elevado
grado de incidencia y otra sin problemas, situadas en las mismas condiciones y son las mismas
para las que se hicieron las curvas de Richards anteriormente mencionadas y los resultados
que se presentan son los análisis correspondientes al momento antes del ensayo. Se decidió
realizar análisis microbiológicos de los suelos con el objetivo de ver si existían diferencias en
muestra Hongos Bacterias Hongos Bacterias Hongos Bacteriasc1 1,22E+04 1,88E+02 1,19E+04 7,00E+01 7,33E+03 5,94E+05c2 3,17E+04 2,39E+03 2,96E+04 0,00E+00 1,22E+08 1,28E+10c3 2,19E+04 1,29E+03 2,08E+04 3,50E+01 6,11E+07 6,42E+09
cfu/g 6,68E+04 8,59E+02 7,06E+04 2,33E+01 4,08E+07 4,28E+09
PDA KOMADA KB
Resultados y Discusión
99
la microflora que pudieran explicar la diferencia de expresión e incidencia. Los suelos no se
encontraban encharcados aunque presentaban elevado contenido en arcillas y con tendencia a
la compactación.
En la parcela 1, todas las plantas muestreaddas tenían síntomas aéreos y en rizoma.
Tabla.11. Valores medios de UFC/100 g de especies fúngicas, bacterianas y Fusarium spp en los medios PDA y Komada de suelos asociados a FMP, realizados sobre tres repeticiones de la parcela 1 (P1) del suelo de la plantación comercial “El Cardón” situada en el norte de Tenerife, municipio de Buenavista.
Se sembraron muestras de cada punto de muestreo y de cada una se realizaron 3 repeticiones en cada medio de cultivo, K, PDA y KB. Los datos se refieren a la dilución 10E-2 para hongos, que es donde aparecían un número superior a 30 colonias e inferior a 300. Para las bacterias se elegía la dilución 10E-3, donde se podían contar más de 3 colonias y menos de 300. Las plantas sembradas en los puntos de muestreos de los suelos A, B, C y F no presentaban síntomas de FMP, las sembradas en los puntos de muestreos de los suelos G, H, D y E no presentaban síntomas aéreos pero si los presentaban en rizoma
La finca Economista también se encuentra situada en el término municipal de Buenavista del
norte de Tenerife. Fue una de las plantaciones más afectadas de todas las estudiadas. Los
resultados microbiológicos se presentan en la siguiente tabla 12.
muestra Hongos Bacterias Fusarium spp. cfu/100 g Hongos Bacterias Fusarium spp. cfu/100 g A 1,00E+03 1,80E+04 1,00E+03 1,90E+04 6,00E+02 0,00E+00 0,00E+00 6,00E+02B 1,00E+03 1,80E+04 0,00E+00 1,90E+04 3,00E+02 7,00E+02 0,00E+00 1,00E+03C 9,00E+03 0,00E+00 3,00E+03 9,00E+03 5,70E+03 1,90E+03 5,70E+03 7,60E+03D 3,00E+03 0,00E+00 1,00E+03 3,00E+03 2,60E+03 0,00E+00 9,00E+02 2,60E+03E 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 0,00E+00 1,80E+03 0,00E+00 0,00E+00 1,80E+03F 3,00E+03 0,00E+00 2,00E+03 3,00E+03 5,00E+02 0,00E+00 4,00E+02 5,00E+02G 1,00E+04 0,00E+00 1,00E+04 1,00E+04 2,00E+02 4,20E+03 2,00E+02 4,40E+03H 6,00E+03 3,00E+03 0,00E+00 9,00E+03 6,70E+03 0,00E+00 0,00E+00 6,70E+03
PDA Komada
Resultados y Discusión
100
Tabla.12. Valores medios de UFC/100 g en suelo de especies fúngicas, bacterianas en los medios PDA y Komada de suelos asociados a FMP de la plantación comercial “Economista” situada en el norte de Tenerife, municipio de Buenavista del Norte
Realizados sobre tres repeticiones de cada muestra (E1 “planta con síntomas aéreos e inicio en rizoma”, E2 “planta con síntomas aéreos e inicio en rizoma”, EFMP “planta con síntomas típicos de FMP aéreos y en rizoma”, Esana “planta sana”). Se sembraron 4 mezclas de suelos y de cada una se realizaron 3 repeticiones en cada medio de cultivo, K, PDA y KB. A partir de las placas de PDA se hizo un recuento del número de colonias pertenecientes al género Fusarium. Los datos se refieren a la dilución 10E-2 para hongos, que es donde aparecían un número superior a 30 colonias e inferior a 300. Para las bacterias se elegía la dilución 10E-3, donde se podían contar más de 3 colonias y menos de 300.
En dos de las plantaciones estudiadas, existen poblaciones microbianas en las que destacan los
altos valores de ufc para Fusarium, respecto al resto de microorganismos (otros hongos y
bacterias). En los puntos de muestreos correspondientes a las plantas enfermas existe un ligero
aumento de la flora fúngica total respecto a la bacteriana total. La presencia de altos valores de
ufc de Fusarium spp. en suelos de platanera ha sido citado por Blesa et al. (1979) y por
Hernández (1997). Estos resultados difieren de lo descrito por Stover (1953), donde lo
esperado en situaciones de encharcamiento es lo contrario, se favorece la flora bacteriana en
relación con la fúngica. Quizás, sea debido a que la situación de encharcamiento en las
plantaciones comerciales estudiadas no sea de forma permanente y por tanto no vemos su
efecto extremo sobre la flora microbiana del suelo, al menos en el momento del análisis ya que
la poblaciones en el suelo son dinámicas y sensibles a los cambios ambientales y edáficos, y
probablemente en otro momento de análisis los resultados serian distintos.
muestra Hongos Bacterias Hongos Bacterias Hongos Bacterias PDA KomadaE1 9,99E+04 5,17E+03 2,98E+04 0,00E+00 1,92E+04 1,50E+07 6,33E+03 7,83E+03E2 1,73E+05 2,67E+03 6,50E+03 2,50E+05 5,33E+05 1,06E+07 1,20E+04 4,42E+03
EFMP 1,32E+05 3,13E+04 5,03E+04 0,00E+00 1,10E+04 5,95E+06 1,00E+05 2,50E+04Esana 6,00E+04 1,07E+05 6,43E+03 0,00E+00 5,00E+04 8,63E+06 2,33E+04 3,27E+03
KB Fusarium spp . totalPDA Komada
Resultados y Discusión
101
2. AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE AISLADOS BACTERIANOS Y
FÚNGICOS
Se han procesado 567 submuestras (rizoma, pseudotallo y raíz) procedentes de 172 plantas y
59 plantaciones en total (18 plantaciones y 90 plantas muestreadas por nosotros y el resto de
muestras enviadas al laboratorio). Para mayoría de los fragmentos sembrados, existió una gran
variabilidad en los aislamientos obtenidos, aunque generalmente se produjo crecimiento, ya
fuera fúngico o bacteriano, de manera similar a lo obtenido por Reinking (1926) citado por
Lahav et al. (1999) y por Deacon et al. (1985) aunque estos autores pusieron de manifiesto
que en algunos casos no se producía crecimiento de ningún tipo, lo que también hemos
observado en varias ocasiones.
Los hongos aislados con mayor frecuencia pertenecen al genero Fusarium, siendo F.
oxysporum el que aparece en el 100 % de las plantas, le sigue F. subglutinans y F.
proliferatum que se encuentran presentes en un 80 % de las muestras procesadas (Fig.20).
(Pocasangre, 2000) estudiando la población de endófitos, obtuvo resultados similares en
plataneras de América Central.
En segundo lugar de abundancia se encuentra el número total de géneros de bacterias que
aparecen como flora asociada a este tipo de sintomatología. Pertenecen en su mayoría a los
géneros Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, Serratia y Enterobacter. Los géneros
Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia han sido descritos como patógenos en la platanera o
asociados a síntomas de podredumbres blandas en pseudotallo y rizoma.
Resultados y Discusión
102
Fig.20. Frecuencia de los géneros fúngicos y total de bacterias /número de puntos de siembra y procedencia de las muestras.
0%
20%
40%
60%
80%
100%
F.oxysp
orum
Otros (
bacte
rias)
Penicill
ium sp
p.
F. subg
lutina
ns
Cephalo
sporiu
m/Acremon
ium sp
p. cf.
Tricho
derma s
pp.
Rhizop
us spp
./Muco
r spp
.
F. prol
iferatu
mF. so
lani
Aspergi
llus s
pp.
F. roseu
m "sens
u Cass
ini"
Cladosp
orium
spp.
Alterna
ria sp
p.
Verticil
lium sp
p.
Chaeto
minum sp
p.
Gliocla
dium sp
p.
Phaecy
lomyce
s spp
.
Rhizoct
onia
spp.
Stemph
illium
spp.
Botrytis
spp.
Thielav
iopsis
spp.
Phoma s
pp. cf
.F. ta
bacin
umScl
erotiu
m spp.
Haprog
raphiu
m spp.
Nigrosp
oras s
pp.
Cylindro
carpo
n spp
.
SUR NORTE LA PALMA OTROS
Resultados y Discusión
103
A continuación se presenta el número total de plantas muestreadas (tabla 13)
Tabla.13. Número total de muestras procesadas para el aislamiento de los microorganismos asociados al FMP, según el órgano vegetal de procedencia y su sintomatología (FMP y MP).
Las muestras dudosas se encuentran incluídas en las plantas con síntomas de FMP, consideradas así en el dignóstico de visu y posteriormente confirmadas o descartadas según los resultados de los posteriores análisis.
2.1. Caracterización cultural de los aislados bacterianos
La selección de aislados bacterianos se hizo a partir de características culturales, mediante las
cuales se agruparon en 5 tipos de coloración de la colonia. El número de seleccionados para
realizar las posteriores caracterizaciones y pruebas de inoculación se describe en la tabla 14.
Tabla.14. Número total de aislados bacterianos y número de cepas seleccionadas para su identificación y caracterización
Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla 15.
tipo muestra FMP MP Total generalhoja 2 2pseudotallo 72 31 103raíz 73 12 85rizoma 337 40 377Total general 484 83 567
síntomas
aislados nº aislados nºtotal A 66 selecciónA 22total B 87 selecciónB 29total C 60 selecciónC 20total N 27 selecciónN 9total R 30 selecciónR 10total aislados 267 total selección 90
Clasificados en 5 tipos diferentes basados en la coloración de las colonias bacterianas en LPGA ( A: amarillo; B: blanco; C: crema; N: naranja; R: rojo).
Resultados y Discusión
104
Tabla.15. Número y caracterización fenotípica en medio LPGA (48 h y 25ºC) de las cepas seleccionadas para su posterior identificación y caracterización metabólica.
Grupos color, hace referencia a los grupos realizados a partir del color de la colonia (A: amarillo; B: blanco; C: crema; N: naranja; R: rojo). Forma* de la colonia (E: estrellada o con lascinias; I: irregular; P: puntos <1 mm; R: redondas o esféricas; M: miceliar; L: levaduriforme). El tamaño: diámetro de la colonia en mm. Bordes: contorno de la colonia. Pig. Dif. (presencia o ausencia de pigmentos difusibles en el medio). Nº de aislados se refiere al número de cepas seleccionadas de cada grupo para las posteriores pruebas; %: se refiere a frecuencia de aislamiento/ 172 muestras.
Grupos color Forma* % en placa Tamaño (mm) Bordes Pig. Dif. NºaisladosA E >75 1-3 Irregular no 3A E >75 3-7 Irregular no 3A I >75 3-5 Irregular no 2A I 50 3-4 Liso no 1A I >75 1-10 Liso no 10A P >50 0.5-1 Puntos no 8A P >75 0.5 Regular no 7A R 75 1-3 Irregular no 3A R 75 0.5-1 Regular no 4A R 75 2-3 Regular no 5A R >75 1-2 Regular no 5A R 75 2-3 Regular no 2A R 75 2-4 Liso no 4A R >75 0.5-5 Liso no 9B E >75 1-3 Irregular no 9B I >75 2-4 Irregular si 11B I >75 Variable Irregular no 16B M >75 Variable Irregular no 5B P >75 0.5 Regular no 10B R >75 2-4 Irregular no 2B R >50 0.5-1 Puntos no 17B R >75 1-5 Regular no 12B R,L >75 3-10 Liso no 5C E 50-75 1-5 Irregular no 7C I 75 1-5 Liso no 10C R >75 1-4 Irregular si 6C R 75 2-4 Liso no 3C R 75 3-4 Liso no 6C R 75 4-5 Liso no 12C R >50 0.5-1 Puntos no 1C R 75 2-4 Regular no 4C R 75 2-4 Regular no 1C R >75 1-4 Regular no 3C R >75 1-3 Regular no 2C R, pR >75 0.5-4 Lisos no 5N P >75 0.5 Regular no 13N R >50 1 Regular no 9N R,E 25-50 1-3 Lisa/irregular no 5R R >75 1-3 Regular no 19R R <25 2-3 Regular si 11
Resultados y Discusión
105
2.1.1. Identificación fenotípica y metabólica de las cepas bacterianas seleccionadas.
Pruebas de hipersensibilidad en hojas de tabaco (Lelliot y Stead, 1987)
A las cepas seleccionadas anteriormente se les realizaron pruebas metabólicas para su
identificación. Los cepas agrupadas metabolicamente, a 48 h de crecimiento, pueden ser
clasificados en los grupos que se muestran en la tabla 16.
Con el objetivo de reducir el número de cepas, los resultados de taxonomía se unieron en una
base de datos con los resultados de la prueba de hipersensibilidad en hoja de tabaco (HR)
descartando las que no pertenecían a un género descrito para la platanera y que eran HR
negativo. En una primera relación, se pensó que las cepas HR positivas tenían más
probabilidad de afectar a la platanera. No obstante, muchas Xhantomonas sp., muchas del
género Erwinia pectinolíticas y Agrobacterium tumefaciens son HR negativas y son bacterias
fitopatógenas bien conocidas en otros patosistemas.
Esto indica que las cepas que producen reacción positiva (fig.21), podrían tener un carácter
patógeno en determinadas condiciones ambientales o de estrés para la planta. En la mayoría de
grupos ha habido algún aislado que ha producido una reacción de hipersensibilidad en el
tabaco: 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, y 15 (tabla 16). En la mayoría de los géneros
presentes se incluyen especies que pueden ser potencialmente patógenas de la platanera, pero
tampoco pueden descartarse los grupos que han dado reacción negativa: 4,5 y 14, porque
podrían producir enzimas o toxinas u otros mecanismos que no desencadenan respuesta
hipersensible.
Fig.21. Reacción positiva de hipersensibilidad en
hoja de tabaco por la inoculación de una cepa perteneciente al género Xanthomonas.
Resultados y Discusión
106
Tabla.16. Grupos metabolicos correspondientes a especies y géneros bacterianos (manual de Bergey’s) en combinación con las pruebas de HR. Grupos Género cepas1 Gram2 OXID3 FLU4 HL5 Vel.6 APN7 U8 I9 E10 ALM11 GEL12 ARG13 HR14 Color15
1 Serratia marcencens 13 - - - 3 R + -/+ - + - + - 9+/3- B,C,R 2 Serratia ficaria 4 - - - 3 R - - + - - + - 1+/1- A,N3 Pantoea spp.2 4 - - - 3 R + - - + - + - 3+ A,N3 Pantoea spp.3 4 - - - 3 R + - - + - + - 3+ N4 Pantoea spp.2, 4 4 - - - 3 R - - + - - + - nr A5 Enterobacter gergoriae 2 - - - 3 R + - - + + + - 1- B5 Enterobacter clocae 1 - - - 3 R + - - + + + - - C5 Enterobacter sp. 1 - - - 3 R + + - - - + - - C5 Enterobacter sp. 1 - - - 3 R + + - - + + - - C5 Enterobacter sp. 1 - - - 3 R + + - + - + - - B5 Enterobacter sp. 1 - - - 3 R + + - + + + - - B6 Erwinia herbicola group 4 - - - 3 R - - - + - + - 2+/2- A7 Klebsiella sp. 3 - - - 3 R + + - + + - - + C7 Klebsiella sp. 3 - - - 3 R + - - + + - - + B8 Xanthomonas maltophilia 4 - + - 1 R + - - + - + - 1+/1- A8 Xanthomonas sp. 10 - +/- - 4 L + - - + +/- - - 4+/3- B9 Pseudomonas fluorescens 1 - + + 1 R - +/- +/- +/- +/- + - + B9 Pseudomonas sp. 6 - + - 1/4 R/L - - - - +/- - - 2+/2- B9 Comomona/Pseudomonas 6 - +/- - 1/4 R/L + + - + +/- - +/- 2+/2- C,B10 Flavobacterium breve 1 - + - 3 L - - + + +/- + +/- + A10 Flavobacterium breve 1 - + - 4 L + - - + +/- + +/- + N11 Chryseomonas luteola 4 - +/- - 1/4 L +/- - +/- + + + - + B,A12 Chryseomonas sp. 6 + + - 3/4 L +/- +/- - +/- + +/- +/- 2+/3- B,C13 Bacillus sp. 6 + - - 1/4 L +/- + - + +/- +/- +/- 3+ B,C14 cocos agrupados cadenas 2 + - - 4 L/R nr + - + nr nr nr - B15 cocos agrupados cubos 1 + + - 3 R - + - - + + - + A
Grupos: obtenidos a partir de la similitud en los perfiles metabólicos y fenotípicos estudiados. HL: se refiere a la utilización como fuente de carbono de la glucosa en condiciones aerobias y anaerobias (Anexo). 1: (-,-); 2 (+,-); 3 (-;+); 4 (+,+). Velocidad de crecimiento en LPGA a 25ºC: R (rápida < 24 h) L (lenta >24h). Color de la colonia en LPGA a 25ºC: A: amarillo; B: blanco; C: crema; N: naranja; R: rojo. Fluo: producción de pigmentos fluorescentes bajo luz UV en medio King B. APN: Reducción de nitratos; U: ureasa; I: Indol; E: esculina; Gel: gelatina; Alm: almidón; Arg: arginina. (Todas estas pruebas se describen en el Anexo).
Resultados y Discusión
107
Algunas especies citas de los géneros encontrados han sido descritas como patógenos o
endófitos de la platanera. Thwaites et al. (1999) realizaron una excelente revisión de las
principales bacteriosis en la platanera y géneros afines.
2.1.2. Ensayo comparativo del crecimiento de una cepa bacteriana durante 24 h y 48 h
mediante HPGC.
En general no existen diferencias entre los diferentes cuadrantes al cabo de 24 h de
crecimiento a 28ºC cualitativamente y se mantienen las proporciones de los picos unos
respecto a otros, pero existen diferencias respecto a la cantidad de biomasa disponible para la
realización del ensayo. Los cuadrantes que dan una buena señal en el cromatógrafo son los
cuadrantes nº1 (fig.22), nº 2 y nº 3. El cuadrante 4º no contiene suficiente biomasa para la
detección de unos buenos picos. El cuadrante 5º, contiene excesiva biomasa y aparecen
muchas impurezas en la línea de base, posiblemente debidas a la gran concentración de
pigmentos bacterianos.
En el ensayo a las 48 h, ocurre lo mismo que a las 24 h (fig 23). Los picos resultantes se
mantienen proporcionales entre ellos, independientemente de qué cuadrante se trate. Pero
existen problemas de sensibilidad en el cuadrante 4º como ocurría a las 24 h de crecimiento.
Existen diferencias en todos los casos respecto a la proporción del pico correspondiente a
ácidos grasos de 18 carbonos. En todos los cuadrantes, a las 24 h, este pico es siempre mayor
que el pico correspondiente a 17 átomos de carbono, y por el contrario a las 48 h lo
encontramos siempre inferior. Esta diferencia podría dar lugar a errores en la identificación de
las bacterias de acuerdo con sus perfiles de ácidos grasos.
Por lo tanto, en aquellos cultivos de los que no se disponga de suficiente biomasa a las 24 h.
en el tercer cuadrante para realizar el protocolo (fig. 24), se tendrá que adoptar la estrategia de
sembrar varias placas para solucionar el problema de la biomasa a las 24 h. Otra opción sería
hacer las siembras de cada cepa en placa con medio TSBA, pero en estría de forma confluente,
con lo que se garantiza suficiente biomasa en una sola placa. La alternativa de dejar crecer más
tiempo las colonias sería la menos aconsejable, pues ya se ha visto que existen diferencias en
el perfil de ácidos grasos resultante.
Resultados y Discusión
108
Fig. 22. Cromatograma de las áreas de los
picos correspondientes a los diferentes ácidos
grasos. Cepas del primer cuadrante a las 24 h
de crecimiento
Fig. 23. Cromatograma de las áreas de los
picos correspondientes a los diferentes ácidos
grasos. Cepas del primer cuadrante a la s 48 h
de crecimiento
Fig. 24. Cromatograma de las áreas de los picos correspondientes a los
diferentes ácidos grasos. Cepas del tercer cuadrante a la s 48 h de crecimiento
Resultados y Discusión
109
2.1.3. Caracterización por ácidos grasos de membrana y API 20E, API 20NE
De los grupos anteriormente descritos se eligieron representantes para su clasificación
específica, antes de la selección final para las inoculaciones en plataneras sanas. Los métodos
empleados se eligieron por su gran fiabilidad dado que son protocolos estandarizados y existen
bases de datos donde poder introducir los resultados y obtener una clasificación más precisa.
Los resultados de los API 20 E, utilizados para las bacterias Gram negativo oxidasa negativo
(enterobacterias) y los API 20 NE para las Gram negativo, oxidasa positiva (no
enterobacterias), se muestran en la siguiente tabla 17, junto con los resultados de los perfiles
de ácidos grasos. Las clasificaciones propuestas por el sistema MIS a partir de los perfiles de
ácidos grasos cuyo ns<0.5 no son fiables. En algunos casos se realizó un API 20 E/NE, para
descartar o confirmar la clasificación propuesta por el sistema MIS (tabla 18). Las cepas en las
que no se había realizado el perfil de ácidos grasos y que quedaban incluidas en los grupos
construidos a partir de los perfiles metabólicos, se confirmaron con la realización de API 20
E/NE, dependiendo de si eran enterobacterias o no respectivamente.
Resultados y Discusión
110
Tabla.17. Caracterización por ácidos grasos de mebrana, API 20E y API 20NE de las cepas seleccionadas, representantes de los grupos obtenidos a partir de las cacterizaciones fenotipicas y de las pruebas metabólicas.
ns: nivel de similitud de los perfiles de los ácidos grasos de nuestras cepas con las cepas de referencia introducidas en la base de datos del programa MIS.
GRUPOS sp.Ac.grasos ns API ORIGEN HR1 Serratia marcenscens 0,69 Serratia marcencens Sur Tnfe1 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,24 Sur Tnfe +1 Enterobacter cancerogenus (Erwinia cancerogena) 0,74 Sur Tnfe +1 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,15 Serratia marcencens Sur Tnfe +1 Serratia marcenscens 0,87 Serratia spp Sur Tnfe +1 Serratia marcenscens 0,23 Norte Tnfe +1 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,18 Sur Tnfe +1 Enterobacter taylorae 0,79 La Palma +1 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,24 Norte Tnfe +1 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,50 Norte Tnfe -1 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,16 Norte Tnfe +1 Serratia marcenscens 0,87 Serratia spp Sur Tnfe -2 Serratia ficaria Sur Tnfe -2 Serratia ficaria Norte Tnfe +2 Serratia ficaria Sur Tnfe2 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,24 Serratia ficaria Norte Tnfe3 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,49 Pantoea spp.3 / Stenotrophomonas maltophilia Norte Tnfe +3 Pantoea spp.2 La Palma3 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,49 Pantoea spp.3 Norte Tnfe +3 Serratia marcenscens 0,48 Sur Tnfe +4 Pantoea spp2 , 4 Gran Canaria5 Enterobacter gergoriae Norte Tnfe -5 Kluyvera cryocrescens 0,61 Enterobacter clocae Norte Tnfe -5 Enterobacter spp Sur Tnfe -5 Enterobacter clocae La Palma -5 Escherichia coli 0,45 Sur Tnfe -5 Enterobacter clocae La Palma -6 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,74 Erwinia herbicola group La Palma +6 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,49 Sur Tnfe7 E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 0,22 La Palma +7 Bacillus coagulans 0,72 Norte Tnfe +7 Klebsiella pneumoniae 0,42 Klebsiella spp La Palma +8 X.malthophilia Norte Tnfe8 Xanthomonas maltophilia 0,20 Norte Tnfe -8 Pseudomonas putida 0,41 Sur Tnfe +8 Xanthomonas maltophilia 0,74 El Hierro8 Serratia marcenscens 0,87 X.malthophilia/Pseudomonas sp. Sur Tnfe8 Xanthomonas maltophilia 0,36 X.malthophilia Gran Canaria +8 Xanthomonas maltophilia 0,57 Xanthomonas malthophilia Norte Tnfe8 Xanthomonas maltophilia 0,38 Gran Canaria +9 Actinobacillus lignieresii 0,79 Sur Tnfe -9 Pseudomonas putida 0,41 Comomona testosteroni/Ps.alcaligenes Sur Tnfe +9 Pseudomonas putida 0,41 Sur Tnfe9 Acinotobacter baumannii 0,05 Sur Tnfe -9 Pseudomonas fluorescens Norte Tnfe +9 Acinotobacter baumannii 0,05 Sur Tnfe +9 Curtobacterium flaccumfaciens 0,62 Ps.vesicularis/Ps paucimovilis Sur Tnfe
10 Serratia marcenscens 0,35 Flavobacterium breve Sur Tnfe +11 Enterobacter taylorae 0,79 ? La Palma +11 Enterobacter taylorae 0,79 La Palma11 Chryseomonas luteola La Palma +12 Xanthomonas maltophilia 0,74 El Hierro +12 Ochrobactrum anthropi 0,31 Norte Tnfe -13 Bacillus maceranas 0,18 La Palma +13 Xanthomonas maltophilia 0,68 Norte Tnfe +14 Sur Tnfe -15 Enterobacter taylorae 0,46 La Palma +
Aislados bacterianos procedentes de muestras de campo
Resultados y Discusión
111
Los métodos empleados coincidían en la mayoría de casos en el género al cual se llegaba, pero
a nivel de especie diferían en muchos casos. Los API no están diseñados para la identificación
de bacterias fitopatógenas, y la base de datos no las incluye. De todos modos, es una prueba
muy útil pues se obtienen los resultados en muchos medios de cultivo a la vez en 24 h, y
pueden ser utilizados para diferenciar cepas de una misma especie cuando se conocen sus
perfiles metabólicos. En nuestro caso se observó una gran variabilidad dentro de los grupos
que contenían varias cepas morfológicamente iguales.
La combinación de los perfiles de ácidos grasos y los resultados en los API 20 E y los API 20
NE, hizo posible llegar a la clasificación de nuestra colección (tabla. 17).
2.2. Identificación y caracterización cultural de los aislados fúngicos
Se han identificado 30 géneros diferentes en el total de 567 submuestras procesadas (rizoma,
pseudotallo y raíz) procedentes de 172 plantas y 59 plantaciones. El género Fusarium estuvo
presente en 427 muestras, el 75.31 % del total (tabla 18). Las especies más abundantes (fig.
25) fueron Fusarium oxysporum (42%), F. proliferatum (9.17%) y F. subglutinans. (16.23%).
Reinking (1926) citado por Lahav et al.(1999), encontró Fusarium spp. y F. oxysporum en sus
trabajos sobre el Yellow Mat. En estudios de poblaciones de endófitos, Pocasangre et al.
(2000) obtuvieron aislamientos similares de platanera sana.
Fig.25. Frecuencia de aislamiento (aislados al menos una vez por submuestra) de las especies fúngicas asociadas a muestras de material vegetal con síntomas de FMP, calculada a partir de (número de aislamientos de la especie / número total de submuestras procesadas) x 100.
42,50
28,40
16,239,17
1,94 1,760,005,00
10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,0045,00
Frecuencia tota %
Fusarium oxysporum Otros Fusarium subglutinans
Fusarium proliferatum Fusarium solani Fusarium sp.
Resultados y Discusión
112
El número y la abundancia relativa de cada especie varían en función del tipo de muestra: raíz,
pseudotallo y rizoma, tal y como se muestra en la tabla 18, 19 y fig 26. F. oxysporum es la
especie más abundante en la zona del pseudotallo aunque le sigue muy de cerca las especies F.
proliferatum y F. subglutinans.
Tabla.18. Número y frecuencia relativa de aislamiento de las diferentes especies fungicas asociadas, en función del órgano estudiado.
Las 567 submuestras pertenecen a 172 plantas
Resulta especialmente interesante la elevada frecuencia en pseudotallo correspondiente a la
especie F. proliferatum, dado que no es un hongo habitual en este órgano. En platanera sólo se
ha descrito para enfermedades del fruto (tablas 18, 19 y fig 26).
F. proliferatum ha sido descrito como patógeno de diferentes especies vegetales: por Wu y
Huang (1997) en Lillium, por Elena y Kranias (1996) en espárrago, por Abdalla et al. (2000)
Hongo pseudotallo raíz rizoma Total frec.pseudo frec.raíz frec. Rizomaindeterminado 1 7 5 13 0,99 7,45 1,34Acremonium sp./Cephalosporium sp. 7 2 16 25 6,93 2,13 4,30Alternaria sp. 1 2 3 0,00 1,06 0,54Aspergillus sp. 1 6 7 0,99 0,00 1,61Botrytis sp. 1 2 3 0,00 1,06 0,54Cladosporium sp. 1 6 7 0,99 0,00 1,61Colletotrichum sp. 2 2 0,00 2,13 0,00Cylindrocarpon sp. 1 2 0,00 0,00 0,27Chaetomium sp. 1 4 5 0,00 1,06 1,08Fusarium oxysporum 24 31 136 191 23,76 32,98 36,56Fusarium oxysporum f sp cubense 22 9 34 65 21,78 9,57 9,14Fusarium proliferatum 21 1 30 52 20,79 1,06 8,06Fusarium solani 1 2 8 11 0,99 2,13 2,15Fusarium sp. 1 4 8 13 0,99 4,26 2,15Fusarium subglutinans 14 16 65 95 13,86 17,02 17,47Gliocladium sp. 1 2 3 0,99 0,00 0,54Haplographium sp. 1 1 0,00 0,00 0,27Illosporium sp. 1 2 3 0,99 0,00 0,54Macrophomina sp. 2 2 0,00 2,13 0,00Mucor sp. 1 1 0,00 0,00 0,27Nigrospora sp. 1 1 0,00 0,00 0,27Penicillium sp. 3 1 25 29 2,97 1,06 6,72Phoma sp. cf. 2 2 0,00 2,13 0,00Rhizoctonia sp. 2 3 5 0,00 2,13 0,81Sclerotium sp. 1 1 2 0,00 1,06 0,27Stemphylium sp. 2 2 0,00 0,00 0,54Thielaviopsis paradoxa 5 5 0,00 5,32 0,00Trichoderma sp. 2 3 10 15 1,98 3,19 2,69Verticillium theobromae 1 1 2 0,00 1,06 0,27Total general 101 94 372 567 100,00 100,00 100,00
muestra
Resultados y Discusión
113
en raíces de palmera datilera, por Chao et al. (1998) en álamo y por Conner et al. (1996) en
trigo. En platanera sólo ha sido citado por Jimenez et al. (1993), Lopez Cabrera (1998), y
Ranasinghe (2002) asociado a antracnosis y al “crown rot” de frutos. Jimenez et al. (1997)
aislaron F. proliferatum de frutos plataneras y comprobaron la capacidad de algunos de los
aislados de producir de micotoxinas, pero hasta el momento no se ha descrito asociado a
ninguna sintomatología similar al FMP en platanera.
En Sudáfrica, Blodgett et al. (1998) encontraron, las especies Fusarium sambucinum, F.
oxysporum, y F. subglutinans asociadas a la marchitez de híbridos de Amaranthus. F.
subglutinans ha sido citado como productor de micotoxinas tales como beauvericin (BEA) y
moniliformina, que en ocasiones son fitotóxicas como han citado Logrieco et al. (1993) en
maíz peruano o se acumulan en los granos de maíz híbridos (Kostecki, 1994). También ha sido
citado como patógeno vascular en piña (Martelleto et al., 1998) o produciendo cancros en pino
(Viljoen et al., 1995). En platanera no se ha descrito como causante de ninguna patología.
A continuación se presentan los resultados de las especies pertenecientes al género Fusarium
en función del órgano de donde han sido aisladas (tabla 19).
Tabla.19. Número y frecuencia relativa de los aislados pertenecientes al género Fusarium asociadas a plantas con síntomas de FMP, en función del órgano estudiado.
427 submuestras basadas en 129 plantas.
Las 22 submuestras de pseudotallo correspondientes a 12 plantas, de donde se aisló FOC que
aparecen en la tabla 19, fueron muestras dudosas en su sintomatología, aunque luego fueron
confirmadas como mal de panamá mediante la siembra de los aislados en medio Komada. Con
cuatro de ellos se realizaron posteriormente pruebas de inoculación en plantas sanas,
produciendo los síntomas clásicos. También fue determinado el VCG, confirmando su
Hongo pseudotallo raíz rizoma Total frecTotal frec.pseudFusarium oxysporum 24 31 136 191 44,73 28,92Fusarium oxysporum f sp cubense 22 9 34 65 15,22 26,51Fusarium proliferatum 21 1 30 52 12,18 25,30Fusarium moniliforme 2 1 3 0,70 2,41Fusarium solani 1 2 8 11 2,58 1,20Fusarium sp. 4 6 10 2,34 0,00Fusarium subglutinans 14 16 65 95 22,25 16,87Fusarium tabacinum 1 2 3 0,70 1,20Fusarium total 85 63 281 427 100,00 102,41
muestra
Resultados y Discusión
114
pertenencia al grupo VCG 0120. F. moniliforme ha sido descrito como endófito capaz de
disminuir la capacidad fotosintética de la planta por Pinto et al. (2000) en la platanera.
A continuación se representan las especies más abundantes del género Fusarium en función
del órgano del que fueron aisladas (fig. 26).
Datos a partir de 172 plantas procedentes de 59 plantaciones
Fig.26. Frecuencia de aislamiento respecto al órgano del que proceden, de las especies más abundantes pertenecientes al género Fusarium.
La caracterización cultural de las diferentes especies aisladas pertenecientes al género
Fusarium en su gran mayoría, se realizó a partir de cultivos monospóricos en MM, PDA y K,
se puso de manifiesto la gran variabilidad cultural existente incluso en una misma línea
monospórica (Nelson, 1983). Fue necesario trabajar en condiciones estandarizadas para
obtener una clasificación fiable.
24 2112
31
116
136
30
64
0
20
40
60
80
100
120
140
pseudotallo raíz rizoma
Fusarium oxysporum Fusarium proliferatum Fusarium subglutinans
Resultados y Discusión
115
2.2.1. Caracterización por grupos de Compatibilidad Vegetativa (VCGs) de los
aislados pertenecientes al género Fusarium
De 172 plantas, 29 con síntomas de MP, se sembraron 83 submuestras y se aisló FOC de todas
ellas. Las procesadas como FMP o dudosas a priori, fueron 143 plantas de las que se
sembraron 429 submuestras. Se obtuvieron 256 aislamientos que fueron clasificados como
Fusarium oxysporum, de las cuales 65 dieron reacción positiva en medio Komada (K), por lo
tanto el error de diagnostico fue del 25,39 %, cifra que pone de manifiesto la dificultad de
diagnostico diferencial entre el MP y el FMP. Los aislados de F. oxysporum con reacción
negativa en medio Komada. En la tabla 20 se presentan los resultados de las caracterizaciones
por VCGs de los aislados F. oxysporum.
Tabla.20. Compatibilidad con el VCG 0120 de la selección de aislados pertenecientes a la especie F.oxysporum y frecuencia de obtención de los mutantes nit 1; nit 3; nit M y crn.
Los aislados de F. oxysporum asociados a plantas con síntomas de FMP, son Komada
negativo, no pertenecientes al grupo de compatibilidad vegetativa 0120. Como hemos visto
anteriormente, los aislamientos Komada positivo provienen en su mayoría de plantas con
código frec nit1 frec nit3 frec nit M frec cnr VCG012032 4/10 1/10 0 5/10 +33j 8/10 0 0 2/10 +32j 4/10 0 1/10 5/10 +37 2/10 0 1/10 7/10 +14,3,2,1 R2B 8/12 0 1/12 3/12 -R1GB 8/12 1/12 0 3/12 -34J 5/10 1/10 1/10 3/10 -T P-2 ve 6/10 0 0 4/10 -11,3,2,1 5/10 0 1/10 4/10 -11,1,1,5 7/10 0 0 3/10 -29 5/10 3/10 0 3/10 +27 5/10 2/10 0 3/10 +Duran 3/10 0 1/10 6/10 +14 6/10 1/10 0 3/10 +R1PMA 8/10 1/10 0 1/10 -12 7/10 0 0 3/10 -16 6/10 0 0 4/10 +i 3/10 1/10 0 6/10 -10 7/10 2/10 0 1/10 +eE2B
Resultados y Discusión
116
síntomas clásicos de MP y de un 25,39 % de plantas dudosas. La frecuencia de los diferentes
tipos de mutantes obtenidos se corresponde con lo descrito en la literatura. Los nit 1 han sido
los más abundantes, seguidos de los nit3 y nit M (tabla 20). La compatibilidad vegetativa entre
los aislados K positivo y el VCG de referencia 0120, ha sido en todos los casos positiva.
Algunos de los F. oxysporum que habían sido K negativo, también mostraron compatibilidad
vegetativa con el VCG de referencia 0120, lo que quiere decir que estos aislados también son
F. oxysporum f. sp. cubense y que el medio Komada es una herramienta preliminar de
caracterización pero no es definitiva (fig.29). Todos los aislados que son K positivo son F.
oxysporum f. sp. cubense (Ploetz y Correll, 1988; Regalado-Guijarro y Hernandez 1998), pero
no puede descartarse que lo sean también los que son K negativo. La respuesta K positivo
puede verse modificada por muchos factores externos, debido a que el crecimiento diferencial
es una característica fenotípica, que esta influenciada por el ambiente. En cambio los VCG
como herramienta de caracterización de los patógenos, es la más eficaz (Puhalla, 1985),
existen diferencias de intensidad de respuesta, pero no de error (fig.27, 28).
Resultado y Discusión
117
Fig. 27. Compatibilidad vegetativa entre un
aislado F. oxysporum f. sp. cubene nit 1 y nit M
VCG 0120 de referencia
Fig. 28. Comapatibilidad vegetativa débil entre
un aislado F. oxysporum f. sp. cubene nit 1 y nit
Fig. 29 a)FOC reacción Komada positiva colonias
laciniadas. b) FO reacción Komada negativo
a b
Resultados y Discusión
118
2.2.2. Caracterización por velocidad de crecimiento en placa en los medios de cultivo
PDA y Komada, a 15ºC y 25ºC de los aislados pertenecientes al género
Fusarium.
Los resultados se presentan en la tabla 21.
Tabla.21. Velocidad de crecimiento (mm/h) de las especies más frecuentes asociadas a plantas con síntomas de FMP pertenecientes al género Fusarium, realizada con 5 repeticiones en los medio de cultivos PDA y Komada.
Los valores de la velocidad de crecimiento (mm/h) corresponden a la pendiente de la recta de regresión. El coeficiente r en todos los caso es de un valor >0,95.
especie PDA25º K25º PDA15ºC K15ºCF. oxysporum 0,20 0,11 0,14 0,05F. oxysporum 0,23 0,08 0,05 0,04F. oxysporum 0,26 0,20 0,11 0,06F. oxysporum 0,28 0,09 0,14 0,08F. oxysporum 0,29 0,09 0,08 0,04F. oxysporum 0,30 0,13 0,13 0,06F. oxysporum 0,30 0,10 0,05 0,04F. oxysporum 0,30 0,14 0,15 0,05F. oxysporum 0,31 0,07 0,14 0,03F. oxysporum 0,31 0,08 0,09 0,03F. oxysporum 0,32 0,13 0,18 0,06F. oxysporum 0,32 0,13 0,19 0,05F. oxysporum 0,32 0,13 0,18 0,06F. oxysporum 0,33 0,05 0,23 0,11F. oxysporum 0,33 0,09 0,12 0,03F. oxysporum 0,35 0,08 0,06 0,03F. oxysporum 0,36 0,09 0,14 0,04F. oxysporum 0,49 0,16 0,17 0,09FOC 0,39 0,11 0,16 0,02F. proliferatum 0,20 0,08 0,12 0,06F. proliferatum 0,26 0,09 0,09 0,02F. proliferatum 0,30 0,11 0,22 0,06F. proliferatum 0,33 0,14 0,13 0,07F. proliferatum 0,37 0,22 0,11 0,04F. subglutinans 0,17 0,11 0,21 0,07F. subglutinans 0,22 0,12 0,06 0,03F. subglutinans 0,25 0,10 0,22 0,10F. subglutinans 0,27 0,13 0,06 0,02F. subglutinans 0,30 0,09 0,06 0,03F. subglutinans 0,32 0,15 0,18 0,05F. subglutinans 0,32 0,21 0,28 0,11F. subglutinans 0,36 0,09 0,27 0,06F. moniliforme 0,52 0,15 0,08 0,04
Resultados y Discusión
119
El crecimiento en placa en los dos medios ensayados, PDA y Komada, de todos los hongos se
ha ajustado a la ecuación lineal y=ax+b, con una r de regresión lineal comprendida entre 0,95
y 0,99, en las dos temperaturas probadas. Los resultados para F.subglutinans, F. proliferatum;
F. oxysporum se corresponden con lo descrito en la bibliografía (Nelson, 1983). El
crecimiento en PDA y a 25ºC ha sido el más rápido para todas las especies. Se observa que la
especie F. moniliforme es la que presenta una velocidad de crecimiento en placa con medio
PDA a 25º mayor (tabla 21). En PDA a 15ºC, la velocidad mayor la presentan aislados de
F.proliferatum (0,22 mm/h) y F. subglutinans (0,28 mm/h).
3. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD
3.1. Pruebas de patogenicidad de bacterias
Se han realizado pruebas de patogenicidad, inoculando plantas de platanera con representantes
de cada grupo, pero no se ha podido reproducir ningún síntoma similar a los del FMP, ni
ninguno de las bacteriosis descritas para platanera. En la tabla 22, se muestran los resultados
obtenidos en las inoculaciones de las plataneras sanas con cepas seleccionadas.
Tabla.22. Severidad de síntomas en rizoma y avance de las necrosis en pseudotallo de plataneras del cultivar. ‘Gran Enana’ inoculadas con aislados bacterianos asociados al FMP.
Nº de plantas con síntomas sobre 3 repeticiones Rizoma vasos
Valores de severidad
Especies bacterianas inoculadas Severidad=0 1 2 3 4 1 2 3 4 5
Acinotobacter baumannii 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0
Bacillus coagulans 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0
Control 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Control 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0
Curtobacterium flaccumfaciens 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Chryseomonas luteola 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Chryseomonas luteola 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0
Chryseomonas luteola 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0
E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0
E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1
E. agglomerans (Erwinia herbicola group) 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0
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Resultados y Discusión
120
Nº de plantas con síntomas sobre 3 repeticiones Rizoma vasos
Valores de severidad
Especies bacterianas inoculadas Severidad=0 1 2 3 4 1 2 3 4 5
Enterobacter clocae 2 0 1 0 0 0 0 0 0 0
Enterobacter clocae 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0
Enterobacter gergoriae 2 0 0 0 0 1 0 0 0 0
Enterobacter spp 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Enterobacter taylorae 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Enterobacter taylorae 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0
Erwinia spp 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0
Erwinia spp 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0
Klebsiella pneumoniae 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Klebsiella spp 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0
Klebsiella spp 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0
Pantoea spp.2 0 2 1 0 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas fluorescens 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas putida 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Pseudomonas putida 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0
Pseudomonas spp 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1
Pseudomonas spp 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0
Pseudomonas spp. 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Serratia ficaria 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Serratia marcencens 2 0 0 0 0 0 0 0 0 1
Serratia marcenscens 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0
Serratia marcenscens 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0
Serratia marcenscens 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0
X.malthophilia 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0
X.malthophilia 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1
Xanthomonas malthophilia 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0
Xanthomonas maltophilia 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0
Xanthomonas maltophilia 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1
Xanthomonas maltophilia 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0
Xanthomonas spp. 11 2 0 0 0 0 0 0 0 0
Xanthomonas spp. 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0
Se representa el número de plantas con índices de severidad de síntomas en rizoma (0-4) y cm de avance en vasos. Nº de plantas que a los 90 días de la inoculación manifestaban síntomas en rizoma de intensidad
Resultados y Discusión
121
medida de 0-4 donde 1 es ¼ del rizoma, y 4 es el rizoma total necrosado en una circunferencia imaginaria total dividida en cuatro trozos. En los vasos la escala 1-4 son cm de avance de la bacteria a través del pseudotallo
En las inoculaciones se observaron síntomas ligeros en el rizoma con cepas de distintos grupos
y sólo con los grupos 1, 3, 8, y 9 en los vasos. En la tabla 23, se muestra el número de plantas
que a los 30, 60, 70 y 90 días de la inoculación manifiestaron diferente grado de severidad de
los síntomas evaluados.
Tabla.23. Nº de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ que a los 30, 60, 70 y 90 días de la inoculación con aislados bacterianos asociados al FMP, manifestaban síntomas en rizoma y/o en los vasos.
Evaluación de síntomas en rizoma de severidad medida de 0-4 donde 1 es ¼ del rizoma, y 4 es el rizoma total necrosado en una circunferencia imaginaria total dividida en cuatro trozos. En los vasos la escala 1-4 son cm de avance de la bacteria a través del pseudotallo.
De especial interés resultan las cepas que han conseguido avanzar a través del pseudotallo o
que han conseguido necrosar tejido en el rizoma (tabla 22 y fig. 30). Estas cepas pertenecen en
su mayoría a los géneros Serratia, Xanthomonas, Klebsiella, Erwinia, Pseudomonas y
Enterobacter, algunos de ellos con especies patógenas de la platanera o que están descritos en
la literatura en asociación con platanera, aunque ninguno de ellos ha conseguido reproducir los
síntomas típicos de esas bacteriosis en los asociados al FMP, en las condiciones
experimentales ensayadas en las que las plantas no fueron sometidas a ningún tipo de estrés
abiótico. Los géneros Pseudomonas y Erwinia han sido descritos por Vovlas et al. (1994)
asociados a las heridas causadas por nemátodos en raíces de platanera.
En especial el género Erwinia alberga especies patógenas para la platanera tales como Erwinia
carotovora que produce una podredumbre blanda y maloliente, descrita por diversos autores
como Pereira y Nunes (1988), Cedeno-M et al. (1990), Lakshmanan y Mohan (1992), y
Guzmán (1996), E. chrysanthemi fue citada por Robinson y Manicom (1991) como patógeno
Nºplantasfinal(dias) 0 1 2 3 4 1 2 2 4 5
30 6 15 2 6 1 3 6 5 2 460 14 5 0 0 0 0 0 0 2 170 19 3 0 0 0 0 0 0 0 090 0 28 0 0 0 0 0 0 0 0
total 39 51 2 6 1 3 6 5 4 5
rizoma vasos
Resultados y Discusión
122
del cultivar ‘Cavendish’ en Sudáfrica, sobre todo en los primeros estadios después del
transplante. Ninguno de los aislados pertenecientes a esos dos géneros ha producido la
sintomatología tipica en las condiciones ensayadas. El género Xhantomonas alberga especies
patógenas para la platanera como X. campestris pv. manihotis (Hahn et al., 1989) y el género
Ralstonia alberga la especie más devastadora conocidas en la platanera Ralstonia
solanacearum (P. solanacearum) productoras de enfermedad bien conocidas como Moko,
Bood disease, etc. (Akiew, 1992; Eden Green et al., 1994) que también han sido descritos
asociados a podredumbres blandas en la platanera. Otros géneros como Serratia, han sido
aislados como microflora asociada a la platanera por González (1996). En los trabajos sobre
‘Yellow Mat’ realizados por Reinking (1926) y citado por Lahav et al.(1999) también fueron
aislados algunos géneros bacterianos, cuyas pruebas de patogenicidad resultaron ser negativas
llegandose a la conclusión de que dichos géneros no parecen estar implicados en la producción
de los síntomas asociados.
Fig.30. Detalle del avance a través de los vasos del pseudotallo de una
cepa de Xanthomonas campestris inoculada.
Resultados y Discusión
123
3.2. Pruebas de patogenicidad in vitro de hongos
En ningún caso se produjeron los síntomas típicos de FMP ni de MP. Los síntomas evaluados
fueron amarilleo, marchitez, colapso y muerte de las plántulas. En la tabla 24 se presentan los
resultados obtenidos.
Tabla.24. Severidad expresada en porcentaje de síntomas externos, necrosis en rizoma, colapso y de muertes de plántulas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP en pruebas in vitro bajo condiciones de hipoxia radical y Tª 17ºC/26ºC
Los valores están expresados en frecuencias de número de plantas con síntomas/5 repeticiones Hipoxia (1= condiciones normales, 2=condiciones de hipoxia)
Especie T (ºC) hipoxia amarilleo marchitez necrosis colapso muerteF. oxysporum 17 1 50,00 96,67 73,33 65,00 33,33F. oxysporum 17 2 90,00 66,67 40,00 33,33 30,00F. oxysporum 26 1 82,50 88,33 72,50 57,50 6,67F. oxysporum 26 2 100,00 100,00 50,00 43,33 23,33F. proliferatum 17 1 33,33 100,00 60,00 26,67 26,67F. proliferatum 17 2 66,67 66,67 13,33 13,33 0,00F. proliferatum 26 1 46,67 93,33 66,67 46,67 26,67F. proliferatum 26 2 100,00 100,00 53,33 13,33 13,33F. solani 17 1 0,00 100,00 100,00 80,00 0,00F. solani 17 2 100,00 0,00 0,00 40,00 0,00F. solani 26 1 20,00 60,00 40,00 0,00 0,00F. solani 26 2 100,00 100,00 60,00 80,00 40,00F. subglutinans 17 1 13,33 100,00 66,67 40,00 26,67F. subglutinans 17 2 100,00 73,33 65,00 33,33 26,67F. subglutinans 26 1 40,00 66,67 60,00 26,67 26,67F. subglutinans 26 2 100,00 86,67 93,33 20,00 13,33FOC 17 1 0,00 100,00 50,00 75,00 0,00FOC 17 2 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00FOC 26 1 100,00 100,00 100,00 100,00 20,00FOC 26 2 100,00 100,00 60,00 40,00 40,00indeterminado 17 1 0,00 20,00 20,00 0,00 0,00indeterminado 17 2 100,00 20,00 0,00 0,00 0,00indeterminado 26 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00indeterminado 26 2 0,00 0,00 40,00 0,00 0,00mezcla de spp. 17 1 0,00 20,00 20,00 80,00 0,00mezcla de spp. 17 2 100,00 100,00 20,00 40,00 20,00mezcla de spp. 26 1 100,00 100,00 60,00 20,00 0,00mezcla de spp. 26 2 100,00 100,00 100,00 100,00 0,00Trichoderma sp. 17 1 0,00 80,00 0,00 0,00 0,00Trichoderma sp. 17 2 100,00 80,00 0,00 20,00 0,00Trichoderma sp. 26 1 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00Trichoderma sp. 26 2 100,00 40,00 100,00 100,00 20,00Control 17 1 20,00 0,00 0,00 0,00 0,00Control 17 2 20,00 0,00 0,00 0,00 0,00Control 26 1 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00Control 26 2 60,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Resultados y Discusión
124
A continuación se presentan los resultados del ANOVA para los valores del peso fresco y seco
de las plántulas.
Tabla.25. Resultados del ANOVA para las variables peso fresco y seco de plántulas de platanera cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP en pruebas in vitro bajo condiciones de 26ºC y con/sin hipoxia radical y 17ºC y con/sin hipoxia radical.
***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050
Los resultados del ANOVA presentados en la tabla 25 proceden del análisis de las frecuencias
calculadas a partir de 20 repeticiones por inoculo, y 5 para cada factor. Existe interacción entre
la temperatura y la inoculación de los hongos sobre el peso fresco y el peso seco de las
plantas. A continuación se presentan los valores de los pesos frescos y secos de las plantas in
vitro inoculadas con las diferentes especies fúngicas.
Tabla.26. Medias de los valores de los pesos frescos y pesos secos de las plantas de platanera in vitro cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con diferentes especies fúngicas.
Los resultados muestran que existen diferencias significativas entre el control y las diferentes
especies fúngicas inoculadas en plantas in vitro de platanera del cultivar ‘Gran Enana’.
Peso fresco Peso secoespecie 0,001** 0,001**Temperatura *** ***hipoxia radical 0,642ns 0,020**especie*Tª 0,004** 0,001**especie*hipoxia 0,289ns 0,509nsespecie*Tª*hipoxia 0,623ns 0,942ns
Peso fresco Peso secoControl 79,50 b 3,40 bindeterminado 49,75 ab 3,27 abF. subglutinans 35,00 a 2,24 amezcla de spp. 32,75 a 2,17 aF. proliferatum 30,75 a 1,64 aFOC 30,00 a 1,95 aTrichoderma sp. 29,75 a 2,50 aF. solani 23,75 a 1,75 aF. oxysporum 22,08 a 1,53 a
Resultados y Discusión
125
En la siguiente fig 31, se representan los pesos frescos y secos de las plantas de platanera
cultivar ‘Gran Enana’ in vitro bajo los efectos de temperatura a 17º/26º C y bajo con/sin
hipoxia radical
Pf= peso fresco/ Ps= Peso seco de las plantas in vitro.
Fig.31. Peso fresco y peso seco de las plantas de platanera cultivar ‘Gran Enana’ in vitro bajo temperatura 17º/26º C y con/sin hipoxia radical.
Existen diferencias significativas entre los pesos frescos de las plantas cuando crecen a 17ºC y
a 26º C, pero no las hay para los pesos secos. No existen diferencias significativas entre los
pesos frescos ni secos cuando las plantas se encuentran bajo el factor con/sin hipoxia radical
(fig. 31).
A continuación se presentan los resultados de la severidad de síntomas externos (tabla 27),
necrosis en rizoma, colapso y muerte de plántulas de platanera in vitro bajo condiciones de
hipoxia radical y temperaturas de 17ºC y 26ºC.
Pf/Ps a temperatura 17º/26ºC
0
10
20
30
40
50
(g)
Pf Ps
Pf 21,972 41,944
Ps 1,411 2,575
17º C 26º C
Pf/Ps con/sin hipoxia radical
0
10
20
30
40
hipoxia
(g)
Pf Ps
Pf 30,75 33,167
Ps 1,753 2,236
con s in
Resultados y Discusión
126
Tabla.27. Severidad de síntomas externos, necrosis en rizoma, colapso y porcentaje de muerte de plataneras cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP en pruebas in vitro bajo condiciones de temperatura de 17/26ºC y con/sin hipoxia radical
U: Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales). 90 repeticiones por tratamiento.
La expresión de los síntomas se ve favorecida a temperatura de 26ºC (tabla 27), aunque se han
producido más muertes a 17ºC, posiblemente debido a que la temperatura de 26 ºC favorece el
desarrollo del inoculo y también el de la planta mientras que a 17ºC se hace más lento el
crecimiento de ambos. Estas observaciones se reflejan en la disminución de los pesos frescos y
secos de las plantas a 17ºC y como hemos visto anteriormente en el apartado de características
culturales, la velocidad de crecimiento de estas especies a temperatura de 17ºC diminuye
respecto a la velocidad de crecimiento a 26ºC.
La temperatura a 17ºC y la hipoxia radical por separado, influyen significativamente sobre el
amarilleo foliar y las necrosis en rizoma observadas en las plantas in vitro. La hipoxia radical
también influye sobre el colapso foliar. Estos resultados concuerdan con lo citado para
condiciones de campo donde la hipoxia puede producir amarilleo y colapso foliar citas.
En al tabla 28 se presentan los resultados de las inoculaciones con cada una de las especies
fúngicas seleccionadas.
amarilleo marchitamiento necrosis colapso muerte17ºC 158,778 172,361 162,713 174,676 179,59126ºC 195,119 181,613 191,206 179,311 174,424Mann-Whytney U 12369,000 14759,500 13061,500 15167,000 16032,000p 0,000 0,257 0,002 0,609 0,462sin hipoxia 135,134 181,157 186,340 186,126 176,749con hipoxia 218,160 172,913 167,817 168,028 177,247Mann-Whytney U 8248,500 16302,500 17209,500 17172,000 15531,000p 0,000 0,313 0,049 0,046 0,943
Resultados y Discusión
127
Tabla.28. Efecto del factor especie fúngica sobre la severidad de síntomas externos, necrosis en rizoma y porcentaje de muerte de plántulas de platanera cv ‘Gran Enana’ en pruebas de inoculación in vitro.
KW: Prueba no paramétrica múltiple de Kruscal Wallis que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales). 20 repeticiones por inóculo.
Existen diferencias en la expresión de los síntomas dependiendo de la especie inoculada (tabla
27). En la siguiente tabla 29 se desarrolla la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis,
comparando cada una de las especies inoculas con el control, para determinar a qué inoculo
son debidas las diferencias encontradas.
amarilleo marchitamiento necrosis colapso muerteControl 104,63 45,00 87,50 112,50 147,50FOC 197,78 221,50 205,17 210,56 176,92F. oxysporum 202,30 200,38 190,08 200,00 189,74F. proliferatum 169,34 203,85 172,81 156,63 176,92F. solani 157,58 159,73 175,75 200,75 165,15F. subglutinans 171,19 188,59 213,14 166,35 189,38Mucor sp. 106,95 63,58 115,37 112,50 147,50Trichoderma sp. 192,88 133,25 131,63 165,45 156,33Total 192,88 186,20 175,75 218,40 156,33Kruskal-Wallis 43,34 134,05 49,44 44,75 18,83
p 0,000 0,000 0,000 0,000 0,016
Resultados y Discusión
128
Tabla.29. Resultados de la prueba Man-Whitney U de la comparación del tratamiento control con cada una de las especies fúngicas para la severidad de los síntomas externos, necrosis de rizoma, colapso y porcentaje de muertes de plántulas de platanera cv ‘Gran Enana’ en pruebas in vitro.
U: Prueba no paramétrico simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales). 20 repeticiones por inóculo.
Todas las especies inoculadas producen algún tipo de síntoma de forma significativamente
diferente al control, independientemente de los factores hipoxia y frío, excepto el aislado
indeterminado, que fue inocuo para las plantas, bajo todas las condiciones ensayadas (tabla
29). En la tabla 30 se presentan los resultados de la inoculación con FOC, incluido como
patógeno de referencia.
amarilleo marchitamiento necrosis colapso muerteControl 36,625 17,500 35,000 40,000 55,000F oxysporum 74,534 77,803 74,812 73,957 71,393Mann-Whytney U 522,500 140,000 490,000 590,000 890,000
p 0,000 0,000 0,000 0,000 0,015Control 14,750 10,500 13,500 14,500 18,000FOC 24,778 29,500 26,167 25,056 21,167Mann-Whytney U 85,000 0,000 60,000 80,000 150,000
p 0,001 0,000 0,000 0,000 0,060Control 28,875 16,000 19,000 31,000 33,000F. subglutinans 43,771 48,136 47,119 43,051 42,373Mann-Whytney U 367,500 110,000 170,000 410,000 450,000
p 0,004 0,000 0,000 0,005 0,017Control 29,500 13,500 26,000 33,000 35,500F.proliferatum 44,167 49,500 45,333 43,000 42,167Mann-Whytney U 380,000 60,000 310,000 450,000 500,000
p 0,005 0,000 0,000 0,014 0,052Control 17,500 14,000 15,500 15,500 19,500F. solani 23,500 27,000 25,500 25,500 21,500Mann-Whytney U 140,000 70,000 100,000 100,000 180,000
p 0,056 0,000 0,000 0,000 0,152Control 15,500 15,500 18,000 17,500 20,500Tricoderma sp. 25,500 25,500 23,000 23,500 20,500Mann-Whytney U 100,000 100,000 150,000 140,000 200,000
p 0,002 0,002 0,018 0,009 1,000Control 19,875 19,000 18,500 20,000 20,000Mucoral 20,132 21,053 21,579 20,000 20,000Mann-Whytney U 187,500 170,000 160,000 190,000 190,000
p 0,926 0,141 0,068 1,000 1,000
Resultados y Discusión
129
Tabla.30. Resultados de la prueba de Mann-Whitney U no paramétrica para la severidad de síntomas externos, necrosis en rizoma, colapso y muerte de plántulas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con FOC en pruebas in vitro, Tº 17/26ºC y con/sin hipoxia radical
U: Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales). 10 repeticiones por tratamiento.
El amarilleo foliar producido por FOC es mayor cuando las plantas se encuentran bajo el
factor hipoxia y a temperatura de 26ºC (tabla 30). El colapso de la última hoja se produce con
más frecuencia cuando las plantas se encuentran bajo condiciones de hipoxia. Los síntomas en
rizoma y la muerte de plántulas sólo son explicables por la inoculación con FOC y no
dependen ni de la temperatura ni de la hipoxia. Según estos resultados parece que la severidad
de los síntomas externos se ve influenciada por la temperatura y las condiciones de hipoxia
radical, en cambio los síntomas en rizoma y la muerte de plántulas no dependen ni de la
temperatura ni de la hipotexia radical. A continuación se presentan los resultados para F.
Proliferatum, una de las especies de Fusarium más frecuentemente aisladas de plantas con
FMP.
FOC amarilleo marchitamiento necrosis colapso muerte17ºC 7,000 9,500 8,000 7,875 8,00026ºC 11,500 9,500 10,700 10,800 10,700Mann-Whytney U 20,000 40,000 28,000 27,000 28,000p 0,014 1,000 0,192 0,180 0,099sin hipoxia 7,500 9,500 10,500 12,500 9,000con hipoxia 11,500 9,500 8,500 6,500 10,000Mann-Whytney U 22,500 40,500 49,500 67,500 36,000p 0,028 1,000 0,331 0,006 0,539
Resultados y Discusión
130
Tabla.31. Resultados de la prueba de Mann-Whitney U no paramétrica para la severidad de síntomas externos, necrosis en rizoma, colapso y muerte de plántulas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ inoculadas con Fusarium proliferatum en pruebas in vitro, Tº 17/26ºC y con/sin hipoxia radical
U: Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales). 10 repeticiones por tratamiento.
Existen diferencias significativas entre la inoculación de F. proliferatum en las plántulas con y
sin hipoxia radical, para las variables amarilleo, necrosis de rizoma, colapso y muerte (tabla
31). En condiciones de hipoxia radical, se produce un aumento del número de casos con
amarilleo, pero una reducción en la variable necrosis, colapso y muerte. Estos resultados, son
difíciles de explicar, pero una posibilidad podría ser que F. proliferatum que es aeróbio
estricto, se ha desarrollado más en condiciones normales, llegando a producir un efecto
fitotóxico debido a su propio carácter saprofítico o a la producción de algún tipo de toxina,
que explicaría el aumento del número de casos en las condiciones normale. Esta explicación
podría explicar el aumento de amarilleo también bajo condiciones normales, que se ve
aumentado por el efecto hipoxia como se muestra en la tabla 27.
Las pruebas de patogenicidad in vitro muestran que algunas especies del género Fusarium,
pueden provocar síntomas externos tales como amarilleo y colapso de la emisión de hojas
nuevas, necrosis en el interior del rizoma y en ocasiones, muerte de las plántulas bajo
condiciones de hipoxia radical y temperaturas de 26ºC y 17ºC. Estos resultados ponen de
manifiesto la capacidad saprófitica sobre plántulas de platanera de algunas especies fúngicas
bajo condiciones de estrés. Aguilar et al. (2000) demostraron que la hipoxia radical podía
F. proliferatum amarilleo marchitamiento necrosis colapso muerte17ºC 27 28,5 27 29 29,526ºC 34 32,5 34 32 31,5Mann-Whytney U 345 390 345 405 420p 0,065 0,088 0,073 0,375 0,492sin hipoxia 24 32,5 35 34 33,5con hipoxia 37 28,5 26 27 27,5Mann-Whytney U 255 510 585 555 540p 0,001 0,088 0,021 0,038 0,039
Resultados y Discusión
131
inducir la perdida de resistencia del cultivar ‘Willians’ a la infección por poblaciones de FOC
molecularmente próximas a la raza 1.
Por otro lado, la anóxia radical no produce la muerte de la planta de platanera a corto plazo (6
meses) en pruebas “in vitro” realizadas en laboratorio, aunque si induce al amarilleo foliar. No
obstante, como ya se ha indicado, en ninguno de los casos hemos obtenido los síntomas
clásicos de FMP ni de MP, por lo que los resultados de este ensayo no son concluyentes y se
invalidan como prueba de patogenicidad, al menos para FOC en platanera bajo estas
condiciones. Las pruebas de patogenicidad in vitro, sí han sido útiles en otros patosistemas.
como demostró Durán González (2001) llegando a reproducir los síntomas clásicos de la
fusariosis del esparrago mediante la inoculación de F. oxysporum f. sp. asparragui en pruebas
in vitro.
Resultados y Discusión
132
Fig. 32: Inoculaciones in vitro de Fusarium
subglutinans y control
Fig. 33: Inoculación de Fusarium
subglutinans con y sin aceite mineral
Fig. 34: Perspectiva general del ensayo de inoculaciones de aislados
fúngicos sobre cv ‘ Gran Enana’
Resultados y Discusión
133
3.3. Ensayo de patogenicidad de especies fúngicas en invernadero, a temperatura de
25-30ºC bajo condiciones de encharcamiento.
No se obtuvieron los síntomas clásicos, sino pequeños puntos necróticos, generalmente en la
zona de inserción de raíces y leves oscurecimientos vasculares en las zonas contigüas a la
inserción (fig. 34). En la siguiente figura 35 se presentan los resultados de la evaluación de los
síntomas en rizoma observados en el ensayo de patogenicidad desarrollada en invernadero
bajo temperaturas 26º-30ºC.
KW: Prueba no paramétrica múltiple de Kruscal Wallis que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Fig.35. Análisis no paramétrico Kruscal Wallis de los valores (escal INIBAP) de severidad de los síntomas en rizoma observados en plataneras del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP, bajo condiciones controladas de invernadero a 26º-30ºC.
Existen diferencias significativas entre inóculos. Los valores más altos corresponden F.
proliferatum, seguido por F subglutinans, F. solani y F oxysporum (fig 37, 38).
En la siguiente figura 36 se presenta el análisis no paramétrico de la severidad de síntomas en
rizoma de plantas del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP,
bajo condiciones de encharcamiento y no encharcamiento en invernadero climatizado con
temperaturas entre 26º-30ºC.
KW: 25110; p: 0.001**
0 100 200 300
rizom
a
F. proliferatumF. subglutinansF. solaniF. oxysporumIndeterminadoTrichodermaControl turbaControl suelo
Resultados y Discusión
134
226
221riz
oma
U: 25422; p: 0.497 ns
encharcado no encharcado
U: Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Fig.36. Análisis no paramétrico Mann-Whitney U de la severidad de síntomas evaluados mediante la
escala INIBAP. de plataneras del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP, bajo condiciones de encharcamiento y no encharcamiento en invernadero climatizado con temperaturas entre 26º-30ºC.
No existen diferencias significativas entre los tratamientos encharcado y no encharcado para la
variable síntomas en rizoma (fig.36), aunque las plantas cultivadas en suelos encharcados
presentaban valores más altos que las que se encontraban en suelos no encharcados.
Resultados similares se obtuvieron en el ensayo in vitro en plántulas sometidas a situaciones
de hipoxia. Como ya hemos comentado, Lahav et al.(1999) concluyó que el encharcamiento
por sí mismo, no producía síntomas de “Yellow Mat”.
En la tabla 32 se presentan los resultados del ANOVA y valores medios de variables
fenológicas de platanera cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con diferentes especies fúngicas bajo
condiciones de encharcamiento / no encharcamiento del suelo.
Resultados y Discusión
135
Tabla.32. Resultados del ANOVA y valores medios de variables fenológicas de plantas de platanera del cultivar ‘Gruesa’, inoculadas con diferentes especies fúngicas bajo condiciones de encharcamiento / no encharcamiento del suelo
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple Tukey. ANOVA donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
El número de raíces se ve reducido por el efecto encharcamiento del suelo, y por todos los
inóculos probados, excepto por F. solani de forma significativamente diferente de los
controles, los cuales, alcanzan los valores más elevados de esta variable, aunque no existe
interacción entre el tratamiento encharcamiento y los inóculos. Cuando se estudian solo los
controles, ocurre lo mismo con las variables de peso fresco y peso seco de las raíces. Aunque
en este caso si existe interacción entre los tratamientos control y el de encharcamiento (tabla
33).
Tabla.33. Efecto del encharcamiento sobre el peso fresco (pf), peso seco (ps) y altura de plataneras del cultivar ‘Gruesa’ plantadas en suelo natural y en sustrato de turba:picón (70:30), utilizados como control bajo condiciones contraladas de invernadero a 25ºC.
Tratamiento Pf aereo Ps aereo alturacontrol suelo 331,571 30,557 64,107control turba 352,187 29,994 53,893ANOVAtipo de sustrato 0.385 ns 0.862 ns 0.155 ns encharcamiento *** *** ***Interacción 0.091 ns 0.106 ns ***
Tratamiento Raíces Pf raíces Ps raícescontrol suelo 52.286 b 162.643 b 13.143 b control turba 53.938 b 177.688 b 11.875 bF. oxysporum 41.472 a 99.938 a 7.132 aF. Proliferatum 45.063 b 101.594 a 6.580 aF. solani 43.812 ab 94.812 a 5.250 aF. subglutinans 40.295 a 92.089 a 5.786 aTrichoderma 41.812 a 108.563 ab 6.563 aindeterminado 40.812 a 91.625 a 6.911 aANOVAAislados *** *** ***encharcamiento *** *** ***Interacción 0.388 ns 0.024 ** ***
Resultados y Discusión
136
ANOVA donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Las variables de la parte aérea sólo fueron evaluadas para ver el efecto encharcamiento sobre
los controles, pero no el de los inóculos, ya que aparentemente no existían diferencias entre las
alturas de las plantas independientemente del inóculo (tabla 33).
No existen diferencias significativas entre tipos de sustrato para ninguna de las variables
estudiadas, aunque los valores para el peso fresco y el seco de la parte aérea fueron mayores
en sustrato con turba que en suelo. La variable altura se comporta de forma diferente,
encontrando los valores más elevados en las plantas cultivadas en suelo que en las cultivadas
en turba, existiendo interacción del tratamiento encharcamiento con estos sustratos. Puede que
estos resultados sean debidos a la acidificación del sustrato en encharcamiento, siendo más
pronunciado en la turba que en la tierra.
En la tabla 34 se presentan los resultados de los análisis de macro y micronutrientes en las
hojas de plataneras del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con diferentes especies fúngicas asociadas
al FMP y sometidas a encharcamiento del suelo, bajo condiciones controladas de invernadero
a 26º-30º C.
Tabla.34. Valores medios de macro y micronutrientes en hojas de plataneras del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con diferentes especies fúngicas asociadas al FMP y sometidas a encharcamiento del suelo, bajo condiciones controladas de invernadero a 25ºC
ANOVA, ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Sólo aparecen diferencias significativas en los elementos K, Ca, Mg y Cu. No existen
diferencias significativas entre los dos tratamientos para los elementos, N, P, Na, Fe, Mn, y Zn
(tabla 34). Aunque la diferencia no es significativa, el aumento de Na en los suelos
encharcados respecto los no encharcados, es una consecuencia descrita por diferentes autores.
El K y el Cu alcanzan valores mayores en suelos encharcados que en los que no lo están. Por
N % P% K% Ca % Mg ppm Na ppm Fe ppm Mn ppm Zn ppm Cu ppm1: Enchar 3,617 0,36 6,193 0,649 0,589 709,029 287,166 903,4 36,286 14,2592: No Enchar 3,571 0,354 5,634 0,815 0,68 526,889 269,011 710,258 33,75 12,766ANOVA 0,431ns 0,595ns 0,023** 0,012** 0,045** 0,271ns 0,457ns 0,081ns 0,416ns 0,047**
Resultados y Discusión
137
el contrario el Ca y el Mg son menores en los encharcados que en los no encharcados, la
disminución de valoes de Ca y Mg ha dido citada por Dorel y Ozier Lafontaine (1998).
Todos estos valores, se encuentran dentro del rango normal para la platanera y ninguna de las
plantas ensayadas manifestaron síntomas de deficiencias.
La primera conclusión que se desprende de estos resultados, es que ninguno de los aislados
inoculados en estas condiciones ha logrado reproducir los síntomas de FMP, aunque no puede
descartarse el papel de alguno de ellos, en especial F proliferatum, en otras condiciones más
favorecedoras de la expresión sintomática del FMP o otras condiciones de ensayo, como
posiblemente sea la utilización de plantas adultas y en tiempos de ensayo mayores. Por otra
parte, es necesario llegar a conseguir situaciones de encharcamiento que conduzcan a
respuestas más extremas sobre las propiedades físico químicas del suelo y la nutrición de las
plantas, tal y como se halla descrito en la literatura. En nuestro caso hemos podido medir
únicamente el oxigeno disuelto en el agua de riego pero no hemos podido establecer si se ha
producido una situación de hipoxia o anóxia radical, aunque en este sentido las observaciones
sobre el número de raíces emitidas, aumentos en el diámetro, aumento del volumen y del
aerenquima total, así como el aumento de las ramificaciones y los ápices necrosados son
indicadores de que ha habido al menos una baja concentración de oxigeno en suelo.
Los análisis foliares indican que no existe ninguna deficiencia de nutrientes, aunque si se ven
asociados valores bajos de calcio y valores elevados de sodio a situaciones de encharcamiento
como las citadas para Canarias por Suárez y Santana (2002) en platanera.
Resultados y Discusión
138
Fig. 37. Vista general del ensayo de patogenicidad en condiciones de invernadero de diferentes
especies fúngicas en combinación con encharcamiento, sobre cv ’Gran Enana’
Fig.39. Detalle de rizoma con
síntomas de punteado típico de FMP
Fig.38: Detalle de síntomas en rizoma,
avance por el cilindro central de raíz
Resultados y Discusión
139
KW: 21108; p: 0.001**
0 100 200 300
rizom
a
F. proliferatum
F. subglutinans
F. oxysporum
F. solani
Control turba
Control suelo
3.4. Ensayo de patogenicidad de especies fúngicas a temperaturas de 17º-28ºC bajo
condiciones de encharcamiento y con simulación de daños mecánicos.
Como en el ensayo anteriormente descrito, no se han obtenido los síntomas clásicos, sino
pequeños puntos necróticos, generalmente en la zona de inserción de raíces y leves
oscurecimientos vasculares en las zonas adyacentes a la inserción. En la siguiente figura 40 se
presentan los resultados de la evaluación de la severidad de los síntomas:
KW: Prueba no paramétrica múltiple de Kruscal Wallis que lleva asociada una probabilidad donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales)
Fig.40. Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma obtenidos en plataneras cultivar
‘Gruesa’ inoculadas con una selección de especies fúngicas bajo condiciones controladas de invernadero a 17º-28ºC y encharcamiento del suelo.
Existen diferencias significaivas entre los inóculos probados para la variable síntomas en
rizoma (p = 0,001), siendo la inoculación de F. proliferatum el que presentó valores mayores
de severidad de síntomas.
En las siguientes gráficas (fig. 41) se muestran los efectos de los factores encharcamiento
(izquierda) y raíces cortadas (derecha) sobre la severidad de síntomas en rizoma en plantas
inoculadas con especies fúngicas asociadas al FMP.
Resultados y Discusión
140
U: Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Fig.41. Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma obtenidos en plataneras del
cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con una selección de especies fúngicas bajo condiciones controladas de invernadero a 17º-28ºC. A la izquierda: Efecto del encharcamiento del suelo sobre la expresión de los síntomas en rizoma. A la derecha: Efecto del corte de las raíces sobre la expresión de los síntomas en rizoma.
Los resultados obtenidos muestran que ninguno de los inóculos probados reproduce los
síntomas típicos asociados al FMP bajo las condiciones ensayadas (fig.41), aunque existen
diferencias significativas entre aislados para síntomas en rizoma. No exiten diferencias entre
encharcados y no encharcados para síntomas en rizoma y entre raíces cortadas y raíces no
cortadas.
En la siguiente tabla 35, se presentan los resultados obtenidos de la severidad de los síntomas
en rizoma producidos por la inoculación con FOC (referente de patogenicidad) bajo
encharcamiento/no encharcamiento y raíces cortadas/no cortadas
Tabla.35. Prueba Mann-Whitney de los síntomas en rizoma producidos por la inoculación con FOC
bajo encharcamiento/no encharcamiento y raíces cortadas/no cortadas
179,193
170,734
rizom
a
U: 15962; p: 0.341 ns
Encharcado No encharcado
193,42
156,26
rizom
a
U: 18466; p: 0.000***
raíces cortadas no cortadas
Tratamientos Nº muestras Suma Rangos Media Suma Rangosraíz cortada 32 1090,5 34,08raíz no cortada 31 925,5 29,85Mann-Whitney U=562,5 p=0,309 nsEncharcado 32 890 27,81No encharcado 31 1126 36,32Mann-Whitney U= 362 p= 0.040**
FOC rizoma
Resultados y Discusión
141
U:Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales
Los inóculos FOC, produjeron síntomas en rizoma de MP con mayor frecuencia e intensidad
cuando las plantas no se encontraban encharcadas que cuando sí lo estaban (tabla 35). Por el
contrario, en el resto de los inóculos ocurre al revés, aparecen más puntos necróticos en los
rizomas de las plantas que se encontraban encharcadas. Este comportamiento es
significativamente diferente para la interacción del tratamiento encharcamiento con la
presencia por especies fúngicas, aunque no lo es para los inóculos ni para el encharcamiento
por separado (fig. 41). Para FOC, no existen diferencias significativas entre raíces cortadas y
no cortadas mientras que para los otros inóculos si las hay.
A continuación (tabla 36) se presentan los resultados de los analisis de macro y
micronutrientes.
Tabla.36. Resultados del ANOVA y valores medios de macro y micronutrientes de hojas de platanera del cultivar ‘Gruesa’ inoculadas con los hongos seleccionados y sometidas a encharcamiento del suelo bajo condiciones controladas de invernadero a 17º-28ºC.
ANOVA, ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
No existen diferencias significativas para ninguno de los elementos foliares analizados (tabla
36). A continuación se presentan los resultados de la tendencia del pH y de la conductividad
eléctrica (fig.42).
N % P% K% Ca % Mg ppm Na ppm Fe ppm Mn ppm Zn ppm Cu ppm1: Enchar 3,062 0,307 4,832 1,083 0,779 1000,673 345,817 335,306 20,834 7,9172: No Enchar 3,038 0,324 4,874 1,12 0,73 600,674 190,982 272,57 18,888 7,35ANOVA 0,912ns 0,681ns 0,946ns 0,762ns 0,470ns 0,135ns 0,331ns 0,499ns 0,202ns 0,454ns
Resultados y Discusión
142
Fig.42. Tendencia de la diferencia de pH del agua de riego con el pH del agua de drenaje en plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a encharcamiento e inoculadas con diferentes especies fungicas.
La tendencia del pH a lo largo del tiempo es a disminuir, aunque la reducción no es
estadísticamente significativa debido a la incorporación semanal de agua para el
mantenimiento del nivel de encharcamiento (fig. 42).
Fig.43. Tendencia de la conductividad (mS) en plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a encharcamiento e inoculadas con diferentes especies fungicas.
Como se observa en la fig. 43, la conductividad tiende a aumentar a lo largo del tiempo
posiblemente debido a la acumulación de sales en el agua de drenaje de las plantas
encharcadas.
pH
-2,00
-1,50
-1,00-0,50
0,00
0,50
1,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40
días
dif p
H
Control tierra
Control turba
e Fo
1500,13 C7 B2F.subJP-2ria F.prol
1800,6 C3 oqueTricho.1500,13 C9 B1 F.sol
agua sola
Conductividad
-400,00-200,00
0,00200,00400,00600,00
0 5 10 15 20 25 30 35 40
días
dif c
ond
Control tierra
Control turba
e Fo
1500,13 C7 B2F.subJP-2ria F.prol
1800,6 C3 oqueTricho.1500,13 C9 B1 F.sol
Resultados y Discusión
143
4. INTERACCIÓN DE FACTORES ABIÓTICOS Y BIÓTICOS
4.1. Ensayo preliminar con suelos esterilizados y no esterilizados de plantaciones
comerciales
4.1.1. Suelos del Norte de Tenerife
En ningún caso se han obtenido los síntomas clásicos, sino pequeños puntos necróticos,
generalmente en el lugar de inserción de las raíces y leves oscurecimientos vasculares en
zonas contiguas, que en ocasiones se podían seguir desde el cilindro central de las raíces hasta
la zona vascular del rizoma. Los resultados se exponen en la fig. 44
MSR=Media de la suma de rangos .KW=Prueba: de Kruskal Wallis, (no paramétrica múltiple) .Variable de valores discretos (1,2) U= Prueba no paramétrico simple de Mann-Whitney U
Fig.44. Síntomas en el interior del rizoma en plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ en diferentes
suelos esterilizados/no esterilizados del norte de Tenerife. A la izquierda valores para los suelos 1 ( C ), 2 ( E ), 3 ( Z. ). A la derecha, Valores para suelo esterilizado (1) y no esterilizado (2).
En fig. 44 izquierda, según la prueba de Kruskal-Wallis para el análisis no paramétrico de la
variable “síntomas en rizoma”, los tres suelos se comportan significativamente diferentes (p ≤
0.030) con el valor más bajo para el suelo 2.
En fig. 44 derecha, se muestra que, existen diferencias altamente significativas entre los
síntomas producidos en suelos esterilizados (1) y los producidos en suelos no esterilizados (2)
con p = 0,000, correspondiente al valor de U.
MSR de síntomas en rizoma
65,50
55,00
70,00
1
2
3
KW: 7,021; p: 0.030**
MSR de síntomas en rizoma
53,00
74,00
1
2
U: 1323; p: 0.000***
Resultados y Discusión
144
En la figura 45, se presentan las frecuencias de plantas sintomáticas, muertas y sanas.
Fig.45. Frecuencia de plantas con síntomas en rizoma, muertas y sanas en los diferentes suelos del norte
de Tenerife para el tratamiento esterilización/no esterilizacón. Códigos de suelos C=1; E=2; Z=3.
Como se observa en la figura 45, sólo hubo muertes en el suelo C, cuando se encontraba no
esterilizado, y en un caso cuando se encontraba en suelo esterilizado, que corresponde al suelo
1. En los otros suelos no ha habido muerte de plantas, aunque sí se han encontrado síntomas
consistentes en pequeñas zonas necróticas en los suelos no esterilizados.
En la tabla 37 se muestran los resultados del ANOVA para diferentes variables fenológicas
Suelos Norte
-50%
0%
50%
100%
C1N
C1S
C2N
C2S
C3N
C3S
E1N
E1S
E2N
E2S
E3N
E3S Z1
N
Z1S
Z2N
Z2S
Z3N
Z3S
Pic
on
nº plantas sintomas nº plantas muertas nº plantas sanas
Resultados y Discusión
145
Tabla.37. Resultados del ANOVA y valores medios de diferentes variables fenológicas de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ en muestras de suelos en esterilizados y no esterizados, procedentes de 3 plantaciones comerciales de la vertiente norte de la isla de Tenerife con FMP.
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Códigos de los Suelos: 1, 2, 3 seguidos de Tratamiento del suelo se refieren a 1: esterilización; 2: no esterilización.
Los resultados del ANOVA (tabla 37) indican que existen diferencias significativas para
algunas de las variables estudiadas. Cuando se analiza factorialmente, existen diferencias
significativas para el factor suelo en todas las variables excepto para peso fresco raiz/aéreo (Pf
R/A). Existen diferencias significativas entre suelo esterilizado/ suelo no esterilizado para las
variables peso fresco aéreo(Pf), peso seco aéreo (Ps) y la relación del peso fresco raiz/aéreo
(Pf R/A). La interacción suelo por esterilidad/ no esterilidad es significativa para las variables
peso fresco y peso seco tanto aéreo (Pf aéreo y Ps aéreo) como de raíz (Pf raíz y Ps raíz).
El número de hojas emitidas desde el inicio del ensayo hasta el final (dif. nh), es una variable
indicativa del desarrollo fenológico de la planta y resulta muy sensible a situaciones de estrés
(Alves, 1997). El peor comportamiento de esta variable se ha producido en las plantas
cultivadas en el suelo 1 y en el suelo 2 cuando se encontraba sin esterilizar.
En la variable diferencia de altura inicial respecto la final, las plantas cultivadas en el sustrato
control y en el suelo 3, adquieren los valores mayores de crecimiento siendo
significativamente diferente del resto de plantas en los otros suelos y tratamientos,
posiblemente debido a una buena estructura.
suelos norte dif altura dif nh pf arereo ps aereo pf raíz ps raíz pf R/Acontrol 6,300 b 2,467 b 80,400 b 30,073 c 30,067 c 4,667 bc 38,076 c
1.1 4,024 a 1,714 ab 37,050 a 13,120 ab 12,400 a 2,545 a 33,377 a1.2 2,500 a 1,429 a 34,667 a 10,545 a 17,533 ab 3,225 ab 52,905 d2.1 3,786 a 2,048 b 63,048 b 22,183 c 23,476 bc 5,448 c 37,581 b2.2 4,071 a 1,810 ab 54,762 b 19,814 bc 29,190 c 5,679 cd 55,192 d3.1 7,024 b 2,143 b 103,238 c 39,546 d 37,333 c 7,376 d 36,636 a3.2 6,119 b 2,143 b 67,952 b 25,740 c 33,048 c 5,247 c 49,070 d
ANOVAsuelo *** *** *** *** *** *** 0,082nstratamiento 0,050ns 0,103ns *** *** 0,124ns 0,253ns ***suelo*tratamiento 0,118ns 0,503ns *** 0,001** 0,005** 0,003** 0,123ns
Resultados y Discusión
146
El suelo 1, el más tendente a la compactación y con un alto contenido en arcillas, fúe el peor
para las variables de crecimiento y el que presentó un mayor número de muertes de plantas.
Dorel (1993) describió alteraciones en el crecimiento y desarrollo fenológico de plantas de
platanera en condiciones de campo que nosotros hemos observado en este ensayo, atribuyendo
la reducción en los valores de algunas variables a la compactación del suelo.
En la tabla 38 se presentan los resultados del ANOVA para los análisis foliares.
Tabla.38. Resultados del ANOVA para macro y micronutrientes de las plataneras cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelos Norte de Tenerife en condiciones de suelo esterilizado y no esterilizado.
ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050
Como puede observarse (tabla 38), para el factor suelo sólo existen diferencias significativas
para el Mg, Na y Boro. Estos resultados caben dentro de los esperados, ya que diferencias en
Na y en Mg en suelos de platanera en Canarias, han sido encontradas por Alvarez (1999). El
contenido en Na puede jugar un papel muy importante en la capacidad de expansión de las
arcillas, cuando se encuentra en valores elevados y el Ca en valores críticos (Suárez y Santana,
2002). El papel del B en ciertos síndromes como el del corazón hueco de coles, etc. e incluso
en la muerte de raíces y necrosis meristemática del plátano ha sido citado por Batino et al.
(1975) y por Ko et al. (1997). También ha sido implicado en decoloraciones vasculares en
otras especies (Ali y Jarvis, 1988).
En la tabla 39, se presentan los resultados para el magnesio y el boro. En la tabla 40 se
muestran los resultados para el sodio.
Suelo N N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Mn (ppm) Zn (ppm) B (ppm)suelo 0,462ns 0,217ns 0,382ns 0,396ns 0,020** 0,010** 0,279ns 0,836ns 0,269ns 0,048**trat 0,580ns 0,252ns 0,881ns 0,509ns 0,491ns 0,040** 0,932ns 0,077ns 0,134ns 0,172nssuelo*trat 0,502ns 0,934ns 0,518ns 0,813ns 0,980ns 0,023** 0,963ns 0,986ns 0,991ns 0,547ns
Resultados y Discusión
147
SUELO Mg (%) B(%)
1 0.608 45.73
2 1.090 32.80
3 0.573 44.45
Tabla.39. Valores medios de magnesio y boro de muestras foliares combinadas de platanera cultivadas en suelos del Norte de la Isla de Tenerife
Tabla.40. Valores medios de Na (ppm) de muestras foliares combinadas de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelos del norte de Tenerife en condiciones de suelo esterilizado/no esterilizado.
SUELOS TRATAMIENTOS
1 2 3 1 2
Na (ppm) 1898.4 611.383 397.283 559.544 1378.500
Las plantas cultivadas en el suelo 2, presentan los valores menores de boro (B), pero en este
suelo fue donde la expresión de síntomas en rizoma fue menor y no hubo ninguna planta
muerta.
El suelo 1 es el que presenta un mayor contenido en sodio (Na) y en este suelo fue donde se
observaron más muertes, aunque estos valores se encuentran dentro del rango tolerado por la
platanera (tabla 40).
Tanto en suelos esterilizados y como no esterilizados, los valores de todos los elementos se
encuentran dentro de los rangos establecidos como normales para la platanera en todos los
tratamientos. Se puede deducir que no existe ningún factor nutricional que conduzca a la
expresión de las necrosis en las inserciones de las raíces ni a los oscurecimientos vasculares en
rizoma observados en este ensayo.
Estos resultados indican que la estructura del suelo juega un papel importante en la expresión
de síntomas, ya que incluso esterilizado, el suelo 1 es el que presenta valores más bajos para
algunas variables y no puede descartarse que algún factor abiótico esté implicado en la
expresión de los síntomas evaluados en este ensayo, aunque las necrosis observadas en
rizoma, no fueron las típicas del FMP.
Este suelo 1 fue el que también presentó un mayor número de muerte de plántulas en
condiciones de suelo natural. Por este motivo se planteó otro ensayo de mejora de la estructura
Resultados y Discusión
148
del suelo por adición de “picón” para determinar si el número de plantas muertas y de plantas
con presencia de necrosis en el rizoma estaba relacionado con la estructura del suelo y si se
mantenía que los síntomas aparecían únicamente en el suelo no esterilizado.
Según los resultados cabria pensar que existe algún factor biótico integrante de la microflora
del suelo responsable al menos de las necrosis en las inserciones de raíces y oscurecimientos
vasculares en rizoma, ya que estos no pueden explicarse únicamente por la mala estructura del
suelo. Los resultados de las pruebas de patogenicidad demostraron que especies fúngicas
seleccionadas pertenecientes al género Fusarium, producían necrosis similares a las
observadas en estos ensayos. Estos resultados sugerían plantear otros ensayos similares con
otros suelos y otras condiciones de estrés o considerar otros niveles de las ya probadas -quizás
aumentar la duración de los ensayos para obtener la expresión total de síntomas-, dado que los
síntomas obtenidos no eran exactamente los observados en plataneras adultas en condiciones
de campo que sufrían FMP y podríamos estar cometiendo un error al asumir que los síntomas
en rizoma evaluados son con certeza un inicio de la sintomatología del FMP.
4.1.2. Suelos del Sur de Tenerife
En ningún caso se han obtenido los síntomas típicos del FMP. Del mismo modo que en el
ensayo anterior, se obtuvieron puntos necróticos, generalmente en el lugar de inserción de las
raíces y leves oscurecimientos vasculares en zonas contiguas, que en ocasiones se podían
seguir desde el cilindro central de las raíces hasta la zona vascular del rizoma. En el suelo de la
plantación afectada de MP, las plantas presentaron los síntomas típicos. Los resultados se
exponen en la fig. 46.
Resultados y Discusión
149
KW: Prueba de Kruskal Wallis, no paramétrico múltiple que compara los valores discretos que la variable puede adquirir. U: Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U.
Fig.46. Severidad de síntomas externos de platanera del cultivar ‘Gran enana’ en suelos del sur de Tenerife. A la izquierda aparece representadas las medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma y amarilleo encontrados en los tres suelos (1, 2, 3) ensayados. A la derecha aparecen representadas las MSR de los síntomas en rizoma y amarilleo donde 1: es suelo esterilizado y 2 es suelo no esterilizado.
El análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis realizado sobre las variables síntomas en rizoma
y síntomas de amarilleo foliar, muestra que para síntomas en rizoma no existen diferencias
significativas entre los dos suelos evaluados para el FMP (2 y 3), aunque si existen diferencias
significativas para los síntomas de amarilleo foliar. Para el factor esterilización /no
esterilización del suelo existen diferencias significativas tanto para síntomas en rizoma (p=
0,000), como para amarilleo foliar (p= 0,000), obteniéndose los valores más altos en el suelo
no esterilizado. Estos resultados podrían deberse a la presencia de una determinada microflora
en los suelos sin esterilizar o a cambios en la estructura física o en la química de los suelos por
efecto de la esterilización, aunque esto último parece menos probable ya que se hizo al vapor.
Como se demostró en los ensayos de patogenicidad, las plantas inoculadas con algunas
especies fúngicas presentaron pequeñas necrosis similares a las obtenidas en este ensayo, por
lo que podría sugerirse la implicación de algún componente biótico presente en la microflora
MSR de síntomas en rizoma
50,50
76,50
1: estéril
2: no estéril
U: 1165,5; p: 0.000***
MSR de síntoma amarilleo foliar
53,00
74,00
1: estéril
2: no estéril
U: 1323; p: 0.000***
MSR de síntoma en rizoma
39,00
46,00
2
3
U: 735; p: 0.128 ns
MSR de síntoma amarilleo foliar
38,00
47,00
2
3
U: 609; p: 0.005**
Resultados y Discusión
150
en la producción de las necrosis evaluadas como síntomas en rizoma y del amarilleo foliar, ya
que en ningún caso se has producido los síntomas típicos del FMP.
A continuación en la figura 47, se presentan las frecuencias de plantas con síntomas, plantas
muertas y plantas sanas.
Fig.47. Frecuencia de plantas sanas, muertas y con síntomas en rizoma en los diferentes suelos del sur de
Tenerife para los tratamientos esterilización/no esterilización.
Los síntomas en rizoma se han producido solamente en las plantas cultivadas en suelos no
esterilizados, excepto en una planta del suelo JC3 esterilizado. La muerte de plantas se ha
observado sólo en el suelo J3N (no esterilizado). A continuación presentamos en la tabla 41
los resultados del ANOVA.
Tabla.41. Resultados del ANOVA para variables fenológicas de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ en tres suelos del sur de Tenerife bajo condiciones de suelo esterilizado/no esterilizado.
Suelos Sur
-20%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
J1S
J1N
J2S
J2N
J3S
J3N
JC1S
JC1N
JC2S
JC2N
JC3S
JC3N
Pic
on
nº plantas sintomas nº plantas muertas nº plantas sanas
Factores (3 suelos) altura diametro nh pf arereo ps aereo pfraizsuelo *** *** 0,026 ** *** *** ***tratamiento *** *** *** *** *** 0,036 **suelo*tratamiento 0,627 ns 0,071 ns 0,038 ** 0,104 ns 0,145 ns 0,006 **parcela (suelo) 0,621 ns 0,450 ns 0,037 ** 0,346 ns 0,235 ns 0,818 ns
Factores (2 suelos) altura diametro nh pf arereo ps aereo pfraizsuelo 0,583 ns 0,411 ns 0,018 ** 0,321 ns 0,869 ns 0,118 nstratamiento *** *** 0,050 ** 0,327 ns *** 0,957 nssuelo*tratamiento 0,362 ns 0,054 ns 0,050 ** 0,319 ns 0,288 ns 0,124 nsparcela (suelo) 0,470 ns 0,249 ns 0,074 ns 0,413 ns 0,866 ns 0,760 ns
Resultados y Discusión
151
Tabla superior. ANOVA para tres suelos, incluido el procedente de una plantación con MP. Tabla inferior. ANOVA para dos suelos de plantaciones con FMP. Parcelas(Suelos)= Efecto de las parcelas dentro de suelos (“nested”) ANOVA***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. suelos: 1,2,3; tratamiento: esterilización /no esterilización; parcela (suelo): 3 repeticiones de cada suelo evaluadas. Nh: número de hojas emitidas; pf: peso fresco; ps: peso seco.
El análisis de la varianza, indica que cuando consideramos el suelo que procedía de una
plantación afectada por MP (suelo 1), existen diferencias entre los 3 suelos. En general, no se
han obtenido diferencias significativas para la interacción suelo por tratamiento de
esterilización, ni para el factor parcelas dentro de suelos, salvo para la variable número de
hojas en ambos casos y para el peso fresco de la raíz sólo en la interacción suelo por
tratamiento. Las diferencias significativas observadas en las variables estudiadas para el factor
suelo y para el factor esterilización / no esterilización del suelo podrían explicarse por la
expresión de MP en las plantas cultivadas en este suelo. En cambio cuando sólo comparamos
los suelos procedentes de plantaciones que presentaban problemas de FMP (2 y 3), no existen
diferencias entre los suelos. Por lo tanto, las diferencias observadas en las variables de
desarrollo de las plantas entre los tres suelos son debidas al suelo 1, ya que cuando
comparamos solos los suelos 2 y 3 estas diferencias desaparecen (tabla 41).
En la siguiente tabla 42, presenta la reparación de medias de las variables fenotipicas de la
interacción suelos bajo y el factor esterilización / no esterilización del suelo.
Tabla.42. Valores medios para diferentes variables fenológicas de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ en tres suelos del sur de Tenerife bajo condiciones de esterilización/no esterilización.
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. Códigos de los Suelos: 1, 2, 3 seguidos de 1: esterilización; 2: no esterilización. Nh: número de hojas emitidas; pf: peso fresco; ps: peso seco.
suelos sur altura diametro nh pf arereo ps aereo1.1 36,976 c 35,081 d 9,667 c 164,135 c 69,511 c1.2 32,452 bc 32,067 cd 8,714 ab 139,026 bc 55,921 bc2.1 33,548 c 32,424 cd 9,238 bc 141,561 bc 57,705 bc2.2 28,143 a 26,002 a 8,333 a 90,449 a 28,924 a3.1 33,190 bc 31,466 bc 9,333 bc 130,705 b 53,289 b3.2 29,571 ab 28,359 ab 9,333 bc 98,690 a 32,160 a
Resultados y Discusión
152
La interacción es estadísticamente diferente para todas las variables estudiadas ya que alguno
de los suelos siempre presenta diferencias significativas entre esterilizado y no esterilizado
(tabla 42). Los valores más bajos de altura se registran en el suelo 2 no esterilizado.
Para el resto de variables, diámetro, número de hojas emitidas al final del ensayo y peso fresco
y seco aéreo, el comportamiento de las plantas es similar, se mantiene que los valores más
bajos de las variables fenológicas se dan cuando el suelo (1,2,3) no está esterilizado (trat 2).
Las combinaciones suelos 2.2 y 3.2 presentan los valores más bajos en todas las variables. Los
valores más elevados se dan en las plantas cultivadas en el suelo 1 esterilizado (trat 1), que es
el que presentaba la mejor estructura. Este suelo provenía de una plantación con Mal de
Panamá, que sólo se expresó en las plantas cultivadas cuando el suelo no estaba esterilizado
(1.2).
A continuación se presentan los valores medios de las variables fenológicas para el factor
suelo esterilizado/no esterilizado.
Tabla.43. Resultados del ANOVA y valores medios de difrentes variables fenológicas para el factor suelo esterilizado / suelo no esterilizado de plantas ‘Gran Enana’ en suelos del sur de Tenerife.
ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Nh: número de hojas emitidas; pf: peso fresco; ps: peso seco.
Existen diferencias significativas para todas las variables excepto para el peso fresco de la raíz.
Los valores más altos corresponden al suelo esterilizado. Como ocurrió en el anterior ensayo,
la reducción de los valores de las variables de crecimiento y la obtención de síntomas en
rizoma se ha producido mayoritariamente en los suelos no esterilizados. Estas diferencias
podrían explicarse de la misma manera que en los suelos del norte, podría existir un
componente de la microflora del suelo que pudiera estar afectando negativamente a las plantas
o que estas condiciones abióticas no son las favorables para la expresión del FMP. En la tabla
44 se expresan los resultados de los análisis foliares.
Tabla.44. Resultados del ANOVA y valores medios de micro y macronutrientes de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ en suelos del sur de Tenerife esterilizados y no esterilizados.
3suelos trat altura diametro nh pf arereo ps aereo pfraiz1: estéril 34,571 32,99 9,413 145,467 60,168 29,9692: no estéril 30,056 28,809 8,794 109,388 39,002 33,465ANOVA *** *** 0,001 ** *** *** 0,062 ns
Resultados y Discusión
153
ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Suelo: 1, 2, 3; Tratamiento (trat): esterilización del suelo.
Los análisis foliares muestran que existen diferencias significativas para la mayoría de los
elementos respecto a los diferentes suelos ensayos. Para el tratamiento de esterilización /no
esterilización del suelo no existen diferencias significativas entre los elementos estudiados. En
la interacción de suelo con el tratamiento del suelo no existen diferencias significativas para
los distintos nutrientes salvo para el potasio (tabla 44).
En la tabla 45 se muestran la separación de medias de los nutrientes analizados en muestras
foliares de las plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en los tres suelos
ensayados.
Tabla.45. Valores medios de micro y macronutrientes de muestras foliares combinadas de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ del Sur de la Isla de Tenerife cultivadas
SUELO P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Mn (ppm) B (ppm)
1 0.209 4.360 1.237 1.008 2027.941 248.577 62.758
2 0.224 4.976 1.060 0.840 1770.160 163.9 52.071
3 0.292 4.848 1.377 0.585 681.900 67.15 77.200
Resultados basados en muestras foliares combinadas de 21 repeticiones por suelo.
Considerando en conjunto los suelos del norte y del sur, podemos decir que en ningún caso se
han producido los síntomas típicos del FMP, sino pequeñas necrosis y algunos amarilleos
foliares. En ambos casos, esos síntomas fueron más evidentes para casi todas las variables
estudiados en los suelos no esterilizados. Asimismo, también en los dos grupos de suelos
existen diferencias significativas para algunos macro y micronutrientes, pero esas diferencias
no existen si se considera el factor esterilización/ no esterilización del suelo. Los síntomas no
típicos se han dado en suelos no esterilizados y no existen diferencias significativas para todos
Suelo S N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Mn (ppm) Zn (ppm) B (ppm)suelo 0,367ns *** 0,025** 0,022** 0,050** *** 0,563ns 0,002** 0,857ns 0,039**trat 0,274ns 0,225ns 0,274ns 0,914ns 0,392ns 0,071ns 0,201ns 0,268ns 0,476ns 0,071nssuelo*trat 0,337ns 0,092ns 0,050** 0,441ns 0,840ns 0,236ns 0,270ns 0,248ns 0,211ns 0,612ns
Resultados y Discusión
154
los elementos entre suelos esterilizados y no esterilizados, excepto en la interacción
Suelo*Tratamiento para el potasio.
Estos resultados sugieren que en los suelos no esterilizados, pueden haber factores bióticos
que podrían influir en que las plantas mostrasen una disminución del vigor de crecimiento y
desarrollo -fenómeno asociado al FMP y a otras situaciones de estrés- y en que un mayor
número de plantas manifestasen puntos necróticos en el rizoma que podrían corresponder a un
inicio de los síntomas de FMP, así como un mayor número de muertes. El hecho de que sólo
ocurra cuando el suelo no está esterilizado indica que podría estar implicado algún organismo
presente en la microflora del suelo. Por otra parte, estos resultados demuestran que si se tratase
de un patógeno similar a FOC, los síntomas se hubieran reproducido del mismo modo que en
el suelo 1, procedente de una plantación afectada de MP. Los oscurecimientos vasculares tanto
en el punto de inserción de las raíces como los que se extienden hasta el anillo vascular del
rizoma observados, podrían estar causados, entre otras, por especies de Fusarium como las
que se han descrito asociadas a daños por nemátodos (Vovlas et al., 1994) o las citadas para
espárrago (Elena y Kranias, 1996). Varias especies de Fusarium han sido citadas para los
suelos de platanera por Hernández (1997) y como se ha visto en el apartado anterior se aíslan
con bastante frecuencia de raíz, rizoma y pseudotallo. Algunas de esas mismas especies
produjeron síntomas similares en las pruebas de patogenicidad.
No obstante, tampoco podría excluirse una causa abiótica (Bell, 1980), como lesiones de las
raíces contra las paredes de la maceta, estrés por el tamaño reducido de la maceta, efecto de
lenta compactación del suelo, etc., problemas habituales en el cultivo en macetas de muchas
especies vegetales, o podría tratarse de una interacción entre los dos como describen Trapero
Casas (1985) en chick-pea y Blanco (1996); Schippers y Gams (1979) en diferentes
patosistemas.
Resultados y Discusión
155
4.2. Ensayo de mejora de la estructura de un suelo mediante la mezcla con
“picón”(lapilli volcánico).
En la figura 48 se presentan los valores de severidad de síntomas internos y externos
obtenidos.
Como en los ensayos anteriores, en ningún caso se obtuvieron los síntomas típicos de FMP
U:Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p>0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Fig.48. Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma, acortamiento de entrenudos y amarilleo de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelo procedente de la plantación “Carmelo Villa” ( C ), bajo condiciones de suelo esterilizado y no esterilizado.
Existen diferencias altamente significativas entre los síntomas producidos en suelos
esterilizados y los producidos en suelos no esterilizados con p = 0,000, para la variable,
síntomas en rizoma (fig.48). También existen diferencias significativas entre los síntomas de
amarilleo producidos en suelo esterilizado y los producidos en suelos no esterilizados, con p <
0,009. No existen diferencias significativas para la variable de acortamiento de entrenudos
entre las plantas sembradas en suelos esterilizados y las sembradas en suelos esterilizados con
p > 0,725 (fig. 48).
68,31
77,05
68,02
85,14
74,75
85,48
AmarilleoU:3499,5 p:0,009**
Abrochamiento U:2743 p:0,725 ns
RizomaU:3483 p:0,000**
esteril no esteril
Resultados y Discusión
156
KW: 1.397; p: 0.706 ns
79,71
74,50
73,82
75,33
Rizo
ma
dilución 25 dilución 50
dilución 75 no dilución 100
KW: 34.554; p: 0.000***
59,94
63,39
76,30
108,47
Abr
ocha
mie
nto
dilución 25 dilución 50
dilución 75 no dilución 100
KW:12.876; p: 0.005**
65,56
71,65
72,64
96,10
Am
arille
o
dilución 25 dilución 50
dilución 75 no dilución 100
Posiblemente sea debido a que esta variable está más relacionada con las bajas temperaturas
que con la condición de esterilidad / no esterilidad del suelo, y el ensayo se realizó bajo
temperatura de 20-28ºC en condiciones de invernadero.
A continuación presentamos los resultados de los síntomas obtenidos en función del factor
mezcla de suelo (fig. 49).
Fig.49. Síntomas producidos en plataneras cv ‘Gran
Enana’ cultivadas en suelo procedente de la plantación Carmelo Villa, bajo condiciones de mezcla de suelo (25 %, 50 %, 75 % y 100 %) con picón.
Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma, acortamiento de entrenudos y amarilleo (de izquierda a derecha). KW: Prueba no paramétrico múltiple de Kruscal Wallis que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales). Dilución= Mezcla de suelo: 25, 50, 75 y 100 % del suelo.
Existen diferencias significativas en la expresión del amarilleo foliar de las plantas cultivadas
en las diferentes mezclas del suelo (fig.49). El suelo sin mezclar es el que presenta valores más
elevados de síntomas de amarilleo. Las mezclas de suelos 25, 50 y 75% se comportan
similarmente. El valor más bajo de amarilleo se presenta en el suelo diluido al 75%. El suelo
sin mezclar presenta los valores más altos de acortamiento de entrenudos, siendo
significativamente diferente (p= 0,000) del resto de mezclas de suelo (75, 50, 25 %) que se
Resultados y Discusión
157
comportan de forma similar. No existen diferencias significativas entre las diferentes mezclas
del suelo para la severidad de síntomas en rizoma (fig. 49).
El factor mezcla del suelo es significativamente diferente para la severidad de síntomas
externos (fig.49), siendo más bajos los valores cuando el suelo está sin mezclar y más altos
cuando está mezclado al 25%, lo que corrobora la importancia de la estructura del suelo sobre
el desarrollo de las plantas citada por Dorel (1993).
Los síntomas aéreos acortamientos de entrenudos y amarilleo se ven más acentuados en las
plantas sembradas en los suelos no diluidos indistintamente que estén esterilizados o no. La
variable síntomas en rizoma, por el contrario, se ve relacionada con el efecto esterilización del
suelo - no esterilización significativamente, siendo la peor combinación 1.4 (no esterilización,
100%), mientras que no lo esta con el efecto mezcla de suelo.
Malcolm (1991) describe como un fenómeno generalizado que en las plantas sometidas a
compactación producto de situaciones intermitentes de sequía y encharcamiento de un suelo
con elevado contenido en arcillas, se producen heridas y necrosis en las raíces de las plantas.
A continuación se presentan los resultados de las diferentes variables fenológicas estudiadas
bajo los diferentes tratamientos y sus interacciones (tabla 46).
Tabla.46. Resultados del ANOVA para variables fenológicas de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en mezclas de suelos con diferentes cantidades de picón, de tres muestras del suelo de la plantación comercial “Carmelo Villa” situada en el norte de la isla de Tenerife, en condiciones de mezclas de suelos esterilizadas y no esterilizadas.
ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. RepSuelo: repeticiones 1, 2, 3; Tratamiento: suelo esterilizado y suelo no esterilizado. Dilución= Mezcla de suelo: 25, 50, 75 y 100 % del suelo.
Todas las variables estudiadas muestran diferencias significativas para el factor mezcla de
suelo. Existen diferencias significativas en las variables número de hojas, peso seco aéreo y de
ANOVA total altura diametro nh pfaereo psaereo pfraiz psraizesteril 0,692ns 0,365ns 0,024** 0,244ns 0,014** 0,002** ***repsuelo *** *** 0,060ns *** 0,600ns 0,418ns 0,405nsdilución *** *** *** *** *** *** ***repsuelo*esteril *** *** 0,414ns *** 0,057ns 0,419ns 0,439nsesteril*dilución *** *** 0,189ns *** *** 0,002** 0,048**repsuelo*dilución 0,066ns 0,283ns 0,193ns 0,014** 0,059ns 0,001** 0,048**repsuelo*esteril*dilución 0,101ns 0,065ns 0,340ns 0,009** 0,322ns 0,001** 0,008**
Resultados y Discusión
158
raíz, así como en el peso fresco aéreo para el factor suelo esterilizado / no esterilizado. Se
observa que en las variables fenológicas, que el suelo sea no esterilizado es peor que lo sea
esterilizado, exceptuando las variables de las raíces (peso fresco y seco) que se ven afectadas
negativamente cuando el suelo esta esterilizado. La interacción esterilización*mezcla de suelo
es significativa para las variables altura, diámetro, peso fresco y peso seco tanto aéreo como
de raíz.
A continuación se desarrolla la separación de medias para el factor mezcla de suelo (tabla 47).
Tabla.47. Valores medios de diferentes variables fenológicas de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ en diferentes mezclas de suelos con picón, de un suelo del Norte de Tenerife
ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Mezcla de suelo: 25, 50, 75 y 100 % del suelo. Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple Tukey
Cuando los suelos ensayados se encuentran sin mezclar, todas las variables estudiadas se ven
reducidas significativamente (tabla 47). Las mezclas de suelos al 25 y 50 % del suelo, mejoran
los valores alcanzados por las variables. Los suelos sin mezclar mostraban gran compactación,
elevado contenido en arcillas y mal drenaje. Estos resultados indican que la estructura del
suelo es un factor del suelo que afecta a las variables de crecimiento de las plantas y que
mejorando la estructura de un suelo que contiene inicialmente alto contenido en arcillas, puede
mejorarse el desarrollo de las plantas cultivadas en él (tabla 47), aunque se sabe que estas
mejoras son casi imposibles de introducir en condiciones de campo (Mª Carmen Cid,
comunicación personal). El picón, resulta un elemento inerte que confiere más porosidad y
permeabilidad al suelo, evitando o retardando la compactación y por tanto sus consecuencias
estresantes para la planta.
dilución % altura diametro nh pfaereo psaereo pfraiz psraiz25 32,081 c 30,783 c 10,167 b 113,166 bc 10,730 b 34,625 b 3,975 c50 31,675 bc 31,136 c 10,050 b 119,145 c 11,103 b 34,548 b 3,587 bc75 28,894 b 28,308 b 9,636 ab 99,692 b 10,324 b 29,472 b 3,092 ab100 24,931 a 25,059 a 9,389 a 67,426 a 6,362 a 20,491 a 2,385 a
ANOVA *** *** *** *** *** *** ***
Resultados y Discusión
159
A continuación se muestra el comportamiento de las variables estudiadas bajo los diferentes
tratamientos y sus interacciones, desarrollando la separación de medias para la interacción de
los factores mezcla de suelo* esterilización (tabla 48).
Tabla.48. Resultados del ANOVA para variables fenológicas de plantas del cultivar ‘Gran enana’ en diferentes mezclas de suelos con picón, de un suelo del Norte de Tenerife, parala infección mezcla de suelo por esterilización del suelo.
En la siguiente tabla 49 se muestran los valores medios de las variables fenológicas en la
interacción mezcla del suelo/ tratamiento de esterilización del suelo.
Tabla.49. Valores medios de diferentes variables fenológicas de plantas del cultivar ‘Gran enana’ en diferentes mezclas de suelos con picón, de un suelo del Norte de Tenerife, parala infección mezcla de suelo por esterilización del suelo.
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Códigos de Tratamiento se refieren a 1: esterilización; 2: no esterilizados seguidos de las Mezclas de suelos del suelo: 1 (25%), 2 (50%), 3 (75%), 4 (100%).
Es significativa la interacción entre el factor mezcla de suelo y el de esterilidad con p*** en
las variables altura, diámetro, peso fresco y seco aéreo y en peso fresco de las raíces (tabla 48).
Los valores más bajos de todas las variables corresponden a las plantas cultivadas en el suelo
no esterilizado que se encuentran sin mezclar, 2.4, siendo significativamente diferente del
resto de tratamientos, excepto en la altura que se comporta como el 1.4, suelo sin mezclar
esterilizado. Este fenómeno puede ser debido a que al factor mezcla del suelo, o sea su textura
dilución/esteril altura diametro nh pfaereo psaereo pfraiz psraiz1.1 31,519 bcd 30,457 bc 10,429 b 111,999 cd 11,705 c 36,170 d 4,326 c1.2 28,382 bc 29,191 bc 9,941 ab 95,168 bc 9,509 bc 32,755 bcd 3,477 bc1.3 29,182 bcd 27,614 b 9,818 ab 96,998 bc 11,809 c 32,895 bcd 3,705 bc1.4 27,000 ab 27,965 b 9,650 ab 78,822 ab 7,987 b 24,884 b 2,955 b2.1 32,643 cd 31,110 bc 9,905 ab 114,332 cd 9,756 bc 33,080 cd 3,623 bc2.2 34,109 d 32,573 c 10,130 b 136,867 d 12,280 c 35,874 d 3,667 bc2.3 28,750 bc 28,655 b 9,545 ab 101,039 bc 9,581 bc 27,761 bc 2,785 ab2.4 22,344 a 21,427 a 9,063 a 53,179 a 4,331 a 15,001 a 1,673 a
ANOVA altura diametro nh pfaereo psaereo pfraiz psraizesteril 0,601ns 0,556ns 0,039** 0,240ns 0,016** 0,010** 0,001**dilución *** *** *** *** *** *** ***esteril*dilución *** *** 0,184ns *** *** 0,014** 0,072ns
Resultados y Discusión
160
y estructura sea una característica que influya sobre el desarrollo de la planta, más que la
microflora que pueda haber en dicho suelo (tabla 49).
4.3. Ensayo de encharcamiento del sustrato durante diferentes tiempos (2, 4, 6 y 24h)
en macetas de 5 litros de capacidad.
Como en todos los ensayos anteriores, no se han producido los síntomas típicos de FMP
Medias de la suma de rangos (MSR) de amarilleo foliar y síntomas en rizoma (de izquierda a derecha).KW: Prueba no paramétrica múltiple de Kruscal Wallis que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Fig.50. Severidad de síntomas de amarilleo y necrosis en rizoma producidos en platanera del cultivar
‘Gran Enana’ cultivadas en sustrato tierra/picón bajo condiciones de diferentes tiempos de encharcamiento (2, 4, 6 y 24 h),
Aunque el tratamiento que ha presentado los valores más elevados de amarilleo es el de
encharcamiento durante 24 h, y los más bajos, el suelo no encharcado, no existen diferencias
significativas entre los diferentes tratamientos (fig.50).
Se detectaron diferencias significativas entre los tiempos de encharcamiento para pequeñas
necrosis del rizoma. Sin embargo no se produjeron los síntomas típicos, quizás para
conseguirlo, se necesiten tiempos superiores (encharcamiento permanente) o la interacción con
algún agente biótico o abiótico distinto de los estudiados hasta el momento. No obstante,
Lahav et al. (1999) observó que el encharcamiento por si mismo no producía los síntomas de
‘Yellow Mat’, desorden con síntomas que pueden considerarse similares a los de FMP.
6,63
9,38
7,75
13
15,75
amar
illeo
KW: 7.433; p: 0.115 ns
0 h 2 h 4 h 6 h 24 h
6,5
6,5
9
14
16,5
rizom
a
KW: 13.063; p:0.011**
0 h 2 h 4 h 6 h 24 h
Resultados y Discusión
161
Los efectos de los tiempos de encharcamiento sobre las variables fenológicas se presentan en
la tabla 50.
Tabla.50. Efecto de diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h) sobre las variables fenológicas de plataneras cv ‘Gran Enana’.
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo realizado en macetas de 5l de capacidad. Tratamientos de encharcamiento durante 0, 2, 4, 6 y 24 h; ‘enchar5l horas’= encharcamiento en macetas de 5 litros de capacidad durante diferentes tiempos en horas; nh= número de hojas; n raices= número de raíces.
Para todas las variables estudiadas el valor más bajo se obtiene en las plantas sometidas a
encharcamiento de 24 h a días alternos, siendo significativamente diferente del resto de
tratamientos (tabla 50). El número de raíces resulta ser una variable muy afectada por el
aumento del tiempo de encharcamiento, aunque se produce solapamiento entre los efectos del
tiempo de encharcamiento, ya que por un lado no existen diferencias entre 24, 6,4 y 2 h y por
otro lado por otro tampoco existen entre 0,2,4,y 6 h. Existen diferencias significativas entre los
tiempos extremos de 0 y 24 h de encharcamiento (tabla 50).
En la tabla 51 se presentan los resultados para las variables fenológicas estudiadas.
Tabla.51. Efecto de diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h) sobre las variables de peso fresco (pf) y peso seco (ps) en diferentes órganos de plataneras del cultivar ‘Gran Enana’.
enchar5l horas Pf pseud Pspseudo Pf aereoT PsaereoT Pf raíz Ps raíz Pf aereoT/raíz Ps aereoT/raíz0 763,525 b 34,538 ab 1234,907 b 74,720 b 317,242 b 27,327 b 3,944 ab 2,924 a2 878,587 b 39,993 ab 1356,150 b 83,642 b 273,122 b 18,690 ab 4,970 bc 4,637 ab4 990,390 b 46,053 b 1528,847 b 90,370 b 261,135 ab 17,205 ab 5,890 c 5,524 b6 899,280 b 41,200 ab 1396,080 b 83,862 b 254,830 ab 17,625 ab 5,520 c 4,778 b24 365,235 a 26,222 a 566,820 a 46,073 a 181,755 a 12,230 a 3,123 a 3,896 ab
ANOVAtratamiento *** 0,016** *** *** 0,004** 0,034** *** 0,005**
enchar5l horas altura diametro nh n raices area foliar0 56,25 b 79,497 b 16,00 b 93,00 b 7193,70 ab2 56,25 b 84,778 b 16,25 b 79,00 ab 9898,80 b4 58,25 b 82,113 b 16,00 b 84,00 ab 9995,00 b6 55,25 b 83,025 b 16,00 b 81,75 ab 9732,25 ab24 40,50 a 67,270 a 13,25 a 58,75 a 4933,25 a
ANOVAtratamiento *** *** *** 0,031** 0,018**
Resultados y Discusión
162
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo realizado en macetas de 5l de capacidad. Tratamientos de encharcamiento durante 0, 2, 4, 6 y 24 h
Existen diferencias significativas entre tiempos de encharcamiento para todas las variables
estudiadas (tabla 51). Para peso fresco del pseudotallo, peso fresco total y peso seco total, se
obtiene un comportamiento similar al observado para altura, diámetro y número de hojas, es
decir diferencias entre 24 h y cada uno de los tiempos 0,2,4 y 6 h, que a su vez no presentan
diferencias entre sí. El peso fresco y el peso seco de la raíz tienen un comportamiento similar
al número de raíces, habiendo diferencias entre los valores extremos, pero también
solapamientos.
A continuación se presentan los resultados de los análisis de micro y macronutrientes en el
pseudotallo de las plantas utilizadas en el ensayo.
Tabla.52. Valores medios de micro y macronutrientes del pseudotallo de plataneras del cultivar ‘‘Gran Enana’’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo realizado en macetas de 5l de capacidad. Tratamientos de encharcamiento durante 0, 2, 4, 6 y 24 h.
Los análisis realizados para evaluar el estado nutricional de las plantas en cada uno de los
diferentes tratamientos muestran que en el caso del pseudotallo, todos los elementos se ven
afectados negativamente por el encharcamiento de 24 h (tabla 52). En general el valor de cada
elemento se reduce cuando aumenta el tiempo de encharcamiento excepto en el caso del Mn,
cuyos valores aumentan cuanto más tiempo de encharcamiento se aplica sobre las plantas. El
valor más elevado de todos los elementos corresponde a los tratamientos control y 2h de
encharcamiento. Los elementos Mg, Fe y Mn no presentan diferencias significativas en
pseudotallo. Resultados similares fueron obtenidos por Dorel (1993).
N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Zn (ppm) Mn (ppm)enchar horas
0 2,375 b 0,448 c 9,067 b 0,758 c 0,468 a 1884,8 ab 143,0 a 126,0 c 69,75 a2 2,388 b 0,345 b 9,555 b 0,695 bc 0,483 a 2185,5 ab 107,3 a 103,0 bc 63,5 a4 2,362 b 0,328 b 9,313 b 0,572 ab 0,345 a 2248,3 b 141,3 a 46,5 a 70,8 a6 2,600 b 0,305 b 9,163 b 0,515 a 0,342 a 2277,5 b 139,5 a 65,5 ab 73,0 a
24 1,725 a 0,203 a 4,573 a 0,428 a 0,238 a 1607,8 a 101,0 a 43,0 a 78,8 aANOVA *** *** *** *** 0,052ns 0,022** 0,337ns 0,001** 0,454ns
analisis del pseudotallo
Resultados y Discusión
163
En la tabla 53 se presentan los resultados de los análisis de micro y macronutrientes del nervio
foliar.
Tabla.53. Valores medios de micro y macronutrientes del nervio foliar de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo realizado en macetas de 5l de capacidad. Tratamientos de encharcamiento durante 0, 2, 4, 6 y 24 h.
En el caso del nervio foliar (tabla 53), los elementos N, P, y K mantienen la tendencia de
menor valor a más tiempo de encharcamiento existiendo diferencias significativas entre los
tratamientos. No existen diferencias significativas para el Ca, Mg, Fe y Zn, aunque la
tendencia es la misma que para los anteriores. Resaltar que para el Na y Mn la tendencia se
invierte, a mayor tiempo de encharcamiento aumentan los valores de estos elementos en este
órgano existiendo diferencias significativas entre tiempos de encharcamiento. Datos similares
en cultivo de plataneras adultas cultivadas en condiciones de campo fueron descritos por Dorel
(1993).
A continuación se presentan los resultados de los análisis foliares de la última hoja emitida o
“cigarro puro” (tabla 54).
N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Zn (ppm) Mn (ppm)enchar horas
0 1,825 b 0,475 c 9,995 b 0,952 a 0,340 a 1045,0 a 49,75 a 18,00 a 76,50 a2 1,800 b 0,410 b 10,482 b 0,860 a 0,325 a 1054,0 a 58,00 a 23,75 a 71,50 a4 1,800 b 0,420 bc 10,752 b 0,900 a 0,360 a 1306,3 ab 64,50 a 26,00 a 87,5 a6 1,838 b 0,390 b 10,750 b 0,870 a 0,290 a 1326,8 ab 61,25 a 21,50 a 90,50 a
24 1,238 a 0,212 a 6,772 a 0,848 a 0,315 a 1506,3 b 49,50 a 24,50 a 148,75 aANOVA *** *** *** 0,717ns 0,592ns 0,006** 0,229ns 0,212ns ***
analisis del nervio foliar
Resultados y Discusión
164
Tabla.54. Valores medios de micro y macronutrientes de “cigarro puro” (última hoja emitida sin desarrollar) de las plataneras del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo realizado en macetas de 5l de capacidad. Tratamientos de encharcamiento durante 0, 2, 4, 6 y 24 h.
En el análisis del “cigarro puro” (tabla 54), se mantiene la tendencia de que a mayor tiempo de
encharcamiento, menor es el contenido en N, P, K y Fe pero sólo existen diferencias
significativas para el P, Fe y Zn. No existen diferencias significativas para el Ca, Mg y Na. El
Mn continua con la tendencia de que a más tiempo de encharcamiento, mayor contenido, pero
en este caso no existen diferencias significativas entre tratamientos.
En la tabla siguiente se presentan los resultados para el análisis en macro y micronutrientes en
el peciolo foliar (tabla 55).
Tabla.55. Valores medios de micro y macronutrientes del peciolo foliar de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo realizado en macetas de 5l de capacidad. Tratamientos de encharcamiento durante 0, 2, 4, 6 y 24 h.
En el pecíolo (tabla 55), existen diferencias significativas entre tratamientos para N, P, K y Ca.
A mayor tiempo de encharcamiento, menor es el contenido de los nutrientes excepto para el
N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Zn (ppm) Mn (ppm)enchar horas
0 3,450 a 0,467 b 6,74 a 0,16 a 0,34 a 525,75 a 98,50 b 40,75 c 66,50 a2 3,317 a 0,397 ab 6,84 a 0,14 a 0,35 a 594,67 a 84,00 b 34,33 bc 53,67 a4 3,367 a 0,410 b 6,68 a 0,15 a 0,28 a 568,33 a 86,00 b 26,67 ab 58,33 a6 3,633 a 0,407 b 6,94 a 0,15 a 0,34 a 621,00 a 94,00 b 30,00 bc 67,33 a
24 2,017 a 0,277 a 4,95 a 0,14 a 0,22 a 542,00 a 53,33 a 14,67 a 79,67 aANOVA 0,184ns 0,004** 0,083ns 0,947 ns 0,054ns 0,451ns 0,003** 0,001** 0,191ns
analisis del puro foliar
enchar horas N (% ) P (% ) K (% ) Ca (% ) Mg (% ) Na (ppm) Fe (ppm) Zn (ppm) Mn (ppm) K/Ca+Mg0 1,825 b 0,357 c 10,313 b 0,830 b 0,405 a 1658,75 a 44,75 a 15,00 a 75,75 b 8,748 a2 1,813 b 0,257 b 10,505 b 0,645 ab 0,287 a 1772,25 a 54,00 a 14,25 a 71,75 ab 11,325 a4 1,950 b 0,262 b 10,533 b 0,643 ab 0,270 a 1454,50 a 54,75 a 15,25 a 86,50 a 11,596 a6 1,888 b 0,260 b 10,543 b 0,753 ab 0,255 a 2371,25 a 57,75 a 13,50 a 93,25 a 10,584 a24 1,338 a 0,147 a 5,828 a 0,600 a 0,165 a 1664,25 a 48,25 a 14,50 a 130,00 a 8,077 a
ANOVAtratamiento *** *** *** 0,024** 0,215ns 0,345ns 0,497ns 0,744ns *** 0,074ns
Resultados y Discusión
165
Mn, existiendo diferencias significativas entre el tratamiento de 24 h, donde alcanza el valor
más alto, y el resto de los tratamientos. La relación K/Ca+Mg no es significativamente
diferente entre tratamientos. Los valores para el Ca son relativamente bajos en esta hoja
“puro” respecto a los valores alcanzados en los otros organos analizados, posiblemente debido
a que esta hoja es una hoja en crecimiento activo aún no desarrollada.
En la tabla 56 se presentan los resultados para el limbo foliar.
Tabla.56. Valores medios de micro y macronutrientes de limbo foliar de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tiempos de encharcamiento (0, 2, 4, 6 y 24 h).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo realizado en macetas de 5 litros de capacidad. Tratamientos de encharcamiento durante 0, 2, 4, 6 y 24 h.
Por último en el limbo foliar (tabla 56) la tendencia es que a mayor tiempo de encharcamiento,
menores son los valores de los nutrientes. Esta relación se mantiene para el N, P, K, Ca, Mg y
Fe pero sólo es significativamente diferente para el P, K, Ca y el Mg. El Na y el Zn se
comportan al revés en este órgano, a mayor tiempo de encharcamiento, mayores son los
valores alcanzados de estos elementos, pero sólo es significativamente diferente para el Na. El
Mn también mantiene esta tendencia pero sólo para los tiempos 2, 4 y 6 horas, ya que en el
tratamiento de 24h disminuye significativamente.
Respecto a los valores de referencia para análisis foliares del limbo, en todos los tratamientos
se observó un exceso de N (3.4-3.8%). La tendencia de este elemento es aumentar cuanto
mayor es el tiempo de encharcamiento, aunque en el tratamiento de 24 h, disminuye sin ser
significativamente diferente al resto de tratamientos. En el caso del P los tratamientos 0, 2, 4 y
6 h de encharcamiento manifiestan un exceso (0,32-0,37 %). En este caso el encharcamiento
durante 24 h ha reducido el P hasta valores adecuados (0.22%). Con el K, ocurre lo mismo que
N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Zn (ppm) Mn (ppm)enchar horas
0 3,662 a 0,378 c 4,912 b 0,982 ab 0,520 ab 614,75 a 132,75 a 25,00 a 127,75 a2 3,725 a 0,340 b 4,935 b 1,072 ab 0,555 b 614,50 a 116,00 a 27,25 a 164,25 ab4 3,750 a 0,328 bc 4,887 b 1,160 b 0,595 b 664,25 a 128,25 a 25,50 a 237,75 c6 3,800 a 0,350 bc 4,662 b 1,102 ab 0,583 b 1769,25 b 138,50 a 28,75 a 210,50 bc
24 3,487 a 0,215 a 3,823 a 0,840 a 0,392 a 1736,00 b 110,50 a 29,75 a 165,50 abANOVA 0,084ns *** 0,001** 0,038** 0,003** *** 0,133ns 0,259ns ***
analisis del limbo foliar
Resultados y Discusión
166
con el P. En el caso del Ca, Na, Fe, Zn y Mn todos los tratamientos se encuentran en un rango
adecuado del mismo modo que el Mg, aunque este elemento puede decirse que se encuentra
ligeramente por encima del rango medio en los tratamientos de 0, 2, 4 y 6 horas de
encharcamiento.
En resumen, para el pseudotallo, nervio foliar y peciolo foliar existen diferencias significativas
entre tratamientos para N, P, y K. Estos resultados podrían explicarse teniendo en cuenta el
abono soluble empleado, ya que contenia valores elevados de N:P:K para plantas jóvenes.
Pese a que en en el abono, no se incorporó una corrección para calcio ni para microelementos,
no se han obtenido niveles bajos ni síntomas de deficiencias en ningún caso.
Para el Ca, un macronutriente muy sensible al encharcamiento, se han encontrado diferencias
en pseudotallo, peciolo foliar y limbo foliar.
En el caso del Na, otro elemento sensible al encharcamiento, se observan diferencias
significativas para el pseudotallo, nervio foliar y limbo foliar. El Fe sólo presenta diferencias
significativas en el “cigarro puro”. El Zinc, presenta diferencias significativas en el
pseudotallo y el “cigarro puro”. El Mn presenta diferencias significativas para el limbo foliar y
el peciolo.
Las variables relacionadas con la raíz son las más afectadas por el encharcamiento aunque 24
h es igual a 6 a 4 y a 2 y por otra parte 0 h es igual a 2, 4 y 6 h. A mayor tiempo de
encharcamiento menores son todas las variables fenológicas estudiadas. Los tiempos
establecidos de encharcamiento intermedios (2, 4 y 6 h) no son rangos adecuados para ver el
efecto del encharcamiento en la platanera, pues no existen diferencias significativas entre
ellos. No obstante, en la mayoría de los órganos estudiados los análisis foliares muestran que
al menos para NPK, existen diferencias significativas, con los valores más bajos para 24 h, en
el que parece que comienzan a darse bloqueos nutricionales que se reflejan con valores
menores, aunque no llegan a ser extremos para que se manifiesten en forma de deficiencia.
Este efecto es significativo para el P, independientemente del órgano que se analice.
Aunque las variables fenológicas de la platanera son sensibles a tiempos de encharcamiento
superiores a 24 h, este tiempo no es letal, presumiblemente por la capacidad de adaptación de
la platanera, utilizando estrategias de adaptación como incrementando el volumen de
aerenquima lo que permite que las raíces reciban O2 desde las hojas (Aguilar et al., 1999).
Resultados y Discusión
167
5,5
13,5
5,5
9,5
A
B
C
D
KW: 11; p: 0.012**
síntomas en rizoma
De este ensayo se desprende que se deben fijar tiempos de encharcamiento mayores de 1 día, y
ver cual es el límite soportable por la planta, y si este límite conduce a manifestaciones de
síntomas asociados al FMP por sí sólo. Se puede concluir que en sustrato de picón (inerte y
esterilizado), con diferentes tiempos de encharcamiento (0-24h), y con un abono sin
correcciones para Ca ni micronutrientes no se reproducen los síntomas asociados al FMP.
4.4. Ensayo de encharcamiento permanente e intermitente del sustrato turba:picón
(70:30) en contenedores de 50 litros de capacidad.
Como en todos los ensayos descritos hasta el momento, no se obtuvieron los síntomas típicos,
aunque se observaron algunas decoloraciones en rizoma más parecidas a esos síntomas. El
análisis de la severidad de los síntomas en rizoma se representa en la fig 51.
Fig.51. Severidad de síntomas en
rizoma de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en sustrato turba/picón (70:30) bajo condiciones de diferentes tiempos de encharcamiento.
( A: 1/2 maceta encharcada total (17.5 cm); B: encharcamiento total (34 cm); C: control; D: encharcamiento 5 días/ 2 días aireación ). Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma. KW: Prueba no paramétrica múltiple de Kruscal Wallis que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Existen diferencias significativas entre tratamientos, los valores más altos corresponden al
tratamiento B, que es el que ha presentado unas decoloraciones en rizoma más similares a las
clásicas de FMP, sin ser iguales (fig. 51), existiendo diferencias significativas con el resto de
tratamientos. Los tratamientos A y el C son los que han presentado ausencia o menor
severidad de síntomas en rizoma, mientras que el tratamiento B seguido del D han presentado
mayor intensidad de síntomas según la escala INIBAP.
Resultados y Discusión
168
En la tabla 57 se presentan los resultados del ANOVA para las variables fenológicas
estudiadas.
Resultados y Discusión
169
Tabla.57. Resultados del ANOVA y valores medios de diferentes variables fenológicas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ para el factor tratamiento de encharcamiento (A, B, C y D)*
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo diseñado en cuadrado latino realizado en macetas de 50 l de capacidad. *Tratamientos A: encharcamiento intermitente (5 días/ 2 días aireación) hasta la mitad de la maceta (17,5 cm); B: encharcamiento permanente total (34 cm); C: control; D: encharcamiento total (34 cm) 5 días/ 2 días aireación.
Para el diámetro y para el área foliar los tratamientos son iguales dos a dos : A=C y B=D Para
la altura y el número de hojas, existen solapamientos entre tratamientos Para ninguna de las
variables existen diferencias significativas entre filas y columnas salvo para área foliar dentro
de filas (tabla 57)
En la tabla 58 se presentan los resultados para las variables pesos frescos de pseudotallo, hoja
rizoma y raíz de las plantas sometidas a los distintos tratamientos de encharcamiento.
Tabla.58. Efecto de diferentes tratamientos de encharcamiento (A, B, C y D) sobre las variables de peso fresco (pf) y peso seco (ps) en diferentes organos de platanera del cultivar ‘Gran Enana’
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo diseñado en cuadrado latino realizado en macetas de 50 l de capacidad. *Tratamientos A: encharcamiento intermitente (5 días/ 2 días aireación) hasta la mitad de la maceta (17,5 cm); B: encharcamiento permanente total (34 cm); C: control; D: encharcamiento total (34 cm) 5 días/ 2 días aireación.
enchar50l dif altura dif diametro dif nh area foliarA 89,75 b 172,195 b 10,00 ab 8246,8 bB 40,25 a 98,186 a 6,00 a 3980,0 aC 84,75 ab 162,772 b 11,75 b 7267,1 bD 62,25 ab 111,877 a 6,75 a 4727,4 a
ANOVAtratamiento 0,042** *** 0,011** ***
fila 0,939ns 0,413ns 0,614ns 0,036**columna 0,418ns 0,196ns 0,064ns 0,068ns
enchar50l Pf pseud Pf hoja Pf rizoma Pf raíz Ps raízA 8675 b 3500 b 3399,75 b 1613,49 b 145,015 bB 2422 a 1079 a 1325,99 a 625,93 a 59,608 aC 8175 b 2850 b 2315,65 ab 1127,22 ab 116,593 abD 3450 a 1650 a 1228,25 a 725,05 a 68,260 ab
ANOVAtratamiento *** *** *** *** 0,010**
fila 0,132ns 0,065ns 0,022** 0,626ns 0,342nscolumna 0,198ns 0,158ns 0,149ns 0,051ns 0,037**
Resultados y Discusión
170
Para todas las variables fenológicas estudiadas se obtuvieron diferencias significativas entre
tratamientos y no existen diferencias significativas para filas ni para columnas, salvo para el
peso seco de raíz dentro de columnas (tabla 57). Para peso fresco del pseudotallo y peso fresco
de hoja los tratamientos son iguales dos a dos : A=C y B=D. En el resto de las variables, los
valores más altos se obtienen en A y los más bajos en B.
En las variables de peso fresco y aéreo de los diferentes órganos (tabla 58) se mantiene la
tendencia de los tratamientos anteriormente descritas para las variables fenológicas de altura,
número de hojas y número de raíces sanas y total (tabla 58). El peor tratamiento (B) continua
siendo significativamente diferente al mejor (A). El tratamiento C se comporta como el A y el
tratamiento D como B sin existir diferencias significativas, excepto en la variable peso fresco
(pf) de rizoma, en el que el control (C) se comporta como uno de los peores siendo
significativamente diferente del tratamiento A, y en las variables peso seco (ps) de rizoma y
peso seco (ps) de raíz no existen diferencias entre tratamientos.
A continuación se presentan los resultados para las variables referentes a la raíz de las plantas
sometidas a los diferentes tratamientos de encharcamiento (tabla 59).
Tabla.59. Efecto de diferentes tratamientos de encharcamiento (A, B, C y D) sobre variables relacionadas con raíces de platanera del cultivar ‘Gran Enana’.
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo diseñado en cuadrado latino realizado en macetas de 50 l de capacidad. *Tratamientos A: encharcamiento intermitente (5 días/ 2 días aireación) hasta la mitad de la maceta (17,5 cm); B: encharcamiento permanente total (34 cm); C: control; D: encharcamiento total (34 cm) 5 días/ 2 días aireación.
Existen diferencias significativas entre tratamientos para las variables número de raíces sanas,
número de raíces totales y longitud media máxima de las 5 raíces más largas de cada planta
enchar50l n raices T n raices sanas n puntas lesionadas n ramif. sanas n ramif lesionadas Long max raizA 303,00 b 207,25 b 94,00 4,333 19,333 87,175 bB 168,00 a 43,25 a 124,75 3,000 27,000 26,875 aC 253,75 ab 205,75 b 48,00 7,333 4,333 76,625 bD 196,25 ab 104,25 a 92,00 4,667 20,667 39,175 a
ANOVAtratamiento 0,013** *** 0,084ns 0,743ns 0,086ns 0,001**
fila 0,759ns 0,933ns 0,689ns 0,681ns 0,089ns 0,858nscolumna 0,596ns 0,971ns 0,505ns 0,120ns 0,478ns 0,994ns
Resultados y Discusión
171
(tabla 59). Como en otras variable estudiadas, los valores más altos corresponde al tratamiento
A y los más bajos al tratamiento B.
A continuación, en tabla 60 se presentan los resultados de los análisis foliares para el limbo
foliar.
Tabla.60. Analisis de macro y micronutrientes en el limbo foliar de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tratamientos de encharcamiento (A, B, C y D) cultivadas en macetas de 50 l de capacidad en sustrato turba:picón (70:30).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo diseñado en cuadrado latino realizado en macetas de 50 l de capacidad. *Tratamientos A: encharcamiento intermitente (5 días/ 2 días aireación) hasta la mitad de la maceta (17,5 cm); B: encharcamiento permanente total (34 cm); C: control; D: encharcamiento total (34 cm) 5 días/ 2 días aireación.
Los valores más altos se han obtenido en los tratamientos A y C, exceptuando el
microelemento Fe, cuyo comportamiento es inverso, ya que a mayor tiempo de
encharcamiento, mayor es el valor alcanzado en el limbo foliar. Existen diferencias
significativas entre tratamientos para la composición en N, K, Mg y Fe (tabla 60).
Contrariamente a lo ocurrido en el ensayo anterior en macetas de 5 litros de capacidad, no se
han obtenido diferencias para Ca ni para Na. Respecto a los valores de referencia en limbo, el
nitrógeno se encuentra en los valores adecuados sólo en el peor tratamiento (B) ya que este
provocó una reducción en contenido de N respecto al resto de tratamientos que presentaron
exceso de N de forma significativamente diferente. La tendencia de que a más tiempo de
encharcamiento sin aireación, menor es el valor alcanzado de los nutrientes en limbo foliar, se
ha mantenido también en el resto de elementos analizados. Para los elementos P, Ca Na, Zn,
Mn y la relación K/Ca+Mg no existen diferencias significativas entre tratamientos.
En la siguiente tabla 61, se muestran los resultados para los análisis de nutrientes en peciolo.
enchar 50l N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Zn (ppm) Mn (ppm) K/Ca+MgA 3,45 a 0,28 a 4,06 a 0,74 a 0,52 b 518,50 a 94,25 a 16,75 a 328,75 a 3,27 aB 2,11 b 0,22 a 4,52 ab 0,68 a 0,44 ab 577,75 a 105,50 a 19,75 a 351,75 a 4,17 aC 3,21 a 0,30 a 4,79 b 0,70 a 0,50 ab 986,25 a 106,50 ab 17,50 a 374,00 a 4,05 aD 3,29 a 0,31 a 4,72 a 0,64 a 0,43 a 639,25 a 131,25 b 19,50 a 448,75 a 4,57 a
ANOVAtratamiento 0,006** 0,059ns 0,006** 0,885ns 0,021** 0,277ns 0,007** 0,725ns 0,492ns 0,113ns
analisis del limbo foliar
Resultados y Discusión
172
Tabla.61. Analisis de macro y micronutrientes en el peciolo foliar de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ sometidas a diferentes tratamientos de encharcamiento (A, B, C y D) cultivadas en macetas de 50 litros de capacidad en sustrato turba:picón (70:30).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo diseñado en cuadrado latino realizado en macetas de 50 l de capacidad. *Tratamientos A: encharcamiento intermitente (5 días/ 2 días aireación) hasta la mitad de la maceta (17,5 cm); B: encharcamiento permanente total (34 cm); C: control; D: encharcamiento total (34 cm) 5 días/ 2 días aireación.
Sólo existen diferencias significativas entre tratamientos para los elementos Mg y Fe. En
general, la tendencia del Mg se mantiene como el resto de nutrientes, a peores condiciones,
menor es el valor alcanzado. El Fe mantiene la tendencia inversa al resto de elementos, a
peores condiciones mayor es su valor alcanzado en el pecíolo (tabla 61).
El P, se encuentra en valores adecuados en el tratamiento B, pero en exceso en los
tratamientos A, C y D. El K se encuentra en exceso en todos los tratamientos, debido
posiblemente al abonado realizado rico en este elemento y a su acumulación en los
tratamientos sin drenaje. El Ca se encuentra en los niveles adecuados en el tratamiento A, y en
bajos niveles en el resto de tratamientos, posiblemente debido a que el abonado realizado no lo
contenía. El Mg, Na, Fe, Zn y Mn se encuentran en los valores adecuados en todos los
tratamientos. La relación K/Ca+Mg no es significativamente diferente entre tratamientos.
enchar 50l N (%) P (%) K (%) Ca (%) Mg (%) Na (ppm) Fe (ppm) Zn (ppm) Mn (ppm) K/Ca+MgA 0,83 a 0,38 a 6,89 a 0,61 a 0,35 ab 345,0 a 30,5 a 14,5 a 174,5 a 7,24 aB 0,53 a 0,15 a 9,82 a 0,57 a 0,23 a 4389,0 a 70,0 b 14,0 a 148,0 a 11,43 aC 1,40 a 0,39 a 8,45 a 0,63 a 0,39 b 892,0 a 34,5 a 15,5 a 222,5 a 8,21 aD 1,00 a 0,37 a 8,06 a 0,50 a 0,25 ab 843,5 a 35,5 a 17,0 a 224,0 a 10,77 a
ANOVAtratamiento 0,394ns 0,311ns 0,874ns 0,804ns 0,036** 0,511ns 0,003** 0,545ns 0,424ns 0,430ns
analisis del peciolo foliar
Resultados y Discusión
173
4.5. Ensayo de simulación en condiciones controladas de compactación del suelo y
encharcamiento intermitente.
Los síntomas típicos de FMP que incluyen decoloración vascular en rizoma, sólo se
obtuvieron en una de las plantas que también presentó síntomas de colapso y muerte. Como en
anteriores ensayos, en el resto de las plantas sólo se observaron algunos puntos necróticos en
la zona de inserción de las raíces y leves oscurecimientos vasculares en zonas próximas a esas
necrosis.
Tabla.62. Síntomas en rizoma de plantas de platanera de cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelo esterilizado y no esterilizado, sometido a encharcamiento y compactación.
U: Prueba no paramétrica simple de Mann-Whitney U que lleva asociada una probabilidad donde ***: p 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000<p<0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p >0.050 (las dos muestras comparadas son iguales). Medias de la suma de rangos (MSR) de los síntomas en rizoma. Encharcamiento intermitente (Ciclo 1 semana): Riego (600 cc/día) con llave cerrada ➨ (4d) Capa freática alta y Con llave abierta ➨ (3d) sin riego. Se utilizaron macetas de 1.7 l de capacidad, en las que siguiendo la metodología habitual se consiguieron 2 valores de densidad aparente para simular la compactación:: 1500 g de suelo/ 1700 ml: ρ =0.88 g/ml ; 1800 g de suelo/ 1700 ml: ρ= 1.06 g/ml
Como puede observarse (tabla 62), sólo se obtuvieron diferencias significativas para el factor
suelo esterilizado/ suelo no esterilizado, siendo mayor el número de plantas con síntomas en el
tratamiento de suelo no esterilizado. Este hecho sugiere la existencia de una microflora
presente en el suelo no esterilizado, que procedía de una plantación del norte de Tenerife
afectada de FMP. Los síntomas no típicos, podrían corresponder a zonas de inserción de raíces
muertas, que pueden ser colonizados por algunas especies de Fusarium, como las comúnmente
encontradas en nuestros aislamientos. La única planta que presentó síntomas prácticamente
idénticos a los observados en campo estaba en suelo no esterilizado y compactado ( 0.88
tratamientos muestras Suma de rangos media suma de rangosencharcadas 28 795,5 28,4
no encharcadas 28 800,5 28,6Mann-Whitney U 389,5 p 0,938 ns
compactadas 28 798 28,5no compactadas 28 798 28,5
Mann-Whitney U 392 p 1,000 nstierra esteril 28 714 25,5
tierra no esteril 28 882 31,5Mann-Whitney U 308 p 0,010 **
Síntoma en rizoma
Resultados y Discusión
174
g/cm3). Malcolm y Lewis (1991) describen heridas en las raicillas y necrosis en las raíces de
las plantas sometidas a compactación producto de situaciones intermitentes de sequía y
encharcamiento de un suelo con elevado contenido en arcillas. La compactación afecta
negativamente a varias variables fenológicas y ha sido postulada como uno de los factores
abióticos implicados en el FMP y en ‘Yellow Mat’ (Deacon et al., 1985); (Reinking, 1926)
citado por Lahav et al. (1999). En cuanto al factor encharcamiento, nuestros resultados
coinciden con lo citado por Lahav et al. (1999), quien comentó que el encharcamiento por si
mismo no producía los síntomas del “Yellow Mat”, desorden aparentemente similar a al FMP
Tabla.63. Resultados del ANOVA y valores medios de las variables fenológicas de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelos esterilizados y no esterilizados bajo condiciones de encharcamiento intermitente y compactación.
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Ensayo diseñado en cuadrado latino realizado en macetas de 50 l de capacidadEncharcamiento intermitente (Ciclo 1 semana): Riego (600 cc/día) con llave cerrada ➨ (4d) Capa freática alta y Con llave abierta ➨ (3d) sin riego. Se utilizaron macetas de 1.7 l de capacidad, en las que siguiendo la metodología habitual se consiguieron 2 valores de densidad aparente para simular la compactación:: 1500 g de suelo/ 1700 ml: ρ =0.88 g/ml ; 1800 g de suelo/ 1700 ml: ρ= 1.06 g/ml
Para el factor suelo esterilizado / suelo no esterilizado, existen diferencias significativas para
altura (p < 0.006) y para número de raíces (tabla 63). Las plantas que se encontraban en
condiciones de suelo esterilizado alcanzaban mayor altura y mayor número de raíces que las
plantas que se encontraban sembradas en suelos no esterilizados, existiendo diferencias
significativas. Aunque el “vacio biológico” ha sido citado como negativo, también podría
Tratamientos dif i-f alturaif i-f diametr nh n raicesEsterilizado 44,304 b 45,638 a 19,357 a 60,286 bNo esterilazo 38,625 a 42,972 a 18,839 a 51,292 aANOVA. Esteril.1 0,006** 0,064ns 0,153ns 0,023**Encharcado 39,071 a 45,573 a 19,375 a 67,250 bNo encharcado 43,857 b 43,037 a 18,821 a 44,327 aANOVA. Encharcamiento.2 0,019** 0,078ns 0,127ns ***Compactación 1500 g 42,500 a 46,481 b 19,554 b 59,435 aCompactación 1800 g 40,429 a 42,129 a 18,643 a 52,143 aANOVA. Compactación.3 0,300ns 0,003** 0,014** 0,063nsANOVA. Interacciones1*2 0,578ns 0,004** 0,036** 0,618ns1*3 0,928ns 0,629ns 0,518ns 0,657ns2*3 0,858ns 0,944ns 0,727ns 0,471ns1*2*3* 0,401ns 0,293ns 0,881ns 0,137ns
Resultados y Discusión
175
ocurrir que la microflora de este suelo sea en conjunto más perjudicial que beneficiosa, lo que
explicaría los resultados obtenidos (Troelstra et al., 2001).
La misma tendencia del factor suelo esterilizado / no esterilizado se observa para el
tratamiento compactación (tabla 63), cuanto más compactado esta el suelo, menores son los
valores alcanzados por todas las variables, siendo significativamente diferentes para las
variables diámetro (p<0.003) y número de hojas emitidas. Reducciones en estas variables
también fueron observadas en platanera por Dorel (1990; 1993). El número de raíces no
presentó diferencias significativas, pero los valores más altos corresponden a la compactación
más baja.
En el caso del factor encharcamiento del suelo, se observan diferencias significativas para las
variables altura y número de raíces. Se observa una disminución en la altura de las plantas que
se encontraban en suelo encharcado respecto a las que se encontraban en suelo no encharcado
(p<0.005). Sin embargo el número de raíces aumenta en el suelo encharcado (p<0.005). El
mayor número de raíces en el suelo encharcado podría explicarse por una mayor emisión para
compensar las necrosadas y porque en el suelo no encharcado la compactación fue
posiblemente mayor. Disminuciones en altura y en otras variables fenológicas asociadas a la
compactación han sido citadas para platanera por Dorel (1993). El número de hojas y el
diámetro no presentaron diferencias significativas en las sucesivas observaciones, excepto en
la última del diámetro.
El número de raíces no fue significativamente diferente para ninguna de las interacciones
(tabla 63). En la combinación suelo no encharcado* suelo no esterilizado * compactación
1500, una de las plantas presentó colapso de la hoja central y muerte, expresando en grado
máximo los síntomas característicos de FMP en pseudotallo y rizoma. De esta planta se
aislaron predominantemente especies de Fusarium (fig 55, 56).
Las variables diámetro y número de hojas presentaron diferencias significativas para la
interacción encharcamiento/ no encharcamiento * suelo esterilizado / suelo no
esterilizado, p≤ 0.004. que se desarrollan en la siguiente tabla 64 y fig.52. Los resultados
muestran que la combinación de suelo no esterilizado * suelo no encharcado fue la peor.
En la tabla 64, se presentan los valores de la interacción encharcamiento por esterilización del
suelo.
Resultados y Discusión
176
esteril no esteril0
10
20
30
40
50
60
Inter Est/Nest*ench/NenchDiam y n h
diam e diam n h en h no en
Tabla.64. Valores medios del diametro del pseudotallo y emisión de nº de hojas en platanera del cultivar ‘Gran Enana’ bajo el efecto de la interacción del tratamiento encharcamiento con esterilización del sustrato tierra:picón (70:30).
Las medias que comparten la misma letra no son significativamente diferentes, p =< 0,050 según la prueba de rango múltiple de Tukey. ANOVA ***: p 0.000; **: 0.000<p<0.050; ns: no significativo p>0.050. Encharcamiento intermitente (Ciclo 1 semana): Riego (600 cc/día) con llave cerrada ➨ (4d) Capa freática alta y Con llave abierta ➨ (3d) sin riego. Se utilizaron macetas de 1.7 l de capacidad, en las que siguiendo la metodología habitual se consiguieron 2 valores de densidad aparente para simular la compactación:: 1500 g de suelo/ 1700 ml: ρ =0.88 g/ml ; 1800 g de suelo/ 1700 ml: ρ= 1.06 g/ml
Para el diámetro, en suelo encharcado los valores son iguales en suelo esterilizado que en no
esterilizado, mientras que en suelo no encharcado, los valores en no esterilizados son
inferiores (tabla 64). Este resultado podría explicarse por la posible hipoxia producida en suelo
encharcado, que inhibiría el desarrollo microorganismos potencialmente perjudiciales.
Fig.52. Interacción de los factores suelo esterilizado / No esterilizado * suelo encharcado / no encharcado.
En la fig. 52 se observa gráficamente las interacciones. Como puede apreciarse, tanto para el
diámetro como para el número de hojas no existen diferencias significativas entre plantas
encharcadas y no encharcadas cuando el suelo esta esterilizado y sí existen diferencias
Interacción 1*2 diametro nhEsteril*Encharcado 44,769 ab 19,250 abEsteril*No Encharcado 46,506 b 19,464 abNo esteril*Encharcado 46,376 b 19,500 bNo esteril*No Encharcado 39,568 a 18,179 a
ANOVA 0,004** 0,036**
Resultados y Discusión
177
significativas cuando el suelo no está esterilizado (fig. 52). Los valores más bajos para las
variables diámetro y número de hojas, que presentan una interacción significativa entre los
tratamientos esterilización y encharcamiento del suelo (1*2), se obtienen para la interacción
suelo no esterilizado por suelo no encharcado(tabla 64).
A continuación se muestra la evolución del pH y conductividad eléctrica de la solución de
encharcamiento (fig. 53).
Fig.53. Evolución del pH y de la conductividad del agua de drenaje en un ciclo de 3 d de encharcamiento/ 4 días de drenaje /3 días de encharcamiento.
Como puede observarse en la figura 50, el pH del agua de riego a los 3 días de encharcamiento
tiende a disminuir y la conductividad eléctrica a aumentar. Estas variaciones se han descrito
bajo situaciones de estrés por Álvarez et al. (1995), Grimaldi (1986), Drew et al. (1979),
Eckstein y Robinson (1996) y Ke (1979).
En las condiciones ensayadas sólo se ha conseguido reproducir síntomas en el tratamiento
suelo compactado*suelo no encharcado* suelo no esterilizado (fig. 55, y 56). Estos resultados
sugieren que la microflora presente en el suelo, perteneciente al género Fusarium en su
mayoría, o la combinación de ésta con otro rango o tipo de factores abióticos, pueda tener un
papel en la expresión de síntomas del FMP bajo ciertas condiciones de estrés, aunque no se
puede descartar un origen fisiológico o nutricional inducido por dichas situaciones. Los
valores foliares indican que no existe ninguna deficiencia asociada a la expresión de los
síntomas observados aunque valores elevados de K y bajos de Calcio y en otros casos valores
bajos de N han sido encontrados en algunos órganos analizados. En cebada bajo
encharcamiento, Drew et al. (1979) encontraron niveles bajos de nitrogeno. Valores bajos de
0
5
10
15
20
25
3 d enchar inicio 3 dias enchar
cond
6,5
7
7,5
8
8,5
pH
Cond (mS) enchar pH enchar
Resultados y Discusión
178
calcio han sido asociados a salinidad en tomate por diferentes autores Adams et al., (1989) y
por Halperin et al., (1997). Chillet et al., (2000) encontraron una asociación entre elevados
valores foliares de Mn y bajos de Ca con la susceptibilidad de la platanera a Colletotrichum
musae.
Resultados y discusión
179
Figura 55. Punteado discontinuo en
el pseudotallo característico del FMP
.
Figura 56 . Síntoma característico del FMP en rizoma.
Oscurecimientos en el anillo vascular y en la médula.
Figura 54 . Bandejas utilizadas en el
tratamiento de encharcamiento intermitente.
Resultados y Discusión
180
4.6. Ensayo “Compactación del suelo y dosis de Riego”
La plantación se realizó en la primera semana de marzo de 2002. Los datos climáticos de la
zona (1999-2002) donde se encuentra situada la plantación se presentan en la siguiente figura
57.
Fig.57. Datos climáticos facilitados por el servicio de meteorología del Dpto. de Suelos y riegos del ICIA,
en la localidad de Güímar.
Los datos climáticos muestran que en la época cuando se realizó la plantación, en marzo del
2002, se estaban dando las temperaturas mínimas más bajas que del invierno, sobre 10º C.
Durante el cultivo las plantas no han presentado ningún tipo de síntomas que recordasen a los
del FMP, aunque si se ha observado un cierto acortamiento de entrenudos.
En estos momentos el cultivo esta casi finalizado. Ya se han cosechado todos los racimos,
aunque todavía quedan algunos, sobre todo en el bloque 2 que es el que ha presentado mayor
retraso en el ciclo fenológico. Por esta razón presentamos un análisis preliminar de los datos
obtenidos, aunque presumiblemente no será muy diferente del definitivo.
Los resultados para la diferencia entre las tomas de datos a los 5 y a los 9 meses después de la
plantación de algunas variables fenológicas se presentan en la siguiente tabla 65.
Güimar, Extremas clásicas
0 ,0
5 ,0
10 ,0
15 ,0
20 ,0
25 ,0
30 ,0
35 ,0
40 ,0
1999-2002
tem
pera
tura
0
20
40
60
80
10 0
12 0
TEMP.MA X TEMP.MIN HUM.MA X HUM.MIN
Resultados y Discusión
181
Tabla.65. Resultados del ANOVA para las variables Altura del pseudotallo, (Altl9l59); Diámetro (Diaml9l5) y Número de hojas(Nhl9l5) de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en una parcela bajo diferentes niveles de compactación del suelo y diferentes dosis de riego.
ANOVA ALTL9L5 DIAM L9L5 NHL9L5
BLOQUE 0.009** 0.000*** 0.501 ns
RIEGO 0.599 ns 0.510 ns 0.252 ns
ANOVA donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Para el factor bloque (tabla 65), se obtuvieron diferencias significativas para altura del
pseudotallo y para el diámetro. El factor riego no presenta diferencias significativas para
ninguna de las variables. A continuación se presenta la separación de medias de estas variables
para los dos factores del diseño (tabla 66).
Tabla.66. Valores medios de los factores bloque y riego para las variables altura, diametro y número de hojas de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en una parcela bajo diferentes niveles de compactación del suelo y diferentes dosis de riego
BLOQUE Altl9l5 Diaml9l5 Nhl9l5
BLOQUE1 90.250 ab 140.04 a 15.58 ns
BLOQUE2 75.50 a 117.56 a 14.50 ns
BLOQUE3 97.08 b 166.514 b 16.50 ns
RIEGO
RIEGO1 86.88 ns 142.98 ns 15.63 ns
RIEGO 2 91.472 ns 146.83 ns 16.88 ns
RIEGO 3 84.472 ns 134.31 ns 14.05 ns
ANOVA donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales) Valores seguidos de una misma letra no son estadísticamente diferentes según la prueba de rango múltiple de Tukey
Sólo se obtuvieron diferencias significativas para la altura y el diámetro en el factor bloque
(tabla 66). Los valores más altos para la altura se obtuvieron en el bloque 3 que no estaba
Resultados y Discusión
182
compactado, había recibido un lavado de sales y enmiendas de yeso agrícola y de materia
orgánica, aunque estadísticamente es igual a bloque 1.
Los bloques 2 y 3 presentaron valores más bajos de las variables. El bloque 1 fue compactado,
no fue lavado para sales y no recibió enmiendas de yeso agrícola ni enmiendas orgánicas. Por
los tratamientos aplicados cabria haber esperado los peores resultados en el bloque 1
Posiblemente pueda ser atribuido a que el bloque 2 sufrió más los efectos del viento, que
afecta mucho a las variables fenológicas de la platanera.
Para el diámetro, los resultados son más próximos a los esperados pues los bloques 1 y 2 son
estadísticamente iguales y diferentes del 3. Reducciones en variables fenológicas en relación
con problemas de compactación del suelo han sido citadas por Dorel (1990) y por Irizarry et
al. (1980).
El ANOVA para variables del ciclo fenológico y de producción se presenta en la siguiente
tabla 67
Tabla.67. Resultados del ANOVA para las variables PL-PAR; PP, PR; NM y ND de plantas de platanera del cultivar ‘Gran Enana’ cultivadas en suelo con diferentes niveles de compactación y a diferentes dosis de riego.
PL-PAR PP PR NM ND
ANOVA
BLOQUE **0.005 0.294 NS *0.018 0.103 NS 0.130 NS
RIEGO 0.311 NS 0.110 NS **0.001 0.287 NS **0.009
PL_PAR= Plantación parición (sem); PP= Peso racimo; PR= Peso del raquis; NM= Número de manos; ND= Número de dedos ANOVA donde ***: p = 0.000 (diferencias altamente significativas); **: 0.000 < p < 0.050 (diferencias significativas); ns: no significativo p > 0.050 (las dos muestras comparadas son iguales).
Existen diferencia significativas entre bloques para las variables plantación- parición y peso
del raquis (tabla 67). Para el factor riego sólo existen diferencias significativas en la variable
peso del raquis. La separación de medias de estas variables se presenta en la siguiente tabla 68.
Resultados y Discusión
183
Tabla.68. Valores medios paras los factores bloque y riego de las variables PL-PAR; PP; PR; NM; y ND
BLOQUE PL-PAR PP PR NM ND
1 47.75 ab 34.31 ns 2.72 b 10.66 ns 194.43 ns
2 50.95 b 33.78 ns 2.49 ab 10.19 ns 185.19 ns
3 43.11 a 31.71 ns 2.16 a 10.36 ns 184.26 ns
RIEGO
1 (100 %) 48.94 ns 31.68 ns 2.04 a 10.22 ns 178.23 a
2 (175 %) 45.39 ns 35.35 ns 2.80 b 10.55 ns 194.99 b
3 (250 %) 47.48 ns 32.78 ns 2.52 ab 10.43 ns 190.67 ab
PL_PAR= Plantación parición (sem); PP= Peso racimo; PR= Peso del ráquis; NM= Número de manos; ND= Número de dedos Valores seguidos de una misma letra no son estadísticamente diferentes según la prueba de rango múltiple de Tukey
El bloque 3 es estadísticamente diferente de los bloques 1 y 2, que son iguales entre sí (tabla
68). En el bloque 2 se ha producido un retraso en la parición de entre 2 y 3 semanas con
respecto a estos bloques. Retrasos del ciclo fenológico también han sido citados por Dorel
(1990, 1993) y por Irizarry et al.. (1980). De nuevo aquí vuelven a comportarse igual los
bloques 1 y 3, cuando cabría haber esperado diferencias más claras. Posiblemente al ser un
ensayo de campo, estén actuando otros factores que no se han podido controlar en el ensayo,
como gradientes de insolación, efecto viento etc.
A punto de finalizar el ensayo, se han ido cortando las plantas una vez que se había
recolectado el racimo al objeto de observar si se habían producido síntomas en el interior del
rizoma. No sólo se han estudiado las plantas de ensayo sino también las plantas borde.
Se han observado síntomas típicos en tres plantas del bloque 1 (compactado, no lavado, no
enmendado); dos en el bloque 2 (compactado, lavado y enmendado) y una planta borde en el
bloque 1 (no compactado, lavado y enmendado). También se han observado lo que podría ser
inicio de síntomas, o síntomas claros pero en zonas relativamente pequeñas de la médula en
plantas del bloque 1 y del 2 (fig. 59, 60, 61, 62). La presencia de síntomas en rizoma no
acompañados de síntomas externos fue citada por Deacon et al.. (1985).
En todos los casos las plantas estaban sometidas a la dosis (100%) de riego que es la
recomendada para la zona por el Departamento de suelos y Riegos del ICIA. Estos resultado
Resultados y Discusión
184
sugieren que los síntomas están asociados al suelo compactado y que la dosis de riego en
exceso no fue más perjudicial, posiblemente debido a que cuando el suelo se encontraba al 100
% de saturación el resto de agua era drenada. En uno de los ensayos de invernadero también se
obtuvieron síntomas casi típicos en una planta que estaba en suelo compactado (fig. 55, 56).
En las plantas sometidas a dosis intermedias de riego o a la dosis máxima, se ha observado un
mayor número de plantas caídas que tenían el rizoma poco sumergido en el suelo y mostraban
un sistema radical muy dañado por el encharcamiento. Los datos de sensores ECHO aún no
estudiados muestran que en algunas plantas se han producido tiempos de encharcamiento de 4
horas después de cada pulso de riego ( dos al día), con valores de agua volumétrica cercanos al
50 % sólo en algunos casos.
Pese a que el suelo fue teóricamente homogeneizado por el tratamiento de compactación, la
baja incidencia podría estar relacionada con la heterogeneidad de los suelos agrícolas de
Canarias. Pero como todavía no tenemos los resultados de los análisis foliares, ni los del suelo
de esas plantas, que nos aporten claves para la interpretación, no podemos establecer
conclusiones definitivas sino esta hipótesis de la asociación con la compactación y los factores
asociados a la misma como hipoxia y resistencia mecánica a las raíces,
En la fig 58, se representa la disposición de los tratamientos en la parcela experimental, así
como la posición de las plantas que han presentado síntomas.
Resultados y Discusión
185
b b b b b** b b b b b
b** v ace b ace v b v**** ace b
b v ace b ace v*** b v**** ace b
b v ace b ace v b v ace b
b ace v b v ace b ace v b
b ace v* b v ace b ace v bb ace v b v ace b ace v b
b b b b b b b b b b
b ace v b v ace b ace v b
b** ace v b v ace b ace v b
b ace v b v ace b ace v b
b v*** ace** b ace v** b v ace b
b** v ace b ace v**** b v ace bb v ace b ace v b v ace b
b b b b b b b b b b
b v ace b ace v b v ace b
b v ace b ace v b v ace* b
b v ace b ace v b v ace b
b ace v b v ace b ace v b
b ace v b v ace b ace v bb ace v b v ace b ace v b
b b b b b b b b b b
Entrada
**
* Puntos en el raquis de la piña ** Oscurecimientos grisáceos generalizados en el rizoma, puntos necróticos en la zona de inserción de las raíces *** Puntos necróticos en la zona de inserción de las raíces y en el tejido adyacente **** Síntomas de Falso mal de Panamá en rizoma (v) Planta de cultivo in vitro, (ace) Planta obtenida de cultivo acelerado, (b) Plantas bordes fuera de ensayo (1) Bloque Compactado y no lavado, (2) Bloque compactado y lavado, (3) Bloque no compactado y lavado Riego normal 100% de predicción Riego intermedio 175% de predicción Riego extremo 250% de predicción
Fig.58. Localización de las plantas con síntomas en el ensayo sobre el efecto de compactación y diferentes
dosis de riego en campo sobre un ciclo de cultivo de cv ‘Gran Enana’
Resultados y Discusión
186
Fig.59. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación
y dosis de riego intermedia (175% del asesorado)
Fig.60. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación
y dosis de riego intermedia (175% del asesorado)
Resultados y Discusión
187
Fig.61. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación
y dosis de riego intermedia (250% del asesorado)
Fig.62. Síntomas reproducidos en condiciones de campo, compactación
y dosis de riego intermedia (175% del asesorado)
Resultados y Discusión
188
5. ESTUDIOS HISTOQUÍMICOS
5.1. Muestras de cortes en fresco
• Rizoma
Los cortes realizados de las muestras en fresco de rizoma eran demasiado gruesos y debido a
la estructura compacta del rizoma, era difícil la penetración de los colorantes y la observación
de las estructuras tisulares.
La desorganización vascular que se observa en las plantas con FMP de forma generalizada,
puede ser una consecuencia de las disfunciones metabólicas que se producen bajo diferentes
factores de estrés y al “Yellow Mat” por Reinking (1926) citado por Lahav et al.. aunque
también ha sido asociada tanto a patógenos como a salinidad y bloqueos nutricionales como el
Ca y el B (Epstein, 1973).
• Pseudotallo
En pseudotallo, las muestras procedentes de la planta sana presentaban la luz de los vasos
xilemáticos vacía y el conjunto de las células del floema y placas cribosas se encontraban bien
organizadas (fig.63). En las muestras procedentes de plantas con síntomas de FMP puede
observarse una obstrucción parcial de la luz del xilema (fig. 64) y detalle (fig.65) que cuando
se tiñen con calcofluor e incide sobre la muestra un haz de luz azul, la celulosa de todas las
paredes celulares emite fluorescencia azul, aunque las sustancias que ocluyen los vasos no se
tiñen (fig.66).
• Raíces
En la raíz de todas las plantas, el floruglucinol tiñó color rojo cereza las paredes celulares
lignificadas y puso de manifiesto la fuerte lignificación de las células de la endodermis del
cilindro central (fig.67) y la epidermis, así como las paredes celulares de las células
parenquimáticas cercanas a la epidermis de las muestras procedentes de plantas con FMP. El
interior de algunas de estas células se teñía con floroglucinol posiblemente debido a que
acumulaban lignina (fig.68). La lignificación de las células es una respuesta defensiva que
puede producirse inespecificamente ante diferentes factores de estrés, tanto abióticos como
bióticos (Beckman, 1987) y (Deborath, 2001). Cachorro et al.. (1993) observaron deposiciones
Resultados y Discusión
189
de lignina en los tejidos vasculares en raíces de Phaseolus vulgaris en respuesta a estrés salino
y iones de Ca 2+. La auramina O tiñe la cutina y lípidos de todas las paredes celulares de la
raíz, que cuando se observa bajo luz azul, emiten fluorescencia amarilla, excepto de las
cercanas a la endodermis (fig. 72).
Los rafidios presentes en los cortes procedentes de muestras sintomáticas, se localizan cerca
de la epidermis. En la (fig.67) y en detalle en la (fig.69), puede observarse la presencia de un
rafidio cerca de la endodermis. En los cortes de muestras con síntomas se observan grandes
espacios aéreos que constituyen el aerenquima (fig.70). Un incremento en el volumen total
ocupado por el aerenquima ha sido citado para plataneras en situaciones de hipóxia, (Aguilar
et al.., 1999).
Resultados y Discusión
190
Fig.65. Cortes en fresco del
pseudotallo de planta con FMP. de
vaso xilemático colapsado en
planta x10 sin teñir.
Fig. 63. Corte en fresco del pseudotallo
de planta sana, detalle de la
organización los vasos xilema y floema,
en planta sana, x4 sin teñir. Fig 64. Cortes en fresco del
pseudotallo de planta con FMP.
de vaso xilemático colapsado en
planta x4 sin teñir.
Fig.66. Cortes en fresco del
pseudotallo de planta con FMP.
de vaso xilemático colapsado en
planta x4 Tinción calcofluor.
Resultados y Discusión
191
Fig.67. Corte en fresco, detalle de células
lignificadas de la endodermis en planta
sana. x10. Tinción Floroglucinol
Fig.69. Corte en fresco, detalle de células
cercanas a la epidermis lignificadas. x 4
Tinción con Floroglucinol (sup.). Planta
con FMP. (inf) detalle x10 Tinción con
Floroglucinol.
Fig. 68. Detalle de rafidio en corte de raíz
de planta con FMP en fresco. x10. Tinción
azul de Tripán.
Fig.70. Corte en freco de raíz de planta
con FMP, donde se observan los espacios
aéreos que configuran el aerenquima.x4
sin teñir.
Fig.71. Corte en fresco de la raíz de
planta control. x10. Tinción con
auramina O.
Resultados y Discusión
192
5.2. Muestras fijadas incluidas en parafina.
Después de la observación de las muestras desparafinadas y selección de los portas para las
posteriores tinciones, las observaciones que se describen a continuación están basadas en 15
repeticiones de portas por cada muestra.
Rizoma
En plantas sanas la corteza del rizoma está constituida por células parenquimatosas que
acumulan almidón, muy destacable en la tinción de PAS aunque en menor cantidad que las
que se encuentran en el interior del anillo vascular (fig.72). La presencia de tales cantidades de
almidón pone de manifiesto la función del rizoma como órgano de reserva. En plantas con
FMP se observó menor cantidad de almidón acumulado (fig.73) y (fig.74). Esta observación
podría explicarse por el hecho de que en plataneras enfermas o bajo situaciones de estrés
puede darse una reducción de la fotoasimilación (Lecuona, 1975) y (Sandoval y Müller, 1990).
La tinción con calcofluor reveló que existía una mayor presencia de rafidios en los rizomas
procedentes de plantas con síntomas de FMP que en las plantas sanas (fig.75). La presencia de
rafidios es habitual en las zonas cercanas a la epidermis y se les atribuye un papel en la
defensa pasiva de la planta (Lecuona, 1975). El calcofluor tiñe la celulosa de todas las paredes
celulares emitiendo fluorescencia azul cuando un haz de luz azul incide sobre la muestra
(fig.76) y (fig.77), pero no tiñe las oclusiones xilemáticas que cuando se observan bajo la luz
blanca son de color marrón (fig.78) y (fig.79).
La auramina O tiñe la cutina y lípidos y como ocurre con el calcofluor, la auramina O tiñe las
paredes celulares de todas las células (fig.80), pero no tiñe el contenido de las oclusiones
xilemáticas que bajo luz blanca se ven de color marrón (fig.81). En muestras de rizoma de
plantas con síntomas de FMP, teñidas con auramina O, aparecen células llenas de sustancias
que cuando incide luz azul sobre ellas, emiten fluorescencia amarilla. Posiblemente sean
células especializadas en acumular sustancias de naturaleza lipídica (fig.82).
Las oclusiones xilemáticas se tiñen de color violeta y azul oscuro con el azul de toluidina
(fig.83) por lo que posiblemente contengan sustancias tipo lignina. También se tiñen con
Gerlach (fig.84) donde aparecen teñidas de color rojo, por lo que también indica que en su
composición pueda haber lignina. En otras zonas, aparecen células llenas de una sustancia de
Resultados y Discusión
193
color azul muy intenso, casi negro que posiblemente sea debido a una mezcla de sustancias
que pudieran ser parecidas a las descritas por Beretta et al.. (1988) quien observó la presencia
de bloqueos xilemáticos producidos por sustancias de naturaleza lipídica, además de calosas,
lignina, sustancias pecticas, gomas y proteínas en citrus. También se observa una
desorganización de los vasos y estructuras del tejido (fig.85) y presencia de rafidios (fig.86).
Resultados y Discusión
194
Fig. 75. Corte en parafina (10
µm) de rizoma procedente de
planta con FMP. Rafidios. x40.
Tinción con calcofluor.
Fig. 74. Corte en parafina (10
µm) de rizoma procedente de
planta con FMP. x4. Tinción
PAS.
Fig. 73. Corte en parafina (10
µm) de rizoma procedente de
planta con FMP. x10. Tinción
PAS.
Fig. 72. Corte en parafina (10
µm) de rizoma procedente de
planta control. x10. Tinción PAS.
Resultados y Discusión
195
Fig.76. Corte en parafina (10µm) de rizoma procedente deplanta con FMP. x10. TinciónCalcofluor.
Fig. 77. Corte en parafina (10µm) de rizoma procedente deplanta con FMP. x25. TinciónCalcofluor.
Fig.78. Corte en parafina (10µm) de rizoma procedente deplanta con FMP. x10. Sinteñir.
Fig.79. Corte en parafina (10µm) de rizoma procedente deplanta con FMP. x25. Sinteñir.
Fig.80. Corte en parafina (10µm) de rizoma procedente deplanta con FMP. x25. TinciónAuramina O.
Fig.81. Corte en parafina (10µm) de rizoma procedente deplanta con FMP. x25. Sinteñir.
Resultados y Discusión
196
Fig.82. Corte en parafina (10 µm)de rizoma procedente de plantacon FMP. x10. Tinción AuraminaO.
Fig.83. Corte en parafina (10 µm)de rizoma procedente de plantacon FMP. x40. Tinción Azul detoluidina.
Fig.84. Corte en parafina (10 µm)de rizoma procedente de plantacon FMP. x4. Tinción Gerlach.
Fig.85. Corte en parafina (10 µm)de rizoma procedente de plantacon FMP. x4. Tinción Gerlach.
Fig.86. Corte en parafina (10 µm)de rizoma procedente de plantacon FMP. x10. Tinción Gerlach.
Resultados y Discusión
197
Pseudotallo
En plantas con FMP la mayoría de los haces vasculares de xilema se encuentran colapsados
por sustancias amorfas, de forma generalizada que cuando se observan sin teñir bajo luz
blanca son de color marrón (fig.87) y cuando se aplica calcofluor no se tiñen (fig.88). En la
tinción con Auramina O sucede lo mismo, las oclusiones no se tiñen (fig.89) mientras que con
la tinción de Gerlach las oclusiones se tiñen en azul muy intenso como ocurría en el rizoma
(fig 90) y con la tinción de azul de toluidina se tiñen color violeta oscuro (fig.91).
Entre los vasos del floema se encuentran células parenquimatosas acompañantes, algunas
repletas de materiales que se tiñen en Gerlach de color rojo, azul o negro (fig. 90). Este
fenómeno se observa en todos los casos. En las plantas afectadas por FMP, el floema se
presenta desorganizado y en algunos casos repleto de materiales amorfos (fig 94). Reinking
(1926) estudiando plantas afectadas de “Yellow mat” (YM), sólo observó alteraciones en el
floema.
En el xilema del pseudotallo de plantas con MP, también se observan oclusiones de la misma
forma que en las muestras de FMP, de color marrón cuando se encuentran sin teñir (fig.92),
mientras que con Auramina O se tiñen todas las paredes celulares emitiendo fluorescencia
amarilla, pero no se tiñe su contenido (fig.93).
En plantas con MP se observan afectados, únicamente los vasos xilemáticos colonizados
supuestamente por FOC. Observaciones similares fueron realizadas por Beckman (1990). El
resto de estructuras tisulares y floema se encuentran aparentemente sin ninguna alteración
como en las plantas sanas. El colapso de placas cribosas y xilema ha sido descrito por
Beckman (1987) en la platanera asociado a la enfermedad de Mal de Panamá, y por
microorganismos no patógenos y por factores de estrés abiótico por Halperin et al., (1997) en
tomate.
En la epidermis de las vainas que configuran el pseudotallo, es frecuente encontrar estomas
(Lecuona, 1975); en nuestras observaciones en plantas con síntomas de FMP, los estomas
aparecen semiabiertos (fig. 94). Se ha descrito que en procesos fisiológicos desfavorables, los
estomas se ven afectados por pérdida de turgencia y muchas veces pierden su función (Huang
et al.., 1994).
Resultados y Discusión
198
Fig. 87. Corte en parafina(10 µm) de pseudotalloprocedente de planta conFMP. x10. Sin teñir.
Fig. 88. Corte en parafina(10 µm) de pseudotalloprocedente de planta conFMP. x10. TinciónCalcofluor.
Fig. 89. Corte en parafina(10 µm) de pseudotalloprocedente de planta conFMP. x25. TinciónAuramina O.
Resultados y Discusión
199
Fig.90. Corte en parafina (10µm) de pseudotallo procedentede planta con FMP. x25.Tinción Gerlach.
Fig.91. Corte en parafina (10µm) de pseudotallo procedentede planta con FMP. x25.Tinción Azul de Toluidina.
Fig. 92. Corte en parafina (10µm) de pseudotallo procedentede planta con FMP. x10. Sintinción.
Fig.93. Corte en parafina (10µm) de pseudotallo procedentede planta con FMP. x10.Tinción Auramina O.
Fig.94. Corte en parafina (10µm) de pseudotallo procedentede planta con FMP. x10.Tinción Gerlach.
Resultados y Discusión
200
Raíz
Los vasos del xilema de las muestras procedentes de las plantas control, se encuentran
rodeados por una fila de células parenquimatosas muy pequeñas que pueden acumular tanino.
En la tinción de Gerlach la endodermis y las paredes de los vasos xilemáticos aparecen teñidas
de rojo, mientras que el resto de las paredes celulares se tiñen en verde turquesa (fig.95).
Tanto en plantas con FMP y MP se observaron lo que podrían ser tílides, protusiones de las
células parenquimatosas que rodean las traqueidas que penetran por las puntuaciones porosas
y se desarrollan en su luz teñidas con azul de toluidina de color rojo (fig.96) y con Gerlach de
color verde turquesa y rojo (fig.97). Observaciones similares han sido descritas por Beckman
(1987) para el MP. A veces fueron tan numerosas que llenaron la luz de la traqueida y xilema
(Fig. 98, 99). Lecuona (1975) y Sandoval y Müller (1990) observaron tílides en plantas
afectadas de infecciones vasculares. En muestras procedentes de MP, en algunos vasos
xilemáticos, se han observado oclusiones por micelio y la presencia de conidias fusiformes -
posiblemente de FOC- que se tiñen con Gerlach (fig.98), de color rojo (fig.99) y (fig.100), con
azul de toluidina color lila (fig.101) y con PAS en rojo (fig.102) y (fig.103), mientras que en
plantas con FMP, sólo se ha observado micelio sin ninguna estructura que permita su
identificación (fig.104). También se observan diferencias en las lagunas lisogénicas y
aerenquima radical que parecen ser mayores en tamaño y cantidad en las plantas que presentan
sintomatología asociada al FMP. Huang et al. (1994) describió la formación del aerenquima
en raíces de trigo y Aguilar et al. (1999) bajo condiciones de hipóxia.
El calcofluor tiñe los rafidios que se encuentran distribuidos por todas las zonas de la raíz,
incluso en los espacios aéreos del aerénquima. En este caso no se observaron diferencias
respecto a su abundancia entre los dos tipos de muestras.
En general, se observa que en plantas afectadas por FMP existe un desorden generalizado de
las estructuras vasculares, tanto xilema como floema, en los tres tipos de tejidos estudiados:
pseudotallo, rizoma y raíz.. Existen elementos diferenciadores en la expresión del Mal de
Panamá y el Falso Mal de Panamá en los diferentes tejidos estudiados. En el MP sólo está
afectado el xilema, manteniéndose una estructura normal en el resto de los tejidos. En el FMP
Resultados y Discusión
201
se observa una desorganización general de los tejidos, incluido el xilema, que se presenta
además ocluido por materiales amorfos.
Las observaciones realizadas con las diferentes tinciones contribuyen a un mejor conocimiento
de lo que ocurre en la expresión de síntomas asociados al FMP y nos permiten diferenciarlos
de los descritos para el MP.
Resultados y Discusión
202
Fig.95. Corte en parafina(10 µm) de raíz procedentede planta con sana. x25.Tinción Gerlach.
Fig.96. Corte en parafina(10 µm) de raíz procedentede planta con FMP. x25.Tinción Azul de Toluidina.
Fig.97. Corte en parafina(10 µm) de raíz procedentede planta con FMP. x25.Tinción Gerlach.
Resultados y Discusión
203
Fig.98. Corte en parafina (10 µm) de raíz procedente de planta con MP. x10. Tinción
Fig.99. Corte en parafina (10µm) de raíz procedente deplanta con MP. x40. Tinción
Fig.100. Corte en parafina (10µm) de raíz procedente deplanta con MP. x40. Tinción
Fig.101. Corte en parafina (10µm) de raíz procedente deplanta con MP. x40. Tinción
Resultados y Discusión
204
Fig.102. Corte en parafina (10µm) de raíz procedente deplanta con MP. x25. TinciónPAS
Fig.103. Corte en parafina (10µm) de raíz procedente deplanta con MP. x40. TinciónPAS
Fig.104. Corte en parafina (10µm) de raíz procedente deplanta con FMP. x25. TinciónAzul de Toluidina
CONCLUSIONES
Conclusiones
206
1.El Falso Mal Panamá (FMP) es un desorden que se ha presentado mayoritariamente
asociado a plantaciones nuevas sobre suelos vírgenes, antiguos suelos de platanera que
habían estado en baldío durante unos años, o cultivados con papa u otras hortícolas.
2.El momento de aparición generalmente ha sido en primavera, a la salida de inviernos
anormalmente fríos. Frecuentemente las plantaciones afectadas presentaban problemas de
suelos tales como compactación y cierto nivel de encharcamiento así como valores bajos
de calcio y materia orgánica y altos de niveles de sodio.
3. Asociada al desorden se encuentran una serie de especies fúngicas, predominantemente
del Género Fusarium como: F. oxysporum, F. subglutinans, F. proliferatum y F. solani así
como géneros bacterianos como Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia.
4. Ninguna de estas especies fúngicas y bacterianas ha producido la aparición de síntomas
típicos en pruebas de inoculación simples ni en aquellas en las que se han ensayado
interacciones con factores abióticos como encharcamiento y compactación del suelo
5. En dos ocasiones, bajo encharcamiento intermitente y bajo compactación del suelo
combinada con encharcamiento intermitente se han obtenido síntomas similares a los
típicos de Falso Mal Panamá (FMP) en ensayos de invernadero.
6. En ensayos de campo de compactación del suelo y dosis de riego, se han logrado
reproducir los síntomas típicos del interior del rizoma en plantas del tratamiento de
compactación bajo todas las dosis de riego.
7. Estudios histológicos sobre plantas con los síntomas característicos de FMP han puesto
de manifiesto que el xilema puede presentar oclusiones con materiales de diversa
naturaleza y que el floema se encuentra desorganizado junto con las células acompañantes
que pueden presentar además importantes acumulaciones de sustancias de naturaleza
lipídica, polisacáridos y proteínas.
Conclusiones
207
8. Se ha establecido un criterio diagnostico diferencial entre el Mal de Panamá (MP) y el
FMP basado en la observación de síntomas y completado con la respuesta en medio
Komada, la determinación del Grupo de Compatibilidad Vegetativa (VCGs) y estudios
histológicos para determinar anomalías en el xilema y en el floema.
9. Aunque no queda completamente descartado que alguna de las especies estudiadas
pueda jugar un papel en el desorden bajo condiciones abióticas distintas de las ensayadas,
los resultados obtenidos apuntan a un origen abiótico, en particular a ciertas características
de los suelos que produzcan compactación, hipoxia y bloqueo en la absorción de
nutrientes.
10. La mejora de la estructura, la textura y el drenaje del suelo, así como un reparto de la
dosis de riego en dos o tres aplicaciones por día, parecen ser hasta el momento los únicos
consejos de control que pueden ser útiles para los agricultores.
BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
Anexo
ii
1. Bacterias
1.1. Medio Nutrient Agar
Nutrient Agar (Oxoid) 28 g
Agar bacteriológico 5 g
Agua destilada 1 l
Dejar calentar el agua a 80ºC y añadir los dos componentes, agitar bien y repartir 6.5 ml
en cada tubo. Autoclavar a 120º durante 20 min.
1.2. Medio LPGA
Bactopeptona 5.0 g
Extracto de levadura 5.0 g
Glucosa 10.0 g
Agar 15.0 g
Agua destilada 1.0 l
Se esteriliza en el autoclave durante 20 min. a 121ºC
1.3. Detección de pigmentos fluorescentes en medio B de King (Hing y col.,
1954).
Proteasa Peptona 20 g
Glicerol 10 ml
Fosfato bipotásico anhidro 1.5 g
Sulfato magnésico hidratado 1.5 g
Agar 20 g
Agua destilada 1 l
Ajustar el pH a 7 y esterilizar a 120º C durante 20 min.
Anexo
iii
1.4. TSBA
Composición para 1 l de agua destilada.
Soja Tripticaseina caldo. (500 Gr BBLBD) 30 g/l
Bacto-agar (Difco) 15 g/l
Autoclavar a 121ºC durante 15 minutos.
1.5. Reacción a una solución de KOH al 3%
Sobre un portaobjetos se depositan unas gotas de KOH 3%, a continuación se realiza un
frotis con una asa de Köller que con la luz de la punta llena de cfu recogidas de una
placa sembrada en triple estría del tercer cuadrante (células en estado exponencial) y se
separa el asa suavemente dos o tres veces del porta, si se forma un hilo mucilaginoso
desde la suspensión de cfu en KOH unido al asa posiblemente las células son gram -, si
no se forma un hilo mucilaginoso son gram +.
1.6. Tinción del gram
Diferencia los organismos gram-positivos de organismos gram-negativos. Se realizó
preparando un frotis de células que se cubrió con cristal violeta (= violeta de genciana)
durante 2 min. Este colorante además de teñir fija las posee acción fijadora. Se lavó con
agua y a continuación se aplicó lugol (ioduro potásico) durante 1 min. Se lavó con una
mezcla de alcohol acetona hasta que no se observó a simple vista pérdida de color. Se
lavó con agua y se dejó secar la preparación a temperatura ambiente, que se observó al
microscopio óptico. Las bacterias gram negativas se destiñen con el alcohol acetona, por
eso se observan color violeta, mientras que las gram positivas se observan color rojas.
Anexo
iv
1.7. Crecimiento anaeróbico en el medio Hugh y Leifson (Hugh y leifson, 1953)
BactoTriptona 2.0 g
Cl 5.0 g
K2HPO4 0.3 g
Agar 5.0 g
Azul de bromotimol 0.2% 40ml
Glucosa 10.0 g
Agua destilada 1.0 l
Se ajusta el pH a 7.1 (coloración verde del medio) y se esteriliza en autoclave 20 min. a
120º C. Se reparte 5 ml por tubo. Se inoculan dos tubos por cepa, uno de ellos se cubre
con 3-4 cm de aceite de vaselina estéril. La reacción se considera positiva cuando el
medio vira a color amarillo-naranja después de tres días.
1.8. Reacción oxidasa (Kovaks, 1956)
Se añadieron unas gotas de una solución de dihidrocloruro de tetrametil-p-
feniléndiamina (1% p/v en agua) a un papel de filtro. Inmediatamente después se toma
un asa de plástico cargada de bacterias cultivadas 24 h a 25ºC en Kb y se extendió sobre
el papel de filtro impregnado. La aparición de color violeta en los primeros 10 s se
considera positiva.
1.9. Reducción de nitratos (Cother, 1987)
KNO3 1.0 g
bactopeptona 10.0 g
Agua destilada 1.0 l
Se esteriliza en autoclave 20 min. a 120ºC. Se ajusta el pH a 7. Se sembraron tubos de 5
ml de medio, se incubaron a 25 ºC y se leyeron a los 3 días. La lectura se efectuó con
Anexo
v
tiras Merkoquant. Estas tiras presentan dos pastillas rectangulares absorbentes en su
extremo. La primera pastilla detecta la presencia de nitritos, y la segunda la presencia de
nitratos. Cuando las dos pastillas cambian de color, quiere decir que todos los nitratos
del medio no han pasado a nitritos pero que la reacción es positiva. Si ninguna de las
dos cambia de color, quiere decir que todos los nitratos han pasado a nitritos y todos los
nitritos a nitrógeno atmosférico., La reacción solo se considera negativa cuando solo se
ha producido cambio de color en la primera pastilla, eso quiere decir que todos los
nitratos iniciales continúan estando presentes en el medio y que por tanto no se ha
producido reacción.
1.10. Degradación de almidón a glucosa
ADSA-MICRO 25 g
Agar 5 g
Agua destilada 1 l
Esterilizar durante 15 min. a 120º C en el autoclave. El medio se reparte en placas de
Petri convencionales y las cepas se siembran dibujando una línea recta sobre el medio.
A lectura se realiza a las 48 h, añadiendo lugol sobre el medio. Si la cepa ha conseguido
degradar el almidón a glucosa, alrededor de la línea sembrada se formará un halo
hialino, pues el lugol tiñe solamente el almidón presente en el medio de cultivo.
1.11. Degradación de la gelatina
Nutrient gelatina 128 g
Agua destilada 1 l
Esterilizar durante 15 min. a 120º C en autoclave. Repartir en tubos 5 ml. La cepas se
siembran por picadura. La lectura se realiza a las 24, 48h, y al séptimo y quinceavo día.
Antes de realizar la lectura se colocan con los tubos durante 10min a 4ºC para evitar
falsos positivos, ya que la incubación a 25º C podría licuar la gelatina un poco.
Observar si la gelatina se ha licuado y la velocidad de la reacción.
Anexo
vi
1.12. Prueba de la patata
Sumergir una patata en una solución de lejía comercial al 50% durante media
hora.
Al lado de la llama, con un bisturí flameado con alcohol, cortar la patata en trozos y
hacer una herida e inocular con la cepa.
Realizar el control.
1.13. Arginina dihidrolasa (Thornley, 1960)
Peptona neutralizada 1.0 g
(Oxoid L34)
NaCl 5.0 g
K2HPO4 0.3 g
L (+)arginina HCl 10.0 g
Rojo fenol 0.01 g
Agar 3.0 g
Agua destilada 1 l
Se ajusta el pH a 7.2 y se esteriliza en el autoclave durante 15 min. a 121ºC. Después de
la inoculación se cubre el medio con 3-4 cm de aceite de vaselina estéril y se incuba a
25ºC. El cambio del color del medio a rosado se considera como reacción positiva. La
lectura se realiza a los siete días.
1.14. Esculina
Bactopeptona 10 g
Citrato de hierro y amonio 1 g
Agar 20 g
Agua destilada 1 l
Anexo
vii
Ajustar el pH a 7.5-7 y esterilizar a 120º durante 20 min. La lectura se realiza a la 24 y
72 h. También puede prepararse sin agar. Es positivo cuando vira a un color marrón
muy oscuro o negro.
1.15. Urea
L- Triptofano 1.5 g
Fosfato monopotásico 0.5 g
Fosfato dipotásico 0.5 g
Cloruro sódico (ClNa) 3 g
Urea 10 g
Alcohol 95º 5 ml
*Rojo fenol 1% 1.34 ml
Agua destilada 500 ml
*Rojo fenol
Rojo fenol 0.5 g
Etanol 5 ml
Agua destilada 45 ml
Esterilizar por filtración de membrana de 45 µm. La reacción se lee a las 24 h si se ha
producido un cambio de color de rojo a marrón oscuro.
Anexo
viii
1.16. Composición de los reactivos para el protocolo de extracción de ac. Grasos
I, Sistema MIS
! Composición de los reactivos
Reactivo # 1
- NaOH 45 g
- Metanol 150 ml
- Agua destilada desionizada 150 ml
Reactivo # 2
- HCl 6,00 N 270,8 ml
- Metanol 229,2 ml
Reactivo # 3
- Hexano 200 ml
- Metil-tert Butil Eter (MTBE)* 200 ml
*Este producto es explosivo en condiciones de elevada temperatura, aunque si se trabaja
en campana de extracción de gases y se almacena en lugares aireados no tiene porqué
ocurrir ningún percance. La mezcla con el hexano lo hace más estable.
Este producto puede substituirse por éter etílico, aunque éste presenta algunas
desventajas, como que siempre se obtiene un pico correspondiente a éste producto, el
cual hace difícil la identificación del perfil del cromatograma obtenido. Otro
inconveniente es que con éste producto, no se detectan algunos ac. grasos cíclicos, que
podrían ser, en algunos casos, determinantes para la distinción entre cepas muy
parecidas. En general se pierde resolución utilizando el éter etílico.
Reactivo # 4
- NaCl 11 g
- Agua destilada 900 ml
! Composición del medio de cultivo
Anexo
ix
1.17. Consideraciones del sistema MIS o MIDI, en la cromatrografía de gases
para la identificación de microorganismos.
• En la hoja de resultados, aparece una identificación con el medio TSBA y otra con la
abreviatura CLIN, sólo nos debemos de fijar en la dada para TSBA ya que todo el
trabajo presentado ha estado realizado con este medio. La clasificación dada con
CLIN, se refiere a clínica, y está referida a la siembra de los microorganismos en el
medio agar sangre.
• Al lado de algunas especies aparece un asterisco (*), este símbolo quiere decir que la
especie señalada, ha sido incorporada recientemente a la base de datos y que
anteriormente, podía encontrarse con otro nombre.
• El sistema MIS (System Software), compara el cromatograma obtenido de una
muestra problema con 10-20 cromatogramas de referencia (dependiendo de la
variedad intraespecífica existente) que contiene en la base de datos y te da una
relación de especies de acuerdo con un índice de similitud que varía entre 0 y 1. Para
una determinada especie dada por el programa existirá un valor del índice de
similitud que cuanto más se aproxime a 1, significará que más se parece el
cromatograma de la muestra problema con el conjunto de cromatogramas de
referencia para ésta especie. Hay que tener en cuenta que éste índice no es un valor
de probabilidad.
Cuando el índice de similitud es inferior a 0,01, quiere decir que posiblemente hay una
contaminación en la muestra, y que se tendría que repetir el protocolo partiendo de un
cultivo puro. Pero si se repite, probablemente, se obtendrán las mismas especies con un
índice de similitud mayor, ya que la base de datos te da el nombre de la especie
mayoritaria en la muestra problema.
1.18. Reactivos utilizados en el protocolo de extracción de ac grasos II.
Metanolisis
Reactivo # 0
Agitar bien la mezcla.
Metanol 30 ml
Tolueno 15 ml
Ac. Sulfúrico 1 ml
Anexo
x
1.19. Condiciones del cromatógrafo UAB
Tª del inyector: 250ºC
Tª del detector: 300ºC
Tiempo de equilibrio: 5 minutos
Tª inicial: 170ºC
Rampa de 5ºC/minuto hasta 300ºC
Tª final: 300ºC
Tiempo de Tª final: 0 minutos
Columna: 1. Ultra 2 (Crosslinked 5 % PhMe Silicone), 25 m x 0,2 mm x 0,33 µm
film Thickness ( tipo capilar ).
2.HP-5.( Crosslinked 5% PHME Silicone), 30 m x 0,32 mm x 0,25 µm
film Thickness (tipo semicapilar).
Presión de gases:
Hidrógeno: 2 bar
Helio: 2,8 bar
Aire: 4 bar
Flujo total: 100 ml/min.
Purga sel Septum: 2,29 ml/min.
Tiempo de un no retenido: 2,40 min.
Velocidad de flujo lineal: 20,875 ml/min.
Flujo volumétrico: 1,0048 ml/min.
Relación de división: 1:99
Presión en cabeza de columna: 50 KPa
Flujo de gases en detector:
Helio: 15,8 ml/min.
Hidrogeno: 30,2 ml/min.
Aire: 500 ml/min.
Anexo
xi
2. Hongos
2.1. Medio MS (Murashige y
Skoog 1962)
complementado con sacarosa 90g/l
Sales inorgánicas
CaCl2 332.02 mg/l
NH4NO3 1650 mg/l
MgSO4 80.70 mg/l
H3BO3 6.2 mg/l
CoCl2·6H2O 0.025 mg/l
CuSO4·6H2O 0.025 mg/l
MnSO4·H2O 16.90 mg/l
KI 0.83 mg/l
KNO3 1900 mg/l
KH2PO4 170 mg/l
Na2MoO4·2H2O 0.25 mg/l
ZnO4·7H2O 8.60 mg/l
Fuente de hierro
Na2·EDTA 37.26 mg/l
FeSO4·7H2O 27.80 mg/l
Vitaminas
Mio-inositol 100 mg/l
Acido nicotínico 0.5 mg/l
Piridoxina HCl 0.5 mg/l
Tiamina HCl 0.5 mg/l
Glicina (base libre) 2.0 mg/l
2.2. Medio de cultivo utilizado en
los ensayos preliminares in
vitro.
Solución de nutrientes minerales
NO3- 4.5 mol m3
SO42- 2.0
[H2PO4- + HPO4
2-] 0.08
Ca2+ 2.0
NH4+ 0.5
Mg 2+ 0.4
K+ 3.3
Micronutrientes
B 0.006
Cu 0.0008
Zn 0.0012
Mn 0.001
Mo 0.0001
Fe 0.015
FeSO4 0.06
Anexo
xii
El pH final se debe ajustar a 6.5.
El modo de preparación es el siguiente:
Se preparan las soluciones de macro y micronutrientes por separado.
Se prepara una solución nutritiva con 100 ml de los macronutrientes y 1 ml de los
micronutrientes.
Paralelamente se disuelven 6 g de agar en 899 ml de agua destilada en agitador a 80ºC o
se puede autoclavar a 115ºC durante 5 min. Se deja enfriar hasta 40º y se añade 101 ml
de la solución nutritiva. Se agita bien.
Se reparten 100 ml en cada recipiente, se tapan con papel de aluminio y se autoclavan a
121ºC durante 15 min. El pH final es de 6,7
En la cámara de flujo laminar se deja enfriar y se siembran las plantas.
Las palntas se extraen del pote comun y se cortan las raíces para introducirlas bien en el
agar. Estarán bajo fluorescente de 280 lux, a 25ºC y fotoperiode de 16 h de luz y 8 de
oscuridad diarias, hasta que comiencen a emitir nuevas raíces.
Anexo
xiii
3. HISTOQUIMICA
3.1. Listado de muestras para cortes en fresco
Plantas sana.
1. Barranco del agua. Los Silos.
2. Finca suerte 4º
Plantas con síntomas de FMP
1. Carmelo Villa, planta con todos los sintomas internos y externos de FMP. 7 meses
de plantación
2. Finca Suerte 4ª. Planta con colapso y piña abortada, sin parir en el interior del
pseudotallo.Vainas ext.
Plantas dudosas de FMP
1. Carmelo Villa, planta arrancada por sintomas de amarilleos. Riego en exceso. Sin
sintomas internos. Sana?
2. Finca Suerte 4ª.Planta con signos de encharcamiento
3.2. Listado de muestras procesadas con parafina
3 plantas FMP procedente de Los Realejos
3 plantas sanas procedente de Los Realejos
1 planta con Mal de Panamá procedente de Valle Guerra. CATESA
3.3. Protocolo de deshidratación
solución tiempo
i. Etanol 70% 5 h
ii. TBA mix 70% Mínimo 15 h
iii. TBA mix 85% 60 min
iv. TBA mix 95% 75 min
v. TBA mix 100% 75 min
vi. TBA I puro 75 min
vii. TBA II puro 75 min
viii. TBA III puro Mínimo 15 h
Anexo
xiv
3.4. Mexclas TBA
Agua (v) Etanol 90% (v) Etanol 100% (v) TBA puro (v)
TBA mix 70% 30 50 - 20
TBA mix 85% 15 50 - 35
TBA mix 95% - 45 - 55
TBA mix 100% - - 25 75
3.5. Protocolo de Inclusión en Parafina
Solución tiempo
i. TBA puro + Aceite parafinado (1:1) 30ºC 24 h
ii. Material anterior sobre parafina 60ºC 24 h
iii. Parafina I 60ºC 6 h
iv. Parafina II 60ºC 48 h
v. Parafina III 60ºC 24 h
vi. Inclusión en molde
Anexo
xv
4. Plan de abonado del ensayo de diferentes dosis de riego y compactación en campo
Planificación del abonado diario en el ensayo de GüimarNºplantas total: 220 Borde: 112 Tratamiento: 108
T1: 148 T2: 36 T3: 36marzo/abril N: 15g/pl/mes abono: 1g/pl/dia
lunes martes miércoles jueves viernest1 444 148 148 148 148t2 108 108 108 108 108t3 108 108 108 108 108
mayo/junio N: 30g/pl/mes abono: 2g/pl/dialunes martes miércoles jueves viernes
t1 888 296 296 296 296t2 216 72 72 72 72t3 216 72 72 72 72
julio N: 25g/pl/mes abono: 1,67g/pl/dialunes martes miércoles jueves viernes
t1 741,48 247,16 247,16 247,16 247,16t2 180,36 60,12 60,12 60,12 60,12t3 180,36 60,12 60,12 60,12 60,12
agosto/septiembre N: 20g/pl/mes abono: 1,34g/pl/dialunes martes miércoles jueves viernes
t1 594,96 198,32 198,32 198,32 198,32t2 144,72 48,24 48,24 48,24 48,24t3 144,72 48,24 48,24 48,24 48,24
octubre No hay que abonar con NNoviembre/diciembre N: 10g/pl/mes abono: 0,67g/pl/dia
lunes martes miércoles jueves viernest1 297,48 99,16 99,16 99,16 99,16t2 72,36 24,12 24,12 24,12 24,12t3 72,36 24,12 24,12 24,12 24,12
Fe de erratas
Pág. 12 línea 9 debe decir (Domínguez y Rodríguez, 2001).
Pág. 12 linea 29 donde dice:...Suárez (2000), debe decir: Suárez (1996)
Pág. 12 linea 30 donde dice:...pozos y..., debe decir: pozos o galerías...
Pág 16 linea 27 debe decir: decoloración vascular producida...
Pág. 18 linea 19 debe decir: ( Declerck et al., 2002; Risede y Simoneau, 2001)
Pág 19 linea 8 debe decir: Frisulo et al. (1994)
Pág. 19 linea 12. debe decir: Xylariaceous taxa.
Pág. 21 donde dice Nelson, 1983 debe decir Nelson et al. 1983.
Pág. 21 donde dice Nelson, 1981 debe decir Nelson et al., 1981.
Pág. 22 última línea debe decir (Ploetz et al., 1990).
Pág. 25 línea 3 debe decir Kangire et al. (2000).....
Pág. 29 linea12 debe decir :(Venter y Currier, 1977; Ali y Jarvis, 1988)
Pág 40 linea 22 debe decir: 1986; Malcolm y Lewis, 1991).
Pág. 41 linea 12 debe decir Aguilar et al.(2000 a y b)
Pág. 41 linea 23 debe decir: Stevens y Harvey (1995) en vid...
Pág. 43 línea 20 debe decir Domínguez y Rodríguez (2000).
Pág. 46línea 18 debe decir Borges Pérez et al. (1991).
Pág. 47 línea 16 debe decir Marschner et al. (1996).
Pág. 47 linea 26 debe decir: (Charpentier, 1968).
Pág. 48 líneas 13, 15 y 21 debe decir Lahav e Israeli ......
Pág. 50 línea 15 debe decir (Arroyo et al., 1993; ......).
Pág. 51 línea 3 debe decir (Komada, 1975 ,1976).
Pág. 51 línea 10 debe decir (Martin-Prevel et al., 1984).
Pág. 52 línea 11 debe decir (...... ; Page et al., 1986).
Pag. 54 línea 17 debe decir ......supervisión de los Doctores.....
Pág. 54 última línea debe decir ( Klement y Sands, 1990).
Pág. 55 Fig. 3. debe decir: Pseudomonas.
Pág. 60 línea 4 debe decir ....... Nelson et al. (1983), ........
Pág. 61 Tabla 2 debe decir (Nelson et al., 1983; Nelson, 1990).
Pág. 61 y sucesivas donde dice: fialides debe decir: fiálidas.
Pág. 62 Tabla 3 debe decir (Leslie, 1990).
Pág. 65 línea 8 debe decir ( Peñalver y López, 1994).....
Pág. 66 linea 4 debe decir: ...diera reacciones rápidas ... fitopatógenos u hongos...
Pág. 67 linea 4 debe decir: ...se desarrollaba la planta...
Pág. 68 última linea debe decir:...mediante el riego...
Pág. 77 linea 19 debe decir: ...ensayos, se analizaron...
Pág. 78 linea 27 debe decir: ...se ajustaba de acuerdo...
Pág. 87 Figuras 12 y 13 debe decir: (octubre 96-marzo 99)
Pág. 89 Tabla 5 donde dice: Incidencia(%), debe decir: Incidencia media y donde dice:
Incidencia media, debe decir:Total
Pág. 89 linea 16 debe decir: De las plantaciones...
Pág. 91 linea 12 debe decir: ...del rizoma que era...
Págs. 96 y 97 donde dice: plantación(es) debe decir :parcela(s).
Pág. 97 linea 9 dice: plarcela , debe decir:parcela.
Pág. 98 Tabla 10. donde dice: Municipio de Los Realejos , debe decir: municipio de
Buena Vista del Norte.
Pág. 101 linea 5 debe decir:... Para la mayoría...
Pág. 107 Linea 1 debe decir: Algunas especies han sido...
Pág. 118 Tabla 21 última linea donde dice: F. moniliforme, debe decir: F. proliferatum
Pág. 121 linea 10 debe decir: ...esas bacteriosis o los ...
Pág. 127 y sucesivas donde dice: cv ,debe decir: cv.
Pág. 129 linea 8 debe decir: hipoxia radical
Pág. 137 linea 2 debe decir: ...de valores...
Pág. 139 linea 8 debe decir: ...inoculación con F. proliferatum la...
Pág. 151 linea 13 debe decir: ...tabla 42, se presenta la separación de medias de las
variables fenológicas de ...
Pág. 155 linea 11 donde dice: sembradas , debe decir: cultivadas.
Pág. 158 linea 1 donde dice: peso fresco aéreo, debe decir: peso seco de raíz.
Pág 159 Tablas 48 y 49 dice:infección, debe decir:interacción
Pág 170 linea 8 debe decir: número de hojas (tabla 57).El peor....
Pág. 170 linea 11 donde dice: ....uno de los peore siendo...., debe decir: ...peores no
siendo...
Pág. 177 linea 13 debe decir: ...género Fusarium
Pág. 182 linea 3 debe decir: Los bloques 1 y 2 ...
Pág. 183 párrafo 1donde dice:El bloque... respecto a los bloques., debe decir: Para la
variable PL-PAR el bloque 3 es estadísticamente diferente al bloque 2 y es igual al
bloque 1.
Pág. 188 linea 9 donde dice: ...de estrés y ... , debe decir: ...de estrés. Reinking (1926)
citado por Lahav et al. (2000), describe el Yellow Mat, desorganización vascular
asociada al floema cuya causa no se conoce. La desorganización vascular ha sido
asociada tanto a patógenos como a salinidad y bloqueos nutricionales como el Ca y el B
(Epstein,1973).
Pág. 189 linea 2 debe decir : e iones...
Pág. 190 Figuras: 64,65 y 66 donde dice FMP. , debe decir : FMP
Pág 191 Figuras. 69 donde dice: FMP. , debe decir: FMP
Pág 191 pie de Fig. 68 corresponde a pie de Fig. 69 y viceversa.
Pág. 192 linea 12 donde dice: ...(Lecuona, ...), debe decir: (Lecuona ,1975; Sandoval y
Müller,1990).
Pág. 203 Fig. 98 debe decir:Tinción Gerlach.
Pág. 203 Fig.99, 100 y 101 debe decir: Tinción Azul de toluidina
REFERENCIAS
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1673.
2.- Citadas en bibliografia que no aparecen en el texto
Battino et al. 1975.
Blesa et al, 1979.
Crisci, 1983.
Klement, 1990.
Panis y Thinh, 2001.
Peng et al. 1999.
Tamietti y Matta, 1989.
Vandermolen, 1978
Vandermolen et al., 1976.
3. Citaciones incorrectas
Pág. 213. Chao, L., Zeng, D., Sun, F., Zhao, T., Liu, C., Chao, L. J., Zeng, D. P., Sun, F.
Z., Zhao, T. C., and Liu, C. J. (1998). Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg -
a pathogen causing wetwood in poplar trees. Scientia Silvae Sinicae 34, 69-73.
Pág. 214 debe decir Correll, J. C. ; Klittich, C.J. R.; Leslie, J. C. (1978b) Nitrate
nonutilizing mutantas........
Pág. 219. Debe decir :Lecuona, M. C. (1975). Contribucion al estudio...........Servicio de
Publicaciones de la Caja de Ahorros de Santa Cruz de Tenerife. (Investigación.5). 180
pp.
Pag. 221. Debe decir: Nelson, P. E. (1990). Taxonomy of fungi in the genus Fusarium
with emphasis in Fusarium oxysporum. In Fusariumn Wilt of banana. Pp 27-37. Edited
by Randy C. Ploetz. APS Press.
Pág. 221. Nicole, M., Boher, B., Valette, C., Martinez, C., Calatayud, P. A., Kpemoua,
K., Daayf, C., Daniel, J. F., Bresson, E., Sarah, J. L., Andary, C., Geiger, J. P., and
Vercambre, B. (1996). Contribution of cytology to the study of defence mechanisms of
plants to parasitic attacks. In "Interactions insectes plantes. Actes des 5e journees du
groupe de travail Relations insectes plantes, Montpellier, France 26 27 Octobre 1995.
1996, 19 28; 39 ref." Edition de l'ORSTOM; Paris; France.
Pág. 223 Última cita debe decir Ploetz, R. C. and Pegg, K. G.
Pág. 224. Risède, J. M. Falta año de cita.
Pág. 230. Zimmermann, U., Zhu, J. J., Meinzer, F. C., Goldstein, G., Schneider, H.,
Zimmermann, G., Benkert, R., Thurmer, F., Melcher, P., Webb, D., and Haase, A.
(1994). High molecular weight organic compounds in the xylem sap of mangroves:
implications for long-distance water transport. Botanica Acta 107, 218-229.